SK101997A3

SK101997A3 - Aprotinin variants with improved properties, drugs containing the same and their use

Info

Publication number: SK101997A3
Application number: SK1019-97A
Authority: SK
Inventors: Werner Schroder; Soren Bjorn; Kjeld Norris; Viggo Diness; Leif Norkskov-Lauritsen; Niels D Christensen
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1996-07-25
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 1998-03-04
Also published as: ID17508A; DE19629982A1; IL121361A0; NO973426D0; ES2217350T3; AR008783A1; CA2207071A1; TR199700688A2; RU2197983C2; SV1997000068A; CO4890857A1; JPH10101700A; HUP9701290A3; AU2870197A; PL321341A1; DE59711356D1; AU762041B2; TW480271B; US20030096752A1; YU31697A

Description

VARIANTY APROTINÍNU SO ZLEPŠENÝMI VLASTNOSŤAMI, LIEKY TIETO LÁTKY OBSAHUJÚCE A ICH POUŽITIE

Oblasť techniky

Vynález sa týka variantov aprotinínu so zlepšenými enzýmovo inhibitorickými, imunologickými a farmakokinetickými vlastnosťami a ich výroby.

Doterajší stav techniky

Aprotinín, ktorý je tiež označovaný ako hovädzí pankreatický trypsínový inhibítor (BPTI), patrí ku skupine inhibítorov serínových proteáz Kunitzovho typu. Spektrum inhibovateľných serínových proteáz zahrňuje napríklad trypsín, chymotrypsín, plazmín a plazmový kalikreín (W. Gebhard, H. Tschesche a H. •Fritz, Proteinase Inhibitors, Barret and Salvesen (eds.)^ Elsevier Science Publ. BV 357-387, 1986).

Aprotinín sa skladá z 58 aminokyselín. Trojdimenzionálna štruktúra bielkoviny bola osvetlená pomocou rôntgenovej štruktúrnej analýzy a NMRspektroskopie (Wlodawer a kol., J. Mol. Biol. 198 (3), 469 - 480, 1987, Wagner a kol., J. Mol. Biol. 196 (1), 227 - 231, 1987, Berndt a kol., Biochemistry 32 (17), 4564-4570, 1993).

Pod obchodným názvom Trasylol® sa pôvodne používal prírodný aprotinín na ošetrenie pankreatitídy. Ako ukázali klinické štúdia, je dnes Trasylol® používaný v srdcovej chirurgii alebo pri ošetrení aprotinínom sa signifikantne zníži pri takýchto operáciách potreba transfúzií a vedie to k redukcii dodatočného krvácania (D. Royston, J. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 6, 76-100, 1992).

Mohlo sa preukázať, že pri výmene aminokyseliny určujúcej inhibičnú špecifičnosť v polohe 15 vedie k hodnotným variantom aprotinínu so

30720/H zlepšenými inhibičnými vlastnosťami (DE-PS 3 339 693). Vždy podľa zavedenej aminokyseliny môžu byť týmto spôsobom vyrobené aktívne inhibítory, ktoré inhibujú napríklad pankreatickú alebo leukocytárnu elastázu.

Neskôr sa ukázalo, že boli zistené inhibičné vlastnosti aprotinínu a variantov vyrobených výmenou v polohe 15, tiež výmenou ďalších aminokyselinových zvyškov v kontaktnom regióne medzi inhibovanou cieľovou proteázou a molekulou inhibítora. K tomu patria predovšetkým dodatočné aminokyselinové zvyšky v polohe 14, 16, 17, 18, 19, 34, 38 a 39. Varianty aprotinínu so zlepšenými vlastnosťami, získané výmenou jedného alebo viacerých takýchto aminokyselinových zvyškov v oblasti kontaktného regiónu boli okrem iného popísané napríklad v nasledujúcich spisoch: WO 89/01968, WO 89/10374, EP 0 307 592 a EP 683 229.

Zaujímavo môžu byť zlepšené farmakokinetické vlastnosti aprotinínu a jeho variantov výmenou aminokyselín, ktoré určujú fyzikálno - chemické , i vlastnosti látky. Tak sa podarilo znížením celkového kladného náboja molekuly signifikantné zníženie väzby v obličkách. Takéto varianty boli popísané v spise WO 92/06111.

Z dôvodu lepšej možnosti technickej pripraviteľnosti je v určitých prípadoch výhodné vyhotovenie modifikácie na N-terminálnom konci molekuly. Takéto modifikácie môžu byť skrátenie, predĺženie alebo delécia Nterminálneho konca u jednej alebo niekoľkých aminokyselín. N-terminálne modifikované varianty aprotinínu sú popísané napríklad v EP 419 878.

Podstata vynálezu

Predmetom predloženého vynálezu sú varianty aprotinínu, ktoré sa vyznačujú nasledujúcimi znakmi:

1. Výmena jednej alebo viacerých aminokyselín v aktívnom centre molekuly kvôli zlepšeniu aktivitných vlastností.

30720/H

2. Výmena aminokyselín kvôli zníženiu pozitívneho netto-náboja s cieľom zlepšenia imunologických a farmakokinetických vlastností.

3. Modifikácia N-terminálnej aminokyselinovej sekvencie z dôvodu technickej pripraviteľnosti.

Varianty aprotinínu, ktoré práve obsahujú iba jeden z uvedených znakov, sú popísané vo vyššie uvedených spisoch. Varianty aprotinínu podľa predloženého vynálezu zjednocujú vo svojej molekulovej štruktúre dva alebo tri z vyššie uvedených znakov. Sekvencia aminokyselín je pre niektoré varianty napríklad znázornená na obr. 1.

Varianty aprotinínu podľa predloženého vynálezu sa však neobmedzujú iba na príklady, uvedené na obr. 1. K variantom aprotinínu podľa predloženého vynálezu patria tiež varianty s N-terminálnym predĺžením Ala(-2)-Gln(-1), s prirodzeným aminokyselinovým zvyškom prolínom v polohe 2, s výmenou iných aminokyselín, nesúcich kladný, náboj, za neutrálne alebo záporne nabité aminokyselinové zvyšky alebo s výmenou iných neutrálnych aminokyselín za negatívne nabité aminokyselinové zvyšky. Voľba výmeny aminokyselinových zvyškov sleduje princíp získania látky, ktorá by pri fyziologickej hodnote pH mala redukovaný pozitívny netto - náboj, výhodne v oblasti +2 až -2. Uvedené zmeny v aminokyselinovej sekvencii vrátane N-terminálneho predĺženia alebo skrátenie alebo delécia môže byť využité v ľubovoľnej vzájomnej kombinácii. K variantom aprotinínu podľa predloženého vynálezu patria teda všetky zlúčeniny, ktoré vykazujú kombináciu vyššie uvedených znakov a ktoré majú pri fyziologickej hodnote pH redukovaný pozitívny netto - náboj.

