WO2000078811A1 - Variants d'antithrombine humaine - Google Patents

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antithrombin
heparin
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Takehiko Koide
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Aventis Pharma Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
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    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
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    • C07K14/8121—Serpins
    • C07K14/8128—Antithrombin III
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to an artificial human anti-thrombin mutant having a high protease inhibitory activity even in the absence of heparin. More specifically, the present invention relates to a mutant obtained by modifying the three-dimensional structure of a natural human antithrombin molecule by genetic manipulation, and to a human antithrombin mutant having a three-dimensional structure after heparin binding.
  • the mutant can be used, for example, for the treatment of DIC thrombotic diseases and toxemia of pregnancy.
  • antithrombin II is hereinafter referred to as antithrombin.
  • Natural human antithrombin is a single-chain glycoprotein with a molecular weight of 58,000, which has protease inhibitory activity in the blood coagulation system. Natural human antithrombin is biosynthesized as a precursor protein consisting of 464 amino acid residues.However, during the secretion process, the signal peptide part consisting of 32 residues is cleaved off, resulting in the invasion of blood vessels. The circulating mature human antithrombin is composed of 432 amino acid residues.
  • Natural human antithrombin like i-antitrypsin and heparin cofactor II, is a plasma protein belonging to the Serpins superfamily. Thrombin, activated factor X (factor Xa), activated IX (factor IXa) It is a major regulator of the coagulation system that controls the activity of major coagulation enzymes. Naturally occurring human antithrombin having such pharmacological activities can correct abnormal hypercoagulability, specifically, toxicosis predominantly characterized by intravascular coagulation syndrome (DIC), hypertension during pregnancy, proteinuria, and edema. It is used to treat thrombophilia due to congenital human antithrombin deficiency.
  • DIC intravascular coagulation syndrome
  • natural human antithrombin molecules have a large number of strands composed of antiparallel / 3-sheets (slA ⁇ ) which are roughly classified into three directions, ⁇ , ⁇ and C. It is a protein composed of nine ⁇ -helices (abbreviated as hA to hI) and a coil structure (Stein PE, Carrel 1 RW, Nature Struct Biol 2:96 1995). Recently, the X-ray crystal structures at 2.6 A resolution of native and latent forms of antithrombin dimer (Skinner K., et al., J. Mol. Biol.
  • human antithrombin is an ⁇ incomplete '' serpin as an inhibitor in the absence of heparin, and in the presence of heparin For the first time I thought it would be a "complete" inhibitor.
  • One or more of the amino acids at positions 9, 9, 96, 135, 155, 192, 393 and 394 are converted to other amino acids. Further, a human antithrombin mutant has been disclosed (Japanese Patent Application Laid-Open No. H2-262598). Also, 11th to 14th,
  • At least one amino acid in each of the four regions at positions 41 to 47, 125 to 133, and 384 to 398 is at least one in each region, alone or in combination.
  • a human antithrombin mutant that has been converted to a homolog is disclosed (JP-A-5-339292). However, the efficacy of these mutants is not always sufficient, and it is desired to produce human antithrombin mutants that have stronger protease inhibitory activity in the absence of heparin.
  • An object of the present invention is to provide a novel human antithrombin mutant that functions as a complete inhibitor in the absence of heparin and has high protease inhibitory activity.
  • Arg393 moves about 70 people from end to end of the human antithrombin molecule with protease. This dynamic change is thought to be important for stable complex formation with protease.
  • the presence of a latent form inserted into the molecule as s4A is known even though the reaction site is not cleaved.
  • the formation of s 4 A is considered to be a stable structure of serpins.
  • the reaction loop of natural ⁇ -antitrypsin is completely exposed on the surface of the molecule, and the side chain of Pet Met358 is oriented to the outside of the molecule.
  • the conformation complementary to the active site of serine protease (conformation) which has high reactivity with protease, and is likely to cause intramolecular insertion of the reaction loop after cleavage.
  • the side chain of Pg Arg393 of natural human antithrombin is oriented inside the molecule, its reactivity with protease is extremely low (Jin L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 14683, 1997).
  • the present inventor has previously described human antithrombin, analyzing the conformational changes for each reaction loop of plasminogen ⁇ lipped base a pair inhibitor development 1 and alpha iota _ anti trypsin, by studying the natural human Toanchi P14 position (Ser380) in thrombin functions as a complete inhibitor in the absence of heparin and is high It was determined to be an important site for producing an appropriate three-dimensional structure having protease inhibitory activity. Furthermore, the present inventors have proposed that the positions P15 to P10 in the natural human antithrombin reaction loop are referred to as a proximal hinge region (proximal hinge). It was investigated.
  • this proximal hinge region plays the role of hinge (hinge) when the reaction loop enters as s4A, its base, P16 (Glu378), has the same high protease inhibitory activity as P14. It was determined to be a site to be converted to an appropriate amino acid in order to produce a human antithrombin mutant having an appropriate tertiary structure having
  • the natural human anti-thrombin reaction loop is cleaved by protease, it is inserted into the molecule as s4A between s3A and s5A, and the region involved in opening between these strands Is known to be a shutter region centered on hB (Ser79 to Thr90) (Stein PE, Carrell RW, Nature Struct Biol 2:96, 1995).
