ES2318075T3 - Metodo para acelerar la velocidad de eliminacion mucociliar. - Google Patents

Abstract

El uso de un inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz para preparar un medicamento para tratar una enfermedad pulmonar asociada con la retención y acumulación de moco, seleccionada del grupo de enfermedades que consiste en fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, bronquietasis, sinusitis crónica y otitis media con efusión, comprendiendo el medicamento una cantidad eficaz de un inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz humanas y un vehículo fisiológicamente aceptable para él, en el que el inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz comprende la secuencia de aminoácidos:

Description

Método para acelerar la velocidad de eliminación mucociliar.

Referencia cruzada

Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente de EEUU nº de serie 09/218.918, presentada el 22 de diciembre, 1998.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden proteínas inhibidoras de serinproteasas, según se especifica en la presente, en la producción de medicamentos que estimulan la velocidad de eliminación mucociliar de moco y esputo en los conductos respiratorios pulmonares.

Antecedentes de la invención Problema tratado

La disfunción mucociliar, caracterizada por la incapacidad del epitelio ciliar para eliminar el moco y el esputo en los conductos respiratorios pulmonares, es una complicación grave de enfermedades pulmonares obstructivas crónicas, como la bronquitis crónica (BC), bronquiectasis (BE), asma y, en especial, fibrosis quística (FQ). Los pacientes que padecen una disfunción mucociliar son particularmente vulnerables a infecciones bacterianas secundarias. Se han descrito modalidades de tratamiento y mantenimiento para la FQ y otras enfermedades respiratorias asociadas con una disfunción mucociliar y la necesidad de mejores tratamientos. Véase, por ejemplo, Braga, "Drugs in Bronchial Mucology", Raven Press, Nueva York, 1989; Lethem et al., Am. Rev. Respir. Dis., 142:1053-1058, 1990; patente de EEUU nº 5.830.436.

Fibrosis quística

La fibrosis quística (FQ) en una enfermedad recesiva autosómica que provoca anomalías en los fluidos y el transporte de electrolitos en los epitelios exocrinos. Se han descubierto mutaciones en el DNA que codifica una proteína denominada regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística ("cystic fibrosis transmembrane conductance regulator", CFTR) en casi todos los pacientes con FQ. Las células pulmonares se encuentran particularmente afectadas (Di Santagrese et al., Am. J. Med., 66:121-132 (1979)).

En la FQ, la frontera luminal de las células mucosas de los conductos respiratorios no responde a la activación por proteína-quinasas dependientes de cAMP de los canales de iones cloruro de la membrana. La permeabilidad celular al Cl^{-} es defectuosa, y se acelera la absorción de Na^{+} a través de la membrana celular. Estos dos desequilibrios de los electrolitos tienden a reducir el nivel de hidratación del moco de los conductos respiratorios, contribuyendo con ello a las secrecciones pulmonares viscosas características de la FQ (Knowles, Clin. Chest. Med., 11:75 (1986)). Bacterias y micoplasmas adventicios entran en los conductos respiratorios y establecen colonias dentro del moco. El moco espeso asociado con la FQ aísla estos patógenos del sistema inmunológico. Puesto que la eliminación mucociliar es menor en pacientes con FQ, también se reduce la eliminación bacteriana. Por tanto, son habituales la congestión e infección pulmonares. La presencia prolongada de estos agentes patógenos invariablemente inicia reacciones inflamatorias que comprometen la función pulmonar (Bedrossian et al., Human Pathol., 7:195-204, 1976).

La viscosidad del moco en pulmones con FQ es, en parte, debida a una menor hidratación del moco, relacionada con el funcionamiento defectuoso del canal de Cl^{-} y la modificación de la concentración de iones sodio (Na~) en el líquido de la superficie de los conductos respiratorios (LSCR), que cambia la velocidad de eliminación mucociliar (EMC) de los conductos respiratorios. Los mecanismos implicados en el transporte de moco se han estudiado in vitro e in vivo. Los esputos de BC, FQ y BE son transportados lentamente por el epitelio ciliar de mamíferos en la tráquea bovina con poco moco (TBPM) (Wills et al., J. Clin. Invest., 97(1):9-13, 1995). El transporte lento del esputo enfermo en la TBPM puede estar conectado con su bajo contenido en electrolitos/osmolitos (Wills et al., J. Resp. Crit. Care Med., 151(4):1255-1258, 1997). En efecto, se sabe que el esputo enfermo tiene un bajo contenido en electrolitos con relación al plasma (Matthews et al., Am. Rev. Resp. Dis., 88:199-240, 1963; Potter et al., Am. Rev. Resp. Dis., 67(1):83-87, 1967; Tomkiewicz et al., Am. Rev. Resp. Dis., 148(4, pt. 1):1002-1007, 1993).

