UA55380C2 - Варіант апротиніну з покращеними властивостями - Google Patents
Варіант апротиніну з покращеними властивостями Download PDFInfo
- Publication number
- UA55380C2 UA55380C2 UA97073949A UA97073949A UA55380C2 UA 55380 C2 UA55380 C2 UA 55380C2 UA 97073949 A UA97073949 A UA 97073949A UA 97073949 A UA97073949 A UA 97073949A UA 55380 C2 UA55380 C2 UA 55380C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- aprotinin
- sequence
- solution
- buffer
- vector
- Prior art date
Links
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 title claims abstract description 76
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 title claims abstract description 68
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims description 3
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 7
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 4
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 4
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 4
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 239000008207 working material Substances 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- 108090000113 Plasma Kallikrein Proteins 0.000 description 3
- 102000003827 Plasma Kallikrein Human genes 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 2
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 2
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 2
- 241001190694 Muda Species 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N sinapic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 2
- PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N sinapinic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- MYVIATVLJGTBFV-UHFFFAOYSA-M thiamine(1+) chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N MYVIATVLJGTBFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 3-(3-aminophenyl)sulfonylaniline Chemical compound NC1=CC=CC(S(=O)(=O)C=2C=C(N)C=CC=2)=C1 LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150101112 7 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000921522 Bos taurus Cytochrome c Proteins 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102400000967 Bradykinin Human genes 0.000 description 1
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- 101710132360 Kunitz-type serine protease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 244000208060 Lawsonia inermis Species 0.000 description 1
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 208000004221 Multiple Trauma Diseases 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 244000004005 Nypa fruticans Species 0.000 description 1
- 235000005305 Nypa fruticans Nutrition 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000181331 Saron Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000012443 analytical study Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N lufenuron Chemical compound C1=C(Cl)C(OC(F)(F)C(C(F)(F)F)F)=CC(Cl)=C1NC(=O)NC(=O)C1=C(F)C=CC=C1F PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N melittin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002742 methionines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004172 pyridoxine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013606 secretion vector Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 229940108519 trasylol Drugs 0.000 description 1
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
- C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Винахід стосується варіанту апротиніну з покращеними фермент-інгібіторними, імунологічними та фармакологічними властивостями.
Description
Даний винахід стосується варіантів апротиніну, що є кращими інгібіторами ферментів, мають поліпшені імунологічні та фармакокінетичні властивості.
Апротинін, який також позначається як інгібітор трипсину підшлункової залози бика (ВРТІ), відноситься до родини інгібіторів серинових протеаз типу Кунітца. Спектр серинових протеаз, що піддаються інгібуванню,- включає, наприклад, трипсин, хімотрипсин, плазмін та калікреїн плазми ((М/.«зернага, Н.Те5спезспе, Н.Е
Ргоївїпазе Іппіріюгв5, Ваїтеїї апа Заїмезеп (єдв.), ЕІівемієг Зсіепсе Рибі. ВМ 375-387, 1986).
Апротинін складається з 58 амінокислот. Тривимірна структура білка була встановлена за допомогою рентгеноструктурного аналізу та ЯМР-спектроскопії (У/Лодамег еї аї., 9У.Мої. Віо!. 198(3), 469-480, 1987; М/адпег єї а!., У. Мої. Вісі. 196 (1), 227-231, 1987; Ветаї еї а!., Віоспетівзігу 32 (17), 4564-4570, 1993).
Під торговою назвою Трасилол?оО природний апротинін давно використовується для лікування панкреатиту.
Зараз ТрасилолФб використовується при серцевій хірургії, після того, як клінічні дослідження показали, що обробка апротиніном суттєво знижує потребу у переливанні крові при подібних операціях та приводить до зменшення вторинних кровотеч (О0.Ноузіоп, у. СагаііїНогас. Мазе. Апезій. 6; 76-100, 1992).
Вдалось показати, що заміна амінокислоти, яка відповідає за специфічність інгібування, у положенні 15 приводить до одержання цінних варіантів апротиніну з поліпшеними інігібіторними властивостями (патент ФРН З 339 693). В залежності від введеної амінокислоти можна, таким чином, одержати активні інгібітори, які, наприклад, інгібують еластазу підшлункової залози або лейкоцитів.
Далі було показано, що інгібіторні властивості апротиніну та одержаних при заміні у положенні 15 варіантів визначаються також іншими амінокислотами у місці контакту цільової протеази, що піддається інгібуванню, та молекули інгібітора. Сюди відносяться, перш за все додаткові амінокислотні залишки у положеннях 14, 16, 17, 18, 19, 34, 38 та 39. Варіанти апротиніну з поліпшеними властивостями, одержані в результаті заміни одного або декількох з цих амінокислотних залишків в області контакту, були серед інших описані, наприклад, у наступних матеріалах: міжнародна заявка на патент 89/01968, міжнародна заявка на патент 89/10374, заявка на європейський патент 0307592, заявка на європейський патент 683 229.
Цікавим способом могли бути поліпшені фармакокінетичні властивості апротиніну та його варіантів шляхом заміни амінокислот, що визначають фізико-хімічні властивості речовини. Так, вдалося шляхом зниження загального позитивного заряду молекули значно зменшити зв'язування нирками. Такі варіанти були описані у міжнародній заявці на патент 92/06111.
Базуючись на поліпшених технічних можливостях одержання, вигідно в окремих випадках проводити модифікацію М-кінця молекули інгібітора. Такі модифікації можуть вкорочувати М-кінці або подовжувати їх, або приводити до видалення однієї або декількох амінокислот. Модифіковані по М-кінцю варіанти апротиніну були описані у європейському патенті 419 878.
Задачею винаходу є одержання варіанта апротиніну з поліпшеними властивостями. Задача вирішується запропонованим варіантом апротиніну з сумарним зарядом від «3 до -3 при рН 7 та з амінокислотами Агд15 або
Аг915-Аїа17 на ділянці зв'язування.
Бажано, щоб варіант апротиніну використовували для інгібування серинових протеаз.
Бажано, щоб варіант апротиніну мав змінену М-кінцеву послідовність та подовження або вкоречення на М- кінці, або подовжені амінокислоти на М-кінці.
Амінокислотна послідовність, наприклад, для деяких варіантів апротиніну представлена на фіг. 1.
Задача також вирішується запропонованим варінатом апротиніну, що вибирається з групи дез-Рго2-5ег10-
Ага15-АІа17-Азр24-Тнг26-С1и31-А5п41-сС1и53-апротиніну, дез-Рго2-зег10-Аг915-Азр24-Тпг26-С1и31-А5па41-сС1и53- апротиніну, дез-Рго2-Зе10-Ага15-5е117-Азр24-Тнг26-С1и31-А5п41-сС1и53-апротиніну, дез-Рго2-зег10-Аг915-АЇіа17-
Тнг26-С1и31-Авп41-Стіи5З-апротиніну, дез-Рго2-Вег10-Аг915-АІа17-Авзр24-Тпг26-Азп41-сС1и53-апротиніну, Зег10-
Ага15-АІіа17-Азр24-Тнг26-С1и31-А5п41 -СіибЗ-апротиніну, Зег10-Аг915-Азр24-Тнг26-с1и31-Авп41-С1и53- апротиніну, Зег10-Агд15-5ег17-Авр2г4-Тнг26-С1и31-А5п41-(3І053-апротиніну, Зег10-Агд15-Аїа! 7-Тпг26-С1И31 -
Авп41-сС1и53-апротиніну, Зег10-Агд15-АІа17-Азр24-Тпг26-Азп41-С1и53-апротиніну.
Ці варіанти апротиніну можуть також мати амінокислоту пролін у положенні 2.
Варіанти апротиніну згідно з винаходом, проте, не обмежуються вказаними на фіг. 1 прикладами. До варіантів апротиніну згідно з винаходом відносяться також варіанти з подовженням на М-кінці АІа(2)-С1Іп(-1), з залишком природної амінокислоти проліну у положенні 2, з заміною інших амінокислот, які мають позитивний заряд по відношенню до нейтральних або тих, що несуть негативний заряд, амінокислотним залишкам, або з заміною інших нейтральних амінокислот по відношенню до негативно заряджених амінокислотних залишків. Вибір заміни амінокислотних залишків здійснюють при цьому згідно з таким принципом, щоб одержана речовина мала при фізіологічному значенні рН зменшений сумарний позитивний заряд, бажано в області від 2 до -2. Згадані зміни в амінокислотній послідовності, включаючи подовження або вкорочення, або видалення М-кінця, можуть використовуватись у будь-яких комбінаціях одна з одною. До варіантів апротиніну згідно з винаходом відносяться, таким чином, усі сполуки, для яких характерна комбінація згаданих вище ознак, та які мають при фізіологічному значенні рН знижений загальний позитивний заряд.
