ES2303508T3 - Variantes de antitrombina humana. - Google Patents
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Abstract
Una variante de antitrombina humana en la que la Asp de la posición 278 se ha sustituido por Gly, His o Tyt, respectivamente.
Description
Variantes de antitrombina humana.
Esta invención se refiere a un variante
artificial de antitrombina humana que tiene una elevada actividad
inhibidora de proteasa en ausencia de heparina. Más particularmente,
la invención se refiere a una variante de antitrombina humana que
tiene una estructura tridimensional después de unirse a heparina, en
donde la estructura tridimensional de la molécula de antitrombina
humana natural es modificada mediante un procedimiento de ingeniería
genética. La variante de la invención puede usarse para el
tratamiento de, por ejemplo, DIC, enfermedades trombóticas o
gestosis.
Se ha descrito que existen varios tipos de
actividades de antitrombina en la antitrombina natural, y se han
propuesto las antitrombinas I a VI. Sin embargo, en vista del hecho
de que hasta el presente únicamente la antitrombina III ha sido
aislada como proteína, actualmente se denomina a la antitrombina III
simplemente antitrombina. Por consiguiente, a partir de este
momento en la presente memoria se denominará antitrombina a la
antitrombina III en lo que respecta a esta invención.
La antitrombina humana natural es una
glicoproteína de cadena sencilla que tiene un peso molecular de
58.000, que presenta actividad inhibidora sobre las proteasas en el
sistema de coagulación sanguínea. La antitrombina humana natural se
biosintetiza como una proteína precursora que consiste en 464
residuos de aminoácido, pero se extrae un péptido señal que
consiste en 32 residuos del curso de secreción. Por tanto, la
antitrombina humana madura que circula por los vasos sanguíneos
está compuesta por 432 residuos de aminoácido. Los seis residuos de
cisteína (Cys) forman enlaces de disulfuro, y la molécula de
antitrombina humana se estabiliza con los puentes
S-S en tres localizaciones de
Cys8-Cys128, Cys21-Cys95 y
Cys247-Cys430. La antitrombina humana natural
contiene aproximadamente un 15% de azúcares, y los residuos de
asparagina tienen ligadas cadenas de azúcares de tipo complejo en
cuatro posiciones (Asn96, Asn135, Asn155 y Asn192). La posición
molecular de la antitrombina humana natural que interactúa
directamente con el centro activo de la proteasa y se une a él se
denomina centro reactivo, que es Arg393-Ser394
localizado cerca del extremo C de la cadena peptídica.
La antitrombina humana natural es una proteína
de plasma que pertenece a la superfamilia serpina como la
antitripsina-\alpha_{1} y el cofactor II de
heparina, y es un factor de control principal del sistema de
coagulación sanguínea que controla las actividades de las
principales enzimas de coagulación, tal como la trombina, el factor
X activado (factor Xa), el factor IX activado (factor IXa), etc.
Una antitrombina humana natural que presenta dichas actividades
farmacológicas se ha usado para la normalización de la coagulación
anormalmente acelerada, más específicamente, la coagulación
intravascular diseminada (DIC, del inglés "Disseminated
Intravascular Coagulation"), y gestosis, cuyos síntomas
principales son hipertensión, proteinuria y edema durante el periodo
de embarazo, así como para tratar la
hiper-trombopoyesis derivada de una deficiencia de
antitrombina humana congénita.
Es bien conocido que la antitrombina humana
natural tiene una elevada afinidad por la heparina, y que en
presencia de heparina las tasas de inhibición de trombina y factor
Xa pueden acelerarse 1.000 veces y 300 veces, respectivamente.
Los análisis hechos hasta el momento a nivel de
estructura primaria han revelado que hay una posición de unión a
heparina localizada en la región terminal de la antitrombina humana
natural, y que la posición reactiva con la proteasa está localizada
cerca del extremo C (Arg393-Ser394). Además, el
5-10% de la antitrombina humana natural es una
especie molecular en la que la cadena de azúcares no está ligada a
Asn135 (antitrombina humana \beta), y dicha especie revela una
mayor afinidad a heparina que la especie molecular dominante
(antitrombina humana \alpha).
