JPH10510996A

JPH10510996A - ヒト好中球エラスターゼ阻害特別設計ヒト由来クニッツドメイン

Info

Publication number: JPH10510996A
Application number: JP8520491A
Authority: JP
Inventors: レイ，アーサー，チャールズ; ラドナー，ロバート，チャールズ; グターマン，ソニア，コソウ; ロバーツ，ブルース，リンゼイ; マークランド，ウィリアム; ケント，レイチェル，バリボー
Original assignee: Dyax Corp
Current assignee: Dyax Corp
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 1995-12-15
Publication date: 1998-10-27
Anticipated expiration: 2015-12-15
Also published as: ATE311452T1; ES2255066T3; DE69534656T2; CA2207820A1; EP0797666A2; JP3977419B2; DK0797666T3; EP1734121A3; EP1734121A2; WO1996020278A3; DE69534656D1; EP0797666B1; US5663143A; WO1996020278A2

Abstract

(57)【要約】本発明はヒト好中球エラスターゼに対する一連の小型で強力なタンパク質インヒビターに関する。インヒビターのグループの１つは、ITI-D1およびITI-D2と呼ばれるドメインを含有するヒトインター−α−トリプシンインヒビター（ＩＴＩ）の軽鎖に見出されたクニッツ型阻害ドメインから導かれる。本発明は、ｈＮＥに対して極めて高い親和性を有するITI-D2の変異体を開示する。本発明はITI-D2配列の改変を包含するが、この改変は酵母ピチア・パストリスにおけるその生産を容易にするものであり、またｈＮＥに対するきわめて強力なインヒビターをあたえるものである。本発明はまた、配列セグメントを一つのクニッツドメインから他のドメインへ転位する方法、およびインヒビターの製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト好中球エラスターゼ阻害特別設計ヒト由来クニッツドメイン関連出願クロスリファレンス本出願は、１９９４年１２月１６日に提出した出願番号第08/358,160号の部分継続出願である。出願番号第08/358,160号は１９９２年２月２８日出願の出願番号第08/133,031号の部分継続出願である。出願番号第08/133,031号は現在放棄されたラドナー、グッターマン、ロバーツ、マークランド、レイ（Ley）およびケント（Kent）の１９９１年３月１日出願の部分継続出願出願番号第07/664,989号に関連する。これは現在放棄されたラドナー（Ladner）およびグッターマン（Gute rman）の１９８８年９月２日出願の出願番号第07/240,160号の部分継続出願に関連する。出願番号第07/240,160号は、現在放棄されたラドナー、グッターマン、ロバーツ（Roberts）およびマークランド（Markland）の１９９０年３月２日出願の出願番号第07/487,063号の部分継続出願である。出願番号第07/487,063号は、現在放棄された１９８８年９月２日出願の出願番号第07/240,160号の係属出願である。先行出願はすべて、本明細書に参考資料として包含される。以下の関連する共有出願も、参考資料として包含される。ロバート・チャールス・ラドナー（Robert Charles Ladner）、ソニア・コソフ・グッターマン(Sonia Kosov Guterman)、ラッヘル・バリブー・ケント（Rachel Baribault Kent）およびアーサー・チャールス・レイ（Arthur Charles Ley）は、１９８９年１月８日出願U.S.S.N第07/293,980号、表題「新規ＤＮＡ結合タンパク質およびポリペプチドの発生と選択（GENERATION AND SELECTION OF NOVE L DNA-BINDING PROTEINS AND POLYPEPTIDES）」の共同発明者である。この出願はプロテイン・エンジニアリング・コーポレーション（Protein Engineering Co rporation）に譲渡されている。ロバート・チャールス・ラドナー、ソニア・コソフ・グッターマンおよびブルース・リンゼイ・ロバーツ（Bruce Lindsay Roberts）は、１９９０年１月２６日出願のU.S.S.N第07/470,651号(現在、放棄されている)、表題「新規配列特異性ＤＮＡ修飾酵素の産生（PRODUCTION OF NOVEL SEQUENCE-SPECIFIC DNA-ALTERI NG ENZYMES）」の共同発明者である。これも同様にプロテイン・エンジニアリング・コーポレーションに譲渡されている。ラドナー、グッターマン、ケント、レイおよびマークランドによる、出願番号第07/558,110号も、プロテイン・エンジニアリング・コーポレーションに譲渡されている。ラドナーは１９９１年５月１７日に第07/715,834号を出願したが、この出願をここに引用して組み込む。発明の背景発明の分野本発明はヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）を阻害する新規タンパク質に関する。これらのタンパク質それぞれの配列の大部分は、ｈＮＥに関してきわめて僅かか全く活性を持たない既知のヒトタンパク質と同一である。情報開示１．ｈＮＥ、その天然インヒビターおよび病理学ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ、ヒト白血球エラスターゼ（ｈＬＥ）とも呼ばれる；EC 3.4.21.11）は細胞外マトリックス成分（CAMP82、CAMP88、MCWH89）に対し広い活性スペクトルを有する29Kdプロテアーゼである。この酵素は多形核白血球のアズール顆粒の主要中性プロテアーゼの一つであり、病原体の除去と結合組識再生に関与する（TRAV88）。ｈＮＥの主要な全身性生理的インヒビター（HE ID86）である循環α−１−プロテアーゼインヒビター（API、以前はα１アンチトリプシンと呼ばれていた）の遺伝的減少、または酸化によるAPI の不活性化（喫煙者気腫）の症例では、肺組識の広い範囲の破壊はｈＮＥのエラスターゼ活性が制御されない結果であると考えられる（CANT89）。嚢胞性繊維症および気腫を含むヒトの呼吸器疾患いくつかは、肺の上皮表面上に好中球負荷が増加することが特徴であり（SNID91、MCEL91、GOLD86）、好中球によるｈＮＥ放出が病気の進行に関与している（MCEL91、WEIS89）。嚢胞性繊維症患者へのAPI のエアゾル投与の予備的実験では、このような処置が呼吸器組識損傷とホストの抗菌防禦の増大に有効であることを示唆している（MCEL91）。 API は、肺の抗エラスターゼ剤として日常的に大量に使用するには、実用上いくつかの問題点がある。それらの問題は分子サイズが相対的に大きいこと(394残基、51ｋダルトン)、分子内に安定化のためのジスルフィド架橋結合がないこと、および３つの部位でグリコシル化によりタンパク質が特異的な翻訳後修飾を受けることである。多分もっと重要なのは、活性化好中球から放出されるものと同様に、API が酸化に鋭敏であることである。従って小さく、安定で非毒性であり、きわめて有効なｈＮＥのインヒビターは治療的価値が大きいであろう。２．出発タンパク質結合ドメイン（IPBD）としてのITIドメイン１およびITIドメイン２多くの哺乳動物種はその血漿中に、配列の相同性と物理的・化学的性質の類似性からインターα−トリプシンインヒビター（ITI）と同定されるタンパク質、すなわち巨大な（Mγ、約240,000）体循環プロテアーゼインヒビターを持っている（最近の総説ではODOM90、SALI90、GEBH90、GEBH86を参照）。ヒトITI の配列を表400 に示す。無傷のインヒビターはグリコプロテインであり、現在、強いグリコサミノグリカン結合を介して相互作用する３個のグリコシル化サブユニットで構成されると信じられている（ODOM90、SALI90、ENGH89、SELL87）。ITI の抗トリプシン活性は一番小さいサブユニットにあり（ITI 軽鎖、非グリコシル化Ｍγ 約15,000）、それは尿（UTI）および血清（STI）に見出された酸安定性インヒビターとアミノ酸配列が同一である（GEBH86、GEBH90）。ITI軽鎖のアミノ酸配列を表400 に示す。成熟した軽鎖はSer10 においてグリコシル化された21残基のＮ −末端配列と、それに続く２つの縦に並んだクニッツ型ドメインとからなる。クニッツドメインの最初のものはAsn45 においてグリコシル化されている（ODOM90 ）。ヒトタンパク質では、２番目のクニッツ型ドメインがトリプシン、キモトリプシンおよびプラスミンを阻害することが示されている（ALBR83a、ALBR83b、SE LL87、SWAI88）。一番目のドメインにはこれらの活性が欠けているが、白血球エラスターゼを阻害すると報告されている（≒１μM＞Ｋi＞≒１nM）（ALBR83a、b 、ODOM90）。ITI 軽鎖をコードしているcＤＮＡはまた、α−１−ミクログロブリンもコードし（TRAB86、KAUM86、DIAR90）、そのタンパク質は翻訳後プロテアーゼ消化により切り離される。 ITI 軽鎖の２個のクニッツドメイン（ITI-D1およびITI-D2）には、それを出発有望結合ドメイン（Initial Potential Binding Domain: IPBD）として有用なものとするいくつかの特徴がある。ITI-D1はGEBH86の図１に示される、UTI 配列の少なくとも26〜76残基を包含する。クニッツドメインは、残基22から始まり終わりは残基79までの残基を包含すると考えることができる。残基22から残基79は、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（BPTI）と同じ長さを有し、システイン結合を有する58個のアミノ酸ドメインを構成する。ITI-D2は少なくとも残基82から132 を包含し、残基78から始まり残基135 で終わるものも、古典的な58アミノ酸長により近いドメインを与えるので含めてもよい。ITI-D1の最後のシステイン（ITI 軽鎖の残基76）とITI-D2の最初のシステイン（ITI 軽鎖の残基82）の間の間隔は僅か５残基であるので、いくらかの重複なしにはそれぞれのドメインに58個のアミノ酸を割り当てることはできない。本明細書では特に述べない限り、二番目のドメインはITI 軽鎖の残基78から始まるものとする。それぞれのドメインはBPTI および米国特許第5,223,409号に記載されたEPiNEシリーズタンパク質と極めて相同である。単離されたドメインITI-D1とITI-D2のＸ−線構造はないものの、アルツハイマーアミロイドβ-タンパク質（AAβP）前駆体から単離された関連するクニッツ型ドメインの結晶学的研究は、このペプチドがBPTI（HYNE90）の構造とほとんど同一の３次元構造をとっていることを示している。毒蛇のグリーンマンバ毒液由来のα−デンドロトキシンの三次元構造が決定されたが（SKAR92）、その構造はBPTIに極めてよく似ている。著者によれば「α− DTX の主鎖の折り畳みは相同なウシ膵臓トリプシンインヒビター（BPTI）に類似しているが、BPTIの‘アンチプロテアーゼ部位’に近いポリペプチド鎖のセグメントに関して有意の差がある。α−DTX の構造をBPTIの現存するモデル、およびそのトリプシンおよびカリクレインとの複合体と比較すると、α−DTX がトリプシンおよびキモトリプシンを阻害できない理由を説明する構造的差異が明らかになる」ということである。ブラックマンバＫの毒液の構造がＮＭＲスペクトルで決定された。これは残基５と残基55（最初および最後のシステイン）の間にアミノ酸配列で32個の違いがあるにもかかわらず、BPTIの構造ときわめて類似した３次元構造を有する（BPRI ：BERN93）。「トキシンＫの溶液構造は、残基２〜56の骨格原子に対しそれぞれ 1.31Åおよび0.92Åのr.m.s.d値を有している塩基性膵臓トリプシンインヒビター（BPTI）の溶液構造、およびデンドロアスピス・アングスティセプス（Dendor oaspis angusticeps）由来のα−デンドロトキシンのＸ線結晶構造ときわめて類似している。トキシンＫとBPTIの間の若干の部分構造の違いは、BPTIにおける水和水の4個の内部分子中の2個との分子間相互作用が、トキシンＫでは分子内水素結合に置き換えられているという事実と直接関連している」。従って単離したIT I-D1ドメインまたは単離したITI-D2ドメインのどちらも溶液３次元構造は、BPTI 、AAβP、およびブラックマンバＫ毒液の構造にきわめて類似していることは有り得る。その場合、先に記載されたBPTIをIPBDとして使用する利点は、ITI-D1およびITI-D2にも当てはまる。ITI-D1およびITI-D2は、特異的抗エラスターゼ活性の開発のためのIPBDとして、さらに有益である。第一に、ITI-D1ドメインは白血球エラスターゼ（ALBR83a、b、ODOM90）およびカテプシンＧ（SWAI88、ODOM90）双方を阻害すると報告されているが、これはBPTIにない活性である。第二にITI-D1 は関連するセリンプロテアーゼであるトリプシン、キモトリプシンおよびプラスミンに対する親和性がなく（ALBR83a、b、SWAI88）、これは阻害の特異性を開発する上で一つの利点である。ITI-D2はグリコシル化されていない利点を有する。さらにITI-D1およびITI-D2はヒト由来ポリペプチドであるので、その誘導体は臨床応用で最小の抗原性を示すと予想される。３．