KR980009283A - 특성이 개선된 아프로티닌 변이체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 효소 억제, 면역학적, 및 약물동력학적 특성이 개선된 아프로티닌 변이체 및 그 제법에 관한 것이다.

Description

특성이 개선된 아프로티닌 변이체
본 발명은 효소 억제, 면역학적 및 약물동력학적 특성이 개선된 아프로티닌 변이체 및 그 제법에 관한 것이다.
소 췌장 트립신 억제제(BPTI)로도 불리는 아프로티닌은 쿠니쯔(Kunitz)형의 세린 프로테아제 억제제군에 속한다. 억제할 수 있는 세린 프로테아제 범주에는 예를 들면 트립신, 키모트립신, 플라즈민 및 혈장 칼리크레인이 포함된다(W. Gebhard, H. Tschesche ＆ H. Fritz, Proteinase Inhibitors, Barrets ＆ Salvesen (편), Elsevier Science Publ. BV 375-387, 1986).
아프로티닌은 58개의 아미노산으로 구성된다. 이 단백질의 3차원 구조는 X-선 구조 분석과 ㎚R 분광 분석법의 도움으로 밝혀졌다 (Wlodawer et at., J. Mol. Biol. 198 (3), 469-480, 1987; Wagner et al., J. Mol. Biol. 196 (1), 227-231, 1987; Berndt et al., Biochemistry 32 (17), 4564-4570, 1993).
천연 아프로티닌은 트라실롤(Trasylol)(등록상표)이라는 상표명으로 처음에는 췌장염의 치료에 사용되었다. 트라실롤은 오늘날에는 심장 수술에 사용되고 있는데, 이것은 임상 연구 결과 이런 형태의 수술에 있어서 아프로티닌 처치가 수혈에 대한 요구를 현저히 낮추며 수술 후 출혈을 감소시키는 것으로 나타났기 때문이다 (D. Royston, J. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 6, 76-100, 1992).
억제 특이성을 규정하는 15 위치에 있는 아미노산의 치환이 억제 특성이 개선된 유용한 아프로티닌 변이체를 이끌어낸다는 것을 보일 수 있었다(독일 특허 제3 339 693호). 도입되는 아미노산에 따라서는 이런 방식으로 췌장 또는 백혈구에서 유래한 엘라스타제를 억제하는 유효한 억제제를 생산할 수 있다.
아프로티닌 및 15 위치에서의 치환에 의해 생산된 변이체의 억제 특성은 억제하려는 표적 프로테아제와 억제제 분자간의 접촉 부위에 있는 다른 아미노산 잔기에 의해서도 결정된다는 것 역시 보일 수 있었다. 여기에는 특히 14, 16, 17, 18, 19, 34, 38 및 39 위치에 있는 부가적인 아미노산 잔기가 포함된다. 접촉 부위 영역에 있는 이들 아미노산 잔기 중 하나 이상의 치환으로 인해 특성이 개선된 아프로티닌 변이체는 우선 예를 들어 다음 특허 출원에 기재되어 있다: 국제 특허 공개 제89/01968호, 동 제89/10374호, 유럽 특허 제0 307 592호, 동 제683 225호.
흥미롭게도, 아프로티닌 및 그 변이체의 약물동력학적 특성을 그 물질의 물리화학적 성질을 규정하는 아미노산 치환에 의해 개선할 수 있었다. 그에 따라 분자의 양성 순전하를 낮춤으로써 신장 결합을 현저히 낮출 수 있었다. 이런 형태의 변이체는 국제 특허 공개 제92/06111호에 기재되어 있다.
더 좋은 공업적 제조성을 이유로, 일부 경우에는 억제제 분자의 N-말단쪽 말단에 대한 변형을 행하는 것이 간편하다. 이러한 변형은 하나 이상의 아미노산의 N-말단 단축 또는 연장 또는 결실일 수 있다. N-말단쪽이 변형된 아프로티닌 변이체는 유럽 특허 제419 878호에 기재되어 있다.
본 발명은 종래 기술의 아프로티닌 변이체보다 특성이 개선된 아프로티닌 변이체를 제공하려는 것이다.
제1도는 본 발명에 따른 아프로티닌 변이체의 아미노산 서열을 예시한 도.
본 발명에 따른 아프로티닌 변이체
본 출원에서 설명되는 아프로티닌 변이체는 다름 특징들에 의해 구별된다:
1. 활성 특성의 개선을 위한, 분자의 활성 중심에 있는 하나 이상의 아미노산의 치환.
2. 면역학적 및 약물동력학적 특성을 개선하려는 목적을 가진, 양성 순전하를 감소시키기 위한 아미노산 치환.
3. 산업적 제조성을 이유로 한, N-말단 아미노산 서열의 변형.
각각이 상기한 특징 중 하나만을 지닌 아프로티닌 변이체는 위에 인용한 특허출원들에 설명되어 있다
본 발명에 따른 아프로티닌 유도체는 이제 그 분자 구조에 상기한 특징들 중 둘 또는 셋을 합친다. 아미노산 서열을 예로서 일부 변이체에 대해 도면에 제시하였다.
본 발명에 따른 아프로티닌 변이체는 그러나 도1에 거명된 예에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 아프르티닌 변이체는 N-말단이 연장된 Ala(-2)-Gln(-1)-, 원래의 아미노산 잔기 프롤린이 2 위치에 있는, 양전하를 지닌 다른 아미노산이 중성 또는 음으로 대전된 아미노산 잔기로 치환된, 또는 다른 중성 아미노산이 음으로 대전된 아미노산 잔기로 치환된 변이체 역시 포함한다. 여기서 아미노산 잔기 치환물의 선택은 생리적 pH에서 양의 순전하가 감소된, 바람직하게는 .2 내지 -2 범위인 물질을 생산한다는 원칙에 따른다. 린-말단 연장 또는 단축 또는 결실을 비롯하여 언급된 아미노산 서열의 변화는 서로 다른 것과의 임의의 바람직한 조합으로 활용될 수 있다. 본 발명에 따른 아프로티닌 변이체는 따라서 상기한 특징들의 조합을 포함하고 생리적 pH에서 감소된 양의 순전하를 갖는 모든 화합물을 포함한다.