Варіанти апротиніну мають наступні ознаки: 1. Заміна однієї або декількох амінокислот в активному центрі молекули для підвищення активності. 2. Заміна амінокислот для зниження загального позитивного заряду з метою поліпшення імунологічних та фармакокінетичних властивостей.
З. Модифікація М-кінцевої амінокислотної послідовності на основі технічних можливостей одержання.
Несподівано було виявлено, що комбінація двох або трьох згаданих вище ознак приводить не тільки до одержання, але навіть до посилення чітко виражених окремих ознак. У доповнення до цього можуть виявлятись нові властивості речовин, що, наприклад, відносяться до імунологічних, фармакокінетичних або поверхневих властивостей сполук. Нові варіанти виявляють знижену реактивність по відношенню до поліклональних людських та кролячих антисироваток, які одержували при використанні апротиніну. Далі було знайдено, що нові варіанти поводять себе як менш активні імуногени у порівнянні з апротиніном, тобто вони викликають знижену імунну відповідь. Далі було показано, що варінати згідно з винаходом індукують незначне вивільнення гістаміну з клітин крові. Далі нові варіанти чітко показали незначне акумулювання у нирках у порівнянні з апротиніном. Кінетичні константи інгібування ферменту (значення Кі) несподівано були поліпшені, незважаючи на велику кількість змін у молекулі по відношенню до первинних варіантів молекули. Бажані такі, що мають загальний заряд від 2 до -2, особливо бажані ті, що мають заряд від «1 до -1.
Описані нові інгібітори протеїназ придатні для лікування хворобливих станів, при яких, а також в результаті комплексних хірургічних операцій, як, наприклад, при хірургії серця або алоартропластичній заміні суставів у трансплантаційній медицині, це є прийнятним також для активування плазматичних ферментних систем завдяки тривалому або інтенсивному контакту крові з чужерідними поверхнями.
Інгібітори знижують втрату крові при операціях, пов'язаних з підвищеним ризиком кровотечі (наприклад, операції на серці, хірургія кісток та суставів). Вони прийнятні для терапії при шоку, множинних травмах та черепно-мозкових травмах, сепсисі, дессимінованій внутрішньосудинній коагулопатії, ураженнях багатьох органів, запальних захворюваннях за участю системи калікреїну, як наприклад, захворювання суглобів, та при астмі. Вони запобігають інвазійному росту пухлин та метастазуванню внаслідок інгібування плазміну. Вони також придатні для терапії болей та набряків, завдяки інгібуванню синтезу брадикініну, а також для лікування інсультів.
Вони також корисні при терапії діалізом та при штучних органах для запобігання запаленням та коагуляції, а також для зменшення ризику кровотечі. Для одержання варіантів апротиніну згідно з винаходом зручно використовувати способи генетичної інженерії Для цього за допомогою загальноприйнятих молекулярнобіологічних способів вводять у прийнятний мікробний експресійний організм генноінженерну інформацію для синтезу у кожному окремому випадку варіантів апротиніну, що розглядаються. Рекомбінантний мікроорганізм піддають ферментації; шляхом вибору прийнятних умов вводять гетерологічну спадкову інформацію для експресії. Експресовані варіанти апротиніну одержують після закінчення з культурального середовища.
Прийнятні організми-хазяї для продукування варіантів апротиніну згідно з винаходом можуть бути бактеріями, дріжджами або грибами. Експресія може відбуватися внутрішньоклітинно або поза клітиною при використанні прийнятних секреторних систем. Варінати апротиніну можуть бути при правильно процесовані або злиті у пептидах або білках.
Прийнятні системи для експресії варіантів апротиніну були описані в заявці на європейський патент 683 229, в міжнародних заявках на патент 89/02463, 90/10075 та в різних інших патентних заявках, що були згадані раніше.
Способи виконання винаходу
Ферменти
Ферменти, що використовували (рестрикційні ендонуклеази, лужні фосфатази з кишечника теляти, полінуклеотидкіназа фага Т4 та ДНК-лігаза фага Т4), були одержані від фірм Бьорінгер Маннхайм та Гібко,
Бразилія, їх використовували згідно з інструкціями виробника.
Молекулярнобіологічні методики
Звичайні операції клонування, як наприклад, виділення плазмідної ДНК з Е.соїї (так звана мініпідготовка) та трансформацію Е.соїї за допомогою плазмідної ДНК здійснювали по Затрьгоок та інш. (Молекулярне клонування,
Колд Спрінг, Харбор, 1989). Як організм-хазяїн для трансформації виводили штам ОНб5ба бактерій Ес.соїї (Гібко,
Бразилія). Для виділення великої кількості плазмідної ДНК використовували Оіадеп-кінці (Оіадеп). Екстракцію фрагментів ДНК з агарозних гелів проводили за допомогою струменевої сорбції згідно з вказівками виробника (Геномед).
Олігонуклеотиди для експериментів з сайт-специфічним мутагенезом та праймер для полімеразної ланцюгової реакції та реакції секвенування були одержані за допомогою "ДНК-синтезатора 380 А" фірми Еплайд
Байєсістемс. Дослідження мутагенезу проводили за способом Оепд та Міскоїюй (Оепао та інш., Апаї. Віоспет. 200, 81-88,1992) при використанні набору фірми Фармація Байєтек (,Унікальний сайт-елімінаційний мутагенез"). Усі векторні конструкції та експерименти по мутагенезу були підтверджені за допомогою циклу секвенування ДНК Тад з використанням термінаторів з флуоресцентною міткою на секвенаторі АВІ 373А (Еплайд Байесистемс).
Трансформація Засспаготусез сегемівіає
Клітини дріжджів, наприклад, штаму УС34.40 (МАТа, игаЗ3-52, зис2) вносили в 10мл МЕРО (295 глюкоза; 290 пептин; 195 дріжджовий екстракт Оіїсо) та одержували значення оптичної густини від 0,16 до 0,8 при боООнм.
Клітини промивали 5мл розчину А (1М сорбіт, 10 мМ біцин, рН 8,35; 395 етиленгліколь) повторно суспендували у
О,2мл розчину А та витримували при -7020.
Плазмідну ДНК (5 мкг) та носій ДНК (50 мкг ДНК із сперми оселедця) додають до заморожених клітин. Потім клітини шляхом струшування протягом 5 хвилин розморожують при температурі 37"С. Після додавання 1,5мл розчину В (4095 РЕС 1000; 200мМ біцин рН 8,35) клітини протягом 60 хвилин інкубують при температурі 30"С, промивають 1,5мл розчину С (0,15 М Масі; 10мМ біцин, рН 8,35) і ресуспендують в 100мкл розчину С. Посів здійснюють на селективному середовищі, що містить 295-ний агар. Трансформанти одержують після інкубування протягом З діб при 302С.
Живильні середовища для ферментації 1. Середовище 502:
Васю Уеаві Мігодеп Вазе б, 7г/л
Глюкоза" 20г/л
КНгРО»Х б, 7г/л рнб,о 2. Середовище 505:
Глюкоза" 20г/л
Дріжджовий екстракт Осо 20г/л
КНгРО»Х б,7г/л
(МНа»БОА 2,Ог/л
Ма5о»х х 7 НгО 1,Ог/л
Розчин мікроелементів 51 4 1,Омл/л рне,о
Мікроелементиий розчин 51 4:
Тігіріех ПІ бг/л
РебОх х 7 Н2гО 2г/л 7п504х7 НО О,1г/л
Мпсіг х 4 Н2О 0,ОЗг/л
НзВОз О,Зг/л
СоСіг х 6 НгО О,2г/л
СиСігх2 НО 0,О1г/л
МіСі» х 6 НгО О,02г/л
Маг2Мосх х 2Н20 0,ОЗг/л х є автоклавують окремо 3. Ферментативне середовище:
Глюкоза" 2,Ог/л
Соєвий пептон 25г/л
КНегРОх 1,4г/л
Ма5ох х 7 НгО 1,Ог/л
Тіамін хлорид 5,1мг/л
Інозит 2Омг/л
Мікроелементний розчин З,Омл/л
Вітамінний розчин З,Омл/л (МНа»БОА 2,Ог/л рноь,5
Живильний розчин:
Глюкоза" 530г/л (МНао2г504 5,Ог/л
КНегРОх 2,9г/л
Ма5ох х 7 НгО З,вг/л
Тіамінхлорид 1Змг/л
Інозит 7Омг/л
Розчин мікроелементів б,вмл/л
Розчин вітамінів б,вмл/л
Розчин мікроелементів:
ГРесіз х б НгО 13,5г/л 7пСігх4 НО 2г/п
НзВОз О,5г/л
СоСіг х 6 НгО 2,0г/л
Сбибол х 5 НгО0 1,9г/л
МагМода х 2 НгО 1,0г/л
НОЇ конц. 100мл х є автоклавують окремо
Вітамінний розчин:
Рибофлавін 0,42г/л
Са-пантотенат 5,9г/л
Нікотинова кислота б. 1г/л
Гідрохлорид піридоксину 1,7 г/л
Біотин О,Обг/л
Фолієва кислота О,04г/л
Приготування консервованих робочих матеріалів 200мл середовища 502 в колбі Ерленмейєра на 1 літр інокулюють консервованим робочим матеріалом до концентрації 195. Культуру протягом 72 годин інкубують при 28"С при струшуванні (260об/хв). Потім по 2мл наливають в контейнери для консервування і заморожують рідким азотом.