  • the gap between s3A and s5A is opened, the inventor first cuts off the hydrogen bond between both strands, and then these strands slide on the groove of hB, and the "easy to open" was found to be related to the ease of entry of the reaction loop.
  • the shutter region of natural human antithrombin is an important region that affects the opening and closing between s3A and s5A, and also affects the binding to heparin and the activity of antithrombin. It was concluded that a human antithrombin mutant having an appropriate three-dimensional structure having high protease inhibitory activity could be prepared by converting the 8th position (Leu78), which corresponds to the above, into another amino acid.
  • the present inventors analyzed and studied the dynamic structural change of natural human antithrombin and the promotion of protease inhibitory activity by heparin binding, particularly the three-dimensional structure of each amino acid in the heparin binding region.
  • the heparin-binding region in natural human antithrombin has been developed by antithrombin Toyama (Koide T., Takahashi K., et al., Pro atl. Acad. Sci.) In which Arg at position 47 has been converted to Cys. .USA, 81: 289, Analysis of abnormal cases such as 1984), chemical modification experiments, and analysis of site-specific mutants have revealed that these are basic amino acid residues present in hA and hD.
  • the N-terminal portion of human antithrombin plays a role as a three-dimensional gate that stabilizes the antithrombin-pentapentahlide complex when it is bound by pen saccharide. (Fitton, HL, et al., Protein science 7: 782, 1998). Comparing the three-dimensional structures of native and latent forms of native human antithrombin, the hD of the native form is slightly twisted, and the heparin binding sites Arg47, Lys25 and Lysl25.
  • Argl29 point in the direction of the pentasadlide bond region, and the ⁇ group of the Argl29 forms a hydrogen bond with the side chain of Asp278 to stabilize the side chain, thereby forming the pentasadlide sulfate. It facilitates ionic interaction with the group.
  • hD elongates immediately, Arg47 hydrogen bonds with Serl12, Lysl25 hydrogen bonds with Ile7, and is a region of amino acid residues important for heparin binding. Are not all oriented in the direction of the heparin binding region (Skinner R., et al., J. Mol. Biol. 266: 601, 1997).
  • the present inventor has determined that by pre-cutting the hydrogen bond between Argl29 and Asp278, it is possible to change the three-dimensional structure similar to that in the presence of heparin even in the absence of heparin. Where it is hydrogen bonded to Argl29
  • the present inventor examined the information on the dynamic structural change of antithrombin due to heparin binding of natural human antithrombin analyzed so far, and found that the protease inhibitory activity of natural human antithrombin was A conversion site on the steric structure that is preferable for promotion was derived. That is, by appropriately converting the hinge region of the reaction loop of natural human antithrombin, the hinge region during s4A formation, and the site related to heparin binding to one or two or more other amino acids, an appropriate protease inhibitory activity is obtained. It was concluded that a human antithrombin mutant having a unique three-dimensional structure could be produced.
  • the present inventors have conducted intensive studies on the improvement of the human antithrombin mutant, and as a result, succeeded in producing a novel human antithrombin mutant having an appropriate three-dimensional structure having high protease inhibitory activity, and completed the present invention. Done.
  • the present invention relates to a mutant of natural human antithrombin, wherein the amino acid sequence at positions 78, 278, 378 and
  • human antithrombin variant characterized in that at least one of the amino acids at position 380 has been converted to another amino acid.
  • the present invention comprises a DNA encoding the above human antithrombin mutant.
  • FIG. 1 shows the construction of an AT recombinant mutant expression vector (example of Ser380His).
  • novel human antithrombin mutant of the present invention produced a mutant similar to the three-dimensional structure after heparin binding by site-directed mutagenesis.
  • Neomycin resistant stably expressing cells were selected with G418 and pooled.
  • a pulsed one-thirds experiment was performed using a pool of stably expressed BHK (baby hamster kidney) cells. 5 ⁇ 10 5 cells were seeded on a 35 mm diameter dish and cultured.
  • CM culture supernatant
  • CE cell extract
  • CM For mutants with high secretion, CM after 8 hours of chase was collected. Add thrombin or factor Xa to the recovered solution 500 ⁇ 1, and in the absence of heparin, at 37 ° C for 5 minutes and 60 minutes.In the presence of heparin, react for 5 minutes and immunoprecipitate, 10% The amount of the complex was determined by SDS-PAGE (+ SH).
  • Table 1 summarizes the secretivity of each antithrombin recombinant mutant from BHK cells. The figure shows the intracellular and secretory amounts 8 hours after the chase when the radiation dose at the time of pulse labeling was set to 100%, whereas the secretion amount of the natural recombinant was 89%.
  • the Leu78Phe mutant in which Leu at position 78 was converted to Phe had 90% secretion.
  • Asp at position 278 is converted to Ala, Gly, His, or Tyr (Asp278Ala, Asp278Gly, Asp278His, or Asp278Tyr)
  • the natural recombinant is 104%, 104%, 165%, or 160%, respectively. Secretion more than the body was obtained.
  • mutants in which Asp at position 278 was converted to Arg, Asn, or Val had 57%, 48%, or 51% secretion, respectively.