Otros estudios de la TBPM han demostrado que el transporte del moco enfermo mejora mucho después de un tratamiento con cloruro de sodio (Wills et al., 1995). Además, estudios clínicos han demostrado que la inhalación de disolución salina hipertónica, o del bloqueante del canal de sodio epitelial (CNaE) amilorida puede aumentar la EMC significativamente en pacientes enfermos (Robinson et al., Thorax, 52(10):900-903, 1997; App et al., Am. Rev. Resp. Dis., 141, 605-612, 1990). En fecha reciente, se ha esclarecido la relación entre la eliminación del moco y su composición iónica in vivo en el modelo de cobaya de la velocidad del moco traqueal (VMT). Estudios in vivo han demostrado que 5 minutos con un aerosol de disolución salina hipertónica aumenta la VMT de forma transitoria. Se observó un aumento en la VMT 1 minuto después de administrar un aerosol de disolución salina hipertónica (al 14,4%). La VMT era 5,1 \pm 1,0 mm.min^{-1} (n=9) en animales expuestos a disolución salina al 0,9%, comparada con 11,3 \pm 1,3 mm.min^{-1} en animales expuestos a disolución salina hipertónica (n=9; p \leq 0,001) (Newton y Hall, 1997). La amilorida inhalada también provocó un aumento en la VMT. Se observó un aumento significativo en la VMT 15 minutos después de una administración de 20 minutos de aerosol de amilorida (10 mM). La VMT era 3,2 \pm 2,5 mm.min^{-1} (n=9) en animales expuestos a agua, comparada con 8,1 \pm 0,3 mm.min^{-1} en animales expuestos a amilorida (n=8; p \leq 0,05) (Newton et al., Ped. Pulm., S17, resumen 364, 1998). Estos agentes parecen actuar aumentando el contenido iónico del líquido de la superficie de los conductos respiratorios (LSCR).

Las pruebas genéticas clínicas procedentes de sujetos con pseudohipoaldosteronismo sistémico (PHAS) también apoyan la opinión de que la infrarregulación de la actividad de los canales de sodio epiteliales de los conductos respiratorios aumentará la eliminación mucociliar en el pulmón. Los pacientes con PHAS con mutaciones de pérdida de función en los genes de las subunidades del canal de sodio epitelial no tenían absorción de sodio desde las superficies de los conductos respiratorios, presentaban una mayor concentración de iones sodio en el líquido de la superficie nasal comparada con sujetos normales, y tenían una velocidad de eliminación mucociliar pulmonar 4 veces mayor comparada con los sujetos normales (Kerem et al., New England J. Med., 341, 156-162, 1999).

En fechas recientes, se ha descubierto una serinproteasa denominada proteasa activadora del canal-1 (CAP-1) en la membrana apical de células epiteliales renales del anfibio Xenopus (células A6) (Vallet et al., Nature, 389(6651):607-610, 1997). La CAP-1 parece controlar la actividad del canal de Na^{+} en estas células. La exposición de la membrana apical al inhibidor de Kunitz bovino prototípico, la aprotinina, reduce el transporte de Na^{+} transepitelial (Vallet et al., 1997; Chraibi et al., J. Gen. Physio., 111(1):127-138, 1998). El efecto de la bikunina (1-170), un homólogo humano con dos dominios de Kunitz de la aprotinina bovina (Delaria et al., J. Biol. Chem., 272(18):12209-12214, 1997; Marlor et al., J. Biol. Chem., 272(18):12202-12208, 1997) se evaluó utilizando la corriente en cortocircuito (Icc) de células epiteliales bronquiales humanas cultivadas normales (HBE) in vitro (McAulay et al., Ped. Pulm., S17, resumen 141, 1998). La bikunina (1,5 ug.ml^{-1}; 70 nM) inhibió significativamente en 54% la Icc de Na^{+} en células HBE normales (n=5-8; p \leq 0,05). En general, la bikunina (70 nM) inhibió 58% de la línea de base de Icc en 90 minutos. En otro estudio, la bikunina (5 ug.ml^{-1}) inhibió significativamente (84%) la Icc de Na^{+} en células HBE normales (n=6; p \leq 0,01), mientras que el inhibidor de serinproteasas de la familia de la serpina, el inhibidor de alfa(1)-proteasa (\alpha_{1}-PI) (50 ug.ml^{-1}) no produjo un efecto significativo. En células epiteliales de los conductos respiratorios de fibrosis quística humanas cultivadas in vitro, la Icc fue inhibida por la bikunina (1-170) (1 ug/ml), y fue inhibida por la aprotinina
(20 ug/ml).

