CZ236797A3

CZ236797A3 - Varianty aprotininu se zlepšenými vlastnostmi, léčiva tyto látky obsahující a jejich použití

Info

Publication number: CZ236797A3
Application number: CZ972367A
Authority: CZ
Inventors: Werner Dr. Schröder; Soren Bjorn; Kjeld Norris; Viggo Diness; Leif Norkskov-Lauritsen; Niels Dyhr Christensen
Original assignee: Bayer Aktiengesellschaft
Priority date: 1996-07-25
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 1998-02-18
Also published as: ID17508A; DE19629982A1; IL121361A0; NO973426D0; ES2217350T3; AR008783A1; CA2207071A1; TR199700688A2; RU2197983C2; SV1997000068A; CO4890857A1; JPH10101700A; HUP9701290A3; AU2870197A; PL321341A1; DE59711356D1; AU762041B2; SK101997A3; TW480271B; US20030096752A1

Description

Oblast techniky ΐ

j Vynález se týká variant aprotininu se zlepšenými enzymově inhibitorickými, imunologickými a farmakokinetickými vlastnostmi a jejich výroby.

Dosavadní stav techniky í’

Aprotinin, který je též označován jako hovězí pankreatický trypsinový inhibitor (BPTI) , patří ke skupině inhibitorů serinových proteáz Kunitzóva typu. Spektrum inhibovatelných serinových proteáz zahrnuje například trypsin, chymotrypsin, plasmin a plasmový kalikrein (V. Gebhard, H. Tschesche a H. Fritz, Proteinase Inhibitors, Barret and Salvesen (eds.), Elsevier Science Publ. BV 357387, 1986) .

Aprotinin se skládá z 58 aminokyselin. Trojdimensionální struktura bílkoviny byla osvětlena pomocí rentgenové strukturní analysy a NMR-spektroskopie (Vlodawer a kol. , J.

. '1 ..... ''_Mol.._Biol___1.9.8_(.3.)_,_4.6.9^_4.8.0.,_19-8.7-;—Vagner-a-kol-.-,-J-..-Mo-l—— i f Biol. 196 (1), 227-231, 1987; Berndt a kol., Biochemistry 32 (17), 4564-4570, 1993).

Pod obchodním názvem Trasylol^ se původně používal přírodní aprotinin pro ošetření pankreatitidy. Jak ukázala klinická studia, je dnes Trasylol používán v srdeční s

chirurgii, neboť při ošetření aprotininem se signifikantně sníží při takovýchto operacích potřeba transfusí a vede to k redukci dodatečného krvácení (D. Royston, J. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 6; 76-100, 1992) .

Mohlo být ukázáno, že při výměně inhibiční specifitu určující aminokyseliny v poloze 15 vede k hodnotným variantám aprotininu se zlepšenými inhibičními vlastnostmi (DE-PS 3 339 693) . Vždy podle zavedené aminokyseliny mohou být tímto způsobem vyrobené aktivní inhibitory, které inhibují například pankreatickou nebo leukocytární elastázu.

Později se ukázalo, že byly zjištěny inhibiční vlastnosti aprotininu a variant, vyrobených výměnou v poloze 15 , také výměnou dalších aminokyselinových zbytků v kontaktním regionu mezi inhibovanou cílovou proteasou a molekulou inhibitoru. K tomu patří především dodatečné aminokyselinové zbytky v poloze 14, 16, 17, 18, 19, 34, 38 a 39 . Varianty aprotininu se zlepšenými vlastnostmi, získané výměnou jednoho nebo více takovýchto aminokyselinových zbytků v oblasti kontaktního regionu byly mimo jiné popsány například v následujících spisech : VO 89/01968 , VO 89/10374 , EP 0 307 592 a EP 683 229 .

Zajímavě mohou být zlepšeny farmakokinetické vlastnosti aprotininu a jeho variant výměnou aminokyselin, které určují fyzikálně chemické vlastnosti látky. Ťak se podařilo snížením celkového kladného náboje molekuly signifikantní snížení vazby v ledvinách. Takovéto varianty byly popsány ve spise VO 92/06111 .

Z důvodu lepší možností technické připravitelnosti je v určitých případech výhodné provedení modifikace na N-ter3 rainálním konci molekuly. Takovéto modifikace mohou být zkráceni, prodloužení nebo delece N-terminálního konce u jedné nebo několika aminokyselin. N-terminálně modifikované varianty aprotininu jsou popsané například v EP 419 878.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu jsou varianty aprotininu, které se vyznačují následujícími znaky :

1. Výměna jedné nebo více aminokyselin v aktivním centru molekuly pro zlepšení aktivitních vlastností;

2. Výměna aminokyselin pro snížení positivního netto-náboje s cílem zlepšení imunologických a farmakokinetických vlastností;

3. Modifikace N-terminální aminokyselinové sekvence z důvodu technické připravitelnosti.

Varianty aprotininu, které právě obsahují pouze jeden z uvedených znaků, jsou popsané ve výše uvedených spisech. Varianty aprotininu podle předloženého vynálezu sjednocují ve své molekulové struktuře dva nebo tři z výše uvedených znaků. Sekvence aminokyselin je pro některé varianty příkladně znázorněna na obr. 1 7 ~

Varianty aprotininu podle předloženého vynálezu se však neomezuj i pouze na příklady, uvedené na obr. 1 . K variantám aprotininu podle předloženého vynálezu patří také varianty s N-terminálním prodloužením Ala(-2)-Gln(-1j , s přirozeným aminokyselinovým zbytkem prolinem v poloze 2 , s výměnou jiných aminokyselin, nesoucích kladný náboj, za neutrální nebo záporně nabité aminokyselinové zbytky, nebo s výměnou j iných neutrálních aminokyselin za negativně nabité aminokyselinové zbytky. Volba výměny aminokyselinových zbytků sleduje princip získání látky, která by při fyziologické hodnotě pH měla redukovaný positivní netto-náboj, výhodně v oblasti +2 až -2 . Uvedené změny v aminokyselinové sekvenci včetně N-terminálního prodloužení nebo zkrácení nebo delece může být využito v libovolné vzájemné kombinaci. K variantám aprotininu podle předloženého vynálezu náleží tedy všechny sloučeniny, které vykazují kombinaci výše uvedených znaků a které mají při fyziologické hodnotě pH redukovaný positivní netto-náboj.

Překvapivě se ukázalo, že kombinací dvou nebo tří jmenovaných znaků dochází nejen k dosažení, ale také částečně dokonce k zesílení výraznosti jednotlivých znaků. Kromě toho může být dosaženo signifikantně nových vlastností substance, které se týkají například imunologických, farmakokinetických a povrchově vazných vlastností. Nové varianty vykazují sníženou reakci s polyklonálními lidskými a králičími antisery, která bývají vytvořena při použití aprotininu. Dále bylo zjištěno, že nové varianty mají značně snížené imunogenní chování ve srovnání s aprotininem, to znamená, že vyvolávají sníženou imunoresponsi, Dále bylo ukázáno, že varianty podle předloženého vynálezu indukují ve srovnání s áprotininěm^__nížš’í ‘uvolňovaní’ Histáminu z'”krévriícK' buněk. Dále vykazují nové varianty podstatně nižší akumulaci v ledvinách ve srovnání s aprotininem. Enzymové kinetické inhibiční konstanty (Ki-hqdnoty) jsou překvapivě zlepšené přes velké množství změn v molekulové stavbě ve srovnání s původními variantami molekuly.

