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Diese
Erfindung bezieht sich auf eine künstliche Human-Antithrombinvariante,
die in Abwesenheit von Heparin eine hohe proteaseinhibitorische
Aktivität
besitzt. Spezieller bezieht sich die Erfindung auf eine Human-Antithrombinvariante,
welche nach der Heparinbindung eine dreidimensionale Struktur besitzt,
wobei die dreidimensionale Struktur des natürlichen Human-Antithrombinmoleküls mit einem
gentechnischen Verfahren modifiziert wird. Die Variante der Erfindung
kann beispielsweise zur Behandlung von DIC, thrombotischen Krankheiten
oder Gestose verwendet werden.
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Es
ist bekannt, dass in natürlichem
Antithrombin verschiedene Arten von Antithrombinaktivitäten vorliegen,
und es wurden die Antithrombine I bis VI vorgeschlagen. Unter Berücksichtigung
der Tatsache, dass bislang jedoch nur Antithrombin III als Protein
isoliert wurde, wird Antithrombin III heute einfach als Antithrombin
bezeichnet. In Bezug auf diese Erfindung wird demgemäß Antithrombin
III hierin nachstehend als Antithrombin bezeichnet.
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Natürliches
Human-Antithrombin ist ein einsträngiges Glycoprotein mit einem
Molekulargewicht von 58.000, welches eine inhibitorische Aktivität auf Proteasen
im Blutgerinnungssystem besitzt. Natürliches Human-Antithrombin
wird als ein Vorläuferprotein,
das aus 464 Aminosäureresten
besteht, biosynthetisiert, wobei aber im Verlauf der Sekretion ein
Signal-Peptid, das aus 32 Resten besteht, abgespalten wird. Somit
setzt sich das reife Human-Antithrombin, das in den Blutgefäßen zirkuliert,
aus 432 Aminosäureresten
zusammen. Jeder der sechs Cysteinreste (Cys) bildet Disulfidbindungen
und das Human-Antithrombinmolekül wird an
drei Stellen Cys8–Cys128,
Cys21–Cys95
und Cys247–Cys430
mit den S-S-Brücken
stabilisiert. Natürliches
Human-Antithrombin enthält
ungefähr
15% Zucker, und Zuckerketten des Komplex-Typs sind an vier Positionen (Asn96,
Asn135, Asn155 und Asn192) an Asparaginreste gebunden. Die Stelle
im Molekül
des natürlichen
Human-Antithrombins, die direkt mit dem aktiven Zentrum der Protease
interagiert und sich an dieses bindet, wird eine reaktive Stelle
genannt, welche Arg393–Ser394
ist und sich in der Nähe
des C-terminalen Endes der Peptidkette befindet.
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Natürliches
Human-Antithrombin ist ein Plasmaprotein, das wie α1-Antitrypsin
und Heparin-Cofactor II zu einer Superfamile der Serpine gehört, und
ein wesentlicher Regelfaktor im Blutgerinnungssystem ist, welcher
die Aktivitäten
von Haupt-Gerinnungsenzymen
wie Thrombin, aktiviertem Faktor X (Faktor Xa), aktiviertem Faktor
IX (Faktor Ixa) usw., reguliert. Das natürliche Human-Antithrombin mit
solchen pharmakologischen Aktivitäten wurde zur Normalisierung
von abnormal beschleunigter Gerinnung, spezieller, der disseminierten intravasculären Koaglation
(DIC) und der Gestose, deren hauptsächliche Symptome Bluthochdruck,
Proteinurie und Ödeme
während
der Schwangerschaft sind, sowie zum Behandeln von Hyperthrombopoiesis,
welche sich von angeborenem Human-Antithrombinmangel ableitet, verwendet.
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Es
ist gut bekannt, dass natürliches
Human-Antithrombin eine hohe Affinität für Heparin besitzt, und dass
in Anwesenheit von Heparin die Inhibitionsgeschwindigkeiten für Thrombin
und den Faktor Xa auf das 1000-fache bzw. 300-fache beschleunigt
werden können.
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Bislang
durchgeführte
Analysen der Primärstrukturebenen
haben gezeigt, dass sich eine Heparinbindungsstelle in der N-terminalen Region
des natürlichen
Human-Antithrombins befindet und sich die proteasereaktive Stelle
in der Nähe
des C-terminalen
Endes (Arg393–Ser394)
befindet. Zudem stellen 5–10%
des natürlichen
Human-Antithrombins im Blut eine moleku lare Spezies dar, worin keine
Zuckerkette an Asn135 gebunden ist (Human-Antithrombin β), und diese
Spezies weist eine höhere
Heparinaffinität
auf als eine dominante molekulare Spezies (Human-Antithrombin α).