ピチア・パストリス（Pichia pastoris）からの異種タンパク質の分泌酵母ピチア・パストリスで多数のタンパク質が製造されている。例えば、ベドビック（Vedvick：VEDV91）らおよびワーグナー（Wagner：WAGN92）らはメタノールで誘導してアルコールオキシダーゼプロモーターから、培養培地（CM）中に分泌タンパク質としてアプロチニンを約1mg／mLで製造した。グレッグ（Gregg： GREG93）らはＰ．パストリスにおける多数のタンパク質の製造をレビューしている。GREG93の表１はＰ．パストリスで生産されたタンパク質とその収量を示している。４．クニッツドメインの遺伝子組換えによる製造アプロチニンは組換えＤＮＡ技術で製造された（AUER87、AUER88、AUER89、AUER 90、BRIN90、BRIN91、ALTM91）５．構築法特に述べない限り、遺伝子構築および他の操作は標準的な参考文献にある標準法で行われている（例えばAUSU87およびSAMB89）。参照文献はいづれも、先行技術または特許化された先行技術であるとは認められておらず、記載した日付けは文献に現れた日付であり、実際の発行日と同じではない。参照文献の教示に関する事項は我々が実際にそれを読んだことに基づいており、誤謬に気が付いた場合は記載内容を訂正し、記載事項が正確に報告された実際の仕事を反映しているかどうか実地に試す権利を保有するものである。われわれは参照した研究を、特に新規または矛盾する事実の観点から解釈を試みる権利を保有する。発明の要旨本発明はヒト好中球エラスターゼに対する一連の小型で強力なタンパク質インヒビターを記述する。インヒビターのグループの１つは、ヒト起源のタンパク質の１つに見出されたクニッツ型阻害ドメイン、すなわちITI-D1およびITI-D2と呼ばれるドメインを含有するヒトインター−α−トリプシンインヒビター（ITI ）の軽鎖から導かれる。本発明は、ｈＮＥに対して極めて高い親和性を有するITI-D2 の変異体を開示する。本発明はITI-D2配列の変異を包含するが、この変異は酵母ピチア・パストリスにおけるその生産を容易にするものであり、またｈＮＥに対するきわめて強力なインヒビターをあたえるものである。本発明はまた、配列セグメントを一つのクニッツドメインから他のドメインへ転位する方法、およびその製造方法に関する。本発明は実在のインヒビターの設計、製造および試験を記述する一連の実施例、およびどのようにして他のインヒビターを発見できるかという別な実施例として提示される。本発明は、ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）を高い親和性で阻害するタンパク質に関する。命名および略語用語意味ｘ::ｙフレーム中での遺伝子ｘの遺伝子ｙへの融合Ｘ::Ｙｘ::ｙ融合遺伝子から発現した融合タンパク質 μＭマイクロモル、１０^-6モルｎＭナノモル、１０^-9モルｐＭピコモル、１０^-12モル一文字アミノ酸コードＡ：Ala Ｃ：Cys Ｄ：Asp Ｅ：Glu Ｆ：Phe Ｇ：Gly Ｈ：His Ｉ：Ile Ｋ：Lys Ｌ：Leu Ｍ：Met Ｎ：Asn Ｐ：Pro Ｑ：Gln Ｒ：Arg Ｓ：Ser Ｔ：Thr Ｖ：Val Ｗ：Trp Ｙ：Tyr 本発明の好ましい実施形態の詳細な説明あるタンパク質配列をミスマッチを最小にする様に並べて4個またはそれ以下のミスマッチで以下のパターンに一致する場合、その配列を「アプロチニン様クニッツドメイン」と呼ぶことができる： Cys-(Xaa)6-Gly-Xaa-Cys-(Xaa)8-［Tyr｜Phe］-(Xaa)6-Cys-(Xaa)2-Phe-Xaa-［T yr｜Trp｜Phe］-Xaa-Gly-Cys-(Xaa)4-［Asn｜Gly］-Xaa-［Phe｜Tyr］-(Xaa)5-C ys-(Xaa)3-Cys、（ここで記号｜で分けられた括弧付きのアミノ酸は、その位置における代替アミノ酸である。例えば、［Tyr｜Phe］はその位置でアミノ酸はTyrまたはPheであることを示す。記号Xaa はその位置で任意のアミノ酸が使われることを示す。）上記試験で、一個の挿入または欠損は一個のミスマッチと数える。アプロチニンにおいて、システインは５、14、30、38、51、および55の番号が付けられ、ジスルフィド結合で５と55、14と38、および30と51が結合している。残基15はP1残基と呼ばれ（SCHE67）、アミノ末端に向って残基はP2（残基14）、 P3（残基13）．．．と呼ばれる。残基16はP1'、17はP2'、18はP3'等と呼ばれる。アプロチニンの相同体は多数あり、それらはアプロチニンと一個以上の場所で異なるが、上で定義した基本的な構造を保持している。相同体のリストが与えられると、不確定なそれぞれの位置でのアミノ酸の出現頻度を表にすることができる。（それぞれの不確定な場所で最も高い頻度のを有するアミノ酸の配列は、「コンセンサス・クニッツドメイン」として表100にリストされている）。「ヒト・アプロチニン様クニッツドメイン」は、ヒトタンパク質で天然に見出されるアプロチニン様クニッツドメインである。ヒトアプロチニン様クニッツドメインにはITI-D1、ITI-D2、App-I、TFPI2-D1、TFPI2-D2、TFPI2-D3、LACI-D1、 LACI-D2、LACI-D3、A3コラーゲン、およびHKI B9ドメインが含まれるが、それに限定されるものではない。このリストで、D1、D2等は指定された多重ドメインタンパク質の第一、第二等々のドメインを表す。ｈＮＥへの「弱い」、「中程度」、「強い」、「極めて強い」結合および阻害は、表55に従って定義される。好ましくは本発明のタンパク質は1000pM未満（すなわち「強い」インヒビターである）、より好ましくは50pM未満、最も好ましくは10pM（すなわち「極めて強い」インヒビターである）未満のＫi を有する。本発明の目的では、アプロチニン様クニッツドメインはコンセンサスシーケンスと触媒部位の位置に基づき、10個のセグメントに分けられる。アプロチニンのアミノ酸番号付け法を用い、これらのセグメントは以下の通りである（表100 参照）。１：1-4 （最初のCysより手前の残基）２：5-9 （最初のCysおよびそれに続くP6の手前までの残基）３：10-13（P6〜P3）４：14 （２番目のCys；P2）５：15-21（P1，およびP1'〜P6'）６：22-30（P6'以後および三番目のCysまで（cysを含む）７：31-36（３番目のCys以降からコンセンサスGly-Cysの前まで）８：37-38（コンセンサスGly-Cys）９：39-42（Gly-Cys以後の残基およびコンセンサス［Asn｜Gly］の前まで） 10：43-55（最終Cysまで）（もしあれば、最終Cys以後の残基も含む）アプロチニンとは一個またはそれ以上のアミノ酸挿入または欠損で異なるか、最初のシステインより前、または最後のシステイン以後のアミノ酸の数が異なるアプロチニン様クニッツドメインの場合は、実際のアミノ酸の位置は上記のものと異なることもある。本出願人の意図するところは、これらのドメインを整列させたアプロチニン配列に対応するように番号を付けること、例えばセグメントを同定する目的でドメインの最初のシステインをアミノ酸５という番号を付けることである。セグメント１はアプロチニンの一部であるが、アプロチニン様クニッツドメインの正式の定義の一部ではなく、従って本発明のタンパク質にセグメント１に対応する配列を含む必要がないことに注意してほしい。同様に、セグメント10の一部（最後のCys の後）はドメインに必要な部分ではない。「ヒト型インヒビター」とは、少なくともセグメント３、５、７および９のどれか１つにおいて、最も類似（アミノ酸の同一性に基づき）のヒトアプロチニン様クニッツドメインと少なくとも一個の非保存性変異により異なり、セグメント２、６および10（最後のCys まで考えて）は上記最も類似のヒトアプロチニン様クニッツドメインと同一か、または保存性変異でのみ異なるが天然の非ヒトアプロチニン様クニッツドメインとは同一でないものである（この決定を行うにあたって、セグメント１はドメインを定義する配列の外にあるため、無視されていおり、セグメント４および８は、アプロチニン様クニッツドメインの定義で必要であるので無視されていることに注意してほしい）。本発明のタンパク質は、好ましくはヒト型の、強いまたは極めて強いｈＮＥインヒビターである。これまでに同定されたヒトアプロチニン様クニッツドメインは単に弱いｈＮＥインヒビターであることに注意しなければならない。併記する特許請求の範囲の目的にとって、上記主要領域（アプロチニン残基５ −55）にわたってアミノ酸配列で参照ドメインの対応する配列、または参照ドメイン内の配列に対し少なくとも50％同一であり、それら多様性がすべて保存性および／または半保存性変異の形を取るならば、アプロチニン様クニッツドメインは参照ドメインと「実質的に相同」である。本発明のタンパク質には、表100 に定義された様な参照タンパク質EPI-HNE-3 、EPI-HNE-4、DPI.1.1、DPI.1.2、DPI.1.3、DPI.2.1、DPI.2.2、DPI.2.3、DPI.3 .1、DPI.3.2、DPI.3.3、DPI.4.1、DPI.4.2、DPI.4.3、DPI.5.1、DPI.5.2、DPI.5 .3、DPI.6.1、PI.6.2、DPI.6.3、DPI.6.4、DPI.6.5、DPI.6.6、DPI.6.7、DPI.7. 1、DPI.7.2、DPI.7.3、DPI.7.4、DPI.7.5、DPI.8.1、DPI.8.2、DPI.8.3、DPI.9. 1、DPI.9.2、またはDPI.9.3とほとんど相同であるクニッツドメインを包含するものが含まれる。EPI-HNE-3およびEPI-HNE-4の相同体が特に好ましい。好ましくは、本発明のタンパク質のｈＮＥ−結合ドメインは、アミノ酸配列で対応する参照配列と少なくとも80％同一、より好ましくは少なくとも90％同一である。最も好ましくはミスマッチの数はゼロ、１、２、３、４または５である。ｈＮＥ結合ドメインと参照ドメインとは、単に１個かそれ以上の保存性変異でしか違わないことが最も望ましい。「保存性変異」は次のように定義される。ａ）以下に定義されるアミノ酸の保存性置換、およびｂ）末端、ドメイン間境界で、ループまたは相対的に高い移動度のセグメント（例えばＸ−線回折、中性子回折、またはＮＭＲで高い温度因子または分解能が失われることにより示されるような）中でアミノ酸１個または複数の挿入または欠損。好ましくは末端を除いて、特定の位置で約５個以下のアミノ酸が挿入または欠損し、変異は活性に重要な結合部位を含むとされている領域外である。本明細書における「保存性置換」とは、以下の５群の各群内での交換と定義される。Ｉ．小さな脂肪族性の、無極性またはやや極性の残基［Ala、Ser、Thr（Pro、Gl y）］ II．酸性アミノ酸およびそのアミド［Asp、Glu、Asn、Gln］ III．極性で、正に荷電した残基［His、Lys，Arg］ IV．脂肪族非極性残基［Met、Leu、Ile、Val、（Cys）］およびＶ．大きな芳香族残基［Phe、Tyr、Trp］残基Pro 、Gly およびCys は、それらが特別なコンフォーメーション上の役割を持っているので、括弧に入れた。Cys はしばしばジスルフィド結合に関与し、そうでない場合はきわめて疎水性である。Gly は分子鎖に柔軟性を与える。多くのαヘリックスがGly を含んでいるにも係わらず「ヘリックスブレーカー」といわれることが多い。Pro は鎖に剛直性を与え、これもまた「ヘリックスブレーカー」といわれる。Pro は曲がり角に最も頻繁に見出されるが、それはまたヘリックスおよびシート中にも見出される。これらの残基はある場所では必須であり、別な場所では置き換えることができる。「半保存性変異」は、本明細書では隣り合ったアミノ酸の転位（もしくはそれらアミノ酸の保存性置換）、および半保存性置換と定義される。「半保存性置換」は、グループ（Ｉ）−（Ｖ）のなかの２つのグループの間で交換されることと定義されるが、ただしこれは（Ｉ）、（II）および(III)からなるスーパーグループ内か、（IV）および（Ｖ）からなるスーパーグループ内の交換に限定される。しかし、この定義の目的ではグリシンとアラニンは双方のスーパーグループのメンバーであると考えられる。「非保存性変異」とは、保存性でも半保存性でもない変異である。本発明の好ましいタンパク質はさらに、表711 に記載の好ましい、高度に好ましいまたは最も好ましい変異の一つ、またはそれ以上を特徴とする。好ましくは本発明のタンパク質は、参照ドメインと実質的に相同であるばかりでなく、ヒト型インヒビターであるとみなされるｈＮＥ阻害ドメインを有する。ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１５０１の特許請求の範囲第１項はEpiNEalpha、EpiNE1 、EpiNE2、EpiNE3、EpiNE4、EpiNE5、EpiNE6、EpiME7およびEpiNE8と呼ばれるタンパク質に関する。特許請求の範囲第３項はITI-E7、BITI-E7、BITI-E&-1222、A MINO1、AMINO2、MUTP1、BITI-E7-141、MUTT26A、MUTQE およびMUT1619と呼ばれるタンパク質に関する（EpiNEalphaを除いて、これらのドメインのすべての配列は表100 にある）。特許請求の範囲第４項〜第６項は上記インヒビターと相同であるが同一でないインヒビターに関する。これらの相同インヒビターは主要（リード）インヒビターと、クラスＡ置換の一つ以上（特許請求の範囲第４項）、クラスＡまたはＢ置換の一つ以上（特許請求の範囲第５項）、またはクラスＡ、ＢまたはＣ置換の一つ以上（特許請求の範囲第６項）で異なることもある。クラスＡ、ＢおよびＣ置換は、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１５０１の表65に定義された。便宜上、表65を本明細書に複写している。