Předmětem předloženého vynálezu tedy jsou varianty aprotininu s netto-nábojem +3 až -3 při hodnotě pH 7 as aminokyselinami Arg 15 nebo Arg 15 - Ala 17 . Výhodné jsou takové, které mají netto-náboj +2 až -2 a obzvláště výhodně +1 až -1 .

Tyto aprotininové varianty jsou vhodné pro inhibici plasmatického kallikreinu, tkáňového kallikreinu a plasminu.

Navíc mohou mít tyto varianty aprotininu nměněnou. N-terminální sekvenci.

Tím jsou míněny varianty aprotininu s N-terminálním prodloužením nebo zkrácením nebo s deletovanými aminokyselinami na N-kónci.

Výhodné jsou varianty aprotininu ze skupiny zahrnující :

desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, desPro2-Serl0-Argl5-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, desPro2-Serl0-Argl5-Serl7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-aprotinin.

Tyto varianty aprotininu mohou také nést aminokyselinu prolin v poloze 2 .

Vynález se také týká léčiv, obsahujících jednu nebo více těchto variant aprotininu.

I*'

Popsané nové proteinové inhibitory jsou vhodné pro ošetření stavů onemocnění, při kterých dochází - také v důsledku komplexního chirurgického postupu, například v srdeční chirurgii nebo při alloartroplastických náhradách kloubů v transplantační medicíně - k aktivaci plasmatických enzymových systémů vlivem rozlehlých nebo intensivních kontaktů krve s cizími povrchy.

Inhibitory redukují ztráty krve při operacích, které jsou spojené se zvýšeným risikem krvácení (například operace srdce, kostní a kloubová chirurgie) . Jsou vhodné při terapii šoků, polytraumatu, mozkového a lebečního traumatu, sepse, diseminované nitrocévní koagulopatii (DIC) , celkového selhání orgánů a zánětlivých onemocnění účastněných na kallikreinovém systému, jako jsou revmatická onemocnění kloubů a astma. Zabraňují invasivníu růstu tumorů a tvorbě metastáz inhibicí plasminu. Jsou vhodné také vlivem inhibice syntesy bradykininu k terapii bolestí a edemů, jakož i k ošetření případů mrtvice.

Jsou také použitelné při léčbě dialysou a při použití umělých orgánů, aby snižovaly záněty a koagulaci a aby zmírňovaly risiko krvácení.

Příprava variant aprotininu podle předloženého vynálezu

Pro přípravu variant aprotininu podle předloženého vynálezu je vhodné použít postupů genové techniky. K tomu še používají obvyklé metody molekulární biologie ve vhodných mikrobiálních expresních organismech, které zavádějí genově technickou informaci pro syntesu odpovídající varianty aprotininu. Rekombinantní mikroorganismus se fermentuje; volbou vhodných podmínek jsou dávány heterologní informace pro expresi. Exprimované deriváty aprotininu se nakonec získávají z kultivačního media.

Vhodné hostitelské organismy pro produkci variant podle předloženého vynálezu mohou být bakterie, kvasinky nebo houby. Exprese může probíhat intracelulárně nebo za použití vhodných sekrečních systémů extracelulárně. Varianty aprotininu mohou být exprimovány prostým procesem nebo navázané na peptidy nebo bílkoviny.

Vhodné systémy pro expresi variant aprotininu jsou popsány ve spisech EP 683 229 , VO 89/02463 a VO 90/10075, a v různých dále nebo výše uvedených spisech.

Metody provádění způsobu podle předloženého vynálezu

Enzymy

Použité enzymy (restrikčni endonukleázy, alkalická fosfatáza z telecích střev, T4 polynukleotidkináza a T4 DNA ligáza) byly odebírány od firem Boehringer Mannheim a Gibco/BRL a byly aplikovány podle předpisů výrobců.

Molekulárně biologické techniky

Rutinní klonovací práce, jako je například isolace filasmidové^DNA“ Π. co Γι' (ťakzvaný~ňrini pr ep) a“třaňšf oř^ mace E. coli plasmidovou DNA se.provádí podle Sambrooka a kol. (Molecular Cloning Cold Spring Harbor, 1989). Jako hostitelský organismus se používá E. coli kmen DH5a (Gibco/BRL) . Pro isolaci větších množství plasmidové DNA še používá Qiágeň-tipš (Qiagen) . Extrákcě fragmentů DNA z agarosového gelu se provádí pomocí Jetsorbu podle údajů výrobce (Genomed) ,

Oligonukleotidy pro site directed mutagenesis-experimenty a primery pro PCR-reakce a sekvencovací reakce se vyrobí pomocí 380 A DNA synthesizeru firmy Applied Biosystems . Pokusy na mutagenesi se provádějí podle postupu Denga a Nickoloffa (Deng a kol., Anal. Biochem.

200. 81-88, 1992) za použití kitů firmy Pharmacia Biotech (Unique Site Elimination Mutagenesis) . Všechny konstrukce vektorů a experimenty mutagenese byly potvrzeny pomocí Taq Cycle-DNA-sekvencování s fluorescenčně značenými terminátory na ABI 373 A Sequenceru (Applied Biosystems) .

Transformace Saccharomyces cerevisiae

Buňky kvasinek, například kmene JC34.4D (ΜΑΤα, ura3-52, suc2) se vnesou do 10 ml YEPD (2 % glukosa, 2 % pepton, 1 % Difco kvasničný extrakt) a pěstují se při O.D-óoo nm 0.16 až 0,8 . Buňky se promyji 5 ml roztoku A (1 M solbitol, 10 mM bicin pH 8,35, 3 % ethylenglykol) , resuspendují se v 0,2 ml roztoku A a skladují se při teplotě -70 °C .

Plasmidová DNA (5 pg) a carrier-DNA (50 pg DNA ze sperma sledů) se přidá ke zmraženým buňkám. Buňky se potom nechají roztát třepáním po dobu 5 minut při teplotě 37 °C. Popr'ítlavku^__l'75mT^_řožtók'u B^—~’(40~ %*PĚG 3Ó00~, 200 mM bicin pH 8,35) se buňky inkubuji po dobu 60 minut při teplotě 30 °C , promyji se 1,5 ml roztoku C (0,15 M NaCl, 10 mM bicin pH 8,35) a resuspendují se ve .100 μΐ roztoku C . Naočkování se provádí na selektivní medium se 2 % agaru. Transformandy se získají po inkubaci po dobu 3 dnů při teplotě 30 °C .