La molécula de antitrombina humana natural es,
como otras serpinas sanguíneas, una proteína que comprende en una
estructura tridimensional varias cadenas (denominadas a partir de
aquí s1A - s4C) compuestas de láminas antiparalelas \beta,
clasificadas de forma general en tres direcciones de A, B y C, nueve
hélices \alpha (abreviadas a partir de aquí como hA - hI) y una
función de estructura de bobina (Stein PE, Carrell RW, Nature
Struct Biol 2: 96, 1995). Recientemente, estudios sobre la
estructura cristalina por rayos X a 2,6 \ring{A} de los dímeros
de antitrombina de forma nativa y forma latente (Skinner R., y col.,
J. Mol. Biol. 266: 601, 1997) y sobre las estructuras cristalinas a
2,9 \ring{A} de un complejo con pentasacárido de la función del
núcleo de una heparina de alta afinidad (Jin L. y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, Vol. 94: 14683, 1997) han revelado una posición de
interacción tridimensional de antitrombina humana natural con
heparina, y el cambio estructural dinámico en la molécula de
antitrombina causado por la unión de heparina.
En base a estos cambios estructurales dinámicos
de la molécula de antitrombina humana natural, el presente inventor
ha pensado que la antitrombina humana es una serpina
"incompleta" como inhibidor en ausencia de heparina, y se
convertiría en un inhibidor "completo" únicamente en presencia
de heparina.
En base a estos descubrimientos previos, se ha
intentado la preparación de una variante de la antitrombina humana
que tenga una elevada actividad inhibidora de proteasa incluso en
ausencia de heparina mediante el intercambio de
aminoácido(s) en posición(es) específica(s) en
la antitrombina humana natural. Por ejemplo, se describe una
variante de antitrombina humana en la que uno, dos o más de los
aminoácidos de las posiciones 49, 96, 135, 155, 192, 393 y 394 de
la antitrombina natural son sustituidos por otros aminoácidos
(Patente Japonesa Kokai Nº 262598/1990). Asimismo, se describe otra
variante de antitrombina humana en la que al menos uno de los
aminoácidos de cuatro regiones de las posiciones 11 - 14, 41 - 47,
125 - 133 y 384 - 398 es sustituido por otros aminoácidos, solo o
en combinación en las respectivas regiones (Patente Japonesa Kokai
Nº 339292/1993). Puesto que estas variantes no siempre ejercen un
efecto satisfactorio, ha existido una demanda de la preparación de
una variante de antitrombina humana que tenga una actividad de
inhibición de proteasa aún más potente en ausencia de heparina.
El propósito de la presente invención es
proporcionar una nueva variante de antitrombina humana, que puede
actuar como un inhibidor completo en ausencia de heparina, y que
puede ejercer una elevada actividad inhibidora de proteasa.
Cuando una antitrombina humana natural actúa
como un inhibidor de proteasa, se produce un gran cambio
conformacional en el lazo reactivo de la antitrombina humana. Más
específicamente, el lazo reactivo que sobresale de la superficie
molecular de la antitrombina humana natural es reconocido como un
"sustrato" para la proteasa diana, y el péptido unido a la
posición reactiva [P1 (Arg393)-P1' (Ser394)] es
separado con la proteasa. En ese momento, se forma un enlace acilo
entre el carbono del grupo carbonilo de Arg393 en P1 y el oxígeno
del grupo hidroxilo del centro activo Ser195 de la proteasa,
mediante lo cual se forma un complejo acilo-enzima
y, simultáneamente, se incorporan 15 residuos (P1 - P15) en el
extremo N del lazo reactivo atacado entre s3A y s5A para formar una
nueva cadena (s4A). En este punto, la Arg393 se mueve
aproximadamente 70 \ring{A} desde un extremo a otro de la
molécula de antitrombina humana, junto con la proteasa. Se cree que
este cambio dinámico es significativo para formar un complejo
estable con una proteasa. También se ha encontrado una forma latente
de antitrombina humana natural o activador inhibidor 1 de
plasminógeno en el que el centro reactivo, aunque no es extraído,
se inserta en la molécula como s4A. A partir de estos hechos, se
cree que en la formación de s4A reside una estructura estable de
serpina.
