UA55380C2 - Варіант апротиніну з покращеними властивостями - Google Patents

Abstract

Винахід стосується варіанту апротиніну з покращеними фермент-інгібіторними, імунологічними та фармакологічними властивостями.

Description

Даний винахід стосується варіантів апротиніну, що є кращими інгібіторами ферментів, мають поліпшені імунологічні та фармакокінетичні властивості.

Апротинін, який також позначається як інгібітор трипсину підшлункової залози бика (ВРТІ), відноситься до родини інгібіторів серинових протеаз типу Кунітца. Спектр серинових протеаз, що піддаються інгібуванню,- включає, наприклад, трипсин, хімотрипсин, плазмін та калікреїн плазми ((М/.«зернага, Н.Те5спезспе, Н.Е

Ргоївїпазе Іппіріюгв5, Ваїтеїї апа Заїмезеп (єдв.), ЕІівемієг Зсіепсе Рибі. ВМ 375-387, 1986).

Апротинін складається з 58 амінокислот. Тривимірна структура білка була встановлена за допомогою рентгеноструктурного аналізу та ЯМР-спектроскопії (У/Лодамег еї аї., 9У.Мої. Віо!. 198(3), 469-480, 1987; М/адпег єї а!., У. Мої. Вісі. 196 (1), 227-231, 1987; Ветаї еї а!., Віоспетівзігу 32 (17), 4564-4570, 1993).

Під торговою назвою Трасилол?оО природний апротинін давно використовується для лікування панкреатиту.

Зараз ТрасилолФб використовується при серцевій хірургії, після того, як клінічні дослідження показали, що обробка апротиніном суттєво знижує потребу у переливанні крові при подібних операціях та приводить до зменшення вторинних кровотеч (О0.Ноузіоп, у. СагаііїНогас. Мазе. Апезій. 6; 76-100, 1992).

Вдалось показати, що заміна амінокислоти, яка відповідає за специфічність інгібування, у положенні 15 приводить до одержання цінних варіантів апротиніну з поліпшеними інігібіторними властивостями (патент ФРН З 339 693). В залежності від введеної амінокислоти можна, таким чином, одержати активні інгібітори, які, наприклад, інгібують еластазу підшлункової залози або лейкоцитів.

Далі було показано, що інгібіторні властивості апротиніну та одержаних при заміні у положенні 15 варіантів визначаються також іншими амінокислотами у місці контакту цільової протеази, що піддається інгібуванню, та молекули інгібітора. Сюди відносяться, перш за все додаткові амінокислотні залишки у положеннях 14, 16, 17, 18, 19, 34, 38 та 39. Варіанти апротиніну з поліпшеними властивостями, одержані в результаті заміни одного або декількох з цих амінокислотних залишків в області контакту, були серед інших описані, наприклад, у наступних матеріалах: міжнародна заявка на патент 89/01968, міжнародна заявка на патент 89/10374, заявка на європейський патент 0307592, заявка на європейський патент 683 229.

Цікавим способом могли бути поліпшені фармакокінетичні властивості апротиніну та його варіантів шляхом заміни амінокислот, що визначають фізико-хімічні властивості речовини. Так, вдалося шляхом зниження загального позитивного заряду молекули значно зменшити зв'язування нирками. Такі варіанти були описані у міжнародній заявці на патент 92/06111.

Базуючись на поліпшених технічних можливостях одержання, вигідно в окремих випадках проводити модифікацію М-кінця молекули інгібітора. Такі модифікації можуть вкорочувати М-кінці або подовжувати їх, або приводити до видалення однієї або декількох амінокислот. Модифіковані по М-кінцю варіанти апротиніну були описані у європейському патенті 419 878.

Задачею винаходу є одержання варіанта апротиніну з поліпшеними властивостями. Задача вирішується запропонованим варіантом апротиніну з сумарним зарядом від «3 до -3 при рН 7 та з амінокислотами Агд15 або

Аг915-Аїа17 на ділянці зв'язування.

Бажано, щоб варіант апротиніну використовували для інгібування серинових протеаз.

Бажано, щоб варіант апротиніну мав змінену М-кінцеву послідовність та подовження або вкоречення на М- кінці, або подовжені амінокислоти на М-кінці.

Амінокислотна послідовність, наприклад, для деяких варіантів апротиніну представлена на фіг. 1.

Задача також вирішується запропонованим варінатом апротиніну, що вибирається з групи дез-Рго2-5ег10-

Ага15-АІа17-Азр24-Тнг26-С1и31-А5п41-сС1и53-апротиніну, дез-Рго2-зег10-Аг915-Азр24-Тпг26-С1и31-А5па41-сС1и53- апротиніну, дез-Рго2-Зе10-Ага15-5е117-Азр24-Тнг26-С1и31-А5п41-сС1и53-апротиніну, дез-Рго2-зег10-Аг915-АЇіа17-

Тнг26-С1и31-Авп41-Стіи5З-апротиніну, дез-Рго2-Вег10-Аг915-АІа17-Авзр24-Тпг26-Азп41-сС1и53-апротиніну, Зег10-

Ага15-АІіа17-Азр24-Тнг26-С1и31-А5п41 -СіибЗ-апротиніну, Зег10-Аг915-Азр24-Тнг26-с1и31-Авп41-С1и53- апротиніну, Зег10-Агд15-5ег17-Авр2г4-Тнг26-С1и31-А5п41-(3І053-апротиніну, Зег10-Агд15-Аїа! 7-Тпг26-С1И31 -

Авп41-сС1и53-апротиніну, Зег10-Агд15-АІа17-Азр24-Тпг26-Азп41-С1и53-апротиніну.

Ці варіанти апротиніну можуть також мати амінокислоту пролін у положенні 2.

Варіанти апротиніну згідно з винаходом, проте, не обмежуються вказаними на фіг. 1 прикладами. До варіантів апротиніну згідно з винаходом відносяться також варіанти з подовженням на М-кінці АІа(2)-С1Іп(-1), з залишком природної амінокислоти проліну у положенні 2, з заміною інших амінокислот, які мають позитивний заряд по відношенню до нейтральних або тих, що несуть негативний заряд, амінокислотним залишкам, або з заміною інших нейтральних амінокислот по відношенню до негативно заряджених амінокислотних залишків. Вибір заміни амінокислотних залишків здійснюють при цьому згідно з таким принципом, щоб одержана речовина мала при фізіологічному значенні рН зменшений сумарний позитивний заряд, бажано в області від 2 до -2. Згадані зміни в амінокислотній послідовності, включаючи подовження або вкорочення, або видалення М-кінця, можуть використовуватись у будь-яких комбінаціях одна з одною. До варіантів апротиніну згідно з винаходом відносяться, таким чином, усі сполуки, для яких характерна комбінація згаданих вище ознак, та які мають при фізіологічному значенні рН знижений загальний позитивний заряд.