クラスＡ、ＢおよびＣの意味は以下の通りである。Ａ：分子の電荷が−１〜＋１の範囲にあるならば、主な効果は期待されない；Ｂ：主な効果は期待されないが、Ａよりは有り得る；Ｃ：結合インターフェース中の残基、変化があるか、調べなければならない。それぞれの残基位置はＡ、Ｂ、ＣまたはＸ等級が割り当てられた。Ｘは何らの置換も許されないことを意味する。非Ｘ位置で許される置換が記されている。本発明は、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１５０１の特許請求の範囲第１項および第３項の主要グループに正確に対応するドメインを除外している。好ましくは本発明のドメインはまた、表65に定義された様なクラスＡ置換でない、より好ましくはクラスＡまたはＢ置換でない、さらに好ましくはクラスＡ、ＢまたはＣ置換でない変異の１つ以上で、これらの主要ドメインと異なる。望ましくは本発明のドメインはそれぞれ、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１５０１に記された主要タンパク質のどれよりも、上記参照タンパク質の一つにより類似している。実施例には、それらをコードするＤＮＡ配列と共に、アミノ酸配列の多数の例が含まれる。本発明は示された特定のＤＮＡ配列に限定されないことを理解しなければならない。実施例１：BPTI、ITI-D1および他のクニッツドメインの発現と提示表30は、１）M13IIIシグナルペプチド、２）BPTI および３）成熟M13IIIタンパク質の最初の数個のアミノ酸、をコードする提示遺伝子を示す。発現したII Iのすべてのコピーが成熟タンパク質のアミノ末端で修飾されてることが期待できるように、この遺伝子が唯一のiii 様遺伝子であるようなファージを作成した。BPTIドメインにおける置換は、AccIII、XhoＩ、PflMI、ApaＩ、BssHII、StuＩ、XcaＩ、EspＩ、またはNarＩ（KasＩと同じ認識）部位で区切られたカセット中で行うことができる。表100 は数多くのクニッツドメインのアミノ酸配列を与えるが、そのあるものはｈＮＥを阻害する。表100 に示されるｈＮＥ阻害配列それぞれは、無傷のｈＮＥ結合タンパク質として発現されるか、または大きなタンパク質中にドメインとして取り込まれることができる。表100 に見られるｈＮＥ阻害配列のかなりの部分を包含するタンパク質は、ｈＮＥ阻害活性を示すと期待される。最初のシステインで始まり、最後のシステインまで続く配列が維持されている場合、特にそうである。 ITI ドメイン１は以下に述べるクニッツドメインである。ｈＮＥを提示するマトリックス上に提示ファージが保持される能力は、ファージ上に提示された特定のクニッツドメイン（または他のタンパク質）のｈＮＥに対する親和性と関係がある。ITIドメイン1::iii 融合遺伝子の発現および融合タンパク質のファージ表面上で提示は、ウエスターン分析およびファージ力価中和実験で証明された。IT I-D1提示ファージの感染性は99％まで、ITI には結合するが野生型ファージは影響されない抗体によってブロックされる。表35に、ａ）M13IIIのシグナル配列、ｂ）ITI-D1、およびｃ）M13の成熟したI IIの最初の部分を包含する融合遺伝子の配列を示す。提示されたITI-D1のドメインは、ｉ）一本鎖ファージＤＮＡのオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、およびii）遺伝子中に設計された制限部位（BglＩ、EagＩ、NcoＩ、StyＩ、PslＩおよびKasＩ(２箇所)）を用いるＲＦＤＮＡのカセット突然変異誘発を含む標準法で変化させることができる。実施例２：アガロースに固定化されたプロテアーゼビーズに結合したMA-ITI-D1 ファージの分画 ITI-D1::III融合タンパク質を提示するファージが、プロテアーゼであるヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）と強く相互作用するかどうか試験するため、提示ファージの一定量をアガロースに固定化されたｈＮＥビーズ（「ｈＮＥビーズ」）とインキュベートした。ビーズを洗浄し、結合したファージを米国特許第5,223, 409号に記載通りpH分画で溶離した。段階的グラディエントで使用したpHは7.0、 6.0、5,5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5および2.0であった。溶離と中和後、種々の注入試料、洗液、およびpH溶離分画を力価測定した。ITI-D1を提示しているファージを、EpiNE-7 を提示するファージと比較した。数回の分画の結果を表212に示す（ｈＮＥビーズに結合したEPiNE-7またMA-ITI -D1ファージ）。コントロール提示ファージ（EpiNE-7）を用いて得られたpH溶離プロフィルは、先のプロフィル（米国特許第5,223,409 号）と類似していた。ｈＮＥビーズに添加したEpiNE-7提示ファージの約0.3％が分画工程中に溶離し、溶離プロフィルはpH約4.0 での溶離が最大であった。 MA-ITI-D1 ファージはｈＮＥビーズに対し大きな親和性があるという証拠を示さない。ｈＮＥビーズに結合したMA-ITI-D1 ファージのpH溶離プロフィルでは、 pHを下げていくと回収されるファージは基本的には減る一方である。さらに、分画工程中に回収される、ビーズに添加したファージの全分画量は極めて低く、 0.002％であった。無傷の、大きなITI タンパク質（Ｍr＝24,000）による好中球エラスターゼ阻害に対するＫi の文献値は、60〜150nM の範囲であった（SWAI88、ODOM90）。ｈＮＥビーズに結合した提示ファージのpH分画を我々自身が測定した結果では、ｈＮＥに対し親和性の低い（＞１μＭ）タンパク質提示ファージはビーズに結合していないが、親和性の大きい（nM）タンパク質提示ファージはビーズに結合し、約pH５で溶離することを示している。ITI のｈＮＥに対する阻害活性が全面的に ITI 軽鎖の第一クニッツ型ドメインに依存し、かつこのドメインがMA-ITI-D1 ファージ上に正しく提示されてるならば、提示ファージをｈＮＥ上に結合させ分画させるのに足るｈＮＥに対するインヒビターの最小限の親和性は、50〜100nM の間である。実施例３：ITI-D1のP1領域の変異我々はITI-D1とEpiNE-7はBPTIと溶液中で同じ３次元構造を持つと仮定する。ITI -D1とEpiNE-7は13、17、20、32および39位で同一であるが、ｈＮＥに対する親和性でかなり異なる。ITI-D1のｈＮＥに対する親和性を改善するため、表35に示すようにEpiNE-7配列Val ₁₅-Ala ₁₆-Met₁₇-Phe ₁₈-Pro ₁₉-Arg₂₀（太字の下線アミノ酸は違いを示す）を、EagIとStyＩ／NcoＩ部位の間でITI-D1配列中に、カセット突然変異誘発により取り込ませた。P1位周辺でEpiNE-7変化を有するITI-D1::III融合遺伝子を含む単離ファージは、MA-ITI-D1E7と呼ばれる。実施例４：MA-ITI-D1E7ファージの分画 ITI-D1E7提示ファージがｈＮＥビーズと結合するかどうか試験するため、pH溶出プロフィルを測定した。一定量のEpiNE-7、MA-ITI-D1およびMA-ITI-D1E7提示ファージをｈＮＥビーズと、室温（RT）で３時間インキュベートした。ビーズを洗浄し、ファージを、３点だけののpH溶離を行った以外は米国特許第5,223,409 号に記載の通り溶離した。データは表215 にある。EpiNE-7 提示ファージのpH溶離プロフィルは記載通りである。MA-ITI-D1E7ファージはpH5付近で幅広い溶離ピークを示す。hMEビーズからのpH溶離で得られたMA-ITI-D1E7ファージの比率の総計は、EpiNE-7提示ファージを用いて得られた比率の総計より40倍少なかった。ｈＮＥビーズに結合したMA-ITI-D1E7ファージの溶離挙動は、BPTI［K15L］-II I-MA ファージを用いた場合に見られるものと定性的には類似してる。K15L変異を持ったBPTIはｈＮＥに対し約３nMの親和性を有している（変更と変異は、最初の（野生型）アミノ酸タイプ、次にその位置、次に新しいアミノ酸タイプを与えて示される。従ってK15LはLys15がLeuに変わったことを意味する）。それ以外はすべて同じままであるとして、MA-ITI-D1E7のpH溶離プロフィルは、遊離ITI-D1E 7ドメインのｈＮＥに対する親和性がnM範囲にあることを示唆している。このケース、すなわちP1領域の周辺にITI-D1配列の代わりにEpiNE-7を置換することは、ｈＮＥに対する親和性を20〜50倍増加させたことになる（変更しないITI-D1ではＫi＝60〜150nMであるとして）。 EpiNE-7とITI-D1E7が同じ溶液中の構造を持つならば、これらのタンパク質は相互作用表面上でｈＮＥに対し同一のアミノ酸配列を提示する。この類似性にもかかわらず、EpiNE-7はｈＮＥに対し、ITI-DIEよりもほぼ1000倍大きい親和性を示す。この観察は相互作用の強さを調節する上での非接触２次残基の重要性に脚光を当てるものである。天然のITI 軽鎖は二つの位置、Ser10およびAsn45でグリコシル化されている（ GEBH86）。グリコサミノグリカン鎖を取り除くと、インヒビターのｈＮＥに対する親和性を約５倍減少させることが示された（SELL87）。EpiNE-7とITI-D1E7の間の他の潜在的に重要な差異は実質電荷の差である。EpiNE-7を製造する際のBPT Iにおける変化は、分子上の全電荷を+6から+1へ減少させる。EpiNE-7とITI-D1E7 の間の配列の違いによりさらに、後者の上の電荷が-1に減少する。そのうえ、これらの二つの分子の間の実質電荷の変化は、分子の中心部における配列の違いによる。EpiNE-7における部位26はLysでり、ITI-D1E7ではThrであるが、部位31ではこれらの残基はそれぞれGlnおよびGluである。これらの配列上の変化は、分子上の実質電荷を変えるばかりでなく、負に荷電した残基をITI-D1E7の相互作用表面の近くに置く。部位31に負の電荷を生じることは（本明細書に記載した他のすべてのｈＮＥインヒビターには見出されない）、インヒビター‐プロテアーゼ相互作用を不安定化すると考えられる。実施例５：BITI-E7ファージの調製 MA-ITI-D1E7ファージｈＮＥに対する親和性がMA-EpiNe7よりも低い理由には多分、ａ）IIIsignal::ITI-D1E7::成熟III融合タンパク質の間違った開裂、ｂ）ITI- D1E7ドメイン上の不適切な負電荷、ｃ）Phe4をSer4へ置換すること等によって生じるクニッツドメインのコンフォーメーション上または動的変化、およびd）Q34 またはA11等の、ITI-D1E7:ｈＮＥインターフェースにおける不適当なアミノ酸、がある。最初の３つの可能性を調べるため、EpiNE7の最初の４個のアミノ酸でITI-D1E7 の最初の４個のアミノ酸を置換した。この置換は、IIIシグナル::EpiNE7::成熟I II融合と同じようにシグナルペプチダーゼ−Ｉにより開裂されるペプチドを提供するに違いない。さらにBPTIのPhe4はタンパク質の疎水性コアの一部であり、セリンで置換されているとITI-D1E7の安定性または動的特性が悪くなるのかもしれない。ITI-D1E7は2位に負電荷のGluを持っているのに対し、EpiNE7はProを有する。我々はオリゴヌクレオチド突然変異誘発により、ITI-D1E7タンパク質のアミノ末端に３ヵ所の変化（K1R、E2P、S4F）を導入し、BITI-E7 を製造した。BITI- E7を提示するファージはMA-BITI-E7と呼ばれる。我々はファージMA-ITI-D1とMA-BITIが提示するITI-III融合タンパク質の性質を、先に述べたウエスターン分析を用いて比較したが、いずれの提示ファージ種で製造した融合タンパク質も見かけの大きさ、または相対量に有意の差は見られなかった。従って、ファージ上に提示されるいづれの融合タンパク質も、プロセッシング（開裂）に大きな差はない。さらに、MA-ITI-D1E7およびMA-EpiNE7により提示される遺伝子III融合タンパク質のプロセッシングを受けた型にも大きな差はない。MA-ITI-D1E7とMA-EpiNE7提示ファージで示されるｈＮＥビーズへの結合の大きな差が、プロセッシングの変化によるタンパク質のコンフォーメーションの大きな変化によるとは考えられない。我々はMA-BITIとMA-BITI-E7 提示ファージのｈＮＥビーズへの結合性を、米国特許第5,233,409号に記載の詳細pH分画法で検討した。その結果を表216に示す。 MA-BITIとMA-BITI-E7のpH溶離プロフィルは、MA-ITI-D1とMA-ITI-D1E7 が示すプロフィルとはかなり違っている。いずれの場合も提示された融合タンパク質の想定されるアミノ末端が変ると、ｈＮＥビーズから溶離する負荷された提示ファージ画分の量が数倍増加する。提示ファージに対するｈＮＥビーズの結合容量は、ビーズ調製試料毎に、またそれぞれのビーズ調製試料の経過時間で変化する。従って、別の時に行われた溶出液からのファージの絶対収量を直接比較することは困難である。例えば、ｈＮＥビーズから回収されたMA-EpiNE7 提示ファージ画分の量は、表212 、215 および216 に示されるように実験間で２倍違っている。しかし、pH溶離プロフィルの形は良く似ている。提示ファージの収量を、同時に行った溶離実験でビーズから回収されたMA-EpiNE7ファージの全収量に対し正規化することにより、結合容量の変化をある程度修正することは可能である。表212 、215 および216 に示すデータをそのように正規化した場合、回収されたMA-EpiNE7 と比較した提示ファージの回収率は表10に示すとおりである。従って、提示されたタンパク質のアミノ酸末端配列の変化は、ｈＮＥビーズから溶出される提示ファージの割合を３〜５倍増加させる。