Dos estudios recientes realizados por un único equipo investigador han demostrado un efecto inducido por inhibidores de proteasas sobre la VMT. La \alpha_{1}-PI (10 mg) administrada 30 minutos antes de la exposición al antígeno, o 1 hora después de la exposición, atenúa la reducción inducida por el antígeno en la VMT en ovejas alérgicas, 6 horas después de la exposición (O'Riordan et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med., 97(5):1522-1528, 1997). En la figura 1 del artículo de O'Riordan et al., 1977, los autores demuestran que la \alpha_{1}-PI administrada por sí sola (sin exposición al antígeno) en los conductos respiratorios de ovejas alérgicas no producía efecto en la línea de base de VMT a lo largo de un periodo de 6 horas. En un segundo estudio, la \alpha_{1}-PI se administró 6 horas después de la exposición al antígeno y sólo provocó una reversión significativa de la reducción inducida por el antígeno en la VMT después de 24 horas de la exposición (O'Riordan et al., J. App. Physio., 85(3):1086-1091, 1998). Los autores sostienen que el mecanismo para el efecto de la \alpha_{1}-PI está asociado con su propiedad antielastasa de neutrófilos, puesto que se cree que la elastasa de neutrófilos es la enzima responsable de la menor velocidad de eliminación mucociliar en su modelo. Razonaron que \alpha_{1}-PI puede utilizarse para tratar la disfunción mucociliar producida por la liberación de elastasa de neutrófilos inducida por alergia en el asma (O'Riordan et al., 1998); no especularon sobre el papel potencial en otras enfermedades respiratorias.

Breve sumario de la invención

La presente invención se refiere al uso de inhibidores de serinproteasas de la familia Kunitz, según se especifica en la presente, en la producción de medicamentos que estimulan la velocidad de eliminación mucociliar (EMC) de moco y esputo en los conductos respiratorios del pulmón. Los inhibidores de serinproteasas de tipo Kunitz pueden utilizarse para tratar enfermedades pulmonares como la fibrosis quística (FQ), la bronquitis crónica (BC) y la bronquiectasis (BE), en las que la retención y acumulación de moco es un problema clínico importante. Hasta la fecha, la técnica anterior no ha asociado a los inhibidores de proteasas con la capacidad para aumentar la velocidad de EMC por encima de la línea de base de la velocidad. Los inhibidores de serinproteasas de tipo Kunitz también pueden utilizarse para tratar la sinutis crónica y la otitis media mucoide, en las que la retención y acumulación de moco es un problema clínico.

En una realización, la invención proporciona el uso de un inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz humanas, para preparar un medicamento para tratar una enfermedad pulmonar asociada con la retención y acumulación de moco, seleccionada del grupo de enfermedades que consiste en fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, bronquietasis, sinusitis crónica y otitis media con efusión, comprendiendo el medicamento una cantidad eficaz de un inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz humanas y un vehículo fisiológicamente aceptable para él, en el que el inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz comprende una secuencia de aminoácidos, según se especifica en la reivindicación 1.

Los ejemplos de inhibidores de serinproteasas humanas incluyen la bikunina y sus variantes y fragmentos, como los descritos en el documento WO 97/33996, publicado el 18 de septiembre, 1997 (Bayer Corp.), y la patente de EEUU nº 5.407.915, otorgada el 18 de abril, 1995 (Bayer AG).

Descripción de los dibujos

La invención se entenderá mejor tomando en consideración la siguiente descripción detallada y reivindicaciones, junto con los dibujos, en los que:

La figura 1 representa la secuencia de nucleótidos de EST R35464 (SEQ ID NO:12) y la traducción de esta secuencia de DNA (denominada "ORF") que produce un marco de lectura abierto con cierta similitud de secuencia con la aprotinina. Los aminoácidos 1-110 de la traducción se corresponden con la SEQ ID NO:13, y los aminoácidos 112-130 se corresponden con la SEQ ID NO:72. El producto de la traducción contiene 5 de las 6 cisteínas con el espaciamiento correcto que es característico de los dominios de inhibidores de tipo Kunitz (indicadas en negrita). La posición normalmente ocupada por la otra cisteína (en el codón 38) contiene, en su lugar, una fenilalanina (indicada por un asterisco).

