JP2001000191A

JP2001000191A - ヒトアンチトロンビン変異体

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Publication number: JP2001000191A
Application number: JP11176967A
Authority: JP
Inventors: Takehiko Koide; 武比古小出
Original assignee: Aventis Pharma Ltd
Current assignee: Sanofi Aventis UK Holdings Ltd
Priority date: 1999-06-23
Filing date: 1999-06-23
Publication date: 2001-01-09
Anticipated expiration: 2019-06-23
Also published as: KR20070085485A; WO2000078811A1; AU5568100A; EP1225184A1; CA2375224A1; KR100798285B1; US7001993B1; EP1225184B1; EP1225184A4; ES2303508T3; AU776796B2; KR20020011444A; ATE388965T1; DE60038310D1; JP4339962B2; CA2375224C; KR100832733B1; DE60038310T2

Abstract

(57)【要約】【課題】ヘパリン非存在下でも高いプロテアーゼ阻害
活性を示すヒトアンチトロンビン異変体を提供すること
にある。【解決手段】ヒトアンチトロンビンの変異体であっ
て、天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸配列の７８
位、２７８位、３７８位および３８０位のアミノ酸の少
なくとも１個が他のアミノ酸に変換されているヒトアン
チトロンビン変異体。好ましくは、７８位がＰheによ
り；２７８位がＡla、Ａrg、Ａsn、Ｇly、Ｈis、Ｔyrま
たはＶalにより；３７８位がＬys、ＡsnまたはＶalによ
り；および／あるいは３８０位がＡla、Ａsp、Ｇly、Ｈ
is、Ｉle、Ｌeu、Ａsn、Ｐro、Ａrg、Ｔhr、Ｔyrまたは
Ｖalにより変換されているヒトアンチトロンビン変異
体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘパリン非存在下
でも高プロテアーゼ阻害活性を有する人工のヒトアンチ
トロンビン変異体に関する。さらに詳しくは、本発明は
天然のヒトアンチトロンビン分子の立体構造を遺伝子操
作によって改変した変異体であって、ヘパリン結合後の
立体構造を有するヒトアンチトロンビン変異体に関す
る。該変異体は、例えばＤＩＣ、血栓性疾病や妊娠中毒
症の治療に用いることができるものである。

【０００２】

【従来の技術】天然のアンチトロンビンはいく種類もの
アンチトロンビン活性のあることが示され、アンチトロ
ンビンＩからVIまでが提唱された。しかし、今日までに
タンパク質として単離されたのはアンチトロンビンIII
だけであることから、現在では、アンチトロンビンIII
は単にアンチトロンビンと呼ばれている。従って本発明
において以下アンチトロンビンIIIをアンチトロンビン
と称する。

【０００３】天然のヒトアンチトロンビンは血液凝固系
のプロテアーゼ阻害活性を有する分子量５８,０００の
一本鎖の糖タンパク質である。天然のヒトアンチトロン
ビンは４６４個のアミノ酸残基からなる前駆体タンパク
質として生合成されるが、分泌過程において、３２残基
からなるシグナルペプチド部分が切り離されるため、血
管内を循環する成熟ヒトアンチトロンビンは４３２個の
アミノ酸残基からなる。６個のシステイン残基（Cys）
はすべてジスルフィド結合を形成しており、Ｃys８−Ｃ
ys128、Ｃys21−Ｃys95およびＣys247−Ｃys430の３個
所のＳ−Ｓ架橋でヒトアンチトロンビン分子を安定化し
ている。天然のヒトアンチトロンビンには約１５％の糖
が含まれており、４ヶ所のアスパラギン残基（Asn96、A
sn135、Asn155およびAsn192）に複合型糖鎖が結合して
いる。天然のヒトアンチトロンビンの分子中、プロテア
ーゼの活性中心と直接相互作用し、結合する箇所は反応
部位と呼ばれ、ペプチド鎖のＣ末端近くのＡrg393−Ｓe
r394である。

