JPH05503101A - 好中球化学誘引物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の開発は、退役軍人本部（Ｖｅｔｅｒａｎ’ｓ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔ ｉ−ｏｎ）の医療研究部門と国際保健協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ ｔｅｓｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）認可番号ＨＬ　３０５４２．　ＨＬ　３３２４７お よびＡＩ　２９１０３により一部援助された。合衆国政府は本発明において一定 の権利を存する。

技術分野 本発明は、一般的には化学誘引性タンパク質に関し、より詳しくは、ヒト好中球 に対して化学誘引性のタンパク質、化学誘引物質のペプチド阻害剤、それらのタ ンパク質およびペプチドの製造方法、並びに該タンパク質およびペプチドを含有 する治療組成物に関する。

発明の背景 炎症は感染または負傷に対する生存組織の反応であり、普通は組織の構造と機能 の治癒および回復をもたらす。炎症は病原体を中和および排除して患部の修復を もたらす一連の複雑な反応が関係している。炎症の症状としては、痛み、発熱、 発赤、腫脹および機能障害が挙げられる。周囲組織中への体液および血液細胞性 成分の滲出と共に、血管拡張が起こる。

大部分の炎症状態は好中球または多形核白血球（ＰＭＮ）の存在により特徴づけ られる。

炎症は創傷治癒の初期段階て起こり、創傷治癒過程になくてはならない部分であ る。炎症は肉芽組織の形成を促進する。

この炎症反応の最初の段階は、創傷場所への好中球の流入を伴う。ＰＭＮは創傷 破片および細菌混入物を貧食するのに重要であるが、創傷治癒におけるそれらの 正確な役割は不明である。

炎症は多数の病気状態にも関係がある。肺炎のような病気では、炎症は感染の撲 滅や患者の最終的生存にとって重要である。他の病気では、おそら＜　ＰＭＮに より放出されるタンパク質酵素と酸化剤により引き起こされる組織損傷のため、 無抑制の炎症が有害になることがある。後者の状態では、炎症の減少が患者に有 益である。そのような病気状態の例としては、関節炎および他の炎症性関節疾患 、成人呼吸困難症候群並びに特発性肺繊維症が挙げられる。

肺炎は肺の間隙と空隙におけるＰＭＮの存在により特徴づけられる。例えば、間 隙と空隙の好中球は成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）の証明である（Ｒｉｓｔｏ ｒｅｓｅら、Ｃｈｅｓｔ　８８：　Ａ８６．１９８５；Ｍａｕｎｄｅｒ　ら、Ａ ｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅｓ　ｉｒ、　Ｄｉｓ、１３５：　Ａ２６０．　１９８７） ｅ＋ＡＲＤＳの重度は肺の中の好中球の数に比例し、空隙マクロファージに関し て少ない空隙好中球を有する患者は、より大きい生存率を有する（　Ｍａｕｎｄ ｅｒら、Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ　’　、’　Ｌ臣：Ａ２２１．１９８９）。好 中球流入は特発性肺繊維症ＣＩＦＰ）の病因にも関係しているらしい（Ｂｉｔｔ ｅｒｍａｎら、Ｌ−ロユ１−士ｕ立Ｊ−７２：１８０１−１８１３．　１９８３ 　＋　Ｈｕｎｎｉｎｇｈａｋｅら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ。

堕：２５９−２６９．　１９８１）。

炎症症状における好中球の主な役割は、ＰＭＮ走化性の先天性欠損症であるヨブ 症候群の研究により提唱された（Ｈｉｌｌら、Ｌａｎｃｅｔ　幻６１７−６１９ ．１９７４）　、この状態を有する患者は、炎症の通常の関連症候を伴わない再 発性「冷膿瘍」を経験する。

更に、真性糖尿病を有する患者およびコルチコステロイド治療を受けた患者は感 染に対する応答が損なわれており、これはＰＭＮ走化性の損傷に関連するかもし れない。

血流から肺の中にＰＭＮを漸増させることができる２クラスの走化活性分子が同 定されている。低分子量ヒト脂質はＨｕｎｎｉｎｇｈａｋｅらにより同定され（ Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖ　、ｉ：４７３−４８３、１９８０　）　、これはその後 ロイコトリエンＢ、　（ＬＴＢ、）として同定された（Ｍａｒｔｉｎら、Ａｍ、 　Ｒｅｖ、　Ｒｅｓ　’ｒ、’　■１：１０６−１１１、　１９８４　；　Ｍａ ｒｔｉｎら、Ｊ、　Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅ　ｔ、　Ｌｏ：　１１１４−１１２４゜ １９８７）。ヒト肺胞マクロファージにより生産される約１０．０００ダルトン の分子量を有するタンパク質が記載されている（Ｍｅｒｒｉｌｌ　ら、Ｊ、Ｃｌ １ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　臣：　２６８−２７６、　１９８０）が、正確には同定 または特徴付けされていない。

最近、Ｓｃｈｍｉｄら（Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、　１３９：　２５０−２５６． １９８７）により報告された３−１０ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列 と同一である、４つの異なるグループの相同の低分子量（６〜１０ｋＤａ）ペプ チド化学誘引物質（Ｙｏｓｈ　ｉｍｕｒａら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３９：　７８８−７９３．　１９８７　＋　５ｃｈｒｏｄｅｒ　ら、上−］］ ｌ工弧−ＪＭ＝３４７４−３４８３．　１９８７　＋　Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ　ら 、Ｐｒ　ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＡＦ１４二　９２３３−９２ ３７．　１９８７　：　Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ　ら、Ｊ、　ＥＸ　、　Ｍｅｄ、 　１６７：１８８３−１８９３．　１９８８　ＨＷａｌｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ。

１４９：　７５５−７６１．　１９８７　；　Ｔｈｅｌｅｎ　ら、ＦＡＳＥＢ　 Ｊ、２：　２７０２−２７０６゜１９８８　；　Ｐｅｖｅｒｉ　ら、上二旺Ｌ」 迫虹１６７：　１５４７−１５４９．　１９８８　：Ｌｉｎｄｌｅｙ　ら、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：　９１９９−９２ ０３゜１９８８　；　Ｖａｎ　Ｄａｍｍｅら、Ｊ、　Ｅｘ　、　Ｍｅｄ、１６７ ：　１３６４−１３７６、　１９８８；５ｃｈｒｏｄｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅ　、　Ｃｏｍｍｕ　、　ｆス：　２７７−２８４、１９ ８８）がＬＰＳで感作されたヒト末梢血単核細胞から単離されている。このタン パク質は現在ＮＡＰ−１またはインターロイキン８　（ＩＬ−８）と呼ばれてい る（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、８４：　１０４５−１０４９．　１９８９　）　。

実験証拠は、特定の化学誘引物質の生産が炎症刺激の性質および存続期間により 決定されることを示唆する。よって、それらの化学誘引物質のわずか１つ（例え ばＬＴＢ、）の生産または活性を調節する努力は、炎症反応を制御する際には無 効果であるだろう。

炎症を促進するかまたは減少させることができる物質に対する要望がまだ当業界 に残っている。炎症を促進するものは、創傷の治癒を早めるのにまたは肺炎から の回復を助けるのに用途を見出すことができる。炎症の促進は、糖尿病を含むＰ ＭＮ走化性が欠損している患者、ステロイド療法を受けている患者、および先天 性走化性欠損を有する患者（例えばヨブ症候群）において特に望ましいだろう。

抗炎症剤はある種の炎症性肺疾患の治療において有用であろう。肺胞マクロファ ージ由来の化学誘引物質はおそらく好中球移動を媒介するのに重要であるので、 この炎症過程を中断する努力は、好中球走化性の全機構の解明を必要とするであ ろう。

発明の開示 本発明は、実質的に純粋なブタ肺胞マクロファージ由来の走化因子Ｉ　（ＡＭＣ Ｆ−Ｉ　’）を提供する。−態様では、ＡＭＣＦ−Ｉはアミノ末端アミノ酸配列 Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｇｌ ｎ−Ｘ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ− Ｈｉｓ　（配列番号１）を有し、ここでＸはＣｙｓまたは他のアミノ酸である。

別の態様では、少なくとも約２００．０００単位／■の比活性を有するＡＭＣＦ −Ｉが提供される。更に別の態様では、本発明は少なくとも４００．０００単位 ／■の比活性を有するＡＭＣＦ−Ｉを提供する。

別の観点によれば、本発明は、実質的に純粋なウシ肺胞マクロファージ由来走化 因子ＩＩ　（ＡＭＣＦ−ＩＩ　）を提供する。−態様では、ＡＭＣＦ−１はアミ ノ末端アミノ酸配列５ｅｔ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｇ　１ｕ−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ− Ｇ　１ｕ−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ｖａ　１−Ｖａ　ｌ−Ａｒｇ−Ｇ　ｌｕ−Ｌｅ 　ｕ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｍｅ　ｔ　−Ｘ| Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ− Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−１１ｅ　（配列番号２）を有し、ここでＸはＣｙｓまたは他の アミノ酸である。

