JP2001000191A - ヒトアンチトロンビン変異体 - Google Patents
ヒトアンチトロンビン変異体Info
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Abstract
活性を示すヒトアンチトロンビン異変体を提供すること
にある。 【解決手段】 ヒトアンチトロンビンの変異体であっ
て、天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸配列の78
位、278位、378位および380位のアミノ酸の少
なくとも1個が他のアミノ酸に変換されているヒトアン
チトロンビン変異体。好ましくは、78位がPheによ
り;278位がAla、Arg、Asn、Gly、His、Tyrま
たはValにより;378位がLys、AsnまたはValによ
り;および/あるいは380位がAla、Asp、Gly、H
is、Ile、Leu、Asn、Pro、Arg、Thr、Tyrまたは
Valにより変換されているヒトアンチトロンビン変異
体。
Description
でも高プロテアーゼ阻害活性を有する人工のヒトアンチ
トロンビン変異体に関する。さらに詳しくは、本発明は
天然のヒトアンチトロンビン分子の立体構造を遺伝子操
作によって改変した変異体であって、ヘパリン結合後の
立体構造を有するヒトアンチトロンビン変異体に関す
る。該変異体は、例えばDIC、血栓性疾病や妊娠中毒
症の治療に用いることができるものである。
アンチトロンビン活性のあることが示され、アンチトロ
ンビンIからVIまでが提唱された。しかし、今日までに
タンパク質として単離されたのはアンチトロンビンIII
だけであることから、現在では、アンチトロンビンIII
は単にアンチトロンビンと呼ばれている。従って本発明
において以下アンチトロンビンIIIをアンチトロンビン
と称する。
のプロテアーゼ阻害活性を有する分子量58,000の
一本鎖の糖タンパク質である。天然のヒトアンチトロン
ビンは464個のアミノ酸残基からなる前駆体タンパク
質として生合成されるが、分泌過程において、32残基
からなるシグナルペプチド部分が切り離されるため、血
管内を循環する成熟ヒトアンチトロンビンは432個の
アミノ酸残基からなる。6個のシステイン残基(Cys)
はすべてジスルフィド結合を形成しており、Cys8−C
ys128、Cys21−Cys95およびCys247−Cys430の3個
所のS−S架橋でヒトアンチトロンビン分子を安定化し
ている。天然のヒトアンチトロンビンには約15%の糖
が含まれており、4ヶ所のアスパラギン残基(Asn96、A
sn135、Asn155およびAsn192)に複合型糖鎖が結合して
いる。天然のヒトアンチトロンビンの分子中、プロテア
ーゼの活性中心と直接相互作用し、結合する箇所は反応
部位と呼ばれ、ペプチド鎖のC末端近くのArg393−Se
r394である。
ンチトリプシンやヘパリンコファクターIIと同様にセル
ピン(Serpins)スーパーファミリーに属する血漿タン
パク質で、トロンビン、活性化X因子(Xa因子)、活
性化IX(IXa因子)など主要な凝固酵素の活性を制御す
る凝固系の主要な制御因子である。このような薬理活性
を有する天然のヒトアンチトロンビンは、凝固の異常亢
進の補正、具体的には血管内凝固症候群(DIC)や妊娠
中の高血圧、蛋白尿、浮腫を主徴とする妊娠中毒症およ
び先天性ヒトアンチトロンビン欠乏に基づく血栓形成傾
向の治療を目的として用いられている。
高い親和性があり、ヘパリン存在下でトロンビンやXa
因子に対する阻害速度は、それぞれ1000倍と300
倍に促進されることが良く知られている。
天然のヒトアンチトロンビンのN末端領域にヘパリン結
合部位があり、C末端近傍にプロテアーゼとの反応部位
(Arg393−Sre394)があることが明らかにされている。
また、天然の血中ヒトアンチトロンビンの5〜10%
は、Asn135に糖鎖が結合していない分子種(ヒトアン
チトロンビン β)で、主要な分子種(ヒトアンチトロ
ンビン α)よりも高いヘパリン親和性を示す。
中セルピンと同様に三次元構造的にはA、BおよびCの
3方向に大別される逆平行βシートからなる多数のスト
ランド(s1A〜s4Cと略)、9個のα−ヘリックス(hA〜
hIと略)とコイル構造部分で構成されるタンパク質であ
る(Stein PE, Carrell RW, Nature Struct Biol 2:96
1995)。最近、天然型(native form)と潜在型(laten
t form)のアンチトロンビン二量体の2.6Å分解能で
のX線結晶構造(Skinner R., et al., J.Mol.Biol.