【０００４】天然のヒトアンチトロンビンは、α₁−ア
ンチトリプシンやヘパリンコファクターIIと同様にセル
ピン（Serpins）スーパーファミリーに属する血漿タン
パク質で、トロンビン、活性化Ｘ因子（Ｘa因子）、活
性化IX（IXa因子）など主要な凝固酵素の活性を制御す
る凝固系の主要な制御因子である。このような薬理活性
を有する天然のヒトアンチトロンビンは、凝固の異常亢
進の補正、具体的には血管内凝固症候群（DIC）や妊娠
中の高血圧、蛋白尿、浮腫を主徴とする妊娠中毒症およ
び先天性ヒトアンチトロンビン欠乏に基づく血栓形成傾
向の治療を目的として用いられている。

【０００５】天然のヒトアンチトロンビンはヘパリンに
高い親和性があり、ヘパリン存在下でトロンビンやＸａ
因子に対する阻害速度は、それぞれ１０００倍と３００
倍に促進されることが良く知られている。

【０００６】これまでの一次構造レベルの解析により、
天然のヒトアンチトロンビンのＮ末端領域にヘパリン結
合部位があり、Ｃ末端近傍にプロテアーゼとの反応部位
（Arg393−Sre394）があることが明らかにされている。
また、天然の血中ヒトアンチトロンビンの５〜１０％
は、Ａsn135に糖鎖が結合していない分子種（ヒトアン
チトロンビン β）で、主要な分子種（ヒトアンチトロ
ンビン α）よりも高いヘパリン親和性を示す。

【０００７】天然のヒトアンチトロンビン分子は他の血
中セルピンと同様に三次元構造的にはＡ、ＢおよびＣの
３方向に大別される逆平行βシートからなる多数のスト
ランド（s1A〜s4Cと略）、９個のα−ヘリックス（hA〜
hIと略）とコイル構造部分で構成されるタンパク質であ
る（Stein PE, Carrell RW, Nature Struct Biol 2：96
1995)。最近、天然型（native form）と潜在型（laten
t form）のアンチトロンビン二量体の２.６Å分解能で
のＸ線結晶構造（Skinner R., et al., J．Mol．Biol．
266: 601, 1997）や、高親和性ヘパリンのコア部分のペ
ンタサッカライドとの複合体の２.９Å分解能での結晶
構造が報告され（Jin L.，et al, Proc.Natl. Acad. Sc
i. USA, Vol.94: 14683，1997）、天然のヒトアンチト
ロンビンとヘパリンの三次元相互作用部位とヘパリン結
合によるヒトアンチトロンビン分子内の動的構造変化が
示された。

【０００８】本発明者はこれまでに、これら天然のヒト
アンチトロンビン分子内の動的構造変化から、ヒトアン
チトロンビンはヘパリン非存在下ではインヒビターとし
て「不完全」なセルピンであり、ヘパリン存在下ではじ
めて「完全」なインヒビターとなると考えた。

【０００９】これまでの知見をもとに天然のヒトアンチ
トロンビン中の特定のアミノ酸を変換してヘパリン非存
在下でも高いプロテアーゼ阻害活性を有するヒトアンチ
トロンビン変異体の作製が試みられている。例えば、天
然のヒトアンチトロンビンの４９位、９６位、１３５
位、１５５位、１９２位、３９３位および３９４位のア
ミノ酸の１個または２個以上が他のアミノ酸に変換され
たヒトアンチトロンビン変異体が開示されている（特開
平２−２６２５９８公報）。また、１１〜１４位、４１
〜４７位、１２５〜１３３位および３８４〜３９８位の
４つの領域のアミノ酸が、それぞれの領域、単独で又は
組み合せで少なくとも１個、他のアミノ酸に変換された
ヒトアンチトロンビン変異体が開示されている（特開平
５−３３９２９２公報）。しかしながら、これらの変異
体の効力は必ずしも十分ではなく、ヘパリン非存在下で
更に強いプロテアーゼ阻害活性を持つヒトアンチトロン
ビン変異体の作製が望まれている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、ヘ
パリン非存在下で完全なインヒビターとして機能し、高
いプロテアーゼ阻害活性を有する新規なヒトアンチトロ
ンビン変異体を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決する手段】天然のヒトアンチトロンビンが
プロテアーゼインヒビターとして機能する際、ヒトアン
チトロンビン中の反応ループに大きな構造変化がおこ
る。つまり、天然のヒトアンチトロンビンの分子表面に
突出している反応ループが標的プロテアーゼの「基質」
として認識され、反応部位［P１(Arg393)−P１′(Ser39
4)］のペプチド結合がプロテアーゼにより切断される。
この際、P１位Ａrg393のカルボニル炭素とプロテアーゼ
の活性中心Ｓer195の水酸基の酸素との間にアシル結合
が形成されてアシル酵素複合体となると同時に、切断さ
れた反応ループのＮ末端側１５残基（P１〜P15）が s３
Ａとs５Ａ間に入り込み、新たなストランド（s4A）とな
る。この際、Ａrg393はプロテアーゼを伴って、ヒトア
ンチトロンビン分子の端から端まで約７０Å移動する。
この動的変化がプロテアーゼとの安定な複合体形成に重
要と考えられている。天然のヒトアンチトロンビンやプ
ラスミノーゲンアクチベータインヒビター１では反応部
位が切断されていないにもかかわらず、s４Ａとして分
子内に挿入された潜在型（latent form）の存在も知ら
れており、s４Ａの形成がセルピンの安定な構造と考え
られている。