別の態様では、少なくとも１００．０００単位／■の比活性を有するＡＭＣＦ− Ｉ［が提供される。更に別の態様では、本発明は少なくとも２００．０００単位 ／■の比活性を有するＡＭＣＦ−Ｉ［を提供する。

関連する観点によれば、本発明はブタＡＭＣＦ−ＩおよびＡＭＣＦ−Ｉ［を含ん で成るタンパク質組成物を提供し、該組成物は少なくとも約２０．０００単位／ ■の比活性を有する。

本発明は、更に、生理学的に許容される担体または希釈剤と共に、上述の実質的 に純粋なタンパク質またはタンパク質組成物を含んで成る組成物を提供する。

別の観点によれば、本発明はＡＭＣＦ−ＩまたはＡＭＣＦ−ＩＩをコードする単 離されたＤＮＡ分子を提供する。

更に別の観点によれば、本発明は走化性タンパク質組成物の調製方法を提供する 。該方法は、一般に、（ａ）細菌内毒素のような敗血症メディエータ−によりブ タ単核細胞およびブタマクロファージから成る群から選択された細胞を刺激し、 　（ｂ）刺激された細胞を培養して細胞順化培地を調製し；（Ｃ）細胞順化培地 を濃縮し；（ｄ）濃縮した培地を酸性条件下でクロマトグラフィーにより分離し 、ヒト好中球に対する走化活性を有する画分を得；そして（ｅ）走化活性を有す る画分を回収する、段階を含んで成る。別の態様では、細胞順化培地を濃縮前に 酸性化し、そして濃縮段階がカチオン交換クロマトグラフィーを含んで成る。特 に好ましい態様では、段階（ｅ）の走化活性を有する回収された画分をクロマト グラフィーにより分画してｌまたは複数の走化活性画分と走化活性を実質的に有 しない画分とを与え、そして少なくとも１つの走化活性画分を回収することによ り、タンパク質を更に精製する。分画段階は逆相高性能液体クロマトグラフィー を含んで成ることができる。

本発明の追加の観点は、長さが３〜１８アミノ酸の単離されたペプチドであって 、ＡＭＣＦ−Ｉ　、　ＡＭＣＦ−ＸまたはＮＡＰ−１に向かう好中球の走化性を 阻害するペプチドを提供する。−態様では、該ペプチドはアミノ酸配列Ｒ１−Ｒ ２−Ｔｈｒ−Ｒ３−Ｒ４（配列番号３）を含んで成り、ここでＲ１はＬｅｕ、　 Ｉｌｅ、　Ｖａｌであるかまたは存在せず：Ｒ２はＬｙｓ、　ＴｈｒまたはＡｓ ｎてあり；Ｒ３はＴｙｒ。

Ｈｉｓ、　Ｔｈｒ、　ＳｅｒまたはＬｅｕであり；そしてＲ４はＳｅｒ、　Ｐｒ ｏであるかまたは存在しない。この点で好ましいペプチドは５または７個のアミ ノ酸のもの、特に配列Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ（配列番号４） を含むものである。別の態様では、該ペプチドはアミノ酸配列Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３ −Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｌｅｕ　（配列番号５）を含んで成り、ここでＲ１はＡｌ ａ、　Ｐｒｏ、　Ｇｌｕ、　ｃｔｙであるかまたは存在せず；Ｒ２はＡｒｇ、　 Ａｌａ、　Ｇｌｕ、　Ｇｌｙ、　Ｖａｌであるかまたは存在せず：Ｒ３はＶａｌ 、　Ｓｅｒ、　Ｇｌｕであるかまたは存在せず；Ｒ４はＳｅｒ、　Ｖａｌ、　Ａ ｌａ、　Ａｓｐであるかまたは存在せず；Ｒ５はＡｌａ。

Ａｒｇ、　Ｌｙｓ、　Ｇｌｙ、　ＧｌｕまたはＳｅｒてあり；そしてＲ６はＧｌ ｕまたはＡＳｐである。この点で好ましいペプチドは７個のアミノ酸のものであ り、特に配列Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ　（配 列番号６）を有するものである。それらのペプチドを生理学的に許容される担体 、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、哺乳動物の炎症を低下させる方法におい て有用な医薬組成物を製造することができる。

本発明の上記および他の観点は、下記の詳細な説明および添付図面への参照によ り明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の走化性タンパク質組成物のカチオン交換ＨＰＬＣ精製プロフィ ールである。溶出勾配プログラムは上のパネルに示されている。

図２は、部分精製した走化性タンパク質組成物の逆相ＨＰＬＣ分画の結果を表す 。上のパネルはアセトニトリル溶出勾配と溶出液のＡ２８゜を示す。下のパネル はカラム画分の走化活性とゲル電気泳動パターンを示す。

図３は、ＡＭＣＦ−Ｉｔの最終精製を示す。

図４は、ヒトおよびブタ好中球に対するＡＭＣＦ−Ｉ　（Ａ）およびＡＭＣＦ− Ｉ［（Ｂ）の走化性用量応答曲線を示す。図４０はブタ好中球に対するＡＭＣＦ −１，ＡＭＣＦ−ＩＩおよびＬＴＢ、の用量応答曲線の比較を示す。結果は、種 特異性ザイモサン活性化血清に対する最大応答の比率として表される。

図５は、ＡＭＣＦ−Ｉ　（Ａ）または賦形剤のみ（Ｂ）を滴注した後の肺生検材 料の比較用顕微鏡写真を示す。対照の肺切片を図Ｃに示す。ＡＭＣＦ−Ｉを滴注 された葉では、好中球（矢印）が肺胞空隙（Ａｔ）と肺間隙中に存在している。

図６は、ＡＭＣＦ−Ｉ［（Ａ）または賦形剤のみ（Ｂ）を滴注した後の肺生検材 料の比較用顕微鏡写真を示す。対照の肺切片を図Ｃに示す。ＡＭＣＦ−Ｉ［を滴 注された葉では、好中球（矢印）が肺胞空隙（ＡＩ）と肺間隙中に存在している 。

図７（配列番号１．２および７〜１５）は、ＡＭＣＦ−ＩおよびＡＭＣＦ−Ｉ［ と関連ポリペプチドとのアミノ末端アミノ酸配列の比較である。下の文字は種を 表す：ｐ、ブタ：ｈ、ヒト：ｒ、ラット；ｂ、ウシ；ｍ、マウス：ｃ、ニワトリ 。＊は血小板塩基性タンパク質開裂物ＮＡＰ−２のＮ末端アラニン残基を示す。

図８は、合成ペンタペプチドによる組換えヒトＩＬ−８に向かうヒトＰＭＮ走化 性の用量応答阻害を表す。

発明実施の最良形感 本発明を下記に記載する前に、以後使用する幾つかの用語の定義を記載すること がそれの理解に役立つであろう。

バク質１■あたりの走化活性の単位として定義される。走化活性１単位は、本明 細書に記載のようなヒト好中球を使った走化性アッセイにおいてベースライン（ 負の対照）活性の少なくとも３倍の活性を与えるのに必要な試料の量である。試 料中の全タンパク質量はフォリンフェノール法（Ｌｏｗｒｙら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ、　１９３：　２６５−２７５．１９５１　）により、２８０　ｎ ｍての吸光度（１，０■／−溶液のＡ２１Ｇ＝１．０００　）により、または定 量アミノ酸分析により測定される。

実質的に純粋な：　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、逆相ＨＰＬＣま たは定量アミノ酸分析により測定した時に（全タンパク質量に基づいて）９０％ より大きい純度であること。

本発明者らは、ＬＰＳて刺激されたブタ肺胞マクロファージから１組の新規タン パク質を単離し、特徴づけた。それらのタンパク質は多形核白血球に対する有力 な走化活性を有し、且つそれ自体、炎症を増強するのに有用である。該タンノく り質は抗炎症性化合物の発見のための有用な手段も提供する。

本発明のタンパク質は「肺胞マクロファージ由来走化因子」と呼称される。それ らのタンパク質のうちの２つは以後ＡＭＣＦ−ＩおよびＡＭＣＦ−Ｉｔと呼称さ れる。それらのタンパク質は、ヒト好中球を使った走化性アッセイにおいて測定 すると高い比活性を有する実質的に純粋な形で製造された。ポリアクリルアミド ゲル電気泳動により測定すると両者とも約１０　ｋＤａの分子量を有する。それ らのタンパク質のアミノ酸組成は表３に与えられる。当業者により認識されるよ うに、それらの組成はおおよそのものであり、調製ごとに幾らか異なることがあ り、そしてタンパク質の供給源や使用する特定の分析に依存して異なることがあ る。各々の部分アミノ酸配列を含むＡＭＣＦ−ＩおよびＡＭＣＦ−ＩＩの他の特 異的性質が本明細書中に開示されるけれども、本発明はアミノ酸配列または他の 性質にわずかな変形を有する類似の走化活性ブタタンパク質も包含する。そのよ うな変形は天然に生じることもでき（例えば遺伝的多形性により）または人間の 介入によって（例えばクローン化ＤＮＡの突然変異誘発により）生成することも できる。