Варіанти апротиніну мають наступні ознаки: 1. Заміна однієї або декількох амінокислот в активному центрі молекули для підвищення активності. 2. Заміна амінокислот для зниження загального позитивного заряду з метою поліпшення імунологічних та фармакокінетичних властивостей.

З. Модифікація М-кінцевої амінокислотної послідовності на основі технічних можливостей одержання.

Несподівано було виявлено, що комбінація двох або трьох згаданих вище ознак приводить не тільки до одержання, але навіть до посилення чітко виражених окремих ознак. У доповнення до цього можуть виявлятись нові властивості речовин, що, наприклад, відносяться до імунологічних, фармакокінетичних або поверхневих властивостей сполук. Нові варіанти виявляють знижену реактивність по відношенню до поліклональних людських та кролячих антисироваток, які одержували при використанні апротиніну. Далі було знайдено, що нові варіанти поводять себе як менш активні імуногени у порівнянні з апротиніном, тобто вони викликають знижену імунну відповідь. Далі було показано, що варінати згідно з винаходом індукують незначне вивільнення гістаміну з клітин крові. Далі нові варіанти чітко показали незначне акумулювання у нирках у порівнянні з апротиніном. Кінетичні константи інгібування ферменту (значення Кі) несподівано були поліпшені, незважаючи на велику кількість змін у молекулі по відношенню до первинних варіантів молекули. Бажані такі, що мають загальний заряд від 2 до -2, особливо бажані ті, що мають заряд від «1 до -1.

Описані нові інгібітори протеїназ придатні для лікування хворобливих станів, при яких, а також в результаті комплексних хірургічних операцій, як, наприклад, при хірургії серця або алоартропластичній заміні суставів у трансплантаційній медицині, це є прийнятним також для активування плазматичних ферментних систем завдяки тривалому або інтенсивному контакту крові з чужерідними поверхнями.

Інгібітори знижують втрату крові при операціях, пов'язаних з підвищеним ризиком кровотечі (наприклад, операції на серці, хірургія кісток та суставів). Вони прийнятні для терапії при шоку, множинних травмах та черепно-мозкових травмах, сепсисі, дессимінованій внутрішньосудинній коагулопатії, ураженнях багатьох органів, запальних захворюваннях за участю системи калікреїну, як наприклад, захворювання суглобів, та при астмі. Вони запобігають інвазійному росту пухлин та метастазуванню внаслідок інгібування плазміну. Вони також придатні для терапії болей та набряків, завдяки інгібуванню синтезу брадикініну, а також для лікування інсультів.

Вони також корисні при терапії діалізом та при штучних органах для запобігання запаленням та коагуляції, а також для зменшення ризику кровотечі. Для одержання варіантів апротиніну згідно з винаходом зручно використовувати способи генетичної інженерії Для цього за допомогою загальноприйнятих молекулярнобіологічних способів вводять у прийнятний мікробний експресійний організм генноінженерну інформацію для синтезу у кожному окремому випадку варіантів апротиніну, що розглядаються. Рекомбінантний мікроорганізм піддають ферментації; шляхом вибору прийнятних умов вводять гетерологічну спадкову інформацію для експресії. Експресовані варіанти апротиніну одержують після закінчення з культурального середовища.

Прийнятні організми-хазяї для продукування варіантів апротиніну згідно з винаходом можуть бути бактеріями, дріжджами або грибами. Експресія може відбуватися внутрішньоклітинно або поза клітиною при використанні прийнятних секреторних систем. Варінати апротиніну можуть бути при правильно процесовані або злиті у пептидах або білках.

Прийнятні системи для експресії варіантів апротиніну були описані в заявці на європейський патент 683 229, в міжнародних заявках на патент 89/02463, 90/10075 та в різних інших патентних заявках, що були згадані раніше.

Способи виконання винаходу

Ферменти

Ферменти, що використовували (рестрикційні ендонуклеази, лужні фосфатази з кишечника теляти, полінуклеотидкіназа фага Т4 та ДНК-лігаза фага Т4), були одержані від фірм Бьорінгер Маннхайм та Гібко,

Бразилія, їх використовували згідно з інструкціями виробника.

Молекулярнобіологічні методики

Звичайні операції клонування, як наприклад, виділення плазмідної ДНК з Е.соїї (так звана мініпідготовка) та трансформацію Е.соїї за допомогою плазмідної ДНК здійснювали по Затрьгоок та інш. (Молекулярне клонування,

Колд Спрінг, Харбор, 1989). Як організм-хазяїн для трансформації виводили штам ОНб5ба бактерій Ес.соїї (Гібко,

Бразилія). Для виділення великої кількості плазмідної ДНК використовували Оіадеп-кінці (Оіадеп). Екстракцію фрагментів ДНК з агарозних гелів проводили за допомогою струменевої сорбції згідно з вказівками виробника (Геномед).

Олігонуклеотиди для експериментів з сайт-специфічним мутагенезом та праймер для полімеразної ланцюгової реакції та реакції секвенування були одержані за допомогою "ДНК-синтезатора 380 А" фірми Еплайд

Байєсістемс. Дослідження мутагенезу проводили за способом Оепд та Міскоїюй (Оепао та інш., Апаї. Віоспет. 200, 81-88,1992) при використанні набору фірми Фармація Байєтек (,Унікальний сайт-елімінаційний мутагенез"). Усі векторні конструкції та експерименти по мутагенезу були підтверджені за допомогою циклу секвенування ДНК Тад з використанням термінаторів з флуоресцентною міткою на секвенаторі АВІ 373А (Еплайд Байесистемс).

Трансформація Засспаготусез сегемівіає

Клітини дріжджів, наприклад, штаму УС34.40 (МАТа, игаЗ3-52, зис2) вносили в 10мл МЕРО (295 глюкоза; 290 пептин; 195 дріжджовий екстракт Оіїсо) та одержували значення оптичної густини від 0,16 до 0,8 при боООнм.

Клітини промивали 5мл розчину А (1М сорбіт, 10 мМ біцин, рН 8,35; 395 етиленгліколь) повторно суспендували у

О,2мл розчину А та витримували при -7020.

Плазмідну ДНК (5 мкг) та носій ДНК (50 мкг ДНК із сперми оселедця) додають до заморожених клітин. Потім клітини шляхом струшування протягом 5 хвилин розморожують при температурі 37"С. Після додавання 1,5мл розчину В (4095 РЕС 1000; 200мМ біцин рН 8,35) клітини протягом 60 хвилин інкубують при температурі 30"С, промивають 1,5мл розчину С (0,15 М Масі; 10мМ біцин, рН 8,35) і ресуспендують в 100мкл розчину С. Посів здійснюють на селективному середовищі, що містить 295-ний агар. Трансформанти одержують після інкубування протягом З діб при 302С.