  • Mutants in which Ser at position 380 has been converted to Ala, Arg, Asn, Asp, Gly, His, Pro. Thr, Tyr or Val (Ser380Ala, Ser380Arg, Ser380Asn, Ser380Asp, Ser380Gly, Ser380His, Ser380Pro, Ser380Thr, Ser380Tyr or Ser380Val) produced good secretion properties, but the mutants converted to Asn and Val showed high secretion rates of 154% and 144%, respectively.
  • TAT thrombin
  • Table 2 summarizes the results of examining the ability of each antithrombin recombinant mutant to form a complex with thrombin (TAT).
  • TAT thrombin
  • mutants shown in Table 2 were similar to the naturally-occurring recombinants (Leu78Phe, Asp278His and Ser380Ala mutants) in the long-term (120 minutes) interaction with thrombin, or were naturally-occurring. More than the mutant (Asp278Ala, Asp278Val, Asp278Tyr, Ser380Gly and Ser380Tyr mutants) had a stable TAT-forming ability.
  • Table 3 summarizes the results of examining the ability of each antithrombin recombinant mutant to form a complex with factor Xa (Xa-AT).
  • the maximum effect of the present invention that is, the immediate Xa-AT-forming ability in the absence of heparin, was determined by comparing the relative value of the natural recombinant to the Xa-AT-forming ability of 100% with Leu at position 78. In the Leu78Phe mutant that has been converted to Phe, it was 106%.
  • the mutant In the Asp278Gly, Asp278His, or Asp278Tyr mutant in which Asp at position 278 has been converted to Gly, His, or Tyr, the mutant is 144%, 171%, or 131%, respectively, all of which have higher performance than the natural recombinant.
  • Strange A variant has been obtained.
  • native recombinant comparable Leu78Phe, Asp278Gly, Asp278His and Ser380 Tyr mutant
  • natural recombinant or more As P 278Val , Asp278Tyr and Ser380 Gly mutant.
  • the Ser380Tyr 1 72 122 1 11 value is a relative value with the TAT-forming ability of the natural recombinant AT being 100%.
  • Ser380Tyr 86 90 105 values are relative to the natural recombinant AT, with the Xa-AT formation ability of 100%, Industrial applicability
  • the present invention it is possible to provide a novel human antithrombin mutant having an appropriate three-dimensional structure having high protease inhibitory activity even in the absence of heparin.
  • the recombinant human antithrombin mutant of the present invention is useful, for example, as a therapeutic drug for thrombotic diseases and toxemia of pregnancy.

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Description

明 細 書
ヒ トアンチ ト ロ ンビン変異体
技術分野
本発明は、 へパリン非存在下でも高プロテア一ゼ阻害活性を有する人工のヒ ト アンチトロンビン変異体に関する。 さらに詳しくは、 本発明は天然のヒトアンチ トロンビン分子の立体構造を遺伝子操作によつて改変した変異体であつて、 へパ リン結合後の立体構造を有するヒトアンチトロンビン変異体に関する。 該変異体 は、 例えば D I C . 血栓性疾病や妊娠中毒症の治療に用いることができるもので ある。