本発明によれば、本発明のタンパク質はブタマクロファージまたは単核細胞から 単離することができる。特に好ましい出発材料はブタ肺胞マクロファージであっ て、これは肺洗浄によって得ることができる。単離した細胞を敗血症のメディエ ータ−の存在下で標準的細胞培養方法に従って培養することにより刺激する。適 当なメディエータ−としては、細菌の内毒素（ＬＰＳ）並びにサイトカインＩＬ −１およびＴＮＦが挙げられる。得られた順化培地を回収し、タンパク質量とし て使用する。

順化培地は、常用技術により、例えば限外濾過、透析、塩沈澱、イオン交換クロ マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたはレクチン吸着により 濃縮される。特に好ましい濃縮方法は酸性条件下でのカチオン交換クロマトグラ フィーである。この点で特に好ましいカチオン交換体はスルホプロピルで誘導体 化されたデキストラン、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、 　Ｎ、Ｊ、から入手可能な５Ｐ−３ｅｐｈａｄｅｘＣ−２５である。順化培地を 、約２．０〜７．０、好ましくは約３．５のｐｌを有する溶液中でカチオン交換 体と混合する。カラムを洗浄して未結合物質を除去し、次いでほぼ中性のｐＨの 高温緩衝液を使って結合物質を溶出せしめる。特に好ましいそのような緩衝液は 、１．ＯＭ　ＮａＣ１を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐｉ（７，０であ る。濃縮前に、順化培地を例えば遠心または濾過により清澄化することが存利で ある。タンパク質分解を最小限にとどめるために、濃縮は好ましくは低温、例え ば約５℃で行われる。

次いで濃縮培地をクロマトグラフィーにより分離し、走化活性タンパク質を他の 成分から単離する。クロマトグラフィー前に、例えば低イオン強度の酸性緩衝液 、例えば１０ｍＭ酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液ｐＨ３，５に対する透析により、濃縮培 地の塩濃度を下げることが好ましい。いずれにしても、培地を好ましくは分画前 に酸性化する。次いてカチオン交換樹脂上での高性能液体クロマトグラフィーに より該培地を活性画分と不活性画分とに分離する。そのような好ましい樹脂はス ルホプロピル誘導体化シリカ、例えばＴＳＫ　５Ｐ−５ＰＷ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ 　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）である。あるい は、カチオン交換樹脂上での常用の液体クロマトグラフィーにより分離を行うこ とができる。ｐＨ勾配を使ってカラムを洗浄し、走化活性画分を回収する。ｐＨ 勾配を使ってカラムを洗浄する前に、塩勾配を使って夾雑タンパク質をカラムか ら溶出せしめることが好ましい。得られた組成物は、ＡＭＣＦ−ＩとＡＭＣＦ− Ｉ［を含有しそして典型的には約２０．０００単位／■より大きい比活性を有す る部分精製混合物である。

ＡＭＣＦ−ＩおよびＡＭＣＦ−ＩＩの更なる精製および分離は、走化活性混合物 をクロマトグラフィーにより分画゛することにより達成される。好ましいクロマ トグラフィ一方法としては、逆相高性能液体クロマトグラフィーおよび分子篩ク ロマトグラフィーが挙げられる。この点で好ましいＩ（ＰＬＣ媒体はＶｙｄａｃ 　Ｃ−４多孔質シリカ（Ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ、　Ｈｅ５ ｐｅｒｉａ、　ＣＡ）である。クロマトグラフィー分画前に、例えば低ｐＨ緩衝 液に対する透析により、部分精製した活性混合物を酸性化することが好ましい。

特に好ましい透析緩衝液は１０ｍＭ酢酸／酢酸ＮａｐＨ３，５である。特に好ま しい態様では、調製物を次いでＨＰＬＣカラムに適用し、アセトニトリルのよう な有機溶媒の勾配を使って溶出する。カラム画分を走化活性についてアッセイし 、活性画分を保持する。ＡＭＣＦ−ＩおよびＡＭＣＦ−Ｉ［は、典型的にはそれ らの条件下で約３５％〜約４５％アセトニトリルのところで溶出する。

精製工程は、調製物の走化活性およびタンパク質含量をアッセイすることにより 始終モニタリングすることができる。

走化活性は、好ましくはヒト好中球を使って標準法に従ってアッセイされる。調 製物のタンパク質含量は、２８０　ｎｍての吸光度、ポリアクリルアミドゲル電 気泳動、定量分析技術、または当業界で既知の他の方法によりモニタリングする ことかできる。

本発明のタンパク質は、クローン化ＤＮＡ　（ｃＤＮＡが好ましい）を組換え細 胞中で発現せしめることによって製造することもできる。適当なｃＤＮＡはブタ 肺胞マクロファージｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。適当なラ イブラリーは標準法に従って調製することができる。好ましい方法では、アフィ ニティー精製抗体を使ってブタ肺胞マクロファージｃＤＮＡ発現ライブラリーを スクリーニングする（ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０：　１１９４− １１９８．１９８３　：　Ｄａｖｉｓら、米国特許第４．７８８．１３５号）。

完全な配列が得られるまでクローン化ｃＤＮＡ断片を使って該ライブラリーを再 スクリーニングすることにより部分的ｃＤＮＡクローン（断片）を延長すること ができる。ｃＤＮＡクローニングの別法も適当であり、そのような方法は、本明 細書に開示されるＮ末端アミノ酸配列または単離したタンパク質からのＣＮＢｒ 断片に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプローブを使ってｃＤＮＡライブラ リーをスクリーニングすることを含む。他のクローニング方法はＭａｎｉａｔｉ Ｓら編（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍ ａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ。

１９８２　；これは参考として本明細書に組み込まれる）により記載されている 。クローン化配列の本質は、発現されたクローンの配列決定または活性分析によ り確かめられる。

組換え宿主細胞中での発現のために、化学誘引性タンパク質をコードするＤＮＡ 配列が適当な発現ベクターに挿入される。

この点で育用な発現ベクターは、発現させようとするＤＮＡ配列に作用可能に連 結された転写プロモーターおよびターミネータ−配列を含む。選択される特定の 宿主細胞に依存して、発現ベクターは複製開始点、エン／１ンサ一配列、および 発現レベルを制御または増加させる他のヌクレオチド配列を含むこともできる。

多くの場合、原核宿主を使った時該ベクターが複製および増殖することができる ように細菌の複製開始点を含むことが有利である。宿主細胞中での該ベクターの 選択および保持に備える配列である選択マーカーを発現ベクター中に提供するこ ともできるが、ある場合には、選択マーカーを別個のベクターにおいて宿主細胞 に導入することもできる。

適当な発現ベクターはプラスミドまたはウィルス由来のものであることができ、 または両方の要素を含むこともできる。

適当な要素の選択およびベクターの作製は当業者の普通の技術水準の範囲内であ る。

高等真核細胞（例えば哺乳動物または昆虫細胞）は本発明における宿主細胞とし て好ましい。哺乳動物細胞に使われる発現ベクターは、哺乳動物細胞中に導入さ れたクローン化遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指令することができるプロモータ ーを含んで成る。適当なプロモーターとしては、細胞性プロモーター、例えばマ ウスメタロチオネイン−１（ＭＴ−１）プロモーター（Ｐａｌｍｉ　ｔｅｒら、 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２２：８０９−８１４．１９８３および米国特許第４．５７ ９．８２１号）、並びにウィルス性プロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター （Ｓｕｂｒａｍａｎ　ｉら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１：８５４− ８６４．１９８１）およびアデノウィルス２の主要後期プロモーター（Ｂｅｒｋ ｎｅｒおよび５ｈａｒｐ、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３：　８４１ −８５７゜１９８５）が挙げられる。ＤＮＡ配列挿入部位の下流に置かれるポリ アデニル化シグナルも、そのような発現ベクター中に含まれる。ポリアデニル化 シグナルは、着目のＤＮＡ配列のものであってもよく、または異種遺伝子由来の ものであってもよい。

発現ベクターは、標準法に従って、例えばリン酸カルシウム媒介トランスフェク ション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅ１ｌ　１４：　７２５−７３２゜１９７８　；　 ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、　Ｓｔｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃ　ヱ：６０３−６Ｉ６．１９８１　；　ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄ ｅｒ　Ｅｂ、　五三出匿Ｌ５２：４５６−４６７、１９７３）またはエレクトロ ポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯＪ、↓：８４１−８４５．１９８２ ）により、培養哺乳動物細胞に導入される。処理細胞の小部分がそれらのゲノム 中に該ＤＮＡを組み込むかまたは該ＤＮＡを非染色体核構造において維持する。