266: 601, 1997)や、高親和性ヘパリンのコア部分のペ
ンタサッカライドとの複合体の2.9Å分解能での結晶
構造が報告され(Jin L.,et al, Proc.Natl. Acad. Sc
i. USA, Vol.94: 14683,1997)、天然のヒトアンチト
ロンビンとヘパリンの三次元相互作用部位とヘパリン結
合によるヒトアンチトロンビン分子内の動的構造変化が
示された。
アンチトロンビン分子内の動的構造変化から、ヒトアン
チトロンビンはヘパリン非存在下ではインヒビターとし
て「不完全」なセルピンであり、ヘパリン存在下ではじ
めて「完全」なインヒビターとなると考えた。
トロンビン中の特定のアミノ酸を変換してヘパリン非存
在下でも高いプロテアーゼ阻害活性を有するヒトアンチ
トロンビン変異体の作製が試みられている。例えば、天
然のヒトアンチトロンビンの49位、96位、135
位、155位、192位、393位および394位のア
ミノ酸の1個または2個以上が他のアミノ酸に変換され
たヒトアンチトロンビン変異体が開示されている(特開
平2−262598公報)。また、11〜14位、41
〜47位、125〜133位および384〜398位の
4つの領域のアミノ酸が、それぞれの領域、単独で又は
組み合せで少なくとも1個、他のアミノ酸に変換された
ヒトアンチトロンビン変異体が開示されている(特開平
5−339292公報)。しかしながら、これらの変異
体の効力は必ずしも十分ではなく、ヘパリン非存在下で
更に強いプロテアーゼ阻害活性を持つヒトアンチトロン
ビン変異体の作製が望まれている。
パリン非存在下で完全なインヒビターとして機能し、高
いプロテアーゼ阻害活性を有する新規なヒトアンチトロ
ンビン変異体を提供することにある。
プロテアーゼインヒビターとして機能する際、ヒトアン
チトロンビン中の反応ループに大きな構造変化がおこ
る。つまり、天然のヒトアンチトロンビンの分子表面に
突出している反応ループが標的プロテアーゼの「基質」
として認識され、反応部位[P1(Arg393)−P1′(Ser39
4)]のペプチド結合がプロテアーゼにより切断される。
この際、P1位Arg393のカルボニル炭素とプロテアーゼ
の活性中心Ser195の水酸基の酸素との間にアシル結合
が形成されてアシル酵素複合体となると同時に、切断さ
れた反応ループのN末端側15残基(P1〜P15)が s3
Aとs5A間に入り込み、新たなストランド(s4A)とな
る。この際、Arg393はプロテアーゼを伴って、ヒトア
ンチトロンビン分子の端から端まで約70Å移動する。
この動的変化がプロテアーゼとの安定な複合体形成に重
要と考えられている。天然のヒトアンチトロンビンやプ
ラスミノーゲンアクチベータインヒビター1では反応部
位が切断されていないにもかかわらず、s4Aとして分
子内に挿入された潜在型(latent form)の存在も知ら
れており、s4Aの形成がセルピンの安定な構造と考え
られている。
は分子表面に完全に露出しており、P1位Met358の側鎖
が分子の外側に配向され、セリンプロテアーゼの活性部
位と相補的な立体配座(コンフォメーション)を形成し
ているので、プロテアーゼとの反応性が高く、切断後の
反応ループの分子内挿入が起こりやすい。しかし、天然
のヒトアンチトロンビンのP1位Arg393の側鎖は分子の
内側に配向されているためプロテアーゼとの反応性がき
わめて低い(Jin L.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA, 94: 14683, 1997)。本発明者はさらに重要な
点として、天然のヒトアンチトロンビンの反応ループが
P14位(Ser380)とP15位(Gly379)においてストランド
内に入り込んでいるため、ストランドに歪を与え、切断
された反応ループの挿入も起こりにくい点に注目した。
ヘパリンが天然のヒトアンチトロンビンに結合するとヒ
トアンチトロンビン分子中の様々な部位で立体構造上の
変化がおこるが、このP14位(Ser380)とP15位(Gly37
9)のアミノ酸はヘパリン結合のアロステリック的影響
(立体障害的な影響)を受けてストランドから押し出さ
れ、α−アンチトリプシンと同じ位置に移動する(Jin