【００１２】天然型α−アンチトリプシンの反応ループ
は分子表面に完全に露出しており、P１位Ｍet358の側鎖
が分子の外側に配向され、セリンプロテアーゼの活性部
位と相補的な立体配座（コンフォメーション）を形成し
ているので、プロテアーゼとの反応性が高く、切断後の
反応ループの分子内挿入が起こりやすい。しかし、天然
のヒトアンチトロンビンのP1位Ａrg393の側鎖は分子の
内側に配向されているためプロテアーゼとの反応性がき
わめて低い（Jin L.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sc
i．USA, 94: 14683, 1997）。本発明者はさらに重要な
点として、天然のヒトアンチトロンビンの反応ループが
P14位（Ser380）とP15位（Gly379）においてストランド
内に入り込んでいるため、ストランドに歪を与え、切断
された反応ループの挿入も起こりにくい点に注目した。
ヘパリンが天然のヒトアンチトロンビンに結合するとヒ
トアンチトロンビン分子中の様々な部位で立体構造上の
変化がおこるが、このP14位（Ser380）とP15位（Gly37
9）のアミノ酸はヘパリン結合のアロステリック的影響
（立体障害的な影響）を受けてストランドから押し出さ
れ、α−アンチトリプシンと同じ位置に移動する（Jin
L.，et al, Proc．Natl．Acad．Sci．USA，94: 14683,
1997）。

【００１３】本発明者は、前述のヒトアンチトロンビ
ン、プラスミノーゲンアクチベータインヒビター１およ
びα₁−アンチトリプシン中のそれぞれの反応ループに
関する立体構造変化を解析、検討することにより、天然
のヒトアンチトロンビン中のP14位（Ser380）がヘパリ
ン非存在下で完全なインヒビターとして機能し、高いプ
ロテアーゼ阻害活性を有する適切な立体構造を作製する
ための重要な部位であると判断した。さらに、本発明者
は、天然のヒトアンチトロンビンの反応ループにおける
P15〜P10位は、近位ヒンジ領域（proximal hinge）と呼
ばれていることから、そのヒトアンチトロンビン中にお
ける立体構造的な特徴を検討した。その結果、この近位
ヒンジ領域は反応ループがs4Aとして入り込む際のヒン
ジ(蝶番）の役割を担っていることから、その基部にあ
たるP16位（Glu378）もP14位と同様に高いプロテアーゼ
阻害活性を有する適切な立体構造を持つヒトアンチトロ
ンビン変異体を作製するために適切なアミノ酸に変換す
べき部位であると判断した。