組み込んだ細胞を同定するために、通常、着目の遺伝子と一緒に選択マーカーが 細胞に導入される。好ましい選択マーカーとしては、ネオマイシン、ヒグロマイ シンおよびメトトレキセートといった薬剤に対する耐性を付与する遺伝子が挙げ られる。選択マーカーは、別々のプラスミド上において着目の遺伝子と同時に導 入することができ、またはそれらを同一の発現ベクター上において導入すること もできる。

組み込まれた遺伝子配列のコピー数は、成る選択マーカー（例えば、メトトレキ セートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子）を使って増幅 を通して増加させることかできる。選択マーカーを着目の遺伝子と一緒に細胞に 導入し、そして薬剤選択圧力を適用する。増加したコピー数のクローン化配列に ついて選択することにより、発現レベルを実質的に上昇させることができる。

下等生物の細胞も本発明に用いることができる。この点で、特に好ましい宿主は 酵母サツカロミセス・セレビシェ−（珈二垣国二匹競ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で あるが、他の真菌細胞、例えば他の酵母属を使ってもよい。生物活性のためにジ スルフィド結合および／またはグリコジル化を必要とする組換えタンパク質につ いては、または組換えタンパク質の精製を促進するために、分泌発現系が用いら れる。着目のタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、正しい読み枠において、分 泌シグナルペプチドをコードする配列（「シグナル配列」）と融合される。特に 好ましいシグナル配列としては、ＭＦα１　（酵母α−因子）遺伝子産物のブレ ープロ領域（Ｋｕｒ　ｊａｎおよびＨｅｒｓｋ−ｏｗｉ　ｔｚ、皿３０：　９３ ３−９４３．１９８２　：　Ｓｉｎｇｈ、欧州特許第１２３゜５４４号；並びに Ｋｕｒ　ｊａｎら、米国特許第４．５４６．０８２号）およびＢＡＲＩ遺伝子の 分泌ペプチド部分（ＭａｃＫａｙら、米国特許第４、６１３．５７２号；　Ｍａ ｃＫａｙ、　Ｗｏ　８７１０２６７０）をコードするものか挙げられる。ＢＡＲ Ｉシグナル配列は、ＢＡＲＩ遺伝子産物の第三領域のコード配列と組み合わせる ことができる（　ＭａｃＫａｙら、ＥＰ３１４．０９６　＋　ＭａｃＫａｙら、 米国特許出願第０７／２７０．９３３号）。他の有用なシグナル配列としては、 酵母ＰＨ０５（Ｌｅｍｏｎｔｔら、ＷＯ３６１００６３８）およびα−因子（Ｂ ｒａｋｅ、　ＥＰ　１２３，２８９）遺伝子のものが挙げられる。

酵母を形質転換せしめる方法は公知であり、例えば、Ｂｅｇｇｓ　（Ｎａｔｕｒ ｅ　２７５：　１０４−１０８．　１９７８）およびＨｉｎｎｅｎらにＮａｔ１ ．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５：　１９２９−１９３３．１９７８） により記載されている。適当な発現ベクターとしては、ＹＲｐ７　（Ｓｔｒｕｈ ｌら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６：　１０ ３５−１０３９．１９７９）、　ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ　影１ ２１−１３３．１９７９）、　ｐＪＤ８２４８およびｐＪＤＢ２１９　（Ｂｅｇ ｇｓら、前掲）並びにそれらの誘導体か挙げられる。そのようなベクターは通常 選択マーカーを含むだろう。

欠損性選択マーカー、例えばＢｅｇｇｓ（前掲）の１ｅｕ２−ｄ遺伝子またはＫ ａｗａｓａｋ　ｉとＢｅ１ｌ　（ＥＰ　１７１．１４２）のＰＯＴＩ遺伝子か特 に好ましい。酵母発現ベクターにおいて有用な好ましいプロモーターとしては、 酵母解糖遺伝子（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ　。

２５５：　１２０７３−１２０８０．　１９８０　：　ＡｌｂｅｒおよびＫａｗ ａｓａｋｉ、　上」匿ＬＡ　１．　Ｇｅｎｅｔ、　１：　４１９−４３４．１９ ８２　＋並びにＫａＷａＳａｋｉ、米国特許第４．５９９．３１１号）またはア ルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモーター、特にＡＤＨ２−４ｃプロ モーター（“ＡＤＲ３−４ｃ”としても知られているＨ　Ｒｕ５ｓｅｌｌ　ら、 Ｎａｔｕｒｅ　３０４：　６５２−６５４．１９８３を参照のこと）が挙げられ る。Ｂｉｔｔｅｒ　（ＷＯ８６１０６０７７）およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇら（Ｅ Ｐ　１６４，５５６）により開示されているようなハイブリッドプロモーターも 使うことができる。

ハイブリットプロモーターは、米国特許出願第０７１０３６．８２３号に開示さ れたようにして、酵母接合型調節要素の１または複数のコピーを酵母プロモータ ー中に挿入することにより作製することもできる。

形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主細胞は、炭素源と窒素源並び に適当な補足物を含む培地中で増藩される。特定の細胞種に適切な培地の選択は 当業者の普通の技術水準内である。一般的に上述したようにして細胞または培地 からタンパク質を単離することができる。

本発明のタンパク質は、広域スペクトルの創傷の処置のための治療組成物におい て使用することができる。それらのタンパク質で処置することがてきる創傷のタ イプとしては、表面傷、裂傷、擦過傷、手術傷および火傷が挙げられる。一般に 、本発明のタンパク質は、肉芽組織の形成を所望する任意の状態において有用で あろう。上記創傷に加えて、そのような状態には皮膚移植および人工皮膚での処 置が含まれる。

治療用途には、該タンパク質を生理学的に許容される担体または希釈剤と組み合 わせて局所的に投与することが好ましい。該タンパク質は毒性または発熱性物質 を含まないように調製されるだろう。組成物は創傷を覆うのに十分な量で適用さ れるだろう。組成物は創傷領域内に約１０−”　Ｍ　−１０−’　Ｍの活性タン パク質濃度を提供するように製剤されるだろう。それらの組成物は通常、肉芽組 織形成が実質的に完了するまで１日〜数日間隔で再適用されるだろう。正確な治 療法は、創傷の大きさおよび性質並びに患者の全体状態により決定されるだろう 。重症の場合には、本発明の治療組成物をより頻繁に、即ち一日４回まで、且つ より長期間に渡り投与することが必要であるかもしれない。

は安定剤と共に、本明細書に記載のタンパク質を含んで成る。

典型的には、本明細書に記載のタンパク質は１０−１２Ｍ　−１０−’Ｍの範囲 の濃度で使うことができるが、通常は約１０−８Ｍ〜１０−５Ｍの濃度で使われ るだろう。希釈剤としては、アルブミン、塩溶液、滅菌水、マンニトール等が挙 げられる。他の安定剤、酸化防止剤またはプロテアーゼ阻害剤を添加してもよい 。他の任意の成分としては、増殖因子、例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ） 、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）　、インス リン様増殖因子１　（ＩＧＦ−１）等、および単核細胞化学誘引物質が挙げられ る。あるいは、該タンパク質を水溶液として創傷包帯に適用し、そして包帯を無 菌形態において包装することかできる。

肺炎の治療のためには、本発明のタンパク質は適当な担体と組み合わされ、気管 支または静脈内投与用に製剤される。

気管支投与は噴霧療法または気管支内視鏡によるものであることができる。気管 支投与に適当な担体または希釈剤としては、適当なタンパク質担体、例えばアル ブミンを含む無菌の発熱性物質不含有塩溶液か挙げられる。静脈内投与用の適当 な希釈剤としては、無菌水および無菌塩溶液か挙げられる。

タンパク質は約１０−”　Ｍ　〜１０−’　Ｍ、より好ましくは１０−”Ｍ〜１ ０４Ｍの用量濃度を提供するように製剤される。

本発明のタンパク質は、局所炎症を阻止するために全身的に使用することもてき る。この点ては、該タンパク質は水溶液として製剤され、そして上述したように 静脈内に投与される。

加えて、本発明のタンパク質は抗炎症剤の開発のための有用な手段である。阻止 抗体、ペプチド拮抗剤、および小さい非ペプチド拮抗剤を含む広範囲の抗炎症剤 を開発することができる。例えば、該タンパク質またはそれらの細胞レセプター に対する抗体を、走化活性を阻止するのに用いることかできる。