Prekvapujúco sa ukázalo, že kombináciou dvoch alebo troch menovaných znakov dochádza nielen k dosiahnutiu, ale tiež čiastočne dokonca k zosilneniu výraznosti jednotlivých znakov. Okrem toho sa môžu dosiahnuť významne nové vlastnosti substancie, ktoré sa týkajú napríklad imunologických, farmakokinetických a povrchovo väzbových vlastností. Nové varianty vykazujú zníženú reakciu s polyklonálnymi ľudskými a králičími

30720/H antisérami, ktoré bývajú vytvorené pri použití aprotinínu. Ďalej sa zistilo, že nové varianty majú značne znížené imunógénne správanie v porovnaní s aprotinínom, to znamená, že vyvolávajú zníženú imunitnú odozvu. Ďalej sa ukázalo, že varianty podľa predloženého vynálezu indukujú v porovnaní s aprotinínom nižšie uvoľňovanie histamínu z krvných buniek. Ďalej vykazujú nové varianty podstatne nižšiu akumuláciu v obličkách v porovnaní s aprotinínom. Enzýmové kinetické inhibičné konštanty (Ki-hodnoty) sú prekvapujúco zlepšené napriek veľkému množstvu zmien v molekulovej stavbe v porovnaní s pôvodnými variantmi molekuly.

Predmetom predloženého vynálezu teda sú varianty aprotinínu s netto nábojom +3 až -3 pri hodnote pH 7 a s aminokyselinami Arg 15 alebo Arg 15 Ala 17. Výhodné sú také, ktoré majú netto - náboj +2 až -2 a obzvlášť výhodne +1 až -1.

Tieto aprotinínové varianty sú vhodné na inhibíciu plazmatického kaiikreínu, tkanivového kalikreínu a plazmínu.

Naviac môžu mať tieto varianty aprotinínu zmenenú N-terminálnu sekvenciu.

Tým sa myslia varianty aprotinínu s N-terminálnym predĺžením alebo skrátením alebo s deletovanými aminokyselinami na N-konci.

Výhodné sú varianty aprotinínu zo skupiny zahrňujúcej:

desPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-aprotinín, desPro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-aprotinín, desPro2-Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-aprotinín, desPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-aprotinín, desPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Giu53-aprotinín.

Tieto varianty aprotinínu môžu tiež niesť aminokyselinu prolín v polohe

2.

30720/H

Vynález sa tiež týka liekov, obsahujúcich jednu alebo viacero týchto variantov aprotinínu.

Popísané nové inhibítory proteináz sú vhodné na ošetrenie stavov ochorení, pri ktorých dochádza - tiež v dôsledku komplexného chirurgického postupu, napríklad v srdcovej chirurgii alebo pri aloartroplastických náhradách kĺbov v transplantaČnej medicíne - k aktivácii plazmatických enzýmových systémov vplyvom rozľahlých alebo intenzívnych kontaktov krvi s cudzími povrchmi.

Inhibítory redukujú straty krvi pri operáciách, ktoré sú spojené so zvýšeným rizikom krvácania (napríklad operácia srdca, kostná a kĺbová chirurgia). Sú vhodné pri terapii šokov, polytraumy, mozgovej a lebečnej traumy, sepsy, diseminovanej vnútrocievnej koagulopatii (DIC), celkovom zlyhaní orgánov a zápalových ochorení zúčastňujúcich sa na kalikreínovom systéme, ako sú reumatické ochorenia kĺbov a astma. Bránia invazívnemu rastu tumorov a tvorbe metastáz inhibíciou plazmíňu. Sú vhodné tiež vplyvom inhibície syntézy bradykinínu na terapiu bolestí a edémov, ako i na ošetrenie prípadov mŕtvice.

Sú tiež použiteľné pri liečení dialýzou a pri použití umelých orgánov, aby znižovali zápaly a koaguláciu a aby zmierňovali riziko krvácania.

Príprava variantov aprotinínu podľa predloženého vynálezu

Na prípravu variantov aprotinínu podľa predloženého vynálezu je vhodné použiť postupy génovej techniky. Na to sa používajú bežné metódy molekulárnej biológie vo vhodných mikrobiálnych expresných organizmoch, ktoré zavádzajú génovo technickú informáciu pre syntézu zodpovedajúceho variantu aprotinínu. Rekombinantný mikroorganizmus sa fermentuje; voľbou vhodných podmienok sú dávané heterológne informácie pre expresiu. Exprimované deriváty aprotinínu sa nakoniec získavajú z kultivačného média.

30720/H

Vhodné hostiteľské organizmy pre produkciu variantov podľa predloženého vynálezu môžu byť baktérie, kvasinky alebo huby. Expresia môže prebiehať intracelulárne alebo za použitia vhodných sekrečných systémov extracelulárne. Varianty aprotinínu môžu byť exprimované jednoduchým procesom alebo naviazané na peptidy alebo bielkoviny.

Vhodné systémy pre expresiu variantov aprotinínu sú popísané v spisoch EP 683 229, WO 89/02463 a WO 90/10075, a v rôznych ďalej alebo vyššie uvedených spisoch.

Metódy vykonávania spôsobu podľa predloženého vynálezu

Enzýmy

Použité enzýmy (reštrikčné endonukleázy, alkalická fosfatáza z teľacích čriev, T4 polynukleotidkináza a T4 DNA ligáza) boli odoberané od firiem Boehringer Mannheim a Gibco/BRL a boli aplikované podľa predpisov výrobcov.

Molekulárne biologické techniky

Rutinné klonovacie práce, ako je napríklad izolácia plazmidovej DNA z E. coli (tzv. miniprep) a transformácia E. coli plazmidovou DNA sa vykonáva podľa Sambrooka a kol. (Molecular Cloning Colg Spring Harbor, 1989). Ako hostiteľský organizmus sa používa E. coli kmeň DH5a (Gibco/BRL). Pre izoláciu väčších množstiev plazmidovej DNA sa používa Qiagen-tips (Qiagen). Extrakcia fragmentov DNA z agarózového gélu sa vykonáva pomocou Jetsorbu podľa údajov výrobcu (Genomed).

Oligonukleotidy pre site directed mutagenesis-experimenty a priméry pre PCR - reakcie a sekvencovacie reakcie sa vyrobia pomocou 380 A DNA syntetizéru firmy Applied Biosystems. Pokusy na mutagenézu sa vykonávajú podľa postupu Denga a Nickoloffa (Deng a kol., Anál. Biochem. 200, 81 - 88, 1992) za použitia súprav firmy Pharmacia Biotech (Uníque Site Elimination Mutagenesis). Všetky konštrukcie vektorov a experimenty mutagenézy boli

30720/H potvrdené pomocou Taq CycIe-DNA-sekvencovania s fluorescenčné značenými terminátormi na ABI 373 A Sequenceri (Applied Biosystems).

Transformácia Saccharomyces cerevisiae

Bunky kvasiniek, napríklad kmeňa JC34.4D (MATa, ura3-52, suc2) sa vnesie do 10 ml YEPD (2 % glukóza, 2 % peptón, 1 % Difco kvasničný extrakt) a pestujú sa pri O.D.goonm 0,16 až 0,8. Bunky sa premyjú 5 ml roztoku A (1 M soibitol, 10 mM bicín pH 8,35, 3 % etylénglykol), resuspendujú sa v 0,2 ml roztoku A a skladujú sa pri teplote -70 °C.