Puesto que el lazo reactivo de la antitripsina
\alpha natural está completamente expuesto sobre la superficie de
la molécula y la cadena lateral de Met358 en P1 está orientada hacia
el exterior de la molécula para formar una conformación
complementaria al centro activo de serina proteasa, la reactividad
con la proteasa es elevada y puede producirse la inserción
intramolecular del lazo reactivo después de la extracción. Sin
embargo, puesto que la cadena latera de Arg393 en P1 de la
antitrombina humana natural está orientada hacia el interior de la
molécula, la reactividad con proteasa es extremadamente baja (Jin
L., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 14683, 1997). La
atención del presente inventor se ha centrado en un hecho aún más
significativo, que el lazo reactivo de la antitrombina humana
natural está incorporado en cadenas en P14 (Ser380) y P15 (Gly379),
lo que proporciona cadenas con distorsión y también dificulta la
inserción del lazo extraído. La unión de heparina a antitrombina
humana natural induce cambios conformacionales en varias posiciones
de la molécula de antitrombina humana, y los aminoácidos en P14
(Ser380) y P15 (Gly379) podrían ser extruídos de la cadena mediante
un efecto alostérico (efecto de impedimento estérico) de la unión de
heparina, y deslocalizados a la misma posición que en la
antitripsina \alpha (Jin L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
94: 14683, 1997).
El presente inventor ha analizado y estudiado el
cambio conformacional en los respectivos lazos reactivos de la
anterior antitrombina humana, activador inhibidor 1 de plasminógeno
y antitripsina \alpha_{1}, y, como resultado, ha juzgado que
P14 (Ser380) en la antitrombina humana natural es un posición clave
para la construcción de una estructura tridimensional adecuada que
actúe como un inhibidor completo en ausencia de heparina, y que
tenga una elevada actividad de inhibición de proteasa. Además, en
vista de que la posición de P15 - P10 en el lazo reactivo de la
antitrombina humana natural es denominada región "bisagra
proximal", el presente inventor ha estudiado sus características
de estructura tridimensional en la antitrombina humana y ha
descubierto que dicha región bisagra proximal desempeña un papel
como bisagra cuando el lazo reactivo se incorpora como s4A. En base
a este descubrimiento, el presente inventor ha juzgado que la
posición en P16 (Glu378) correspondiente a la base de dicha bisagra
también es un sitio que debe ser sustituido por otro aminoácido
adecuado para la preparación de una variante de antitrombina humana
que tenga una estructura tridimensional apropiada y una elevada
actividad de inhibición de proteasa, junto con la posición en
P14.
Por otro lado, es sabido que el lazo reactivo de
la antitrombina humana natural está insertado en la molécula como
s4A entre s3A y s5A cuando se extrae con una proteasa, y que la
región que participa en la apertura de estas cadenas es la región
de obturación en la que hB (Ser79 - Thr90) está centrada (Stein PE,
Carrel RW, Nature Struct Biol 2: 96, 1995). El presente inventor ha
descubierto que, en la apertura entre s3A y s5A, los enlaces de
hidrógeno entre ambas cadenas se rompen primero y entonces dichas
cadenas se deslizan por el surco de hB, y que una "apertura más
fácil" de dicha región está relacionada con una "inserción más
fácil" de los lazos reactivos. En resumen, la región de
obturación de la antitrombina humana natural es una región
importante que influye en la apertura y en el cierre entre s3A y
s5A, y además influye en la unión de heparina y en la actividad de
antitrombina. Entonces, el presente inventor ha juzgado que se puede
producir una variante de antitrombina humana que tenga una
estructura tridimensional con una elevada actividad inhibidora de
proteasa sustituyendo el aminoácido de la posición 78 (Leu78), que
corresponde a la base de la región de obturación, por otro
aminoácido.
