TW480271B - Aprotinin variants having improved properties - Google Patents

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經濟部中央檩準局員工消費合作社印製 480271 A7 ____ _B7 __ 五、發明説明（i ) 本發明涉及具有改善的f每抑制活性、免疫學性質和藥物 動力學性質的抑肽胃每變異體及其製備。 抑肽S每也稱爲牛胰蛋白|每抑制劑（BPTI)，屬於Kunitz類 型絲胺酸蛋白S每抑制劑家族。可抑制的絲胺酸蛋白S每的範 園包括騰蛋白|每、腺凝乳蛋白I每、血纖維蛋白溶絲和血浆 激肽釋放S每（W· Gebhard，H· Tschesche and H· Fritz， Proteinase Inhibitors, Barrett and Salvesen (eds·)， Elsevier Science Publ· BV 375-387， 1986)。 抑肽胃每由58個胺基酸組成。借助於X-射線結構分析和丽R 光譜分析，闡明了蛋白質的三級結構（Wlodawer et al ·， J. Mol. Biol. 198 (3); 469-480, 1987; Wager et al., J. Mol. Biol. 196 (1), 227-231, 1987; Berndt et al·， Biochemistry 32 (17)， 4564-4570， 1993)。 商品名爲Trasylol®的夭然抑肽酹最初用於胰腺炎的治 療。今天Trasylol®用於心臟外科，因爲臨床研究表明， 用抑肽f每進行治療顯著降低該類型手術中輸血的需要，並 減少術後出血（D· Royston，J. Cardiothorac. Vase. Anesth· 6: 76-100， 1992)。 有跡象表明，在決定抑制特異性的15位胺基酸的置換可 產生具有改善的抑制性質的有用的抑肽鉍變異體（德國專 説明書3 339 693 )。這樣，根據導入的胺基酸不同，可 以產生例如可抑制胰腺或白細胞彈性蛋白酹的各種有效抑 制劑。 還有跡象表明，抑肽f每抑制活性以及在第15位置換產生

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480271 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（2 ) 的變異體們的抑制活性亦由被抑制的目標蛋白酹與抑制劑 分子之間接觸區中的胺基酸殘基所決定。這些胺基酸尤其 包括在第14、16、π、18、19、34、38和39位置上的其它 胺基酸殘基。特别在以下專利申請例如：W〇 89/01968、 W0 89/10374、EP 〇 307 592、EP 683 229中描述 了由接 觸區中置換一個或多個胺基酸殘基產生的性能改善的抑肽 西每變異體。 有趣的是，通過置換確定物質物％隹質的胺基酸，可能改 進抑肽S每及其變異體的藥物動力學性質。因此通過降低分 子的淨正電荷可能顯著降低腎臟的結合。專利申請WO 92/ 06111中描述了該類型的變異體。 爲了提高產業的製備能力，在某些情況下最好進行抑制 分子的N-末端修飾。這類修飾可以是N_末端收縮或延仲， 或是缺失一個或多個胺基酸。EP 419 878中描述了 末⑼ 修飾的抑肽S每變異體。 ^ 本發明的抑肽si變異體 本專利申請中描述的抑肽酹變異體的區别在於以下特徵 1·置換分子活性中心的一個或多個胺基酸，以改進涪性性 2·置換胺基酸降低淨正電荷，以改進免疫學性質和藥物動 力學性質。 3.修飾N-末端胺基酸序列，以改進產業製備能力。 上述專利申請中描述的每個抑肽|每變異體只含有其中〜 -4 - 暖及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） I:------衣· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} ί 1 1 * 、訂- 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 480271 A7 ______B7 五、發明説明（3 ) 個上述特徵。現在，本發明的抑肽馘變異體在其分子結構 中結合了兩個或三個上述特徵。圖中舉例顯示了某些變異 體的胺基酸序列。 ~ 然後，本發明的抑肽酹變異體不限於圖i所示的實例。 本發明抑肽S每變異體也包括具有N-末端延伸Ala(_2)_Gln (-1)的變異體、在2位具有中性胺基酸殘基脯胺酸的變異 體、由中性或帶負電荷的胺基酸殘基置換其他帶正電荷的 胺基酸的變異體、或由帶負電荷的胺基酸殘基置換其他中 性胺基酸的變異體。這裡胺基酸殘基置換的選擇按照以下 原則進行：產生的物質在生理pH下淨正電荷降低，最好爲 +2至-2。上述胺基酸序列的改變（包括末端延伸或收縮 或缺失）可以根據需要相亙結合來加以利用。因此，本發 明的抑肽S每變異體包括含有上述特徵組合、並在生理pH下 淨正電荷降低的所有化合物。 令人驚詩的是，兩個或三個上述特徵的組合似乎不僅使 得我們獲得各個特徵的表現，而且在某些情況下甚至增強 各個特徵的表現。此外，也可能產生涉及例如免疫學性質 、藥物動力學性質和表面結合性質的明顯新的物質性質。 這些新變異體表現出與多株人類抗血清和多株兔抗血清（ 使用抑肽縣所產生）的反應減小。我們還發現，與抑肽西每 相比，新變異體顯著地降低了其免疫原行爲，即它們謗導 的免疫反應較弱。還有跡象表明，本發明的變異體與抑肽 酉每相比，誘導血細胞釋放的組織胺數量降低。此外，與抑 肽西每相比，新變異體還表現出明顯較少之賢臟蓄積量。與 -5 _ i'畴⑥一劣飞' 旌垄直一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M规格（2!0X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 訂 480271