該タンパク質のアミノ酸配列および構造−機能関係の分析は、小ペプチド拮抗剤 の合成の規準を提供する。特に着目されるのは、図７に示される部分アミノ酸配 列間の高相同性領域である。それらの領域としては、配列整列（図７）により決 定すると、ＡＭＣＦ−Ｉのアミノ酸１２−１８、ＡＭＣＦ−ＩＩのアミノ酸１９ −２５あたりの領域、並びにＬＬＩＣＴ、　ＮＡＰ−１およびこの部類の他のタ ンパク質の対応する領域、ＡＭＣＦ−Ｉのアミノ酸１−７、ＡＭＣＦ−■のアミ ノ酸８−１４あたりの領域、並びに関連タンパク質の対応する領域か挙げられる 。ペプチド拮抗剤は個々のタンパク質中に存在する配列、または関連配列の整列 により決定される共通配列に一致させることができ、誘導体化された（即ちホル ミル化された）アミノ酸を含んでもよい。ペプチド拮抗剤は、通常は少なくとも ３個であるか多くても１８個のアミノ酸を含み、好ましくは８個未満のアミノ酸 を含むだろう。この点で好ましい拮抗剤としては、ペプチドＬｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔ ｈｒ−Ｔｙｒ−３ｅｒ　（ＬＫＴＹＳ）　（配列番号４）が挙げられ、該ペプチ ドは１０−”　Ｍはどの低濃度においてＡＭＣＦ−ＩおよびＮＡＰ−１に向かう 好中球の走化性を阻害することがわかった。ＡＭＣＦ−Ｉ　。

ＡＭＣＦ−Ｉｌ、　ＮＡＰ−１または他の走化性ポリペプチドに応答する走化性 を阻害するペプチドは、ＰＭＮ走化性を阻止するのに有用であり、よって炎症を 減少させるのに有用である。従って、そのようなポリペプチドは、炎症性疾患ま たは異常な走化性に関与する他の状態を治療するのに有用であり、ステロイドに 代わって用いることができる。それらの病気としては、喘息、特発性肺繊維症、 類肉腫症およびＡＲＤＤといった呼吸器疾患：アテローム性動脈硬化症、関節炎 、並びにブドウ膜炎を含む眼の病気か挙げられる。該ペプチドを生理学的に許容 される希釈剤、担体および賦形剤と組み合わせて、注射、吸入または摂取による 投与のための溶液、軟膏、粉末または他の製剤を製造することができる。投与の 形式は一般に治療すべき状態により決定されるだろう。例えば、呼吸器疾患用の 治療薬は通常は吸入により投与されるだろう。本発明のペプチドを含む医薬組成 物は、作用部位（例えば血流中または気管支上皮内層面上）において約１０１Ｍ 〜１０−’　Ｍのペプチド濃度を提供するように製剤される。

最後に、後述される走化性アッセイ方法は、抗走化因子についてスクリーニング するために改変することができる。アッセイに試験化合物を添加することにより 、タンパク質の活性を阻害する該化合物の能力が測定される。

炎症を促進するために本発明のタンパク質の断片を使うこともてきる。上述した ように、該タンパク質の配列を分析して活性部位を決定し、そして活性部位配列 を含む小ペプチドを調製し、走化活性についてアッセイする。小ペプチドは、別 の常法により、例えば完全タンパク質のタンパク質分解消化によりまたは組換え 細胞中ての小さいＤＮＡ分子の発現により調製することもてきる。

２０〜３０ｋｇのヨークシャ一種の雄ブタをＬａｔｃｈ　Ｆａｒｍｓ、　Ｎｏｒ ｔｈＢｅｎｄ、　ＷＡから入手し、ＡＭとＰＭＮの両方の入手源として使った。

ブタＡＭは肺全体洗浄により得た。ブタを２５０■のケタミンと１００■のキシ ラジンの部内注射により鎮静させ、次いで静注ナトリウムベントタールで安楽死 させた。動物を仰臥にし、正中胸骨切開術により胸部を開き、肺虚脱を許容した 。気管を隔離し、切除し、＃７のカフ付気管内挿管を挿管した。カフを気管内で 膨張させ、５０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む無菌の発熱性物質不含有０．９％ＮａＣ１ を３０ｃｍ　Ｈ２Ｏの静水圧まで（約２Ａ）気道に滴注した。重力ドレナージに より細胞に富む液体を収集した。

各動物においてこの洗浄操作を２回繰り返した。平均ブタ肺洗浄は、９６％±１ ．５％ＡＭ、２％±０．８％リンパ球および１％±０．４％ＰＭＮの純度を有す る２、７Ｘ１０＠±１．３ｘｌＯＱ（平均±Ｓ、　Ｄ、　）の生存ＡＭを与えた 。ＡＭの生存率はトリパンブルー色素排除により常に９０％を越えた。

洗浄液を２００Ｘｇて１５分間遠心して細胞をペレット化した。

細胞ベレットを無菌の発熱性物質不含有０．９％ＮａＣ１で２回洗浄し、１０Ｍ ｇ／ｒＩＬｌの大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）内毒素（０２６：Ｂ６．　Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）、１００　Ｕ／ｒ ！Ｌｌのペニシリン（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ＭｃＣｌｅａｎ 、　ＶＡ）、　１００μｇ／ｍｌのストレブトマイシン（ＦＬＯＷ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ）　、２ｍＭのし一グルタミン（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ）および５（ｌμｇ／ｍｊ７のゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ　１６４０ 　（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）中に２Ｘ１０’の生存 ＡＭ／１ｎｌの最終濃度に再懸濁した。細胞懸濁液を１５０　ｃｍの培養フラス コ中に５Ｘ１０’の生存ＡＭ／ａ（の密度に塗布し、５％ＣＯ□／空気中て３７ °Ｃでインキュベートした。２４時間後、順化培地を吸引し、血液寒天プレート 上で定量的に培養して細菌汚染を評価し、そして１０，０００Ｘｇて３０分間の 遠心により清澄化した。細菌増殖か全くない試料のみをその後の研究に使った。

順化培地を一７０°Ｃで３０日間以上保存した。

ＡＭ順化培地をブタおよびヒトＰＭＮに対する走化活性について試験した。ヒト ＰＭＮは肘前の静脈穿刺によって得、ブタＰＭＮは全身麻酔下での剣状上心臓穿 刺によって得た。ＰＭＮはＦｅｒｒａｎｔｅおよびＴｈｏｎｇの方法（Ｊ、［ｍ ｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３６：　１０９−１１７．１９８０）により、 Ｍｏｎｏ−Ｐｏ１ｙ　Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　Ｍｅｄｉａ　（ＦｌｏｗＬａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ）を使って単離した。ＰＭＮを５％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｈ ｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｌｏｇａｎ、　Ｕｔ ａｈ）を含むＲＰＭ［１６４０培地に３Ｘ１０６細胞／ｍｉ７の濃度に再懸濁し た。

微小走化性チャンバーを使った変更Ｂｏｙｄｅｎ法（Ｆａｌｋら、Ｊ、−［ｍｍ ｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３３：　２３９−２４７．１９８０）　（Ｎｅｕ ｒｏｐｒｏｂｅ　Ｃｏ、。

Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ）により走化性をアッセイした。ＰＭＮ　（１，８Ｘ １０５ＰＭＮを含む６０μｍ）を該チャンバーの上側区画のウェルに入れた。試 験しようとする試料を、０．２％ウシ血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝化塩溶 液ｐＨ７，２に連続希釈し、２５μｒの試料を該チャンバーの下側区画の各ウェ ルに添加した。チャンバーの上側と下側の区画をニトロセルロースフィルター（ ３，０ｕ　ｍ孔径、　Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、［ｎｃ、、　Ｃａｂｉｎ　Ｊｏｈ ｎ、　ＭＤ）により分離した。５％ＣＯ□および湿潤空気中で３７°Ｃにて２時 間インキュベートした後、フィルターを取り出し、変形へマドキンリン／エオシ ン染色法により染色した。ＰＭＮ走化性は、５×５世の接眼レンズグリッドを使 って１０個の高倍率視野（ｘ４５０）中ての移動の終点における細胞の総数とし て測定した。ＡＭ順化培地はブタＰＭＮとヒトＰＭＮの両方について走化活性を 有することが認められた。

ｌ、ｌＸｌ０”個の生存ＡＭから作製したＬＰＳ刺激Ａｌｔｌ順化培地５００　 ｒｎｌからＡＭＣＦを精製した（単一ブタ全肺洗浄のものと同等）。

各段階での回収率を示す精製手順の概要を表１に示す。全ての試料とカラム画分 を５°Ｃて維持するかまたは一７０°Ｃて凍結させた。ただし、２つのＨＰＬＣ 負荷と溶出段階は室温で行った。