Entonces, el presente inventor ha analizado y
estudiado los cambios estructurales dinámicos de la antitrombina
humana natural y la promoción de la actividad inhibidora de
proteasa, que son inducidos por la unión de heparina; en
particular, la estructura tridimensional de cada aminoácido de la
región de unión de heparina. Hasta ahora se ha elucidado que la
región de unión de heparina de la antitrombina humana natural
consiste en un grupo de residuos de aminoácido básicos que están
localizados en hA y hD, en base a los análisis de casos anómalos
tales como la antitrombina TOYAMA, en donde la Arg de la posición 47
es sustituida por Cys (Koide T., Takahashi K. y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 81: 289, 1984) o experimentos de modificación
química, así como el análisis de variantes preparadas mediante
mutagénesis específicas de posición. El anteriormente mencionado
análisis de rayos X de la estructura cristalina (Jin L. y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 14683, 1997) ha elucidado que las
posiciones de unión de pentasacárido derivadas de heparina de la
antitrombina humana natural están en hD (cadenas laterales de
Lys125 y Arg129), hA (cadenas laterales de Arg46 y Arg47, y amida
de cadena principal de Asn45), la región N-terminal
(cadenas laterales y amidas de cadena principal de Lys11 y Arg13),
y amida de cadena principal de Glu113 y cadena lateral y amidas de
cadena principal de Lys114 en la "hélice P" (P origina de
pentasacárido), que se forma entre hC-hD a través de
la unión con pentasacárido. Cuando el polisacárido entra en
contacto, Arg46 y Arg47 se mueven 17 \ring{A} y 8 \ring{A},
respectivamente, para formar un enlace de hidrógeno con el grupo
sulfato de la cadena de azúcar. Además, hD está inclinada un ángulo
de aproximadamente 10 grados en la dirección de empuje de s2A y s3A,
y la estructura de bobina de Glu113 - Gln118 en su lado
N-terminal es modificada a dos hP giradas hacia la
dirección de ángulo derecho a hD. Además, también se forma una
hélice girada una vuelta y media en el lado
C-terminal de hD, de tal modo que las cadenas
laterales de Arg132, Lys133 y Lys136 están dirigidas hacia la
posición de unión del pentasacárido. Estos residuos están muy lejos
de los pentasacáridos y por tanto no se forma un enlace de hidrógeno
entre ellos, pero es muy posible que dichos residuos interactúen
con una heparina de cadena larga. Además, en dicha forma nativa de
la antitrombina humana, los residuos de aminoácido en P14 y P15 del
lazo reactivo dificultado son extruídos por un efecto alostérico
provocado por la elongación de hD, y la distorsión de cadenas se
elimina y simultáneamente la cadena lateral de Arg393 en P1 se
dirige hacia el exterior de la molécula, que se transforma en una
forma que puede reaccionar como un inhibidor (Pike RN y col., J.