놀랍게도, 언급된 특징들 둘 또는 셋의 조합은 개별 특징의 발현을 달성하는 것 뿐 아니라 일부 경우에는 그 발현의 강화에까지도 이르게 하는 것으로 보인다. 더욱이, 면역학적, 약물동력학적 및 표면 결합 특성 등에 관련된 유의한 새로운 물질 특성을 창출할 수 있었다. 새로운 변이체는 아프로티닌을 이용하여 생산된 사람 및 토끼의 다클론 항혈청과 감소된 반응을 보인다. 새로운 변이체가 아프로티닌과 비교하여 뚜렷하게 저하된 면역원적 양태를 보인다, 즉 이들이 더 적은 면역 반응을 유도한다는 것이 더 밝혀졌다. 본 발명에 따른 변이체가 아프로티닌과 비교하여 혈구에서 히스타민의 방출이 더 낮아지게 유도한다는 것 또한 보일 수 있었다. 새로운 변이체는 그 밖에도 아프로티닌과 비교하여 뚜렷이 낮은 신장 축척을 보인다. 효소-동력학적 억제 상수(Ki값)는 분자의 몸통에 있는 다수의 변화에도 불구하고 이 분자의 이전 변이체들과 비교할 때 놀라우리만치 향상되었다.
본 발명은 따라서 pH 7에서 순전하가 +3 내지 -3이며 아미노산 Arg 15 또는 Arg 15-Ala 17을 갖는 아프로티닌 변이체에 관련된다. 바람직한 변이체는 순전하가 12 내지 -2인 것, 특히 바람직하게는 +1 내지 -1의 전하를 갖는 것들이다.
이들 아프로티닌 변이체는 혈장 칼리크레인, 조직 칼리크레인 및 플라즈민의 억제에 적합하다.
또한, 이들 아프로티닌 변이체는 변형된 N-말단 서열을 가질 수 있다.
이와 같이 N-말단 연장 또는 단축이 있거나 N-말단에 결실된 아미노산이 있는 아프로티닌 변이체를 의도한다.
바람직한 아프로티닌 변이체는
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌, DesPro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌, DesPro2-Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌, DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌 및 DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-아프로티닌으로 이루어진 군에서 선택된 것들이다.
이들 아프로티닌 변이체는 또한 위치 2에 아미노산 프롤린을 가질 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 상기 아프로티닌 변이체를 함유한 의약에도 관련된다.
본 명세서에서 설명되는 새로운 프로테아제 억제제는 혈액의 광범위하거나 강렬한 외래 표면 접촉으로 인해 -또한 심장 수술에서 또는 이식 의학에 이물관절형성 관절 대체 등에서와 같이 비교적 복잡한 외과적 방법의 결과로서- 혈장 효소계의 활화가 일어나는 질병 상태의 치료에 적합하다.
이 억제제는 높은 출혈 위험이 수반되는 수술 (예, 심장 수술, 골 및 관절 수술)에서 혈액 손실을 감소시킨다. 이들은 쇼크, 다중외상 및 두개 및 뇌 외상, 패혈증, 전염된 혈관내 응혈이상증 (DIC), 다중 기관 부전, 류마티성 관절 질환과 같이 칼리크레인계가 관련된 염증성 질환 및 천식에 있어서 치료에 적합하다. 이들은 플라즈민의 억제에 의해 침식성 종양 성장 및 전이를 방지한다. 이들은 브라디키닌 합성의 억제로 인해 통증 및 부종 치료법에, 그리고 졸중의 치료에도 적합하다. 이들은 염증성 질환, 응혈 및 출혈 위험 상승을 방지하는 투석 요법 및 인공 장기에도 적합하다.
본 발명에 따른 아프로티닌 변이체의 제조
본 발명에 따른 아프로티닌 변이체를 제조하기 위해서는, 유전공학적 방법을 사용하는 것이 편리하다. 이를 위해, 통상적인 분자생물학적 방법을 사용하여 각 경우에 고려되는 아프로티닌 변이체의 합성을 위한 유전공학적 정보를 적절한 미생물 발현 생물에 도입시킨다. 재조합 미생물을 발효시키는데 적절한 조건의 선택에 의해 이종 유전 정보가 발현된다. 발명된 아프로티닌 변이체는 후속적으로 배양액으로부터 수득된다.
본 발명에 따른 아프로티닌 변이체의 생산에 적합한 숙주 생물은 세균, 효모 또는 진균일 수 있다. 발명은 세포내 또는 적절한 분비 시스템을 사용하면 세포외로 이루어질 수 있다. 아프로티닌 변이체는 펩티드 또는 단백질로 정확히 프로세싱되거나 융합된다.
아프로티닌 변이체의 발현에 적합한 시스템은 유럽 특허 제683 229호, 국제 특허 공개 제87/02463호, 동 제90/10775호 및 위에서 이미 언급한 다른 특허 출원들에서 설명된 바 있다.
발명을 실행하는 방법
효소
사용된 효소 (제한 엔도뉴클레아제, 송아지 소장에서 얻어진 알칼리 포스파타제, T4 폴리뉴플레오티드키나제 및 T4 DNA 리가제)는 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim) 및 기브코(GIBCO/BRL)에서 구입하였으며 제조자의 설명에 따라 사용하였다.
분자 생물학 기술
일상적인 클로닝 작업, 예를 들면 대장균으로부터의 플라스미드 DNA의 단리 (소위 미니프렙) 및 플라스미드 DNA를 사용한 대장균의 형질전환과 같은 것은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989]에 따라 실시하였다. 형질전환에 사용된 숙주 생물은 대장균 균주 DH5μ (GIBCO/BRL)이었다. 보다 다량의 플라스미드를 단리하기 위해서는 콰이아진(Qiagen) 팁 (Qiagen사)을 사용하였다. 아가로스 겔로부터 DNA 단편을 추출하는 것은 젯트소브(Jetsorb)를 이용하여 제조사(Genomes)의 지시에 따라 실행하였다.
"부위특이적 돌연변이유발" 실험을 위한 올리고뉴클레오티드 및 PCR 및 서열결정 반응을 위한 프라이머는 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems)사의 "380 A DNA 합성기"를 사용하여 제조하였다. 돌연변이유발 실험은 파르마시아(Pharmacia Biotech)사의 키트("Unique Site Elimination Mutagenesis")를 사용하여 문헌(Deng ＆ Nickoloff, Anal. Biochem., 200, 81-88, 1992)의 방법에 따라 실행하였다. 모든 벡터 구조물 및 돌연변이유발 실험은 "ABI 373 A 서열결정기" (어플라이드 바이오시스템)에서 형광 표지된 터미네이터를 사용하여 Taq 싸이클 DNA 서열결정에 의해 확인하였다.