結合の増加に加えて、MA-BITI-E7に導入された変化は、親株のMA-ITI-DIEファージよりも低いpHでｈＮＥビーズから溶出するファージを作り出す。親株の提示ファージはpH約5.0を中心とする広いpHピークで溶出するが、MA-BITI-E7提示ファージに対するpH溶離プロフィルはpH4.75〜pH4.5のあたりにpHピークを有する。 MA-BITI-E7提示ファージのpH溶離ピークは、米国特許第5,223,409号に記載のB PTI（KI5L）とBPTI（K15V、R17L）提示ファージが示すピーク（それぞれpH4.75 とpH4.5〜pH4.0）の間にある。提示ファージが示すpHピークから、溶液中に遊離しているBITI-E7タンパク質は100pM台のｈＮＥに対する親和性を有すると予想される。これは、ITI-D1E7に対して見積もられたものより、ｈＮＥに対する親和性で約10倍の増加に相当する。先に記したように、ファージタンパク質のウエスターン分析は、アミノ末端配列の変更による遺伝子III融合タンパク質に大きな変化はないことを示している。従って、ｈＮＥビーズに対する提示ファージの親和性の変化は、アミノ末端変異株ではプロセシングが変わって（正常になって）タンパク質の折り畳みが大規模に変わったためと思われる。部分的には結合の改善は、1）２位でGluからPro に変えたことによる、タンパク質上での実効負電荷の減少（-1〜0へ）、または2 ）タンパク質の疎水性コア中の４位でSerからPheへ置換したことによる、タンパク質の安定性の増加、または3）両方の置換の複合効果のためであると思われる。実施例６：MA-BITI-E7-1222およびMA-BITI-E7-141の製造と性質推定クニッツ：ｈＮＥインターフェース内で、BITI-E7とEpiNE7はただ二ヵ所、1 1と34で異なるだけである。EpiNE7ではこれらの残基はそれぞれThrとValである。BITI-E7ではそれらはAlaとGlyである。さらにBITI-E7は31にGluを有するが、E piNE7はGlnを有する。その残基は直接インターフェース中にないが、負電荷は結合に影響すると思われる。11、31および34位における置換のプロテアーゼ：インヒビター相互作用に対する影響を調べるため、我々はオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を用いた。 ITI-D1誘導体BITI-E7-1222は、A11T変異を有するBITI-E7である。ITI-D1誘導体BITI-E7-144はE31QおよびQ34V変異を有するBITI-E7である。これらのタンパク質を提示するファージはMA-BITI-E7-1222とMA-BITI-E7-141である。我々はMA-BI TI-1222とMA-BITI-E7-141 のｈＮＥに対する結合性を、先に記載された拡張pH分画プロトコルを用いて測定した。結果を表217（MA-BITI-E7およびMA-BITI-E7-12 22について）および218（MA-EpiNE7およびMA-BITI-E7-141 について）に示す。M A-BITI-E7とMA-BITI-E7-1222のpH溶離プロフィルはほとんど一致する。両方のファージ種とも、負荷ファージとｈＮＥビーズから溶離されたファージの比率の総計が同じで（0.03％）、かつ同じpH溶離プロフィルのピーク（pH5.0〜pH4.5の間）を示す。従って、提示されたITI-D1誘導体におけるT11A置換は、ｈＮＥビーズへの結合に何ら良い効果を持たない。対照的に、31および34位の置換は、提示ファージのｈＮＥ結合能に強く影響する。MA-BITI-E7-141ファージの溶離プロフィルpHピークは、親株のMA-BITI-E7ファージに対するより低いpHへ移動する。さらにピークの位置（pH4.5とpH4.0の間）は、この実験でMA-EpiNE7ファージが示すピークと同じである。最後に、MA-BI TI-E7-141ファージは親株のMA-BITI-E7に対し、ｈＮＥビーズから溶離される負荷ファージの全画分で10倍の増加を示す（0.3%対0.03%）。ｈＮＥビーズから溶離されるMA-BITI-E7-141ファージの全量は、MA-EpiNE7ファージのそれのほぼ2倍である。上記の結果は、Ma-BITI-E7-141提示ファージのｈＮＥへの結合は、MA-EpiNE7 のそれに匹敵することを示している。溶液中の２種のタンパク質（EpiNE7とBITI -E7-141）がｈＮＥに対しよく似た親和性を有するならば、ｈＮＥに対するBITI- E7-141タンパク質のｈＮＥに対する親和性は1pMのオーダーである。このような親和性は親のタンパク質（BITI-E7）で上に見積もられたそれより約100倍大きく、無傷のITIタンパク質で報告されたｈＮＥに対する親和性より10⁵〜10⁶倍大きい。実施例７：BITI-E7-141の突然変異誘発 BITI-E7-141はITI-D1とは9ヵ所で異なる（１、２、４、15、16、18、19、31、および34）。ｈＮＥに対する高い親和性を維持しつつ、ITI-D1からの変化が最も小さいタンパク質を得るために、１、２、４、15、16、18、19、31、および34位での変化を反対にする効果を調べた。試験したBITI-E7-141 の誘導体はMUT1691 、 MUTP1およびMUTT26Aであった。試験したBITIの誘導体はAMINO1およびAMINO2である。試験したBITI-E7の誘導体はMUTQEである。これらの配列のすべてを表100 に示す。MUT1619はITI-D1の残基Ala₁₆とSer₁₉を回復している。「MUTP1」と名付けられた配列は、BITI-E7-141の文脈中にアミノ酸Ｉ₁₅、Ｇ₁₆、Ｓ₁₉を持つ。Ｍ₁₇ とＦ₁₈は、高い親和性のｈＮＥ結合には最適であると思われる。Ｇ₁₆とＳ₁₉は、ｈＮＥに対するBPTI変異株のライブラリーから得られた高親和性のｈＮＥ結合BP TI変異株では頻繁に出現する（ROBE92）。提示されたITI-D1ドメインの想定アミノ末端に３つの変化を導入して、MA-BITI 系ファージを製造した。AMINO1は配列 K1-E2を有し、一方AMINO2はK1-S4を有する。これらの配列のアミノ末端領域中の他のアミノ酸は、ITI-D1中と同じである。MUTQEはBITI-E7-141をQ31E置換したものである（ITI-D1w.t.残基を再導入）。最後に、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドMUTT26Aは、Ｎ−連結グリコシル化の潜在部位であるN24-G25-T26を取り除くことを意図している。ヒト血清から単離された無傷のITI 分子中では、軽鎖ポリペプチドはこの部位でグリコシル化される（N45、ODOM90）。BITI-E7-141タンパク質が真核性発現経由で製造される場合、N24がグリコシル化されることも有り得る。長期間の治療のために使用された場合、このようなグリコシル化がタンパク質に免疫原性を与えることもありうる。MUTT26Aは変異T26Aを含み、その位置の残基の全体的な化学的性質の変化を最小限にして、潜在的グリコシル化部位を除去する。さらに、他のBPTI相同体でも26位にAla残基が頻繁に見出される（米国特許第5,223,409号の表34参照）。突然変異誘発はMA-BITI-E7-141上のssＤＮＡ上で行われた。実施例８：変異を誘発したMA-BITI-E7-141提示ファージのｈＮＥ結合性表219 は、ｈＮＥビーズから溶離した様々な提示ファージのpH溶離データである。ビーズに導入した全pfuは第２列に示す。簡略化pH溶離プロトコルの各pH分画中（pH7.0、pH3.5およびpH2.0）に回収された負荷pfuの量は、次の３つの縦列にある。詳細pH溶離プロトコルを用いて得られたデータでは、pH3.5の欄に記載した値はpH6.0、pH5.5、pH5.0、ph4.5、pH4.0およびpH3.5溶離試料中に回収された試料の負荷との比率の和を表す。pH2.0の欄に記載した値はpH3.0、pH2.5およびp H2.0溶離試料から得られた比率の和である。pHプロトコル全体を通して得られた負荷pfuとの比率の総計は、６番目の列にある。表のリストの最後の縦列は、MA- BITI-E7-141ファージに対して得られた値に対して正規化された、回収されたpfu の負荷pfuとの比率の総和を記載する。表219 に示したデータ間の比較を行う場合、二つの因子を考慮しなければならない。最初のものは、ｈＮＥビーズからのファージ放出が速度依存性であることと、詳細pH溶離プロトコルは時間が長くかかることにより、pH3.5 分画に回収された負荷pfu の画分が多くなることであるが、これは簡略化プロトコルで得られる値と比べて、詳細プロトコルではpH2.0 フラクションに食い込んでいるからである。この効果の大きさは、MA-BITI-E7-141提示ファージを二つのプロトコルを用いてｈＮＥビーズから溶離した場合、得られた結果を比較すると分かる。二番目の因子は、表219 にリストされた負荷pfuの範囲で、負荷pfuの量が回収に影響することである。負荷pfu 量が多いほど、溶離液中に回収されるものの割合が大きくなる。この効果は負荷pfu の量が３から４倍差があるとき明らかである。この効果は、高い力価で負荷したファージからのデータをより低い力価で負荷したファージからのデータと比較する場合、ｈＮＥビーズに対する提示ファージの親和性を高く見積もりすぎる結果となる。この警告を頭において、我々は表219 のデータを解釈することができる。MA-B ITE-E7-141提示ファージ（親株）に導入した変異の、ｈＮＥビーズへの提示ファージの結合に対する影響は、３種類にグループ分けすることができる。すなわち、ほとんどまたは全く測定できる変化がないもの、中程度の効果（２〜３倍）があるもの、大きな効果（＞５倍）があるものである。 MUTT26AとMUTQEの変化は、提示ファージのｈＮＥビーズへの結合にわずかな影響しかない様に思われる。回収された全pfu量で言えば、これらの変異を含む提示ファージは、親株と同じ程度ｈＮＥビーズに結合する。実際、親株と、MUTT26 A提示ファージで得られた拡張pH溶離プロトコルからの溶離プロフィルは区別できない。MUTT26A提示ファージの結合は、親株に対してわずかに減少している様に思われ、負荷pfu量から見ればこの結合は幾分多く見積もられていることも有り得る。 MUTP1およびMUT1619オリゴヌクレオチドを経由して導入された配列の変異は、提示ファージのｈＮＥビーズへの結合を約2〜3倍減少させるように思われる。負荷力価と、様々な溶離分画の間で回収されたpfu量の分布から見れば、以下のことが有り得る：1）提示ファージはどちらも、ｈＮＥビーズに対してMA-EpiNE7提示ファージよりも低い親和性を有する； 2）MUT1619提示ファージは、ｈＮＥビーズに対してMUTP1提示ファージよりも大きい親和性を有する。 BITI-E7-14のアミノ末端での配列の変異は、提示ファージのｈＮＥへの結合を少なくとも10倍減少させるように思われる。AMINO2の変化はAMINO1の変化よりも、提示ファージの結合を相当程度減少させると考えられる。表219 のデータの上記解釈に基づき、我々は次のように結論することができる：１）ITI-D1およびその誘導体で２６位のTHRをALAに置換することは、インヒビターとｈＮＥとの相互作用に何らの影響もない。従って、真核細胞培養で生産したインヒビタータンパク質のAsn24 位でのグリコシル化の可能性は、ｈＮＥに対する親和性を何ら減少させずに回避することができる。２）E31QとQ34Vによる提示ファージのｈＮＥビーズに対する親和性の増加は、主として34位でのVal置換の結果である。３）ITI-D1のアミノ末端領域での3ヵ所（1、2および4位）の変化はすべて、ｈＮＥビーズに対する提示ファージの結合に様々な程度で影響する。S4Fという変異はE2Pとほぼ同じ程度の影響を持つように思われる。1位での変化はわずかな影響しかないと考えられる。４）BITI-E7-141のP1残基の周辺（15位）での変化は、ｈＮＥに対する提示ファージの結合に影響する。変異A16GとP15Sは、インヒビターの親和性をある程度減少させるように思われる（多分3倍程度）。I15V置換は結合をさらに減少させる。 BITI-E7-141はITI-D1とは9ヵ所で異なる。上記議論から、ITI-D1に基づく高親和性ｈＮＥインヒビターは、僅か5または6ヵ所でITI-D1配列と異なる様に構成することができる。これらの差異は：2位のPro、4位のPhe、15位のVal、18位のPhe 、34位のVal、および26位のAlaである。Asn24のグリコシル化が関係しない場合、Thrを26位に保持することができる。まとめ：ｈＮＥに対する単離ITI-D1の親和性の見積もり提示ファージのｈＮＥへの結合とそこからの溶離に基づき、ITI-D1の様々な誘導体が溶液中で単独で示すｈＮＥに対する親和性を見積もることができる。これらの見積りは表55にまとめられている。 ITIドメイン2から導かれるｈＮＥインヒビター ITI-D1から導かれるｈＮＥインヒビターに加えて、本発明はITI-D2から導かれるインヒビターを包含する。これらのインヒビターはピチア・パストリスで収率よく製造された。EPI-HNE-4はヒト好中球エラスターゼをＫ_D≒５pM で阻害する。 EPI-HNEタンパク質の精製と性質Ｉ．EPI-HNEタンパク質実施例９：EPI-HNE-3およびEPI-HNE-4のアミノ酸配列表100に４種のヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）インヒビタータンパク質−EPI -HNE-1（EpiNE1と同一）、EPI-HNE-2、EPI-HNE-3、およびEPI-HNE-4 - のアミノ酸配列を示す。これらのタンパク質は、示された親クニッツ型ドメインから導かれた。それぞれのタンパク質は、クニッツ型ドメインの特徴である６個のシステイン残基（影付き）で親ドメインと対応させてならべてある。