Живильні середовища для ферментації 1. Середовище 502:

Васю Уеаві Мігодеп Вазе б, 7г/л

Глюкоза" 20г/л

КНгРО»Х б, 7г/л рнб,о 2. Середовище 505:

Глюкоза" 20г/л

Дріжджовий екстракт Осо 20г/л

КНгРО»Х б,7г/л

(МНа»БОА 2,Ог/л

Ма5о»х х 7 НгО 1,Ог/л

Розчин мікроелементів 51 4 1,Омл/л рне,о

Мікроелементиий розчин 51 4:

Тігіріех ПІ бг/л

РебОх х 7 Н2гО 2г/л 7п504х7 НО О,1г/л

Мпсіг х 4 Н2О 0,ОЗг/л

НзВОз О,Зг/л

СоСіг х 6 НгО О,2г/л

СиСігх2 НО 0,О1г/л

МіСі» х 6 НгО О,02г/л

Маг2Мосх х 2Н20 0,ОЗг/л х є автоклавують окремо 3. Ферментативне середовище:

Глюкоза" 2,Ог/л

Соєвий пептон 25г/л

КНегРОх 1,4г/л

Ма5ох х 7 НгО 1,Ог/л

Тіамін хлорид 5,1мг/л

Інозит 2Омг/л

Мікроелементний розчин З,Омл/л

Вітамінний розчин З,Омл/л (МНа»БОА 2,Ог/л рноь,5

Живильний розчин:

Глюкоза" 530г/л (МНао2г504 5,Ог/л

КНегРОх 2,9г/л

Ма5ох х 7 НгО З,вг/л

Тіамінхлорид 1Змг/л

Інозит 7Омг/л

Розчин мікроелементів б,вмл/л

Розчин вітамінів б,вмл/л

Розчин мікроелементів:

ГРесіз х б НгО 13,5г/л 7пСігх4 НО 2г/п

НзВОз О,5г/л

СоСіг х 6 НгО 2,0г/л

Сбибол х 5 НгО0 1,9г/л

МагМода х 2 НгО 1,0г/л

НОЇ конц. 100мл х є автоклавують окремо

Вітамінний розчин:

Рибофлавін 0,42г/л

Са-пантотенат 5,9г/л

Нікотинова кислота б. 1г/л

Гідрохлорид піридоксину 1,7 г/л

Біотин О,Обг/л

Фолієва кислота О,04г/л

Приготування консервованих робочих матеріалів 200мл середовища 502 в колбі Ерленмейєра на 1 літр інокулюють консервованим робочим матеріалом до концентрації 195. Культуру протягом 72 годин інкубують при 28"С при струшуванні (260об/хв). Потім по 2мл наливають в контейнери для консервування і заморожують рідким азотом.

Ферментація в колбах для струшування

Як попередню культуру 200мл середовища 502 в 1-літровій колбі інокулюють консервованим робочим матеріалом і протягом 72 годин ферментують при струшуванні (260об/хв). Використовуючи попередню культуру, основні культури (200мл середовища 505 в 11 пробірках) інокулювали до концентрації 195 і протягом 72-96 годин інкубують при 28"С при струшуванні.

Ферментація в 10-лігровому біореакторі

Як попередню культуру 200мл середовища 502 в 1-літровій колбі інокулюють консервованим робочим матеріалом і протягом 72 годин ферментують при струшуванні (260об/хв). Основна культура в 10-літровому ферментаторі піддається «Іеа-ьаІсп»-ферментації протягом 96 годин. Як живильне середовище використовують ферментативне середовище, початковий об'єм якого становить 7л. Ферментатор інокулюють 200 мілілітрами попередньої культури.

Умови ферментації

Температура: 2876

Швидкість обертання мішалки: 5Обоб/хв

Вентиляція: ТОл/хв рн: 5,5

Тиск в головці: 200мбар

Після 7 годин ферментування починають підживлення. Швидкість підживлення регулюють за респіраторним коефіцієнтом (Незрігаюгівспе Оцойепі - ВО - утворений СОг/спожитий кисень). Якщо значення КО стає більшим, ніж 1,15, швидкість підживлення зменшують, якщо значення НО стає меншим, ніж 1,05, швидкість підживлення підвищують.

Через однакові проміжки часу беруть проби із ферментатора і шляхом вимірювання оптичної густини при 700Онм визначають ріст клітин. Крім того, шляхом вимірювання активності визначають концентрацію Вау 19-8757 у надосадовій рідині.

Після закінченні ферментації значення рН знижують до 3,0 додаванням 5095 (вага/об"єм) лимонної кислоти і ферментатор протягом 10 хвилин нагрівають при 70"С. Потім клітини відокремлюють шляхом центрифугування при 75004 і надосадову рідину подають на очистку білка.

Матеріали для хімічного аналізу білків

Аналіз послідовностей здійснювався за допомогою білкового секвентора моделі 473А фірми Арріїєй

Віозузієт5 (м. Форстер-Сіті, США). Використовувалась стандартна програма секвенування. Секвентор, різні програми секвенування, а також РТН-система детектування докладно описані в інструкції користувача (О5егв5 тапциаї ргоїєїп зедоєпсіпд зузієт тоде! 473А) (1989) Арріїєа Віозувієтв Еогзієг Спу, СА 94404, ОБА).

Реагенти для роботи секвентора та хроматографічні колонки для РТН детектування постачаються фірмою

Арріїєа Віозувіетв.

Аналіз за допомогою рідинної хроматографії під високим тиском (НРІ С) здійснювався НРІ С-системою НР 1090 фірми Немеїй Раскага (0-МаідьЬгопп). Для відокремлення застосовувалась НРІ С-колонка АР-18 (250мм х 4 бмм, 5-мікронний матеріал, діаметр пор 300 Ангстрем) ВасКегтопа (О-Сго55 (зегац).

Використовувалась установка для капілярного електрофорезу моделі 270 А-НТ фірми Арріїєа Віозузіет5 (Богзієї Сйу, СА 94404, БА). Проби вводились, як правило, гідродинамічно через різні проміжки часу.

Використовувалась капілярна колонка (50мкм х 72см) фірми Арріїєа Віозувзієтв.

Аналіз амінокислот здійснювався аналізатором 13000 фірми Еррепадог Віоїгопік (О-Маїпіаї).

Використовувалась легко модифікована стандартна програма розділення від Віоїгопік. Програма розділення та робота аналізатора вичерпно описані в довіднику до приладу.

Молекулярна вага визначалась за допомогою системи МАГОЇ | фірми Кгаз/5пПітааги (О-Юцізриго). 505- електрофорез здійснювався за допомогою електрофорезної системи фірми Ріпапгтасіа (О-Егеїрига).

Визначення кінетичних параметрів здійснювалось за допомогою зчитувача для мікротитрувальних планшетів фірми 5І Т (0-Стеїзпеіт). Промивання мікротитрувальних планшетів здійснювалось за допомогою промивного апарату фірми Супагес (О-Оепкепаоп).