Plazmidová DNA (5 pg) a carrier-DNA (50 pg DNA zo spermií sleďov) sa pridá k zmrazeným bunkám. Bunky sa potom nechajú roztopiť trepaním po dobu 5 minút pri teplote 37 °C. Po prídavku 1,5 ml roztoku B (40 % PEG 1000, 200 mM bicín pH 8,35) sa bunky inkubujú po dobu 60 minút pri teplote 30 ’C, premyjú sa 1,5 ml roztoku C (0,15 M NaCl, 10 mM bicín pH 8,35) a resuspendujú sa v 100 pi roztoku C. Naočkovanie sa vykonáva na selektívne médium s 2 % agaru. Transformandy sa získajú po inkubácii po dobu 3 dni pri teplote 30 °C.

Živné médiá pre fermentáciu

1. SD2-médium:

Bacto Yeast Nitrogen Base 6,6 g/l glukóza* 20 g/l

KH₂PO₄

6,7 g/l g/l 20 g/l 6,7 g/l 2,0 g/l pH 6,0

2. SC5-médium:

glukóza kvasničný extrakt Difco

KH₂PO₄ (NH₄)₂SO₄

30720/H δ

MgSO₄ x 7 Η₂0 roztok stopových prvkov SL4	1,0 g/l 1,0 ml/l
Roztok stopových prvkov SL4:
Titriplex III	5 g/l
FeSO₄ x 7 H₂O	2 g/l
ZnSO₄ x 7 H₂O	0,1 g/l
MnCI₂ x 4 H₂O	0,03 g/l
H3BO3	0,3 g/l
CoCI₂ x 6 H₂O	0,2 g/l
CuCI₂x2 H₂O	0,01 g/l
NíCI₂ x 6 H₂O	0,02 g/l
Na₂MoO₄ x 2 H₂O	0,03 g/l
* oddelene autoklávované ·
3. Fermentačné médium:
glukóza*	2,0 g/l
sójový peptón	25,0 g/l
KH₂PO₄	1,4 g/l
MgSO₄ x 7 H₂O	1,0 g/l
tiamínchlorid	5,1 mg/l
inozitol	20 mg/l
roztok stopových prvkov	3 ml/l
roztok vitamínov	3 ml/l
(NH₄)₂SO₄	3,8 g/l d!
Živný roztok:
glukóza*	530 g/l

30720/Η

(NH₄)₂SO₄	5,0 g/l
κη₂ρο₄	2,9 g/l
MgSO₄ x 7 H₂0	3,8 g/l
tiamínchlorid	13 mg/l
inozitol	70 mg/l
roztok stopových prvkov SL4	6,8 ml/l
roztok vitamínov	6,8 ml/l

Roztok stopových prvkov:
FeCI₃ x 6 H₂O	13,5 g/l
ZnCI₂ x 4 H₂O	2,0 g/l
H3BO3	0,5 g/l
CoCI₂ x 6 H₂O	2,0 g/l
CuSO₄ x 5 H₂O	1,9 g/l
Na₂MoO₄ x 2 H₂O	2,0 g/l
CaCI₂ x 2 H₂O	1,0 g/i
HCI kone.	100 ml/l
* oddelene autoklávované
Roztok vitamínov:
Riboflavín	0,42 g/l
pantotenát vápenatý	5,9 g/l
kyselina nikotínová	6,1 g/l
hydrochlorid pyridoxínu	1,7 g/l
biotín	0,06 g/l
kyselina folová	0,04 g/l.

30720/Η

Výroba pracovných konzerv

Základnou konzervou sa 1 % zaočkuje 200 ml SD2-média v jednolitrovej Erlenmayerovej banke. Kultúra sa inkubuje na trepačke (260 otáčok za minútu) po dobu 72 hodín pri teplote 28 °C. Potom sa naplní vždy 2 ml do nádobiek a zmrazí sa v kvapalnom dusíku.

Fermentácia v trepacích bankách

Ako predkultúra sa 1 % zaočkuje 200 ml SD2-média v jednolitrovej banke pracovnou konzervou a fermentuje sa po dobu 72 hodín pri teplote 28 °C na trepačke pri 260 otáčkach za minútu. Touto predkultúrou sa 1 % zaočkujú hlavné kultúry (200 ml SC5-média v jednolitrových bankách) a inkubujú sa po dobu 72 až 96 hodín na trepačke pri teplote 28 °C.

Fermentácia v desaťlitrových bioreaktoroch

Ako predkultúra sa 1 %. zaočkuje 200 ml SD2-rňédia v jednolitrovej banke pracovnou konzervou a fermentuje sa po dobu 72 hodín pri teplote 28 °C na trepačke pri 260 otáčkach za minútu. Hlavná kultúra v desaťlitrovom reaktore sa kultivuje ako fed-batch fermentácia po dobu 96 hodín. Ako živné médium sa použije vyššie uvedené fermentačné médium, štartovací objem je 7

I. Fermentor sa zaočkuje 200 ml predkultúry.

Podmienky fermentácie:

Teplota: 28 °C

Otáčky miešadla: 500 otáčok za minútu

Vzdušnenie: 10 l/min.

pH: 5,5

Tlak v hlave fermentora: 20 kPa

Po 7 hodinách fermentácie sa zaháji prídavok živín. Hodnoty prídavku živín sú riadené cez respiračné kvocienty (RQ) (RQ = vytvorený oxid

30720/H uhličitý/spotrebovaný kyslík). Pokiaľ stúpne RQ na hodnotu > 1,15, tak sa prídavok živín zníži, ak klesne na hodnotu < 1,05, tak sa prídavok živín zvýši.

V pravidelných intervaloch sa z fermentora odoberajú vzorky a zisťuje sa rast buniek meraním optickej hustoty pri 700 nm. Okrem toho sa zisťuje koncentrácia Bay 19-8757 v roztoku meraním aktivity.

Na konci fermentácie sa hodnota pH zníži prídavkom 50 % kyseliny citrónovej (hmotnosť/objem) na 3,0 a obsah fermentora sa zahreje po dobu 10 minút na teplotu 70 °C. Bunky sa potom oddelia odstredením pri 7 500 g a získaný roztok sa použije na vyčistenie bielkovín.

Materiály pre proteínchemickú analytiku

Sekvenačné analýzy sa vykonávajú pomocou proteínsekvenátora model 473A firmy Applied Biosystems (Forster City, USA). Používa sa štandardný sekvenovací program. Sekvenátor, rôzne programy sekvenovania, ako i PTHdetekčný systém sú detailne popísané v návode na'obsluhu (User's manual protein sequencing systém model 473 A) (1989) Applied Biosystems Forster City, CA 94404, USA).

Reagencie pre prevádzku sekvenátora a HPLC-stípec pre PTH-detekciu boli prevzaté od Applied Biosystems.

HPLC-analýzy sa vykonávajú s pomocou HP 1090 HPLC-System firmy Hewlett Packard (D-Waldbronn). Pre delenie sa používa RP-18-HPLC-stípec (250 mm x 4,6 mm, 5 μ-materiál, priemer pórov 3 x 10’⁵ mm) firmy Backerbond (D - Gross Gerau).