親タンパク質中にある残基と異なるインヒビタータンパク質中の残基は大文字で示してある。配列 EPI-HNE-1、EPI-HNE-2、EPI-HNE-3、およびEPI-HNE-4（表100）を有する全タンパク質が作られた。ｈＮＥ阻害配列の一つを包含する大きなタンパク質は、強いｈＮＥ阻害活性を有するものと期待され、EPI-HNE-1、EPI-HNE-2、EPI-HNE-3、およびEPI-HNE-4が特に好ましい。表100に見られるｈＮＥ阻害配列のどれか１つの重要な部分（特に最初のシステインからまたはそれより前から始まり、最後のシステインまでまたはそれより先に続く配列が保持される場合）を包含するタンパク質は、強いｈＮＥ阻害活性を示すと期待される。ｈＮＥインヒビターEPI-HNE-1とEPI-HNE-2は、ウシタンパク質BPTI（アプロチニン）から導かれる。クニッツ型ドメイン中で、これらの二つのインヒビターは同じ８ヶ所でBPTIと異なる：K15I、R17F、I18F、I19P、R39M、A40G、K41Nおよび R42G。さらにEPI-HNE-2はアミノ末端に4個の迫加残基（EAEA）が存在することで、BPTIとEPI-HNE-1 の双方と異なる。これらの残基はピチア・パストリスでタンパク質の分泌を促進するために追加された。 EPI-HNE-3 はヒトインターα−トリプシンインヒビタータンパク質の軽鎖の２番目のクニッツドメイン（ITI-D2）から導かれる。EPI-HNE-3 のアミノ酸配列は、ITI-D2（3-58）のアミノ酸配列とは、わずか４ヶ所で異なるだけである。すなわち R15I、I18F、Q19PおよびL20R である。EPI-HNE-4はEPI-HNE-3とは、Ｐ．パストリスでタンパク質分泌を促進し、ｈＮＥに対するＫ_Dを改善するアミノ末端残基の置換A3Eで異なる。表602にｈＮＥインヒビタータンパク質の物理的性質をいくつか示す。4種のタンパク質はすべて小さく、高親和性（Ｋi＝２〜６pM）で、作用の早い（ｋ_on＝４〜１１×１０⁶ Ｍ ^-1s^-1）ｈＮＥインヒビターである。 II．ｈＮＥインヒビターEPI-HNE-2、EPI-HNE-3およびEPI-HNE-4の製造実施例１０：ピチア・パストリス生産系 BPTIおよびITI-D2より導かれる種々のEPI-HNE タンパク質を発現するために、ピチア・パストリス変異株を用いた。BstBIおよびEcoRI部位（表111 ）を用いて、タンパク質発現カセットをプラスミドpHIL-D2中にクローン化する。pHIL-D2のＤＮＡ配列を表250に示す。クローン化遺伝子は上流のＰ．パストリスの（"aox1 5 "とラベル）aox1遺伝子プロモーターおよび調節配列（黒い影を付けた領域）と、下流ポリアデニル化および転写停止配列（２番目の斜線を付けた領域、"aox1 3"とラベル）で転写調節される。P．パストリスGS115は非活性ヒスチジノール・デヒドロゲナーゼ（his4）遺伝子を含む変異株である。プラスミドpHIL-D2 とその誘導体上に含まれるhis4遺伝子は、ホスト株のヒスチジン欠損を補うために使用することができる。指定されたSacI部位でプラスミドpHIL-D2 を直線化し、形質転換するとAox1座でホストゲノム中に相同組換えによるプラスミドの取り込みが起こる。発現プラスミドのコピーが組み込まれたＰ．パストリス株は、唯一の炭素源としてのメタノールの存在下で生育してプロモーターが活性化された場合、 aox1の制御下にタンパク質遺伝子を発現する。我々はこの高密度ピチア・パストリス生産システムを、細胞培養培地中への分泌によりタンパク質を製造するために使用した。表に示したBstBIおよびEcoRI部位を用い、望みのｈＮＥインヒビターのアミノ末端に直接融合させたS.セレビシエ（S．cervisiae）接合因子α−プレプロペプチドをコードする合成ＤＮＡ配列をプラスミドpHIL-D2に連結して、発現プラスミドを構築した。表251 にpHIL-D2 をpHIL-D2（MFα−PrePro :: EPI-HNE-3 ）に変換するBstBI-EcoRI挿入断片のＤＮＡ配列を示す。この構造で、融合タンパク質は上流のＰ．パストリスの誘導性 aox1遺伝子プロモーターと、下流のaox1遺伝子転写停止配列およびポリアデニル化配列の制御下に置かれる。発現プラスミドはSacI消化で直線化され、線状ＤＮＡはスフェロプラスト形質変換によって相同組換えでＰ．パストリス株GS115 に組み込まれる。再生スフェロプラストを添加ヒスチジンなしで生育させて選別し、再度プレーティングして、個々の単離体をメタノール資化フェノタイプ（mut+ ）、分泌レベルおよび遺伝子量（サザーンハイブリダイゼーション実験で算出）で選別した。ｈＮＥインヒビター生産能に関して高レベル分泌株を選別した。EP I-HNE-2の生産についてはPEY-33、EPI-HNE-3の生産についてはPEY-43 が選ばれた。これらの株はどちらも、発現プラスミドの4個のコピーが縦に並んでaox1座に組み込まれていると推定された。 pHIL-D2 由来プラスミドのクニッツドメインをコードするセグメントの変異を可能にするため、我々は表111に示した２個の制限部位−4780のBstBI部位と5498 の AaiII部位−を除去した。従ってクニッツドメインをコードするセグメントはそれぞれ１つずつのAatIIおよびEcoRI部位で囲まれている。新しいプラスミドは pD2pick("insert")と呼ばれるが、"insert"はaox1プロモーターの制御下でコードされるドメインを定義する。表253にpD2pick(MFα::EPI-HNE-3)のＤＮＡ配列を示す。表254はpD2pick(MFα::EPI-HNE-3)中の制限部位のリストを示す。 EPI-HNE-4 はpD2pick（MFαPrePro::EPI-HNE-4）でコードされるが、それは１）表251 に示すAatII/EcoRIセグメントが表252に示すセグメントで置換され、２）上記制限部位の変化が行われている点でpHIL-D2と異なる。PEY-53株は、pD2pi ck(MFα::EPI-HNE-4)で形質転換されたＰ．パストリスである。実施例１１：タンパク質製造タンパク質を製造するため、ｐ．パストリス株を、ディガン（Digan：DIGA89）ら記載の工程と類似した混合栄養培養で成長させた。他の研究者らがＰ．パストリス中でクニッツドメインの生産を報告しているが、分泌系の多くにはプロテアーゼがかかわっていることは公知である。従って、新しいインヒビターが分泌経路で何らかのキー酵素を阻害する可能性があるので、ｈＮＥを強く阻害する変性クニッツドメインがＰ．パストリスから自動的に分泌されるとは言えない。それにもかかわらず、Ｐ．パストリスがｈＮＥインヒビターを高収率で分泌できることを、我々は見出した。簡潔に言えば、培養物はグリセロールを炭素源として、最初にバッチ法で生育させた。グリセロールが消費された後、細胞量を更に増やし、aox1プロモーターの抑制を解除するため、培養物をグリセロール制限栄養モードで約4時間培養した。最終生産期では、培養物はメタノール制限栄養モードで生育させた。この培養期中、aox1プロモーターは完全に活性であり、培地中にタンパク質が分泌された。表607と表608に一連の発酵中のメタノール制限供給時のPEY-33およびPEY-43培養について細胞成長速度（A₆₀₀として算出）と、タンパク質分泌量（mg/l）を示す。発酵培地中のインヒビタータンパク質の濃度は、記載の時間に得られた無細胞培養液を希釈して、ｈＮＥのin vitro分析から測定した。遺伝子量、発酵条件、細胞濃度、および分泌速度が似ているにもかかわらず、2種の株で分泌したインヒビタータンパク質の最終濃度はほぼ一桁違っている。PEY-33発酵培地中のEP I-HNE-2の最終濃度は720mg/l で、PEY-43発酵培地中のEPI-HNE-3の最終濃度は85 mg/l であった。最終分泌タンパク質濃度の差は、酵母の合成およびプロセシングシステムが異なったタンパク質配列と相互作用する効率の特異的差によると思われる。 PEY-33株はEPI-HNE-2タンパク質をアミノ酸組成とN-末端配列決定から表601に示す配列を持つ正しくプロセシングされたクニッツドメインである単一分子種として分泌する。PEY-43の培養で生産された主要分子種は、正しくプロセシングされたEPI-HNE-3タンパク質であった。しかしながら、この株は少量の（全EPI-HNE -3の約15％〜20％）間違ってプロセシングされた物質も分泌した。この物質は、成熟クニッツドメインからのMFαPreProリーダーペプチドの間違った開裂に由来する、アミノ末端が伸びた（主に長さで9または7残基）タンパク質の混合物であることが分かった。以下に述べるように、正しくプロセシングされたタンパク質を、ほとんどこれらの汚染物がなくなるまで精製した。 III．ｈＮＥ-インヒビターEPI-HNE-2およびEPI-HNE-3の精製本タンパク質を、標準の生化学的技術でファーメンター培養培地から容易に精製することができる。以下に述べるように、特定の精製法は個々のタンパク質の特定の性質によって変わる。実施例１２：EPI-HNE-2の精製表603にEPI-HNE-2、ロット1の精製の詳細を示す。PEY-33ファーメンター培養液を8000×g、15分の遠心で収穫し、細胞ペレットを廃棄した。4個の0.2μフィルターパックを装備したミニタン（Minitan）ウルトラフィルトレーションシステム（ミリポア社（Millipore Corporation、Bedford、MA））を用い、3.3リッターの上清を精密濾過した。精密ろ過工程から得られた濾液をその後の2段の限外ろ過工程に用いた。最初に、0.2μ精密ろ過液を、8枚の30,000NMWLポリスルフォンフィルタープレート（ #PLTKOMPO4、ミリポア社）を装備したミニタン装置を用いて２回の３０Ｋ限外ろ過を行った。最初の３０Ｋ限外ろ過からの保持液を10mM、pH3.5のクエン酸ナトリウムで希釈し、２回目の３０Ｋ限外ろ過に供した。２回の３０Ｋ限外ろ過液を合わせ、約1.4グラム（ｈＮＥ阻害測定より算出）のEPI-HNE-2を含む最終容積5リッターを得た。 5,000NMWLフィルタープレート（#PLCCOMO4、ミリポア社）を装備したミニタン装置を用いた限外ろ過工程で、緩衝液を交換しながら３０Ｋ限外ろ過液を濃縮した。５Ｋ限外ろ過中に２回保持液を約300mlから1.5リッターに希釈した。最終限外ろ過保持液（約200ml）を10mM、pH3.5のクエン酸ナトリウムで最終容量1000ml に希釈した。５Ｋ限外ろ過保持液から、室温の硫酸アンモニウム沈殿でEPI-HNE-2タンパク質を得た。0.25M酢酸アンモニウム（pH=3.2）100ml（1/10容）を５Ｋ限外ろ過保持液に加え、次いで最終容量（1.1リッター）と同量の3M硫酸アンモニウムを加えた。室温で30分間インキュベート後、沈殿物を10,000×g、45分の遠心でペレット化した。上澄液を除き、ペレットを最終容積400mlで水に溶解、硫酸アンモニウム沈殿を上記の割合を用いて繰り返した。2回目の硫酸アンモニウム沈殿で得られたペレットを、最終容積300mlとなるよう50mM酢酸ナトリウム（pH=3.5）に溶解した。残留硫酸アンモニウムをイオン交換クロマトグラフィーで、EPI-HNE-2調製試料から除去した。硫酸アンモニウム沈殿工程から得られた溶液を、あらかじめ10 mMクエン酸ナトリウム（pH=3.5）で平衡化した強カチオン性交換カラム（50mlベッド容積マクロプレップ（Macroprep）50S）（バイオラッド・ラボラトリース（ Bio-Rad Laboratories,Inc.、Hercules、CA））に負荷した。負荷後、カラムを3 00mlの10mMクエン酸ナトリウム、pH=3.5で洗浄した。次にEPI-HNE-2を、50mM NH₄ OAc（pH=6.2）でカラムからバッチ式で溶離した。EPI-HNE-2活性を含む分画をプールし、得られた溶液を凍結乾燥した。乾燥したタンパク質を50mlのdH₂Oに溶かし、溶液を0.2μフィルター（#4192、ゲルマン・サイエンス（Gelman Science 、Ann Arbor、MI））に通した。最終貯蔵液中の活性インヒビターの濃度は、2mM （13.5 mg/ml）と測定された。この貯蔵溶液（EPI-HNE-2、ロット1）を1mlずつ小分けにして4℃と-70℃で11ヶ月以上保存したが、活性は失われなかった。表603に、精製の各段階でのEPI-HNE-2の収率と相対純度をまとめる。精製工程の全体的な収率は約30％であった。主な損失源は、0.2μ精密ろ過と３０ｋ限外ろ過の保持液分画中の材料の保持であった。実施例１３：EPI-HNE-3の精製 EPI-HNE-3、ロット1の精製を表604に示す。PEY-43ファーメンター培養液を8,000 ×g、15分間の遠心で収穫し、細胞ペレットを捨てた。上清（3100ml）を0.2μミニタンパック（4パック）で精密ろ過した。濃縮後、0.2μ濾過からの最終濾過液の容積が3300mlとなるように、保持液のダイアフィルトレーションを行った。 0.2μ精密ろ過工程からの濾過液につき、３０Ｋ限外ろ過を行った。保持液の容積が250mlに減少したとき、保持液の容積を一定（250ml）にして10ml/minの速度で30分間、保持液のダイアフィルトレーションを行った。得られた最終容積は 3260mlであった。ファーメンター培養培地を濃縮したとき、EPI-HNE-3タンパク質とその他の成分が溶液から沈殿することが分かった。この理由で、５ｋ限外ろ過を行わなかった。正しくプロセシングされたEPI-HNE-3を、誤プロセシング型および他のファーメンター培養培地成分がほとんどなくなるまでイオン交換クロマトグラフィーで精製した。ベッド容積30mlの強カチオン性交換カラム（マクロプレップ50S）を1 0mMのクエン酸ナトリウム（pH=3.5）で平衡化した。３０Ｋ限外ろ過濾液をカラムに負荷し、EPI-HNE-3のカラムへの結合を、カラム通過液中に完全にインヒビター活性が失われていることを実証して確かめた。