Використовувались ферменти та живильні середовища фірми СаІріоспет (0-Вай бодеп). Всі інші хімікати та реагенти постачались фірмою Мегек (О-Оаптвіаді) або фірмою бідта (О-Оєїзеппоїеп). Планшети на 96 комірок були від фірми Стгеїпег.

Поліклональні анти-апротинінантитіла кроликів одержувались в кроликах шляхом імунізації апротиніном.

Поліклональні анти-апротинінантитіла людини походять від пацієнтів, що лікуються апротиніном.

Хімічний аналіз білків

Аналіз М-термінальних кінців 1-Знмоль розчиненого у воді інгібітора протеаз завантажують на пластину секвентора, попередньо інкубовану полібреном. Протеїн секвенують з майже нормальним циклом. РТН-амінокислоти ідентифікують шляхом безпосередньої хроматографії за допомогою 50 пмоль РТН-стандарту.

Аналіз амінокислот 200мкг протеїну розчиняли в 200мкл 6М НС і протягом 1 години гідролізують при температурі 16670. Близько

ТІнмоль проби подають на аналізатор амінокислот. Кількість амінокислоти визначають за допомогою З5нмоль стандарту. 5О5-електрофорез 5ОБ-електрофорез здійснюють за умовами Лемлі (ІГаєттії). 7Омкг інгібітора протеаз аналізують за допомогою 10-20-процентного 505-гелю і проявляють за допомогою фарбування сріблом (Мерріл (Мегтії) та інші).

ЦК. Саеттії, Машге 227, 680-685 (1970).

С.В. Ме!тії, М.І. Оипац, О. Соідтапп, Апаї. Віоспет. 100: 201-207 (1981).

Капілярний електрофорез анг інгібітора протеаз досліджують за допомогою капілярного електрофорезу на скляній колонці (довжина 72см, внутрішній діаметр 50мкм). Умови: сила струму 90мкА, температура колонки 257"С, 100нМ фосфатний буфер рнН3З,0, детектування при довжині хвилі 210нм, подача під тиском протягом Зсек.

Хроматографія зі зворотною фазою 5нмоль інгібітора протеаз піддають хроматографії на НРІ С-колонці АР-18 (250мм х 4,бмм, 5-мікронний матеріал, діаметр пор 300 Ангстрем) фірми ВасКегропа. Як елюент використовують градієнт ацетонітрил/ТЕА.

Умови: потік 0,7мл/хв, температура колонки 40"С, детектування 40"С, розчинник А: 0,195 ТЕА, розчинник В: 0,190

ТЕА/60595 ацетонітрил; градієнт: Охв. 095 В, 10 хв. 090 В, 7Охв. 100905 В, 8Охв. 0958.

Визначення молекулярної ваги 1мкг інгібітора протеаз аналізують системою МАЇ І. Як матрикс використовують синапінову кислоту. Як стандартні білки для калібрування маси використовують бичачий інсулін, цитохром С та меліттин.

Вміст протеїну

Вміст протеїну визначають ВСА-методом. При цьому методі наявними протеїнами здійснюється перетворення іонів С2: в іони С», які з біцинхоніновою кислотою утворюють комплекс, що має поглинання при

56бонм.

Ліофілізований протеїн доводять до рівноважної вологості і в концентрації 1мг/мл розчиняють в 0,995 розчині

Масі. Готують ряд розведень. До 50мкл розчину зразка додають 1000мкл ВСА-тест-реагента, реакційну трубочку щільно закривають пробкою і точно 30 хвилин інкубують при 60"С. Після охолодження зразків на льодяній бані протягом 5 хвилин здійснюють вимірювання при температурі 257С та довжині хвилі 56бОнм.

Активність: (тест на гальмування трипсину, титрометричний)

Активність визначають модифікованим Р.І.Р.-тестом гальмування трипсину. Вау у 19-8757 гальмує каталізований трипсином гідроліз Ма-бензоїл-І-аргінінетилового ефіру (ВАЕЕ). Карбонільні групи, що звільняються при реакції, визначають шляхом лужного титрування. Залишкова активність трипсину є мірою інгібіторної активності тестованої речовини.

Ліофілізований білок доводять до рівноважної вологості і в концентрації тмг/мл розчиняють в 0,995 розчині

Масі. Готують ряд розведень. До їмл розчину зразка додають 2мл буфера (15мМ боратного буфера, рН 8,0 з 200мМ Сасі») та 0, вмл розчину трипсину (2мг/мл) і інкубують 5 хвилин при 25"С. На закінчення додають 0,2мл розчину ВАЕЕ (6 8мг/мл) і через 5 хвилин вимірюють споживання КОН.

Визначення перехресної реакції інгібіторів протеаз з поліклональними анти-апротинінантитілами кроликів та людини. 0,5-1Онг інгібітора протеаз або апротиніну, розчиненого в буфері зв'язування, протягом ночі звхязують на мікротитрувальному планшеті при температурі 4"С. Комірки чотири рази промивають кожного разу 200 мікролітрами промивного буфера, а потім додають 100мкл розчину для блокування. Планшет накривають і протягом години інкубують при 37"С. Після промивання описаним вище чином додають поліклональні анти- апротинінантитіла кролика (0,2мкл/мл в 195 В5А в РВ5-буфері) або поліклональні антитіла людини (20мкл/мл в 196 НБА в РВ5-буфері). Планшет накривають і протягом години інкубують при 37"С, а потім промивають описаним вище чином. Потім додають 100мкл біотинільованих анти-антитіл кролика чи людини (25мкл.- 10мл 190

ВЗА чи 195 НБА в РВ5-буфері) і протягом години інкубують при 37"С. Пластинку промивають описаним вище чином і до кожного заглиблення додають 100 мклстрептавідіно-пероксидазного комплексу (50мкл. 10мл 195 ВБА чи 195 Н5А в РВ5-буфері). Планшет накривають і годину інкубують при 37"С, а потім промивають описаним вище чином.

Субстратну реакцію здійснюють за допомогою ТМВ-субстрату т розчину пероксидази (1-1; 100 мкл на кожну комірку). Реакцію припиняють через 10 хвилин 2М фосфорною кислотою (100 мкл/комірку) і вимірюють абсорбцію при 450 нм (еталон 57Онм).