Pre kapilárnu elektroforézu sa používa model 270 A-HT od firmy Applied Biosystems (Forster City, CA 94404, USA). Vzorky sa injikujú spravidla hydrodynamický v rôznych časových intervaloch. Použité kapilárne stĺpce (50 pm x 72 cm) sú od Applied Biosystems.

30720/H

Analýzy aminokyselín sa vykonávajú pomocou analyzátora aminokyselín LC 3000 firmy Eppendorf Biotronik (D-Maintal). Používa sa ľahko modifikovaný štandardný deliaci program firmy Biotronik. Programy delenia a funkcie analyzátora sú obšírne popísané v návode na použitie prístroja.

Molekulové hmotnosti sa zisťujú pomocou systému MALDI firmy Kratos/Shimadzu (D-Duisburg). SDR-elektroforéza sa vykonáva pomocou systému elektroforézy firmy Pharmacia (D-Freiburg).

Zisťovanie kinetických dát sa vykonáva pomocou míkrotitračných doštičiek firmy SLT (D-Crailsheim). Umývanie míkrotitračných doštičiek sa vykonáva pomocou umývacieho prístroja firmy Dynatec (D-Denkendorf).

Enzýmy a substráty sú od firmy Calbiochem (D-Bad Soden). Všetky ostatné chemikálie sú od firmy Merck (D-Darmstadt) alebo Sigma (DDeisenhofen). 96-jamkové doštičky sú od firmy Greiner.

Polyklonálne králičie anti-aprotinínové protilátky sa získajú z králikov imunizáciou aprotinínom. Ľudské polyklonálne anti-aprotinínové protilátky pochádzajú od pacientov, ošetrených aprotinínom.

Proteínchemická analytika

N-termínálna sekvenčná analýza až 3 mmól inhibítora proteázy sa pridá k sekvenčnej membráne ktorá bola predinkubovaná polybrénom. Proteín sa sekvenuje v celkom normálnom cykle sekvenátora. PTH-aminokyseliny sa identifikujú za použitia online-HPLC pomocou 50 pmól PTH-štandardu.

Analýza aminokyselín

200 pg proteínu sa rozpustí v 200 pl 6 N kyseliny chlorovodíkovej a hydrolyzuje sa po dobu jednu hodinu pri teplote 166 °C. Asi 1 mmól vzorky sa nanesie do analyzátora aminokyselín. Množstvo aminokyselín sa zisťuje cez 5 mmól štandard.

30720/H

SDS gelová elektroforéza

SDS gelová elektroforéza sa vykonáva v podmienkach podľa Laemmli. 10 pg proteázového inhibítoru sa analyzuje v 10 % až 20 % SDS-gelu a detekuje sa pomocou vyfarbenia striebrom (Merril a kol.).

U.K. Laemmli, Náture 227, 680 - 685 (1970),

C. R. Merril, M. L. Dunau, D Goldmann, Anál. Biochem. 100, 201 -207 (1981). Kapilárna elektroforéza ng inhibítora proteázy sa skúma pomocou kapilárnej elektroforézy na sklenenom stĺpci (dĺžka 72 cm, vnútorný priemer 50 pm). Podmienky: prúd 90 pA, teplota stĺpca 25 °C, 100 nM fosfátový pufor pH 3,0, detekcia 210 nm, pod tlakom 3 sekundy.

Reverzná fázová chromatografia nmól proteázového inhibítora sa chromatografuje na stĺpci Bakerbond

RP-18-HPLC (materiál 5 p, 4,6 nm x 250 mm, veľkosť pórov 3 x 10‘⁵ mm). Ako eluent sa použije gradient acetonitril/TFA. Podmienky: rýchlosť toku 0,7 ml/min., teplota stĺpca 40 °C, rozpúšťadlo A 0,1 % TFA, rozpúšťadlo B 0,1 % TFA/60 % acetonitril, gradient: 0 min. 0 % B, 10 min. 0 % B, 70 min. 100 % B, 80 min. 0 % B.

Stanovenie molekulovej hmotnosti pg proteázového inhibítora sa analyzuje technikou MALDI. Ako matrica sa použije kyselina sinapínová. Ako štandardné proteíny pre hmotnostnú kalibráciu sa použije teľací inzulín, cytochróm C a melitín.

Obsah proteínov

Obsah proteínov sa stanovuje metódou BCA. Pri tejto metóde sa premení prítomnými proteínmi Cu²⁺ ióny na Cu¹⁺ ióny, ktoré tvoria s kyselinou bicínchonínový komplex, absorbujúci pri 560 nm.

30720/H

Lyofilizovaný proteín sa prevedie do rovnovážneho stavu vlhkosti a rozpustí sa v koncentrácii 1 mg/ml v 0,9 % roztoku chloridu sodného. Pripraví sa zried’ovací rad. K 50 pl roztoku vzorky sa pridá 1 000 μΙ testovacej reagencie BCA (Pierce), reagenčná skúmavka sa pevne uzatvorí zátkou a inkubuje sa po dobu 30 minút pri teplote 60 °C. Po ochladení vzorky v ľadovom kúpeli po dobu 5 minút sa vykonáva meranie pri teplote 25 °C a vlnovej dĺžke 560 nm.

Aktivita (trypsínový inhibičný test, titračne)

Aktivita sa zisťuje pomocou modifikovaného inhibičného testu trypsínu F.I.P. Bay y 19-8757 inhibuje trypsínom katalyzovanou hydrolýzou Na-benzoylL-arginínetylesteru (BAEE). Karboxylové skupiny, uvoľnené pri reakcii, sa zisťujú alkalimetrickou titráciou. Zvyšková aktivita trypsínu je mierou inhibičnej aktivity účinnej látky.

Lyofilizovaný proteín sa prevedie do rovnovážneho stavu vlhkosti, rozpustí sa v koncentrácii 1 mg/l v 0,9 % roztoku chloridu sodného a pripraví sa zrieďovací rad. K 1 ml roztoku vzorky sa pridajú 2 ml pufra (15 mM borátového pufra, pH 8,0 s 200 mM CaCl2) a 0,8 ml roztoku trypsínu (2 mg/ml) a zmes sa inkubuje po dobu 5 minút pri teplote 25 °C. Potom sa pridá 0,2 ml roztoku BAEE (6,8 mg/ml) a meria sa spotreba KOH po dobu 5 minút.

Zistenie krížovej reakcie proteázového inhibítora s polyklonálnymi králičími, prípadne ľudskými antiaprotinínovými protilátkami

0,5 až 10 ng proteázového inhibítora, prípadne aprotinínu, rozpustených v kopulačnom pufre, sa naviaže cez noc pri teplote 4 °C na mikrotitračnú doštičku. Jamky sa premyjú štyrikrát vždy 200 μΙ premývacieho pufra a potom sa pridá 100 μΙ blokačného roztoku. Doštička sa prikryje a inkubuje sa po dobu jednu hodinu pri teplote 37 °C. Po premytí, ako bolo uvedené vyššie, sa pridá polyklonálna králičia antiaprotinínová protilátka (0,2 pg/ml v 1 % BSA v PBSpufre), prípadne polyklonálna ľudská protilátka (20 pg/ml v 1 % HSA v PBSpufre). Doštička sa zakryje a inkubuje sa po dobu jednu hodinu pri teplote 37

30720/H °C a potom sa premyje, ako je uvedené vyššie. Teraz sa pridá 100 μΙ biotinylovanej anti-králičej, prípadne anti-ľudskej protilátky (25 μΙ + 10 ml 1 % BSA, prípadne 1 % HSA v PBS-pufre) a inkubuje sa po dobu jednu hodinu pri teplote 37 °C. Doštička sa premyje ako je vyššie uvedené a pridá sa do každej jamky 10 μΙ streptavidín - peroxidázového komplexu (50 μΙ + 10 ml 1 % BSA, prípadne 1 % HSA v PBS-pufre). Doštička sa zakryje, inkubuje sa po dobu jednu hodinu pri teplote 37 °C a potom sa premyje, ako je uvedené vyššie.