次にカラムを300mlの10mMクエン酸ナトリウム（pH=3.5）で洗浄した。 EPI-HNE-3をカラムから取り出すため、下記の溶液300mlずつで順次溶離した： 100mM 酢酸アンモニウム、pH=3.5 50mM 酢酸アンモニウム、pH=4.8 50mM 酢酸アンモニウム、pH=6.0 50mM 酢酸アンモニウム、pH=6.0、0.1M NaCl 50mM 酢酸アンモニウム、pH=6.0、0.2M NaCl 50mM 酢酸アンモニウム、pH=6.0、0.3M NaCl 50mM 酢酸アンモニウム、pH=6.0、0.4M NaCl 50mM トリス／Cl pH=8.0、1.0M NaCl EPI-HNE-3の大部分は2回の50mM酢酸アンモニウム、pH=6.0分画で溶離した。0.1M NaCl分画は約19％の負荷EPI-HNE-3活性（159mg負荷で28mg）と、ほとんどすべてのEPI-HNE-3の誤プロセシング型を含んでいた。0.2M NaCl分画は負荷したEPI-HN E-3の約72％（114mg）を含み、分子量の大きい誤プロセシング型とその他のUV吸収混入物はほとんどなかった。EPI-HNE-3の濃度が最も高い50mM酢酸アンモニウム、pH=6.0、0.2M NaCl溶離液画分を合わせた（95mg）。 0.2M NaCl、pH=6.0イオン交換カラム溶離液につき、硫酸アンモニウム沈殿を行った。160mlの溶離溶液に800mlの3M硫酸アンモニウムを加え（最終硫酸アンモニウム濃度＝2.5M）、混合液を室温で18時間インキュベートした。次に沈殿物を 10,000×gで45分間の遠心でペレット化した。上澄液を捨て、ペレット化した材料を100mlの水に溶かした。残存硫酸アンモニウムをEPI-HNE-3からバッチ式イオン交換クロマトグラフィーで除去した。タンパク質溶液のpHを希HOAc（1/10）で3.0に調節し、次にその溶液を、10mMクエン酸ナトリウム、pH=3.5で平衡化した10mlベッド容積のマクロプレップ50Sカラムに負荷した。試料をのせたのち、カラムを100mlの10mMクエン酸ナトリウム、pH=3.5、次いで100mlのdH20で洗浄した。EPI-HNE-3をカラムから、100mlの50mM NH₄CO₃、pH=9.0で溶離した。EPI-HNE-3の濃度が最も高いpH9分画を合わせ（60mg）、凍結乾燥前に4℃で7日間保存した。凍結乾燥したタンパク質粉末を26mlのdH₂Oに溶かし、その溶液を0.2μフィルターに通した（#4912、ゲルマンサイエンス、Ann Arbor、MI）。最終保存溶液中の活性インヒビターの濃度は250μM（1.5mg/ml）であることが分かった。この保存溶液（EPI-HNE-3、ロット1）を１mlづつ分けて70℃で６ヶ月以上保存したが、活性は失われなかった。水溶液（全く緩衝化しないもの）として保存したEPI-HN E-3は、４℃に保ったとき劣化した。５ヶ月後、約70％は、Ｋi が約12pMの活性があった。表604に精製手順の様々な工程での収率と相対純度を示す。主要な精製段階は、最初のイオン交換クロマトグラフィー操作であった。硫酸アンモニウム沈殿工程は、さらにわずかな精製を加えただけであった。インヒビター活性の若干の損失は、pH=9でのインキュベーションで生じた。EPI-HNE-1とEPI-HNE-4の製造と精製は、EPI-HNE-2とEPI-HNE-3の製造と精製と同様であった。実施例１４：EPI-HNE-2とEPI-HNE-3のトリシン（Tricine）-PAGE分析シャガー（Schagger）とフォン・ヤゴブ（von Jagov）の高分解能トリシンゲルシステム（SCHA87）を、上記で製造した精製タンパク質を分析するために使用した。低分子量EPI-HNEタンパク質の分解能を良くするため、我々は4％の濃縮層と10％の分離層とを有する16.5％の解像層を使用した。銀染色後、以下のレーンについてゲルを観察した。レーン１：EPI-HNE-2 25ng レーン２：EPI-HNE-2 50ng レーン３：EPI-HNE-2 100ng レーン４：EPI-HNE-2 200ng レーン５：EPI-HNE-3 25ng レーン６：EPI-HNE-3 50ng レーン７：EPI-HNE-3 100ng レーン８：EPI-HNE-3 200ng レーン９：分子量標準： RPN 755（Amersham Corporation、Arlington Heights、IL）ゲル上に見える染色されたタンパク質と、その分子量（ダルトン）は：オバルブミン(46,000)、カーボニック・アンヒドラーゼ（30,000）、トリプシンインヒビター（21,500）、リゾチーム（14,300）、およびアプロチニン（6,500）である。ゲルに載せたタンパク質の量は、ｈＮＥ阻害測定で決定した。我々は次のような特徴を見出した。すべての負荷量で、EPI-HNE-2、ロット1は予想された大きさ（約6,700D）の単一バンドを示す。同様に、EPI-HNE-3、ロット1タンパク質は予想された大きさ（約6,200D）の単一染色バンドを示す。最高の負荷量で、痕跡量の分子量の大きい（約7,100D）誤プロセシング型が検出された。銀染色高分解能PAGE分析に基づき、双方のタンパク質調製物の純度は、95％より充分大きいと評価された。 IV．EPI-HNE-2とEPI-HNE-3の性質A ．ｈＮＥの阻害実施例１５：ｈＮＥに対するEPI-HNEの測定されたＫ_D ｈＮＥと反応するタンパク質に対する阻害定数（Ｋi ）は、蛍光原性基質（N-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-7-アミノ-4-メチルクマリン、シグマ（Sigm a）M-9771）の加水分解の室温測定を用いて決定した。これらの測定のため、一定量の適当に希釈したインヒビターの保存液を、プラスチック蛍光キュベット中で、反応緩衝液（50mlトリス-Cl、pH=8.0、150mM NaCl、1mM CaCl2、0.25％トリトン-X-100）中の0.847nM ｈＮＥ溶液2mlに加えた。反応液を室温で30分間インキュベートした。インキュベーションが終わった時点で蛍光原性基質を25μMの濃度で加え、基質の酵素分解による470nm（励起380nm）の蛍光の時間的増加を蛍光スペクトロメーター（パーキン・エルマー（Perkin Elmer）650-15）とストリップチャート記録計を用いて記録した。（Ｓo／Ｋm）は0.07であるので、我々は基質とインヒビターの間の競合の補正を行わなかった（ただしＳo は基質濃度、Ｋm は基質のｈＮＥに対する結合定数である）。Ｋi とKapparentは、Ｋi ＝Kapparent× （１／(１＋（Ｓo／Ｋm))）で関係づけられる。補正は、Kapparentの可能な誤差と比べて小さい。基質の酵素分解速度は、記録された蛍光の増加の直線勾配から決定した。インヒビター存在下のｈＮＥの残存活性率は、インヒビターの存在で観測された蛍光増加速度の、インヒビターを加えない場合に観測される値に対するパーセンテージとして計算した。我々はｈＮＥと反応するEPI-HNE-2およびEPI-NE-3のＫi を決定するために使用したデータを記録した。上記の様に得られたデータは、添加したインヒビターの関数としてプロットされた残存活性率として記録される。Ｋi と貯蔵液中の活性インヒビター濃度に対する値は、最小二乗適合法プログラムから得られる。データから、室温でｈＮＥと反応するEPI-HNE-2およびEPI-NE-3のＫi 値はそれぞれ、4.8pMおよび6.2pMと計算された。ｈＮＥと反応するEPI-HNE-2およびEPI-NE- 3 のＫi の測定値を表610および表611に示す。ｈＮＥと反応するインヒビターの速度依存性（kinetic on-rate：ｋon）は、インヒビター添加後のｈＮＥによる基質加水分解の漸進的阻害の測定から決定した。この実験のため、既知の濃度のインヒビターを、プラスチック蛍光キュベット中でｈＮＥの溶液（0.847nM）と２mlの反応用緩衝液中の基質（25μM）に加えた。インヒビター添加後、蛍光の変化を連続的に記録した。これらの実験で、試料の蛍光は時間に対し直線的に増加せず、ｈＮＥの阻害がインヒビターを加えることにより増加することを反映して、蛍光増加の速度はだんだん減少した。インヒビター添加後、ある時点における酵素反応速度は、その時点の蛍光の経時変化の接線の傾きから決定した。ｈＮＥと反応するEPI-HNE-2 の速度定数ｋonは以下のように決定した。時間ゼロで0.867nMのｈＮＥを含む緩衝液に1.3nMのEPI-NE-2を加えた（I：E＝1.5：１）。測定残存活性率を、インヒビター添加後の時間の関数として記録した。最小二乗適合法プログラムを使用し、Ｋon＝４．０×１０⁶Ｍ^-1s^-1の値を得た。速度非依存性定数（kinetic off-rate：ｋoff）は測定値Ｋi およびｋonから、次のように計算した。ｋoff＝Ｋ_D×ｋon このような測定で得られた値は、表602に含まれる。EPI-HNEタンパク質は、小型で高親和性で反応の速い、ｈＮＥに対するインヒビターである。B ．特異性実施例１６：EPI-HNEタンパク質の特異性我々は、いくつかのセリンプロテアーゼと反応させてEPI-HNEタンパク質について阻害定数の測定を試みた。その結果を表605にまとめる。キモトリプシンを除くすべての場合、nM領域の濃度の酵素に10〜100μMのインヒビターを添加しても、我々は阻害を観察することはできなかった。表605で、Ｋi に対する我々の計算値（キモトリプシン以外の酵素で）は、試験したインヒビターの最高の濃度で阻害が10％以下であるという従来の仮定に基づいている。キモトリプシンでは、Ｋi は約10μMであり、多分、特異的ではない。C ．In Vitroの安定性実施例１７：酸化的不活性化に対する抵抗性表620は、他の2種の天然タンパク質ｈＮＥインヒビター‐α１プロテアーゼインヒビター（API）および分泌型白血球プロテアーゼインヒビター（SLPI）−と比較した、EPI−HNEタンパク質の酸化的不活性化に対する感受性の測定結果を示す。API（10μM）、SLPI（8.5μM）、EPI-HNE-1（5μM）、EPI-HNE-2（10μM）、E PI-HNE-3（10μM）およびEPI-HNE-4（10μM）を、50mMリン酸緩衝液（pH=7.0）中で室温、20分間、強力な酸化剤であるクロラミン-Tに暴露した。インキュベーション時間の終わりに、メチオニンを最終濃度4mMで加えて酸化反応を停止させた。さらに10分間インキュベーションを行った後、停止した反応液を希釈し、我々の標準ｈＮＥ阻害分析法で残存活性を測定した。 API とSLPIは酸化剤対インヒビターの低いモル比で不活性化された。API とSL PIの50％阻害に必要なクロラミン−Ｔ：タンパク質モル比はそれぞれ、約１：１および２：１であった。これらの比率は、2または4個の容易に酸化されるメチオニン残基が、API およびSLPIそれぞれに存在するという報告とよく対応する。対照的に、試験したすべてのモル比でクロラミン-Tに暴露後、4種のEPI-HNEはすべて基本的には完全なｈＮＥ阻害活性を保持している（EPI-HNE-3およびEPI-HNE-4 の場合は50:1まで）。EPI-HNE-3とEPI-HNE-4はいづれもメチオニン残基を含んでいない。対照的にEPI-HNE-1とEPI-HNE-2はメチオニン残基を含んでいる（表100 参照）。これらの2種のタンパク質が酸化的不活性化に抵抗性があることは、メチオニン残基が酸化剤に近づけないか、またはｈＮＥと相互作用のないタンパク質部分にあることを示している。実施例１８：pH安定性表612はEPI-HNEタンパク質のpH安定性測定結果を示す。pH 1〜pH10の範囲のpH条件に暴露したときのタンパク質の安定性を、37℃で18時間、所定のpHの緩衝液中にインヒビターを保ち、標準ｈＮＥ阻害分析で残存ｈＮＥ阻害活性を測定して評価した。タンパク質は1μMの濃度でインキュベートした。表14に示される緩衝液を記載（STOL90）どおり調合し、示されたpH範囲で使用した。 BPRI由来インヒビターであるEPI-HNE-1とEPI-HNE-2は双方とも、試験したpH値で安定である。ヒトタンパク質クニッツ型ドメイン由来のインヒビターであるEP I-HNE-3とEPI-HNE-4は低いpHでインキュベートした場合は安定であったが、高い pHでは若干活性が失われた。pH=7.5で37℃、18時間インキュベートした場合、EP I-HNE-3調製物は10〜15％のｈＮＥ阻害活性を失った。EPI-HNE-4はpH8.5までそのほぼ完全な活性を維持する。ITI-D2-由来インヒビターの活性はより高いpHレベルで急激に落ち込むので、pH10では最初の活性の30％が残っただけであった。 EPI-HNE-3が高いpHでのインキュベーションに敏感であることは、先に述べた最終精製工程でタンパク質の活性が失われることを説明すると考えられる。実施例１９：温度安定性 0℃〜95℃の範囲でのEPI-HNEタンパク質の温度安定性を、インヒビターを様々な温度で30分間インキュベートし、ｈＮＥに対する残存活性を測定して評価した。これらの実験で、タンパク質濃度はpH=7のリン酸緩衝液中で1μMとした。表630 に示すように、4種のインヒビターはきわめて温度に安定であった。 EPI-HNE-1とEPI-HNE-2は約90℃以下の温度では完全な活性を維持している。EP I-HNE-3とEPI-HNE-4は65℃以下の温度でインキュベートした場合は、完全な阻害活性を維持している。より高い温度ではタンパク質の活性は若干低下する。しかしながら、3種のタンパク質は、95℃で30分間インキュベートしても約50％以上の活性を維持している。実施例２０：その他のｈＮＥ阻害活性配列への道筋本発明は、きわめて親和性の高いｈＮＥインヒビターを、ほんの僅かのアミノ酸置換でヒト由来クニッツドメインから作り出すことができることを示している。ほとんどどのクニッツドメインも、８個またはそれ以下の置換で強力で特異的なｈＮＥインヒビターにすることができると信じる。