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Das
natürliche
Human-Antithrombinmolekül
ist, wie andere Serpine im Blut, ein Protein, das in einer dreidimensionalen
Struktur mehrere Stränge
(hierin nachstehend mit s1A–s4C
abgekürzt),
zusammengesetzt aus antiparallelen β-Blättern, welche grob den drei
Richtungen A, B und C zugeordnet sind, neun α-Helices (hierin nachstehend mit hA–hI abgekürzt) und
einen Coil-Strukturrest umfasst (Stein PE, Carrell RW, Nature Struct
Biol 2: 96, 1995). Unlängst
haben Berichte über
die Röntgenkristallstruktur
der nativen Form und der latenten Form der Antithrombin-Dimere bei
2,6 Å (Skinner
R., et al., J. Mol. Biol. 266: 601, 1997) und über die Kristallstrukturen
eines Pentasaccharid-Komplexes des Kernrests eines hoch-affinen
Heparins bei 2,9 Å (Jin L.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94: 14683, 1997) eine dreidimensionale
interagierende Stelle von natürlichem
Human-Antithrombin mit Heparin, und eine durch Heparinbindung verursachte
dynamische Strukturveränderung
im Antithrombinmolekül
gezeigt.
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Auf
der Grundlage dieser dynamischen Strukturveränderungen im natürlichen
Human-Antithrombinmolekül
erkannte der Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass Human-Antithrombin
als Inhibitor in Abwesenheit von Heparin ein "unvollständiges" Serpin darstellt, und es nur in Gegenwart
von Heparin zu einem "vollständigen" Inhibitor werden
würde.
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Auf
Grundlage dieser bisher gewonnenen Erkenntnisse wurde durch Austauschen
von Aminosäuren/einer
Aminosäure
an den bestimmten Positionen/der bestimmten Position in natürlichem
Human-Antithrombin die Herstellung einer Human-Antithrombinvariante
versucht, die sogar in Abwesenheit von Heparin eine hohe proteaseinhibitorische
Aktivität
besitzt. Beispielsweise ist eine Human-Antithrombinvariante beschrieben,
worin in natürlichem
Human-Antithrombin eine, zwei oder mehrere der Aminosäuren in
den Positionen 49, 96, 135, 155, 192, 393 und 394 durch andere Aminosäuren ersetzt
sind (Japanisches Patent Kokai Nr.
262598/1990 ). Ebenso ist eine
andere Human-Antithrombinvariante
bekannt, worin wenigstens eine der Aminosäuren in vier Regionen der Positionen
11–14,
41–47,
125–133
und 384–398,
in den entsprechenden Regionen alleine oder in Kombination, durch
andere Aminosäuren
ersetzt ist (Japanisches Patent Kokai Nr.
339292/1993 ). Da diese Varianten
nicht immer eine befriedigende Wirkung aufweisen, besteht weiterhin
ein Bedarf zur Herstellung einer Human-Antithrombinvariante, welche
in Abwesenheit von Heparin eine noch stärkere proteaseinhibitorische
Aktivität
besitzt.
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Zweck
der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue Human-Antithrombinvariante
bereitzustellen, welche in Abwesenheit von Heparin als ein vollständiger Inhibitor
wirken kann und eine hohe proteaseinhibitorische Aktivität aufweist.
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Wenn
natürliches
Human-Antithrombin als ein Proteaseinhibitor wirkt, findet eine
große
Konformationsveränderung
in der reaktiven Schleife des Human-Antithrombins statt. Spezieller
wird die aus der Moleküloberfläche des
natürlichen
Human-Antithrombins
herausragende reaktive Schleife als ein "Substrat" der Zielprotease erkannt und die Peptidbindung
an der reaktiven Stelle [P1 (Arg393)-P1' (Ser394)] wird durch die Protease gespalten.