【００１４】他方、天然のヒトアンチトロンビンの反応
ループはプロテアーゼによって切断を受けると、s3Aとs
5A間にs4Aとして分子内に挿入されるが、これらのスト
ランド間が開く際に関与している領域がhB（Ser79〜Thr
90) を中心とするシャッター（shutter）領域であるこ
とが知られている（Stein PE, Carrell RW，Nature Str
uct Biol 2: 96，1995）。本発明者は、s3Aとs5A間が開
く際には、まず両ストランド間の水素結合が切断された
後、これらストランドがhＢの溝の上をスライドし、こ
の領域の「開きやすさ」が反応ループの「入りやすさ」
と関係するとの知見を得た。つまり、天然のヒトアンチ
トロンビンのシャッター領域はs3Aとs5A間の開閉に影響
を与え、さらにヘパリンとの結合やアンチトロンビンの
活性にも影響を与える重要な領域であり、このシャッタ
ー領域の基部にあたる７８位（Leu78）を他のアミノ酸
に変換することにより高いプロテアーゼ阻害活性を有す
る適切な立体構造を持つヒトアンチトロンビン変異体を
作製することができると判断した。

【００１５】次に、本発明者はヘパリン結合による天然
のヒトアンチトロンビンの動的構造変化とプロテアーゼ
阻害活性の促進について特にヘパリン結合領域の各アミ
ノ酸の立体構造を解析、検討した。これまで、天然のヒ
トアンチトロンビン中のヘパリン結合領域は、４７位の
ＡrgがＣysに変換されたアンチトロンビン富山（Koide
T., Takahashi K., et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U
SA, 81:289，1984）などの異常症例の解析や化学修飾実
験、さらには部位特異的変異体の解析によって、hＡとh
Ｄに存在する塩基性アミノ酸残基群であることが明らか
にされてきたが、前述のＸ線結晶構造解析（Jin L., et
al., Proc．Natl．Acad．Sci．USA, 94: 14683, 199
7）によって、天然のヒトアンチトロンビンのヘパリン
由来ペンタサッカライド結合部位は、hＤ（Lys125やArg
129の側鎖)、hＡ（Arg46やArg47の側鎖、およびAsn45の
主鎖アミド）、Ｎ末端領域（Lys11、Arg13の側鎖と主鎖
アミド）とhＣ−hＤ間にペンタサッカロイド結合により
新生する「Ｐ−ヘリックス」（Ｐはペンタサッカロイド
に由来する）中のＧlu113の主鎖アミドとＬys114の側鎖
および主鎖アミドであることが明らかになった。ペンタ
サッカライドが接触すると、Ａrg46とＡrg47はそれぞれ
１７Åと８Å移動して糖鎖の硫酸基と水素結合を形成す
る。また、hDはs2Aとs3Aを押す方向へ約１０度傾き、そ
のＮ末端側のＧlu113〜Ｇln118のコイル構造が２回転の
hPとなり、hＤに対して直角方向に形成される。さら
に、hＤのＣ末端側も１.５回転分のヘリックスが形成さ
れて、Ａrg132、Ｌys133、Ｌys136の側鎖がペンタサッ
カライド結合部位の方向を向くようになる。これらの残
基はペンタサッカライドとは離れているので、両者の間
に水素結合は形成されないが、長鎖ヘパリンとは相互作
用する可能性が高いと考えられている。また、hＤが伸
長することによるアロステリック効果で、上述のヒトア
ンチトロンビンの天然型ではストランド内に入り込んで
いた反応ループ内のP14、P15位のアミノ酸残基が押し出
され、ストランドの歪みがなくなるとともにP１位Ａrg3
93の側鎖が分子の外側を向くようになり、インヒビター
として反応しやすい形に変換される（Pike RN, et a
l.，J．Biol．Chem．272：19652, 1997）。また、ヒト
アンチトロンビンのＮ末端部分（Ile22〜Arg46）は、ペ
ンタサッカライドが結合すると大きく移動してアンチト
ロンビン−ペンタサッカライド複合体を安定化する立体
的なゲートとしての役割を担っている（Fitton, HL, et
al., Protein science 7: 782,1998）。天然のヒトア
ンチトロンビンの天然型（native form）と潜在型（lat
ent form）の立体構造を比較すると、天然型のhＤはわ
ずかにねじれており、ヘパリン結合部位であるＡrg47、
Ｌys125およびＡrg129はペンタサッカライド結合領域の
方向を向き、Ａrg129のＮε基はＡsp278の側鎖と水素結
合を形成して側鎖を安定化することにより、ペンタサッ
カライドの硫酸基とイオン的な相互作用をしやすくして
いる。しかし、潜在型（latent form）では、hＤはまっ
すぐに伸び、Ａrg47はＳer112と、Ｌys125はＩle７と水
素結合しており、ヘパリン結合に重要なアミノ酸残基の
領域はすべてヘパリン結合領域の方向に向いていない
（Skinner R., et al., J．Mol．Biol．266:601,199
7）。そこで、本発明者はＡrg129とＡsp278の水素結合
をあらかじめ切っておくことで、ヘパリン非存在下であ
ってもヘパリン存在下と類似の立体構造に変化させるこ
とができると判断した。そこで、Ａrg129と水素結合し
ている２７８位（Asp278）のアミノ酸を他のアミノ酸に
変換することにより高いプロテアーゼ阻害活性を有する
適切な立体構造を持つアンチトロンビン変異体を作製で
きると考えた。