Ферментація в колбах для струшування
Як попередню культуру 200мл середовища 502 в 1-літровій колбі інокулюють консервованим робочим матеріалом і протягом 72 годин ферментують при струшуванні (260об/хв). Використовуючи попередню культуру, основні культури (200мл середовища 505 в 11 пробірках) інокулювали до концентрації 195 і протягом 72-96 годин інкубують при 28"С при струшуванні.
Ферментація в 10-лігровому біореакторі
Як попередню культуру 200мл середовища 502 в 1-літровій колбі інокулюють консервованим робочим матеріалом і протягом 72 годин ферментують при струшуванні (260об/хв). Основна культура в 10-літровому ферментаторі піддається «Іеа-ьаІсп»-ферментації протягом 96 годин. Як живильне середовище використовують ферментативне середовище, початковий об'єм якого становить 7л. Ферментатор інокулюють 200 мілілітрами попередньої культури.
Умови ферментації
Температура: 2876
Швидкість обертання мішалки: 5Обоб/хв
Вентиляція: ТОл/хв рн: 5,5
Тиск в головці: 200мбар
Після 7 годин ферментування починають підживлення. Швидкість підживлення регулюють за респіраторним коефіцієнтом (Незрігаюгівспе Оцойепі - ВО - утворений СОг/спожитий кисень). Якщо значення КО стає більшим, ніж 1,15, швидкість підживлення зменшують, якщо значення НО стає меншим, ніж 1,05, швидкість підживлення підвищують.
Через однакові проміжки часу беруть проби із ферментатора і шляхом вимірювання оптичної густини при 700Онм визначають ріст клітин. Крім того, шляхом вимірювання активності визначають концентрацію Вау 19-8757 у надосадовій рідині.
Після закінченні ферментації значення рН знижують до 3,0 додаванням 5095 (вага/об"єм) лимонної кислоти і ферментатор протягом 10 хвилин нагрівають при 70"С. Потім клітини відокремлюють шляхом центрифугування при 75004 і надосадову рідину подають на очистку білка.
Матеріали для хімічного аналізу білків
Аналіз послідовностей здійснювався за допомогою білкового секвентора моделі 473А фірми Арріїєй
Віозузієт5 (м. Форстер-Сіті, США). Використовувалась стандартна програма секвенування. Секвентор, різні програми секвенування, а також РТН-система детектування докладно описані в інструкції користувача (О5егв5 тапциаї ргоїєїп зедоєпсіпд зузієт тоде! 473А) (1989) Арріїєа Віозувієтв Еогзієг Спу, СА 94404, ОБА).
Реагенти для роботи секвентора та хроматографічні колонки для РТН детектування постачаються фірмою
Арріїєа Віозувіетв.
Аналіз за допомогою рідинної хроматографії під високим тиском (НРІ С) здійснювався НРІ С-системою НР 1090 фірми Немеїй Раскага (0-МаідьЬгопп). Для відокремлення застосовувалась НРІ С-колонка АР-18 (250мм х 4 бмм, 5-мікронний матеріал, діаметр пор 300 Ангстрем) ВасКегтопа (О-Сго55 (зегац).
Використовувалась установка для капілярного електрофорезу моделі 270 А-НТ фірми Арріїєа Віозузіет5 (Богзієї Сйу, СА 94404, БА). Проби вводились, як правило, гідродинамічно через різні проміжки часу.
Використовувалась капілярна колонка (50мкм х 72см) фірми Арріїєа Віозувзієтв.
Аналіз амінокислот здійснювався аналізатором 13000 фірми Еррепадог Віоїгопік (О-Маїпіаї).
Використовувалась легко модифікована стандартна програма розділення від Віоїгопік. Програма розділення та робота аналізатора вичерпно описані в довіднику до приладу.
Молекулярна вага визначалась за допомогою системи МАГОЇ | фірми Кгаз/5пПітааги (О-Юцізриго). 505- електрофорез здійснювався за допомогою електрофорезної системи фірми Ріпапгтасіа (О-Егеїрига).
Визначення кінетичних параметрів здійснювалось за допомогою зчитувача для мікротитрувальних планшетів фірми 5І Т (0-Стеїзпеіт). Промивання мікротитрувальних планшетів здійснювалось за допомогою промивного апарату фірми Супагес (О-Оепкепаоп).
Використовувались ферменти та живильні середовища фірми СаІріоспет (0-Вай бодеп). Всі інші хімікати та реагенти постачались фірмою Мегек (О-Оаптвіаді) або фірмою бідта (О-Оєїзеппоїеп). Планшети на 96 комірок були від фірми Стгеїпег.
Поліклональні анти-апротинінантитіла кроликів одержувались в кроликах шляхом імунізації апротиніном.
Поліклональні анти-апротинінантитіла людини походять від пацієнтів, що лікуються апротиніном.
Хімічний аналіз білків
Аналіз М-термінальних кінців 1-Знмоль розчиненого у воді інгібітора протеаз завантажують на пластину секвентора, попередньо інкубовану полібреном. Протеїн секвенують з майже нормальним циклом. РТН-амінокислоти ідентифікують шляхом безпосередньої хроматографії за допомогою 50 пмоль РТН-стандарту.
Аналіз амінокислот 200мкг протеїну розчиняли в 200мкл 6М НС і протягом 1 години гідролізують при температурі 16670. Близько
ТІнмоль проби подають на аналізатор амінокислот. Кількість амінокислоти визначають за допомогою З5нмоль стандарту. 5О5-електрофорез 5ОБ-електрофорез здійснюють за умовами Лемлі (ІГаєттії). 7Омкг інгібітора протеаз аналізують за допомогою 10-20-процентного 505-гелю і проявляють за допомогою фарбування сріблом (Мерріл (Мегтії) та інші).
ЦК. Саеттії, Машге 227, 680-685 (1970).
С.В. Ме!тії, М.І. Оипац, О. Соідтапп, Апаї. Віоспет. 100: 201-207 (1981).
Капілярний електрофорез анг інгібітора протеаз досліджують за допомогою капілярного електрофорезу на скляній колонці (довжина 72см, внутрішній діаметр 50мкм). Умови: сила струму 90мкА, температура колонки 257"С, 100нМ фосфатний буфер рнН3З,0, детектування при довжині хвилі 210нм, подача під тиском протягом Зсек.
Хроматографія зі зворотною фазою 5нмоль інгібітора протеаз піддають хроматографії на НРІ С-колонці АР-18 (250мм х 4,бмм, 5-мікронний матеріал, діаметр пор 300 Ангстрем) фірми ВасКегропа. Як елюент використовують градієнт ацетонітрил/ТЕА.
Умови: потік 0,7мл/хв, температура колонки 40"С, детектування 40"С, розчинник А: 0,195 ТЕА, розчинник В: 0,190
ТЕА/60595 ацетонітрил; градієнт: Охв. 095 В, 10 хв. 090 В, 7Охв. 100905 В, 8Охв. 0958.
Визначення молекулярної ваги 1мкг інгібітора протеаз аналізують системою МАЇ І. Як матрикс використовують синапінову кислоту. Як стандартні білки для калібрування маси використовують бичачий інсулін, цитохром С та меліттин.
Вміст протеїну
Вміст протеїну визначають ВСА-методом. При цьому методі наявними протеїнами здійснюється перетворення іонів С2: в іони С», які з біцинхоніновою кислотою утворюють комплекс, що має поглинання при
56бонм.