Živná	media pro fermentaci
1.	SD2-medium :
	Bacto Yeast Nitrogen Base	6,6 g/l
	glukosa*	20 g/l
	kh₂po₄	6,7 g/l pH
2,	SČ5-medium :
	glukosa	20 g/l
	kvasničný extrakt Difco	20 g/l
	kh₂po₄	6,7 g/l
	(nh₄)₂so₄	2,0 g/l
	MgSO₄ x 7 H₂0	1,0 g/l
	roztok stopových prvků SL4	1,0 ml/1
		pH
	Roztok stopových prvků SL4 :
	Titriplex III	5 g/l
	FeS0₄ x 7 H₂0	2 g/l
	ZnSO₄ x 7 H₂0	0,1 g/l
	MnCl₂ x 4 H₂0	0,03 g/l
_ T— — -	” H3^B'°3 ' ”.....”	--------------ο-,-3-g/r-
	CoCl₂ x 6 H₂0	0,2 g/l
	CuCl₂ x 2 H₂0	0,01 g/l
	NíC1₂ x 6 H₂0	0,02 g/l
	Na₂Mo0₄ x 2 H₂0	0,03 g/l

* = odděleně autoklávováno

3.

Ferraentační medium

Glukosa*		2,0 g/1
sojový pepton		25,0 g/1
kh₂po₄		1.4 g/1
MgS0₄ x 7 H₂0		1,0 g/i
thiaminchlorid		5,1 mg/1
inositol	1 f Λ	20 mg/1
roztok stopových	ř prvků	3 ml/1
roztok vitamínů		3 ml/1
(NH₄)₂SO₄		3,8 g/1
Živný roztok :
Glukosa*		530 g/1
(NH₄)₂so₄		5,0 g/1
kh₂po₄		2,9 g/1
MgS0₄ x 7 H₂0		3,8 g/1
thiaminchlorid.		13 mg/1
inositol		70 mg/1
roztok stopových	prvků	6,8 ml/1
roztok vitaminů		6,8 ml/1
Roztok stopových	prvků :

pH 5,5

FeCl₃ x 6 H₂O ZnCl₂ x 4 H₂O h₃bo₃

CoC1₂ x 6 H₂O CUSÓ4 x 5 H₂0 Ná₂Mo04 x 2 H₂O

13, í	5 g/1
2,0	g/1
0,5	g/1
2,0	g/1
1,9	g/1
2,0	g/1

CaCl₂ x 2 H₂0 1,0 g/1

HC1 konc. 100 ml/1 * - odděleně autoklávováno

Roztok vitaminů :

Riboflavin	0,42 g/1
pantothenát vápenatý	5,9 g/1
kyselina nikotinová	6,1 g/1
hydrochlorid pyridoxinu	1,7 g/1
biotin	0,06 g/1
kyselina folová	0,04 g/1

Výroba pracovních konzerv

Základní konzervou se 1% zaočkuje 200 ml SD2-media v jednolitrové Erlenmayerově baňce. Kultura se inkubuje na třepačce (260 otáček za minutu) po dobu 72 hodin při teplotě 28 °C . Potom se naplní vždy 2 ml do nádobek a zmrazí se v kapalném dusíku.

Fermentace v třepacích baňkách

Jako předkultura se 1% zaočkuje 200 ml SD2-media ________v., j.e.dno.litr.o.vé., baňce _ pracovní., konzervou, a_fermentuje .se _po._ ..

dobu 72 hodin při teplotě 28 °C na třepačce při 260 otáčkách za minutu. Touto předkulturou se 1% zaočkuji hlavní kultury (200 ml SC5-media v jednolitrových baňkách) a inkubují se po dobu 72 až 96 hodin na třepačce při teplotě 28 °C .

Fermentace v desetilitrových bioreaktorech

Jako předkultura se 1% zaočkuje 200 ml SD2-media v jednolitrové baňce pracovní konzervou a fermentuje se po dobu 72 hodin při teplotě 28 °C na třepačce při 260 otáčkách za minutu. Hlavní kultura v desetilitrovém reaktoru se kultivuje jako fed-batch fermentace po dobu 96 hodin. Jako živné medium se použije výše uvedené fermentační medium, startovací objem činí 7 1 . Fermentor se zaočkuje 200 ml předkultury.

Podmínky fermentace :

Teplota : 28 °C, otáčky míchadla : 500 otáček za minutu, vzdušnění : 10 1/min pH ; 5,5 tlak v hlavě fermentoru : 20 kPa

Po 7 hodinách fermentace se zahájí přídavek živin., Hodnoty přídavku živin jsou řízeny přes respirační-kvocienty' (RQ) (RQ = vytvořený oxid uhličitý/spotřebovaný kyslík).

Pokud stoupne RQ na hodnotu >1,15 , tak se přídavek živin sníží, pokud klesne na hodnotu <1,05 , tak se přídavek živin zvýší.

.... -----y- pravidelných intervalech se z-fermentoru--odebírají-----vzorky a zjišťuje se růst buněk měřením optické hustoty při 700 nm. Kromě toho se zjišťuje koncentrace Bay 19-8757 v roztoku měřením aktivity.

Na konci fermentace se hodnota pH sníží přídavkem 50% kyseliny citrónové (hmotnost/objem) na 3,0 a obsah fermentoru se zahřeje po dobu 10 minut na teplotu 70 °C. Buňky se potom oddělí odstředěním při 7500 g a získaný roztok se použije k vyčištění bílkovin.

Materiály pro proteinchemickou analytiku

Sekvenční analysy se provádějí pomocí proteinsekvenceru model 473A firmy Applied Biosystems (Forster City, USA) . Používá se standardní sekvencovací program. Sekvencer, různé programy skvencování, jakož i PTH-detekčni systém jsou detailně popsány v návodu k obsluze (User’s manual protein sequencing systém model 473 A)(1989) Applied Biosystems Forster City, CA 94404, USA).

Reagencie pro provoz sekvenceru a HPLC-sloupec pro PTH-detekci byly převzaty od Applied Biosystems.

HPLC-analysy se provádějí za pomoci HP 1090 HPLC-Systemu firmy Hewlett Packard (D-Valdbronn). Pro dělení se používá RP-18-HPLC-sloupec (250 mm x 4,6 mm, 5 μ-materiál, průměr pórů 3 x 10”^ mm) firmy Backerbond (D-Grop Gerau).

Pro kapilární elketroforesu se používá model 270 A-HT od firmy Applied Biosystems (Forster City, CA 94404, USA) . Vzorky se injikují zpravidla hydrodynamicky v různých časových intervalech. Použité kapilární sloupce (50 pm x 72

- em)- - j sou- od -Applied Biosystems-.- - -------———.

Analysy aminokyselin se provádějí pomocí analysátoru aminokyselin LC 3000 firmy Eppendorf Biotronik (D-Maintal). používá se lehce modifikovaný standardní dělící program firmy Biotronik. Programy dělení a funkce analysátoru jsou obšírně popsané v návodu k použití přístroje.