L.,et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94: 14683,
1997)。
ン、プラスミノーゲンアクチベータインヒビター1およ
びα1−アンチトリプシン中のそれぞれの反応ループに
関する立体構造変化を解析、検討することにより、天然
のヒトアンチトロンビン中のP14位(Ser380)がヘパリ
ン非存在下で完全なインヒビターとして機能し、高いプ
ロテアーゼ阻害活性を有する適切な立体構造を作製する
ための重要な部位であると判断した。さらに、本発明者
は、天然のヒトアンチトロンビンの反応ループにおける
P15〜P10位は、近位ヒンジ領域(proximal hinge)と呼
ばれていることから、そのヒトアンチトロンビン中にお
ける立体構造的な特徴を検討した。その結果、この近位
ヒンジ領域は反応ループがs4Aとして入り込む際のヒン
ジ(蝶番)の役割を担っていることから、その基部にあ
たるP16位(Glu378)もP14位と同様に高いプロテアーゼ
阻害活性を有する適切な立体構造を持つヒトアンチトロ
ンビン変異体を作製するために適切なアミノ酸に変換す
べき部位であると判断した。
ループはプロテアーゼによって切断を受けると、s3Aとs
5A間にs4Aとして分子内に挿入されるが、これらのスト
ランド間が開く際に関与している領域がhB(Ser79〜Thr
90) を中心とするシャッター(shutter)領域であるこ
とが知られている(Stein PE, Carrell RW,Nature Str
uct Biol 2: 96,1995)。本発明者は、s3Aとs5A間が開
く際には、まず両ストランド間の水素結合が切断された
後、これらストランドがhBの溝の上をスライドし、こ
の領域の「開きやすさ」が反応ループの「入りやすさ」
と関係するとの知見を得た。つまり、天然のヒトアンチ
トロンビンのシャッター領域はs3Aとs5A間の開閉に影響
を与え、さらにヘパリンとの結合やアンチトロンビンの
活性にも影響を与える重要な領域であり、このシャッタ
ー領域の基部にあたる78位(Leu78)を他のアミノ酸
に変換することにより高いプロテアーゼ阻害活性を有す
る適切な立体構造を持つヒトアンチトロンビン変異体を
作製することができると判断した。
のヒトアンチトロンビンの動的構造変化とプロテアーゼ
阻害活性の促進について特にヘパリン結合領域の各アミ
ノ酸の立体構造を解析、検討した。これまで、天然のヒ
トアンチトロンビン中のヘパリン結合領域は、47位の
ArgがCysに変換されたアンチトロンビン富山(Koide
T., Takahashi K., et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA, 81:289,1984)などの異常症例の解析や化学修飾実
験、さらには部位特異的変異体の解析によって、hAとh
Dに存在する塩基性アミノ酸残基群であることが明らか
にされてきたが、前述のX線結晶構造解析(Jin L., et
al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94: 14683, 199
7)によって、天然のヒトアンチトロンビンのヘパリン
由来ペンタサッカライド結合部位は、hD(Lys125やArg
129の側鎖)、hA(Arg46やArg47の側鎖、およびAsn45の
主鎖アミド)、N末端領域(Lys11、Arg13の側鎖と主鎖
アミド)とhC−hD間にペンタサッカロイド結合により
新生する「P−ヘリックス」(Pはペンタサッカロイド
に由来する)中のGlu113の主鎖アミドとLys114の側鎖
および主鎖アミドであることが明らかになった。ペンタ
サッカライドが接触すると、Arg46とArg47はそれぞれ
17Åと8Å移動して糖鎖の硫酸基と水素結合を形成す
る。また、hDはs2Aとs3Aを押す方向へ約10度傾き、そ
のN末端側のGlu113〜Gln118のコイル構造が2回転の
hPとなり、hDに対して直角方向に形成される。さら
に、hDのC末端側も1.5回転分のヘリックスが形成さ
れて、Arg132、Lys133、Lys136の側鎖がペンタサッ