La figura 2 representa la secuencia de nucleótidos de EST R74593 (SEQ ID NO:14) y la traducción de esta secuencia de DNA (denominada "ORF") que produce un marco de lectura abierto con homología con la clase Kunitz de dominios de inhibidores de serinproteasas. Los aminoácidos 3-22 de la traducción se corresponden con la SEQ ID NO:15, los aminoácidos 24-131 se corresponden con la SEQ ID NO:73, y los aminoácidos 136-166 se corresponden con la SEQ ID NO:74. El producto de la traducción contiene las 6 cisteínas con el espaciamiento correcto que es característico de los dominios de inhibidores de tipo Kunitz (indicadas en negrita). Sin embargo, la secuencia del marco de lectura incluye codones de terminación en el codón 3 y 23.

La figura 3 representa una secuencia de ácido nucleico deducida de la bikunina placentaria humana (SEQ ID NO:9) denominada "consenso", y apareada con la secuencia de aminoácidos de la proteína traducida denominada "traducida". Los aminoácidos -18-179 de la traducción se corresponden con la SEQ ID NO:10, y los aminoácidos 184-214 se corresponden con la SEQ ID NO:76. También se muestra la comparación de la secuencia del ácido nucleico de los EST H94519 (SEQ ID NO:16), N39798 (SEQ ID NO:17), R74593 (corregida para la inserción de G en la posición 114) (SEQ ID NO:75) y R35464 (SEQ ID NO:12). Los nucleótidos subrayados en la secuencia consenso se corresponden con el sitio de los cebadores de PCR descritos en los ejemplos. Los aminoácidos subrayados en la secuencia consenso traducida son restos cuya identidad se ha confirmado mediante secuenciación de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa purificada. El código de los nucleótidos y aminoácidos es el código de una letra estándar, "N" en el código de ácidos nucleicos indica un ácido nucleico sin asignar, y "*" indica un codón de terminación o un aminoácido sin asignar en la secuencia de aminoácidos.

La figura 4A representa las capas superpuestas originales de una serie de EST que presentan algo de homología de secuencia de aminoácidos con EST que codifican la bikunina placentaria humana, o sus porciones. Como referencia se muestran las posiciones relativas de la bikunina (7-64) y la bikunina (102-159), denominadas KID1 y KID2, respectivamente.

La figura 4B representa otras capas superpuestas de EST más completas, que incorporan más EST. Los números del eje-X superior se refieren a la longitud en pares de bases, comenzando desde la primera base de la secuencia EST más 5'. La longitud de cada barra está en proporción con la longitud en pares de bases de los EST individuales incluyendo los huecos. Los números de registro de EST se indican a la derecha de sus respectivas barras EST.

La figura 4C representa el alineamiento correspondiente de las secuencias de oligonucleótidos de cada EST solapante que se muestran de forma esquemática en la figura 4B. La secuencia superior (SEQ ID NO:51), denominada bikunina, representa la secuencia del oligonucleótido consenso derivada de los nucleótidos solapantes en cada posición. Los números se refieren a la posición de pares de bases dentro del mapa del EST. Los oligonucleótidos en los EST R74593 (SEQ ID NO:89) que están en negrita y subrayados (en las posiciones del mapa 994 y 1005) son inserciones de bases observadas en R74593 que estaban siempre ausentes en cada uno de los otros EST solapantes. En la figura 4C, N40851 se corresponde con la SEQ ID NO:77, N39876 se corresponde con la SEQ ID NO:78, R87894 se corresponde con la SEQ ID NO:79, H16866 se corresponde con la SEQ ID NO:80, R34808 se corresponde con la SEQ ID NO:81, T66058 se corresponde con la SEQ ID NO:82, N57450 se corresponde con la SEQ ID NO:83, N57374 se corresponde con la SEQ ID NO:84, R35464 se corresponde con la SEQ ID NO:85, H94519 se corresponde con la SEQ ID NO:86, N39798 se corresponde con la SEQ ID NO:87, H87300 se corresponde con la SEQ ID NO:88, R74593 se corresponde con la SEQ ID NO:89, R31730 se corresponde con la SEQ ID NO:90, R34701 se corresponde con la SEQ ID NO:91, H02982 se corresponde con la SEQ ID NO:92, R32676 se corresponde con la SEQ ID NO:93, T47439 se corresponde con la SEQ ID NO:94, R73968 se corresponde con la SEQ ID NO:95, H39840 se corresponde con la SEQ ID NO:96, H95233 se corresponde con la SEQ ID NO:97, H39841 se corresponde con la SEQ ID NO:98, N30199 se corresponde con la SEQ ID NO:99, T52966 se corresponde con la SEQ ID NO:100, N29508 se corresponde con la SEQ ID NO:101, N26919 se corresponde con la SEQ ID NO:102, N26910 se corresponde con la SEQ ID NO:103, H16757 se corresponde con la SEQ ID NO:104, y N27732 se corresponde con la SEQ ID NO:105.