Ліофілізований протеїн доводять до рівноважної вологості і в концентрації 1мг/мл розчиняють в 0,995 розчині
Масі. Готують ряд розведень. До 50мкл розчину зразка додають 1000мкл ВСА-тест-реагента, реакційну трубочку щільно закривають пробкою і точно 30 хвилин інкубують при 60"С. Після охолодження зразків на льодяній бані протягом 5 хвилин здійснюють вимірювання при температурі 257С та довжині хвилі 56бОнм.
Активність: (тест на гальмування трипсину, титрометричний)
Активність визначають модифікованим Р.І.Р.-тестом гальмування трипсину. Вау у 19-8757 гальмує каталізований трипсином гідроліз Ма-бензоїл-І-аргінінетилового ефіру (ВАЕЕ). Карбонільні групи, що звільняються при реакції, визначають шляхом лужного титрування. Залишкова активність трипсину є мірою інгібіторної активності тестованої речовини.
Ліофілізований білок доводять до рівноважної вологості і в концентрації тмг/мл розчиняють в 0,995 розчині
Масі. Готують ряд розведень. До їмл розчину зразка додають 2мл буфера (15мМ боратного буфера, рН 8,0 з 200мМ Сасі») та 0, вмл розчину трипсину (2мг/мл) і інкубують 5 хвилин при 25"С. На закінчення додають 0,2мл розчину ВАЕЕ (6 8мг/мл) і через 5 хвилин вимірюють споживання КОН.
Визначення перехресної реакції інгібіторів протеаз з поліклональними анти-апротинінантитілами кроликів та людини. 0,5-1Онг інгібітора протеаз або апротиніну, розчиненого в буфері зв'язування, протягом ночі звхязують на мікротитрувальному планшеті при температурі 4"С. Комірки чотири рази промивають кожного разу 200 мікролітрами промивного буфера, а потім додають 100мкл розчину для блокування. Планшет накривають і протягом години інкубують при 37"С. Після промивання описаним вище чином додають поліклональні анти- апротинінантитіла кролика (0,2мкл/мл в 195 В5А в РВ5-буфері) або поліклональні антитіла людини (20мкл/мл в 196 НБА в РВ5-буфері). Планшет накривають і протягом години інкубують при 37"С, а потім промивають описаним вище чином. Потім додають 100мкл біотинільованих анти-антитіл кролика чи людини (25мкл.- 10мл 190
ВЗА чи 195 НБА в РВ5-буфері) і протягом години інкубують при 37"С. Пластинку промивають описаним вище чином і до кожного заглиблення додають 100 мклстрептавідіно-пероксидазного комплексу (50мкл. 10мл 195 ВБА чи 195 Н5А в РВ5-буфері). Планшет накривають і годину інкубують при 37"С, а потім промивають описаним вище чином.
Субстратну реакцію здійснюють за допомогою ТМВ-субстрату т розчину пероксидази (1-1; 100 мкл на кожну комірку). Реакцію припиняють через 10 хвилин 2М фосфорною кислотою (100 мкл/комірку) і вимірюють абсорбцію при 450 нм (еталон 57Онм).
Розчини: 1. Інкубаційний буфер: 15нМ Ма2СОо3, З5нмМ Ммансоз, рно,б 2. Буфери для зразків: Проби розчиняють в потрібній концентрації в інкубаційному буфері. 3. Промивний розчин: 0,195 (об'єм/об'єм) Тмееп-20 в РВ5 4. Розчин для 395 (вага/об'єм) ВЗА або Н5БА в РВ5 блокування:
Приклади
Приклад 1
Одержання вектора експресії дріжджів для секреції рекомбінантного апротиніну ОезРго2-Зе/10-Ага15-АЇа17-
Аврг24-Тпг26-с11и31-Авп41-с1и53
Вихідним матеріалом для одержання гена апротиніну ОезРго2-5Зег10-Агу 15-АІа17-Азр24-Тпг26-с1и31-Авпа1-
Ссійи53 служить ген ЮезРго2-Агд15-АІа!7, через рестрикційні ферменти Ніпа!Ш та Ватні клонований у вектор рист18. Результуючий вектор (рЕМб.61) піддають реакції дволанцюгового мутагенезу за допомогою мутагенного праймера А та селекційного праймера 5са|/Міш! методом Ш.5.Е. (Рпаптасіа Віоїесі). Мутагенний праймер А має таку послідовність:
Праймер А
ГастасСАаАаСТААССаТтААСАСТТСАААТоСасСсааААаАСТасСсАТавАААСТІ аСОСТастТасттАа 3". Цей праймер генерує мутації Азп41 С1Іи53 в гені апротиніну ОезРго2-Агод15-АІа17. Аналіз клону здійснюють шляхом рестрикційного перетравлювання ферментами бєа! та 5рпїЇ. Крім того, бажану послідовність підтверджують секвенуванням ДНК клону рЕМЗ1.8.І. Подальші заміни в області 5і гена (Зег10-Азр24-Тиг26-С1и31) здійснюють за допомогою технології ПЛР із застосуванням праймера В та "зворотного 24-тег М 13" праймера, виходячи із рЕМЗ3З1.8.Ї плазмідної ДНК.
Праймер В вгтасстоесвлдассесСсатстТАСстТаваСССстТасСсАаАаСтТАТСАТОССОТТАСТ
ТСТАСОАТаСААСТОСАСОИССТататаАААССТТСИ,ТАТАССЯИС 3".
Послідовність впізнання Хної підкреслена.
Набір ПЛР містить 20нг рЕМЗ1.8.Ї плазмідної ДНК, 20пмоль зворотного 24-тег М13 праймера, бОпмоль праймера В, 200мкМ амтТР», 1 х ПЛР реакційного буфера І! (Реїкіп ЕІтег), 4мМ МасСі» та 2,5 одиниці Тад ДНК полімерази (Регкіп ЕІтег) в загальному об'ємі 100мкл. Умови циклування були такими: інкубування Зхв. при 942С,
ЗО циклів по їхв. при 94"С, їхв. при 55"С та їхв. при 72"С і заключні 5хв. при 72"С. Набір ПЛР розводять у співвідношенні 1:5 і лігують з вектором рені! (Інвітроджен). Використовуючи лігаційну суміш трансформують клітини Е. соїї ЮОНба. Позитивні клони після рестрикційного перетравлювання ферментами ХпоЇ та Ватні ідентифікують і секвенують кілька клонів. Клон рЕ59.10.Ї містить бажану послідовність і використовується для подальшої роботи.
Човниковий вектор Е.соїї/дріжджі (наприклад, рАг202) використовують для конструкції секреторного вектора дріжджів, в якому послідовність апроти-ніну ОезРго2-5ег10-Аго915-АіІа17-Авзр24-Тпг26-С1и31-А5п41-С1|и53 зв'язана з пре-про-послідовністю альфа-фактору дріжджів.
Вектор рА2гО2 несе ген стійкості до ампіциліну (Біа) та ген ОВАЗ як селектований мічений ген для Б.соїї та дріжджів. Подальшими суттєвими елементами вектора є Сої Е1 та 2 ц початкової точки реплікації (огі). Місце
ВЕРЗ також знаходиться в цій області. Фрагмент ЕсоВіІ-Ніпац розміром 1200 пар основ несе промотор МЕ та М- кінцеву пре-про-послідовність альфа-фактора білка-посередника дріжджів (Кигіап, НегеКом/їг, Сеї! 30, 933-943,
1982). Шляхом введення модифікованого апротиніну ОезРго2-Аг915 сДНК як фрагменту Ніпашп-Ватні, відновлюється розпізнавальна позиція для Кехії-протеази (Тувз-Агу) всередині пре-про-послідовності альфа- фактора (ЕР 0 419 878).
На 3--кінці послідовності апротиніну ОезРго2-Аг915 вектор несе фрагмент Ватні-заї! гена ОВАЗ дріжджів, що в цій позиції функціонує як сигнал закінчення для транскрипції (Магдег єї а!., Мої. Сеї!. Вісі. 6,1095-1101, 1986).
Фрагмент ДНК розміром 180 пар основ за допомогою Хпо!Ї та Ватні вирізають із вектора рЕ59.10.1 , очищають електрофорезом на агарозному гелі і клонують в також розрізаний за допомогою ХпоЇ! та Ватні вектор рАг202 та дефосфорилюють. Шляхом такого клонування апротинін ОезРго2-Аг915 у векторі рА202 замінюють апротиніном ОеєвзРго2-5ег10-Аго15-АЇІа17-Азр24-Тпг26-Сі031 -Авп41-С251053. Клітини дріжджів (УС34.40) трансформують вектором рЕ513.10.Ї, одержаним в результаті цього клонування.