走化性アッセイについては、粗調製物および高温または低ｐＨを含む調製物のア リコートを、０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ、　ｐＨ７，２中に希釈するかまたは３ ５００　ＭＷカットオフの５ｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　 Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ、　ＣＡ） を使って５°Ｃにてそれらを同溶液に対して透析するかのいずれかにより、適切 なイオン強度とｐＨのアッセイ条件に調整した。

Ｖａｒｉａｎ　Ｖｉｓｔａ　５５００液体クロマトグラフ上てＨＰＬＣを行い、 Ｖａｒｉａｎ　ＵＶ−２００紫外検出器（Ｖａｒｉａｎ、　Ｗａｌｎｕｔ　Ｃｒ ｅｅｋ、　ＣＡ）上て２８０　ｎｍまたは２１５　ｎｍにおける吸光度をモニタ リングした。

表１ 試料　容量　全タンパク質　全単位　比活性（ｒＩＬｌ）　（■）　（単位／■ ） 粗ＣＭ　５００　７１．１　２４５０００　３４５０濃縮物　３７　１９．６　 １４７０００　７５００ＳＰ−ＨＰＬＣ２５２，９７５０００２５６００ＲＰ− ＨＰＬＣ６０，１３７３６１００２６４０００ＡＭＣＦ−Ｉ　１　０．０７４　 ３００００　４０５０００ＡＭＣＦ−ＩＩ　Ｏ，５０，０２３５０００２１７０ ００ＣＭ−一順化培地 ＲＰ−ＨＰＬＣ−一逆相高性能液体クロマトグラフィー（Ｃ−４）ＡＭＣＦ−Ｉ 　、　ＡＭＣＦ−Ｉｔ　−一肺胞マクロファージ由来走化因子ビーク■およびＩ Ｉ　（ＲＰ−ＨＰＬＣから）ヒトＰＭＮを精製の過程中の走化活性の検出に使っ た。走化活性は本質的に上述した通りにアッセイした。各実験において各試料の 連続希釈液を４型反復ウェル中で試験し、４重反復測定の結果を平均化した。ザ イモサン活性化ヒト血清（Ｈ２ＡＳ）またはザイモサン活性化ブタ血清（ＰＺＡ Ｓ）を記載された通りに（Ｐｉｌｌｅｍｅｒ　ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、１３７：　１３９−１４２．　１９４１：Ｐｉｌｌｅｍｅｒら、Ｊ、　ＥＸ　 、　Ｍｅｄ、　１０３：　１−１３．１９５６）調製し、０．２％ウシ血清アル ブミン含有リン酸塩緩衝化塩溶液ｐＨ７，２中に１１０希釈し、そして正の対照 として各走化性アッセイに加えた。０．２％ＢＳＡ含ＷＰＢＳ　ｐＨ７，２は負 の対照として働いた。単位／ｉでの走化活性は、ベースライン（負の対照）活性 の少なくとも３倍を維持する試料の最高希釈率の逆数として定義された。比活性 は走化性単位／■全タンパク質量において表され、ここで全タンパク質量はフォ リンフェノール試薬（Ｌｏｗｒｙら、前掲）　、２８０　ｎｍでの吸光度（１， ０ｍｇ／ｒＩＬｌ溶液のＡ２ｇ。＝　１．０００）または定量アミノ酸分析のい ずれかにより決定された。

粗順化培地０．５ｆをｐＨ３，５に調整し、遠心によって清澄化した。次いでこ の溶液を、５°Ｃにおいて１０ｍＭ酢酸／酢酸Ｎａ。

ｐＨ３，５で平衡化された５Ｐ−３ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−２５の２．５ＸＪｃｍ カラムに通した。溶出液がベースライン吸光度に達するまでカラムを洗浄し、次 いて１．０ＭＮａＣ１を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７，０の少量 を使って、吸着したタンパク質を溶出せしめた。カラムに負荷した吸光度単位の ９８％が素通り画分と勾配画分において回収された。洗浄画分には検出可能な走 化活性がなかった。検出可能な走化活性の全部が単一溶出タンパク質ピークに限 定された。この段階によって１０倍濃縮と２倍精製が達成された。

５Ｐ−３ｅｐｈａｄｅｘカラムからの走化活性画分を合わせ、８Ｉ！の１０ｍＭ 酢酸／酢酸Ｎａ　ｐＨ３，５に対して１２時間透析した。透析した試料を、次い で１０ｍＭ酢酸／酢酸Ｎａ　ｐＨ３，５で平衡化されているＴＳＫ　５Ｐ−５Ｐ Ｗの７５Ｘ７．５ａｎカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）上に負荷した。連続した２つの異なる勾配を使って １．０ｍ／／分の流速にてカラムを溶出せしめた。最初の２０分間に渡り、ＩＭ 　ＮａＣ１を含む１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ３，５の制限緩衝液による直線塩勾配を使 った。次の２０分間に渡り、ＩＭ　ＮａＣ１を含む１００ｍＭリン酸カリウムｐ Ｈ７，０の制限緩衝液による「直線Ｊ　ｐＨ勾配をプログラムした。勾配溶出４ ０分間に渡り１．０ｒＩＬ１画分を収集した。連続する塩およびｐＨ勾配を使っ た溶出プロフィールを図１に示す。カラムに負荷した全タンパク質の９３％が素 通り画分と勾配画分において回収された。最後のピーク（画分５６〜６４）のみ が走化活性を含んでいた。この段階により５倍精製が達成された。

５Ｐ−５ＰＷクロマトグラフイーからの走化活性画分５６〜６４を合わせ、０． １％ＴＦＡ中に１：２希釈し、そして０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）　１ ５％アセトニトリルで平衡化されているＣ−４逆相ＨＰＬＣカラム上に負荷した 。０．１％ＴＦＡ　／８０％アセトニトリルの制限溶液を使った３５分間に渡る 直線勾配によりカラムを溶離せしめた。１ｒｒＬｌ／分の流速において０．５ｍ ７７画分を集めた。溶出プロフィールを図２に示す。カラム上に負荷した全タン パク質の８５％が勾配画分において回収された。素通り画分と各勾配画分を走化 活性についてアッセイした。２ピークの活性が３５％〜４５％アセトニトリルの 間に溶出され、それらをＡＭＣＦ−ＩおよびＡＭＣＦ−ＩＩと命名した。それら は走化活性を欠く２本の試験管により隔てられていた。

Ｃ−４ＨＰＬＣからの各画分の１０μ！アリコートを蒸発乾固せしめ、還元およ び非還元条件下のＬａｅｍｍｌ　ｉ緩衝液に再溶解し、５分間煮沸し、そして８ 〜２５％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａ ｗａｙ、　ＮＪ）に適用した。Ｐｈａｓｔ−Ｇｅｔ　システム（Ｐｈａｒｍａｃ 　ｉａ）を使って２０　ｍＡ／ゲルで６５ボルト時間電気泳動を行った。分子量 標準として組換えヒトインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ、　Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ　ａ ｎｄ　Ｃｏ、、［ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）（６，２ｋＤａ）、アルブ ミン（６７ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラ ーゼ（３０ｋＤａ）、トリプシンインヒビター（２０，１ｋＤａ）およびα−ラ クトアルブミン（１４，４ｋＤａ）の混合物を含めた。ＡＭＣＦ−ＩおよびＡＭ ＣＦ−ＩＩの分子量は、ＲＩ対１０ｇ＋ｏ　（分子量）のプロットから１０　ｋ Ｄａであると見積もられた。図２は、３５％〜４５％アセトニトリルにおいて溶 出する物質のＡ２ｍ。、走化活性および５ＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールの合成図 を示す。

画分３８（図２）を、より緩い勾配とより少ない両分容量を使ってＣ−４逆相Ｈ ＰＬＣ上で再クロマトグラフィ処理することにより、ＡＭＣＦ−Ｉ［を更に精製 した（図３）。画分３８を０．１％ＴＦＡ／水中にｌ：ｌ希釈し、０．１％ＴＦ Ａ／３０％アセトニトリルで平衡化されているＶｙｄａｃ　Ｃ−４ＨＰＬＣカラ ムに負荷した。０．０７％ＴＦＡ１５０％アセトニトリルの制限溶液を使った２ ０分間に渡る直線勾配によりカラムを溶離せしめ、１ｒＩＬｌ／分の流速におい て０．２５艷の画分を収集した。電気泳動上純粋である得られたＡＭＣＦ４　（ 図３の画分３４）を次の特徴づけに使った。

ブタおよびヒトＰＭＮに対するＡＭＣＦ−１およびＡＭＣＦ−Ｉｆの走化性用量 応答を図４Ａ−Ｃにおいて比較する。Ａλ（ＣＦ−ＩはブタＰＭＮとヒトＰＭＮ の両方を誘引した。存意な走化活性を有するＡＭＣＦ−Ｉの最低濃度は、ブタＰ ＭＮについては３　Ｘｌ０−１０Ｍであり、ヒトＰＭＨについては３　Ｘｌ０− ’　Ｍてあった。ＡＭＣＦ−Ｉの最大走化活性はブタＰＭＮについては３　Ｘｌ ０−”　Ｍで起こり、モしてヒ）−ＰＭＮについてはＩ　Ｘｌ０−”　Ｍまたは それ以上で起こった（図４Ａ）。