La figura 4D representa la traducción en aminoácidos de la secuencia del oligonucleótido consenso para la bikunina que aparece en la figura 4C (SEQ ID NO:45).

La figura 4E representa la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:46) y la correspondiente traducción en aminoácidos (SEQ ID NO:47) de una secuencia codificadora de bikunina placentaria que se derivó a partir de un banco de cDNA placentario humano mediante amplificación basada en PCR.

La figura 4F representa la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:48) y la correspondiente traducción en aminoácidos (SEQ ID NO:49) de un clon codificador de bikunina placentaria humana nativa que se aisló a partir de un banco de cDNA lambda placentario humano mediante hibridación de colonias.

La figura 4G compara el alineamiento de las secuencias de oligonucleótidos traducidas en aminoácidos para la bikunina placentaria obtenida mediante capas superpuestas de EST (SEQ ID NO:45), clonación basada en PCR (SEQ ID NO:47) e hibridacón de colonias lambda convencional (SEQ ID NO:49).

La figura 5 muestra una gráfica de purificación de bikunina placentaria humana a partir de tejido placentario después de una filtración en gel Superdex 75. La gráfica es una superposición del perfil de elución de la proteína medido mediante DO 280 nm (línea continua), la actividad de la proteína eluida en un ensayo de inhibición de tripsina (el porcentaje de inhibición se muestra con círculos) y la actividad de la proteína eluida en un ensayo de inhibición de calicreína (el porcentaje de inhibición se muestra con cuadrados).

La figura 6 muestra una gráfica que representa la purificación de bikunina placentaria humana a partir de tejido placentario utilizando una cromatografía de fase inversa C18. La gráfica es una superposición del perfil de elución de la proteína medido mediante DO 215 nm (línea continua), la actividad de la proteína eluida en un ensayo de inhibición de tripsina (el porcentaje de inhibición se muestra con círculos) y la actividad de la proteína eluida en un ensayo de inhibición de calicreína (el porcentaje de inhibición se muestra con cuadrados).

La figura 7 representa un gel de SDS-PAGE teñido con plata de bikunina placentaria muy purificada (carril 2) y una serie de proteínas marcadoras de tamaño molecular (carril 1) de los tamaños indicados en kilodaltons. La migración se realizó de arriba abajo.

La figura 8 representa la cantidad de actividad inhibidora de tripsina presente en el caldo de fermentación exento de células procedente del crecimiento de las cepas de levaduras SC101 (panel 8A) o WHL341 (panel 8B) que se transformaron, de forma estable, con un plásmido (pS604) que dirige la expresión de la bikunina placentaria (102-159).

La figura 9 representa un SDS-PAGE teñido con plata (figura 9A) y un análisis de la transferencia Western con pAb antibikunina placentaria (102-159) (figura 9B) de un caldo de fermentación exento de células procedente del crecimiento de las cepa de levaduras SC101 (recombinantes 2.4 y 2.5) que se transformó, de forma estable, con un plásmido que dirige la expresión de la aprotinina bovina o de la bikunina placentaria (102-159). La migración se realizó de arriba abajo.

La figura 10 es una fotografía que muestra un SDS-PAGE teñido con plata de bikunina placentaria muy purificada (102-159) (carril 2) y una serie de proteínas marcadoras de peso molecular (carril 1) de los tamaños indicados en kilodaltons. La migración se realizó de arriba abajo.

La figura 11 es una fotografía que muestra los resultados del análisis de la transferencia Northern de mRNA procedente de diversos tejidos humanos que se hibridó con una sonda de cDNA marcada con ^{32}P que codifica la bikunina placentaria (102-159) (figura 11A), o que codifica la bikunina placentaria (1-213) (figura 11B). La migración se realizó de arriba abajo. Los números a la derecha de cada análisis de la transferencia se refieren al tamaño en kilobases de los marcadores de RNA adyacentes. Los órganos a partir de los cuales se obtiene el mRNA se describen bajo cada carril del análisis de la transferencia.

La figura 12 representa un inmunoanálisis de la transferencia de bikunina placentaria derivada de placenta con antisuero de conejo producido contra bikunina placentaria reducida sintética (7-64) (figura 12A) o 102-159 (figura 12b). En cada panel, los contenidos son: marcadores de tamaño molecular (carriles 1); bikunina placentaria nativa aislada a partir de placenta humana (carriles 2); bikunina placentaria sintética (7-64) (carriles 3); y bikunina placentaria sintética (102-159) (carriles 4). Geles de SDS-PAGE con tricina al 10-20% se analizaron mediante transferencia y se revelaron con un anticuerpo policlonal primario purificado de proteína A (8 ug de IgG en 20 ml de BSA al 0,1%/disolución salina tamponada con Tris (pH 7,5)), seguido de un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina. La migración se realizó de arriba abajo.