經濟部中央檩準局員工消費合作社印製 該分子的早期變異體相比，儘管在該分子中存在大量變化 ，其胃每動力學抑制常數（Ki値）都令人驚訝地提高了。 因此，本發明涉及在pH 7下淨電荷爲+3至_3、且有胺基 酸Arg 15或Arg 15-Ala 17的抑肽酹變異體。優選變昱體 的淨電荷爲+2至-2，特别優選爲^至―〗。 、 這些抑肽S#變異體適用於血漿激肽釋放|每、組織激肽釋 放酉每和血纖維蛋白溶I每的抑制。 另外，這些抑肽酹變異體具有修飾的N_末端序列。 因此，本發明的目的是提供具有N_末端延伸或收縮或具 有缺失的胺基酸的抑肽酹變異體。 推薦的抑肽I每變異體是DesProZ-SerlO-ArglS-AlalY- AspgfThdG-Gli^ 卜 Asn41_Glu53-抑肽酉每、 DesPro2_ Serl〇-Argl5-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽 f每、 DesPro2-Serl〇-Argl5-Serl7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽百每、DesPro2~Serl〇-Argl5-Alal7-Thr26-Glu31 - Asn41-Glu_抑肽酉每和 DesPro2-Ser 10-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-抑肽酉每。 這些抑肽S每變異體在第2位置也攜帶胺基酸脯胺酸。 本發明也涉及包含一個或多個這些抑肽f每變異體的禁物 〇 描述的新的蛋白f每抑制劑適於治療多種疾病，在遑些疾 病中（也由於相對複雜的手術方法，諸如在心臟外科或在 移植術中的異常關節成形的關節置換中的方法等所造成） ，由於血液廣泛的或增強的外源表面接觸，使血槳中絲系 統的活性發生而造成。

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一裝· 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 480271 A7 —______^B7 五、發明説明（5 ^~' — 抑制劑能降料些具有高度“危_手財血液的損 失（例如心臟手術、骨外科和關節外科）。它們適於治療 休克、多處創傷和顱腦創傷、敗血症、散播性血管内凝血 ⑽）、多器官衰竭、涉及激肽釋放㈣統的炎症（諸如 風濕性關節炎和哮喘等）。通過抑制血纖維蛋白溶躲，阻 止惡性腦瘤的生長的轉移。由於抑制舒缓激肽的合成，它 們也適用於疼痛和水腫的治療。它們也適用於透析療法和 人造器官以預防炎症、血凝固和出血風險的增加。 本發明抑肽薛變異體的槊備 爲了制備本發明抑肽S每變異體，最好使用基因工程方法 。爲此，使用習知分子生物學方法，將在各種情況下考慮 用於抑肽f每變異體合成的基因工程信息引入適當的微生物 表現體内。重組微生物進行發酵；通過選擇適宜的條件， 表現異源遺傳信息。隨後從培養基中獲得表現的抑肽g每變 異體。 用於生產本發明抑肽縣變異體的適宜的宿主生物體可以 是細菌、酵母菌或眞菌。表現可以在細胞内進行，或用適 當的分泌系統在細胞外進行。抑肽縣變異體可以正確地加 工或融合爲肽或蛋白質。 專利申請EP 683 229、W0 89/02463、W0 90/10075以及 上述各種其它專利申請中描述了用於表現抑肽S每變異體的 適宜系統。 實施本發明的方法

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ；297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} •衣· -訂_ 480271 經 濟 部 中 央 標 隼 局 員 工 消 費 合 社 印 製 A7 B7 五、發明説明（6 ; 所用的S每（限制性内切I每、來自牛腸的鹼性嶙酸縣、T4 多核荅酸激西每和T4 DNA連接酹）得自B〇eringer Mannheim 和GIBCO/BRL，按照生產商的説明書使用。 分子生物學技術 諸如從大腸桿菌中分離質體DNA (所謂的微制備）和用 質體DNA轉形大腸桿菌等的例行選殖工作按照以肋〜仏等 人的方法進行（Molecular Cloning, Cold Spring Harbor， 1989)。用於轉形的宿主生物體是大腸桿菌菌株DH5^ (GIBCO/BRL)。爲了分離較大量的質體DNA，使用Qiagen牌 取液器槍頭（Qiagen)。按照生產商（Genomed)的詳細説明 ，借助於Jetsorb從瓊脂糖凝膠中提取DNA片斷。 用於"定點謗變"實驗的寡核荅酸和用於PCR和定序反應 的引子用Applied 8丨〇3丫5161113的|1380 A DNA合成儀"進行 製備。謗變實驗按照Deng和Nickoloff的方法（Deng et a·， Anal· Biochem. 200， 81-88， 1992)，用 Pharmacia Biotech的套組（"Unique Site Elimination Mutagenesis" )進行。所有構建的載體和謗變實驗，在nABI 373 A測序 儀”（Applied Biosystems)上通過使用螢光標記終止子的 Taq循環DNA序列分析法進行證實。 釀酒酵母的轉形 酵母菌細胞例如菌株JC34.4D (MATa，ura3_52，suc2) 在10毫升YEPD ( 2%葡萄糖；2%蛋白觫；1% Difco酵母抽提 液）中進行培養，在0^.6〇()111〇爲0.16-〇.8時收獲。細胞 用5毫升溶液a ( 1M山梨醇；10 mM N-二（鲽乙基）甘胺 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂 480271 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（7 ) 酸pH 8.35; 3%乙二醇）洗滌，再懸浮於0.2毫升溶液A中 ，並於-70°C保藏。 將質體DNA(5微克）和載體DNA(50微克，來自鯡魚的 精液）加入冷凍細胞中。細胞於37eC振盪5分鐘進行復甦 。加入1.5毫升溶液 B ( 40% PEG 1000，200 ιηΜ N-二（羥 乙基）甘胺酸pH 8·35)後，細胞於30°C保溫60分鐘，然 後用1.5毫升溶液C (0·15 M NaCl; 10 mM N-二（雞乙基） 甘胺酸pH 8.35)洗滌，再懸浮於100微升溶液C中。在含 有2%瓊脂的選擇培養基上塗佈。於30eC培養3天後獲得轉 形體。 用於發酵的營養培養基 1.SD2培養基： Bac to酵母含氮培養基 葡萄糖* RH 2 P0 4 2.SC5培養基：葡萄糖* Difco酵母抽提液 KH 2 P0 4 (NH4 ) 2 S04 MgSO 4 X 7 Η 2 〇 微量元素溶液SL4 pH 6.0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝- 6.7克/升 20克/升 6.7克/升 pH 6.0 20克/升 20克/升 6.7克/升 2.0克/升 1.0克/升 1.0毫升/升 、-ιτ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 480271 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

五、發明説明（8 ) 微量元素溶液SL4 : Titriplex III FeS04 X7 H2 〇 ZnSO 4 X 7 H 2 〇 MnCl 2 X 4 H 2 〇 h3 bo3