Biol. Chem. 272: 19652, 1997). Además, la región
N-terminal de la antitrombina humana (Ile22 - Arg46)
se mueve enormemente cuando está ligada a pentasacáridos, y por
tanto desempeña un papel como puerta estérica para la estabilización
de un complejo antitrombina-pentasacárido (Fittom
HL. y col., Protein Science 7: 782, 1998). Al comparar las
estructuras tridimensionales de la forma nativa y de la forma
latente de la antitrombina humana natural, la hD de la forma nativa
está ligeramente girada, la posición de unión de heparina, Arg47,
Lys125 y Arg129, están dirigidos hacia la región de unión de
pentasacárido, y el grupo N\varepsilon de Arg129 forma un enlace
de hidrógeno con la cadena lateral de Asp278 para estabilizar dicha
cadena lateral, lo que facilita la interacción iónica con los grupos
sulfato del pentasacárido. Sin embargo, en la forma latente, la hD
se estira hacia fuera, Arg47 y Lys125 forman enlaces de hidrógeno
con Ser112 e Ile7, respectivamente, y todas las regiones de residuos
de aminoácidos que son significativas para la unión de heparina, no
se dirigen hacia las regiones de unión de heparina (Skinner R. y
col., J. Mol. Biol. 266: 601, 1997). En vista de lo anterior, el
presente inventor ha juzgado que la estructura tridimensional puede
ser alterada, incluso en ausencia de heparina, a una conformación
similar a la que tendría en presencia de heparina, mediante una
rotura previa de un enlace de hidrógeno entre Arg129 y Asp278. En
base a lo juzgado, el presente inventor pensó que la sustitución de
aminoácido de la posición 278 (Asp278), que se une a Arg129 a través
de un enlace de hidrógeno, por otro aminoácido puede producir una
variante de antitrombina que tenga una estructura tridimensional
adecuada con una elevada actividad inhibidora de proteasa.
Como se ha descrito antes, el presente inventor
ha estudiado información sobre el cambio conformacional dinámico
que resulta de la unión de heparina a antitrombina humana natural
como se ha analizado previamente y, como resultado, ha descubierto
una posición preferida para la modificación o alteración en la
estructura tridimensional para promover la actividad inhibidora de
proteasa de la antitrombina humana natural. Más específicamente, el
presente inventor ha llegado a la conclusión de que la sustitución
de uno, dos o más aminoácidos adicionales de la región bisagra del
lazo reactivo de la antitrombina humana natural, la región bisagra
para formar s4A, así como aquellos sitios implicados en la unión de
heparina, puede producir una variante de antitrombina humana que
tenga una estructura tridimensional adecuada con una elevada
actividad inhibidora de proteasa. El presente inventor ha realizado
estudios formales sobre la mejora de variante de antitrombina humana
basada en la conclusión antes mencionada, y finalmente ha tenido
éxito en la preparación de una nueva variante de antitrombina humana
que tiene una estructura tridimensional apropiada para una elevada
actividad inhibidora de proteasa, con lo cual se ha completado la
invención.
La presente invención está dirigida a una
variante de antitrombina humana en la que el aminoácido de la
posición 278 de la secuencia de aminoácidos de la antitrombina
humana natural es sustituido por un aminoácido seleccionado entre
Gly, His y Tyr.
Además, la invención está dirigida a un ADN que
codifica dicha variante de antitrombina humana.
La Figura 1 muestra la construcción de un vector
de expresión correspondiente a una variante recombinante de
antitrombina (AT) (para el caso de Ser380His).
La nueva variante de antitrombina de la
invención se preparó mediante mutagénesis específica de posición
como una variante que tiene una estructura tridimensional que es
similar a la que presenta después de la unión a heparina.
La invención se ilustra más específicamente
mediante el método específico para la preparación de una variante
definido a continuación.