La figura 13 representa un gel de SDS-PAGE con tricina al 10-20% teñido con azul de Coomassie de 3 microgramos de bikunina placentaria muy purificada (1-170) derivada de un sistema de expresión de baculovirus/Sf9 (carril 2). El carril 1 contiene marcadores de peso molecular. La migración se realizó de arriba abajo.

La figura 14 representa una comparación del efecto de concentraciones crecientes de bikunina placentaria humana derivada de Sf9 (1-170) (círculos negros), bikunina placentaria sintética (102-159) (círculos blancos) o aprotinina (cuadrados blancos) sobre el tiempo de tromboplastina parcial activada de plasma humano. La coagulación se inició con CaCl_{2}. La concentración de las proteínas se representó frente a la prolongación (en número de veces) del tiempo de coagulación. El tiempo de coagulación sin inhibición era 30,8 segundos.

La figura 15 ilustra el efecto de la bikunina con unos niveles de dosificación de 2 uM y 0,2 uM con relación a la amilorida (100 uM) y un vehículo de disolución salina equilibrada de Hank (HBSS) (control) sobre las diferencias de potencial en tráquea de cobaya 3 horas después del tratamiento.

La figura 16 ilustra (a) la colocación de la jeringa de instilación y la sonda beta con relación a la tráquea de cobaya; (b) una gráfica representativa para la medida de la velocidad media de la tráquea (VMT) utilizando S. cerevisiae marcado con ^{32}P; y (c) el aumento sostenido en la VMT in vivo en cobayas en respuesta a la bikunina (5 ug) con relación al vehículo control de HBSS a las 1,5, 1,75, 2,0, 2,25 y 2,5 horas después de la instilación traqueal.

La figura 17 ilustra que la bikunina (70 nM) disminuye la corriente de sodio en células epiteliales bronquiales humanas cultivadas in vitro con relación a la amilorida (10 uM).

La figura 18 ilustra el efecto de 5 min de un aerosol de disolución salina hipertónica (al 14,4%) sobre el aumento de la VMT, después de un tratamiento con aerosol en tráquea de cobaya.

La figura 19 ilustra el efecto de 20 min de un aerosol de amilorida (10 mM) sobre la VMT, después de un tratamiento con aerosol en tráquea de cobaya.

La figura 20 ilustra que la bikunina (5 ug/ml), la aprotinina (5 ug/ml) y la muteína doble de aproteína (0,5 ug/ml, 1,5 ug/ml y 5 ug/ml) disminuyen la corriente en cortocircuito de sodio en células bronquiales humanas cultivadas in vitro.

La figura 21 ilustra que la aprotinina (1 mg/ml) inhibe la Icc in vitro en células epiteliales bronquiales de FQ humanas.

La figura 22 ilustra que un aerosol de bikunina (3 ml de 3 mg/ml) aumenta significativamente la VMT en ovejas con relación al control de PBS.

La figura 23 ilustra que la bikunina (50 ug/ml) inhibe la corriente de sodio in vitro en células epiteliales traqueales de cobaya durante un periodo de 30 minutos.

La figura 24 ilustra que la bikunina (100 ug/ml) inhibe significativamente la corriente de sodio in vitro en células epiteliales traqueales ovinas durante un periodo de 90 minutos.

La figura 25 ilustra que (a) la exposición a LPS provoca un influjo de PMN significativo, y que (b) la bikunina inhibe significativamente la diferencia de potencial en cobayas preexpuestas a LPS.

La figura 26 ilustra que la muteína doble de aprotinina (10 ug) aumenta la VMT in vivo en cobayas con relación a HBSS durante un periodo sostenido de 1,5 a 2,5 horas después de la administración.

La figura 27 representa un mapa de plásmido de pBC-BK (CMV-IE = inmediato temprano de citomegalovirus; DHFR = dihidrofolato-reductasa; AMP-r = resistencia a la ampicilina).

La figura 28 ilustra que (a) la bikunina (1-170) expresada por CHO (10 ug/ml) disminuye la corriente de sodio in vitro en células epiteliales bronquiales de FQ humanas durante un periodo de 90 minutos, y (b) la bikunina (1-170) de CHO a 1, 5 y 10 ug/ml, y la aprotinina a 20 ug/ml, disminuyen la corriente de sodio a los 90 minutos después de la aplicación apical a células epiteliales bronquiales de FQ humanas in vitro.