효모(Saccharomyces cerevisiae)의 형질전환
효모 세포, 예를 들면 균주 JC34.4D (MATμ, ura3-52, suc2)를 10㎖의 YEPD (2% 글루코스, 2% 펩톤, 1% Difco 효모 추출물)에서 배양하고 0.D.600㎚0.16 내지 0.8에서 수득하였다. 세포를 5㎖의 용액 A(1M 소르비톨, 10㎜ bicine pH 8.35, 3% 에틸렌 글리콜)로 세척하고, 0.2㎖의 용액 A에 재현탁시킨 다음 -7℃에 보관하였다.
플라스미드 BNA(5㎍) 및 담체 DNA(청어 정자에서 얻은 50㎍)를 냉동된 세포에 가하였다. 37℃에서 5분 동안 흔들어서 세포를 해동시켰다. 1.5㎖의 용액 B(40% PEG 1000, 200㎜ bicine pH 8.35)를 가한 후, 세포를 30℃에서 60분 동안 인큐베이션하고, 1.5㎖의 용액 C(0.15 M NaCl, 10㎜ bicine pH 8.35)로 세척한 다음 100㎕에 재현탁시켰다. 평판 배양은 2% 한천을 함유한 선택 배지에서 행해졌다. 형질전환체는 30℃에서 3일 간의 인큐베이션 후에 얻어졌다.
발효용 영양 배지
1. SD2 배지:
2. SC5 배지:
미량 원소 용액 SL4:
* = 별도로 고압살균
3. 발효기 배지:
공급 용액:
미량 원소 용액:
* = 별도로 오토클레이빙
비타민 용액:
작업량의 조제
저장 보관분을 사용하여 1ℓ 얼렌마이어 플라스크 중의 SD2 배지 200㎖를 1%의 농도로 접종하였다. 배양물을 진탕기(260rpm)상, 28℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 각 2㎖를 보관분 용기에 채우고 액체 질소 중에서 냉동시켰다.
진탕기 플라스크 중 발효
전배양으로서, 1 ℓ 플라스크에서 200㎖의 SD2 배지를 작업량의 1%로 접종하고 진탕기 (260rpm) 상, 28℃에서 72 시간 동안 발효시켰다. 이 전배양물을 사용하여 본배양(1 ℓ 플라스크 중 SC5 배지 200㎖)을 1% 농도로 접종하고 진탕기 상, 28℃에서 72-96 시간 동안 인큐베이션하였다.
10ℓ 생물반응기 중 발효
전배양으로서, 1 ℓ 플라스크에서 200㎖의 SD2 배지를 작업량의 1%로 접종하고 진탕기(260rpm) 상, 28℃에서 72시간 동안 발효시켰다. 10 ℓ 발효기에서의 본배양은 96 시간에 걸친 공급 배치 발효로 진행하였다. 사용된 영양 배지는 발효기 배지이고 출발 부피는 7 ℓ 였다. 발효기 내에 200㎖의 전배양물을 접종하였다.
발효 조건
온도: 28℃
교반기의 회전 속도: 500rpm
공기 공급: 10 ℓ /분
pH: 5.5
액두 공간 압력: 200밀리바
7 시간의 발효한 후 공급을 개시하였다. 공급속도는 호흡 지수(RQ) (RQ = 형성된 CO2/소비된 산소)를 통해 조절하였다. RQ가 ＞1.15의 값으로 상승하면 공급 속도를 낮추고, <1.05의 값으로 떨어지면 공급 속도를 상승시켰다.
규칙적인 간격으로 발효기에서 시료를 수거하고 세포 성장을 700㎚에서의 광학 밀도 측정에 의해 산정 하였다. 또한, 상징액 중의 Bay 19-8757 농도를 활성 측정에 의해 산정하였다.
발효 종료시에, 50% (w/v) 시트르산의 첨가로 pH를 3.0까지 낮추고, 발효기를 70℃에서 10분 동안 가열하였다. 그 다음 7,500 × g에서 원심분리하여 세포를 분리해 내고 상징액은 단백질 정제에 넘겼다.
단백질 화학분석용 기구
서열 분석은 어플라이드 바이오시스템 (미국 포스터시 소재)사의 단백질 서열결정기 모텔 473A를 사용하여 시행하였다. 표준 서열결정 프로그램을 사용하였다. 이 서열결정기, 각종 서열결정 프로그램 및 PTH 검출 시스템은 운용 지침서 (단백질 서열결정 시스템 모델 473 A 사용자 설명서, (1989) 어플라이드 바이오시스템 Forster City, CA 94404, USA)에 상세히 설명되어 있다.
서열결정기의 작동을 위한 시약 및 PTH 검출을 위한 HPLC 칼럼은 어플라이드 바이오시스템사에서 입수하였다.
HPLC 분석은 휴렛 패커드(독일 Waldbronn 소재)사의 HP 1090 HPLC 시tm템을 사용하여 시행하였다. 분리를 위해서는 Backerbond (독일 Groβ Gerau 소재)사의 RP-18 HPLC 칼럼 (250㎜ × 4.6㎜, 5μ 재료, 300 Å 공극 직경)을 사용하였다.
모세관 전기영동 모델 270 A-HT는 어플라이드 바이오시스템 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)의 것이었다. 원칙적으로 시료는 여러 가지 시간 간격을 두고 수동력학적으로 주입하였다. 사용된 모세관 칼럼 (50㎛ × 72㎝)은 어플라이드 바이오시스템사의 것이었다.
아미노산 분석은 에펜도르프 비오트로니크 (Eppendorf Biotronik)(독일 마인탈 소재)사의 아미노산 분석기 LC 3000을 사용하여 실행하였다. 비오트로니크사의 약간 수정된 표준 분리 프로그램을 사용하였다. 분리 프로그램 및 분석기의 기능은 장치 지침서에 상세히 설명되어 있다.
분자량은 Kratos/shimadzu (독일 뒤스부르크 소재)사의 MALDI I 시스템으로 산정하였다. SDS 전기영동은 파르마시아 (독일 프라이부르크 소재)사의 전기영동 시스템을 사용하여 행하였다.