カライド結合部位の方向を向くようになる。これらの残
基はペンタサッカライドとは離れているので、両者の間
に水素結合は形成されないが、長鎖ヘパリンとは相互作
用する可能性が高いと考えられている。また、hDが伸
長することによるアロステリック効果で、上述のヒトア
ンチトロンビンの天然型ではストランド内に入り込んで
いた反応ループ内のP14、P15位のアミノ酸残基が押し出
され、ストランドの歪みがなくなるとともにP1位Arg3
93の側鎖が分子の外側を向くようになり、インヒビター
として反応しやすい形に変換される(Pike RN, et a
l.,J.Biol.Chem.272:19652, 1997)。また、ヒト
アンチトロンビンのN末端部分(Ile22〜Arg46)は、ペ
ンタサッカライドが結合すると大きく移動してアンチト
ロンビン−ペンタサッカライド複合体を安定化する立体
的なゲートとしての役割を担っている(Fitton, HL, et
al., Protein science 7: 782,1998)。天然のヒトア
ンチトロンビンの天然型(native form)と潜在型(lat
ent form)の立体構造を比較すると、天然型のhDはわ
ずかにねじれており、ヘパリン結合部位であるArg47、
Lys125およびArg129はペンタサッカライド結合領域の
方向を向き、Arg129のNε基はAsp278の側鎖と水素結
合を形成して側鎖を安定化することにより、ペンタサッ
カライドの硫酸基とイオン的な相互作用をしやすくして
いる。しかし、潜在型(latent form)では、hDはまっ
すぐに伸び、Arg47はSer112と、Lys125はIle7と水
素結合しており、ヘパリン結合に重要なアミノ酸残基の
領域はすべてヘパリン結合領域の方向に向いていない
(Skinner R., et al., J.Mol.Biol.266:601,199
7)。そこで、本発明者はArg129とAsp278の水素結合
をあらかじめ切っておくことで、ヘパリン非存在下であ
ってもヘパリン存在下と類似の立体構造に変化させるこ
とができると判断した。そこで、Arg129と水素結合し
ている278位(Asp278)のアミノ酸を他のアミノ酸に
変換することにより高いプロテアーゼ阻害活性を有する
適切な立体構造を持つアンチトロンビン変異体を作製で
きると考えた。
れた天然のヒトアンチトロンビンのヘパリン結合による
アンチトロンビンの動的構造変化に関する情報を検討し
たうえで、天然のヒトアンチトロンビンのプロテアーゼ
阻害活性促進に好ましい立体構造上の変換部位を導き出
した。すなわち、天然のヒトアンチトロンビンの反応ル
ープのヒンジ領域、s4A形成時のヒンジ領域、さらにヘ
パリン結合に関連する部位を1または2以上他のアミノ
酸に変換することにより高いプロテアーゼ阻害活性を有
する適切な立体構造を持つヒトアンチトロンビン変異体
を作製することができるとの結論を得た。このような結
論に基づき、本発明者はヒトアンチトロンビン変異体の
改良を鋭意研究した結果、高いプロテアーゼ阻害活性を
有する適切な立体構造を持つ新規なヒトアンチトロンビ
ン変異体作製に成功し本発明を完成した。
ロンビンの変異体であって、天然のヒトアンチトロンビ
ンのアミノ酸配列の78位、278位、378位および
380位のアミノ酸の少なくとも1個が他のアミノ酸に
変換されていることを特徴とするヒトアンチトロンビン
変異体よりなる。これらのヒトアンチトロンビン変異体
のうち、次のものが特に好ましい:ヒトアンチトロンビ
ンのアミノ酸配列の78位がPheに変換されているヒト
アンチトロンビン変異体、ヒトアンチトロンビンのアミ
ノ酸配列の278位がAla、Arg、Asn、Gly、His、
TyrおよびValから選ばれるアミノ酸に変換されている
ヒトアンチトロンビン変異体、ヒトアンチトロンビンの
アミノ酸配列の378位がLys、AsnおよびValから選
ばれるアミノ酸に変換されているヒトアンチトロンビン
変異体、ヒトアンチトロンビンのアミノ酸配列の380
位がAla、Asp、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pr
o、Arg、Thr、TyrおよびValから選ばれるアミノ酸