La figura 29 ilustra las etapas del proceso para purificar la bikunina (1-170) a partir de un sistema de expresión de células CHO.

La figura 30A muestra una gráfica de la migración de las isoformas de bikunina (1-170) de CHO purificada utilizando una cromatografía de fase inversa C18. La gráfica es una superposición del perfil de elución de la proteína medido mediante DO 280 nm (línea continua) y el porcentaje de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1% utilizado para eluir la proteína (diamantes).

La figura 30B es una fotografía que muestra un SDS-PAGE teñido con plata de las isoformas glicosiladas de la bikunina purificada (1-170) (carriles 45-55) expresadas a partir de un sistema de expresión de células CHO, y una serie de proteínas marcadoras de tamaño molecular (entre los carriles 54 y 55) de los tamaños indicados en kilodaltons. La migración se realizó de arriba abajo.

La figura 31 es una fotografía que muestra un SDS-PAGE teñido con plata de isoformas de bikunina purificada (1-170) de CHO tratadas con N-glicosidasa F (carriles 2 y 4) y sin tratar (carriles 1 y 3), y una serie de proteínas marcadoras de tamaño molecular de los tamaños indicados en kilodaltons. La migración se realizó de arriba abajo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al uso de un inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz humanas para preparar un medicamento para tratar una enfermedad pulmonar asociada con la retención y acumulación de moco, seleccionada del grupo de enfermedades que consiste en el fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, bronquietasis, sinusitis crónica y otitis media con efusión, comprendiendo el medicamento una cantidad eficaz de un inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz humanas y un vehículo fisiológicamente aceptable para él, en el que el inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz comprende una secuencia de aminoácidos, según se especifica en la reivindicación 1.

Una aplicación preferida para la bikunina placentaria, los dominios aislados y otros variantes es para estimular la eliminación mucociliar en pacientes con FQ como parte de la terapia y gestión de la enfermedad. Estos medicamentos reducen o eliminan la acumulación de moco y esputo en los conductos respiratorios pulmonares en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, reduciendo con ello el riesgo de infecciones pulmonares secundarias y otros efectos secundarios adversos, así como evitando o retrasando la necesidad de cirugía de trasplante de pulmón en pacientes con FQ.

Se ha demostrado que la aprotinina reduce el transporte de Na^{+} transepitelial en la membrana apical de células epiteliales renales del anfibio Xenopus (células A6) (Vallet et al., 1997; Chraibi et al., 1998). Se ha propuesto que el mecanismo de la acción de la aprotinina implica la inhibición de CAP-1, una proteasa implicada en el control de la actividad del canal de Na^{+} en células A6. También se ha demostrado que la bikunina (1-170), un homólogo humano con dos dominios de Kunitz de la aprotinina bovina (Delaria et al., 1997; Marlor et al., 1997) inhibe significativamente in vitro la corriente en cortocircuito (Icc) de células epiteliales bronquiales humanas (HBE) cultivadas normales (McAulay et al., 1998). La bikunina (1,5 ug.ml^{-1}; 70 nM) inhibe significativamente en 54% la Icc de Na^{+} en células HBE normales (n=5-8; p \leq 0,05). En general, la bikunina (70 nM) inhibió 58% de la línea de base de Icc en 90 minutos. En otro estudio, la bikunina (5 ug.ml^{-1}) inhibió significativamente (84%) la Icc de Na^{+} en células HBE normales (n=6; p \leq 0,01), mientras que el inhibidor de serinproteasas de la familia de la serpina, el inhibidor de alfa(1)-proteasa (\alpha_{1}-PI) (50 ug.ml^{-1}) no produjo un efecto significativo. En células epiteliales de los conductos respiratorios de fibrosis quística humanas cultivadas, la Icc fue inhibida por la bikunina (1-170) (1 ug/ml), y fue inhibida por la aprotinina
(20 ug/ml).

A la luz de estas observaciones, los inhibidores de serinprotesas de tipo Kunitz, como la aprotinina, la bikunina placentaria y sus fragmentos, se contemplan como productos terapéuticos para tratar la disfunción mucociliar, incluyendo la fibrosis quística.

Un "inhibidor de Kunitz" significa un inhibidor de proteasas; desde el punto de vista estructural, un "inhibidor de Kunitz" o "dominio de Kunitz" es una proteína, o dominio de proteína, de forma típica con una longitud de aproximadamente 60 aminoácidos y que contiene tres enlaces disulfuro (véase Laskowske y Kato, Ann. Rev. Biochem., 49, 593-626, 1980).