Zu diesem Zeitpunkt wird eine Acylbindung zwischen dem Kohlenstoff
der Carbonylgruppe von Arg393 bei P1 und dem Sauerstoff der Hydroxylgruppe
des aktiven Zentrums Ser195 der Protease gebildet, wobei ein Acyl-Enzym-Komplex
gebildet wird, und gleichzeitig 15 Reste (P1–P15) am N-terminalen Ende der gespaltenen reaktiven
Schleife zwischen s3A und s5A eingefügt werden, um einen neuen Strang
(s4A) zu bilden. An diesem Punkt verschiebt sich Arg393 zusammen
mit der Protease, um ungefähr
70 Å im
Human-Antithrombinmolekül
von einem Ende zum anderen. Es wird vermutet, dass zum Bilden eines
stabilen Komplexes mit einer Protease diese dynamische Veränderung
von Bedeutung ist. Es wurde auch eine latente Form des natürlichen
Human-Antithrombins oder Plasminogen-Aktivator-Inhibitors 1 gefunden, worin
die reaktive Stelle als s4A in das Molekül eingefügt ist, obwohl nicht gespalten
wurde. Aufgrund dieser Fakten kann angenommen werden, dass eine
stabile Struktur von Serpin auf der Bildung von s4A beruht.
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Da
die reaktive Schleife von natürlichem α-Antitrypsin
vollständig über die
Moleküloberfläche hinausragt
und die Seitenkette von Met358 im Molekül bei P1 nach außen gerichtet
ist, um eine komplementäre
Konformation zur aktiven Stelle der Serinprotease zu bilden, ist
die Reaktivität
mit Protease hoch und es ist wahrscheinlich, dass die intramolekulare
Einfügung
der reaktiven Schleife nach der Spaltung auftritt. Da die Seitenkette
von Arg393 bei P1 des natürlichen
Human-Antithrombins im Molekül
jedoch nach innen gerichtet ist, ist die Reaktivität mit der
Protease außerordentlich
gering (Jun L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 14683, 1997).
Die Aufmerksamkeit des Erfinders der vorliegenden Erfindung wurde
auf eine noch wichtigere Tatsache gelenkt, dass die reaktive Schleife
in natürlichem
Human-Antithrombin in die Stränge
bei P14 (Ser380) und P15 (Gly379) eingefügt ist, was eine Verformung
der Stränge
ergibt und auch die Einfügung
der abgespaltenen Schleife schwierig gestaltet. Das Binden von Heparin
an natürliches
Human-Antithrombin verursacht Konformationsveränderungen an zahlreichen Stellen
des Human-Antithrombinmoleküls,
und die Aminosäuren
bei P14 (Ser380) und P15 (Gly379) könnten durch einen allosterischen
Effekt (einen sterischen Behinderungseffekt) des Heparinbindens
aus dem Strang herausgedrückt
werden und an den gleichen Ort wie im α- Antitrypsin verschoben werden (Jin L.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 14683, 1997).
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Der
Erfinder der vorliegenden Erfindung hat die Konformationsveränderung
in den entsprechenden reaktiven Schleifen des vorstehenden Human-Antithrombins,
des Plasminogen-Aktivator-Inhibitors 1 und des α1-Antitrypsins
analysiert und untersucht, und hat festgestellt, dass P14 (Ser380)
in natürlichem
Human-Antithrombin
eine Schlüsselstelle
zum Aufbauen einer geeigneten dreidimensionalen Struktur darstellt,
welche als vollständiger
Inhibitor mit einer hohen proteaseinhibitorischen Aktivität bei Abwesenheit
von Heparin wirkt. Zudem hat der Erfinder der vorliegenden Erfindung
unter Berücksichtigung,
dass die Stelle von P15–P10
in der reaktiven Schleife von natürlichem Human-Antithrombin
als "Proximal Hinge"-Region bezeichnet
wird, ihre dreidimensionale strukturelle Erscheinung in Human-Antithrombin untersucht
und festgestellt, dass diese Proximal Hinge-Region eine Rolle als
Gelenk spielt, wenn die reaktive Schleife als s4A einverleibt wird.
Basierend auf dieser Erkenntnis hat der Erfinder der vorliegenden
Erfindung festgestellt, dass die Stelle bei P16 (Glu378), welche
der Basis dieses Gelenks entspricht, auch eine Stelle ist, die zusammen
mit der Stelle bei P14, zur Herstellung einer Human-Antithrombinvariante
mit einer angemessenen dreidimensionalen Struktur und einer hohen
proteaseinhibitorischen Aktivität
durch eine andere geeignete Aminosäure ersetzt werden muss.