背景技術
天然のアンチトロンビンはいく種類ものアンチトロンビン活性のあることが示 され、 アンチトロンビン Iから VIまでが提唱された。 し力、し、 今日までにタンパ ク質として単離されたのはァンチトロンビン IIIだけであることから、 現在では、 アンチトロンビン IIIは単にアンチトロンビンと呼ばれている。 従って本発明に おいて以下アンチトロンビン ΠΙをアンチトロンビンと称する。
天然のヒ トアンチトロンビンは血液凝固系のプロテアーゼ阻害活性を有する 分子量 58 , 000 の一本鎖の糖タンパク質である。 天然のヒトアンチトロンビン は 4 6 4個のァミノ酸残基からなる前駆体タンパク質として生合成されるが、 分 泌過程において、 3 2残基からなるシグナルべプチド部分が切り離されるため、 血管内を循環する成熟ヒ卜アンチトロンビンは 4 3 2個のァミノ酸残基からなる。 6個のシスティン残基 （Cys) はすべてジスルフィ ド結合を形成しており、 Cys 8— C ysl28、 C ys21— C ys95および C ys247— C ys430の 3個所の S— S架橋 でヒトアンチトロンビン分子を安定化している。 天然のヒトアンチトロンビンに は約 1 5 %の糖が含まれており、 4ケ所のァスパラギン残基 （Asn96、 Asnl35、 Asnl55および Asnl92) に複合型糖鎖が結合している。 天然のヒトアンチトロン ビンの分子中、 プロテアーゼの活性中心と直接相互作用し、 結合する箇所は反応 部位と呼ばれ、 ぺプチド鎖の C末端近くの Arg393—S er394である。 天然のヒトアンチトロンビンは、 i—アンチトリプシンやへパリンコファク タ一 IIと同様にセルピン （Serpins) スーパーファミリーに属する血漿タンパク 質で、 トロンビン、 活性化 X因子 （Xa因子） 、 活性化 IX (IXa因子） など主要な 凝固酵素の活性を制御する凝固系の主要な制御因子である。 このような薬理活性 を有する天然のヒトアンチトロンビンは、 凝固の異常亢進の補正、 具体的には血 管内凝固症候群 （DIC) や妊娠中の高血圧、 蛋白尿、 浮腫を主徴とする妊娠中毒 症および先天性ヒトアンチトロンビン欠乏に基づく血栓形成傾向の治療を目的と して用いられている。
天然のヒトアンチトロンビンはへパリンに高い親和性があり、 へパリン存在下 でトロンビンや X a因子に対する阻害速度は、 それぞれ 1 0 0 0倍と 3 0 0倍に 促進されることが良く知られている。
これまでの一次構造レベルの解析により、 天然のヒ トアンチトロンビンの N 末端領域にへパリン結合部位があり、 C末端近傍にプロテアーゼとの反応部位 (Arg393-Sre394) があることが明らかにされている。 また、 天然の血中ヒトァ ンチトロンビンの 5〜1 0 %は、 A snl35に糖鎖が結合していない分子種 （ヒト アンチトロンビン β で、 主要な分子種 （ヒ トアンチトロンビン α ) よりも高 いへパリン親和性を示す。
天然のヒトアンチトロンビン分子は他の血中セルピンと同様に三次元構造的に は Α、 Βおよび Cの 3方向に大別される逆平行 /3シ一卜からなる多数のストラン ド （slA〜s4Cと略） 、 9個の α—へリックス （hA〜hIと略） とコイル構造部分で 構成されるタンパク質である （Stein PE， Carrel 1 RW, Nature Struct Biol 2： 96 1995)。 最近、 天然型 （native form) と潜在型 （latent form) のアンチトロ ンビン二量体の 2. 6 A分解能での X線結晶構造 （Skinner K.， et al. , J. Mol. Biol. 266 : 601, 1997) や、 高親和性へパリンのコア部分のペンタサッカライド との複合体の 2 . 9 A分解能での結晶構造が報告され （Jin L.， et al, Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94 : 14683, 1997)、 天然のヒトアンチトロンビンと へパリンの三次元相互作用部位とへパリン結合によるヒトアンチトロンビン分子 内の動的構造変化が示された。
本発明者はこれまでに、 これら天然のヒトアンチトロンビン分子内の動的構造 変化から、 ヒ トアンチトロンビンはへパリン非存在下ではィンヒビターとして 「不完全」 なセルピンであり、 へパリン存在下ではじめて 「完全」 なインヒビタ 一となると考えた。
これまでの知見をもとに天然のヒトアンチトロンビン中の特定のアミノ酸を変 換してへパリン非存在下でも高いプロテアーゼ阻害活性を有するヒトアンチトロ ンビン変異体の作製が試みられている。 例えば、 天然のヒ トアンチトロンビンの
4 9位、 9 6位、 1 3 5位、 1 5 5位、 1 9 2位、 3 9 3位および 3 9 4位のァ ミノ酸の 1個または 2個以上が他のアミノ酸に変換されたヒトアンチトロンビン 変異体が開示されている （特開平 2— 2 6 2 5 9 8公報） 。 また、 1 1〜1 4位、
4 1〜4 7位、 1 2 5〜1 3 3位および 3 8 4〜3 9 8位の 4つの領域のァミノ 酸が、 それぞれの領域、 単独で又は組み合せで少なくとも 1個、 他のァミノ酸に 変換されたヒトアンチトロンビン変異体が開示されている （特開平 5— 339292 公報） 。 しかしなカ ら、 これらの変異体の効力は必ずしも十分ではなく、 へパリ ン非存在下で更に強いプロテアーゼ阻害活性を持つヒトアンチトロンビン変異体 の作製が望まれている。
発明の開示
本発明の目的は、 へパリン非存在下で完全なインヒビターとして機能し、 高い プロテアーゼ阻害活性を有する新規なヒトアンチトロンビン変異体を提供するこ と ある。