Розчини: 1. Інкубаційний буфер: 15нМ Ма2СОо3, З5нмМ Ммансоз, рно,б 2. Буфери для зразків: Проби розчиняють в потрібній концентрації в інкубаційному буфері. 3. Промивний розчин: 0,195 (об'єм/об'єм) Тмееп-20 в РВ5 4. Розчин для 395 (вага/об'єм) ВЗА або Н5БА в РВ5 блокування:

Приклади

Приклад 1

Одержання вектора експресії дріжджів для секреції рекомбінантного апротиніну ОезРго2-Зе/10-Ага15-АЇа17-

Аврг24-Тпг26-с11и31-Авп41-с1и53

Вихідним матеріалом для одержання гена апротиніну ОезРго2-5Зег10-Агу 15-АІа17-Азр24-Тпг26-с1и31-Авпа1-

Ссійи53 служить ген ЮезРго2-Агд15-АІа!7, через рестрикційні ферменти Ніпа!Ш та Ватні клонований у вектор рист18. Результуючий вектор (рЕМб.61) піддають реакції дволанцюгового мутагенезу за допомогою мутагенного праймера А та селекційного праймера 5са|/Міш! методом Ш.5.Е. (Рпаптасіа Віоїесі). Мутагенний праймер А має таку послідовність:

Праймер А

ГастасСАаАаСТААССаТтААСАСТТСАААТоСасСсааААаАСТасСсАТавАААСТІ аСОСТастТасттАа 3". Цей праймер генерує мутації Азп41 С1Іи53 в гені апротиніну ОезРго2-Агод15-АІа17. Аналіз клону здійснюють шляхом рестрикційного перетравлювання ферментами бєа! та 5рпїЇ. Крім того, бажану послідовність підтверджують секвенуванням ДНК клону рЕМЗ1.8.І. Подальші заміни в області 5і гена (Зег10-Азр24-Тиг26-С1и31) здійснюють за допомогою технології ПЛР із застосуванням праймера В та "зворотного 24-тег М 13" праймера, виходячи із рЕМЗ3З1.8.Ї плазмідної ДНК.

Праймер В вгтасстоесвлдассесСсатстТАСстТаваСССстТасСсАаАаСтТАТСАТОССОТТАСТ

ТСТАСОАТаСААСТОСАСОИССТататаАААССТТСИ,ТАТАССЯИС 3".

Послідовність впізнання Хної підкреслена.

Набір ПЛР містить 20нг рЕМЗ1.8.Ї плазмідної ДНК, 20пмоль зворотного 24-тег М13 праймера, бОпмоль праймера В, 200мкМ амтТР», 1 х ПЛР реакційного буфера І! (Реїкіп ЕІтег), 4мМ МасСі» та 2,5 одиниці Тад ДНК полімерази (Регкіп ЕІтег) в загальному об'ємі 100мкл. Умови циклування були такими: інкубування Зхв. при 942С,

ЗО циклів по їхв. при 94"С, їхв. при 55"С та їхв. при 72"С і заключні 5хв. при 72"С. Набір ПЛР розводять у співвідношенні 1:5 і лігують з вектором рені! (Інвітроджен). Використовуючи лігаційну суміш трансформують клітини Е. соїї ЮОНба. Позитивні клони після рестрикційного перетравлювання ферментами ХпоЇ та Ватні ідентифікують і секвенують кілька клонів. Клон рЕ59.10.Ї містить бажану послідовність і використовується для подальшої роботи.

Човниковий вектор Е.соїї/дріжджі (наприклад, рАг202) використовують для конструкції секреторного вектора дріжджів, в якому послідовність апроти-ніну ОезРго2-5ег10-Аго915-АіІа17-Авзр24-Тпг26-С1и31-А5п41-С1|и53 зв'язана з пре-про-послідовністю альфа-фактору дріжджів.

Вектор рА2гО2 несе ген стійкості до ампіциліну (Біа) та ген ОВАЗ як селектований мічений ген для Б.соїї та дріжджів. Подальшими суттєвими елементами вектора є Сої Е1 та 2 ц початкової точки реплікації (огі). Місце

ВЕРЗ також знаходиться в цій області. Фрагмент ЕсоВіІ-Ніпац розміром 1200 пар основ несе промотор МЕ та М- кінцеву пре-про-послідовність альфа-фактора білка-посередника дріжджів (Кигіап, НегеКом/їг, Сеї! 30, 933-943,

1982). Шляхом введення модифікованого апротиніну ОезРго2-Аг915 сДНК як фрагменту Ніпашп-Ватні, відновлюється розпізнавальна позиція для Кехії-протеази (Тувз-Агу) всередині пре-про-послідовності альфа- фактора (ЕР 0 419 878).

На 3--кінці послідовності апротиніну ОезРго2-Аг915 вектор несе фрагмент Ватні-заї! гена ОВАЗ дріжджів, що в цій позиції функціонує як сигнал закінчення для транскрипції (Магдег єї а!., Мої. Сеї!. Вісі. 6,1095-1101, 1986).

Фрагмент ДНК розміром 180 пар основ за допомогою Хпо!Ї та Ватні вирізають із вектора рЕ59.10.1 , очищають електрофорезом на агарозному гелі і клонують в також розрізаний за допомогою ХпоЇ! та Ватні вектор рАг202 та дефосфорилюють. Шляхом такого клонування апротинін ОезРго2-Аг915 у векторі рА202 замінюють апротиніном ОеєвзРго2-5ег10-Аго15-АЇІа17-Азр24-Тпг26-Сі031 -Авп41-С251053. Клітини дріжджів (УС34.40) трансформують вектором рЕ513.10.Ї, одержаним в результаті цього клонування.

Інші човникові вектори Е. соїї/дріжджі з різними промоторами, наприклад, конститутивним САРОН або індукованим САЇ. 10 промоторами, можуть бути одержані таким же чином і також ведуть до секреції апротиніну

ОевзРго2-5ег10-Ага15-АЇІа17-Азр24-Тпг26-С1и31 -Азп41 -С1и53.

Зрозуміло, що поряд з цим можна також використовувати човникові вектори з іншим походженням реплікації дріжджів, наприклад, сегмент, що реплікується автономно (агв).

Придатними селективними маркерними генами поряд із геном ОНАЗ є також гени, які сприяють ауксотрофним мутантам дріжджів для прототрофи, такі, наприклад, як ГЕШ2г, НІЗЗ або ТАРІ. Крім того, можуть бути використані також гени, продукти яких визначають стійкість до різних антибіотиків, наприклад, до аміноглікозиду (3418.

Інші дріжджі, наприклад, метилотрофні дріжджі Ріспіа равіогіз або Напзепша роїутогрпа, після трансформації придатними векторами також в змозі продукувати апротинін ЮезРго2-5ег10-Аго15-АІа17-Авр24-Тпг26-С1ИЗ1 -

Авпа41 -С1и53.

Приклад 2

Одержання вектора експресії дріжджів для секреції рекомбінантного апротиніну бег10-Аг4д15-АІа17-Авр24-

Тиг26-21и31 -Авп41 -С1и153 з природною М-кінцевою послідовністю "Агд-Рго-Авр"

Для одержання вектора експресії дріжджів, що дозволяє одержати секрецію рекомбінантного апротиніну

Зег10-Аг915-АІа17-Азр24-Тпг26-С1и31-А5п41-сС1и53 з природною М-кінцевою послідовністю "Аго-Рго-Авр", спочатку за допомогою ПЛР підсилюють і клонують промотор МЕа1 з а-фактором пре-послідовності та 57-кінцем гена апротиніну (до послідовності впізнання рестрикційного ферменту Хпої). Праймери, що використовуються, мають такі послідовності:

Праймер С: вравсАТАСТАТТОАТААСАТТТТАААСаТтАТТТОАСАДА 3". Послідовність розпізнавання ЕсоВМУ підкреслена.