CoCl 2 X6 H2 〇 CuCl 2 X2 H2 〇 NiCl 2 X6 H2 〇 Na 2 M〇0 4 X 2 H 2 〇 $ =單獨高壓滅菌 3.發酵罐培養基： 葡萄糖* 大豆蛋白月東 KH 2 P0 4

MgSO 4 X 7 Η 2 〇 系迦素叙働 肌醇 微量疋素溶液 維生素溶液 (ΝΗ4 ) 2 S〇4 進料溶液： 葡萄糖* 5克/升 2克/升 〇.1克/升 〇.〇3克/升 〇.3克/升 〇.2克/升 〇.〇1克/升 〇.〇2克/升 〇.〇3克/升 2.0克/升 25.0克/升 1.4克/升 1.0克/升 5.1毫克/升 20毫克/升 3毫升/升 3毫升/升 3.8克/升 pH 5.5 530克/升 -10 -

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 480271 A7 B7 五、發明説明（9 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (NH4 ) 2 S〇4 5.0克/升 KH 2 P0 4 2.9克/升 MgS〇4 x7 H2 0 3.8克/升 硫胺素氣化物 13毫克/升 肌醇 70毫克/升 微量元素溶液 6.8毫升/升 維生素溶液 6.8毫升/升 微量元素溶液： FeC 1 3 X 6 Η 2 0 13.5克/升 ZnCl 2 X4 H2 0 2.0克/升 h3 bo3 〇.5克/升 CoCl 2 X 6 H 2 0 2.0克/升 CuSO 4 X 5 H 2 0 1.9克/升 Na2 Mo04 X2 H2 〇 2.0克/升 CaCl 2 X 2 H 2 0 1.〇克/升 濃鹽酸 100克升/升 *二單獨高壓滅菌 維生素溶液： 核黄素 0.42克/升 泛酸鈣 5.9克/升 烟酸 6.1克/升 0比哆醇鹽酸鹽 1.7克/升 生物素 〇.〇6克/升 葉酸 〇.〇4克/升 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 480271 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（10 ) 接種液的製備 於1L錐形瓶中，在200毫升SD2培養基中接種保藏原種至 濃度爲。培養物在搖床上（260rpm)於28ec培養72小時 。然後以每份2毫升裝入保藏容器中並在液氮中冷凍。 在搖床上的燒瓶中進行的發酵 作爲預培養，於1L錐形瓶中，將2〇〇毫升SD2培養基用接 種液接種至濃度爲1%，然後在搖床上（26〇rpm)於28°C培養 72小時。用預培養物接種主培養物（在孔燒瓶中的2〇〇毫 升SC5培養基）至濃度爲1%，然後在搖床上於28亡培養72-96小時。 在10L生物反應器中的發酵 作爲預培養，於1L錐形瓶中，將2〇〇毫升SD2培養基用接 種液接種至濃度爲1%，然後在搖床上（260rpm)於28eC培養 72小時。10L發酵罐中的主培養在96小時的過程中分批進 料行發酵。所用的營養培養基爲發酵罐培養基，起始體積 爲7L。發酵罐用200毫升預培養物進行接種。 發酵條件： 溫度：28¾ 攪拌器的旋轉速度·· 500 rpm 通氣：10升/分鐘 pH ： 5.5 端部空間壓力：200 mbar 發酵7小時後，開始進料，進料速率由呼吸商（rq) ( RQ =產生的C0 2 /消耗的氧氣）控制。如果RQ升至>1 · 15， -12 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 480271 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ____ B7五、發明説明（U ) 那麼降低進料速率，如果RQ降至〈1.05，那麼增加進料速 率。 按一定的時間間隔，從發酵罐中取出樣品，通過測定 700 nm的光密度檢測細胞的生長。另外，通過活性測量測 定上清液中Bay 19-8757的濃度。 發酵結束時，通過加入5〇%(w/v)檸檬酸將PH降至PH 3， 發酵罐於70eC加熱1〇分鐘。然後以7,500X g離心分離出細 胞，上清液用於蛋白質純化。 用於蛋白質化學分析的材料 序列分析用 Applied Biosystems (Forster City, USA) 的473型蛋白質測序儀進行。使用標準測序程序。在掭作 手册中詳細描述了測序儀、各種測序程序和PTH檢測系@ (用户手册，473 A型蛋白質測序系統（1989) Applied Biosystems Forster City, CA 94404， USA)。 用於測序儀操作的試劑和用於PTH檢測的HPLC柱得自 Applied Biosystems 〇 HPLC分析用 Hewlett Packard (D-Waldbronn)的HP HPLC系統進行。將Backerbond (D_Gro>8 Gerau)的RP、q HPLC柱（250毫米Χ4·6毫米，5a材料，孔徑爲300 用 於分離。 270 A-HT型毛細電泳儀來自Applied Biosystems (Forster City，CA 94404, USA)。通常按不同的時間間 隔流體動力學地注射樣品。所用的毛細管拄（50微米X 公分）來自 Applied Biosystems。 -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝 -訂_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480271 A7 B7 五、發明説明（12 ) 〜 ^ ---一—~

胺基酸刀析用 Βί。^。—（D Maintal)的LC 3000胺基酸料儀進行。使_ wa的標 準分離裎序。僅33 < ^器手册中詳細描述了分離程序和分析儀的 功能。 、为子量用 Krat〇s/shimadzu (D-Duisburg)的MALDI I 系 統進行。SDS電泳用 pharmaeia (D_Freiburg)的電泳 系統進行。 、動力學數據用SLT (D-Crailsheim)的微量滴定板讀板儀 進行测定。微量滴定板用Dynatec (D-Denkendorf)的洗滌 儀進行洗滌。 百每和受質來自Calbiochem (D-Bad Soden)。所有其它化 學品和試劑都來自Merck (D-Darmstadt)或S igma (D-Deisenhofen)。％ 孔板購自 Greiner。 多株兔抗抑肽f每抗體通過用抑肽西每使兔免疫而獲得。人 類多株抗抑肽f每抗體來自用抑肽|每治療的病人。 蛋白質的化學g P末端序列分折 將溶於水中的卜3 nmol蛋白酹抑制劑加到用P〇lybrene 預保溫的測序紙上。用快速正常的測序儀周期進行序列分 析。PTH胺基酸用聯機的HPLC，借助於50 pmol PTH標準物 進行識别。 胺基酸分析 將200微克蛋白質溶於200微升6N HC1中，於166¾水解 1小時。將大約lnmol樣品加入胺基酸分析儀中。用5nmQl