A 2,5 \mug (10 \mul) de cADN (de cadena
sencilla) para la forma nativa de antitrombina se le añadieron 30
\mul de un cebador de variante (0,475 OD/mL) para la sustitución
de aminoácidos para sintetizar un cADN de longitud completa con
polimerasa de ADN. A continuación, se determinó la secuencia de
nucleótidos para confirmar una formación de variante. Se integró
cADN (1,4 kb) para cada variante de antitrombina en la posición
EcoRI del vector pcD2, y a continuación se rompió con EcoRI y PstI
para confirmar la dirección de la secuencia insertada. El vector
con la secuencia integrada en la dirección correcta fue transfectado
en células BHK para una producción a gran escala mediante un método
de fosfato cálcico (Figura 1). Se seleccionaron las células que
expresan de forma estable y que son resistentes a neomicina con G418
y reunieron. Las células BHK (riñón de cría de hámster) que
expresan de forma estable se usaron para llevar a cabo el
experimento de persecución por pulsos. Se sembraron 5x10^{5}
células en un plato de 35 mm de diámetro y se cultivaron durante una
noche. Fueron marcadas con 6,8 \muL de EXRE35S35S (100
\muCi/mL) durante 30 minutos. A continuación se intercambió el
caldo de cultivo con DME/10%FCS, Met, Cys, y a continuación se llevó
a cabo un ensayo de persecución durante 8 horas para obtener medio
de cultivo (CM) y extractos celulares (CE) después de 0; 0,5; 1; 2;
4 y 8 horas. Se inmunoprecipitaron el CM y el CE de cada punto con
un anticuerpo y Staphylosorb^{TM}, a continuación se realizó
SDS-PAGE al 8% (+SH), y se midió la radioactividad
de las bandas RI resultantes para determinar la cantidad segregada
de la variante recombinante de antitrombina.
Para las células que segregan una elevada
cantidad de la variante de antitrombina se recogió el CM después de
8 horas de persecución. A 500 \muL del líquido recogido se añadió
trombina o factor Xa, y, después de reaccionar a 37ºC durante 5
minutos o 60 minutos sin heparina, o durante 5 minutos con heparina,
se llevó a cabo una precipitación inmune y se determinó la cantidad
de complejo mediante SDS-PAGE al 10%
SDS-PAGE (+SH).
La secreción de célula BHK de cada variante
recombinante de antitrombina se resume en la Tabla 1, que muestra
las cantidades intracelulares y segregadas tras 8 horas de
persecución, considerando la radioactividad del marcado de pulsos
como 100%. La cantidad segregada de la antitrombina recombinante de
tipo nativo fue 89%, mientras que la variante Leu78Phe en la que se
sustituyó la Leu de la posición 78 por Phe mostró una cantidad
segregada del 90%. Las variantes en las que la Asp de la posición
278 fue sustituida por Ala, Gly, His o Tyr (Asp278Ala, Asp278Gly,
Asp278His o Asp278Tyr) mostraron secreciones del 104%, 104%, 165% o
160%, respectivamente, que fueron mayores que la de la antitrombina
recombinante de tipo nativo.
Por otro lado, las variantes en las que la Asp
de la posición 278 fue sustituida por Arg, Asn o Val (Asp278Arg,
Asp278Asn o Asp278Val) mostraron secreciones de 57%, 48% o 51%,
respectivamente. Se obtuvo una secreción satisfactoria en todas las
variantes en las que la Ser de la posición 380 fue sustituida por
Ala, Arg, Asn, Asp, Gly, His, Pro, Thr, Tyr o Val (Ser380Ala,
Ser380Arg, Ser380Asn, Ser380Asp, Ser380Gly, Ser380His, Ser380Pro,
Ser380Thr, Ser380Tyr o Ser380Val). Especialmente, las variantes
sustituidas por Asn y VaL proporcionaron una elevada secreción, del
154% y del 144%, respectivamente.
Los resultados de los estudios sobre la
capacidad de formación de complejo
trombina-antitrombina (TAT) de cada variante
recombinante de antitrombina se resumen en la Tabla 2. La capacidad
inmediata de formación de TAT en ausencia de heparina, que es el
mayor efecto de la invención, fue del 131% para la variante Leu78Phe
en la que la Leu de la posición 78 fue sustituida por Phe, del 163%
para la variante Asp278His en la que la Asp de la posición 278 fue
sustituida por His, y del 171% y el 172% para las variantes
Ser380Gly y Ser380Tyr en las que la Ser de la posición 380 fue
sustituida por Gly y Tyr, respectivamente, en términos de valor
relativo cuando se define como 100% la capacidad de formación de
TAT de un tipo nativo de recombinante, y en todos los casos se
proporcionaron variantes que tienen una mayor eficacia que la del
tipo nativo de recombinante. Además, tal como se muestra en la
Tabla 2, en la interacción con trombina a lo largo de un periodo de
tiempo prolongado (120 minutos), las variantes Leu78Phe, Asp278His
y Ser380Ala presentaron el mismo nivel de capacidad de formación de
TAT estable que el tipo nativo de antitrombina recombinante, y las
variantes Asp278Ala, Asp278Val, Asp278Tyr, Ser380Gly y Ser380Tyr
presentaron un mayor nivel de capacidad de formación de TAT estable
que el tipo nativo de antitrombina recombinante.