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Andererseits
ist bekannt, dass die reaktive Schleife in natürlichem Human-Antithrombin
als s4A zwischen s3A und s5A in das Molekül eingefügt wird, wenn mit einer Protease
gespalten wird, und dass die Region, welche am Öffnen dieser Stränge mitwirkt
die Verschlussregion ist, worin sich hB (Ser79–Thr90) im Zentrum befindet
(Stein PE, Carrel RW, Nature Struct Biol 2: 96, 1995). Der Erfinder
der vorliegenden Erfindung hat festgestellt, dass beim Öffnen zwischen
s3A und s5A die Was serstoffbindungen zwischen beiden Strängen zuerst
gespalten werden und diese Stränge
dann über
die Furche von hB gleiten und, dass ein "einfacheres öffnen" dieser Region mit einem "einfacheren Einfügen" der reaktiven Schleifen
in Verbindung steht. Zusammenfassend ist die Verschlussregion im
natürlichen
Human-Antithrombin eine wichtige Region, welche das öffnen und
das Schließen
zwischen s3A und s5A beeinflusst und weiter das Binden von Heparin
und die Aktivität von
Antithrombin beeinflusst. Der Erfinder der vorliegenden Erfindung
hat in der Folge festgestellt, dass eine Human-Antithrombinvariante,
die eine dreidimensionale Struktur mit einer hohen proteaseinhibitorischen
Aktivität
besitzt, durch Ersetzen der Aminosäure in der Position 78 (Leu78),
welche der Basis der Verschlussregion entspricht, mit einer anderen
Aminosäure,
hergestellt werden kann.
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Dann
hat der Erfinder der vorliegenden Erfindung die dynamischen Strukturveränderungen
in natürlichem
Human-Antithrombin und die Begünstigung
der proteaseinhibitorischen Aktivität, welche durch die Heparinbindung
verursacht werden, insbesondere die dreidimensionale Struktur jeder
Aminosäure
in der heparinbindenden Region, analysiert und untersucht. Bisher
wurde, basierend auf der Analyse von abnormen Fällen wie TOYAMA-Antithrombin, worin
Arg in Position 47 durch Cys ersetzt ist (Koide T., Takahashi K.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 289, 1984), oder chemischen
Modifizierungsversuchen sowie der Analyse von Varianten, die durch
Stellungs-spezifische Mutagenese hergestellt wurden, gezeigt, dass
die Heparinbindende Region in natürlichem Human-Antithrombin
aus einer Gruppe von grundlegenden Aminosäureresten besteht, welche sich
bei hA und hD befinden. Die vorstehend erwähnte Röntgenanalyse der Kristallstruktur
(Jin L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 14683, 1997) hat
gezeigt, dass sich die von Heparin abgeleiteten Pentasaccharid-Bindungsstellen
in natürlichem
Human-Antithrombin in hD (Seitenketten von Lys125 und Arg129), in
hA (Seitenketten von Arg46 und Arg47 und Hauptkettenamid von Asn45),
im N-terminalen Bereich (Seitenketten- und Hauptkettenamide von
Lys11 und Arg13), und im Hauptkettenamid von Glu113 und den Seitenketten-
und Seitenkettenamiden von Lys114 in der "P-Helix" (P leitet sich von Pentasaccharid ab)
befinden, welche zwischen hC–hD
durch Binden von Pentasaccharid gebildet wird. Wenn Kontakt mit
Pentasaccarid hergestellt wird, verschieben sich Arg46 und Arg47
um 17 Å bzw.
8 Å, um
eine Wasserstoffbindung mit der Sulfatgruppe der Zuckerkette zu
bilden. Darüber
hinaus ist hD in einem Winkel von etwa 10 Grad gegen die Druckrichtung
von s2A und s3A geneigt und die Coil-Struktur von Glu113–Gln118 an seiner N-terminalen
Seite ist zu einem zweifach verdrehten hP gegen die rechtwinkelige
Richtung von hD modifiziert. Darüber
hinaus wird auch eine eineinhalbfach verdrehte Helix an den C-terminalen
Seiten von hD derart gebildet, dass die Seitenketten von Arg132,
Lys133 und Lys136 in Richtung der Pentasaccharidbindungsstelle ausgerichtet
sind. Diese Reste sind weit von den Pentasacchariden entfernt und
daher wird keine Wasserstoffbindung zwischen ihnen gebildet, aber
es ist für
diese Reste in hohem Maße
möglich,
mit einem langkettigen Heparin zu interagieren. In dieser nativen
Form des Human-Antithrombins sind darüber hinaus die Aminosäurereste
bei P14 und P15 in der gehinderten reaktiven Schleife durch einen
allosterischen Effekt, der durch Verlängerung von hD verursacht wird,
herausgepresst und die Verwindung der Stränge wird beseitigt und gleichzeitig
wird die Seitenkette von Arg393 bei P1 nach außen aus dem Molekül gerichtet,