Substrátová reakcia sa vykonáva s TBM-substrátom + roztokom peroxidázy (1 :1, 100 μΙ pre jamku). Reakcia sa skončí po 10 minútach 100 μΙ pre jamku 2 M kyseliny fosforečnej a meria sa absorpcia pri 450 nm (referencie 570 nm).

Roztoky

1. Inkubačný pufor:

2. Pufor pre vzorky:

konceninkubačnom

3. Premývací roztok:

4. Blokačný pufor:

Príklady vyhotovenia vynálezu

Príklad 1 nM Na2CO3, 35 mM NaHCOá; pH 9,6 vzorky sa vo vhodnej trácii rozpustia v pufre

0,1 % (v/v) Tween-20 v PBS % (v/v) BSA v PBS.

Výroba kvasinkového expresného vektora pre sekréciu rekombinantného desPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26- Glu31-Asn41-Glu53-aprotinínu

Ako východiskový materiál pre výrobu génu desPro2-Ser10- Arg15Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinínu slúži gén desPro2-Arg15Ala17, ktorý bol klonovaný reštrikčnými enzýmami Hlndlll a BamHI do vektora

30720/H pUC18. Rezultujúci vektor (pEM6.6.L) sa podrobí pomocou Mutagenese Primeru A a Scal/Mlul U.S.E. Selektionsprimeru dvojskrutkovnicovej mutagenéznej reakcii podľa postupu U.S.E. (Pharmacia Biotech). Mutagenese Primer A má nasledujúcu sekvenciu:

Primer A

5'GGCTGCAGAGCTAACCGTAACAACTTCAAATCCGCGGAAGACTGCATGG AAATTGCGGTGGTGCTTAG 3'. Tento primár generuje mutácie Asn41 a Glu53 v géne desPro2-Arg15-Ala17 aprotinínu. Analýza klonov sa vykonáva reštrikčným štepením pomocou enzýmov Seal a Sphl. Požadovaná sekvencia bola okrem toho potvrdená pomocou DNA-sekvenovania klonu pEM31.8.L. Ďalšie výmeny v 5'-oblasti génu (Ser10-Asp24- Thr26-Glu31) boli vykonané pomocou PCR-techniky za použitia Priméru B a reverzného 24-mér M13' Priméru, keď sa vychádzalo z pEM31.8.L plazmid DNA. Primér B má nasledujúcu sekvenciu:

Primér B

5'TGCCTCGAGCCGCCGTCTACTGGGCCCTGCAGAGCTATCATCCGTTACT TCTACGATGCAACTGCAGGCCTGTGTGAAACCTTCGTATACGGC 3'. Xhol poznávacia sekvencia je podčiarknutá.

PCR-vsádzka obsahuje 20 ng pEM31.8.L plazmid DNA, 20 pmól reverzný 24-mér M13' priméru, 60 pmól Priméru B, 200 pm dNTPs, 1 x PCR reakčného pufra II (Perkin Elmer), 4 mM chloridu horečnatého a 2,5 U Taq DNA polymerázy (Perkin Elmer) v celkovom objeme 100 pl. Podmienky cyklu sú:

min. pri teplote 94 °C, 30 cyklov vždy 1 min. pri teplote 94 °C, 1 min. pri teplote 55JO aJ min. pri teplote 72 °C a nasledujúca päťminútová inkubácia pri teplote 72 °C. PCR-vsádzka sa zriedi 1:5a liguje sa s vektorom pCRII (invitrogén). Ligačnou vsádzkou sa transformujú bunky E. coli DH5a. Pozitívne klony sa identifikujú po reštrikčnom štepení enzýmami Xhol a BamHI a viacero

30720/H klonov sa sekvenuje. Kloň pES9.10.L obsahuje požadovanú sekvenciu a používa sa pre ďalšiu prácu.

Vektor E. coli/kvasinky (napríklad pA202) sa použije na konštrukciu kvasinkového sekrečného vektoru, v ktorom je spojená sekvencia desPro2Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41- Glu53-aprotinínu s pre-prosekvenciou alfa-faktoru kvasiniek.

Vektor pA202 nesie gén ampicilínovej rezistencie (bla) a URA3 gén ako selektovateľný značkový gén pre E. coli a kvasinky. Ďalšie esenciálne prvky vektoru sú Col E1 a 2 μ pôvodný bod replikácie (ori) REP3 Locus sa nachádza rovnako v tomto regióne. 1200 Bp veľký EcoRI-HindlII-fragment nesie MFal promótor a N-terminálnu pre-pro-sekvenciu kvasinkového alfa-faktorpredchádzajúceho proteínu (Kurjan a Herskowitz, Celí 30, 933 - 934, 1982). Zavedením modifikovaného desPro2-Arg15-aprotinín cDNA ako HindlII-BamHI fragment sa opäť vyrobí rozpoznávacie miesto pre Kexll -proteázu ('Lys-Arg') , 1 vo vnútri alfa-faktor-pre-pro-sekvencie (EP 0 419 878).

Na 3'-konci sekvencie desPro2-Arg15-aprotinínu nesie vektor BamHlSall fragment kvasinkového URA3 génu, ktorý v tejto polohe funguje ako terminačný signál pre transkripciu (Yarger a kol., Mol. Celí. Biol. 6, 1095 1101, 1986).

180 Bp veľký DNA-fragment sa pomocou Xhol a BamHI odštepí z vektora pES9.10.L, vyčistí sa elektroforézou na agarózovom geli a klonuje sa do rovnako pomocou Xhol a BamHI štepeného a defosforylovaného vektoru pA202. Týmto klonovaním sa nahradí DesPro2-Arg15-aprotinín vo vektore pA202 za desPro2-Ser10-Arg15 -Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53aprotinín. Bunky kvasiniek (JC34.4D) sa transformujú vektorom pES13.10.L, rezultujúcim z tohto klonovania.

Iné vektory E. coli/kvasinky s rôznymi promótormi ako je napríklad konštitívny GAPDH alebo indukovateľný GAL 10 promótor, sa môžu vyrobiť

30720/H podobným spôsobom a vedú rovnako k sekrécii desPro2-Ser10-Arg15-Ala17Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53- aprotinínu.

Okrem toho je samozrejme tiež možné použiť vektory s inými pôvodmi replikácie kvasiniek, ako je napríklad chromozomálny autonómne replikovateľný segment (ars).