동력학적 데이터의 측정은 SLT (독일 크라일스하임 소재)사의 마이크로타이터 플레이트 판독기를 사용하여 행차였다. 마이크로타이터 플레이트의 세척은 Dynatec(독일 뎅켄도르프 소재)사의 세척 장치를 사용하여 행하였다.
효소 밑 기질은 칼비오헴 (독일 바트 소덴 소재)사의 것이었다. 다른 모든 화학약품 및 시약은 머크 (독일 다름슈타트 소재) 또는 시그마(독일 다이젠호펜 소재)사의 것이었다. 96-웰 플레이트는 그라이너에서 입수하였다.
아프로티닌을 사용한 면역화에 의해 토끼에서 다클론 토끼 항아프로티닌 항체를 유도하였다. 사람 다클론 항아프로티닌 항체는 아프로티닌으로 처치된 환자에게서 얻었다
단백질 화학분석
N-말단 서열 분석
물에 용해시킨 1-3㎚ol의 프로테아제 억제제를 폴리브렌(Polybrene)과 예비인큐베이션시킨 서열결정기 시이트에 걸었다. 단백질은 신속 보통 서열결정기 싸이클을 이용하여 서열결정하였다. PTH 아미노산은 50pmo1 PTH 기준물질을 이용하여 온라인 HPLC를 통해 동정하였다.
아미노산 분석
200㎍의 단백질을 200㎕의 6 N HCl에 용해시킨 다음 166℃에서 1시간 동안 가수분해시켰다 시료 약 1㎚ol을 아미노산 분석기에 가하였다. 아미노산의 양은 5㎚ol 기준물질을 통해 산정하였다.
SDS 겔 전기영동
SDS 겔 전기영동은 래믈리(Laem㎖i)의 조건에 따라 실행하였다. 10㎍의 프로테아제 억제제를 10-20% 세기의 SDS 겔을 사용하여 분석하고 은 염색(Merril et al.)을 통해 가시화하였다.
U.K. Laem㎖i, Nature 227, 680-685 (1970).
C.R. Merril, M.L. Dunau, D. Goldmann, Anal. Biochem. 100: 201-207 (1981).
모세관 전기 영동
8ng의 프로테아제 억제제를 유리 칼럼 (길이 72㎝, 내경 50㎛)상에서 모세관 전기영동을 통해 조사하였다. 조건: 전류 밀도 90μA, 칼럼 온도 25℃, 100 ㎚ 인산염 완충액 pH 3.0, 검출 210㎚,, 가압하 장전 3초.
역상 크로마토그래피
5㎚ol의 프로테아제 억제제를 Bakerbond RP-18 HPLC 칼럼 (5μ 재료, 4.6㎚ × 250㎜, 300Å 공극크기)에서 크로마토그래피하였다. 사용된 용리액은 아세토니트릴/TFA 구배였다. 조건: 유속 0.7㎖/분, 칼럼 온도 40℃, 검출 40℃, 용매 A 0.1% TFA, 용매 B 0.1% TFA/60% 아세토니트릴, 구배 : 0분 0% B, 10 분 0% B, 70 분 100%% B, 80 분 0% B.
분자량 산정
1㎍의 프로테아제 억제제를 MALDI 기술을 사용하여 분석하였다. 사용된 매트릭스는 시나프산이었다. 질량 보정용 기준 단백질은 소 인슐린, 시토크롬 C 및 멜리틴이었다.
단백질 함량
단백질 함량은 BCA법에 의거해 산정하였다. 이 방법에서는, Cu2+이온을 존재하는 단백질을 이용해 반응시켜 Cu1+이온으로 만들어 비신코닌(bicinchoninic)산과 착물을 형성하는데, 이것은 560㎚에서 빛을 흡수한다.
동결건조된 단백질을 평형 수분 함량이 되게 한 다음 0.9% NaCl 용액에 1㎎㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 연속 희석물을 마련하였다. 100㎕의 BCA 시험 시약 (Pierce)을 50㎕의 시료 용액에 가차고, 스토퍼로 시험관을 단단히 닫은 다음 60℃에서 정확히 30 분 동안 인큐베이션하였다. 시료를 빙조에서 5분 동안 냉각시킨 후, 25℃ 파장 560㎚에서 측정을 행하였다.
활성 (트림신 억제 시험, 적정법)
활성은 수정 F.I.P. 트립신 억제 시험에 의거해 산정하였다. Bay y19-8757은 트립신이 촉매하는 Nμ-벤조일-L-아르기닌 에틸 에스테르 (BAEE)의 가수분해를 억제한다. 이 반응에서 방출되는 카르복실기를 알칼리 적정에 의해 측정한다. 트립신 잔류 활성은 활성 화합물의 억제 활성의 척도이다
동결건조된 단백질을 평형 수분 함량이 되게 한 다음 0.9% NaCl 용액에 1㎎/㎖의 농도로 용해시키고 연속 희석물을 마련하였다. 2㎖의 완충액 (200㎜ CaCl2를 함유한 15㎜ 붕산염 완충액, pH 8.0) 및 0.8㎖의 트립신 용액 (2㎎/㎖)을 1㎖의 시료 용액에 가하고, 혼합물을 25℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 0.2㎖의 BAEE 용액 (6.8㎎/㎖)을 가하고 KOH 소비량을 5분에 걸쳐 측정하였다.
프로테아제 억제제와 다클론 토끼 또는 사람 항아프로티닌 항체의 교차 반응의 측정
커플링 완충액에 용해시킨 0.5-l0ng의 프로테아제 억제제 또는 아프로티닌을 4℃에서 하룻밤 동안 마이크로타이터 플레이트에 결합시켰다. 웰을 매회 200㎕의 세척 완충액으로 4회 세척한 다음 100㎕의 블로킹 용액을 가하였다. 플레이트를 덮고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상기한 대로 세척한 후 다클론 토끼 항아프로티닌 항체 (PBS 완충액 중 1% BSA 중 0.2㎍/㎖) 또는 다클론 사람 항체 (PBS 완충액 중 1% HSA 중 20㎍/㎖)를 가하였다. 플레이트를 덮고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음 상기한 대로 세척하였다. 그 다음 100㎕의 비오티닐화 항토끼 또는 항사람 항체 (25㎕ + PBS 완충액 중 1% BSA 또는 1% HSA 10㎖)를 가차고 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기한 대로 세척하고 100㎕의 스트렙타비딘-퍼옥시다아제 복합체 (50㎕ + PBS 완충액 중 1% BSA 또는 1% HSA 10㎖)를 각 웰에 가하였다. 플레이트를 덮고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음 상기한 대로 세척하였다.