welches sich in eine Form umwandelt, die als Inhibitor wirken kann
(Pike RN, et al., J. Biol. Chem. 272: 19652, 1997). Darüber hinaus
verschiebt sich die N-terminale Region von Human-Antithrombin (Ile22-Arg46) in hohem
Maße,
wenn sie an Pentasaccharid gebunden wird, und spielt somit eine
Rolle als sterisches Tor zum Stabilisieren eines Antithrombin-Pentasaccharidkomplexes
(Fittom HL., et al., Protein Science 7: 782, 1998). Beim Vergleichen
der dreidimensionalen Strukturen der nativen Form und der latenten
Form von natürlichem
Human-Antithrombin
ist hD der nativen Form leicht verdreht, die Heparin-bindende Stelle
Arg47, Lys125 und Arg129 ist in Richtung der Pentasaccharid-bindenden
Region ausgerichtet und die Nε-Gruppe von Arg129
bildet eine Wasserstoffbindung mit der Seitenkette von Asp278, um
diese Seitenkette zu stabilisieren, was die ionische Interaktion
mit den Sulfatgruppen des Pentasaccharids erleichtert. In der latenten
Form verlängert
sich hD jedoch geradeaus, Arg47 und Lys125 bilden Wasserstoffbindungen
mit Ser112 bzw. Ile7, und alle Aminosäurereste-Regionen, welche für das Binden von Heparin bedeutsam
sind, sind nicht in Richtung der Heparin-bindenden Regionen ausgerichtet
(Skinner R., et al., J. Mol. Biol. 266: 601, 1997). In Anbetracht
dessen hat der Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass
die dreidimensionale Struktur sogar in Abwesenheit von Heparin durch
vorhergehende Spaltung einer Wasserstoffbindung zwischen Arg129
und Asp278 in eine Konformation ähnlich
zu jener in Gegenwart von Heparin verändert werden kann. Basierend
auf dieser Feststellung erkannte der Erfinder der vorliegenden Erfindung,
dass das Ersetzen der Aminosäure
in Position 278 (Asp278), welche über eine Wasserstoffbindung
an Arg129 gebunden ist, mit einer anderen Aminosäure, eine Antithrombinvariante
liefern kann, welche eine geeignete dreidimensionale Struktur mit
einer hohen proteaseinhibitorischen Aktivität besitzt.
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Wie
vorstehend erläutert
hat der Erfinder der vorliegenden Erfindung die Informationen über die
dynamische Konformationsveränderung
von Antithrombin infolge der Heparinbindung an natürliches
Human-Antithrombin wie zuvor analysiert, und als ein Ergebnis eine
bevorzugte zu modifizierende oder zu verändernde Stelle in der dreidimensionalen
Struktur gefunden, um die proteaseinhibitorische Aktivität von natürlichem
Human-Antithrombin zu begünstigen.
Spezieller ist der Erfinder der vorliegenden Erfindung zum Schluss
gelangt, dass der Ersatz durch eine, zwei oder mehrere andere Aminosäuren in
der Gelenks-Region
der reaktiven Schleife von natürlichem
Human-Antithrombin, der s4A bildenden Gelenks-Region, sowie an jenen
Stellen, die an der Heparinbindung beteiligt sind, eine Human-Antithrombinvariante
herstellen kann, die eine geeignete dreidimensionale Struktur mit
einer hohen proteaseinhibitorischen Aktivität besitzt. Der Erfinder der
vorliegenden Erfindung hat ernsthafte Untersuchungen zur Verbesserung
von Human-Antithrombinvarianten auf Grundlage der vorstehend erwähnten Schlussfolgerung
betrieben und war schließlich
erfolgreich beim Herstellen einer neuen Human-Antithrombinvariante,
die eine passende dreidimensionale Struktur für eine hohe proteaseinhibitorische
Aktivität
aufweist, wonach diese Erfindung fertig gestellt wurde.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Human-Antithrombinvariante,
worin die Aminosäure
in Position 278 in der Aminosäuresequenz
von natürlichem
Human-Antithrombin mit der Aminosäure, ausgewählt aus Gly, His und Tyr, ersetzt
ist.
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Darüber hinaus
bezieht sich die Erfindung auf eine DNA, welche für diese
Human-Antithrombinvariante codiert.
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1 zeigt
den Aufbau eines Expressionsvektors für eine rekombinante Antithrombinvariante
(AT) (im Fall von Ser380His).
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Die
neue Antithrombinvariante der Erfindung wurde durch Stellungs-spezifische
Mutagenese als eine Variante, welche eine dreidimensionale Struktur
besitzt, die ähnlich
zu jener nach dem Binden an Heparin ist, hergestellt.