Molekulové hmotnosti se zjišťují pomocí systému MALDI I firmy Kratos/Shimadzu (D-Duisburg). SDR-elektroforesa se provádí pomocí systému elektroforesy firmy Pharmacia (D-Freiburg).

Zjišťování kinetických dat se provádí pomocí mikrotitračních destiček firmy SLT (D-Crailsheim). Mytí mikrotitračních destiček se provádí pomocí mycího přístroje firmy Dynatec (D-Denkendorf) .

Enzymy a substráty jsou od firmy Calbiochem (D-Bad Soden) . Všechny ostatní chemikálie jsou od firmy Merck (D-Darmstadt) nebo Sigma (D-Deisenhofen) . 96-jamkové destičky jsou od firmy Greiner.

Polyklonální králičí anti-aprotininové protilátky se získají z králíků imunisací aprotininem. Lidské polyklonální anti-aprotininové protilátky pocházejí od pacientů, ošetřených aprotininem.

Proteinchemická analytika

N-Terminální sekvencová analysa až 3 mmol proteázového inhibitoru se nasadí na - Šěqůenzersheet ^l,_, ^_který”byl-předinkubován· polybrenem--^-Pro—— ---- — tein se skvencuje v celkem normálním cyklu sekvencemi. PTH-aminokyseliny se identifikují za použití online-HPLC pomocí 50 pmol PTH-standardu.

Analysa aminokyselin

200 pg proteinu se rozpustí ve 200 μΐ 6 N kyseliny chlorovodíkové a hydrolysuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 166 °C . Asi 1 mmol vzorku se nanese do analysátoru aminokyselin. Množství aminokyselin se zjišťuje přes 5 mmol standard.

SDS gelová elektroforesa

SDS gelová elektroforesa se provádí v podmínkách dle Laemmli. 10 pg proteázového inhibitoru se analysuje v 10% ,až 20% SDS-gelu a detekuje se pomocí vybarvení stříbrem (Merril a kol.)

U.K. Laemmli, Nátuře 227, 680-685 (1970) ;

C.R. Merril, M.L. Dunau, D. Goldmann, Anal. Biochem. 100 : 201-207 (1981).

Kapilární elektroforesa ng proteázového inhibitoru se zkoumá pomoci kapilární elektroforesy na skleněném sloupci (délka 72 cm, vnitřní průměr 50 μπι) . Podmínky : proud 90 μΑ, teplota sloupce 25 °C , 100 nM fosfátový pufr pH 3,0 , detekce 210 nm, pod tlakem 3 vteřiny.

Reversní'fázová chromatograf±e ' ---------------- —- —- — 5 nmol proteázového inhibitoru se chromatografuje na sloupci Bakerbond RP-18-HPLC (materiál 5 μ, 4,6 nm x 250 mm, velikost pórů 3 x 10’^ mm) . Jako eluent se použije gradient acetonitril/TFA . Podmínky : rychlost toku 0,7 ml/min, teplota sloupce 40 °C , rozpouštědlo A 0,1 %

TFA , rozpouštědlo B 0,1 % TFA/60 % acetonitril; gradient: 0 min 0 % B , 10 min 0 % B , 70 min 100 % B , 80 min 0 % B .

Stanovení molekulové hmotnosti pg proteázového inhibitoru se analysuje technikou MALDI . Jako matrice se použije kyselina sinapinová. Jako standardní proteiny pro hmotnostní kalibraci se použije telecí insulin, cytochrom C a melittin.

Obsah proteinů

Obsah proteinů se stanovuje metodou BCA . Při této 2+ 1+ metodě se přemění přítomnými proteiny Cu ionty na Cu ionty, které tvoří s kyselinou bicinchoninovou komplex, absorbující při 560 nm .

Lyofilisovaný protein se převede do rovnovážného stavu vlhkosti a rozpustí se v koncentraci 1 mg/ml v 0,9% roztoku chloridu sodného. Připraví se zředbvací řada. K 50 pl* roztoku vzorku se přidá 1000 μΐ testovací reagencie BCA (Pierce) , reagenční zkumavka se pevně uzavře zátkou a ínkubuje se po dobu 30 inut při teplotě 60 °C . Po ochlazení vzorku v ledové lázni po dobu 5 minut se provádí měření při teplotě 25 °C a vlnové délce 560 nm.

Aktivita (trypsinový inhibiční test, titračně)

Aktivita se zjišťuje pomoci modifikovaného inhibičního testu trypsinu F.I.P.. Bay y 19-8757 inhibuje trypsinem katalysovanou hydrolysu Na-benzoyl-L-argininethylesteru (BAEE) . Karboxylové skupiny, uvolněné při reakci, se zjiš17 fuj i alkalimetrickou titrací. Zbytková aktivita trypsinu je mírou inhibiční aktivity účinné látky,

Lyofilisovaný protein se převede do rovnovážného stavu vlhkosti, rozpustí se v koncentraci 1 mg/1 v 0,9% roztoku chloridu sodného a připraví se zřeďovací řada. K 1 ml roztoku vzorku se přidají 2 ml pufru (15 mM borátového pufru, pH 8,0 se. 200 mM CaCl₂) a 0,8 ml roztoku trypsinu (2 mg/ml) a směs se inkubuje po dobu 5 minut při teplotě 25 °C . Potom se přidá 0,2 ml roztoku BAEE (6,8 mg/ml) a měří se spotřeba KOH po dobu 5 minut.

Zjištění křížové reakce proteázového inhibitoru s polyklonálními králičími, popřípadě lidskými antiaprotininovými protilátkami

0,5 až 10 ng proteázového inhibitoru, popřípadě aprotininu, rozpuštěných v kopulačním pufru, se naváže přes noc při teplotě 4 °C na mikrotitrační destičku. Jamky se promyjí čtyřikrát vždy 200 μΐ promývacíhó pufru a potům se přidá 100 μΐ blokačního roztoku. Destička se přikryje a inkubuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C . Po promytí, jak bylo uvedeno výše, se přidá polyklonální králičí antiaprotininová protilátka (0,2 pg/ml v 1% BSA v PBS-pufru), popřípadě polyklonální lidská protilátka (20 —-gg/mi—v -1%- HSA v -PBS-pufruj-. —Destička se^zakryje -a-inku-— buje se po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C a potom se promyje, jak je uvedeno výše. Nyní se přidá 100 μΐ biotinylované anti-králičí, popřípadě anti-lidské protilátky (25 μΐ + 10 ml 1% BSA , popřípadě 1% HSA v PBS-pufru) a inkubuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C . Destička se promyje jak je výše uvedeno a přidá se do každé jamky 100 μΐ streptavidin-peroxidázového komplexu (50 μΐ + + 10 ml 1% BSA , popřípadě 1% HSA v PBS-pufru) . Destička se zakryje, inkubuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C a potom se promyje, jak je uvedeno výše.