Праймер 0: вГа,авастопАСасСАСАААТСТОаТСТАаССАААаСАСААпААдаСАасСаАА

СААПАСАССАаСТаААААТАСАТаСААТСТСАТТСТТТТААТССОТТТАТАТТ 3.

Послідовність розпізнавання ХнНої! підкреслена.

Набір ПЛР містить 200нг рАг02 плазмідної ДНК, 0,2мкМ праймера С, 0,2мкМ праймера 0, 200мкМ амктрРв, 1 х

ПЛР реакційного буфера 11 (Бігаїадепе, Оріїі-Ргіте М) та 2,5 одиниці Тад полімерази (Реїкіп ЕІтег) загальним об'ємом 50мкл. Умови циклування: інкубування 1 хв. при 94"С, 30 циклів по 1хв. при 94"С, 1хв. при 507С та 2хв. при 727С і заключні 5хв. при 7270.

ПЛР-набір розводять у співвідношенні 1:5 і лігують з вектором рені! (Інвітроджен). Сумішшю для лігування трансформують клітини Е. соїї ОНба Позитивні клони ідентифікують після рестрикційного перетравлювання ферментом ЕсоВі і секвенують кілька клонів. Клон ріШ20.11.Ї. використовують для подальшої роботи.

Човниковий вектор руУЕ52 (Інвітроджен) Е.соПУдріжджі використовують для конструкції вектора секреції дріжджів, в якому послідовність апротиніну бЗепо-Аго15-АІа17-Авр24-Тпг26-с1и31-А5п41-с31053 безпосередньо зв'язана з альфа-фактором пре-послідовності дріжджів. Спочатку вектор рУЕ52 вирізають рестрикційними ферментами 55рі та Ватні, дефосфорилюють і очищають у гелі. При цьому наявні у векторі РУЕБ2 промотор

СА! 1 та її оїї видаляють. Фрагмент ДНК розміром близько 1030 пар основ за допомогою ферментів ЕсоВМ та Хної вирізають із вектора ріШ20.11.Ї, очищають електрофорезом на агарозному гелі і разом з фрагментом ХноЇ! та

Ватні розміром близько 180 пар основ із вектора рЕ59.10.Ї клонують у векторі РХЕ52, розрізаному ферментами

Зері та Ватні. Лігаційною сумішшю трансформують клітини Е.соїї ОНБба. Позитивні клони після рестрикційного перетравлювання ферментом Хпо! ідентифікують і секвенують. Клітини дріжджів (9УС234.40) трансформують вектором ріО28.11.ї, одержаним в результаті цього клонування. Експресійний вектор ріО28.11.Ї більше не містить ос-фактора про-послідовності, так що процесування апротиніну бег10-Аго15-Аіа17-Азр24-Тнг26-С1и31-

Азп41-С1и53 здійснюється виключно завдяки сигнальній пептидазі і незалежно від розщеплення протеазою Кехі!.

Приклад З

Ферментація Засспаготусез сегемівіає

Експресійний штам Засспаготусев сегемівіае ферментують описаним вище чином.

Приклад 4

Очищення похідних апротиніну без сумарного зарядупри нейтральному значенні рн 1. Огляд придатних способів очищення

Після ферментації клітини відокремлюють центрифугуванням, а надосадову рідину фільтрують з метою видалення клітин, що ще залишились.

Звільнену від клітин надосадову рідину підкислюють концентрованою лимонною кислотою до значення рн 3,0. Розчин розводять очищеною водою до досягнення електропровідності меншої, ніж вмСм/см. Потім розчин подають на колонку катіонного обмінника, попередньо врівноважену кислим буфером. Не зв'язаний матеріал видаляють шляхом промивання великою кількістю стартового буфера. Продукт елююють за допомогою сольового градієнта. Одержані фракції досліджують на вміст продукту за допомогою рідинної хроматографії під високим тиском зі зворотною фазою (АР-НРІ С) та біологічного тесту активності, який виявляє інгібування протеаз.

Фракції, що містять продукт, очищують і безпосередньо подають на препаративну ВР-НРІ С-колонку. Перед цим колонку врівноважують кислим буфером. Продукт елююють за допомогою градієнта органічного розчинника.

Фракції описаним вище чином знову досліджують на наявність продукту і фракції, що містять продукт, очищають.

В залежності від досягнутої чистоти продукту, можливо знадобиться очищення на другій ВР-НРІ С-колонці. Умови в основному аналогічні описаним вище. Одержаний розчин продукту розводять водою для ін'єкцій, розливають порціями і висушують заморожуванням.

Для очищення похідних апротиніну без сумарного заряду при нейтральному значенні рН з описаними вище процесами можуть бути комбіновані також афінна хроматографія за допомогою трипсину, (мобілізованого на сефарозі та гельпроникна хроматографія. 2. Очищення апротиніну ОезРго2-5ег10-Аго15-АЇіа17-Азр24-Тпг26-С1и31 -Азп41 -С1и53

Матеріал із 10-літрового ферментатора очищують таким способом.

Після закінчення ферментації вміст ферментатора підкислюють концентрованою лимонною кислотою до значення рН 3,0 і 10 хвилин витримують при 70 "С. Потім шляхом центрифугування (15 хвилин, 75009, Негаєив 7епіпййде) видаляють клітини і одержану надосадову рідину фільтрують (8мкм-0,2мкм, МіПіроге, Німеччина).

Надосадова рідина із цієї стадії після заморожування при -187"С може зберігатись до наступного використання.

Потім розчин розводять очищеною водою до досягнення електропровідністі менше 8мСм/см і подають на колонку

ЗР-Зерпагозе ЕЕ (Рпаптасіа, Швеція). Колонку попередньо врівноважують 50нМ цитрат-МаоН-буфером, рН3У. Не зв'язаний протеїн видаляють інтенсивним промиванням таким же буфером. Потім продукт елююють за допомогою сольового градієнта (1М МасСі) Одержані фракції досліджують на вміст продукту за допомогою рідинної хроматографії під високим тиском зі зворотною фазою (АР-НРІ С, С4) та шляхом тестування протеазо- інгібіторної активності. Фракції, що містять бажаний продукт, очищають.

Потім розчин продукту безпосередньо подають на першу АР-НРІ С-колонку (боцгсе 15 АРС, РНаптасіа,

Швеція), попередньо врівноважену 0,195 розчином трифтороцтової кислоти у воді. Не зв'язаний протеїн видаляють інтенсивним промиванням таким же буфером. Продукт елююють за допомогою лінійного ацетонітрильного градієнта (0-7095). Одержані фракції знову досліджують на вміст продукту описаними вище способами і ті з них, що містять продукт, очищають. Для заключного очищення розчин, що містить продукт, розводять водою для ін'єкцій і подають на другу АР-НРІ С-колонку (Мудас С8, Мудас, США), попередньо врівноважену 0,195 розчином трифтороцтової кислоти у воді. Не зв'язаний протеїн видаляють інтенсивним промиванням таким же буфером. Продукт елююють за допомогою лінійного ацетонітрильного градієнта (0-70).