特に既知のヒトクニッツドメインのどれでも、きわめて安定で強力、高度に選択性のあるｈＮＥインヒビターとなるように改造できる。ｈＮＥ阻害クニッツドメインにする３つの道筋がある：１）特異的ｈＮＥ結合に関与することが分かっているセグメントの置換、２）ｈＮＥ結合に重要であると考えられる残基一つ一つの置換、および３）ｈＮＥインヒビターを選択するためのクニッツドメインのライブラリーの利用。実施例２１：クニッツドメインのセグメントの置換表100は11種のヒトクニッツドメインのアミノ酸配列を示す。これらの配列は10 個のセグメントに分解される：１：Ｎ末端残基４；２：残基５；３：6-9(または 9a）；４：10-13；５：14；６：15-21；７：22-30；８：31-36；８：37-38；９：39-42；および10：43-C末端（または42a末端）。セグメント１、３、５、７および９は、クニッツドメインの結合性に強く影響する残基を含み、表100 のコンセンサス・クニッツドメインで二重下線が付けられている。セグメント２に余分な１個の残基とセグメント10に２個の余分な残基を持つTFPI-2ドメイン２以外は皆、セグメント１以外のセグメントの長さが同じである。セグメント１はアミノ末端にあり、タンパク質の安定性と動的性質に影響して結合に影響を及ぼす。セグメント３、５、７および９は、クニッツドメインが活性部位に結合するときセリンプロテアーゼと接触する残基を含む。ｈＮＥを高い親和性で阻害するためには、ｈＮＥと高度に相補的である分子が必要である。セグメント３、５、７および９は、プロテアーゼと接触するアミノ酸を供給する。セグメント１、３、５、７および９の配列は、相互、および他のセグメントと関連して共同作業しなければならない。それにもかかわらず、我々はきわめて多くの異なった配列が、高い親和性でｈＮＥを阻害することができることを示した。免疫原となる可能性を減らすためには、ヒトタンパク質にきわめて類似したｈＮＥインヒビターであることが好ましい。候補の高親和性ｈＮＥインヒビタータンパク質配列は、ｈＮＥを強く／極めて強く阻害するアプロチニン型クニッツドメインを取り出し、セグメント２、４、６、８および１０のうちの１つ、２つ、３つ、３つまたはすべてを、表100 にリストされた様なヒトクニッツドメインからの対応するセグメント、または人に対し相対的に低い免疫原性を有することが分かっているセグメントで置き換えることにより得られる（セグメント２、４、６、８および10のそれぞれは、同じヒトのドメインから、または異なったヒトのドメインから取り出すことができる）。また、免疫原性の少ない高度にｈＮＥを阻害するドメインは、ヒトアプロチニン型クニッツドメインの一つについて、セグメント３、５、７および９（好ましくはセグメント１も）のうちの１つ、２つ、３つまたはすべてを、１つ以上の強く／極めて強くｈＮＥを阻害するアプロチニン様クニッツドメインの、対応するセグメントで置き換えることで得られる。このようなヒト型ｈＮＥインヒビターを製造する場合、当然、上述の元のタンパク質の１つと同一のセグメントではなくて、１個以上の保存性変異で天然起源セグメントとは異なるセグメントを使用することができる。このような差異は当然、その有り得る阻害活性および／または免疫原性を適正に考慮して採用しなければならない。場合によっては、セグメントが数のヒトドメイン（セグメント２、４、６、８および10の場合）からの、または複数の強い／極めて強いｈＮＥインヒビタードメイン（セグメント３、５、７および９の場合）からの対応セグメント間のハイブリッドであることが有利である。セグメント１は強い／極めて強いｈＮＥインヒビターのセグメント１か、ヒトアプロチニン様クニッツドメインのセグメント１に対応するか、または双方からのセグメント１のキメラであることができる。タンパク質DPI.1.1、DPI.2.1、DPI.3.1、DPI.4.1、DPI.5.1、DPI.6.3、DPI.7. 1、DPI.8.1およびDPI.9.1はこの様にして設計された。DPI.1.1はApp-Iから、セグメント３、５、７および９をEPI-HNE-1由来の対応するセグメントで置き換えて誘導された。DPI.2.1はTFPI2-D1から、残基3、5、7および9をEPI-HNE-1由来の対応する残基で置き換えて誘導された。DPI.3.1はTFPI2-D2から、9a-21をEPI-HN E-4の残基10-21で置き換え、残基31-42bをEPI-HNE-4の残基31-42で置き換えて誘導された。DPI.4.1はTFPI2 -D3から、セグメント３、５、７および９をMUTQE由来の対応する残基で置き換えて誘導された。DPI.5.1はLACI-D1から、セグメント３、５、７および９をMUTQEの対応する残基で置き換えて誘導された。DPI.6.1は LACI-D2から、セグメント３、５、７および９をMUTQE由来の対応する残基で置き換えて誘導された。DPI.7.1はLACI-D3から、セグメント３、５、７および９をEP I-HNE-4由来の対応する残基で置き換えて誘導された。DPI.8.1はA3コラーゲンクニッツドメインから、セグメント３、５、７および９をEPI-HNE-4由来のセグメントで置き換えて誘導された。DPI.9.1はHKI B9ドメインから、セグメント３、５、７および９をEPI-HNE-4由来の対応する残基で置き換えて誘導された。上記キメラは本発明の好ましい実施形態を構成するが、本発明はこれらのキメラに限定されない。実施例２２：クニッツドメイン中の点置換この実施例では、ある種の置換突然変異について議論する。この実施例は本発明の好ましい実施形態を述べるが、本発明を限定するものではないことを強調しておく。本実施例で述べるタンパク質配列のすべては表100に載せてある。設計されたプロテアーゼインヒビター（Designed Protease Inhibitor）は"DPI"と表され、ヒトクニッツドメインから誘導されたものである（表100に挙げている）。DPI.i.2 （ｉ＝1〜9）と記された配列それぞれは、最小限の点突然変異を行って、表の二つ上の欄のものから誘導される。DPI.i.3(ｉ＝1〜9）と記されたそれぞれの配列は、親和性を増すことを目的により多くの突然変異を行って、それより三つ上の欄の配列から誘導される。いくつかの親（出発）ドメインについては、さらに別の実施例が与えられる。DPI.i.1と記された配列は実施例21で議論される。最も重要な位置は18と15である。ValとIleが15位にあり（Ileは好ましい）、P heが18位にあれば、クニッツドメインはどれも良いインヒビターとなり得る。（しかし、このような特徴は必ずしもこのような活性に必須ではない）。クニッツドメインがPheを18位に持ち、IleかValを15位に持ち、かつ良いインヒビターでない場合、中間に適切な結合を妨げる一つ以上の残基がある可能性がある。本明細書で開示した、ｈＮＥに対するきわめて高い親和性を有するクニッツドメイン（表100に挙げた様な）は、残基10、12〜19、21、および32〜42に荷電基を持たない。きわめて高親和性のｈＮＥインヒビターでは、11位には中性または正に荷電した基だけが見られる。きわめて高親和性のｈＮＥインヒビターでは、 31位には中性および負に荷電した基だけがある。親のクニッツドメインが、これまで中性基のみが観測されたこれらのどれかの位置に荷電基を有する場合、ｈＮＥへの結合を改善する次のステップとして、荷電基のそれぞれを表790の可能性基から選んだ非荷電基に交換することが好ましい。同様に、11および19位の負荷電基および31位の正荷電基を表790からえらんだ基で置き換えることが好ましい。高親和性ｈＮＥインヒビターでは、10位にTyr、SerおよびValが見られる。この位置はｈＮＥと接触しないと思われるので、AsnまたはAlaでもよいであろう。高親和性ｈＮＥインヒビターでは、11位にThr、AlaおよびArgが見られる。Glnと Proはクニッツドメイン中の11位にきわめてよく見られるものであり、許容範囲にある。12位はほとんど常にGlyである。12位がGlyでない場合、それをGlyに変えてみることを勧める。今までに製造された高親和性ｈＮＥインヒビターはすべてPro13を有するが、それが必要であるということは示されていない。多くのクニッツドメイン（62.5 ％）はPro13を有する。13位がProでない場合、Proに交換することはｈＮＥの親和性を改善すると思われる。ここはVal、Ala、LeuまたはIleでも許容される。 14位はCysである。14-38のジスルフィド結合が省略された、クニッツドメインときわめてよく似たドメインを作成することが可能である。このようなドメインは、３個の標準ジスルフィドを有する真のクニッツドメインより安定性が低いと考えられる。 15位は好ましくはIleかValである。Ileがより好ましい。ほとんどのクニッツドメイン（82％）は16位にGlyかAlaを有し、これはきわめて重要である。残基16がGlyかAlaでない場合、16位をGlyかAlaに交換するが、Al aが好ましい。非常に強力なｈＮＥインヒビターの17位はPheかMetを有する。Ile またはLeuを有するものはそれほど強力でない。Pheが好ましい。酸化に対する耐性が重要でない場合のみMetを使用すべきである。18位はPheである。高親和性ｈＮＥインヒビターは19位にProかSerを有することが示された。19位のGlnまたはLysも許容される。極めて高い親和性を有するｈＮＥインヒビターでは、21位にTyrまたはTrpが見られる。Pheでもよい。高親和性ｈＮＥインヒビターでは、31位にGln、Glu、およびValが見られる。これは結合のインターフェースの端にあるので、その他の型でも充分作用すると思われるが、塩基性の型（ArgおよびLys）は避けなければならない。高親和性ｈＮＥインヒビターでは、32位にThrおよびLeuが見られる。この残基は直接接触しない亜と思われるので、非荷電型もうまくいくであろう。この場所にはProがきわめて普通である。Serが見られるが、Thrと似ている。Alaは天然クニッツドメインに見られるが、問題を起こしそうにない。33位はクニッツドメインでは常に Pheである。 34位にはｈＮＥに対する高い親和性を保ちながらいろいろなアミノ酸型をおくことができるようである。大きな疎水基（Phe、Trp、Tyr）は適当でない。34位にはValとProが最も好ましい。35-38位は配列Tyr-Gly-Gly-Cysを含む。天然クニッツドメインでは36位の多様性は少ない。BPTI-トリプシン複合体で、Gly36をSe rに変えると、トリプシンに対する結合が減少する。それにもかかわらず、S36と T36はｈＮＥへの結合を妨げず、それを改善することさえある。残基36がGlyでない場合、それをGlyに変えることを考えなければならない。 39位は多様な型を許容する様に思われる。MetとGlnは極めて親和性の高いインヒビターで働いていることが知られている。AlaまたはGlyのいずれも40位に受け入れられるが、Glyが好ましい。天然クニッツドメインでは、Asnは41位で今までで最も普通の型であり、ドメインを安定化する働きがある。42位ではGlyが好ましいが、Alaも許される。最後に、クニッツドメインで高度に保存されている位置を、必要あれば保存型に変えてもよい。例えば、X36G、X37G、X41NおよびX12Gの突然変異は、これらの位置に今までこれらのアミノ酸がなかった場合は望ましい。上記突然変異を表711にまとめる。表711には例えば、15位の残基を（それが何であれ）Ileに変えるか、またはすでにIleである場合はそのままにしておくX15I の形の突然変異が含まれる。突然変異X18F、およびX15IまたはX15Vのいずれか（ X15Iが好ましい）を含むクニッツドメインは、ｈＮＥに対し強い親和性を有する。表711に見られる1から約8までの突然変異で明らかなように、ｈＮＥに対するタンパク質の親和性は、Ｋi が１〜５pMの範囲に近づく様に増加する。配列DPI.1.2は、App-Iの配列からR15I、I18FおよびF34Vの変化により構成され、強力なｈＮＥインヒビターとなるはずである。DPI.1.3は、R15I、M17F（酸化感受性を避けるため）、I18F、P32T、F34VおよびG39Mを有し、より強力なインヒビターとなるはずである。 DPI.2.2は変異R15I、L18FおよびL34VによりTFPI2-D1の配列から誘導され、強力なｈＮＥインヒビターとなるはずである。DPI.2.3は、変異Y11T、R15I、L17F 、L18F、R31Q、Q32T、L34VおよびE39Mによりさらに強力であると思われる。 DPI.3.2はTFPI2-D2から、変異E15I、T18F、S26A（グリコシル化を防ぐため）、K32T、およびF34Vにより誘導され、強力なｈＮＥインヒビターとなる。DPI.3. 3は、変異Δ9a、D11A、D12G、Q13P、E15I、S17F、T18F、E19K、K20R、N24A（グリコシル化を防ぐため）、K32T、F34VおよびΔ42a-42bを有し、より強力であろう。 DPI.4.2はTFPI2-D3から、変異S15I、N17FおよびV18Fにより誘導され、ｈＮＥの強力なインヒビターとなる。DPI.4.3は変異E11T、L13P、S15I、N17F、V18F、A 32T、T34VおよびT36Gを有し、より強力になる。 DPI.5.2はLACI-D1より、変異K15IおよびM18Fにより誘導され、強力なｈＮＥのインヒビターとなり得る。DPI.5.3は変異D10Y、D11T、K15I、I17F、M18FおよびE 32Tのためより強力になる。DPI.5.3を改善する他の変異には、F21W、I34V、E39M およびQ42Gが含まれる。 DPI.6.2の配列は、変異R15VおよびI18Fにより、ヒトLACI-D2の配列から構築される。その他のLACI-D2の配列はｈＮＥと結合の差し障りにならないと思われる。DPI.6.3は、さらに二つの変異 −Y17FとK34V−を持ち、そのため本明細書に開示されたｈＮＥインヒビターに似てくる。