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訂 480271 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（13 ) 標準物測定胺基酸的量。 SDS凝膠電泳 按照Laemmli的條件進行SDS凝膠電泳。用10-20%強度的 SDS凝膠分析10微克蛋白酹抑制劑，並用銀染法進行目測 檢驗（Merri 1等人）。 U.K. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970). C.R. Merril, M.L. Dunau, D. Goldman, Anal. Biochem. 100:201-207 (1981). 毛細電泳 在玻璃拄（長度爲72公分，内徑爲50微米）上進行毛細 電泳，研究8 ng蛋白f每抑制劑。條件：電流密度爲90UA ，柱溫爲25eC，1〇〇 nM磷酸鹽組衝液pH 3.0，測定210 nm ，在3秒内在壓力下加樣。 反相色譜法 將5nmol蛋白f每抑制劑在Bakerbond RP-18 HPLC柱（5u 材料，4.6nmX 250mm，孔徑爲300 A )上進行色譜分離。 所用的洗脱液爲乙胯/TFA梯度。條件：流速爲0.7毫升/ 分鐘，柱溫爲40eC，測定溫度爲40ec，溶劑A爲0.1% TFA ，溶劑B爲0.1% TFA/60%乙骑；梯度；0分鐘0% B，10分 鐘〇% B，70分鐘 100% B，80分鐘0% B。 分子」量的測定 1微克蛋白S每抑制劑用MALDI技術進行分析。所用的基 質爲齐子酸。用於質量校準的標準蛋白質爲牛胰島素、細 胞色素C和蜂毒肽。

本紙張尺度適巧中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 卿271 A7 經濟部中央檩準局員工消費合作衽印製 五、發明説明（14 ) 曼|含量 蛋白含量按照BCA法進行測定。在該方法中，Cu2+離子借 助於存在的蛋白質反應爲Cui+離子，後者與bicinchoninic acid形成絡合物，在56〇nm處有吸收崎 涞乾的蛋白質在濃度爲1毫克/毫升時達到平衡含濕量 ，並溶於0·9% NaCl溶液中。製備稀釋系列。將1000微升 BCA試驗試劑（Pierce)加入5〇微升樣品溶液中，用塞子緊 緊塞住試管，並於60¾恰好保溫30分鐘。在冰浴中將樣品 冷卻5分鐘後，於25eC、波長爲560 nm進行測定。 鱼座丄ί縢蛋白g每抑制試驗，滴定分析） 活性按照修改的F.I ·Ρ·胰蛋白转抑制試驗進行測定。 Bay 19-8757抑制胰蛋白酹催化的Να_苯甲醯基气精胺酸 乙酯（ΒΑΕΕ)的水解。通過鹼滴定測定反應中釋放的羧基基 圏。胰蛋白西每的殘留活性是活性化合物抑制活性的度量秩 準0 w 滚乾的蛋白質在濃度幻毫克/毫升時達到平衡含 ，並溶於0.9% NaCl溶液中，製備稀釋系列。 ·: 衝液（15 mM硼酸鹽緩衝液，pH 8 〇含 笔， 釦η β主必成求 β ^2〇〇 mM CaCl 〇 ) 和0.8¾升胰蛋白酹溶液（2毫克/毫升）知 ) 中，混合液於25。以呆溫5分鐘。然後知 當升樣品 液（6.8毫克/毫升），在5分鐘内測定κ〇0的毫升随溶 赶舰射滅紅減減別' w消耗量° 定 叉反應 將溶於偶聯缓衝液的〇.5-10ng蛋白縣抑制劑戋抑肽酹、 -16 _ 適用中國國家ii^rA4規-^τ210χ297公i r (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝· 訂 A7 B7 五、發明説明（15 ) 4C過夜結合到微量滴定板上。每個孔用洗滌缓衝液洗滌 4次，每次200微升，然後加入1〇〇微升封閉溶液。蓋上微 量滴定板，於37C保溫1小時。按上述方法洗滌後，加入 多株兔抗抑肽S每抗體（在含有1% 缓衝液中爲〇 2 微克/毫升）或人類抗體（在含有缓衝液中 爲20微克/¾升）。蓋上微量滴定板，於37。〇保溫】小時 ，然後按上述方法洗滌。然後加入1〇〇微升生物素化的抗 兔或抗人類抗體（25微升+1〇毫升含有1%防4的？防缓衝 液或含有1% HSA的PBS緩衝液），混合物於37。〇保溫i小 時。按上述方法洗滌微量滴定板，然後每孔加入1〇〇微升 抗生蛋白鏈黴素-過氧化|每複合物（5〇微升+ 1〇毫升含有 1% BSA的PBS缓衝液或含有1% HSA的PBS缓衝液）。蓋上徵 量滴定板，於37¾保溫1小時，然後按上述方法洗滌。 史質反應用TMB受質+過氧化|每溶液（1 + 1;每孔1〇〇 微升）進行。10分鐘後每孔用1〇〇微升2 Μ磷酸終止反應， 然後於450nm (參考爲570nm)進行測定。 溶液： 1·保溫缓衝液·· 15nM Na2 C03，35 mM NaHC03，pH 9.6 2·樣品緩衝液··將樣品以適當的濃度溶於保溫缓衝液。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

3·洗滌缓衝液：含有〇·1% (v/v) Tween 20的PBS 4·封閉緩衝液：含有3% (w/v) BSA或HSA/的PBS 實施例 實施例L 甩於分組 DesPro2-Serl〇-Argl5_Alal7-Asp24-Thr26 -

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） 經濟部中央檬準局員工消費合作社印製 480271 A7 _B7 五、發明説明（16 )

Glu31-Asn41-Glu53-抑肽g每的酵^ 用於製備DesPro2-Serl〇-Argl5-AU17-ASp24-Thr26-

Glu31-Asn4卜Glu53-抑肽S每基因的起始材料爲DesPr〇2一 Argl5-Alal7基因，用限制性内切縣Hindlll和BamHI將後 者選殖到載體PUC18中。產生的載體（pEM6 6 L)按照u s E·法（Pharmacia Biotech)，用謗變引子 A*Scal/Mlul U.S.E·選擇引子進行雙鏈謗變反應。謗變引子八具有以下 序列：