Vhodne selektovateľné markérové gény sú okrem URA3 génu také gény, ktoré auxotrofnému mutantovi kvasinky dopomáhajú k prototrofii, ako sú napríklad gény LEU2, HIS3 alebo TRP1. Okrem toho je možné tiež samozrejme použiť gény, ktorých produkty sprostredkovávajú rezistenciu voči rôznym antibiotikám, ako je napríklad aminoglykozid G418.

Iné kvasinky, ako sú napríklad kvasinky Pichia pastoris alebo Hansenula polymorpha, sú po transformácii vhodnými vektormi rovnako schopné produkcie desPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26 -Glu31 -Asn41 -Glu53aprotinin.

Príklad 2

Výroba kvasinkového expresného vektora pre sekréciu rekombinantného Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31- Asn41-Glu53-aprotinínu s prírodnou N-terminálnou sekvenciou 'Arg-Pro-Asp'

Na výrobu kvasinkového expresného vektoru, ktorý dovoľuje sekréciu Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53- aprotinínu s prírodnou N-terminálnou sekvenciou 'Arg-Pro-Asp', sa najprv cez PCR amplifikuje a klonuje MFa1 promótor s α-faktorom pre-sekvencie a 5'-koncom génu aprotinínu (až k rozpoznávacej sekvencii reštrikčného enzýmu Xhol). Použitý primér má nasledujúcu sekvenciu:

Primér C

S'-GGGATATCTATTGATAAGATTTAAAGGTATTTGACAAG-S'

30720/H

Rozpoznávacia sekvencia EcoRV je podčiarknutá.

Primér D

5-GGGCTCGAGGCAGAAATCTGGTCTAGCCAAAGCAGAAGAAGCAGCG

AACAAGACAGCAGTGAAAATAGATGGAATCTCATTCTTTTAATCGTTTATAT

T-3*

Rozpoznávacia sekvencia Xhol je podčiarknutá.

PCR-vsádzka obsahuje 200 ng pA202 plazmid DNA, 0,2 μΜ priméru C, 0,2 μΜ priméru D, 200 pM dNTPs, 1 x PCR reakčného pufra 11 (Stratagene, opti-PrimeTM) _a 2,5 U Taq DNA polymerázy (Perkin Elmer) v celkovom objeme 50 pl. Podmienky cyklu sú: 1 min. pri teplote 94 °C, 30 cyklov vždy 1 min. pri teplote 94 °C, 1 min. pri teplote 50 °C a 2 min. pri teplote 72 °C a nasledujúca päťminútová inkubácia pri teplote 72 °C. PCR-vsádzka sa zriedi 1:5a liguje sa s vektorom pCRII (invitrogén). Ligačnou vsádzkou sa transformujú bunky E. coli DH5a. Pozitívne klony sa identifikujú po reštrikčnom štepením enzýmom EcoRI a viacero klonov sa sekvencuje. Kloň plU20.11.L sa používa pre ďalšiu prácu.

Vektor E. coli/kvasinky pYES2 (invitrogén) sa použije pre konštrukciu kvasinkového sekrečného vektoru, v ktorom je spojená sekvencia Ser10Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53- aprotinínu priamo s pre-prosekvenciou alfa-faktoru kvasiniek. Najprv sa rozštepí vektor pYES2 reštrikčnými enzýmami Sspl a BamHI, defosforyluje sa a čistí sa gelovou chromatograf iou. Na vektore pYES2 prítomný GAL1 promótor a fl ori sa pri tom odstráni. Asi 1030 Bp veľký fragment DNA sa pomocou EcoRV a Xhol odštepí z vektoru plU20.11.l_, vyčistí sa pomocou elektroforézy na agarázovom geli a spoločne s asi 180 Bp veľkým Xhol a BamHI fragmentom z vektoru pES9.10.L sa klonujú do vektoru pYES2, rozštepeného pomocou Sspl a BamHI. Ligačnou vsádzkou sa transformujú bunky E. coli DH5a. Pozitívne klony sa identifikujú a sekvencujú po reštrikčnom štepení enzýmom Xhol. Bunky kvasiniek (JC34.4D) sa transformujú vektorom plU28.11.L, rezultujúcim z tohto klonovania.

30720/H

Expresný vektor plU28.11.L neobsahuje žiadnu α-faktor pro-sekvenciu, takže prebieha procesovanie Ser10-Arg15- Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53aprotinínu výhradne signálnou peptidázou a je nezávislé od štepenia Kexll proteázou.

Príklad 3

Fermentácia Saccharomyces cerevisiae

Expresný kmeň Saccharomyces cerevisiae sa fermentuje ako je popísané vyššie.

Príklad 4

Čistenie derivátov aprotinínu bez netto-náboja pri neutrálnej hodnote pH

1. Prehľad vhodných postupov čistenia

Po fermentácii sa bunký oddelia odstredením a zvyšná kvapalina sa prefiltruje, aby sa odstránili zvyšné bunky.

Hodnota pH tejto kvapaliny sa nastaví pomocou koncentrovanej kyseliny citrónovej na 3. Roztok sa musí vhodne zriediť vyčistenou vodou tak, aby bola nastavená vodivosť nižšia ako 8 mS/cm. Potom sa roztok nanesie na stĺpec katiónomeniča, ktorý bol vopred ekvilibrovaný kyslým pufrom. Neviazaný materiál sa odstráni dostatočným premytím štartovacím pufrom. Produkt sa eluuje pomocou gradientu soli. Získané frakcie sa skúšajú na svoj obsah produktu pomocou reverznej vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie (RPHPLC) a biologickým testom aktivity, ktorý stanovuje inhibíciu proteáz. Produkt obsahujúci frakcie sa spojí a priamo sa nanesie na preparatívny RP-HPLC stĺpec, ktorý bol vopred ekvilibrovaný kyslým pufrom. Neviazaný proteín sa zo stĺpca odstráni premytím štartovacím pufrom a produkt sa eluuje pomocou gradientu organických rozpúšťadiel. Frakcie sa potom znova skúšajú na obsah produktu ako je uvedené vyššie a tie frakcie, ktoré obsahujú produkt, sa spoja. V závislosti od dosiahnutej čistoty produktu môže byť nutné spojené frakcie

30720/H čistiť cez druhý RP-HPLC stĺpec. Podmienky sú v podstate rovnaké ako je popísané vyššie. Získaný roztok produktu sa zriedi vodou pre injekcie, naplní sa do vhodných nádob a lyofilizuje sa.

Iné metódy na čistenie derivátov aprotinínu bez netto-náboja pri neutrálnej hodnote pH, ktoré sa môžu kombinovať s vyššie popísanými procesmi, sú afinitná chromatografia na sefaróze s imobilizovaným trypsínom a gelová permeačná chromatografia.