Інші човникові вектори Е. соїї/дріжджі з різними промоторами, наприклад, конститутивним САРОН або індукованим САЇ. 10 промоторами, можуть бути одержані таким же чином і також ведуть до секреції апротиніну
ОевзРго2-5ег10-Ага15-АЇІа17-Азр24-Тпг26-С1и31 -Азп41 -С1и53.
Зрозуміло, що поряд з цим можна також використовувати човникові вектори з іншим походженням реплікації дріжджів, наприклад, сегмент, що реплікується автономно (агв).
Придатними селективними маркерними генами поряд із геном ОНАЗ є також гени, які сприяють ауксотрофним мутантам дріжджів для прототрофи, такі, наприклад, як ГЕШ2г, НІЗЗ або ТАРІ. Крім того, можуть бути використані також гени, продукти яких визначають стійкість до різних антибіотиків, наприклад, до аміноглікозиду (3418.
Інші дріжджі, наприклад, метилотрофні дріжджі Ріспіа равіогіз або Напзепша роїутогрпа, після трансформації придатними векторами також в змозі продукувати апротинін ЮезРго2-5ег10-Аго15-АІа17-Авр24-Тпг26-С1ИЗ1 -
Авпа41 -С1и53.
Приклад 2
Одержання вектора експресії дріжджів для секреції рекомбінантного апротиніну бег10-Аг4д15-АІа17-Авр24-
Тиг26-21и31 -Авп41 -С1и153 з природною М-кінцевою послідовністю "Агд-Рго-Авр"
Для одержання вектора експресії дріжджів, що дозволяє одержати секрецію рекомбінантного апротиніну
Зег10-Аг915-АІа17-Азр24-Тпг26-С1и31-А5п41-сС1и53 з природною М-кінцевою послідовністю "Аго-Рго-Авр", спочатку за допомогою ПЛР підсилюють і клонують промотор МЕа1 з а-фактором пре-послідовності та 57-кінцем гена апротиніну (до послідовності впізнання рестрикційного ферменту Хпої). Праймери, що використовуються, мають такі послідовності:
Праймер С: вравсАТАСТАТТОАТААСАТТТТАААСаТтАТТТОАСАДА 3". Послідовність розпізнавання ЕсоВМУ підкреслена.
Праймер 0: вГа,авастопАСасСАСАААТСТОаТСТАаССАААаСАСААпААдаСАасСаАА
СААПАСАССАаСТаААААТАСАТаСААТСТСАТТСТТТТААТССОТТТАТАТТ 3.
Послідовність розпізнавання ХнНої! підкреслена.
Набір ПЛР містить 200нг рАг02 плазмідної ДНК, 0,2мкМ праймера С, 0,2мкМ праймера 0, 200мкМ амктрРв, 1 х
ПЛР реакційного буфера 11 (Бігаїадепе, Оріїі-Ргіте М) та 2,5 одиниці Тад полімерази (Реїкіп ЕІтег) загальним об'ємом 50мкл. Умови циклування: інкубування 1 хв. при 94"С, 30 циклів по 1хв. при 94"С, 1хв. при 507С та 2хв. при 727С і заключні 5хв. при 7270.
ПЛР-набір розводять у співвідношенні 1:5 і лігують з вектором рені! (Інвітроджен). Сумішшю для лігування трансформують клітини Е. соїї ОНба Позитивні клони ідентифікують після рестрикційного перетравлювання ферментом ЕсоВі і секвенують кілька клонів. Клон ріШ20.11.Ї. використовують для подальшої роботи.
Човниковий вектор руУЕ52 (Інвітроджен) Е.соПУдріжджі використовують для конструкції вектора секреції дріжджів, в якому послідовність апротиніну бЗепо-Аго15-АІа17-Авр24-Тпг26-с1и31-А5п41-с31053 безпосередньо зв'язана з альфа-фактором пре-послідовності дріжджів. Спочатку вектор рУЕ52 вирізають рестрикційними ферментами 55рі та Ватні, дефосфорилюють і очищають у гелі. При цьому наявні у векторі РУЕБ2 промотор
СА! 1 та її оїї видаляють. Фрагмент ДНК розміром близько 1030 пар основ за допомогою ферментів ЕсоВМ та Хної вирізають із вектора ріШ20.11.Ї, очищають електрофорезом на агарозному гелі і разом з фрагментом ХноЇ! та
Ватні розміром близько 180 пар основ із вектора рЕ59.10.Ї клонують у векторі РХЕ52, розрізаному ферментами
Зері та Ватні. Лігаційною сумішшю трансформують клітини Е.соїї ОНБба. Позитивні клони після рестрикційного перетравлювання ферментом Хпо! ідентифікують і секвенують. Клітини дріжджів (9УС234.40) трансформують вектором ріО28.11.ї, одержаним в результаті цього клонування. Експресійний вектор ріО28.11.Ї більше не містить ос-фактора про-послідовності, так що процесування апротиніну бег10-Аго15-Аіа17-Азр24-Тнг26-С1и31-
Азп41-С1и53 здійснюється виключно завдяки сигнальній пептидазі і незалежно від розщеплення протеазою Кехі!.
Приклад З
Ферментація Засспаготусез сегемівіає
Експресійний штам Засспаготусев сегемівіае ферментують описаним вище чином.
Приклад 4
Очищення похідних апротиніну без сумарного зарядупри нейтральному значенні рн 1. Огляд придатних способів очищення
Після ферментації клітини відокремлюють центрифугуванням, а надосадову рідину фільтрують з метою видалення клітин, що ще залишились.
Звільнену від клітин надосадову рідину підкислюють концентрованою лимонною кислотою до значення рн 3,0. Розчин розводять очищеною водою до досягнення електропровідності меншої, ніж вмСм/см. Потім розчин подають на колонку катіонного обмінника, попередньо врівноважену кислим буфером. Не зв'язаний матеріал видаляють шляхом промивання великою кількістю стартового буфера. Продукт елююють за допомогою сольового градієнта. Одержані фракції досліджують на вміст продукту за допомогою рідинної хроматографії під високим тиском зі зворотною фазою (АР-НРІ С) та біологічного тесту активності, який виявляє інгібування протеаз.
Фракції, що містять продукт, очищують і безпосередньо подають на препаративну ВР-НРІ С-колонку. Перед цим колонку врівноважують кислим буфером. Продукт елююють за допомогою градієнта органічного розчинника.
Фракції описаним вище чином знову досліджують на наявність продукту і фракції, що містять продукт, очищають.
В залежності від досягнутої чистоти продукту, можливо знадобиться очищення на другій ВР-НРІ С-колонці. Умови в основному аналогічні описаним вище. Одержаний розчин продукту розводять водою для ін'єкцій, розливають порціями і висушують заморожуванням.
Для очищення похідних апротиніну без сумарного заряду при нейтральному значенні рН з описаними вище процесами можуть бути комбіновані також афінна хроматографія за допомогою трипсину, (мобілізованого на сефарозі та гельпроникна хроматографія. 2. Очищення апротиніну ОезРго2-5ег10-Аго15-АЇіа17-Азр24-Тпг26-С1и31 -Азп41 -С1и53
Матеріал із 10-літрового ферментатора очищують таким способом.
Після закінчення ферментації вміст ферментатора підкислюють концентрованою лимонною кислотою до значення рН 3,0 і 10 хвилин витримують при 70 "С. Потім шляхом центрифугування (15 хвилин, 75009, Негаєив 7епіпййде) видаляють клітини і одержану надосадову рідину фільтрують (8мкм-0,2мкм, МіПіроге, Німеччина).
Надосадова рідина із цієї стадії після заморожування при -187"С може зберігатись до наступного використання.
Потім розчин розводять очищеною водою до досягнення електропровідністі менше 8мСм/см і подають на колонку
ЗР-Зерпагозе ЕЕ (Рпаптасіа, Швеція). Колонку попередньо врівноважують 50нМ цитрат-МаоН-буфером, рН3У. Не зв'язаний протеїн видаляють інтенсивним промиванням таким же буфером. Потім продукт елююють за допомогою сольового градієнта (1М МасСі) Одержані фракції досліджують на вміст продукту за допомогою рідинної хроматографії під високим тиском зі зворотною фазою (АР-НРІ С, С4) та шляхом тестування протеазо- інгібіторної активності. Фракції, що містять бажаний продукт, очищають.