【００１６】このように、本発明者はこれまでに解析さ
れた天然のヒトアンチトロンビンのヘパリン結合による
アンチトロンビンの動的構造変化に関する情報を検討し
たうえで、天然のヒトアンチトロンビンのプロテアーゼ
阻害活性促進に好ましい立体構造上の変換部位を導き出
した。すなわち、天然のヒトアンチトロンビンの反応ル
ープのヒンジ領域、s4A形成時のヒンジ領域、さらにヘ
パリン結合に関連する部位を１または２以上他のアミノ
酸に変換することにより高いプロテアーゼ阻害活性を有
する適切な立体構造を持つヒトアンチトロンビン変異体
を作製することができるとの結論を得た。このような結
論に基づき、本発明者はヒトアンチトロンビン変異体の
改良を鋭意研究した結果、高いプロテアーゼ阻害活性を
有する適切な立体構造を持つ新規なヒトアンチトロンビ
ン変異体作製に成功し本発明を完成した。

【００１７】すなわち、本発明は、天然のヒトアンチト
ロンビンの変異体であって、天然のヒトアンチトロンビ
ンのアミノ酸配列の７８位、２７８位、３７８位および
３８０位のアミノ酸の少なくとも１個が他のアミノ酸に
変換されていることを特徴とするヒトアンチトロンビン
変異体よりなる。これらのヒトアンチトロンビン変異体
のうち、次のものが特に好ましい：ヒトアンチトロンビ
ンのアミノ酸配列の７８位がＰheに変換されているヒト
アンチトロンビン変異体、ヒトアンチトロンビンのアミ
ノ酸配列の２７８位がＡla、Ａrg、Ａsn、Ｇly、Ｈis、
ＴyrおよびＶalから選ばれるアミノ酸に変換されている
ヒトアンチトロンビン変異体、ヒトアンチトロンビンの
アミノ酸配列の３７８位がＬys、ＡsnおよびＶalから選
ばれるアミノ酸に変換されているヒトアンチトロンビン
変異体、ヒトアンチトロンビンのアミノ酸配列の３８０
位がＡla、Ａsp、Ｇly、Ｈis、Ｉle、Ｌeu、Ａsn、Ｐr
o、Ａrg、Ｔhr、ＴyrおよびＶalから選ばれるアミノ酸
に変換されているヒトアンチトロンビン変異体。さらに
本発明は上記ヒトアンチトロンビン変異体をコードして
いるＤＮＡよりなる。