기질 반응은 TMB 기질 + 퍼옥시다아제 용액 (1+1, 웰 당 100㎕)을 사용하여 행하였다. 10분 후 웰 당 100㎕의 2 M 인산을 사용하여 반응을 중지시키고 450㎚ (기준 570㎚)에서 빛의 흡수를 측정하였다
용액:
1. 인큐베이션 완충액: 15㎚ Na2CO3, 35㎜ NaHCO3, pH 9.6.
2. 시료 완충액: 시료를 인큐베이션 완충액에 적절한 농도로 용해시켰다.
3. 세척 용액: PBS 중 0.1%(v/v) Tween 20.
4. 블로킹 완충액' PBS 중 3%(w/v) BSA 또는 HSA.
[실시예 1]
재조합 DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-G1u31-Asn41-Glu53-아프로티닌의 분비를 위한 효모 발현 벡터의 제조
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌 유전자의 제조를 위해 사용된 출발 물질은 제한 효소 HindIII와 BamHI을 이용하여 벡터 pUC18에 클로닝한 DesPro2-Arg15-Ala17 유전자였다. 결과로 얻어진 벡터 (pEM6.6.L)를, U.S.E.법 (Pharmacia Biotech)에 따라 돌연변이유발 프라이머 A와 Scal/㎖ul U.S.E. 선별 프라이머를 이용해 이중 가닥 돌연변이유발 반응에 투입하였다. 돌연변이유발 프라이머 A는 다음 서열 1의 서열을 가졌다:
프라이머 A
5'GGCTGCAGAGCTAACCGTAACAACTTCAAATCCGCGGAAGACTGCATGG
AAACTTGCGGTGGTGCTTAG 3'
이 프라이머는 DesPro2-Arg15-Ala17 아프로티닌 유전자에 Asn 41 및 Glu53의 돌연변이를 발생시킨다. 클론 pEM31.8.L의 DNA 서열결정에 의해 더 확인하였다. 유전자의 5' 영역에 있는 또 다른 치환(Ser-10-Asp24-Thr26-Glu31)은 pEM31.8.L 플라스미드 DNA에서 출발하여 프라이머 B 및 '역 24량체 M13' 프라이머를 사용하여 PCR 기법을 이용하여 만들어내었다. 프라이머 B는 다음 서열 2의 서열을 가졌다:
프라이머 B
5'TGCCTCGAGCCGCCGTCTACTGGGCCCTGCAGAGCTATCATCCGTTACTTCC
TACGATGCAACTGCAGGCCTGTGTGAAACCTTCGTATACGGC 3'
XhoI 인지 서열은 밑줄을 그었다.
PCR 혼합물은 20 ng의 pEM31.8.L 플라스미드 DNA, 20 pmol의 '역 24량체 M13' 프라이머, 60 pmol의 프라이머 B, 200 μM의 dNTP, 1 × PCR 반응 완충액 Ⅱ (Perkin Elmer), 4 ㎜ ㎎Cl2및 2.5 U의 Taq DNA 폴리머라아제 (Perkin Elmer)를 총부피 100㎕에 함유하였다. '싸이클' 조건: 94℃에서 3 분, 각 경우 94℃ 1 분, 55℃ 1 분 및 72℃ 1 분 30 싸이클, 후속 72℃에서 5 분 인큐베이션, PCR 혼합물을 1:5로 희석하고 벡터 pCRII (Invitrogen)와 연결하였다. 연결 혼합물을 사용하여 대장균 DH5μ 세포를 형질전환 시켰다 효소 XhoI 및 BamHI으로 제한 소화시킨 후 양성 클론을 동정하였으며 몇 개의 클론을 서열결정 하였다 클론 pES9.10.L이 목적하는 서열을 함유하였으므로 후속 연구에 사용하였다.
대장균/효모 셔틀 벡터 (예, pA202)를 사용하여 DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌 서열이 효모 알파 인자 프리-프로 서열에 연결된 효모 분비 벡터를 구성하였다.
벡터 pA202는 암피실린 내성 유전자 (boa) 및 URA3 유전자를 대장균 및 효모에 대한 선별 마커 유전자로 지니고 있다. 이 벡터의 또 다른 필수 요소는 Col El 및 2 μ 복제 기원 (ori)이다. REP3 좌위 역시 이 영역에 놓여있다. 1200 bp EcoRI HindIⅡ 단편이 MF α 1 프로모터 및 효모 알파 인자 전구 단백질의 N-말단 프리-프로 서열을 함유한다 (Kurjan ＆ Herskowitz, Cell 30, 933 943, 1982). 변형된 DesPro2-Agr15-아프로티닌 cDNA를 HindIⅡ-BamHI 단편으로 도입시킴으로써 알파 인자 프리-프로 서열 내의 KexII 프로테아제 인식 부위 ('Lys-Arg')가 다시 마련되었다 (유럽 특허 제0 419 878호).
벡터는 DesPro2-Agr15-아프로티닌 서열의 3' 말단에 효모 URA3 유전자의 BamHI-SalI 단편을 지니는데, 이것은 이 위치에서는 전사 종료 신호로 기능한다 (Yarger et al., Mol. Cell. Biol. 6, 1095-1101, 1986).
벡터 pES9.10.L에서 XhoI과 BamHI으로 180 bp DNA 단편을 절단해 내고, 아가로오스 겔 전기영동을 통해 정제한 다음 역시 XhoI과 BamHI으로 절단하고 탈포스포릴화한 벡터 pA202에 클로닝하였다.
이 클로닝에 의해 벡터 pA202내의 DesPro2-Agr15-아프로티닌이 DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌으로 대체되었다. 이 클로닝에서 얻어지는 벡터 pES13.10.L을 사용하예를 들어 내재 GAPDH 또는 유도성 GAL 10 프로모터와 같은 다른 프로머터가 있는 다른 대장균/효모 셔틀 벡터는 비슷한 방식으로 제조하고 역시 DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌의여 효모 세포 (JC34.4D)를 클로닝하였다.