に変換されているヒトアンチトロンビン変異体。さらに
本発明は上記ヒトアンチトロンビン変異体をコードして
いるDNAよりなる。
は部位特異的変異導入法によってヘパリン結合後の立体
構造に類似する変異体を作製した。以下に、具体的な変
異体作製方法を記載し、本発明をさらに具体的に説明す
る。天然型アンチトロンビンcDNA(1本鎖)2.5μg
(10μl)にアミノ酸置換のための変異プライマー(0.4
75 OD/ml)30μlをアニーリングさせ、DNAポリメ
ラーゼで全長を合成させた。次に、塩基配列を決定して
変異導入を確認した。各アンチトロンビン変異体cDNA
(1.4kb)をpcD2ベクターのEcoRI部位に組み込み、EdoR
IとPstIで切り出して、挿入配列の方向を確認した。順
方向に組み込まれたものについて、大量調製のために、
リン酸カルシウム法で、BHK細胞にトランスフェクト
した(図1)。G418でネオマイシン耐性の安定発現
細胞を選択し、それらをプールした。安定発現BHK
(baby hamster kidney)細胞のプールを用いてパルス
−チェイス実験を行った。直径35mmのディッシュに5
×105個の細胞をまき、一晩培養した。EXPRE35S35S
(100μCi/ml)を6.8μl添加し、30分ラベル後、培
養液をDME/10%FCS、Met、Cysに交換して8
時間チェイスを行い、0、0.5、1、2、4、8時間
後の培養上清液(CM)と細胞抽出液(CE)を得た。各時
間毎のCMとCEを抗体とStaphylosorbTMで免疫沈降
後、8%SDS−PAGE(+SH)を行い、得られた当該RI
バンドのRI量を定量することによって、組み換え変異
体の分泌量を定量した。分泌量の高い変異体について
は、8時間チェイス後のCMを回収した。回収液500
μlに対して、トロンビンまたはXa因子を加え、ヘパリ
ン非存在下では、37℃、5分と60分、ヘパリン存在
下では、5分反応後、免疫沈降し、10%SDS−PAGE
(+SH)で複合体量を定量した。
泌性について、表1にまとめて示した。パルスラベル時
の放射線量を100%とした時のチェイス8時間後の細
胞内量と分泌量を示したものであるが、天然型組換え体
の分泌量が89%であったのに対して、78位のLeuが
Pheに変換されているLeu78Phe変異体は分泌量が90
%であった。また、278位のAspがAla、 Gly、Hi
sまたはTyrに変換されている変異体(Asp278Ala、Asp2
78Gly、Asp278HisまたはAsp278Tyr)では、それぞれ1
04%、104%、165%または160%と天然型組
換え体以上の分泌性が得られた。一方で、278位のA
spがArg、AsnまたはValに変換されている変異体(As
p278Arg、Asp278AsnまたはAsp278Val)では、それぞれ
57%、48%または51%の分泌性であった。380
位のSerがAla、Arg、Asn、Asp、Gly、His、Pr
o、Thr、TyrまたはValに変換されている変異体(Ser
380Ala、Ser380Arg、Ser380Asn、Ser380Asp、Ser380Gl
y、Ser380His、Ser380Pro、Ser380Thr、Ser380Tyrまた
はSer380Val) では、いずれも良好な分泌性が得られた
が、なかでも、AsnとValに変換された変異体では、そ
れぞれ154%と144%と高い分泌性が得られた。
体(TAT)形成能を調べた結果を表2にまとめて示し
た。本発明の最大の効果であるヘパリン非存在下での即
時性のTAT形成能は、天然型組換え体のTAT形成能
を100%とした相対値が、78位のLeuがPheに変換
されているLeu78Phe変異体では131%、278位の
AspがHisに変換されているAsp278His変異体では1
63%、さらに、380位のSerがGlyまたはTyrに変
換されているSer380GlyとSer380Tyr変異体では、そ
れぞれ171%と172%であり、いずれも天然型組換
え体よりも高性能な変異体が得られている。さらに、表
2に示した変異体は、いずれも長時間(120分)のトロ
ンビンとの相互作用においても、天然型組換え体と同程