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Die
Erfindung wird spezieller durch das bestimmte Verfahren für die Herstellung
einer Variante, wie hierin nachstehend ausgeführt, erläutert.
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Zu
2,5 μg (10 μg) cDNA (einsträngig) der
nativen Form von Antithrombin wurden 30 μg eines Varianten-Primers (0,475
OD/ml) zur Aminosäuresubstitution
anelliert, um eine cDNA in vollständiger Länge mit DNA-Polymerase zu synthetisieren.
Dann wurde die Nukleotid-Sequenz bestimmt, um die Bildung der Variante zu
bestätigen.
Für jede
Antithrombinvariante wurde cDNA (1,4 kb) in die EcoRI-Stelle des
pcD2-Vektors integriert und dann mit EcoRI und PstI gespalten, um
die Richtung der eingefügten
Sequenz zu bestätigen.
Der Vektor mit der in der richtigen Richtung integrierten Sequenz
wurde in BHK-Zellen für
eine Herstellung in großem
Maßstab
mit einer Kalziumphosphatmethode (1) transfisziert.
Die neomycinresistenten, stabil exprimierenden Zellen wurden mit
G418 ausgewählt
und konzentriert. Die konzentrierten, stabil exprimierenden BHK-(Babyhamster-Nieren-)Zellen
wurden zur Durchführung
von Pulse-Chase-Versuchen
verwendet. 5 × 105 Zellen wurden auf eine Schale mit 35 mm
Durchmesser platziert und über
Nacht kultiviert. Sie wurden während 30
Minuten mit 6,8 μg
EXRE35S35S (100 μCi/ml)
markiert. Dann wurde die Kulturlösung
durch DME/10% FCS, Met, Cys ausgetauscht und dann wurde der Chase-Versuch
während
8 Stunden ausgeführt,
um Kulturmedien (CM) und Zellextrakte (CE) nach 0, 0,5, 1, 2, 4
und 8 Stunden zu erhalten. Die CM und CE wurden zu jedem Zeitpunkt
mit einem Antikörper
und StaphylosorbTM immunpräzipitiert,
dann wurde 8% SDS-PAGE (+SH) ausgeführt, und die Radioaktivität in den
erhaltenen RI-Banden wurde gemessen, um die ausgeschiedenen Mengen
der rekombinanten Antithrombinvariante zu bestimmen.
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Für die Zelle,
welche eine große
Menge der Antithrombinvariante sekretiert, wurde das CM nach 8 Stunden
Chase-Versuch gesammelt. Zu 500 μg
der gesammelten Flüssigkeit
wurde Thrombin oder Faktor Xa zugesetzt und nach dem Umsetzen bei
37°C während 5
Minuten oder 60 Minuten ohne Heparin, oder während 5 Minuten mit Heparin,
wurde eine Immunpräzipitation
durchge führt
und die Menge des Komplexes mit 10% SDS-PAGE (+SH) bestimmt.
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1) Sekretion
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Die
Sekretion aus BHK-Zellen von jeder rekombinanten Antithrombinvariante
sind in Tabelle 1 zusammengefasst, welche die intrazellulären und
sekretierten Mengen nach 8 Stunden Chase-Versuch, unter der Annahme,
dass die Radioaktivität
im Pulse-Markieren 100% beträgt,
zeigt. Eine sekretierte Menge des Nativ-Typs des rekombinanten Antithrombins
betrug 89%, wohingegen die Leu78Phe-Variante, worin Leu bei Position
78 durch Phe ersetzt war, eine sekretierte Menge von 90% zeigte.
Die Variante, worin Asp bei Position 278 durch Ala, Gly, His oder
Tyr (Asp278Ala, Asp278Gly, Asp278His oder Asp278Tyr) ersetzt war,
zeigte eine Sekretion von 104%, 104%, 165% bzw. 160%, welche höher war
als jene des rekombinanten Antithrombins des Nativ-Typs.
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Andererseits
zeigte die Variante, worin Asp bei Position 278 durch Arg, Asn oder
Val (Asp278Arg, Asp278Asn oder Asp278Val) ersetzt war, eine Sekretion
von 57%, 48% bzw. 51%. Eine zufriedenstellende Sekretion war bei
allen Varianten gegeben, worin Ser bei Position 380 durch Ala, Arg,
Asn, Asp, Gly, His, Pro, Thr, Tyr oder Val (Ser380Ala, Ser380Arg,
Ser380Asn, Ser380Asp, Ser380Gly, Ser380His, Ser380Pro, Ser380Thr,
Ser380Tyr oder Ser380Val) ersetzt war. Insbesondere die Varianten,
bei welchen mit Asn und Val ersetzt wurde, lieferten eine hohe Sekretion
von 154% bzw. 144%.