引子A 5，GGCTGCAGAGCTAACCGTAACAACTTCAAATCCGCGGAAGACTGCATG GAAACTTGCGGTGGTGCTTAG3’。該引子在DesPro2-Argl5-Alal7抑肽酹基因中產生突變Asn41和Glu53。用縣Seal和 SphI進行限制性降解來進行選殖體的分析。所需的序列再 通過選殖體PEM31.8.L的DNA序列分析加以證實。由 PEM31.8.L質體DNA開始，用引子Β和’反24-mer Μ13,引子 借助於PCR技術在基因的5’區產生進一步的置換（Ser 10-Asp24-Thr26-Glu31)。引子B具有以下序列；

引子B 5 ’ TGCCTCGAGCCGCCGTCTACTGGGCCCTGCAGAGCTATCATCCGTTAC TTCTACGATGCAACTGCAGGCCTGTGTGAAACCTTCGTATACGGC 3’ 。 底線上爲XhoIS每的别序列。 總體積爲100微升的PCR混合物中含有20ng pEM31.8.L質 體 DNA、20 pmol ’反 24-mer M13’引子、60 pmol 引子 B、 200 uM dNTPs、1XPCR反應缓衝液II (Perkin Elmer)、 -18 - /蹲

Lhp 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂 ^〇υζ/| 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 五、發明説明（17 ) 4_mM %C1 2 和2.5 U Taq DNA聚合鉍（Perkin Elmer)。，循 環條件爲：94eC 3分鐘，然後以94eC 1分鐘、55¾ 1分 鐘和72°C 1分鐘進行30個循環，隨後於72¾保溫5分鐘。 將％1^昆合物按1:5稀釋，與載體PCRII (Invitrogen)連接 。用連接混合物轉形大腸桿菌DH5a細胞。用I每Xhol和 BamHI進行限制性降解後識别陽性選殖體，並對幾個選殖 體進行序列分析。選殖體pES9· 10·L含有所需的序列，將 其用於進一步的研究。 大腸桿菌/酵母菌穿梭載體（例如pA202 )用於酵母菌 分泌載體的構建，其中將Despr〇2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24〜Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽5每序列連接到酵母 α—因子的pre-pro序列上。 載體PA202攜帶的胺苄青霉素抗性基因（bla)和URA3基因 作爲大腸桿菌和酵母菌的選擇性標記基因。載體的另一基 本要素爲Col E1和2α複製原點（〇ri)。REP3位點也位於該 區内。1200 bp EcoRI-Hindlll片斷攜帶MFal啓動子和酵 母因子前體蛋白的N-末端pre-pro序列（Kurjan and Herskowitz，cell 30，933-943，1982 )。通過導入作爲 Hindlll-BamHI 片斷的已修飾DesPro2-Argl5-抑肽ϊ每cDNA， 酵母α -因子pre-pro序列内KexII蛋白f每的識别位點（’Lys一 Arg’）得已製備（EP 0 419 878)。 在DesPro2-Argl5-抑肽S#序列的3,末端，載體攜帶酵母 URA3基因的BamHl-Sail片斷，後者在該位置作爲轉綠的終 止信號（Yarger et al·，Mol. Cell· Biol· 6，1095-1101 本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 480271 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（18 ) ，1986) 〇 用Xhol和BamHI從載體PES9.10.L切下180 bp DNA片斷， 通過瓊脂糖凝膠電泳進行純化，然後選殖到也用Xh〇I和 BamHI切割並去磷酸化的載體pA2〇2中。通過該選殖，載體 PA202 中的 DesPro2-Argl5-抑肽 S 每被 DesProZ-SerlO-ArglS- Alan-AspZlThde-01ιι31-Α3η4Κ1ιι53-抑肽 f 每置換 。用 該選殖產生的載體PES13.10.L選殖酵母菌細胞（JC34.4D)。 具有不同啓動子（諸如組成型GAPDH啓動子或可誘導型 GAL 10啓動子等）的其它大腸桿菌/酵母菌穿梭載體可以 用相似的方式進行製備，也導致〇65?1^2161'10^^15-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酹的分泌。 另外，當然也可以使用具有其它酵母複製原點（諸如自 主複製染色體的片斷（ars)等）的穿梭載體。 除USA3基因外，適合的選擇性標記基因是那些繁助酵母 恢復原養型的營養缺陷型突變體基因，諸如LEU2、HIS3或 TRP1基囡。此外，當然也可以使用那些其產物賦予各種抗 生素（諸如胺基糖菩G418等）抗性的基因。 其它酵母菌（諸如甲基營養型酵母菌Pichia past〇r*is 或Hansenula polymorpha等）在用適當的載體轉形後，也能夠生產DesPro2-Serl〇-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31 - Asn41_Glu53-抑肽 f每。 實施例2 用於分泌具有天然N-末端序列’Arg-Pro-Asp’的t^BLSerlO- Argl5_Alan-Asp24_Thr26 -G1 u31 -Asn41 _G 1 u53-抄肽g每的 -20 - 1魅 ^^張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐) " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝- 訂 480271 A7 B7 五、發明説明（19 ) 酵母表現載體的製備 爲了製備能夠分泌具有天然N-末端序列’Arg-Pro-Asp， 的Serl〇-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31_Asn41-Glu53-抑肽S#的酵母表現載體，首先通過PCR擴增和選殖具有α_ 因子前-列和抑肽S每基因5’末端（直到限制性内切f每Xh〇I 的識别位點）的MF〇t 1啓動子。所用的引子具有以下序列： 引子C :