분비를 가져올 수 있다.
또한, 다른 효모 복제 기원, 예를 들면 자동적으로 염색체에 의해 복제되는 구간 (arts)와 같은 것을 가진 석틀 벡터를 사용하는 것도 물론 가능하다.
URA3 유전자 외에, 적절한 선별 마커 유전자는 예를 들어 LEU2, HIS3 또는 TRP1 유전자와 같이 영양요구형 효모 돌연변이체가 기본영양을 취하는 것을 돕는것들이다. 또한, 예를 들어 G4l8과 같이 그 산물이 각종 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자 역시 물론 사용될 수 있다.
다른 효모, 예를 들면 메틸영양형 효모 Pichia pastoris 또는 Hansenula polymorph와 같은 것 역시 적절한 벡터로 형질전환시킨 후에는 DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌을 생산할 수 있다.
[실시예 2]
본래의 N-말단 서열 'Arg-Pro-Asp'를 가진 재조합 Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌의 분비를 위한 효모 발현 벡터의 제조
본래의 N-말단 서열 'Arg-Pro-Asp'를 가진 Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌의 분비를 가능하게 하는 효모 발현 벡터의 제조를 위해, 알파 인자 프리-서열을 갖춘 MFμ1 프로모터와 아프로티닌 유전자의 5' 말단 (제한 효소 XhoI의 인식 서열까지)을 먼저 PCR로 증폭시키고 클로닝하였다. 사용된 프라이머는 다음 서열 3 및 4의 서열을 가졌다:
프라이머 C:
5'GGGATATCTATTGATAAGATTTAAAGGTATTTGACAAG3'
EcoRV 인식 서열은 밑줄을 그었다.
프라이머 D:
5'GGGCTCGAGGCAGAAATCTGGTCTAGCCAAAGCAGAAGAAGCAGCGAAC
AAGACAGCAGTGAAAATAGATGGAATCTCATTCTTTTAATCGTTTATATT 3'.
XhoI 인식 서열은 밑줄을 그었다.
PCR 혼합물은 200 ng의 pA202 플라스미드 DNA, 0.2 μM 프라이머 C, 0.2 μM 프라이머 D, 200 μM dNTP, 1 × PCR 반응 완충액 Ⅱ (Stratagene, Opti-Prime(상표명)) 및 2.5 U의 Taq DNA 폴리머라아제(Pertain Elmer)를 총부피 50 ㎕에 함유하였다. '싸이클' 조건: 94℃에서 1 분, 각 경우 94℃ 1 분, 50℃ 1분 및 72℃ 2 분 30 싸이클, 후속 72℃에서 5 분 인큐베이션. PCR 혼합물을 1:5로 희석하고 벡터 pCRII (Invitrogen)와 연결하였다. 이 연결 혼합물을 사용하여 대장균 DH5α 세포를 형질전환시켰다. 효소 EcoRI으로 제한 소화시킨 후 양성 클론을 동정하였으며 몇 개의 클론을 서열결정하였다. 클론 pIU20.11.L을 후속 연구에 사용하였다.
대장균/효모 셔틀 벡터 pYES2(Invitrogen)를 사용하여 Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌 서열이 효모 알파 인자 프리-서열에 직접적으로 연결된 효모 분비 벡터를 구성하였다. 벡터 pYES2를 먼저 제한 효소 SspI 및 BamHI으로 절단하고, 탈포스포릴화시킨 다음 겔로 정제하였다. 벡터 pYES2에 존재하는 GAL1 프로모터와 f1 ori를 이렇게 제거하였다. 벡터 pIU20.11.L에서 EcoRV와 XhoI으로 약 1030 bp DNA 단편을 절단해 내고, 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제한 다음 벡터 pES9.10.L에서 나온 약 180 bP의 XhoI 및 BamHI 단편과 함께 SspI과 BamHl으로 절단한 벡터 pYES2에 클로닝하였다. 이 연결 혼합물을 사용하여 대장균 DH5α 세포를 형질전환시켰다. 효소 EcoRI으로 제한 소화시킨 후 양성 클론을 동정하고 서열결정하였다. 이 클로닝에서 얻어지는 벡터 pIU28.11.L을 사용하여 효모 세포(JC34.4D)를 형질전환시켰다. 발현 벡터 pIU28.11.L을 더 이상 알파 인자 프로-서열을 함유하지 않으므로 Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌의 프로세싱은 전적으로 시그날 펩티 다아제에 의해서만 일어나며 KexII 프로테아제에 의한 절단과는 무관하다.
[실시예 3]
효모의 발효
효모 발현주를 위에 설명한 대로 발효시켰다.
[실시예 4]
중성 pH에서 순전하가 없는 아프로티닌 유도체의 정제
1. 적절한 정제 방법 조사
발효시킨 후, 원심분리에 의해 세포를 분리해 내고 남아있는 세포를 제거하기 위해 남게되는 상징액을 여과하였다.
무세포 상징액에 진한 시트르산을 가하여 pH 3으로 조정하였다. 8 mS/㎝ 미만의 전도율을 확립하기 위해 용액을 정제수로 적절히 희석해야 한다. 후속적으로, 사전에 산 완충액과 평형을 이루게 한 양이온 교환 칼럼에 용액을 가하였다. 미결합 물질은 출발 완충액을 사용한 충분한 세척으로 제거하였다. 생성물은 염 구배를 이용해 용출시킨다. 얻어진 분획은, 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 및 프로테아제 억제를 측정하는 생물학적 활성 시험을 이용하여 생성물 함량에 대해 더 조사하였다. 생성물을 함유한 분획을 모으고 예비 RP-HPLC 칼럼에 직접 가하였다. 칼럼은 앞서 산성 완충액으로 평형을 이루게 하였다. 미결합 단백질은 출발 완충액으로 칼럼을 세척함으로써 제거하였다. 생성물은 유기 용매 구배를 이용하여 용출시켰다. 분획들은 여기서도 위에 이미 설명한 바와 같이 생성물 함량에 대해 조하한 다음 생성물을 함유한 분획을 모았다. 얻어진 생성물의 순도에 따라서는 모아진 분획을 또 하나의 RP-HPLC 칼럼에서 정제하는 것이 필요할 수도 있다. 조건은 이미 설명한 것과 기본적으로 동일하다. 얻어진 생성물 용액을 주사를 위해 물로 희석하고 적절한 분량으로 배분한 다음 동결건조시켰다.