Substrátová reakce se provádí s TBM-substrátem + roztokem peroxidázy (1:1; 100 μΐ pro jamku) . Reakce se ukončí po 10 minutách 100 μΐ pro jamku 2 M kyseliny fosforečné a měří se absorpce při 450 nm (reference 570 nm) .

Roztoky

Inkubační pufr :

Pufr pro vzorky :

nM Na2CO3, 35 mM NaHCOg, pH 9,6 vzorky se ve vhodné koncentraci rozpustí v inkubačním pufru

Promývací roztok :

0,1% (v/v)

Tween-20 v PBS

Blokační pufr :

3% (v/v) BSA v PBS.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba kvasinkového expresního vektoru pro sekreci rekombinantního desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr2ó-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu

Jako výchozí materiál pro výrobu, genu desPro2-SerlO- Ar gl 5-Alal7-Asp24-Thr 26-Glu31-A$n41-Glu5 3-aprotininu slouží gen desPro2-Argl5-Alal7 , který byl klonován restrikčními enzymy HindiTI a BamHI do vektoru pUC18 . Resultující vektor (pEM6.6.L) se podrobí pomocí Mutagenese Primeru A a Scal/Mlul U.S.E. Selektionsprimeru dvoušroubovícové mutagenesní reakci podle postupu U.S.E (Pharmacia Biotech). Mutagenese Primer A má následuj ící sekvenci :

Primer A .1 i ’ GGCTGCAGAGCTAACCGTAACAACTTCAAATCCGCGGAAGACTGCATGGAAACTTGC GGTGGTGCTTAG 3’ . Tento primer generuje mutace Asn41 a Glu53 v genu desPro2-Argl5-Alal7 aprotininu. Analysa klonů se provádí restrikčním štěpením pomocí enzymů Seal a Sphl. Požadovaná sekvence byla kromě toho potvrzena pomocí DNA-sekvencování klonu pEM31.8.L . Další výměny v 5'-oblasti genu (Serl0-Asp24-Thr26-Glu31) byly provedeny pomoci PCR-techniky za použití Primeru B a reversního 24-mer M13 ’ Primeru, když se vycházelo z pEM31.8.L plasmid DNA . Primer . B má následující sekvenci :

Primer B ’ TGCCTCGAGCCGCCGTCTACTGGGCCCTGCAGAGCTATCATCCGTTACTTCTACG ATGCAACTGCAGGCCTGTGTGAAACCTTCGTATACOGC 3’ . Xhol poznávací

~.sekvence-je podtržená-.- -....................— ·.....*·—

PCR-vsázka obsahuje 20 ng pEM31.8.L plasmid DNA , 20 pmol reversní 24-mer M13 ’ primeru, 60. pmol Primeru B , 200 μΜ dNTPs , 1 x PCR reakčního pufru II (Perkin Elmer), 4 mM chloridu hořečnatého a 2,5 U Taq DNA polymerázy (Peřkin Elmer) v celkovém objemu 100 μΐ . Podmínky cyklu jsou :

min pří teplotě 94 °C , 30 cyklů vždy 1 min při teplotě 94 °C , 1 min při teplotě 55 °C a 1 min při teplotě 72 °C a následující pětiminutová inkubace při teplotě 72 °C. PCR-vsázka se zředí 1:5 a liguje se s vektorem pCRII (invitrogen) . Ligační vsázkou se transformují buňky E. coli DH5a . Positivní klony se identifikuji po restrikčním štěpení enzymy Xhol a BamHI a více klonů se sekvencuje.

Klon pES9.10.L obsahuje požadovanou sekvenci a používá se pro další práci.

Vektor E. coli/kvasinky (například pA202) se použije pro konstrukci kvasinkového sekrečního vektoru,, ve kterém je spojena sekvence desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu se, pre-pro-sekvencí alfa-faktoru kvasinek.

Vektor pA202 nese gen ampicilinové resistence (bia) a URA3 gen jako selektovatelný značkový gen pro E. coli a kvasinky. Další esenciální prvky vektoru jsou Col El a 2 μ původní bod replikace (ori) . REP3 Locus se nachází rovněž v tomto regionu. 1200 Bp veliký EcoRI-Hindl11-fragment nese MFal promotor a N-terminální pre-pro-sekvenci kvasinkového alfa-faktor-předchozího proteinu (Kurjan a Herskowitz, Cell 30, 933-934, 1982) . Zavedením modifikovaného desPro2-Argl5-aprotinin-cDNA jako HindlII-BamHI fragment se opět vyrobí rozeznávací místo pro KexII-proteázu . . ._(.’_Lys-Arg-.uvnitř -a-l-fa-faktor-pre-pro = sekvence (EP 0 419 878).

Na 3*-konci sekvence desPro2-Argl5-aprotininu nese vektor BamHI-Sáli fragment kvasinkového URA3 genu, který v této poloze funguje jako terminační signál pro transkripci (Yarger a kol., Mol. Cell. Biol. 6., 1095-1101, 1986) .

180 Bp veliký DNA-fragment se pomocí Xhol a BamHI odštěpí z vektoru pES9.10.L , vyčistí se elektroforesou na agarosovém gelu a klonuje se do rovněž pomocí Xhol a BamHI štěpeného a defosforylovaného vektoru pA202 . Tímto klonováním se nahradí desPro2-Argl5-aprotinin ve vektoru pA202 za desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Clu53-aprotinin. Buňky kvasinek (JC34.4D) se transformují vektorem pES13.10.L , resultujícím z tohoto klonování.

Jiné vektory E. coli/kvasinky s různými promotory, jako je například konstitutivní GAPDH nebo indukovatelný GAL 10 promotor, se mohou vyrobit obdobným způsobem a vedou rovněž k sekreci desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu.

Vedle toho jé samozřejmě také možné použít vektory s jinými původy replikace kvasinek, jako je například chromosomální autonomně replikovatelný segment (ars) .

Vhodné selektovatelné markerové geny jsou vedle UŘA3 genu takové geny, které auxotrofnímu mutantu kvasinky dopomáhají k prototrofii, jako jsou například geny LEU2 , HIS3 nebo TRPÍ . Kromě toho je možno také samozřejmě použít geny, jejichž produkty zprostředkovávají resistenci vůči různým antibiotikům, jako je například amnoglykosid G418 .

Jiné kvasinky, jako jsou například kvasinky Pichia pastoris nebo Hansehula polymorpha, jsou po transformaci vhodnými vektory rovněž schopné produkovat desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu3l-Asn41-Glu53-aprotinin.