対比して、ＡＭＣＦ−ＩＩはブタＰＭＮを誘引したが、ヒトＰＭＮに対しては非 常に小さな効果しか持たなかった（図４Ｂ）。有意な走化活性を有するＡＭＣＦ −ＩＩの最低濃度はｌＸｌ０−”　Ｍ付近であった。ＡＭＣＦ−Ｉｆは、３回の 別々の実験のうち１実験においてしかヒ）　ＰＭＮに対する有意な走化活性を持 たなかった。

図４０はＡＭＣＦ−Ｉ　、　ＡＭＣＦ−Ｉ［およびＬＴＢ、の用量応答を比較す る。ＡＭＣＦ−Ｉの最大走化活性は、同時に試験したザイモサン活性化ブタ血清 で観察されたものの１００％を上回った。

ＡＭＣＦ−ＩＩはＬＴＢ、で観察されたものと同様な傾斜を有する用量応答関係 を証明した。

生体内ＰＭＮ走化性 ２頭の健康なヨークシャ一種のブタをキシラジンとケタミンで鎮静せしめ、次い で１００■のナトリウムチオベンタールを静内投与することにより麻酔した。フ ァイバーオプチック気管支内視鏡を経口的に挿入し、先端を小言（対照側）また は右肺中葉（実験側）のいずれかに割り込ませた。ＡＭＣＦ−Ｉの１０−９Ｍ溶 液１０　ｒｎｌを次のようにして調製した。逆相ＨＰＬＣ（図２）からの画分３ ５のｌＯμｌを無菌の０．２％ウシ血清アルブミン含有リン酸塩緩衝化塩溶液ｐ Ｈ７，２で１．０ｒｎｌに希釈した。滴注直前にこの溶液を発熱性物質不含有０ ．９％ＮａＣ１て１〇−に希釈する。１０μ！の０．１％ＴＦＡ／４０％アセト ニトリルを無菌の０．２％ウシ血清アルブミン含有リン酸塩緩衝化塩溶液ｐＨ７ ，２で１．０ｍｌに希釈し、次いで発熱性物質不含有０．９％ＮａＣ１て１０ｍ １に更に希釈することにより、対照溶液を調製した。

ＡＭＣＦ−Ｉ調製物中には内毒素は検出されなかった。溶液１０−を滴注した直 後に１０ｒＩＬｌアリコートの空気を５回注入して液体のアリコートを肺切片中 に分散させた。４時間後、ブタを再び鎮静させ麻酔した。ファイバーオプチック 気管支内視鏡を有する肺切片の各々において、５つの３０−アリコートの発熱性 物質不含有０．９％ＮａＣ１を使って気管支肺胞洗浄を行った。

各洗浄液アリコートを穏和な吸引により収集した。Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　ＭｃＧｒａｗ　Ｐａ ｒｋ、　ＩＬ）で染色した洗浄液のサイトスピン調製物において、洗浄液中の全 細胞計数を測定した。ｌ動物についての全細胞および分別細胞計数を表２に示す 。ＡＭＣＦ−Ｉの滴注は、対照に対して全回収ＰＭＮの２０倍増加を引き起こし た。加えて、ＡＭＣＦ−ＩはＡＭの９．６倍増加とリンパ球の２５．８倍増加を 引き起こした。

表２ □　− 滴注物　肺葉　容量　全細胞数　ＡＭ　ＰＭＮ　ＬＹＭＰＨＣｍｌ’）　（ＸＩ Ｏ’）　（ＸＩＯ’）　（ＸＩＯ”）　（ＸＩＯ’）ＡＭＣＦ−Ｉ　ＲＭＬ　１ ３６　１３７０　５６２　６７１　１３７対照　小舌　１２９　６６．４　５８ ．４　２．７　５．３増加倍率＝　２０．６　９．６　２４９　２５．８ＡＭＣ Ｆ−Ｉ　−一肺胞マクロファージ由来走化因子ピークＩ対照−ＡＭＣＦ−Ｉ以外 の全部を含む溶液（説明文を参照のこと）ＲＭＬ　−一　右肺中葉 ＡＭ−一肺胞マクロファージ ＰＭＮ　−一　多形核白血球 ＬＹＭＰＨ−−リンパ球 肺切片の組織病理学切片を図５に示す。組織病理学のために、正中切開術によっ て小舌および右肺中葉の開放肺生検を実施した。肺組織をホルマリン固定し、パ ラフィン包埋し、そして光学１１ｍ鏡検歪検査めに切片をヘマトキシリンとニオ シンで染色した。ＡＭＣＦ−Ｉを滴注した実験用肺切片（右肺中葉）は、肺の間 隙並びに肺胞の空隙を巻き込んだ、炎症細胞、卓越的にはＰＭＮの著しい浸潤を 示した（図５Ａ）。対照の肺切片（小舌）を比較のため示したが、正常な外観を 有した（図５Ｃ）。

同じ方法により、１０−”　Ｍ溶液を使ってＡＭＣＦ−ＩＩを生体内走化活性に ついて試験した。肺生検（図６）は肺間隙におけるＰＭＮの存在を示した。

アミノ酸組成および配列分析 アミノ酸組成分析用試料を、５．７Ｎ定沸ＨＣＩ上での蒸気相加水分解により２ ４時間分解した。ＡＭＣＦ−Ｉの２つの２μｇ試料とＡＭＣＦ−Ｉｆの２つの０ ．５μｇ試料を加水分解し、全部で４つの試料を個別にＢｅｃｋｍａｎ　Ｓｙｓ ｔｅｍｓ　６３００高性能アミノ酸分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍ ｅｎｔｓ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）にかけた。未修飾のＡＭＣＦ−Ｉお よびＡＭＣＦ−ＩＩのアミノ酸組成分析を表３に示す。

それらの組成は明らかに異なる。両方ともチロシンを欠いている。ＡＭＣＦ−Ｉ はメチオニンが無＜、ＡＭＣＦ−ＩＩはフェニルアラニンが無い。

表３ ＡＳＰ　５．８　７＋１ ＳＥＲ４，Ｂ　５．Ｉ ＧＬＸ　１９．８　１０ｊ ＰＲ０５，１７，６ ＧＬＹ　４．０　６Ｊ ＡＬＡ　’　３．４　９．７ ＣＹＳ　ＮＤ　ＮＤ ＶＡＬ　１０−０　６．８ ＭＥＴ　Ｏ２−５ ＴＹＲＯＯ Ｐ肛　４．３０ ＡＲＧ　５．７　５．９ ＴＲＰ　ＮＤ　ＮＤ ＊　５ＤＳ−ＰＡＧＥ推定分子量に基づく評価値。システィンとトリプトファン の量は決定されなかった（ＮＤ）。

自動気相ペプチドシークエネータ−（４７５型Ｐｕ１ｓｅ　ＬｉｑｕｉｄＰｒｏ ｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ　：　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、 　Ｉｎｃ、、　ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、　ＣＡ）を使って、ＡＭＣＦ−Ｉとへへ ＩｃＦ−ＩＩの１０μｇ試料のエドマン分解によりＮ末端配列分析を行った。検 出可能なＰＴＨ誘導体が無いサイクルはシスティンとした。未修飾のＡＮＩＣＦ −■の最初の２０アミノ酸の配列と未修飾のＡＭＣＦ−Ｉ［の最初の３０アミノ 酸の配列を表４に示す。Ｘは、後述の通り仮にシスティンとして同定されたアミ ノ酸を示す。

（配列番号ｌ） Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌａｕ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｇｌ ｎ−Ｘ−工１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−５ａｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ− ＨｉｓＡ八Ｉｃへ−Ｉ［ （配列番号２） ｓｅｒ−ｐｒｏ−工１ａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａユａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ− Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｍｅｔ−Ｘ−Ｌａｕ− Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−工ｍｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ− Ｍａｔ−工１ｅ それらのユニークアミノ酸配列を有する他のタンパク質は、ＦＡＳＴＡおよびｔ ＦＡＳＴＡ　（Ｐｅａｒｓｏｎおよびｔ、ｉｔｔｍａｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：　２４４２−２４４８．１９８８）プロ グラムを使ったＥＭＢＬ、　ＧｅｎＢａｎｋ、　５ｗ１ｓｓｐｒｏｔおよびＰＡ Ｒデータベースのコンピューター調査において全く見つからなかった。ＡＭＣＦ −ＩとＡＭＣＦ−ＩＩは明らかに別個のものであるが、それらの間には相同性が ある。加えて、それらは、同じく好中球に対する走化活性を示す他のタンパク質 の特定領域に対する相同性がある（図７．上のパネル）。それらのタンパク質の 最大合致整列は、きわめて近接している２つのシスティン残基の顕著な保存を示 す。それらのシスティン残基は未修飾のＡＭＣＦ−ＩとＡＭＣＦ−ＩＩのエドマ ン分解における２つの空白サイクルと一致する。この相同性比較は、図７に示さ れるようなＡＭＣＦ−ＩとＡＭＣＦ−ＩＩ　（配列番号１および２）の両方の配 列中の未同定の部分がＣｙｓであることを示唆する。