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 5，GGGATATCTATTGATAAGATTTAAAGGTATTTGACAAG3，。底線上 爲EcoRV酹的識别序列。 引子D : SOGGCTCGAGGCAGAAATCTGGTCTAGCCAAAGCAGAAGAAGCAGCGAAC"0 AAGACAGCAGTGAAAATAGATGGAATCTCATTCTTTTAATCGTTTATATT 39. 。 橫線上爲Xh〇I酹的識别序列。 總體積爲50微升的PCR混合物中含有200ng pA202質體DNA 、〇 · 2 α Μ引子 C、0 · 2 u Μ引子 D、200 u M dNTPs、1 X PCR 反應缓衝液 11 (Stratagene，Opt卜PrimeTM)和2·5 U Taq DNA聚合酹（Perkin Elmer)。’循環’條件爲：94¾ 1分鐘 ，然後以94¾ 1分鐘、50¾ 1分鐘和72¾ 2分鐘進行30個 循環，隨後於72°C保溫5分鐘。將PCR混合物按1 : 5稀釋， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 與載體pCRII (Invitrogen)連接。用連接混合物轉形大腸 桿菌DH5cx細胞。用S每EcoRI進行限制性降解後識别陽性選 殖體，並對幾個選殖體進行序列分析。選殖體pIU2〇.ll.L 用於進一步的研究。 大腸桿菌/酵母菌穿梭載體pYES2 (Invitrogen)用於酵 -21 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐 480271 A7 B7 經濟部中央檩準局員工消費合作衽印製 五、發明説明（20) 母分泌載體的構建，其中將Serl〇-Argl5-Alal7-Asp24-1^1*26411131431141-611153-抑肽|每序列直接連接到酵母〇( 因子的前-序列上。載體PYES2首先用限制性内切S每SspI 和BamHI進行酹切、去磷酸化，然後進行凝膠純化。以這 種方式取出存在於載體pYES2上的GAL1啓動子和fl ori。 用EcoRV和Xhol從載體pIU20.11.L切下大約1030 bp DNA片 斷，通過瓊脂糖凝膠電泳純化，然後與載體PES9.10.L的 大約180 bp Xhol和BamHI片斷一起選殖到用SspI和BamHI 西每切的載體PYES2中。用連接混合物轉形大腸桿菌DH5a細 胞。用酹Xhol進行限制性降解後識别陽性選殖體並遣彳_ 列分析。用源於該選殖的載體PIU28· 11·L轉形酵母菌 (JC34.4D)。表現載體不再含有^-因子的原-序列，阳跑 ，只能通過信號肽|每進行Serl〇-Argl5-Alal7-Asp24、 Τ1ΐΓ26-61ιι31-Α3η4Κ1ιι53-抑肽f每的加工，而不受 蛋白縣S每切的影響。 I 實施例3 釀酒酵母的發酵 釀酒酵母表現菌株按上述方法進行發酵。 實施例4 在中悻p_H不多淨電荷的抑肽Μ衍生物的純化 1 ·適宜純化方法的調查 發酵後，通過離心分離出細胞，遽留下的上清液，、 去留下的細胞。 加入濃檸檬酸，將不含細胞的上清液調至pH 3。溶液 必 -- (請先閱讀背面之注意事項再填々馬f

-訂- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 480271 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 —- _______B7___ _______ 五、發明説明（21) 須用純水進行適當地稀釋，以建立低於8 mS/公分的導電 率。隨後，將溶液裝到預先用酸性缓衝液平衡的陽離子交 換柱上。用起始緩衝液進行大量地洗務，除去未結合的物 質。借助於鹽梯度洗脱產物。獲得的部分借助於反相高磨 液相色譜（RP_HPLC)以及測定蛋白酹抑制的生物學活性試 驗進一步調查產物内含物。含併含產物的部分，直接装到 製備型RP-HPLC柱上。柱子預先用起始缓衝液進行平衡。 用有機溶劑梯度洗脱產物。獲得的部分再按上述方法調鲞 產物内含物，合併含有產物的部分。根據達到的產物純度 ，可能必須在第二個RP-HPLC柱上純化合併的部分。條件 基本上與上述條件相同。獲得的產物溶液用水稀釋，以用 於注射，分成適當的份數並冷凍乾燥。 可以與上述方法一起使用的、在中性pH不帶淨電荷的抑 肽酉每衍生物的其它純化方法是瓊脂糖-固定化胰蛋白縣親 和層析法以及凝膠滲透色譜法。 2.DesPro2~Serl〇-Argl5-Alal7-Asp24'Thr26-Glu31- Asn41-Glu53_抑肽鉍的純化 來自10升發酵的材料按照以下方法進行純化。在發酵完 成後，將發酵罐内含物用濃檸檬酸調至pH 3，並於70°C加 熱10分鐘。然後通過離心除去細胞（Heraeus離心機， 7500X g，15分鐘），過遽獲得的上清液（8-〇·2微米， Millipore，Germany)。上清液可以從該階段開始，於 - 18eC冷凍儲藏直至下一次使用。然後加入純水，將溶液 稀釋爲導電率低於8 mS/公分，裝到SP-瓊脂糖FF柱上 -23 - $^^度適财關家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） C请先閱讀背面之注意事項存填寫本貢〕

装·

480271 經濟部中央檩準局員工消費合作衽印製 A7 B7 五、發明説明（22) " 一

(Pharmacia, Sweden) 〇 拄子預先用 50 nM擰檬酸鹽-Na〇H 缓衝液pH 3平衡。用相同的缓衝液進行充分洗滌，除去未 結合的蛋白質。然後借助於鹽梯度（1M NaCl)洗脱產物。 獲得的部分借助於反相高壓液相色譜（RP-HPLC，C4)以及 蛋白f每抑制活性試驗調查產物内含物。合併那些含有所需 產物的部分。 然後將產物溶液直接裝到預先用0.1%三氟乙酸/水平衡 的第一RP-HPLC柱上（Source 15 RPC，Pharmacia，

Sweden)。用相同的缓衝液進行充分洗滌，除去未結合的 蛋白質。借助於線性乙騎梯度（0-70%)洗脱產物。獲得的 部分再用上述方法調查產物内含物，然後合併那些含有產 物的部分。 對於最後的純化，含有產物的溶液用水稀釋，以用於注 射，然後裝到預先用0.1%三氟乙酸/水平衡的第二RP-HPLC 柱上（Vyadc C8，Vydac，USA)。用相同的缓衝液進行充分 洗滌，除去未結合的蛋白質。然後借助於線性乙骑梯度（0 -70%)洗脱產物。獲得的部分用上述方法調查產物内含物 ，然後合併那些含有產物的部分。 獲得的產物溶液用水稀釋，以用於注射，分成適當的份 數（20、10、1和0.2毫克），凍乾並進行分析。 實施例5 使用〇65?厂〇-561"10-八115-八1317-八5口2411^26-011131 - Asn41-Glu53-抑肽S#進行的人類血漿激肽釋放鉍的Ki的 測定