Příklad 2

Výroba kvasinkového expresního vektoru pro sekreci rekombinantní ho Serl0-Argl5- Alal7-Asp24-Thr2ó-Glu31- Asn41 -Glu53-aprotíninu s přírodní N-terminální sekvencí ’Arg-Pro-Asp’

Pro výrobu kvasinkového expresního vektoru, který dovoluje sekreci Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu s přírodní N-terminální sekvencí ’A.rg-Pro-Asp ’ , se nejprve přes PCR ámplifikuje a klonuje MFal promotor s α-faktorem pre-sekvence a 5’-koncem genu aprotininu (až k rozpoznávací sekvenci restrikčního enzymu Xhol) . Použitý primer má následuj ící sekvenci :

Primer C ’ -GGGATATCTATTGATAAGATTTAAAGGTATTTGACAAG- 3 ’ . Rozpoznávací sekvence EcoRV je podtržena.

Primer D ’ -GGGCTCGAGGCAGAAATCTGGTCTAGCCAAAGCAGAAGAAGCAGCGAACAAGAC AGCAGTGAAAATAGATGGAATCTCATTCTTTTAATCGTTTATATT-3 ’ . Rozpoznávací sekvence Xhol je podtržena.

PCR-vsázka obsahuje 200 ng pA202 plasmid DNA, 0,2 _ __μΜ. .primeru-C0-,-2- -μΜ-primeru^-D200' μΜ tlNTPš ,^- i x”PČR reakčního pufru 11 (Stratagene, opti-Prime ) a 2,5 U Taq DNA polymerázy (Perkin'Elmer) v.celkovém objemu 50 μΐ. Podmínky cyklu jsou : 1 min při teplotě 94 °C , 30 cyklů vždy 1 min při teplotě 94 °C , 1 min při teplotě 50 °C a 2 min při teplotě 72 °C a následující pětiminutová inkubace při teplotě 72 °C. PCR-vsázka se zředí 1 : 5 a liguje se s vektorem pCRII (invitrogen) . Ligační vsázkou se transformují buňky E. coli DH5« . Positivní klony se identifikují po restrikčním štěpení enzymem EcoRI a více klonů se sekvencuje. Klon pIU20.11.L se používá pro další práci.

Vektor E. coli/kvasinky pYES2 (invitrogen) se použije pro konstrukci kvasinkového sekrečního vektoru, ve kterém je spojena sekvence Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu přímo s pre-pro-sekvencí alfa-faktoru kvasinek. Nejprve se rozštěpí vektor pYES2 restrikčními enzymy SspI a BamHI , defúsforyluje se a čistí se gelovou chromatografií. Na vektoru pYES2 přítomný GAL1 promotor a fl ori se při tom odstraní. Asi 1030 Bp velký fragment DNA se pomocí EcoRV a Xhol odštěpí z vektoru pIU20.11.L , vyčistí se pomocí elektroforesy na agarosovém gelu a společně s asi 180 Bp velkým Xhol a BamHI fragmentem z vektoru pES9.10.L se klonují do vektoru pYES2 , rozštěpeného pomocí SspI a BamHI . Ligační vsázkou se transformují buňky E. coli DH5a . Positivní klony se identifikují a sekvencuji po restrikčním štěpení enzymem Xhol . Buňky kvasinek (JC34.4D) se transformují vektorem pIU28.11.L , resultujícím z tohoto lonování. Expresní vektor pIU28.11.L neobsahuje žádnou α-faktor pro-sekvenci, takže probíhá procesování Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu výhradně signální peptidázou a je nezávislé na štěpení... KexI.I proteázou-...... - .....

Příklad3

Fermentace Saccharomyces cerevisiae

Expresní kmen Saccharomyces cerevisiae se fermentuje jak je popsáno výše.

Příklad 4

Čištění derivátů aprotininu bez netto-náboje při neutrální hodnotě pH

1. Přehled vhodných postupů čištění

Po fermentaci se buňky oddělí odstředěním a zbylá kapalina se přefiltruje, aby se odstranily zbylé buňky.

Hodnota pH této kapaliny se nastaví pomocí koncentrované kyselinycitrónové na 3 . Roztok se musí vhodně zředit vyčištěnou vodou tak, aby byla nastavena vodivost nižší než 8 mS/cm . Potom se roztok nanese na sloupec kationtoměniče, který byl předem ekvilibrován kyselým pufrem. Nevázaný materiál se odstraní dostatečným promytím startovacím pufrem. Produkt se eluuje pomocí-gradientu soli. Získané frakce se zkouší na svůj obsah produktu pomocí reversní vysokotlaké kapalinové chromatografie (RP-HPLC) a biologickým testem aktivity, který stanovuje inhibici proteáz. Produkt obsahující frakce se spojí a přímo se nanesou na preparativní RP-HPLC sloupec, který byl předem ekvilibrován kyselýmpuf r.em..... „Nevázaný- protein -se ze sloupce odstraní -promytím startovacím pufrem a produkt se eluuje pomocí gradientu organických rozpouštědel. Frakce se potom znovu zkoušejí na obsah produktu jak je uvedeno výše a ty frakce, které obsahují produkt, se spojí. V závislosti na dosažené čistotě produktu může být nutné spojené frakce čistit přes druhý RP-HPLC sloupec. Podmínky jsou v podstatě stejné, jako je popsáno výše. Získaný roztok produktu se zředí vodou pro injekce, naplní se do vhodných nádob a lyofilisuji se.

Jiné metody pro čištění derivátů aprotininu bez netto-náboje při neutrální hodnotě pH , které se mohou kombinovat s výše popsanými procesy, je afinitní chromato_; grafie na sepharose s imobilisovaným trypsinem a gelová permeační chromatografie.

2. Čištění desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu3l-Asn41-Glu53-aprotininu

Materiál z destilitrového fermentoru se čistí následujícím postupem. Po ukončení fermentace se hodnota pH obsahu fermentoru upraví pomocí koncentrované kyseliny citrónové na 3 a zahřívá se na teplotu 70 °C po dobu 5 minut. Potom se buňky odstraní odstředěním (15 minut,

7500 x g , odstředivka Heraeus) a získaná kapalina se přefiltruje (8 μπι až 0., 2 μιη, Millipore, BRD) . Z tohoto stupně se může filtrát zpracovat zmrazením při teplotě -18 °C pro další použití. Roztok se potom přídavkem vyčištěné vody zředí tak, aby vodivost byla nižší než 8 mS/cm a nanese se na sloupec SP-sépharosy FF (Pharmacia, Švédsko) , kteý byl předem ekvilibrován 50 nM citrát-NaOH pufru, pH 3 . Nenavázaný protein se odstraní intensivním

-------------- ...promýváním -stejným--puf-rem. - -Potom · se- produkt 'eluuje' pomocí' ' i gradientu soli (1 M NaCl) . Získané frakce se zkoušejí pomocí reversní vysokotlaké kapalinové chromatografie (RP-HPLC, C4) a testováním proteázové inhibiční aktivity na obsah produktu. Spojí se frakce, které obsahují požadovaný produkt.