顕著な相同性は、図７に示されるように、それらのシスティン残基にきわめて近 接してはっきり表れた。加えて、ＬｅｓｚｃｚｙｎｓｋｉおよびＲｏｓｅ　（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ　２３４：　８４９−８５５．１９８６）の演算法を使ったそれら のペプチド全部の二次構造分析は、ＡＭＣＦ−Ｉの残基１３〜１８に相当するそ れらの分子の領域においてオメガループが存在することをを暗示した。

実施例３−走化性のペプチド阻害剤 Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３１型ペプチド合成装置を使って、 ペンタペプチド、ロイシル−リジル−スレオニル−チロシル−セリン（ＬＫＴＹ Ｓ）　（配列番号４）を合成した。次いでこのペンタペプチドを、０．１％ＴＦ Ａて平衡化されたＶｙｄａｃ　Ｃ−４カラムを使ったＨＰＬＣにより均一ピーク に精製し、アセトニトリルの０〜６０％勾配により溶出せしめた。Ｂｅｃｋｍａ ｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　６３００アミノ酸分析装置を使ったアミノ酸組成分析により 、該ペプチドの濃度を定量した。

走化性阻害活性をアッセイするために、５％熱不活性化ウつ胎児血清を含むＲＰ Ｍｒ、　ｐＨ７，５中で、ＬＫＴＹＳ　（ＩＸＩＯ−１２Ｍ〜３　ＸＩＯ−７Ｍ ）の存在下または非存在下で３７°Ｃて３０分間ＰＭＮをインキュベートした。

次いて該細胞をＰＢＳ中で洗浄し、化学誘引物質としてブタＡＭＣＦ−Ｉ、天然 および組換えＮＡＰ’ｌ並びにザイモサン活性化血清を使って実施例１に記載の 走化性アッセイにおいて使用した。このペンタペプチドは、ＡＭＣＦ−Ｉに向か うブタＰＭＮ走化性の用量依存性阻害を示し、そして生来のヒトＮＡＰ−１およ び組換えヒト［Ｌ−８に向かうブタＰＭＮ走化性を阻害することがわかった（図 ８）。Ｉ　Ｘｌ０−１０Ｍはどの低い該ペンタペプチド濃度が走化性を阻害する のに有効であることがわかった。ザイモサン活性化血清を化学誘引物質として使 った時には、阻害活性は全く観察されなかった。

今まで明確化と理解の目的で説明および実施例により本発明を幾らか詳細に記載 してきたが、添付の請求の範囲内で幾つかの変更および改良を行い得ることは明 らかであろう。

画分番号 画分番号 ＦＭＧ、３ ＦＩＧ。５Ｃ 好中球化学誘引物質 化学誘引活性を有する実質的に純粋なブタタンパク質および該タンパク質の調製 方法。それらのタンパク質は、好中球走化性を増強するための組成物において、 例えば肉芽組織の形成を促進する際に有用である。該タンパク質は、好中球走化 性を阻害するペプチドを含む炎症性および抗炎症性剤を開発する方法においても 有用である。

国際調査報告

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に純粋なブタＡＭＣＦ−Ｉ。
2. ２．アミノ末端アミノ酸配列【配列があります】（配列番号１）を有し、ここで ＸはＣｙｓまたは他のアミノ酸である、請求項１に記載のＡＭＣＦ−Ｉ。
3. ３．少なくとも約２００，０００単位／ｍｇの比活性を有する、請求項１に記載 のＡＭＣＦ−Ｉ。
4. ４．少なくとも４００，０００単位／ｍｇの比活性を有する、請求項１に記載の ＡＭＣＦ−Ｉ。
5. ５．実質的に純粋なブタＡＭＣＦ−ＩＩ。
6. ６．アミノ末端アミノ酸配列【配列があります】（配列番号２） を有し、ここでＸはＣｙｓまたは他のアミノ酸である、請求項５に記載のＡＭＣ Ｆ−ＩＩ。
7. ７．少なくとも約１００，０００単位／ｍｇの比活性を有する、請求項５に記載 のＡＭＣＦ−ＩＩ。
8. ８．少なくとも２００，０００単位／ｍｇの比活性を有する、請求項５に記載の ＡＭＣＦ−ＩＩ。
9. ９．ブタＡＭＣＦ−ＩとＡＭＣＦ−ＩＩとを含んで成り、そして少なくとも約２ ０，０００単位／ｍｇの比活性を有する、タンパク質組成物。
10. １０．ブタＡＭＣＦ−Ｉをコードする単離されたＤＮＡ分子。
11. １１．前記分子がアミノ末端アミノ酸配列【配列があります】（配列番号１）を コードし、ここでＸはＣｙｓまたは他のアミノ酸である、請求項１０に記載のＤ ＮＡ分子。
12. １２．ブタＡＭＣＦ−ＩＩをコードする単離されたＤＮＡ分子。
13. １３．前記分子がアミノ末端アミノ酸配列【配列があります】（配列番号２）を コードし、ここでＸはＣｙｓまたは他のアミノ酸である、請求項１２に記載のＤ ＮＡ分子。
14. １４．生理学的に許容される担体または希釈剤と共に、ブタＡＭＣＦ−Ｉおよび ブタＡＭＣＦ−ＩＩから成る群から選択されたタンパク質を含んで成る組成物。
15. １５．前記タンパク質が１０−８Ｍ〜１０−５Ｍの濃度で存在する、請求項１４ に記載の組成物。
16. １６．３〜１８個のアミノ酸から成る単離されたペプチドであって、前記ペプチ ドがアミノ酸配列【配列があります】（配列番号３）を含んで成り、ここで Ｒ１は【配列があります】であるかまたは存在せず；Ｒ２は【配列があります】 またはＡｓｎであり；Ｒ３は【配列があります】またはＬｅｕであり；そしてＲ ４は【配列があります】であるかまたは存在せず、そして前記ペプチドがＡＭＣ Ｆ−Ｉ，ＡＭＣＦ−ＩＩまたはＮＡＰ−１に向かう好中球の走化性を阻害するこ とを特徴とする単離されたペプチド。
17. １７．Ｒ１がＬｅｕであり、Ｒ２がＬｙｓであり、Ｒ３がＴｙｒでありそしてＲ ４がＳｅｒである、請求項１６に記載の単離されたペプチド。
18. １８．前記ペプチドが５アミノ酸の長さのものである、請求項１６に記載の単離 されたペプチド。
19. １９．前記ペプチドが７アミノ酸の長さのものである、請求項１６に記載の単離 されたペプチド。
20. ２０．【配列があります】（配列番号４）から本質的に成る単離されたペプチド 。
21. ２１．３〜１８個のアミノ酸から成る単離されたペプチドであって、前記ペプチ ドがアミノ酸配列【配列があります】（配列番号５）を含んで成り、ここで Ｒ１は【配列があります】であるかまたは存在せず；Ｒ２は【配列があります】 であるかまたは存在せず；Ｒ３は【配列があります】であるかまたは存在せず； Ｒ４は【配列があります】であるかまたは存在せず；Ｒ５は【配列があります】 またはＳｅｒであり；そしてＲ６はＧｌｕまたはＡｓｐであり、 そして前記ペプチドがＡＭＣＦ−Ｉ，ＡＭＣＦ−ＩＩまたはＮＡＰ−１に向かう 好中球の走化性を阻害することを特徴とする単離されたペプチド。
22. ２２．Ｒ１がＡｌａであり、Ｒ２がＡｒｇであり、Ｒ３がＶａｌであり、Ｒ４が Ｓｅｒであり、Ｒ５がＡｌａでありそしてＲ６がＧｌｕである、請求項２１に記 載の単離されたペプチド。
23. ２３．前記ペプチドが７アミノ酸の長さのものである、請求項２１に記載の単離 されたペプチド。
24. ２４．【配列があります】（配列番号６）から本質的に成る単離されたペプチド 。
25. ２５．生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に、請求項１６〜２ ４のいずれか一項に記載のペプチドを含んで成る医薬組成物。
26. ２６．哺乳動物における炎症を減少させるための医薬品の製造に使われる組成物 であって、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載のペプチドを含んで成る組成 物。
27. ２７．活性治療物質として使われる、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の ペプチド。