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2) Komplexbildungsvermögen mit Thrombin (TAT)
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Die
Ergebnisse der Versuche zum Thrombin-Antithrombinkomplex-(TAT)-Bildungsvermögen von
jeder rekombinanten Antithrombinvariante sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Das sofortige TAT-Bildungsvermögen in Abwesenheit
von Heparin, welches die bedeutendste Wirkung der Erfindung ist,
betrug 131% für
die Leu78Phe-Variante, worin Leu bei Position 78 durch Phe ersetzt
war, 163% für
die Asp278His-Variante, worin Asp bei Position 278 durch His ersetzt
war, und 171% und 172% für
die Ser380Gly- und Ser380Tyr-Varianten, worin Ser bei Position 380
durch Gly bzw. Tyr ersetzt war, ausgedrückt als relativer Wert, wenn
das TAT-Bildungsvermögen
eines nativen Typs der Rekombinanten als 100% definiert ist, und
Varianten mit einer größeren Wirksamkeit
als jene eines nativen Typs der Rekombinanten wurden in jedem Fall
bereitgestellt. Bei der Interaktion mit Thrombin über einen
verlängerten
Zeitraum (120 Minuten) zeigten zudem, wie in Tabelle 2 gezeigt,
die Leu78Phe-, Asp278His und Ser380Ala-Varianten das gleiche Ausmaß an stabilem
TAT-Bildungsvermögen
wie der native Typ des rekombinanten Antithrombins, und die Asp278Ala-,
Asp278Val-, Asp278Tyr-, Ser380Gly- und Ser380Tyr-Varianten zeigten
ein höheres
Ausmaß an
stabilem TAT-Bildungsvermögen
als der native Typ des rekombinanten Antithrombins.
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Zudem
konnten alle Varianten das sofortige TAT-Bildungsvermögen in Gegenwart
von Heparin behalten, und haben sich auch als ein wirksames antithrombotisches
Mittel, um in Kombination mit Heparin verwendet zu werden, gezeigt.
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3) Komplexbildungsvermögen mit Faktor Xa (Xa-AT)
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Die
Ergebnisse der Untersuchungen über
das Faktor-Xa-Antithrombinkomplex-(Xa-AT)-Bildungsvermögen von
jeder rekombinanten Antithrombinvariante mit Faktor Xa (Xa-AT) werden
in Tabelle 3 zusammengefasst. Das sofortige Xa-AT-Bildungsvermögen in Abwesenheit
von Heparin, welches die bedeutendste Wirkung dieser Erfindung ist,
betrug 106% für
die Leu78Phe-Variante, worin Leu bei Position 78 durch Phe ersetzt war,
ausgedrückt
als relativer Wert, wenn das Xa-AT-Bildungsvermögen von einem Nativ-Typ der
Rekombinanten als 100% definiert ist. Ebenso wurden Werte von 144%,
171% und 131% in den Fällen
der Asp278Gly-, Asp278His- und Asp278Tyr-Varianten erhalten, worin Asp
bei Position 278 durch Gly, His bzw. Tyr ersetzt war, und in jedem
Fall konnten jene Varianten mit einer höheren Wirksamkeit als ein rekombinantes
Antithrombin des Nativ-Typs erhalten werden. Zudem zeigten bei der
Interaktion mit dem Faktor Xa über
einen verlängerten Zeitraum
(60 Minuten) die Leu78Phe-, Asp278Gly-, Asp278His- und Ser380Tyr-Varianten
das gleiche Ausmaß an
stabilem TAT-Bildungsvermögen
wie der Nativ-Typ
der Rekombinanten, und die Asp278Val-, Asp278Tyr- und Ser380Gly-Varianten
zeigten ein höheres
Ausmaß an
stabilem TAT-Bildungsvermögen
als das rekombinante Antithrombin des Nativ-Typs.