Потім розчин продукту безпосередньо подають на першу АР-НРІ С-колонку (боцгсе 15 АРС, РНаптасіа,
Швеція), попередньо врівноважену 0,195 розчином трифтороцтової кислоти у воді. Не зв'язаний протеїн видаляють інтенсивним промиванням таким же буфером. Продукт елююють за допомогою лінійного ацетонітрильного градієнта (0-7095). Одержані фракції знову досліджують на вміст продукту описаними вище способами і ті з них, що містять продукт, очищають. Для заключного очищення розчин, що містить продукт, розводять водою для ін'єкцій і подають на другу АР-НРІ С-колонку (Мудас С8, Мудас, США), попередньо врівноважену 0,195 розчином трифтороцтової кислоти у воді. Не зв'язаний протеїн видаляють інтенсивним промиванням таким же буфером. Продукт елююють за допомогою лінійного ацетонітрильного градієнта (0-70).
Одержані фракції знову досліджують на вміст продукту описаними вище способами і ті з них, що містять продукт, очищають.
Одержаний розчин продукту розводять водою для ін'єкцій, розливають потрібними порціями (20,10, 1 та 0, 2мг), ліофілізують та аналізують.
Приклад 5
Визначення Кі-значення калікреїну плазми крові людини з апротиніном ЮОевзРго2-5ег10-Ага15-АІа17-Агврг4-
Тиг26-с1и31-Авп41-С1и53
Приклад: 1 одиницю калікреїну плазми розводять до 1їбмл буфером (0,05М Ттіз/0,1 М масі, 0,05 95 Тмееп-20, рн 8.2). 200мкл цього ферментативного розчину змішують з об'ємами, що зменшуються, тест-буфера (250, 240, 230,220,200, 180, 170, 150, 100, 5Омкл), а потім додають кількість інгібітора, що збільшується, в буфері для визначення (10, 20, ЗО, 50, 70, 80, 100, 150, 200 і 250 мкл, концентрація 0,7мкг/мкл).
Розчин інгібітора ферментів попередньо інкубують протягом 4 годин при кімнатній температурі. Потім 180 мкл кожного розчину поміщують у комірку мікротитрувального планшету і змішують з 20 мкл субстратного розчину.
Вимірюють зміну абсорбції на хвилі 405нм за 10 хвилин. Визначають швидкість ферментної реакції, а також значення Кі за методом Віейй (Віоспетіса! Медісіпе 32: 387-97(1984)).
Розчин сирового субстрату: 01 М в ОМ5О
Субстратний розчин: 1 х 103М 5-2302 в буфері для визначення
Буфер для визначення: 0,05М тріс-(гідроксиметил)-амінометан), 0,1 мМ масі, 0,05 95 Тмееп-20; рН 8,2; 1 мл бензилового спирту/л.
Кінетичні константи комплексування з ферментним фактором Хіа плазміну, бичачим трипсином та хімотрипсином визначають таким же способом. Субстратами служили: Хромозим Рі. для плазміну, НО-Рго-РНе-
Агуд-рМА для фактора ХІ, 5-2444 для трипсину та 5ис-Рпе-І ен-Рпе-рМА для хімотрипсину.
Приклад 6
Результати хімічної характеристики білка апротиніну ОезРго2-Зег10-Аг915-АЇІа17-АзО24-Тнг26-С1и31-Авпа1- аиБ5З
Інгібітор протеаз апротинін ЮОеєзРго2-5ег10-Аго915-АІа17-Авр24-Тпг26-С1031-А5п41-Сі053 одержують за допомогою дріжджевих організмів, змінених методами генної інженерії. Із надосадової рідини його очищують до однорідності за допомогою різних хроматографічних способів. Ідентичність інгібітора з клонованої послідовністю підтверджують подальшими аналітичними дослідженнями білка.
Аналіз М-термінальних послідовностей
Інгібітор протеаз повністю секвенують у 57 стадій. Наведений нижче запис показує визначену послідовність білка, ідентичну з клонованою послідовністю. 1
Ага-Азр-РНе-Сув-Іеи-СпИи-Рго-Рго-Зег-Тпг-Сіу-Рго-Сув-Аго-АЇіа-Аїа-Іе-Пе-Ага-туг- 21
РНе-Туг-Авр-АІа-Тиг-АІа-С1у-Геи-Сув-С1и-Типг-Рпе-МаІ-Туг-сСіу-с1у-Суз-Аго-Аїа-
Авп-Агд-Авп-Азп-Рпе-Ї уз-5ег-АІа-сіи-Авр-Сув-Меї-Спи- Тпг-Сув-Спу-с1у-Аїа
Аналіз послідовностей апротиніну ОезРго2-5ег10-Аг915-АІа17-Авр24-Тпг26-С1и31-А5п41-С1и53 здійснюють у 57 стадій.
Аналіз амінокислот
Аналіз амінокислот представляє важливий кількісний параметр для характеристики білка. Поряд із вмістом білка при відомій первинній структурі визначають кількість амінокислот. Аналіз амінокислот апротиніну ОезРгог2-
Зег10-Ага15-АІа17-Авр24-Тпг26-с1и31-А85п41-С1053 добре узгоджується з теоретичними знаннями про первинну структуру (табл. 1).
Таблиця 1
Аналіз амінокислот апротиніну ОезРго2-Зег10-Аго15-АЇа17-Азр24-Тпг26-С1иЗ І-А5п41-(31Ии53.
Експериментальні значення взяті відносно АІа-7
Амінокислоти Експериментальні значення Теоретичні значення
Суз5ОзН 5,28 (5)
Азр 6,27 6
Інг 3,49 4 зег 1,58 2 си 4,25 4 спу 6,16 (5)
Аа 7,00 7 маї 0,98 1
Меї 1,10 1
Не 1.66 2
Ї ем 1,89 2
Туг 2,49 З
Рпе 411 4 ув 1,05 1
Ага 4,73 5
Рго 3,23 З "у Цистеїни та метіоніни визначались після оксидування пермурашиною кислотою.
Хроматографія зі зворотною фазою
При НРІ С-хроматографії білків на хімічно зв'язаній зворотній фазі зв'язування з фазою, що використовується відбувається за рахунок гідрофобної взаємодії білків. Протеїни переміщуються в залежності від сили їх зв'язування зі стаціонарною фазою органічних розчинників (мобільна фаза). На цій підставі цей метод є добрим критерієм для оцінки чистоти протеїну. Апротинін ЮОевРго2-Зег10-АТаІ5-АІа17-Азр24-Тпг26-21и31-Ав5п41-с1и53 елююється як єдиний пік АР-18-фази. Виявилось, що ізольований інгібітор протеаз дуже чистий.
СЕ-Хроматографія
Капілярний електрофорез робить можливим відокремлення пептидів та білків на підставі їх заряду в електричному полі. При цьому якість відокремлення залежить від буфера, значення рН, температури та використовуваних домішок. Як капіляри застосовують колонки з так званим злитим кремнеземом з внутрішнім діаметром 50-100мкм. Апротинін ЮОезРго2-Зе/10-Аг915-АЇа17-Азр24-Тнг26-С1іи31-А5п41-С1153 відокремлюють на колонці зі злитим кремнеземом в електричному полі. Електроферограма має один гострий пік.
Визначення молекулярної ваги
Молекулярну вага апротиніну ОезРго2-Зег10-Аго15-АЇІа17-Азр24-Тпг26-с1и31-А5п41-с2І053 була визначена за допомогою системи МАГ ОІ: 6223 Дальтон. Виміряна молекулярна вага перебуває у відповідності з теоретичним значенням 6215 Дальтон в рамках точності методу вимірювання. Як матрикс використовують синапінову кислоту. 5О5-гель-електросьЬорез
Апротинін ЮОезРго2-5ег10-Аг915-АІа17-Азр24-Тпг26-с1и31-А5п41-С1053 аналізували за допомогою 505- електрофорезу за умов відновлення та у невідновлювальних умовах. Електроферограма має смугу в області близько 6,5кД.
Приклад 7
Визначення значень Кі для комплексування ферментів запротиніном ЮОезРго2-5ег10-Ага15-АІа17-Азр24-Тпг26-
Сій31-А5п41-с1053
Інгібіторні константи апротиніну Ое5Рго2-Зе10-Аго15-Аіа17-Авзр24-Тнг26-С1и31-А5п41-СІ053 визначались для різних ферментів. В табл. 2 наведені значення Кі.
Таблиця 2
Інгібіторні константи комплексування апротиніну ОезРго2-5ег10-Аго915-АІа17-Азр24-Тпг26-с1и31-Авпа41- сіи5З3 з ферментами та калікреїном плазми, фактором Хіа, бичачим хімотрипсином та бичачим трипсином.