度(Leu78Phe、Asp278HisおよびSer380Ala変異
体)、あるいは天然型組換え体以上(Asp278Ala、As
p278Val、Asp278Tyr、Ser380GlyおよびSer380Ty
r変異体)の安定したTAT形成能を有していた。ま
た、ヘパリン存在下の即時性のTAT形成能について
は、いずれも変異体でも保存されており、ヘパリンとの
共用による抗血栓症薬としての有効性も示された。
(Xa−AT)形成能を調べた結果を表3にまとめて示し
た。本発明の最大の効果であるヘパリン非存在下での即
時性のXa−AT形成能は、天然型組換え体のXa−AT
形成能を100%とした相対値が、78位のLeuがPhe
に変換されているLeu78Phe変異体では106%であっ
た。また、278位のAspがGly、HisまたはTyrに変
換されているAsp278Gly、Asp278HisまたはAsp278
Tyr変異体では、それぞれ144%、171%または1
31%であり、いずれも天然型組換え体よりも高性能な
変異体が得られている。さらに、長時間(60分)のXa
因子との相互作用においても、天然型組換え体と同程度
(Leu78Phe、Asp278Gly、Asp278HisおよびSer380Tyr変
異体)、あるいは天然型組換え体以上(Asp278Val、Asp
278TyrおよびSer380Gly変異体)の安定したTAT形成
能を有していた。また、ヘパリン存在下の即時性のXa
−AT形成能は、Leu78Phe、Asp278AlaおよびAsp2
78Gly変異体では、天然型組換え体に比べてほぼ半減し
ており、ヘパリン非依存性の高性能Xa因子阻害剤とし
て有効であることが示された。一方、Asp278Val、As
p278Tyr、Ser380Gly、Ser380ThrおよびSer380Ty
rの各変異体については、天然型組換え体以上のヘパリ
ン存在下の即時性のXa−AT形成能が保存されてお
り、ヘパリンとの共用による抗血栓症薬としての有効性
も示された。
いプロテアーゼ阻害活性を有する適切な立体構造を持つ
新規なヒトアンチトロンビン変異体を提供することがで
きる。本発明の組換えヒトアンチトロンビン変異体は、
例えば血栓性疾病や妊娠中毒症の治療薬として有用であ
る。
0Hisの例)を示す。
Claims (6)
- 【請求項1】 ヒトアンチトロンビンの変異体であっ
て、天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸配列の78
位、278位、378位および380位のアミノ酸の少
なくとも1個が他のアミノ酸に変換されていることを特
徴とするヒトアンチトロンビン変異体。 - 【請求項2】 天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸
配列の78位がPheに変換されていることを特徴とする
請求項1記載のヒトアンチトロンビン変異体。 - 【請求項3】 天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸
配列の278位がAla、Arg、Asn、Gly、His、Tyr
およびValから選ばれるアミノ酸に変換されていること
を特徴とする請求項1記載のヒトアンチトロンビン変異
体。 - 【請求項4】 天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸
配列の378位がLys、AsnおよびValから選ばれるア
ミノ酸に変換されていることを特徴とする請求項1記載
のヒトアンチトロンビン変異体。 - 【請求項5】 天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸
配列の380位がAla、Asp、Gly、His、Ile、Le
u、Asn、Pro、Arg、Thr、TyrおよびValから選ば
れるアミノ酸に変換されていることを特徴とする請求項
1記載のヒトアンチトロンビン変異体。 - 【請求項6】 請求項1記載のヒトアンチトロンビン変
異体をコードしているDNA。
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