Además, todas las variantes pudieron mantener la
capacidad formadora de TAT inmediata en presencia de heparina, y
también se ha demostrado que son agentes antitrombóticos eficaces
para su uso en combinación con heparina.
Los resultados de los estudios sobre la
capacidad de formación de complejo factor
Xa-antitrombina (Xa-AT) de cada
variante recombinante de antitrombina con factor Xa
(Xa-AT) se resumen en la Tabla 3. La capacidad
inmediata de formación de Xa-AT en ausencia de
heparina, que es el mayor efecto de esta invención, fue del 106%
para la variante Leu78Phe en la que la Leu de la posición 78 fue
sustituida por Phe, en términos de valor relativo si se define el
100% como la capacidad de formación de Xa-AT de tipo
nativo de recombinante. Asimismo, se obtuvieron valores del 144%,
171% y 131% en los casos de las variantes Asp278Gly, Asp278His y
Asp278Tyr en donde la Asp de la posición 278 fue sustituida por
Gly, His o Tyr, respectivamente, y podría haberse obtenido
variantes con una mayor eficacia que el tipo nativo de antitrombina
recombinante para todos los casos. Además, en la interacción con
factor Xa a lo largo de un periodo de tiempo prolongado (60
minutos), las variantes Leu78Phe, Asp278Gly, Asp278His y Ser380Tyr
presentaron el mismo nivel de capacidad de formación de TAT estable
que el tipo nativo de recombinante, y las variantes Asp278Val,
Asp278Tyr y Ser380Gly presentaron un mayor nivel de capacidad de
formación de TAT estable que el tipo nativo de antitrombina
recombinante.
Además, la capacidad inmediata de formación de
Xa-AT en presencia de heparina en los casos de las
variantes Leu78Phe, Asp278Ala y Asp278Gly disminuyó aproximadamente
a la mitad, en comparación con tipo nativo de antitrombina
recombinante, y esto demuestra la efectividad de dichas variantes
como inhibidor no dependiente de heparina para el factor Xa con una
gran eficacia. Por otro lado, las variantes Asp278Val, Asp278Tyr,
Ser380Gly, Ser380Thr y Ser380Tyr han retenido la capacidad
inmediata de formación de TAT en presencia de heparina, demostrando
con ello su efectividad como agentes antitrombóticos para su uso en
combinación con heparina.
Valor expresado en términos de valor relativo si
se define como 100% la capacidad de formación de
Xa-AT de tipo nativo de AT recombinante.
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Valor expresado en términos de valor relativo si
se define como 100% la capacidad de formación de
Xa-AT de tipo nativo de AT recombinante
De acuerdo con la presente invención, se puede
proporcionar una nueva variante de antitrombina humana, que tiene
una estructura tridimensional apropiada capaz de exhibir una elevada
actividad inhibidora de proteasa incluso en ausencia de heparina.
La variante recombinante de antitrombina humana de la invención es
útil como agente terapéutico de, por ejemplo, enfermedades
trombóticas o gestosis.
Claims (2)
1. Una variante de antitrombina humana en la que
la Asp de la posición 278 se ha sustituido por Gly, His o Tyt,
respectivamente.
2. Un ADN que codifica una variante de
antitrombina humana como la reivindicada en la reivindicación 1.
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