【００１８】

【実施例】本発明の新規なヒトアンチトロンビン変異体
は部位特異的変異導入法によってヘパリン結合後の立体
構造に類似する変異体を作製した。以下に、具体的な変
異体作製方法を記載し、本発明をさらに具体的に説明す
る。天然型アンチトロンビンcDNA（１本鎖）２.５μg
（10μl）にアミノ酸置換のための変異プライマー（0.4
75 OD／ml）３０μlをアニーリングさせ、ＤＮＡポリメ
ラーゼで全長を合成させた。次に、塩基配列を決定して
変異導入を確認した。各アンチトロンビン変異体cDNA
（1.4kb）をpcD2ベクターのEcoRI部位に組み込み、EdoR
IとPstIで切り出して、挿入配列の方向を確認した。順
方向に組み込まれたものについて、大量調製のために、
リン酸カルシウム法で、ＢＨＫ細胞にトランスフェクト
した（図１）。Ｇ４１８でネオマイシン耐性の安定発現
細胞を選択し、それらをプールした。安定発現ＢＨＫ
（baby hamster kidney）細胞のプールを用いてパルス
−チェイス実験を行った。直径３５mmのディッシュに５
×１０⁵個の細胞をまき、一晩培養した。EXPRE35S35S
（100μCi/ml）を６.８μl添加し、３０分ラベル後、培
養液をＤＭＥ／１０％ＦＣＳ、Ｍet、Ｃysに交換して８
時間チェイスを行い、０、０.５、１、２、４、８時間
後の培養上清液(ＣＭ)と細胞抽出液(ＣＥ)を得た。各時
間毎のＣＭとＣＥを抗体とStaphylosorb^TMで免疫沈降
後、８％SDS−PAGE（＋SH）を行い、得られた当該ＲＩ
バンドのＲＩ量を定量することによって、組み換え変異
体の分泌量を定量した。分泌量の高い変異体について
は、８時間チェイス後のＣＭを回収した。回収液５００
μlに対して、トロンビンまたはＸa因子を加え、ヘパリ
ン非存在下では、３７℃、５分と６０分、ヘパリン存在
下では、５分反応後、免疫沈降し、１０％SDS−PAGE
（＋SH）で複合体量を定量した。

【００１９】１) 分泌性各アンチトロンビン組換え変異体のＢＨＫ細胞からの分
泌性について、表１にまとめて示した。パルスラベル時
の放射線量を１００％とした時のチェイス８時間後の細
胞内量と分泌量を示したものであるが、天然型組換え体
の分泌量が８９％であったのに対して、７８位のＬeuが
Ｐheに変換されているＬeu78Ｐhe変異体は分泌量が９０
％であった。また、２７８位のＡspがＡla、Ｇly、Ｈi
sまたはＴyrに変換されている変異体（Asp278Ala、Asp2
78Gly、Asp278HisまたはAsp278Tyr）では、それぞれ１
０４％、１０４％、１６５％または１６０％と天然型組
換え体以上の分泌性が得られた。一方で、２７８位のＡ
spがＡrg、ＡsnまたはＶalに変換されている変異体（As
p278Arg、Asp278AsnまたはAsp278Val）では、それぞれ
５７％、４８％または５１％の分泌性であった。３８０
位のＳerがＡla、Ａrg、Ａsn、Ａsp、Ｇly、Ｈis、Ｐr
o、Ｔhr、ＴyrまたはＶalに変換されている変異体（Ser
380Ala、Ser380Arg、Ser380Asn、Ser380Asp、Ser380Gl
y、Ser380His、Ser380Pro、Ser380Thr、Ser380Tyrまた
はSer380Val) では、いずれも良好な分泌性が得られた
が、なかでも、ＡsnとＶalに変換された変異体では、そ
れぞれ１５４％と1４４％と高い分泌性が得られた。

【００２０】２) トロンビンとの複合体（TAT）形成能各アンチトロンビン組換え変異体のトロンビンとの複合
体（TAT）形成能を調べた結果を表２にまとめて示し
た。本発明の最大の効果であるヘパリン非存在下での即
時性のＴＡＴ形成能は、天然型組換え体のＴＡＴ形成能
を１００％とした相対値が、７８位のＬeuがＰheに変換
されているＬeu78Ｐhe変異体では１３１％、２７８位の
ＡspがＨisに変換されているＡsp278Ｈis変異体では１
６３％、さらに、３８０位のＳerがＧlyまたはＴyrに変
換されているＳer380ＧlyとＳer380Ｔyr変異体では、そ
れぞれ１７１％と１７２％であり、いずれも天然型組換
え体よりも高性能な変異体が得られている。さらに、表
２に示した変異体は、いずれも長時間（120分）のトロ
ンビンとの相互作用においても、天然型組換え体と同程
度（Ｌeu78Ｐhe、Ａsp278ＨisおよびＳer380Ａla変異
体）、あるいは天然型組換え体以上（Ａsp278Ａla、Ａs
p278Ｖal、Ａsp278Ｔyr、Ｓer380ＧlyおよびＳer380Ｔy
r変異体）の安定したＴＡＴ形成能を有していた。ま
た、ヘパリン存在下の即時性のＴＡＴ形成能について
は、いずれも変異体でも保存されており、ヘパリンとの
共用による抗血栓症薬としての有効性も示された。