天然のヒトアンチトロンビンがプロテアーゼインヒビターとして機能する際、 ヒ トアンチトロンビン中の反応ループに大きな構造変化がおこる。 つまり、 天 然のヒ トアンチトロンビンの分子表面に突出している反応ループが標的プロテ ァ一ゼの 「基質」 として認識され、 反応部位 [P l (Arg393)— Ρ Γ (Ser394)] のペプチド結合がプロテアーゼにより切断される。 この際、 P 1位 Arg393の力 ルポニル炭素とプロテア一ゼの活性中心 S erl95の水酸基の酸素との間にァシ ル結合が形成されてァシル酵素複合体となると同時に、 切断された反応ループの
N末端側 1 5残基 （P 1〜P15) が s 3 Aと s 5 A間に入り込み、 新たなストラン ド （s4A) となる。 この際、 A rg393はプロテアーゼを伴って、 ヒ トアンチトロ ンビン分子の端から端まで約 7 0人移動する。 この動的変化がプロテアーゼとの 安定な複合体形成に重要と考えられている。 天然のヒトアンチトロンビンゃブラ スミノーゲンァクチべ一夕インヒビタ一 1では反応部位が切断されていないにも かかわらず、 s 4 Aとして分子内に挿入された潜在型 （latent form) の存在も知 られており、 s 4 Aの形成がセルピンの安定な構造と考えられている。
天然型 α—アンチトリブシンの反応ループは分子表面に完全に露出しており、 P 1位 Met358の側鎖が分子の外側に配向され、 セリンプロテアーゼの活性部位と 相補的な立体配座 （コンフォメーンヨン） を形成しているので、 プロテア一ゼと の反応性が高く、 切断後の反応ループの分子内挿入が起こりやすい。 しかし、 天 然のヒ 卜アンチトロンビンの P1位 A rg393の側鎖は分子の内側に配向されてい るためプロテアーゼとの反応性がきわめて低い （Jin L.， et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 : 14683, 1997)。 本発明者はさらに重要な点として、 天然の ヒトアンチトロンビンの反応ループが P14位 （Ser380) と P15位 （Gly379) におい てストランド内に入り込んでいるため、 ストランドに歪を与え、 切断された反応 ループの挿入も起こりにくい点に注目した。 へパリンが天然のヒトアンチトロン ビンに結合するとヒトアンチトロンビン分子中の様々な部位で立体構造上の変化 がおこるが、 この P14位 （Ser380) と P15位 （Gly379) のアミノ酸はへパリン結合 のァロステリ ック的影響 （立体障害的な影響） を受けてストランドから押し出さ れ、 ひ一アンチトリプシンと同じ位置に移動する （Jin L. , et al， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 : 14683, 1997)。
本発明者は、 前述のヒトアンチトロンビン、 プラスミノーゲンァクチべ一タイ ンヒビター 1および α ι _アンチトリプシン中のそれぞれの反応ループに関する 立体構造変化を解析、 検討することにより、 天然のヒ トアンチトロンビン中の P14位 （Ser380) がへパリ ン非存在下で完全なインヒビターとして機能し、 高い プロテアーゼ阻害活性を有する適切な立体構造を作製するための重要な部位であ ると判断した。 さらに、 本発明者は、 天然のヒトアンチトロンビンの反応ループ における P15~P10位は、 近位ヒンジ領域 （proximal hinge) と呼ばれているこ とから、 そのヒトアンチトロンビン中における立体構造的な特徴を検討した。 そ の結果、 この近位ヒンジ領域は反応ループが s4Aとして入り込む際のヒンジ （蝶 番） の役割を担っていることから、 その基部にあたる P16位 （Glu378) も P14位 と同様に高いプロテアーゼ阻害活性を有する適切な立体構造を持つヒトアンチト ロンビン変異体を作製するために適切なァミノ酸に変換すべき部位であると判断 した。
他方、 天然のヒ トアンチトロンビンの反応ループはプロテア一ゼによって切断 を受けると、 s3Aと s5A間に s4Aとして分子内に挿入されるが、 これらのストラン ド間が開く際に関与している領域が hB (Ser79〜Thr90) を中心とするシャツタ 一 (shutter) 領域であることが知られている （Stein PE, Carrell RW， Nature Struct Biol 2 : 96， 1995) 。 本発明者は、 s3Aと s5A間が開く際には、 まず両ス トランド間の水素結合が切断された後、 これらストランドが h Bの溝の上をスラ ィドし、 この領域の 「開きやすさ」 が反応ループの 「入りやすさ」 と関係すると の知見を得た。 つまり、 天然のヒトアンチトロンビンのシャッター領域は s3Aと s5A間の開閉に影響を与え、 さらにへパリンとの結合やアンチトロンビンの活性 にも影響を与える重要な領域であり、 このシャツタ一領域の基部にあたるマ 8位 (Leu78) を他のァミノ酸に変換することにより高いプロテアーゼ阻害活性を有す る適切な立体構造を持つヒトアンチトロンビン変異体を作製することができると 判断した。