Potom se roztok produktu přímo nanese na RP-HPLC sloupec (Source 15 RPC, Pharmacia, Švédsko) , který byl předem ekvilibrován 0,1% kyselinou trifluoroctovou ve vodě. Nenavázaný protein se odstraní intensivním promytím stejným pufrem. Produkt se eluuje pomocí lineárního acetontrilového gradientu (0 až 70 %) . Získané frakce se zkoušejí na obsah produktu znovu výše popsanými metodami a ty frakce, které obsahuj i produkt, se spoj í.

Pro závěrečné čištění se produkt obsahující roztok zředí vodou pro injekční účely a nanese se na druhý RP-HPLC sloupec (Vydac C8, Vydac, USA) , který byl předem ekvilibrován 0,1% kyselinou trif luoroctovou ve vodě. Nenavázaný protein se odstraní intensivním promytím stejným pufrem. Produkt se eluuje pomocí lineárního acetontrilového gradientu (0 až .70 %) . Získané frakce se zkoušejí na obsah produktu znovu výše popsanými metodami a ty frakce, které obsahují produkt, se spojí.

Získaný roztok produktu se zředí vodou pro injekce, naplní se do vhodných nádob (20, 10, 1 a 0,2 mg) , lyofi1 i suje se a analysuje.

Příklad 5

Stanovení hodnoty Ki lidského plasmového kallikreinu ponoci des Pr o - Ser 10 -Ar.gl 5.- Alal7 - Asp 24 -Thr 26 - Glu31 - Asn4 l·- Glu5 3 - aprotininu

Příklad :

jednotka lidského plasmového kallikreinu se zředí pufrem (0,05 M Tris-/0,l M NaCl, 0,05 % Tween-20; pH 8,2) na 16 ml . 200 μΐ tohoto roztoku enzymu se smísí se snižujícími se objemy testovacího pufru (250, 240, 230, 220, 200, 180, 170, 150, 100, 50 μΐ) a potom se přidá vzrůstající množství inhibitoru v assay pufru (10, 20, 30, 50,70,

80, 100, 150, 200 a 250 μΐ; koncentrace 0,7 gg/μΐ) .

Roztok enzym/inhibitor se předběžně inkubuje při teplotě místnosti po dobu 4 hodin. Potom se 180 μΐ z každého roztoku vnese do jamky mikrotitrační destičky a smísí se se 20 μΐ roztoku substrátu. Změna absorpce se měří při 405 nm po dobu 10 minut. Stanovuje se rychlost enzymové reakce a z té se počítá hodnota Ki podle metody Bietha (Biochemical Medicine 32 ; 387-397 (1984)).

Substrát Stock roztok': 0,1 M v DMSO roztok substrátu : 1 x 10’% S-2302 v assay-pufru assay-pufr : 0,05 M tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 0,1 M NaCl, 0,05 % Tween-20; pH 8,2; 1 ml benzylalkohol/1 .

Kinetické konstanty komplexování s enzymovým plasminovým faktorem Xla, hovězím trypsinem a chymotrypsinem se stanovují stejnými postupy. Substráty jsou Chromozym PL pro plasmin, HD-Pro-Phe-Arg-pNA pro faktor XI , S-2444 pro trypsin a Suc-Phe-Leu-Phe-pNA pro chymotrypsin.

Příklad 6

Výsledky proteinchemické charakterisace desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu

Proteázový inhibitor desPro2-Ser!0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin se vyrobí pomocí genovými technikami změněného kvasinkového organismu sekreci, Z kapaliny nad kvasinkami se čistí různými chromatograf ickými postupy až do homogenity. Identitu inhibitoru s klonovanou sekvencí ukazují následující proteinově analytické zkoušky,

N-terminální sekvenční analysa

Proteázový inhibitor se úplně sekvencuje přes 57 stupňů. V následujícím je uvedena proteinová sekvence, která je identická s klonovanou sekvencí

Arg-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Ser-Thr-Gly-Pro-Cys-Arg15

-Ala-Ala-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asp-Ala-Thr-Ala-Gly-Leu29

-Cys-Glu-Thr - Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Asn-Arg- Asn43

-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Glu-Thr-Cýs-Gly-Gly57

-Ala

Sekvenční analysa desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr2ó- T.Glu3.1.^Asn41^Glu53-ap-rotin-inu p-řes.....5-7-stupňů -.—

Analysa aminokyselin

Analysa aminokyselin představuje důležitý kvantitativní parametr pro charakterisaci proteinu. Vedle obsahu proteinu se při známé primární struktuře zjišťuje počet jednotlivých aminokyselin. Analysa aminokyselin desPro2-Ser10-ArglS-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu je v dobrém souladu s teoretickými hodnotami z primární struktury, jak je patrno z tabulky 1 .

Tabulka 1

Analysa aminokyselin desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu Celé počty jsou vztaženy na Ala = 7 .

Aminokyselina	celý počet	teor. počet
CysSO₃H		5,28	6
Asp		6,27	6
Thr		3,49	4
Ser		1,58	2
Glu		4,25	4
Gly		6,16	6
Ala		7,00	7
Val		0,98	1
Met		1,10	1
Ile		1,66	2
Leu		1,89	2-
Tyr		2,49	3
Phe		⁴ 4,11	4
Lys		1,05	1
Arg		4,73	' 5
Pro		3,23	3

*)' cystein a’métMónirfTsě' 'stanovuj ípó oxidaci' Kyselinou permravenči (Met jako methioninsulfon).

Reversní fázová chromatografie

Při HPLC-chromatografii proteinů na chemicky vázané reversní fázi dochází přes hydrofobní vzájemné působení proteinů k vazbě na použitou fázi. Proteiny se podle síly své vazby na stacionární fázi vytěsňují organickými rozpouštědly (mobilní fáze) . Z tohoto hlediska je tato metoda dobrým kriteriem pro určení čistoty proteinu. DesPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin je eluován jako jediný peak z RP-18-fáze. Ukázalo se, že isolovaný proteázový inhibitor je velmi čistý.

CE-chromat Ogr af i e

Kapilární elektroforesa dovoluje dělení peptidů a proteinů na základě jejich náboje v elektrickém poli. Úspěšnost dělení při tom závisí na pufru, hodnotě pH, teplotě a použitých additivech. Jako kapiláry se používají takzvané fused silica sloupce s vnitřním průměrem 50 až 100 μπ . DesPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr2ó-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin se dělí na fused silica sloupci v elektrickém poli. Elektroforeogram vykazuje štíhlý peak.

Stanoveni molekulové hmotnosti

Molekulová hmotnost desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24~ ^zThr26-Glu31- Asn41“Glu53'-'aprotinínu bylazj ištěna^- pomoci - - ^r

MALDI-techniky 6223 Daltonů. Zjištěná molekulová hmotnost je při tom v dobrém souladu s teoretickou hodnotou 6215 Daltonů v rámci přesnosti metody měření. Kyselina sinapinová se použije jako matrice.

SDS-gelová elektroforesa

DesPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin se analysuje pomocí SDS-elektoforesy za redukujících a neredukujících podmínek. Vykazuje pásy v oblasti ca. 6,5 kD .