【００２１】３) Ｘa因子との複合体（Xa−AT）形成能各アンチトロンビン組換え変異体のXa因子との複合体
（Xa−AT）形成能を調べた結果を表３にまとめて示し
た。本発明の最大の効果であるヘパリン非存在下での即
時性のＸa−ＡＴ形成能は、天然型組換え体のＸa−ＡＴ
形成能を１００％とした相対値が、７８位のＬeuがＰhe
に変換されているＬeu78Ｐhe変異体では１０６％であっ
た。また、２７８位のＡspがＧly、ＨisまたはＴyrに変
換されているＡsp278Ｇly、Ａsp278ＨisまたはＡsp278
Ｔyr変異体では、それぞれ１４４％、１７１％または１
３１％であり、いずれも天然型組換え体よりも高性能な
変異体が得られている。さらに、長時間（60分）のＸa
因子との相互作用においても、天然型組換え体と同程度
（Leu78Phe、Asp278Gly、Asp278HisおよびSer380Tyr変
異体）、あるいは天然型組換え体以上（Asp278Val、Asp
278TyrおよびSer380Gly変異体）の安定したＴＡＴ形成
能を有していた。また、ヘパリン存在下の即時性のＸa
−ＡＴ形成能は、Ｌeu78Ｐhe、Ａsp278ＡlaおよびＡsp2
78Ｇly変異体では、天然型組換え体に比べてほぼ半減し
ており、ヘパリン非依存性の高性能Ｘａ因子阻害剤とし
て有効であることが示された。一方、Ａsp278Ｖal、Ａs
p278Ｔyr、Ｓer380Ｇly、Ｓer380ＴhrおよびＳer380Ｔy
rの各変異体については、天然型組換え体以上のヘパリ
ン存在下の即時性のＸa−ＡＴ形成能が保存されてお
り、ヘパリンとの共用による抗血栓症薬としての有効性
も示された。

【００２２】

【表１】

【００２３】

【表２】

【００２４】

【表３】

【００２５】

【発明の効果】本発明により、ヘパリン非存在下でも高
いプロテアーゼ阻害活性を有する適切な立体構造を持つ
新規なヒトアンチトロンビン変異体を提供することがで
きる。本発明の組換えヒトアンチトロンビン変異体は、
例えば血栓性疾病や妊娠中毒症の治療薬として有用であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡＴ組換え変異体発現ベクターの構築（Ｓer38
0Ｈisの例）を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/64 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA19 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 HA04 4C084 AA01 AA02 AA07 BA22 CA18 DC35 ZA542 ZC202 4H045 AA10 CA42 DA56 EA24 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトアンチトロンビンの変異体であっ
て、天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸配列の７８
位、２７８位、３７８位および３８０位のアミノ酸の少
なくとも１個が他のアミノ酸に変換されていることを特
徴とするヒトアンチトロンビン変異体。
【請求項２】天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸
配列の７８位がＰheに変換されていることを特徴とする
請求項１記載のヒトアンチトロンビン変異体。
【請求項３】天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸
配列の２７８位がＡla、Ａrg、Ａsn、Ｇly、Ｈis、Ｔyr
およびＶalから選ばれるアミノ酸に変換されていること
を特徴とする請求項１記載のヒトアンチトロンビン変異
体。
【請求項４】天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸
配列の３７８位がＬys、ＡsnおよびＶalから選ばれるア
ミノ酸に変換されていることを特徴とする請求項１記載
のヒトアンチトロンビン変異体。
【請求項５】天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸
配列の３８０位がＡla、Ａsp、Ｇly、Ｈis、Ｉle、Ｌe
u、Ａsn、Ｐro、Ａrg、Ｔhr、ＴyrおよびＶalから選ば
れるアミノ酸に変換されていることを特徴とする請求項
１記載のヒトアンチトロンビン変異体。
【請求項６】請求項１記載のヒトアンチトロンビン変
異体をコードしているＤＮＡ。