次に、 本発明者はへパリン結合による天然のヒトアンチトロンビンの動的構造 変化とプロテア一ゼ阻害活性の促進について特にへパリン結合領域の各ァミノ 酸の立体構造を解析、 検討した。 これまで、 天然のヒトアンチトロンビン中の へパリン結合領域は、 4 7位の Argが C ysに変換されたアンチトロンビン富山 (Koide T.， Takahashi K.， et al.， Pro atl. Acad. Sci. USA, 81 : 289, 1984) などの異常症例の解析や化学修飾実験、 さらには部位特異的変異体の解析 によって、 hAと hDに存在する塩基性アミノ酸残基群であることが明らかにされ てきたが、 前述の X線結晶構造解析 （Jin し， et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 : 14683, 1997) によって、 天然のヒ トアンチトロンビンのへパリン由来 ペンタサッ力ライ ド結合部位は、 hD (Lysl25や Argl29の側鎖）、 hA (Arg46や Arg47の側鎖、 および Asn45の主鎖アミ ド） 、 N末端領域 （Lysll、 Argl3の側鎖 と主鎖アミ ド） と h C— hD間にペンタサッ力ロイ ド結合により新生する 「P—へ リックス」 （Pはペンタサッカロイ ドに由来する） 中の G lull3の主鎖アミ ドと Lysll4の側鎖および主鎖アミ ドであることが明らかになった。 ペンタサッカラ ィ ドが接触すると、 Arg46と Arg47はそれぞれ 1 7人と 8人移動して糖鎖の硫酸 基と水素結合を形成する。 また、 hDは s2Aと s3Aを押す方向へ約 1 0度傾き、 その N末端側の G lull3〜G lnll8のコイル構造が 2回転の hPとなり、 hDに対して直 角方向に形成される。 さらに、 hDの C末端側も 1 . 5回転分のへリックスが形成 されて、 Argl32、 L ysl33、 L ysl36の側鎖がペンタサッカライ ド結合部位の方 向を向くようになる。 これらの残基はペン夕サッカライ ドとは離れているので、 両者の間に水素結合は形成されないが、 長鎖へパリンとは相互作用する可能性が 高いと考えられている。 また、 hDが伸長することによるァロステリック効果で、 上述のヒトアンチトロンビンの天然型ではストランド内に入り込んでいた反応ル ープ内の P14、 P15位のアミノ酸残基が押し出され、 ストランドの歪みがなくなる とともに P 1位 Arg393の側鎖が分子の外側を向くようになり、 インヒビターとし て反応しやすい形に変換される (Pike RN, et al. , J. Biol. Chem. 272： 19652, 1997) 。 また、 ヒ トアンチトロンビンの N末端部分 （Ile22~Arg46) は、 ペン夕 サッカライ ドが結合すると大きく移動してアンチトロンビン一ペンタサッ力ライ ド複合体を安定化する立体的なゲートとしての役割を担っている （Fitton, HL， et al. , Protein science 7 : 782, 1998) 。 天然のヒトアンチトロンビンの天然 型 （native form) と潜在型 （latent form) の立体構造を比較すると、 天然型 の hDはわずかにねじれており、 へパリン結合部位である Arg47、 L ysl25およ び A rg l29はペンタサッ力ライ ド結合領域の方向を向き、 A rgl 29の Ν ε基は Asp278の側鎖と水素結合を形成して側鎖を安定化することにより、 ペンタサッ 力ライ ドの硫酸基とイオン的な相互作用をしやすく している。 しかし、 潜在型 (latent form) では、 h Dはまつすぐに伸び、 A rg47は S erl l2と、 L ysl25は I le 7と水素結合しており、 へパリン結合に重要なアミノ酸残基の領域はすべて へパリン結合領域の方向に向いていない (Skinner R. , et al. , J. Mol. Biol. 266 : 601, 1997) 。 そこで、 本発明者は Argl29と Asp278の水素結合をあらかじめ 切っておくことで、 へパリン非存在下であってもへパリン存在下と類似の立体構 造に変化させることができると判断した。 そこで、 A rgl29と水素結合している
2 7 8位 （Asp278) のアミノ酸を他のアミノ酸に変換することにより高いプロテ ァ一ゼ阻害活性を有する適切な立体構造を持つァンチト口ンビン変異体を作製で きると考えた。
このように、 本発明者はこれまでに解析された天然のヒ卜アンチトロンビンの へパリン結合によるアンチトロンビンの動的構造変化に関する情報を検討したう えで、 天然のヒトアンチトロンビンのプロテアーゼ阻害活性促進に好ましい立体 構造上の変換部位を導き出した。 すなわち、 天然のヒトアンチトロンビンの反応 ループのヒンジ領域、 s4A形成時のヒンジ領域、 さらにへパリン結合に関連する 部位を 1または 2以上他のァミノ酸に変換することにより高いプロテアーゼ阻害 活性を有する適切な立体構造を持つヒ卜アンチトロンビン変異体を作製すること ができるとの結論を得た。 このような結論に基づき、 本発明者はヒトアンチトロ ンビン変異体の改良を鋭意研究した結果、 高いプロテアーゼ阻害活性を有する適 切な立体構造を持つ新規なヒトアンチトロンビン変異体作製に成功し本発明を完 成した。
すなわち、 本発明は、 天然のヒ トアンチトロンビンの変異体であって、 天然 のヒ トアンチトロンビンのアミノ酸配列の 7 8位、 2 7 8位、 3 7 8位および
3 8 0位のァミノ酸の少なくとも 1個が他のァミノ酸に変換されていることを特 徴とするヒトアンチトロンビン変異体よりなる。 これらのヒトアンチトロンビン 変異体のうち、 次のものが特に好ましい：
ヒトアンチトロンビンのァミノ酸配列の 78位が Pheに変換されているヒトァ ンチトロンビン変異体、
ヒトアンチトロンビンのアミノ酸配列の 278位が A la、 Arg、 Asn、 Gly、 His. Tyrおよび Valから選ばれるアミノ酸に変換されているヒトアンチトロン ビン変異体、
ヒトアンチトロンビンのァミノ酸配列の 378位が Lys、 Asnおよび Valから 選ばれるアミノ酸に変換されているヒトアンチトロンビン変異体、
ヒトアンチトロンビンのアミノ酸配列の 380位が Ala、 Asp. Gly、 His. I le、 Leu、 Asn、 Pro、 Arg、 Thr、 Tyrおよび Valから選ばれるアミノ酸に 変換されているヒ トアンチトロンビン変異体。
さらに本発明は上記ヒトアンチトロンビン変異体をコ一ドしている DNAより なる。
図面の簡単な説明