2. Čistenie desPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53aprotinínu

Materiál z desaťlitrového fermentora sa čistí nasledujúcim postupom. Po skončení fermentácie sa hodnota pH obsahu fermentora upraví pomocou koncentrovanej kyseliny citrónovej na 3 a zahrieva sa na teplotu 70 °C po dobu 5 minút. Potom sa bunky odstránia odstredením (15 minút, 7500 x g, odstredivka Heraeus) a získaná kvapalina sa prefiltruje (8 pm až 0,2 pm, Millipore, BRD). Z tohto stupňa sa môže filtrát spracovať zmrazením pri teplote -18 °C pre ďalšie použitie. Roztok sa potom prídavkom vyčistenej vody zriedi tak, aby vodivosť bola nižšia ako 8 mS/cm a nanesie sa na stĺpec SPSepharosy FF (Pharmacia, Švédsko), ktorý bol vopred ekvilibrovaný 50 nM citrát-NaOH pufra, pH 3. Nenaviazaný proteín sa odstráni intenzívnym premývaním rovnakým pufrom. Potom sa produkt eluuje pomocou gradientu soli (1 M NaCl). Získané frakcie sa skúšajú pomocou reverznej vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie (RP-HPLC, C4) a testovaním proteázovej inhibičnej aktivity na obsah produktu. Spoja sa frakcie, ktoré obsahujú požadovaný produkt.

Potom sa roztok produktu priamo nanesie na RP-HPLC stĺpec (Source 15 RPC, Pharmacia, Švédsko), ktorý bol vopred ekvilibrovaný 0,1 % kyselinou trifluóroctovou vo vode. Nenaviazaný proteín sa odstráni intenzívnym premytím rovnakým pufrom. Produkt sa eluuje pomocou lineárneho acetonitrilového

30720/H gradientu (O až 70 %). Získané frakcie sa skúšajú na obsah produktu znova vyššie popísanými metódami a tie frakcie, ktoré obsahujú produkt, sa spoja.

Kvôli záverečnému čisteniu sa produkt obsahujúci roztok zriedi vodou pre injekčné účely a nanesie sa na druhý RP-HPLC stĺpec (Vydac C8, Vydac, USA), ktorý bol vopred ekvilibrovaný 0,1 % kyselinou trifluóroctovou vo vode. Nenaviazaný proteín sa odstráni intenzívnym premytím rovnakým pufrom. Produkt sa eluuje pomocou lineárneho acetonitrilového gradientu (0 až 70 %). Získané frakcie sa skúšajú na obsah produktu znova vyššie popísanými metódami a tie frakcie, ktoré obsahujú produkt, sa spoja.

Získaný roztok produktu sa zriedi vodou pre injekcie, naplní sa do vhodných nádob (20, 10, 1 a 0,2 mg), lyofilizuje sa a analyzuje.

Príklad 5

Stanovenie hodnoty Ki ľudského plazmového kallikreínu pomocou desProSer10-Arg15-Alá17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53- aprotinínu

Príklad jednotka ľudského plazmového kalikreínu sa zriedi pufrom (0,05 M Tris-/0,1 M NaCI, 0,05 % Tween-20, pH 8,2) na 16 ml. 200 μΙ tohto roztoku enzýmu sa zmieša so znižujúcimi sa objemami testovacieho pufra (250, 240, 230, 220, 200, 180, 170, 150, 100, 50 μΙ) a potom sa pridá vzrastajúce množstvo inhibítora v assay pufre (10, 20, 30, 50, 70, 80, 100, 150, 200 a 250 μΐ, koncentrácia 0,7 pg/pl).

Roztok enzým/inhibítor sa predbežne inkubuje pri teplote miestnosti po dobu 4 hodiny. Potom sa 180 μΙ z každého roztoku vnesie do jamky mikrotitračnej doštičky a zmieša sa s 20 μΙ roztok substrátu. Zmena absorpcie sa meria pri 405 nm po dobu 10 minút. Stanovuje sa rýchlosť enzýmovej reakcie a z tej sa počíta hodnota Ki podľa metódy Bietha (Biochemical Medicíne 32, 387 - 397 (1984)).

30720/H

Substrát Stock roztok:

Roztok substrátu: assay-pufor:

0,1 M v DMSO x 10³ M S-2302 v assay-pufre 0,05 M tris-(hydroxy-metyl)-aminometán, 0,1 M NaCI, 0,05 % Tween-20, pH 8,2, 1 ml benzylalkohol/l.

Kinetické konštanty komplexovania s enzýmovým plazmidovým faktorom Xla, hovädzím trypsínom a chymotrypsínom sa stanovujú rovnakými postupmi. Substráty sú Chromozym PL pre plazmín, HD-Pro-Phe-Arg-pNA pre faktor XI, S-2444 pre trypsín a Suc-Phe-Leu-Phe-pNA pre chymotrypsín.

Príklad 6

Výsledky proteínchemickej charakterizácie DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinínu

Inhibítor proteázy DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24- Thr26-G|u3'1Asn41-Glu53-aprotinínu sa vyrobí pomocou génovými technikami zmeneného kvasinkového organizmu sekréciou. Kvapaliny nad kvasinkami sa čistia rôznymi chromatografickými postupmi až do homogenity. Identitu inhibítora s klonovanou sekvenciou ukazujú nasledujúce proteínové analytické skúšky.

N-terminálna sekvenčná analýza

Inhibítor proteázy sa úplne sekvenuje cez 57 stupňov. V nasledujúcom je uvedená proteínová sekvencia, ktorá je identická s klonovanou sekvenciou

Arg-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Ser-Thr-Gly-Pro-Cys-Arg15

-Ala-Ala-lle-lle-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asp-Ala-Thr-Ala-Gly-Leu29

-Cys-Glu-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Asn-Arg-Asn43

30720/H

-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-GIU-Asp-Cys-Met-Glu-Thr-Cys-Gly-Gly-57

-Ala

Sekvenčná analýza desPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26- Glu31-Asn41Glu53-aprotinínu cez 57 stupňov

Analýza aminokyselín

Analýza aminokyselín predstavuje dôležitý kvantitatívny parameter pre charakterizáciu proteínu. Okrem obsahu proteínu sa pri známej primárnej štruktúre zisťuje počet jednotlivých aminokyselín. Analýza aminokyselín desPro2-Ser10-Arg15-Ala17- Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinínu je v dobrom súlade s teoretickými hodnotami z primárnej štruktúry ako je zrejmé z tabuľky 1.

30720/H

Tabuľka 1

Analýza aminokyselín desPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 Glu53-aprotinínu. Celé počty sa vzťahujú na Ala = 7

Aminokyselina	Celý počet	Teor. počet
CysSO₃H	5.28	6
Asp .	6.27	6
Thr	3.49	4
Ser	1.58	2
Glu	4.25	4
Gly	6.16	6
Ala	7.00	7
Vaľ	0.98	1
Met	1.10	1
lle	1.66	2
Leu	1.89	2
Tyr	2.49	3
Phe	4.11	4
Lys	1.05	1
Arg	4.73	5
Pro	3.23	3

*) cysteín a metionín sa stanovujú po oxidácii kyselinou permravčou (Met ako metionínsulfón).

30720/H

Reverzná fázová chromatografia

Pri HPLC-chromatografii proteínov na chemicky viazanej reverznej fáze dochádza cez hydrofóbne vzájomné pôsobenie proteínov k väzbe na použitú fázu. Proteíny sa podľa sily svojej väzby na stacionárnej fáze vytesňujú organickými rozpúšťadlami (mobilná fáza). Z tohto hľadiska je táto metóda dobré kritérium pre určenie čistoty proteínu. DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinín je eluovaný ako jediný peak z RP18-fázy. Ukázalo sa, že izolovaný inhibítor proteázy je veľmi čistý.