Приклад 8
Взаємодія інгібіторів протеаз з поліклональними антитілами кроликів і, відповідно, людини
Рекомбінантно одержані інгібітори протеаз досліджувались на їх перехресну активність з поліклональними анти-апротинін-антитілами кроликів та, відповідно, людини. Було встановлено, що різні варіанти інгібіторів протеаз мають слабку взаємодію з апротинін-антисироватками.
ПРОТОКОЛ СЕКВЕНУВАННЯ
(1) ЗАГАЛЬНІ ДАНІ: (ї) ЗАЯВНИК: (А) ІМ'Я: ВАХЕВН ДО (В) ВУЛИЦЯ: ВАХЕВУ/ЕНК (С) МІСТО: ЛЕВЕРКУЗЕН (0) КРАЇНА: НІМЕЧЧИНА (Е) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС: 51368 (Е) ТЕЛЕФОН: 0214-3061455 (С) ТЕЛЕФАКС: 0214- 303482 (ї) НАЗВА ВИНАХОДУ: Похідні апротиніну з покращеними властивостями (її) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 5 (м) КОМПЧЮТЕРНІ ДАНІ: (А) НОСІЙ ІНФОРМАЦІЇ: Гнучкий диск (В) КОМП'ЮТЕР: ІВМ РС сумісний (С) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: РО-Б0О5/М5 0О5 (0) ПРОГР. ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ: Раїепіїп НеїІєазе 41.0, Версія Я1.30В (ЕРА) (2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ Мео:1: () ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 69 Пар основ (В) ВИД: Нуклеотид (С) ФОРМА: Одноланцюгова (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ВИД МОЛЕКУЛИ: Геномна ДНК (ії) ГІПОТЕТИЧНІ: НІ (м) АНТИСМИСЛОВА: НІ (у) ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: Праймер А (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 1: ,вастасСсАаАса СТААССОаТАА СААСТТСААА ТССОаСасцсААС АСТаСАТасА ААСТТОСОСаИт бо сатасттТАа 69 (2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме: 2: () ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ГАМОЕ: 93 Пар основ (В) ВИД: Нуклеотид (С) ФОРМА: Одналанцюгова (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ВИД МОЛЕКУЛИ: Геномна ДНК (ії) ГІПОТЕТИЧНІ: НІ (м) АНТИСМИСЛОВА: НІ (ух ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: Праймер В (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮО МО: 2: тасстослас сассатстАС таааСссСстТас АСАССТАТСА ТССОИТТАСТТ СТАСЧАТОаСА бо
АстасСдасассо тататаАААС СТТСОИТАТАСЄС СХ0аС 93 (2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме: 3: () ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ГАМОЕ: 38 Пар основ (В) ВИД: Нуклеотид (С) ФОРМА: Одналанцюгова (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (їі) ВИД МОЛЕКУЛИ: Геномна ДНК (у ВИД ФРАГМЕНТА: лінійна (/) ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: Праймер С (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІО МО: З: асаАТАТСТА ТТОАТААСАТ ТТАААСОИаТАТ ТТОАСАДО З8 (2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме: 4: () ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 99 Пар основ (В) ВИД: Нуклеотид (С) ФОРМА: Одноланцюгова (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ВИД МОЛЕКУЛИ: Геномна ДНК (ії) ГІПОТЕТИЧНІ: НІ (м) АНТИСМИСЛОВА: НІ (/) ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: Праймер О (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 4: свастоаАсОа САСАААТСТа ЧйТСТАассСАА АССАСААадА асласСсААСА АСАСАССА,Т бо
СААААТАСАТ СОААТСТСАТ ТСТТТТААТС СТТТАТАТТ 99
(2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме: 5: () ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 57 амінокислот (В) ВИД: амінокислота (С) ФОРМА: Одноланцюгова (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ВИД МОЛЕКУЛИ: пептид (м) ВИД ФРАГМЕНТА: лінійний (м) ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: варіант апротиніну (хї) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІО МО: 5:
АкаЯ Ар Ре Сув Гей бій Рго Рко бек Тік Сіу Рго Сув Акуд Аїа А1а 1 5 10 15
І1е І1їе Акуд Тук Рбе Туг АБр Аїа ТПх АТа С1Уу Тец Сув Сі Тік Ре чаї Тук С1у С1у Сув Аку А1а АБп Агуд АБп АвБп о Рре Пух бек Аіїа С1іц 40
Авр Сув Меє бі Тк Сув С1у С1у Аза
Гериктихщм варізнт вгрехтиніму зни З виндхкцм
Поспіддамоцті змінокисниот.
НАКИАКНАКЕ НЕК КВН ЕНЕЕЕНЕЕНЕНЕ ЯНВ вія НЕВНЕЕЕВУННЕНЕНЕТЕ і
Авротнніно ЧЕК ре КЕ Яр КАХ НОТА є КВ вд ЕВ, еВ еВ
Варемеє ВДЕ ен ВН Ве ВЕБ ІК ВК ВК с УК ЕН еуе КВ Б В Нв ее ВІ : п де п в В і сне пе В вн в нею ооооссве Нео ее ОЙ
Фіг.1
Claims (3)
1. Варіант Ое5Рго2-5ег10-Ате15-АІа17-Авр24-Тіг26-О1и31-Авп41-О10и53 апротиніну.
2. Варіант апротиніну згідно з п. 1, який є інгібітором серинових протеаз.
3. Лікарський засіб, що містить варіант апротиніну згідно з п. 1 або п. 2.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19629982A DE19629982A1 (de) | 1996-07-25 | 1996-07-25 | Aprotinin-Varianten mit verbesserten Eigenschaften |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
UA55380C2 true UA55380C2 (uk) | 2003-04-15 |
Family
ID=7800774
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
UA97073949A UA55380C2 (uk) | 1996-07-25 | 1997-07-24 | Варіант апротиніну з покращеними властивостями |
Country Status (37)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6482798B2 (uk) |
EP (1) | EP0821007B1 (uk) |
JP (1) | JPH10101700A (uk) |
KR (1) | KR980009283A (uk) |
CN (1) | CN1172116A (uk) |
AR (1) | AR008783A1 (uk) |
AT (1) | ATE260975T1 (uk) |
AU (2) | AU2870197A (uk) |
BG (1) | BG101787A (uk) |
BR (1) | BR9704068A (uk) |
CA (1) | CA2207071A1 (uk) |
CO (1) | CO4890857A1 (uk) |
CZ (1) | CZ236797A3 (uk) |
DE (2) | DE19629982A1 (uk) |
DZ (1) | DZ2276A1 (uk) |
EE (1) | EE9700177A (uk) |
ES (1) | ES2217350T3 (uk) |
HN (1) | HN1997000094A (uk) |
HR (1) | HRP970384A2 (uk) |
HU (1) | HUP9701290A3 (uk) |
ID (1) | ID17508A (uk) |
IL (1) | IL121361A0 (uk) |
MA (1) | MA24279A1 (uk) |
NO (1) | NO973426L (uk) |
NZ (1) | NZ328402A (uk) |
PE (1) | PE92298A1 (uk) |
PL (1) | PL321341A1 (uk) |
RU (1) | RU2197983C2 (uk) |
SG (1) | SG71714A1 (uk) |
SK (1) | SK101997A3 (uk) |
SV (1) | SV1997000068A (uk) |
TN (1) | TNSN97130A1 (uk) |
TR (1) | TR199700688A2 (uk) |
TW (1) | TW480271B (uk) |
UA (1) | UA55380C2 (uk) |
YU (1) | YU31697A (uk) |
ZA (1) | ZA976585B (uk) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19725014A1 (de) * | 1997-06-13 | 1998-12-17 | Bayer Ag | Aprotininvarianten mit verbesserten Eigenschaften und Bikunine von Aprotininvarianten |
US6974188B2 (en) * | 2003-08-13 | 2005-12-13 | Cosco Management, Inc. | Chair with pivotable chair back |
US20060218667A1 (en) * | 2004-10-12 | 2006-09-28 | Vojdani Fakhrieh S | Plant-produced recombinant aprotinin and aprotinin variants |
WO2006042327A2 (en) * | 2004-10-12 | 2006-04-20 | Large Scale Biology Corporation | Plant-produced recombinant aprotinin and aprotinin variants |
CN101160403B (zh) * | 2005-02-18 | 2014-08-13 | 安吉奥开米公司 | 转运化合物穿过血脑屏障的分子 |
WO2008077478A1 (en) * | 2006-12-22 | 2008-07-03 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Preparation and use of variants of the kunitz domain 2 of the human placental bikunin gene |
WO2008110301A1 (de) * | 2007-03-13 | 2008-09-18 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Aprotinin-varianten mit verbesserten eigenschaften |
DE102007056231A1 (de) | 2007-09-08 | 2009-03-12 | Bayer Healthcare Ag | Herstellung und Verwendung von Varianten humander Kunitz-Typ Protease-Inhibitoren (hKTPI) |