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Zudem
war das sofortige Xa-AT-Bildungsvermögen in Gegenwart von Heparin
in den Fällen
der Leu78Phe-, Asp278Ala- und Asp278Gly-Varianten, verglichen mit
rekombinantem Antithrombin des Nativ-Typs, um ungefähr die Hälfte verringert,
und dies hat die Wirksamkeit dieser Varianten als nicht-heparinabhängiger Inhibitor
für den
Faktor Xa mit einer hohen Wirksamkeit unter Beweis gestellt. Andererseits
haben die Asp278Val-, Asp278Tyr-, Ser380Gly-, Ser380Thr- und Ser380Tyr-Varianten das sofortige
TAT-Bildungsvermögen
in Gegenwart von Heparin beibehalten, und dabei ihre Wirksamkeit
als ein antithrombotisches Mittel, um in Kombination mit Heparin
verwendet zu werden, unter Beweis gestellt.
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Tabelle 1 Sekretion der AT-rekombinanten
Variante
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Intrazellulare
und ausgeschiedene Mengen nach 8 Stunden Chase-Versuch, wobei die Radioaktivität im Pulse-Markieren
mit 100% angenommen wird.
| Rekombinarite | Intrazellulare
Menge (%) | Sekretierte
Menge (%) | Gesamt |
| Nativ | 1,4 | 89 | 90,4 |
| Leu78Phe | 10 | 90 | 100 |
| Asp278Ala | 16 | 104 | 120 |
| AsP278Arg | 4,6 | 57 | 61,6 |
| Asp278Asn | 4,9 | 48 | 52,9 |
| AsP278Gly | 22 | 104 | 126 |
| AsP278His | 9,2 | 165 | 174,2 |
| Asp278Tyr | 16 | 160 | 176 |
| AsP278Val | 4,6 | 51 | 55,6 |
| Glu378Lys | 15 | 62 | 77 |
| Ser380Ala | 4,9 | 79 | 83,9 |
| Ser380Arg | 10 | 73 | 83 |
| Ser380Asn | 38 | 154 | 192 |
| Ser380Asp | 10 | 83 | 93 |
| Ser380Gly | 6,1 | 128 | 134,1 |
| Ser380His | 8,3 | 120 | 128,3 |
| Ser380Pro | 30 | 63 | 93 |
| Ser380Thr | 13 | 122 | 135 |
| Ser380Tyr | 11 | 78 | 89 |
| Ser380Val | 17 | 144 | 161 |
Tabelle 2 TAT-Komplexbildung durch die
AT-rekombinante Variante
| Rekombinantes
AT | TAT
(%) (–)
Heparin, 5 min. | TAT
(%) (–)
Heparin, 120 min. | TAT
(%) (+) Heparin, 5 min. |
| Nativ | 100 | 100 | 100 |
| Leu78Phe | 131 | 93 | 81 |
| Asp278Ala | 102 | 108 | 99 |
| Asp278His | 163 | 95 | 89 |
| Asp278Val | 90 | 108 | 104 |
| Asp278Tyr | 105 | 106 | 104 |
| Ser380Ala | 56 | 86 | 118 |
| Ser380Gly | 171 | 112 | 98 |
| Ser380Tyr | 172 | 122 | 111 |
-
Wert,
ausgedrückt
als relativer Wert, wenn das TAT-Bildungsvermögen von rekombinantem AT des Nativ-Typs
als 100% definiert ist. Tabelle 3 Xa-AT-Komplexbildung durch die
AT-rekombinante Variante
| Rekombinantes
AT | Xa-AT
(%) (–)
Heparin, 5 min. | Xa-AT
(%) (–)
Heparin, 120 min. | Xa-AT
(%) (+) Heparin, 5 min. |
| Nativ | 100 | 100 | 100 |
| Leu78Phe | 106 | 88 | 53 |
| Asp278Ala | 80 | 56 | 44 |
| Asp278Gly | 144 | 87 | 54 |
| Asp278His | 171 | 80 | 89 |
| Asp278Val | 89 | 116 | 136 |
| Asp278Tyr | 131 | 156 | 161 |
| Ser380Gly | 56 | 114 | 168 |
| Ser380Thr | 8,8 | 52 | 128 |
| Ser380Tyr | 86 | 90 | 105 |
-
Wert,
ausgedrückt
als relativer Wert, wenn das Xa-AT-Bildungsvermögen von rekombinantem AT des Nativ-Typs
als 100% definiert ist.
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann eine neue Human-Antithrombin-Variante
bereitgestellt werden, welche eine passende dreidimensionale Struktur
besitzt, die, sogar wenn Heparin nicht anwesend ist, in der Lage
ist, eine hohe proteaseinhibitorische Aktivität auszuüben. Die rekombinante Human-Antithrombin-Variante
der Erfindung ist als therapeutisches Mittel zum Beispiel für thrombotische
Krankheiten oder Gestose nützlich.