LACI-D2 のｈＮＥ結合を改善すると思われる他の変異には、I13P、R32T、およびD10Sが含まれる。DPI.6.4はDPI.6.3にさらに変異N25Aを加えたもので、これはそのタンパク質が白血球細胞中で生産される場合、グリコシル化されるのを防止するためである。グリコシル化を防止する他の置換にはN25K、T27A、T27E、N25S、およびN25Sが含まれる。DPI.6.5は変異I13P、R15V、Y17F、I18F、T19Q、N25A、K34VおよびL39Qによって、1〜5pMの範囲でｈＮＥに親和性を有することが知られているITI-D1、ITI-D2およびBPTI誘導体にさらに近づけたものである。DPI.6.6では、T19QおよびN25Aの変異は復帰している。従って、タンパク質は酵母または他の真核細胞中で、N25でグリコシル化されると思われる。DPI.6.7は変異I13P、R15I、Y17F、I18F、T19P、K34VおよびL39Qを持っている。 DPI.7.2はヒトLACIドメインから、突然変異R15VおよびE18Fにより誘導される。DPI.7.3は突然変異R15V、N17F、E18FおよびT46Kを持っている。T46K突然変異はN44でのグリコシル化を防止する。DPI.7.4は既知の高親和性ｈＮＥインヒビターにさらに似るように、さらに多くの突然変異を持っている。その突然変異はD1 0V、L13P、R15V、N17F、E18F、K34V、S36G、およびT46Kである。DPI.7.5は別なひと揃いの変異、L13P、R15I、N17F、E18F、N19P、F21W、R31Q、P32T、K34V、S3 6GおよびT46Kを持っている。DPI.7.5は真核細胞中でグリコシル化されない。 DPI.8.2はA3コラーゲンクニッツドメインから、変異R15I、D16A、I18F、およびW34Vにより誘導され、強力なｈＮＥインヒビターとなると期待される。DPI.8. 3はA3コラーゲンクニッツドメインから、変異T13P、R15I、D16A、I18F、K20RおよびW34Vにより誘導される。 DIP.9.2はHKI B9クニッツドメインから、変異Q15I、T16A、およびM18Fにより誘導され、強力なｈＮＥインヒビターとなると期待される。DPI.9.3は、変異Q15 I、T16A、M18F、T19P、E31VおよびA34Vのため、より強力である。実施例２３：クニッツドメインのライブラリｈＮＥを強力に阻害することのできる他のクニッツドメインは、ヒトクニッツドメインから、ｈＮＥ阻害配列をヒトドメイン中に置換して、または米国特許第 5,233,409号および関連する特許を用いて誘導することができる。表720は、ヒト LACI-D2をM13 gIIIp上に提示させる遺伝子を示し、特に同じ遺伝子をM13 gVIIIp 、または他のアンカータンパク質（バクテリア外表蛋白（OSPs）等）上に提示するために使用できる。表725はヒトLACI D1を提示させる遺伝子を示す。表730と表735はLACI-D1とLACI-D2の多様化をそれぞれ示す。これらのそれぞれは、一つのセグメントにおける残基10−21の多様化と、別のセグメント中の残基 31−42のそれに分けられる。それぞれの場合で適当なvgＤＮＡが、親型のタンパク質を提示するベクター中に導入され、提示ファージのライブラリは固定化ｈＮＥへの結合で分画される。表遺伝子の残りの部分は対応するファージＭ１３ｍｐ１８中の遺伝子iii と同一である。表１００にあげた配列でｈＮＥを強く阻害するのは、ＥＰＩ-ＨＮＥ-１（＝Ｅpi ＮＥ１）、ＥＰＩ-ＨＮＥ-２、ＥpiＮＥ７、ＥpiＮＥ３、ＥpiＮＥ６、ＥpiＮＥ４、ＥpiＮＥ８、ＥpiＮＥ５、ＥpiＮＥ２、ＢＩＴＩ-Ｅ７-１４１、ＭＵＴＴ２６Ａ、ＭＵＴＱＥ、ＭＵＴ１６１９、ＩＴＩ-Ｄ１Ｅ７、ＡＭＩＮＯ１、ＡＭＩＮＯ２、ＭＵＴＰ１およびＥＰＩ-ＨＮＥ-３、ＥＰＩ-ＨＮＥ-４。表１００にあげた配列でｈＮＥを強く阻害しそうなものは、ＤＰＩ.１.１、ＤＰＩ.１.２、ＤＰＩ.１.３、ＤＰＩ.２.１、ＤＰＩ.２.２、ＤＰＩ.２.３、ＤＰＩ.３.１、ＤＰＩ.３.２、ＤＰＩ.３.３、ＤＰＩ.４.１、ＤＰＩ.４.２、ＤＰＩ.４.３、ＤＰＩ.５.１、ＤＰＩ.５.２、ＤＰＩ.５.３、ＤＰＩ.６.１、ＤＰＩ.６.２、ＤＰＩ.６.３、ＤＰＩ.６.４、ＤＰＩ.６.５、ＤＰＩ.６.６、ＤＰＩ.６.７、ＤＰＩ.７.１、ＤＰＩ .７.２、ＤＰＩ.７.３、ＤＰＩ.７.４、ＤＰＩ.７.５、ＤＰＩ.８.１、ＤＰＩ. ８.２、ＤＰＩ.８.３、ＤＰＩ.９.１、ＤＰＩ.９.２およびＤＰＩ.９.３。表１００中のヒトクニッツドメイン：ＩＴＩ-Ｄ１、ＩＴＩ-Ｄ２、Ａｐｐ-Ｉ、ＴＦＰＩ２-Ｄ１、ＴＦＰＩ２-Ｄ２、ＴＦＰＩ２-Ｄ３、ＬＡＣＩ-Ｄ１、ＬＡＣＩ- Ｄ２、ＬＡＣＩ-Ｄ３、Ａ３コラーゲンクニッツドメイン、およびＨＫＩＢ９ドメイン。合計は全ｐＨ溶離画分から得られた総ｐｆｕまたは負荷との比率各記入値はその区画で得られた負荷量に対する割合合計は全ｐＨ溶離画分から得られた負荷ｐｆｕとの比率の和合計は全ｐＨ溶離画分から得られた総ｐｆｕまたは負荷との比率合計は全ｐＨ溶離画分から得られた総ｐｆｕまたは負荷との比率合計は全ｐＨ溶離画分から得られた総ｐｆｕまたは負荷との比率ＤＮＡはインビボでは二重鎖である直鎖状断片、一方の鎖のみを表示。アミノ酸配列は、インビボでプロセシングされる、ジスルフィド結合を有するタンパク質のものである。ＩＴＩ-Ｄ１は残基２２−７６からなり、残基７７、７７と７８、７７−７９のいずれかを含んでもよい。ＩＴＩ-Ｄ２は残基８０−１３５からなり、残基７９または７８−７９のいずれかを含んでもよい。配列の下の線はジスルフィド結合を示す。Ｐ．パストリスＰＥＹ-３３株によるファーメンター培養の生育とＥＰＩ-ＨＮＥタンパク質の分泌。開始時のメタノール供給制限生育期に続くファーメンター培養の時間的経過を示す。細胞量の増加はＡ₆₀₀で評価した。ファーメンター培養培地中のインヒビタータンパク質の濃度は、表示した時期に採取しアッセイまで−２０℃で保存しておいた無細胞培養培地の希釈液によるｈＮＥ阻害を測定して決定した。Ｐ．パストリスＰＥＹ-４３株によるファーメンター培養の生育とＥＰＩ-ＨＮＥタンパク質の分泌。開始時のメタノール供給制限生育期に続くファーメンター培養の時間的経過を示す。細胞量の増加はＡ₆₀₀で評価した。ファーメンター培養培地中のインヒビタータンパク質の濃度は、表示した時期に採取しアッセイまで−２０℃で保存しておいた無細胞培養培地の希釈液によるｈＮＥ阻害を測定して決定した。タンパク質は決められたｐＨのバッファー中で３７℃で１８時間インキュベートした（本文参照）。全ケースでタンパク質濃度は１μＭであった。インキュベーション時間の終わりに反応物の一部を取って希釈し、残っているｈＮＥ阻害活性を測定した。インヒビターは示されたモル比のクロラミン−Ｔ存在下、室温２０分間インキュベートした。酸化反応はメチオニンを最終濃度４ｍＭまで添加して停止させた。反応停止液中の残存するｈＮＥ阻害活性は酸化剤無添加で観察された活性のパーセンテージとして示した。酸化反応中のタンパク質とその濃度は：ＥＰＩ-ＨＮＥ-１、（５μＭ）；ＥＰＩ-ＨＮＥ-２、（１０μＭ）；ＥＰＩ-ＨＮＥ-３、（１０μＭ）；ＥＰＩ-ＨＮＥ-４、（１０μＭ）；ＡＰＩ、（１０μＭ）；ＳＬＰ、（８．５μＭ）である。タンパク質は記載の温度で１８時間ｐＨ７．０のバッファ中でインキュベートした。全ケースでタンパク質濃度は１μＭであった。インキュベーション時間の終わりに反応物の一部を取って希釈し、残っているｈＮＥ阻害活性を測定した。Ａｌａ₁₀₁は成熟Ｍ１３IIIの最初の残基である。Ａｌａ₁₀₁は成熟Ｍ１３IIIの最初の残基である。１０、１１、１３、１５、１６、１７、１９と２０における多様化は253,400種のアミノ酸配列と589,824種のＤＮＡ配列を与える。３１、３２、３４、３９、４０と４２における多様性は23,328種のアミノ酸配列とＤＮＡ配列を与える。約５．９×１０⁹種のタンパク質配列と１．４×１０¹⁰種のＤＮＡ配列がある。Ａｌａ₁₀₁は成熟Ｍ１３IIIの最初の残基である。６．３７×１０¹⁰種のアミノ酸配列；１．２３８×１０¹¹種のＤＮＡ配列。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者グターマン，ソニア，コソウアメリカ合衆国．02178 マサチューセッツ，ベルモント，オークレイロード 20 (72)発明者ロバーツ，ブルース，リンゼイアメリカ合衆国．01757 マサチューセッツ，ミルフォード，ウィンザーロード 26 (72)発明者マークランド，ウィリアムアメリカ合衆国．01757 マサチューセッツ，ミルフォード，ウィンザーロード 26 (72)発明者ケント，レイチェル，バリボーアメリカ合衆国．01719 マサチューセッツ，ボックスボロー，ストーンヘッジプレイス 60

Claims

【特許請求の範囲】１．５０ピコモル未満のＫi でｈＮＥに結合し阻害する、遺伝子操作されたアプロチニン様クニッツドメインを包含する非天然起源タンパク質であって、前記ドメインは配列EPI-HNE-3、EPI-HNE-4、DPI.1.1、DPI.1.2、DPI.1.3、DPI .2.1、DPI.2.2、DPI.2.3、DPI.3.1、DPI.3.2、DPI.3.3、DPI.4.1、DPI.4.2、DPI .4.3、DPI.5.1、DPI.5.2、DPI.5.3、DPI.6.1、DPI.6.2、DPI.6.3、DPI.6.4、DPI .6.5、DPI.6.6、DPI.6.7、DPI.7.1、DPI.7.2、DPI.7.3、DPI.7.4、DPI.7.5、DPI .8.1、DPI.8.2、DPI.8.3、DPI.9.1、DPI.9.2およびDPI.9.3からなる群より選ばれた参照配列と、最初のシステインから最後のシステインまで伸びる相同領域にわたって、実質的に相同であるアミノ酸配列を包含し、前記ドメインは EpiNEalpha、EpiNE1、EpiNE2、EpiNE3、EpiNE4、EpiNE5、Epi NE6、EpiNE7、EpiNE8、ITI-E7、BITI-E7、BITI-E7-1222、AMINO1、AMINO2、MUTP 1、BITI-E7-141、MUTT26A、MUTQE、およびMUT1619ドメインからなる群から選ばれたどのドメインとも同一でない、非天然起源タンパク質。２．前記領域中で、前記ドメインは参照配列と少なくとも８０％同一であり、前記参照タンパク質配列とは、違っているとしても一つかそれ以上の保存性変異で異なっているにすぎない、請求の範囲第１項に記載のタンパク質。３．前記ドメインが配列EPI-HNE-3、EPI-HNE-4、DPI.1.1、DPI.1.2、DPI.1.3 、DPI.2.1、DPI.2.2、DPI.2.3、DPI.3.1、DPI.3.2、DPI.3.3、DPI.4.1、DPI.4.2 、DPI.4.3、DPI.5.1、DPI.5.2、DPI.5.3、DPI.6.1、DPI.6.2、DPI.6.3、DPI.6.4 、DPI.6.5、DPI.6.6、DPI.6.7、DPI.7.1、DPI.7.2、DPI.7.3、DPI.7.4、DPI.7.5 、DPI.8.1、DPI.8.2、DPI.8.3、DPI.9.1、DPI.9.2およびDPI.9.3からなる群から選ばれる配列と同一であるアミノ酸配列を包含する、請求の範囲第２項に記載のタンパク質。４．前記ドメインが天然起源アプロチニン型クニッツドメインとは、少なくとも突然変異X18Fと、X15VおよびX15Iからなる群から選ばれた突然変異で異なる、請求の範囲第１項に記載のタンパク質。５．前記ドメインが天然起源アプロチニン型クニッツドメインとは、［X16A、 X16G］；［X17F、X17L、X17I、X17M］；［X19P、X19Q、X19K、X19S］；X13P；［ X34V、X34P］；［X39Q、X39M］；［X32T、X32L］；［X31Q、X31E、X31V］；［X1 1T、X11A、X11R］；［X10Y、X10S、X10V］；［X40G、X40A］；X36G；X37Gおよび X12Gからなる群から選ばれた少なくとも一つの変異で異なる、請求の範囲第４項に記載のタンパク質。６．最初のシステインから最後のシステインまで伸びる相同領域内で、遺伝子操作されたドメインと、最も類似した天然起源アプロチニン様クニッツドメインとの間のアミノ酸配列の数の差が４個以下である、請求の範囲第１項に記載のタンパク質。７．前記ドメインが配列EPI-HNE-3とEPI-HNE-4からなる群から選ばれるアミノ酸配列を包含する、請求の範囲第１項に記載のタンパク質。８．請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を包含するＤＮＡ分子。９．請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡコード配列を包含する発現ベクターであって、前記コード配列は機能するよう制御ＤＮＡ配列に連結されており、それにより前記コード配列が前記タンパク質を生産するために適切なホスト中で発現される発現ベクター。１０．請求の範囲第９項に記載の発現ベクターを包含する形質転換細胞であって、前記細胞は前記コード配列の発現に連結する条件下、前記調節配列の制御下で前記タンパク質を生産する形質転換細胞。１１．前記コード配列の発現に連結する条件下で請求の範囲第１０項に記載の形質転換細胞を培養し、それにより前記タンパク質を前記細胞により生産することを包含する、ｈＮＥ阻害活性を有するタンパク質の製造方法。１２．細胞がピチア・パストリス（Pichia pastoris）の細胞である、請求の範囲第１１項に記載の方法。１３．ある場所においてｈＮＥ活性を阻害する方法であって、請求の範囲第１項に記載のタンパク質の阻害量をその場所に導入することを包含する阻害方法。１４．その場所が動物中で過剰ｈＮＥ活性を有する部位である請求の範囲１３項に記載の方法。１５．その動物がヒトである請求の範囲第１４項に記載の方法。