Příklad. 7

Stanovení Ki-hodnoty pro kompkexování enzymů s DesPro2dl·

-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininem

Inhibiční konstanty desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu se stanovují pro různé enzymy. V tabulce 2 jsou uvedené Ki-hodnoty

Tabulka 2

Inhibiční konstanty komplexování desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu s enzymy plasminem, plasmovým kaliikreinem, faktorem Xla, hovězím chymotrypsinem a hovězím trypsinem

Enzym	hodnota Ki [M]
plasmový kallikrein	2 x 10¹¹
plasmin	5 x 10¹⁰
faktor Xla	5 x 10^1θ
trypsin	2 x 10^-11
chymot ryps i n	9 x ΙΟ⁹

Příklad 8

Vzájemné působení proteázových inhibitorů s polyklonálními králičími, popřípadě lidskými anti-aprotininovými protilátkami

Rekombinantně vyrobené proteázové inhibitory se zkoušejí na svoji křížovou aktivitu s polyklonálními králičími, popřípadě lidskými anti-aprotininovými protilátkami. Bylo zjištěno, že různé varianty proteázových inhibitorů vykazují pouze velmi slabé vzájemné působení s' aprotininovými antiséry.

Sekvenční protokol (1) Všeobecné údaje :

(i) Přihlašovatel :

(A)	Jméno :	Bayer AG
(B)	ulice :	Bayerwerk
(C)	místo :	Leverkusen
(E)	stát : Německo
(F)	poštovní	směrovací číslo
(G)	telefon	: 0214-3061455
(H)	telefax	: 0214-303482

(ii) Název vynálezu : Varianty aprotininu se zlepšenými vlastnostmi (iii) Počet sekvencí : 5 (iv) Počítačově čitelná forma :

(A) Nosič dat : Floppy disk (B) počítač : IBM PC compatible (C) provozní systém : PC-DOS/MS-DOS (D) software : Patentln Release #1.0, verse #1.30B (EPA) (2) Údaje pro SEQ ID č.: 1 :

(i) Charakteristické znaky sekvence :

......(Aj--Délka--: -69-párů basí - - - -- *- - - - - - - — (B) druh : nukleotid (C) forma šroubovice : jednoduchá šroubovice (D) topologie : lineární (ii) Druh molekuly : genom-DNA (iii) Hypoteticky : ne (iv) Antisense : ne (ví) Původ :

(A) Organismus : Primer A (xi) Popis sekvence : SEQ ID č. : 1

GGCTGCAGAG CTAACCGTAA CAACTTCAAA TCCGCGGAAG ACTGCATGGA AACTTGCGGT GGTGCTTAG (2) Údaje pro SEQ ID č.: 2 :

(i) Charakteristické znaky sekvence :

(A) Délka : 93 párů basí (B) druh : nukleotid (C) forma šroubovice : jednoduchá šroubovice (D) topologie : lineární (ii) Druh molekuly : genom-DNA (iii) Hypoteticky : ne (iv) Antisense : ne

...... '(v'i')Puvód~ ' ·-···-··.- — (A) Organismus : Primer B (xi) Popis sekvence : SEQ ID č. 2

TGCCTCGAGC CGCCGTCTAC TGGGCCCTGC AGAGCTATCA TCCGTTACTT CTACGATGCA ACTGCAGGCC TGTGTGAAAC CTTOGTATAC GGC (2) Údaje pro SEQ ID č.: 3 :

(i) Charakteristické znaky sekvence :

(A) Délka : 38 párů basí (B) druh : nukleotid (C) forma šroubovice : jednoduchá šroubovice (D) topologie : lineární (ii) Druh molekuly : genom-DNA (iii) Hypoteticky : ne (iv) Antisense : ne (vi) Původ :

(A) Organismus : Primer C (xi) Popis sekvence : SEQ ID č. : 3

GGGATATCTA TTGATAACAT TTAAAGGTAT TTGACAAG (2) Údaje pro SEQ ID č.: 4 :

(i) Charakteristické znaky sekvence :

(A) Délka : 99 párů basí (B) druh : nukleotid (C) ' forma šroub o v'iče : jednoduchá'' šroubovice (D) topologie : lineární (ii) Druh molekuly : genom-DNA (iii) Hypoteticky : ne (iv) Antisense : ne (vi) Původ :

(A) Organismus : Primer D (xi) Popis sekvence : SEQ ID č. : 4

GGGCTCGAGG CAGAAACTCG GTCTAGCCAA AGCAGAAGAA GCAGCGAACA 50 AGACAGCAGT CAAAATAGAT GGAATCTCAT TCTTTTAACT CTTTATATT 99 (2) Údaje pro SEQ ID č.: 5 :

(i) Charakteristické znaky sekvence :

(A) Délka : 57 aminokyselin (B) druh : aminokyseliny (C) forma šroubovice : jednoduchá šroubovice (D) topologie : lineární (ii) Druh molekuly : peptid (v) Typ fragmentu : lineární (vi) Původ :

(A) Organismus : varianta aprotininu

(xi)

Popis

sekvence

: SEQ ID č.

: 5

Arg_

Asp

Phe

Cys

Leu

Glu

Pro

Ser

Thr

Gly..

Pro

Cys

Arg.

.Ala

1

5

10

15

Ala

Ile

Arg

Tyr

Phe

Tyr

Asp

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Cys

Glu

20

25

30

Thr

Phe

Val

Tyr

Gly

cys

Arg

Ala

Asn

Arg

Asn

Phe

Lys

35

40

45

Ser

Ala

Glu

Asp

Cys

Met

Glu

Thr

Cys

Gly

Ala

50

55

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Varianty aprotininu s netto-nábojem +3 až -3 při pH 7 as aminokyselinami ArglS nebo Argl5-Alal7 ve vazebném regionu.
2. Varianty aprotininu podle nároku 1 pro inhibici serinových přoteáz.
3. Varianty aprotininu podle nároku 1 nebo 2 se změněnou N-terminální sekvencí.
4. Varianty aprotininu podle nároku 1 nebo 2 s N-terminálním prodloužením nebo zkrácením nebo s deletovanými aminokyselinami v N-terminálu.
5. Varianty aprotininu ze skupiny zahrnující desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-------aprotinin-;' — - - ............... --·· -........ — ...............desPro2-Serl0-Argl5-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, desPro2-Serl0-Argl5-Serl7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinín, desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, desPro2-SerlO-Argl5-AlaT7-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-aprotinin, Serl0-Argl5-Alal7-Ašp24-Thr26-Glu31-Asn4l-Glu53-aprotinin,

Serl0-Argl5-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, Serl0-Argl5-Serl7-Asn24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, SerlO-Argl5-Alal7-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin a Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-aprotinin.
6. Léčivo, obsahující jednu nebo několik variant aprotininu podle nároků 1 až 5 .
7. Použití variant aprotininu podle nároků 1 až 5 pro výrobu léčiv pro použití v chirurgii pro snížení ztrát krve, při polytraumatu, šoku a zánětech.