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· -訂_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480271 A7 B7 五、發明説明（23) 實施例： 將1單位的人類血漿激肽釋放酹用缓衝液（〇.〇5MTris/ 〇·1 M NaCl，〇·〇5% Tween 20; pH 8·2)稀釋至16毫升0 在200微升該馘溶液加入體積逐級減少的試驗缓衝液（250 微升、240微升、230微升、220微升、200微升、180微升 、170微升、150微升、100微升和50微升）混合，然後增 加加入在分析缓衝液中的抑制劑量（10微升、20微升、30 微升、50微升、70微升、80微升、100微升、150微升、 200微升和250微升；濃度爲0.7微克/微升）。 將鉍/抑制劑溶液於室溫預保溫4小時。然後將180微 升的每種溶液加入微量滴定板的孔中，與20微升受質溶液 混合。於405nm測定10分鐘的吸收變化。測定鉍的反應速 率’由此按照Bieth的方法計算Ki値（Biochemical

Medicine 32:387-397 (1984))。 受質儲液：含〇·1Μ受質的DMS0 (二甲亞ί風） 受質溶液：含1χ1〇_3 MS-2302的分析緩衝液 分析缓衝液：〇·〇5Μ三（麟甲基）-胺基甲烷，〇·1Μ NaCl， 0.05% Tween 20; pH 8·2; 1 毫升苯甲醇/ 升 用同樣的步驟測定與g每血纖維蛋白溶西每因子XIa、牛胰 蛋白I每和胰凝乳蛋白I每絡合的動力學常數。血纖維蛋白溶 酉每的受質爲Chromozym PL，因子XI的受質爲HD-Pro-Phe-kg-pM ’胰蛋白酹的受質爲s-2444，而胰凝乳蛋白酹的 受質爲 Suc-phe-Leu-Phe-pNA。

本紙張尺度適用中國國家檩準Μ規格⑺Ο〆 Μ7公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·

、1T 480271 A7 ______B7 _· 五、發明説明（24)

實施例L

DesPro2^erl〇-Argl5-Alal7--Asp24"Thr26-Glu31-Asn4J^ 每蛋白質化學特徵化的結果 蛋白 I每抑制劑 DesPro2-Serl〇-Argl5_Alal7_Asp24 -

Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽醏通過基因工程修飾的酵 母生物體的分泌進行製備。由酵母上清液用各種色譜法純 化爲同質。用選殖的序列所進行的抑制劑的識别用以下蛋 白質分析研究來表明。 N-末端序^列分析 蛋白胃4抑制劑依超過57步驟作徹底的序列分析。以下序 列顯示出測定的蛋白質序列，與選殖的序列相同。

Arg-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Ser-Thr-Gly-Pro-Cys-Arg-Ala-Ala-Ile-Ile-Arg-Tyr- 變4/ 21

Phe-Tyr-Asp-AIa-Thr-Ala-Gly-Leu-Cys-Glu-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-GIy-Cys-Arg-Ala-

Asn-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Glu-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala

DesPro2-Serl〇-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn4卜Glu53-抑肽S每的序列分析超過57步驟。 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 胺基酸分析 胺基酸分析是蛋白質特徵化的重要的定量參數。除蛋白 質含量外，在已知一級結構的情況下，測定各個胺基酸的 數。DesPro2-Serl〇-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn4：l-Glu53-抑肽酹的胺基酸分析與來自一級結構的理論 -26 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 480271 A7 B7五、發明説明（25) 値（表1 )很好地吻合。 表1 DesPro2-Serl〇-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41_Glu53-抑肽絲的胺基酸分析。殘基數基於Ala=7。 胺基酸 殘基數 理論數

CysS03H 5.28 6 Asp 6.27 6 Thr 3.49 4 Ser 1.58 2 Glu 4.25 4 Gly 6.16 6 Ala 7.00 7 Val 0.98 1 Met 1.10 1 lie 1.66 2 Leu 1.89 2 Tyr 2.49 3 Phe 4.11 4 Lys 1.05 1 Arg 4.73 5 Pro 3.23 3

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 *)半胱胺酸和甲硫胺酸用甲酸氧化進行測定（Met表示甲 硫胺酸Ϊ風）。 反相色譜法 在化學結合的反相蛋白質HPLC色譜中，通過蛋白質的疏 水作用結合到所用的相上。隨結合到固定相的強度的不同 -27 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 480271 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（26) ，蛋白質被有機溶劑（移動相）取代。因此，該方法是評 價蛋白質純度的很好的判别準則。DesPro2-Serl〇-Argl5-八1&17^3?24-1'}^26-011131431141-011153-抑肽1每從1^-18 相中呈單峰洗脱出來。表明分離的蛋白j每抑制劑是純淨的 〇 CE色譜法 毛細電泳允許根據在電場中的電荷分離肽和蛋白質。在 這種情況下分離的品質取決於缓衝液、pH、溫度以及所用 的添加劑。所用的毛細管是所謂的"熔融矽石"柱，内徑爲 50-100aii^DesPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn4卜Glu53-抑肽鉍在電場中的"熔融矽石"柱上分 離。電泳圖譜顯示出一個窄峰。 分子量的測定

DesPro2-Serl〇-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn4卜Glu53-抑肽S每的分子量用MALDI技術測定爲6223道 爾頓。這樣，測定的分子量在測定方法精確度的範園内與 理論値6215道爾頓很好地地吻合。芥子酸用作基質。 SDS凝膠電泳 在還原和非還原條件下用SDS電泳分析〇63?1*〇2-361'10-Αι15-Α1&17-Α3ρ24_Τ1ΐΓ26-〇1ιι31-Α3η4Κ1ιι5〇-抑肽絲。 顯示的帶大约爲6.5 kD。 實施例7