위에 설명한 방법과 결합시킬 수 있는, 중성 pH에서 순전하가 없는 아프로티닌 유도체의 정제를 위한 다른 방법은 세파로오스-고정 트립신 상에서의 친화도 크로마토그래피 및 겔 투과 크로마토그래피이다.
2. DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr25-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌의 정제
10 ℓ 발효에서 얻어진 원료를 다음 방법에 따라 정제하였다. 발효가 완료된 후, 발효기 내용물을 진한 시트르산을 사용하여 pH 3으로 조정하고 70℃에서 10 분 동안 가열하였다. 그 다음 원심분리 (15 분, 7500 × g, Heraeus 원심분리기)에 의해 세포를 제거하고, 얻어진 상징액을 여과하였다 (8 ㎛ 내지 0.2 ㎛, Millipore, 독일). 이 단계부터 -18℃에서 동결시킴으로써 상징액을 후에 사용될 때까지 보관할 수 있다. 그 다음 정제수를 가함으로써 용액을 8 mS/㎝ 미만의 전도율까지 희석하고 SP-세파로오스 FF 칼럼(Pharmacia, 스웨덴)에 가하였다. 칼럼은 미리 50 ㎚ 시트르산염-NaOH 완충액, pH 3으로 평형을 이루게 한 것이다. 미결합 단백질은 동일한 완충액으로 강렬히 세척함으로써 제거하였다. 그 다음 생성물은 염 구배 (1 M NaCl)를 이용하여 용출시켰다. 얻어진 분획은, 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC, C4)를 이용하고 또 프로테아제 억제 활성의 시험에 의해 생성물 함량에 대해 조사하였다. 목적하는 생성물을 함유한 분획을 모았다.
그 다음 생성물 용액을, 미리 0.1% 트리플루오로아세트산/물과 평형을 이루게 해 놓은 제1 RP-HPLC 칼럼 (소스 15 RPC, Pharmacia, 스웨덴)에 직접 가하였다. 미결합 단백질은 동일한 완충액으로 강렬히 세척함으로써 제거하였다. 생성물은 선형 아세토니트릴 구배 (0-70%)를 이용하여 용출시켰다. 얻어진 분획은, 위에 설명한 방법을 사용하여 생성물 함량에 대해 조사하고 목적하는 생성물을 함유한 분획을 모았다.
최종 정제를 위해, 생성물 함유 용액을 주입을 위해 물로 희석하고, 미리 0.1% 트리플루오로아세트산/물과 평형을 이루게 해 놓은 제2 RP-HPLC 칼럼 (Vydac C8, Vydac, 미국)에 가하였다. 미결합 단백질은 동일한 완충액으로 강렬히 세척함으로써 제거하였다. 생성물은 선형 아세토니트릴 구배 (0-70%)를 이용하여 용출시켰다. 얻어진 분획은, 위에 설명한 방법을 사용하여 생성물 함량에 대해 조사하고 목적하는 생성물을 함유한 분획을 모았다.
얻어진 생성물 용액을 주입을 위해 물로 희석하고, 적절한 분량 (20, 10, 1 및 0.2 ㎎)으로 배분하고, 동결건조시킨 다음 분석하였다.
[실시예 5]
DesPro-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌을 사용한 사람 혈장 칼리크레인의 Ki, 측정
예:
1 유닛의 사람 혈장 칼리크FP인을 완충액 (0.05 M 트리스/0.1 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0)을 써서 16 ㎖로 희석하였다. 200 ㎕의 이 효소 용액을 점감하는 부피의 시험 완충액 (250,240,230,220,200,180,170,150,100 및 50㎕)과 혼합한 다음 점증하는 양의 분석 완충액 중 억제제를 가하였다 (10,20,30,50,70,80,100,150,200 및 250㎕, 농도 0.7 ㎍/㎕).
효소/억제제 용액을 실온에서 4 시간 동안 예비인큐베이션하였다. 그 다음 180 ㎕의 각 용액을 마이크로타이터 플레이트의 웰에 가하고 20 ㎕의 기질 용액과 혼합하였다. 흡광도의 변화를 405 ㎚에서 10 분 동안 측정하였다. 효소 반응의 속도를 산정하고 여기에서 Bieth의 방법 (Biochemical Medicine 32: 387-97(1934))에 따라 Ki값을 계산하였다.
기질 모액: DMSO 중 0.1 M
기질 용액: 분석 완층액 중 1 × 10-3M S-2302
분석 완충액: 0.05 M 트리TM-(히드록시메틸)-아미노메탄, 0.1 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.2, 벤질 알코올 1 ㎖/ℓ
플라즈민 인자 XIa, 소 트립신 및 키모트립신 효소와의 착체 형성의 동력학적 상수를 동일한 절차로 측정하였다. 기질은 플라즈민의 경우에는 크로모짐(Chromozym) PL, 인자 XIa의 경우에는 HD-Pro-Phe-Arg-pNA 트립신의 경우에는 S-2444, 그리고 키모트립신의 경우에는 Suc-Phe-Leu-Phe-pNA 였다.
[실시예 6]
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌의 단백질 화학적 특성파악 결과
유전공학에 의해 변화시킨 효모 생물을 통한 분비에 의해 프로테아제 억제제인 DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌을 제조하였다. 각종 크로마토그래피 방법에 의해 이것을 효모 상징액으로부터 균질한 상태까지 정제하였다. 클로닝된 서열을 갖는 억제제의 정체는 다음 단백질 분석적 조사에 의해 보인다.
N-말단 서열 분석
프로테아제 억제제를 57 단계에 걸쳐 완전히 서열결정하였다. 다음 서열 5의 목록은 결정된 단백질 서열을 보이는데, 클로닝된 서열과 동일하다.
1
Arg-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Ser-Thr-Gly-Pro-Cys-Ara-Ala-Ile-Arg-Tyr-
2
Phe-Tyr-Asp-Ala-Thr-Ala-Gly-Leu-Cys-Glu-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Cys-Arg-Ala-
40
Asn-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Glu-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌의 57 단계에 걸친 서열 분석
아미노산 분석
아미노산 분석은 단백질의 특성파악을 위한 중요한 정량적 파라미터이다. 일차 구조가 알려진 경우는, 단백질 함량 외에도 개별 아미노산의 수를 측정하였다.