第 1図は、 AT組換え変異体発現ベクターの構築 （Ser380Hisの例） を示 す。
発明を実施するための最良の形態
本発明の新規なヒトアンチトロンビン変異体は部位特異的変異導入法によつ てへパリン結合後の立体構造に類似する変異体を作製した。
以下に、 具体的な変異体作製方法を記載し、 本発明をさらに具体的に説明す 天然型アンチトロンビン cDNA (1本鎖） 2.5 nig (10^1) にァミノ酸置換の ための変異プライマー （0.475 OD/ral) 30〃1をアニーリングさせ、 DNAポ リメラーゼで全長を合成させた。 次に、 塩基配列を決定して変異導入を確認した。 各アンチトロンビン変異体 cDNA (1.4kb) を pcD2ベクターの EcoRI部位に組み込み、 EdoRIと Pstlで切り出して、 挿入配列の方向を確認した。 順方向に組み込まれた ものについて、 大量調製のために、 リン酸カルシウム法で、 BHK細胞にトラン スフェク トした （第 1図） 。 G418でネオマイシン耐性の安定発現細胞を選択、 それらをプールした。 安定発現 BHK(baby hamster kidney) 細胞のプールを用 いてパルス一チヱイス実験を行った。 直径 35mmのディッシュに 5 x 105個の 細胞をまき、 ー晚培養した。 EXPRE35S35S (100 /Ci/ml) を 6.8 1添加し、 30分ラベル後、 培養液を DMEZ10%FCS、 Met. Cysに交換して 8時間 チェイスを行い、 0、 0.5、 1、 2、 4、 8時間後の培養上清液（CM)と細胞 抽出液（C E)を得た。 各時間毎の CMと C Eを抗体と StaphylosorbTMで免疫沈降 後、 8%SDS— PAGE (+SH) を行い、 得られた当該 R Iバンドの R I量を定量す ることによって、 組み換え変異体の分泌量を定量した。
分泌量の高い変異体については、 8時間チェイス後の CMを回収した。 回収液 500〃1に対して、 トロンビンまたは Xa因子を加え、 へパリン非存在下では、 37°C、 5分と 60分、 へパリン存在下では、 5分反応後、 免疫沈降し、 10% SDS— PAGE (+SH) で複合体量を定量した。
1) 分泌性
各アンチトロンビン組換え変異体の BHK細胞からの分泌性について、 表 1に まとめて示した。 パルスラベル時の放射線量を 100%とした時のチェイス 8時 間後の細胞内量と分泌量を示したものであるが、 天然型組換え体の分泌量が 89 %であったのに対して、 78位の Leuが Pheに変換されている Leu78Phe変異体 は分泌量が 90%であった。 また、 278位の Aspが Ala、 Gly、 Hisまたは Tyrに変換されている変異体 (Asp278Ala、 Asp278Gly、 Asp278His または Asp 278Tyr) では、 それぞれ 104%、 104%、 165 %または 160 %と天然型 組換え体以上の分泌性が得られた。
一方で、 278位の Aspが Arg、 Asnまたは Valに変換されている変異体 (Asp278Arg、 Asp278Asnまたは Asp278Val) では、 それぞれ 57%、 48%また は 51%の分泌性であった。 380位の Serが Ala、 Arg、 Asn、 Asp、 Gly、 His、 Pro. Thr、 Tyrまたは Valに変換されている変異体 （Ser380Ala、 Ser 380Arg、 Ser380Asn、 Ser380Asp、 Ser380Gly、 Ser380His、 Ser380Pro、 Ser380Thr、 Ser380Tyrまたは Ser380Val) では、 いずれも良好な分泌性が得られたが、 なかで も、 Asnと Valに変換された変異体では、 それぞれ 154 %と 144 %と高い分 泌性が得られた。
2) トロンビンとの複合体 （TAT) 形成能
各アンチトロンビン組換え変異体のトロンビンとの複合体 （TAT) 形成能を調 ベた結果を表 2にまとめて示した。 本発明の最大の効果であるへパリン非存在下 での即時性の T AT形成能は、 天然型組換え体の T AT形成能を 100%とした 相対値が、 Ί 8位の Leuが P heに変換されている Leu78P he変異体では 131%、 278位の Aspが Hisに変換されている Asp278His変異体では 163%、 さら に、 380位の Serが Glyまたは Tyrに変換されている Ser380Glyと Ser380 Tyr変異体では、 それぞれ 171%と 172%であり、 いずれも天然型組換え体 よりも高性能な変異体が得られている。 さらに、 表 2に示した変異体は、 いずれ も長時間 （120分） のトロンビンとの相互作用においても、 天然型組換え体と同 程度 （Leu78Phe、 Asp278Hisおよび Ser380Ala変異体） 、 あるいは天然型組 換え体以上 （Asp278Ala、 Asp278Val、 Asp278Tyr、 Ser380Glyおよび Ser 380Tyr変異体） の安定した TAT形成能を有していた。
また、 へパリン存在下の即時性の TAT形成能については、 いずれも変異体で も保存されており、 へパリンとの共用による抗血栓症薬としての有効性も示され i
3) Xa因子との複合体 （Xa— AT) 形成能
各アンチトロンビン組換え変異体の Xa因子との複合体 （Xa— AT) 形成能を調 ベた結果を表 3にまとめて示した。 本発明の最大の効果であるへパリン非存在下 での即時性の Xa— AT形成能は、 天然型組換え体の Xa— AT形成能を 100% とした相対値が、 78位の Leuが Pheに変換されている Leu78Phe変異体では 106%であった。 また、 278位の Aspが Gly、 Hisまたは Tyrに変換されて いる Asp278Gly、 Asp278Hisまたは Asp278Tyr変異体では、 それぞれ 144 %、 171%または 131%であり、 いずれも天然型組換え体よりも高性能な変 異体が得られている。 さらに、 長時間 （60分） の Xa因子との相互作用において も、 天然型組換え体と同程度 (Leu78Phe、 Asp278Gly、 Asp278Hisおよび Ser380 Tyr変異体）、 あるいは天然型組換え体以上 （AsP278Val、 Asp278Tyrおよび Ser380 Gly変異体） の安定した TAT形成能を有していた。