Одержані фракції знову досліджують на вміст продукту описаними вище способами і ті з них, що містять продукт, очищають.

Одержаний розчин продукту розводять водою для ін'єкцій, розливають потрібними порціями (20,10, 1 та 0, 2мг), ліофілізують та аналізують.

Приклад 5

Визначення Кі-значення калікреїну плазми крові людини з апротиніном ЮОевзРго2-5ег10-Ага15-АІа17-Агврг4-

Тиг26-с1и31-Авп41-С1и53

Приклад: 1 одиницю калікреїну плазми розводять до 1їбмл буфером (0,05М Ттіз/0,1 М масі, 0,05 95 Тмееп-20, рн 8.2). 200мкл цього ферментативного розчину змішують з об'ємами, що зменшуються, тест-буфера (250, 240, 230,220,200, 180, 170, 150, 100, 5Омкл), а потім додають кількість інгібітора, що збільшується, в буфері для визначення (10, 20, ЗО, 50, 70, 80, 100, 150, 200 і 250 мкл, концентрація 0,7мкг/мкл).

Розчин інгібітора ферментів попередньо інкубують протягом 4 годин при кімнатній температурі. Потім 180 мкл кожного розчину поміщують у комірку мікротитрувального планшету і змішують з 20 мкл субстратного розчину.

Вимірюють зміну абсорбції на хвилі 405нм за 10 хвилин. Визначають швидкість ферментної реакції, а також значення Кі за методом Віейй (Віоспетіса! Медісіпе 32: 387-97(1984)).

Розчин сирового субстрату: 01 М в ОМ5О

Субстратний розчин: 1 х 103М 5-2302 в буфері для визначення

Буфер для визначення: 0,05М тріс-(гідроксиметил)-амінометан), 0,1 мМ масі, 0,05 95 Тмееп-20; рН 8,2; 1 мл бензилового спирту/л.

Кінетичні константи комплексування з ферментним фактором Хіа плазміну, бичачим трипсином та хімотрипсином визначають таким же способом. Субстратами служили: Хромозим Рі. для плазміну, НО-Рго-РНе-

Агуд-рМА для фактора ХІ, 5-2444 для трипсину та 5ис-Рпе-І ен-Рпе-рМА для хімотрипсину.

Приклад 6

Результати хімічної характеристики білка апротиніну ОезРго2-Зег10-Аг915-АЇІа17-АзО24-Тнг26-С1и31-Авпа1- аиБ5З

Інгібітор протеаз апротинін ЮОеєзРго2-5ег10-Аго915-АІа17-Авр24-Тпг26-С1031-А5п41-Сі053 одержують за допомогою дріжджевих організмів, змінених методами генної інженерії. Із надосадової рідини його очищують до однорідності за допомогою різних хроматографічних способів. Ідентичність інгібітора з клонованої послідовністю підтверджують подальшими аналітичними дослідженнями білка.

Аналіз М-термінальних послідовностей

Інгібітор протеаз повністю секвенують у 57 стадій. Наведений нижче запис показує визначену послідовність білка, ідентичну з клонованою послідовністю. 1

Ага-Азр-РНе-Сув-Іеи-СпИи-Рго-Рго-Зег-Тпг-Сіу-Рго-Сув-Аго-АЇіа-Аїа-Іе-Пе-Ага-туг- 21

РНе-Туг-Авр-АІа-Тиг-АІа-С1у-Геи-Сув-С1и-Типг-Рпе-МаІ-Туг-сСіу-с1у-Суз-Аго-Аїа-

Авп-Агд-Авп-Азп-Рпе-Ї уз-5ег-АІа-сіи-Авр-Сув-Меї-Спи- Тпг-Сув-Спу-с1у-Аїа

Аналіз послідовностей апротиніну ОезРго2-5ег10-Аг915-АІа17-Авр24-Тпг26-С1и31-А5п41-С1и53 здійснюють у 57 стадій.

Аналіз амінокислот

Аналіз амінокислот представляє важливий кількісний параметр для характеристики білка. Поряд із вмістом білка при відомій первинній структурі визначають кількість амінокислот. Аналіз амінокислот апротиніну ОезРгог2-

Зег10-Ага15-АІа17-Авр24-Тпг26-с1и31-А85п41-С1053 добре узгоджується з теоретичними знаннями про первинну структуру (табл. 1).

Таблиця 1

Аналіз амінокислот апротиніну ОезРго2-Зег10-Аго15-АЇа17-Азр24-Тпг26-С1иЗ І-А5п41-(31Ии53.

Експериментальні значення взяті відносно АІа-7

Амінокислоти Експериментальні значення Теоретичні значення

Суз5ОзН 5,28 (5)

Азр 6,27 6

Інг 3,49 4 зег 1,58 2 си 4,25 4 спу 6,16 (5)

Аа 7,00 7 маї 0,98 1

Меї 1,10 1

Не 1.66 2

Ї ем 1,89 2

Туг 2,49 З

Рпе 411 4 ув 1,05 1

Ага 4,73 5

Рго 3,23 З "у Цистеїни та метіоніни визначались після оксидування пермурашиною кислотою.

Хроматографія зі зворотною фазою

При НРІ С-хроматографії білків на хімічно зв'язаній зворотній фазі зв'язування з фазою, що використовується відбувається за рахунок гідрофобної взаємодії білків. Протеїни переміщуються в залежності від сили їх зв'язування зі стаціонарною фазою органічних розчинників (мобільна фаза). На цій підставі цей метод є добрим критерієм для оцінки чистоти протеїну. Апротинін ЮОевРго2-Зег10-АТаІ5-АІа17-Азр24-Тпг26-21и31-Ав5п41-с1и53 елююється як єдиний пік АР-18-фази. Виявилось, що ізольований інгібітор протеаз дуже чистий.

СЕ-Хроматографія

Капілярний електрофорез робить можливим відокремлення пептидів та білків на підставі їх заряду в електричному полі. При цьому якість відокремлення залежить від буфера, значення рН, температури та використовуваних домішок. Як капіляри застосовують колонки з так званим злитим кремнеземом з внутрішнім діаметром 50-100мкм. Апротинін ЮОезРго2-Зе/10-Аг915-АЇа17-Азр24-Тнг26-С1іи31-А5п41-С1153 відокремлюють на колонці зі злитим кремнеземом в електричному полі. Електроферограма має один гострий пік.