DesPro2^Serl〇-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽蔣與縣絡合的Ki値的測定 _ 28 _ 丨_ (座土.·1 *· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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Enel·⑴ 480271— _________—· ! Ί u i 年月一Α7 —ί 載 1 I Β7 明說明（27.) ROC Patent Appln. No.86110514 A 」」中文說明書修正彙29頁-附件(一） Amended Page 29 of the Chinese Specification - (Amended & Submitted on May 11，2001 ) 測定各種酶的 DesPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thi:26_Glu31-Asn41-Ghi53_抑肽酶的抑制常數。表2顯示

Ki值。 表2 :

DesPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-

Asn41-Glu53-抑肽酶與酶及血漿激肽釋放酶、因子XIa、 牛胰凝乳蛋白酶和牛胰蛋白酶絡合的抑制常數。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 酶 Ki [Μ] 1 血漿激肽釋放酶 2Χ 10-11 血纖維蛋白溶酶 5 X 1〇-10 因子XIa 5 X 1〇-10 胰蛋白酶 2Χ ΙΟ'11 胰凝乳蛋白酶_1 1 9Χ 1〇-9 訂： -線

貫施例8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 查白酶抑制劑與多株免或人類抗抑肽醢抗體的相是作用 用重組方法製備的蛋白酶抑制劑多株兔或人類抗抑肤 酶抗體進一步研究其交叉反應。現已發現各種蛋白酶抑制 劑變異體與抑肽酶抗血清只顯示非常弱的相互作用。 簡單圖式說明 圖1說明根據本發明之抑肽酶變異體的實例。 -29t 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱)_2似(修) 480271 Α7 Β7 五、發明説明（28 序列表 ⑴一般資料 (i )申請者：

(A) 姓名：Bayer AG (B) 街道：Bayerwerk (C) 城市：Leverkusen (E) 國家：德國 (F) 郵政編碼：51368 (G) 電話：0214-3061455 (H) 電傳：0214-303482 (ii )發明名稱：具改良性質之抑肽S每變異體 (iii )序列數目：5 (iv)計算機可讀形式： (A) 媒體類型：軟碟 (B) 計算機：ibmopc相容

(C) 操作系統：PC-DOS/MS-DOS (D) 軟體：Patentln Release #1.0，Version #1·30Β (EPA) ⑵SEQ ID Ν0:1的資料： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (i)序列特性 (A) 長度：69個鹼基對 (B) 類型：核菩酸 (C) 鏈型：單鏈 (D)拓樸學：線形 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 480271 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（29) (ϋ )分子類型•·基因組DNA (ffi )假設：否 (iv )反意義：否 (vi )來源： (A)有機體：引子A / (xi)序列説明：SEQ ID NO: 1: '·、、'· GGCTGCAGAG CTAACCGTAA CAACTTCAAA TCCGCGGAAG'C ACTGCATGGA AACTTGCGGT 60 GGTGCTTAG 69 ⑵SEQ ID N0:2的資料 (i )序列特性 (A) 長度：93個鹼基對 (B) 類型：核菩酸 (C) 鏈型：單鏈 (D) 拓樸學：線形 (ii )分子類型：基因組DNA (iii )假設：否 (iv )反意義：否 (vi )來源： (A)有機體：引子B (xi)序列説明：SEQ ID N0:2: TGCCTCGAGC CGCCGTCTAC TGGGCCCTGC AGAGCTATCA TCCGTTACTT CTACGATGCA 60 ACTGCAGGCC TGTGTGAAAC CTTCGTATAC GGC 93 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝·

、1T

480271 A7 B7 五、發明説明（30 ) ⑵SEG ID N0:3的資料 (i )序列特性 (A) 長度：37個鹼基對 (B) 類型：核荅酸 (C) 鏈型：單鏈 (D) 拓樸學：線形 (ii )分子類型：基因組DNA (v )片斷類型：線性 (vi )來源： (A)有機體：引子C (xi)序列説明：SEQ ID N0:3: GGGATATCTA TTGATAAGAT TTAAAGGTAT TTGACAAG 38 ⑵SEQ ID N0:4的資料 (i )序列特性 (A) 長度：99個鹼基對 (B) 類型：核茌酸 (C) 鏈型：單鏈 (D) 拓樸學：線形 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (ii )分子類型：基因組DNA (iii )假設：否 (iv )反意義：否 (vi )來源： (A)有機體：引子D (xi)序列説明：SEQ ID N0:4: _ 〇〇 _ ‘蟒;/ - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 480271 A7 B7 五、發明説明（31 ) GGGCTCGAGG CAGAAATCTG GTCTAGCCAA AGCAGAAGAA GCAGCGAACA AGACAGCAGT GAAAATAGAT GGAATCTCAT TCTTTTAATC GTTTATATT ⑵SEQ ID N0:5的資料 (i )序列特性 60 99 57個胺基酸 胺基酸 單鏈 (A) 長度： (B) 類型： (C) 鏈型： (D) 拓樸學：線形 (a )分子類型：肽 (V )片斷類型：線性 (vi )來源： (A)有機體：抑肽酹變異體 (xi)序列説明：SEQ ID N0:5: (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝·

、tT 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Arg AJa Ala 15 10 !5 lie lie Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe 20 25 30 Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu 35 40 45 Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Aia 50 55

線_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

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   Α8 Β8 t 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 專利申請案第86110514號 ROC Patent Appln. No.86110514 修正之申請專利範圍+文本-附件(二） Amended Claims in Chinese - Encl.(II) + (民國90年5月·1 ~~日送呈） (Submitted on May 11 , 2001 ) 1.抑肽酶(aprotinin)變異體，其選自：〇68?1*〇2-861*10-心815-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Serl0-Argl5-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、 DesPro2-Serl 0-Arg 15-Ser 17-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-抑肽酶、DesPro2-Serl0-Arg 15-Ala 17-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Serl0-Argl5-Alal7_Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-抑肽酶、Ser 10-Arg 15_Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、861<10_^815_八8?24-111126-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、SerlO_Argl5_Serl7_Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、Serl0-Argl5-Alal7-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶和 Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-抑肽酶。 2·—種用於手術中減少血液損失及用於多重損傷、休克及 炎症之醫藥組成物，其包含一種或多種根據申請專利範 圍第1項之抑肽酶變異體。 -34 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 86324B(9BAYBR) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .9 -線