また、 へパリン存在下の即時性の Xa— AT形成能は、 Leu78Phe、 Asp278 Alaおよび Asp278Gly変異体では、 天然型組換え体に比べてほぼ半減しており、 へパリン非依存性の高性能 X a因子阻害剤として有効であることが示された。一 方、 Asp278Val、 Asp278Tyr、 Ser380Gly、 Ser380Thrおよび Ser380Tyr の各変異体については、 天然型組換え体以上のへパリン存在下の即時性の Xa— A T形成能が保存されており、 へパリンとの共用による抗血栓症薬としての有効 性も示された。
A T組換え変異体の分泌性
パルスラベル時の放射線量を 100%とした時の チェイス 8時間後の細胞内量と分泌量 組 換 え 体 細胞内量 (％) 計 天然型 1.4 89 90. 4
Le u 78Ph e 10 90 100
A s p 278 A 1 a 16 104 120
A s p 278 A r g 4.6 57 61 6
As p 278As n 4.9 48 52. 9
A s p 278G 1 y 22 104 126
A s p 278H i s 9.2 165 174. 2
As p 278Ty r 16 160 176
A s p 278 V a 1 4.6 51 55. 6
G l u 378Ly s 15 62 77
S e r 380A l a 4.9 79 83. 9
S e r 380Ar g 10 73 83
S e r 380As n 38 154 192
S e r 380A s p 10 83 93
S e r 380G l y 6.1 128 134. 1
S e r 380H i s 8.3 120 128. 3
S e r 380P r o 30 63 93
S e r 380Th r 13 122 135
S e r 38 OTy r 11 78 89
S e r 380Va l 17 144 161 表 2 A T組換え変異体の TAT複合体形成
TAT (%) TAT (%) TAT (%) 組換え体 AT (- -）へパリン， 5分 (一）へパリン， 120分 (+ )へパリン， 5分 天 然 型 100 100 100
Leu78Phe 131 93 81
Asp278Ala 102 丄 08 99
Asp278His 163 Q 89
Asp278Val 90 108 1 04
Asp278Tyr 105 106 104
Ser380Ala 56 86 1 18
Ser380Gly 171 1 12 98
Ser380Tyr 1 72 122 1 1 1 値は天然型組換え体 A Tの T A T形成能を 100%とした相対値である。
3 AT組換え変異体の Xa— AT複合体形成
Xa— AT (%) Xa— AT (%) Xa— AT (%) 組換え体 AT (―)へパリ ン， 5分 (―)へパリ ン， 60分 (+ )へパリ ン， 5分 天 然 型 100 100 100
Leu78Phe 106 88 53
Asp278Ala 80 56 44
Asp278Gly 144 87 54
Asp278His 171 80 89
Asp278Val 89 1 16 136
Asp278Tyr 131 156 161
Ser380Gly 56 114 168
Ser380Thr 8. 8 52 128
Ser380Tyr 86 90 105 値は天然型組換え体 A Tの Xa— A T形成能を 100%とした相対値である, 産業上の利用可能性
本発明により、 へパリン非存在下でも高いプロテアーゼ阻害活性を有する適切 な立体構造を持つ新規なヒトアンチトロンビン変異体を提供することができる。 本発明の組換えヒトアンチトロンビン変異体は、 例えば血栓性疾病や妊娠中毒症 の治療薬として有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. ヒ トアンチトロンビンの変異体であって、 天然のヒ トアンチトロンビンのァ ミノ酸配列の 7 8位、 2 7 8位、 3 7 8位および 3 8 0位のアミノ酸の少なく とも 1個が他のアミノ酸に変換されていることを特徴とするヒトアンチトロン ビン変異体。
2. 天然のヒトアンチトロンビンのァミノ酸配列の 7 8位が Pheに変換されてい ることを特徴とする請求項 1記載のヒトアンチトロンビン変異体。
3. 天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸配列の 2 7 8位が Ala、 Arg、 Asn、 Gly、 His. Tyrおよび Valから選ばれるアミノ酸に変換されていることを特 徴とする請求項 1記載のヒトアンチトロンビン変異体。
4. 天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸配列の 3 7 8位が Lys、 Asnおよび Valから選ばれるァミノ酸に変換されていることを特徴とする請求項 1記載の ヒ トアンチトロンビン変異体。
5. 天然のヒトアンチトロンビンのアミノ酸配列の 3 8 0位が Ala、 Asp、 Gly、 His、 I le、 Leu、 Asn、 Pro、 Arg、 Thr、 Tyrおよび Valから選ばれるァ ミノ酸に変換されていることを特徴とする請求項 1記載のヒトアンチトロンビ ン変異体。
6. 請求項 1記載のヒトアンチトロンビン変異体をコードしている D N A。
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