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌의 아미노산 분석은 일차 구조에서 연유한 이론적 수치와 잘 일치한다 (표 1).
역상 크로마토그래피
화학적으로 결합된 역상에서의 단백질의 HPLC 크로마토그래피에 있어서, 사용된 상에 대한 결합은 단백질의 소수성 상호작용을 통해 일어난다. 단백질들은 정지상에 대한 그의 결합 강도에 따라 유기 용매(이동상)에 의해 이동하게 된다. 이런 이유로 이 방법은 단백질의 순도를 검사하는 좋은 기준이다.
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌은 RP-18 상에서 단일 피크로 용출된다. 단리된 프로테아제 억제제가 매우 청정한 것이 밝혀졌다.
CE 크로마토그래피
모세관 전기영동은 펩티드 및 단백질이 전기장 속에서의 그의 전하에 근거하여 분리될 수 있게 한다. 이 경우 분리의 품질은 완충액, pH, 온도 및 사용된 첨가제에 달려있다. 사용되는 모세관은 내경이 50-100 ㎛인 소위 "용융 실리카" 칼럼이다.
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌을 전기 장 속에 있는 "용융 실리카" 상에서 분리하였다. 전기영동형상은 폭이 좁은 피크를 보였다.
분자량 산정
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌 의 분자량은 MALDI 기법을 사용했을 때 6223 달톤인 것으로 산정되었다. 이 경우, 산정된 분자량을 측정 방법의 정확도 경계 내에서 이론치인 6215 달톤과 잘 일치한다. 시나프산을 매트릭스로 사용하였다.
SDS 겔 전기영동
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌을 환원 및 비환원 조건 하에서 SDS 전기영동을 통해 분석하였다. 여기서는 약 6.5 kD 범위에 밴드가 보였다.
[실시예 7]
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌 과 효소의 착체 형성에 대한 ki간의 측정
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Ala24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌의 억제 상수를 여러 효소에 대해 측정하였다. 표 2는 ki, 값을 보이는 것이다.
[실시예 8]
프로테아제 억제제와 다클론 토끼 또는 사람 항아프로티닌 항체의 상호작용
다클론 토끼 또는 사람 항아프로티닌 항체를 사용하여 재조합법에 의해 제조된 프로테아제 억제제의 교차 반응성에 대해 더 조사하였다. 각종 프로테아제 억제제 변이체가 아프로티닌 항혈청과 아주 약한 상호작용을 보일 뿐이라는 것이 밝혀졌다.
본 발명에 따른 새로운 아프로티닌 변이체는 아프로티닌을 이용하여 생산된 사람 및 토끼의 다클론 항혈청과 감소된 반응을 보인다. 새로운 변이체는 아프로티닌과 비교하여 뚜렷하게 저하된 면역원적 양태를 보인다, 즉 이들이 더 적은 면역 반응을 유도한다는 것이 밝혀졌다. 본 발명에 따른 변이체가 아프로티닌과 비교하여 혈구에서 히스타민의 방출을 더 낮게 유도한다는 것 또한 보일 수 있었다. 새로운 변이체는 그 밖에도 아프로티닌과 비교하여 뚜렷이 낮은 신장 축척을 보인다. 효소-동력학적 억제 상수 (Ki값)는 분자의 몸통에 있는 다수의 변화에도 불구하고 이 분자의 이전 변이체들과 비교할 때 놀라우리만치 향상 되었다.
<서열표＞
(1) 일반적 정보
(ⅰ) 출원인:
(A) 명칭: 바이엘 아게
(B) 거리: 바이엘베르크
(C) 도시: 레버쿠센
(E) 국가: 독일
(F) 우편번호: 51368
(G) 전화번호: 0214-3061455
(H) 팩스: 0214-303482
(ⅱ) 발명의 명칭: 특성이 개선된 아프로티닌 변이체
(ⅲ) 서열수: 5
(ⅳ) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 플로피 디스켓
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 패턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.30 (EPA)
(2) 서열 1에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 69 염기쌍
(B) 유형: 뉴클FP오티드
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 형태: DNA (게놈)
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티-센스: 없음
(ⅵ) 원 공급원
(A) 유기체: 프라이머 A
(xi) 서열 설명:
서열 1
(2) 서열 2에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 93 염기쌍
(B) 유형: 뉴플레오티드
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 형태' DNA (게놈)
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티-센스: 없음
(ⅵ) 원 공급원
(A) 유기체: 프라이머 B
(xi) 서열 설명:
서열 2
(2) 서열 3에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 38 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 헝태: DNA (게놈)
(V) 단편 형태: 선형
(ⅵ) 원 공급원
(A) 유기체: 프라이머 C
(xi) 서열 설명:
서열 3
(2) 서열 4에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 99 염기쌍
(B) 유형: 뉴플FP오티드
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 형태: DNA (게놈)
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티-센스: 없음
(ⅵ) 원 공급원
(A) 유기체: 프라이머 D
(xi) 서열 설명:
서열 4
(2) 서열 5에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 57 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 형태' 펩티드
(ⅴ) 단편의 유형: 선형
(ⅵ) 원 공급원
(A) 유기체: 아프로티닌 변이체
(xi) 서열 설명:
서열 5

Claims (7)

  1. pH 7에서 순전하가 +3 내지 -3이고 결합 부위에 아미노산 Arg15 또는 Arg15-Ala17을 가진 아프로티닌 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 세린 프로테아제의 억제를 위한 아프로티닌 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형된 N-말단 서열을 갖는 아프로티닌 변이체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-말단 연장 또는 단축이 있거나 N-말단에 결실된 아미노산이 있는 아프로티닌 변이체.
  5. DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌,
    DesPro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌,
    DesPro2-Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌
    DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌,
    DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-아프로티닌,
    Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌,
    Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌,
    Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌,
    Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-아프로티닌 및
    Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-아프로티닌으로 이루어진 군에서 선택된 아프로티닌 변이체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 아프로티닌 변이체 1종 이상을 함유하는 의약.
  7. 수술시 혈액 손실 감소, 다중외상, 쇼크 및 염증에 사용하는 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 아프로티닌 변이체의 용도.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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