Визначення молекулярної ваги

Молекулярну вага апротиніну ОезРго2-Зег10-Аго15-АЇІа17-Азр24-Тпг26-с1и31-А5п41-с2І053 була визначена за допомогою системи МАГ ОІ: 6223 Дальтон. Виміряна молекулярна вага перебуває у відповідності з теоретичним значенням 6215 Дальтон в рамках точності методу вимірювання. Як матрикс використовують синапінову кислоту. 5О5-гель-електросьЬорез

Апротинін ЮОезРго2-5ег10-Аг915-АІа17-Азр24-Тпг26-с1и31-А5п41-С1053 аналізували за допомогою 505- електрофорезу за умов відновлення та у невідновлювальних умовах. Електроферограма має смугу в області близько 6,5кД.

Приклад 7

Визначення значень Кі для комплексування ферментів запротиніном ЮОезРго2-5ег10-Ага15-АІа17-Азр24-Тпг26-

Сій31-А5п41-с1053

Інгібіторні константи апротиніну Ое5Рго2-Зе10-Аго15-Аіа17-Авзр24-Тнг26-С1и31-А5п41-СІ053 визначались для різних ферментів. В табл. 2 наведені значення Кі.

Таблиця 2

Інгібіторні константи комплексування апротиніну ОезРго2-5ег10-Аго915-АІа17-Азр24-Тпг26-с1и31-Авпа41- сіи5З3 з ферментами та калікреїном плазми, фактором Хіа, бичачим хімотрипсином та бичачим трипсином.

Приклад 8

Взаємодія інгібіторів протеаз з поліклональними антитілами кроликів і, відповідно, людини

Рекомбінантно одержані інгібітори протеаз досліджувались на їх перехресну активність з поліклональними анти-апротинін-антитілами кроликів та, відповідно, людини. Було встановлено, що різні варіанти інгібіторів протеаз мають слабку взаємодію з апротинін-антисироватками.

ПРОТОКОЛ СЕКВЕНУВАННЯ

(1) ЗАГАЛЬНІ ДАНІ: (ї) ЗАЯВНИК: (А) ІМ'Я: ВАХЕВН ДО (В) ВУЛИЦЯ: ВАХЕВУ/ЕНК (С) МІСТО: ЛЕВЕРКУЗЕН (0) КРАЇНА: НІМЕЧЧИНА (Е) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС: 51368 (Е) ТЕЛЕФОН: 0214-3061455 (С) ТЕЛЕФАКС: 0214- 303482 (ї) НАЗВА ВИНАХОДУ: Похідні апротиніну з покращеними властивостями (її) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 5 (м) КОМПЧЮТЕРНІ ДАНІ: (А) НОСІЙ ІНФОРМАЦІЇ: Гнучкий диск (В) КОМП'ЮТЕР: ІВМ РС сумісний (С) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: РО-Б0О5/М5 0О5 (0) ПРОГР. ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ: Раїепіїп НеїІєазе 41.0, Версія Я1.30В (ЕРА) (2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ Мео:1: () ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 69 Пар основ (В) ВИД: Нуклеотид (С) ФОРМА: Одноланцюгова (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ВИД МОЛЕКУЛИ: Геномна ДНК (ії) ГІПОТЕТИЧНІ: НІ (м) АНТИСМИСЛОВА: НІ (у) ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: Праймер А (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 1: ,вастасСсАаАса СТААССОаТАА СААСТТСААА ТССОаСасцсААС АСТаСАТасА ААСТТОСОСаИт бо сатасттТАа 69 (2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме: 2: () ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ГАМОЕ: 93 Пар основ (В) ВИД: Нуклеотид (С) ФОРМА: Одналанцюгова (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ВИД МОЛЕКУЛИ: Геномна ДНК (ії) ГІПОТЕТИЧНІ: НІ (м) АНТИСМИСЛОВА: НІ (ух ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: Праймер В (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮО МО: 2: тасстослас сассатстАС таааСссСстТас АСАССТАТСА ТССОИТТАСТТ СТАСЧАТОаСА бо

АстасСдасассо тататаАААС СТТСОИТАТАСЄС СХ0аС 93 (2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме: 3: () ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ГАМОЕ: 38 Пар основ (В) ВИД: Нуклеотид (С) ФОРМА: Одналанцюгова (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (їі) ВИД МОЛЕКУЛИ: Геномна ДНК (у ВИД ФРАГМЕНТА: лінійна (/) ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: Праймер С (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІО МО: З: асаАТАТСТА ТТОАТААСАТ ТТАААСОИаТАТ ТТОАСАДО З8 (2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме: 4: () ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 99 Пар основ (В) ВИД: Нуклеотид (С) ФОРМА: Одноланцюгова (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ВИД МОЛЕКУЛИ: Геномна ДНК (ії) ГІПОТЕТИЧНІ: НІ (м) АНТИСМИСЛОВА: НІ (/) ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: Праймер О (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 4: свастоаАсОа САСАААТСТа ЧйТСТАассСАА АССАСААадА асласСсААСА АСАСАССА,Т бо

СААААТАСАТ СОААТСТСАТ ТСТТТТААТС СТТТАТАТТ 99

(2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме: 5: () ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 57 амінокислот (В) ВИД: амінокислота (С) ФОРМА: Одноланцюгова (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ВИД МОЛЕКУЛИ: пептид (м) ВИД ФРАГМЕНТА: лінійний (м) ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: варіант апротиніну (хї) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІО МО: 5:

АкаЯ Ар Ре Сув Гей бій Рго Рко бек Тік Сіу Рго Сув Акуд Аїа А1а 1 5 10 15

І1е І1їе Акуд Тук Рбе Туг АБр Аїа ТПх АТа С1Уу Тец Сув Сі Тік Ре чаї Тук С1у С1у Сув Аку А1а АБп Агуд АБп АвБп о Рре Пух бек Аіїа С1іц 40

Авр Сув Меє бі Тк Сув С1у С1у Аза

Гериктихщм варізнт вгрехтиніму зни З виндхкцм

Поспіддамоцті змінокисниот.

НАКИАКНАКЕ НЕК КВН ЕНЕЕЕНЕЕНЕНЕ ЯНВ вія НЕВНЕЕЕВУННЕНЕНЕТЕ і

Авротнніно ЧЕК ре КЕ Яр КАХ НОТА є КВ вд ЕВ, еВ еВ

Варемеє ВДЕ ен ВН Ве ВЕБ ІК ВК ВК с УК ЕН еуе КВ Б В Нв ее ВІ : п де п в В і сне пе В вн в нею ооооссве Нео ее ОЙ

Фіг.1

Claims (3)

1. Варіант Ое5Рго2-5ег10-Ате15-АІа17-Авр24-Тіг26-О1и31-Авп41-О10и53 апротиніну.

2. Варіант апротиніну згідно з п. 1, який є інгібітором серинових протеаз.

3. Лікарський засіб, що містить варіант апротиніну згідно з п. 1 або п. 2.