CE-chromatografia

Kapilárna elektroforéza dovoľuje delenie peptidov a proteínov na základe ich náboja v elektrickom poli. Úspešnosť delenia pritom závisí od pufra, hodnoty pH, teploty a použitých aditív. Ako kapiláry sa používajú tzv. fused silica stĺpce s vnútorným priemerom 50 až 100 pm. DesPro2-Ser10Arg15-Ala17- Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinín sa delí na fused silica stĺpci v elektrickom poli. Elektróforeogram vykazuje štíhly peak.

Stanovenie molekulovej hmotnosti

Molekulová hmotnosť desPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26- Glu31Asn41-Glu53-aprotinínu bola zistená pomocou MALDI-techniky 6223 Daltonov. Zistená molekulová hmotnosť je pritom v dobrom súlade s teoretickou hodnotou 6215 Daltonov v rámci presnosti metódy merania. Kyselina sinapínová sa použije ako matrica.

SDS-gelová elektroforéza

DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53aprotinín sa analyzuje pomocou SDS-elektroforézy za redukujúcich a neredukujúcich podmienok. Vykazuje pásy v oblasti ca, 6,5 kD.

30720/H

Príklad 7

Stanovenie Ki-hodnoty pre komplexovanie enzýmov s desPro2 -Ser10-Arg15Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53- aprotinínom

Inhibičné konštanty desPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26 -Glu31Asn41-Glu53-aprotinínu sa stanovujú pre rôzne enzýmy. V tabuľke 2 sú uvedené Ki-hodnoty.

Tabuľka 2

Inhibičné konštanty komplexovania desPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26Glu31-Asn41-Glu53-aprotinínu s enzýmami plazmínom, plazmovým kalikreínom, faktorom Xla, hovädzím chymotrypsínom a hovädzím trypsínom

Enzým	Hodnota Ki [M]
plazmový kalikréín	2x10-11
plazmín	5x10-1°
faktor Xla	5x10-1°
trypsín	2x10-11
chymotrypsín	9 x 10-θ

Príklad 8

Vzájomné pôsobenie inhibítorov proteázy s polyklonálnymi králičími, prípadne ľudskými anti-aprotinínovými protilátkami

Rekombinantne vyrobené inhibítory proteázy sa skúšajú na svoju krížovú aktivitu s polyklonálnymi králičími, prípadne ľudskými antiaprotinínovými protilátkami. Zistilo sa, že rôzne varianty inhibítorov proteázy vykazujú iba veľmi slabo vzájomné pôsobenie s aprotinínovými antisérami.

30720/H

Sekvenčný protokol (1) Všeobecné údaje:

(i) Prihlasovateľ:

(A) Meno: Bayer AG (B) Ulica: Bayerwerk (C) Miesto: Leverkusen (E) Štát: Nemecko (F) Poštové smerovacie číslo: 51368 (G) Telefón: 0214-3061455 (H) Telefax: 0214-303482 (ii) Názov vynálezu: Varianty aprotinínu so zlepšenými vlastnosťami (iii) Počet sekvencii: 5 (iv) Počítačovo čitateľná forma:

(A) Nosič dát: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC compatible * I , (C) Prevádzkový systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verzia #1.30B (EPA) (2) Údaje pre SEQ ID č.: 1 (i) Charakteristické znaky sekvencie:

(A) Dĺžka: 69 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma skrutkovnice: jednoduchá skrutkovnica (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: genóm-DNA (iii) Hypoteticky: nie (iv) Antisense: nie (vi) Pôvod:

(A) Organizmus: Primér A (xi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 1

GGCTGCAGAG CTAACCGTAA CAACTTCAAA TCCGCGGAAG ACTGCATGGA 50 AACTTGCGGT GGTGCTTAG 69

30720/H (2) Údaje pre SEQ ID č.: 2 (i) Charakteristické znaky sekvencie:

(A) Dĺžka: 93 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma skrutkovnice: jednoduchá skrutkovnica (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: genóm-DNA (iii) Hypoteticky: nie (iv) Antisense: nie (vi) Pôvod:

(A) Organizmus: Primér B (xi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 2

TGCCTCGAGC CGCCGTCTAC TGGGCCCTGC AGAGCTATCA TCCGTTACTT 50 CTACGATGCA ACTGCAGGCC TGTGTGAAAC CTTOGTATAC GGC 93 (2) Údaje pre SEQ ID č.: 3 , (i) Charakteristické znaky sekvencie:

(A) Dĺžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma skrutkovnice: jednoduchá skrutkovnica (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: genóm-DNA (iii) Hypoteticky: nie (iv) Antisense: nie (vi) Pôvod:

(A) Organizmus: Primér C (xi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 3

GGGATATCTA TTGATAACAT TTAAAGGTAT TTGACAAG 38 (2) Údaje pre SEQ ID č.: 4 (i) Charakteristické znaky sekvencie:

(A) Dĺžka: 99 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma skrutkovnice: jednoduchá skrutkovnica

30720/H (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: genóm-DNA (iii) Hypoteticky: nie (iv) Antisense: nie (vi) Pôvod:

(A) Organizmus: Primér D (xi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 4

GGGCTCGAGG CAGAAACTCG GTCTAGCCAA AGCAGAAGAA GCAGCGAACA 50 AGACAGCAGT CAAAATAGAT GGAATCTCAT TCTTTTAACT CTTTATATT 99 (2) Údaje pre SEQ ID č.: 5 (i) Charakteristické znaky sekvencie:

(A) Dĺžka: 57 aminokyselín (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma skrutkovnice: jednoduchá skrutkovnica (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: lineárny (vi) Pôvod:

(A) Organizmus: variant aprotinínu

30720/H

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Varianty aprotinínu s netto-nábojom +3 až -3 pri pH 7 a s aminokyselinami Arg15 alebo Arg15-Ala17 vo väzobnom regióne.
2. Varianty aprotinínu podľa nároku 1 na inhibícíu serínových proteáz.

.
3. Varianty aprotinínu podľa nároku 1 alebo 2 so zmenenou Nterminálnou sekvenciou.
4. Varianty aprotinínu podľa nároku 1 alebo 2 s N-terminálnym predĺžením alebo skrátením alebo s deletovanými aminokyselinami v Ntermináli.
5. Varianty aprotinínu zo skupiny zahrňujúcej desPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinín, desPro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-aprotinín, desPro2-Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-aprotinín, desPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-aprotinín, desPro2-Ser10-Arg 15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41 -Glu53-aprotinín,

Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-aprotinín,

Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-aprotinín,

Ser10-Arg 15-Ser17-Asn24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-aprotinín,

Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-aprotinín, Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-aprotinín.
6. Liek obsahujúci jeden alebo niekoľko variantov aprotinínu podľa nárokov 1 až 5.
7. Použitie variantov aprotinínu podľa nárokov 1 až 5 na výrobu liekov na použitie v chirurgii kvôli zníženiu strát krvi, pri polytraume, šoku a zápaloch.