BRPI1103921A2 (pt) | 2011-08-17 | 2013-08-06 | Mahle Metal Leve Sa | camisa de cilindro e liga de ferro fundido |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU560584B2 (en) | 1983-07-28 | 1987-04-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Homologues of aprotinin |
US4595974A (en) * | 1984-09-10 | 1986-06-17 | Burroughs Corporation | Base drive circuit for a switching power transistor |
GB2208511A (en) | 1987-08-07 | 1989-04-05 | Bayer Ag | Variants of bovine pancreatic trypsin inhibitor produced by recombinant dna technology |
DK225488D0 (da) * | 1988-04-26 | 1988-04-26 | Novo Industri As | Polypeptid |
US5591603A (en) | 1987-08-28 | 1997-01-07 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing aprotinin and aprotinin analogs in yeast cells |
DK463887D0 (da) | 1987-09-07 | 1987-09-07 | Novo Industri As | Gaerleader |
DK105489D0 (da) | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
DE3930522A1 (de) | 1989-09-13 | 1991-03-21 | Bayer Ag | Rekombinante aprotinin-varianten - gentechnisches verfahren zur mikrobiellen herstellung von homogen prozessierten aprotinin-varianten sowie die therapeutische anwendung derselben |
US5231010A (en) | 1989-09-13 | 1993-07-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homogeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof |
IL99585A0 (en) * | 1990-10-01 | 1992-08-18 | Novo Nordisk As | Aprotinin analogues,their production and pharmaceutical compositions containing them |
JPH07509229A (ja) * | 1992-07-13 | 1995-10-12 | コルバス・インターナショナル、インコーポレイテッド | ウシ膵トリプシン阻害因子から誘導される因子Xaの阻害因子 |
KR100199565B1 (ko) * | 1994-08-19 | 1999-06-15 | 차동천 | 승화형 감열전사 기록용 수용지의 중간층 제조방법 |
-
1996
- 1996-07-25 DE DE19629982A patent/DE19629982A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-06-20 HN HN1997000094A patent/HN1997000094A/es unknown
- 1997-07-14 EP EP97111980A patent/EP0821007B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-14 AT AT97111980T patent/ATE260975T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-07-14 ES ES97111980T patent/ES2217350T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-14 DE DE59711356T patent/DE59711356D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-15 HR HR19629982.9A patent/HRP970384A2/xx not_active Application Discontinuation
- 1997-07-17 US US08/896,322 patent/US6482798B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-17 AU AU28701/97A patent/AU2870197A/en not_active Abandoned
- 1997-07-21 SV SV1997000068A patent/SV1997000068A/es unknown
- 1997-07-22 CA CA002207071A patent/CA2207071A1/en not_active Abandoned
- 1997-07-22 JP JP9210197A patent/JPH10101700A/ja active Pending
- 1997-07-22 ID IDP972548A patent/ID17508A/id unknown
- 1997-07-22 IL IL12136197A patent/IL121361A0/xx unknown
- 1997-07-22 BG BG101787A patent/BG101787A/xx unknown
- 1997-07-23 AR ARP970103329A patent/AR008783A1/es not_active Application Discontinuation
- 1997-07-23 NZ NZ328402A patent/NZ328402A/xx unknown
- 1997-07-23 DZ DZ970126A patent/DZ2276A1/fr active
- 1997-07-23 YU YU31697A patent/YU31697A/sh unknown
- 1997-07-24 RU RU97112745/14A patent/RU2197983C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-07-24 BR BR9704068A patent/BR9704068A/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-07-24 ZA ZA9706585A patent/ZA976585B/xx unknown
- 1997-07-24 UA UA97073949A patent/UA55380C2/uk unknown
- 1997-07-24 TW TW086110514A patent/TW480271B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-07-24 SG SG1997002627A patent/SG71714A1/en unknown
- 1997-07-24 TN TNTNSN97130A patent/TNSN97130A1/fr unknown
- 1997-07-24 PE PE1997000661A patent/PE92298A1/es not_active Application Discontinuation
- 1997-07-24 NO NO973426A patent/NO973426L/no not_active Application Discontinuation
- 1997-07-24 SK SK1019-97A patent/SK101997A3/sk unknown
- 1997-07-24 KR KR1019970034643A patent/KR980009283A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-07-24 CZ CZ972367A patent/CZ236797A3/cs unknown
- 1997-07-24 HU HU9701290A patent/HUP9701290A3/hu unknown
- 1997-07-24 MA MA24733A patent/MA24279A1/fr unknown
- 1997-07-24 EE EE9700177A patent/EE9700177A/xx unknown
- 1997-07-25 PL PL97321341A patent/PL321341A1/xx unknown
- 1997-07-25 CO CO97042648A patent/CO4890857A1/es unknown
- 1997-07-25 TR TR97/00688A patent/TR199700688A2/xx unknown
- 1997-07-25 CN CN97115348A patent/CN1172116A/zh active Pending
-
2001
- 2001-06-06 AU AU51787/01A patent/AU762041B2/en not_active Ceased
-
2002
- 2002-09-23 US US10/252,967 patent/US20030096752A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Valls et al. | Yeast carboxypeptidase Y vacuolar targeting signal is defined by four propeptide amino acids. | |
AU735015B2 (en) | Use of substrate subtraction libraries to distinguish enzyme specificities | |
US5118668A (en) | Variants of bovine pancreatic trypsin inhibitor and pharmaceutical use thereof | |
FI101232B (fi) | DNA-rakenteet, jotka sisältävät Kluyveromyces-hiivan alfa-tekijän joht osekvenssin ohjaamassa heterologisten polypeptidien erittymistä | |
Tosi et al. | Molecular cloning of human C1 inhibitor: sequence homologies with α1-antitrypsin and other members of the serpins superfamily | |
US5332804A (en) | High molecular weight human angiogenic basic fibroblast growth factors | |
JP2001512684A (ja) | 新規のpichiapastoris遺伝子配列およびそれらの使用方法 | |
NO177716B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive polypeptider, DNA-sekvens, ekspresjonsvektor og antistoff | |
UA55380C2 (uk) | Варіант апротиніну з покращеними властивостями | |
JPH02117697A (ja) | 抗凝固活性を有する新規ポリペプチド | |
IL171158A (en) | Cliquin inhibitors | |
Pohlig et al. | Purification, Characterization and Biological Evaluation of Recombinant Leech‐Derived Tryptase Inhibitor (rLDTI) Expressed at High Level in the Yeast Saccharomyces Cerevisiae | |
JP2916228B2 (ja) | 遺伝子操作した組み換えアプロチニン変異型、均質に処理されたアプロチニン変異型の微生物調製の方法およびその治療学的使用 | |
JP2001238683A (ja) | フリンによるタンパクの微生物的生産方法及びその生産のための細胞 | |
McManus et al. | Posttranslational modification of an isoinhibitor from the potato proteinase inhibitor II gene family in transgenic tobacco yields a peptide with homology to potato chymotrypsin inhibitor I | |
US5707831A (en) | Process for preparing recombinant aprotinin and recombinant aprotinin variants having the natural N-terminal sequence | |
KR950010817B1 (ko) | 사카로미세스 세레비시아에에서 재조합 인간 psti의 제법 | |
US5661000A (en) | Serine protease and serine protease gene | |
Przysiecki et al. | Characterization of recombinant antistasin secreted by Saccharomyces cerevisiae | |
Ngamkitidechakul et al. | Buffered non-fermenter system for lab-scale production of secreted recombinant His-tagged proteins in Saccharomyces cerevisiae | |
JP2829397B2 (ja) | フィブリン結合活性ポリペプチド | |
EP0307478B1 (en) | Serine protease and serine protease gene | |
Hsu et al. | Purification and partial amino acid sequencing of rat bone tumor (UMR106) alkaline phosphatase | |
MXPA05012298A (es) | Proceso de manufactura de una proteina anticoagulante extractada de nematodos (nap). | |
You et al. | Conformational analysis and proteolytic processing of synthetic pre-pro-GnRH/GAP protein |