Una ventaja significativa de los dominios de Kunitz del inhibidor de serinproteasas bikunina y sus fragmentos y análogos de la presente invención es que son proteínas humanas, y también tienen menos carga positiva que Trasylol® (ejemplo 1), reduciendo con ello el riesgo de lesiones renales tras la administración de grandes dosis de las proteínas. Como es de origen humano, la proteína de la presente invención puede administrarse, por tanto, a pacientes humanos con un riesgo significativamente reducido de reacciones inmunológicas no deseadas, comparado con la administración de dosis similares de Trasylol®. Además, se ha descubierto que la bikunina (102-159), la bikunina (7-64) y la bikunina (1-170) son inhibidores significativamente más potentes de la calicreína plasmática que Trasylol® in vitro (ejemplo 3, 4 y 10). Por tanto, se espera que la bikunina y sus fragmentos sean más eficaces in vivo con relación a la aprotinina.

La cantidad de composición farmacéutica empleada dependerá del receptor y del trastorno que se va a tratar. La cantidad precisa puede calcularse sin experimentos indebidos mediante protocolos conocidos por los expertos en la técnica. Como alternativa, la cantidad precisa puede calcularse basándose en la determinación de la cantidad de proteasa diana, como plasmina, calicreína o prostasina, que debe inhibirse para tratar el trastorno. Como se considera que los materiales activos contemplados en esta invención no son tóxicos, el tratamiento implica preferiblemente la administración de un exceso de la cantidad óptimamente requerida del agente activo.

Para estimular las velocidades de eliminación mucociliar en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, las proteínas de la presente invención pueden utilizarse como la aprotinina Trasylol®, tomando en cuenta las diferencias en la potencia. El uso de Trasylol® se indica en Physicians Desk Reference, 1995, que lista el suplemento A de Trasyolo®. Brevemente, con el paciente en posición supina, la dosis de carga de bikunina placentaria, el dominio aislado u otro variante se administra mediante infusión lentamente durante aproximadamente 20 a 30 minutos. En general, se utilizará una dosis total desde aproximadamente 2x10^{6} KIU (unidades inhibidoras de calicreína) y 8x10^{6} KIU, dependiendo de factores como el peso y trastorno del paciente. Las dosis de carga preferidas son las que contienen un total de 1 a 2 millones de unidades inhibidoras de calicreína (KIU).

Las proteínas de la presente invención se emplean en composiciones farmacéuticas formuladas de la manera conocida en la técnica. Estas composiciones contienen un(os) ingrediente(s) activo(s) más uno o más vehículos, diluyentes, cargas, ligantes y otros excipientes farmacéuticamente aceptables, dependiendo de la vía de administración y la forma de dosificación contemplada. Los ejemplos de vehículos orgánicos e inorgánicos terapeúticamente inertes conocidos por los expertos en la técnica incluyen, pero no se limitan a lactosa, almidón de maíz o sus derivados, talco, aceites vegetales, ceras, grasas, polioles como polietilenglicol, agua, sacarosa, alcoholes, glicerina y similares. También pueden añadirse diversos conservantes, emulsionantes, dispersantes, aromatizantes, agentes humectantes, antioxidantes, edulcorantes, colorantes, estabilizantes, sales, tampones y similares, según se requiera para ayudar a la estabilización de la formulación, o para ayudar a aumentar la biodisponibilidad del(los) ingrediente(s) activo(s), o para producir una formulación de aroma u olor aceptable en el caso de una dosificación oral, nasal o pulmonar. El inhibidor empleado en estas composiciones puede estar en forma del compuesto original en sí mismo u, opcionalmente, en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Las composiciones formuladas de esta manera se seleccionan según sea necesario para la administración del inhibidor mediante cualquier vía adecuada conocida por los expertos en la técnica.

Las vías de administración parenteral incluyen la vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal e intramuscular. La administración intravenosa puede utilizarse para obtener la regulación aguda de las concentraciones pico plasmáticas del fármaco, según sea necesario. Como alternativa, el fármaco puede administrarse a una velocidad deseada de forma constante mediante catéter intravenoso. Los vehículos adecuados incluyen diluyentes acuosos estériles sin pirógenos, como agua estéril para inyección, disoluciones tamponadas estériles o disolución salina estéril. La composición resultante se administra al paciente antes y/o durante la cirugía mediante infusión o inyección intravenosa.

Una mejora en la semivida y el transporte del fármaco a los fagosomas, como neutrófilos y macrófagos, implicados en la inflamación puede facilitarse encerrando el fármaco en liposomas. Debe ser posible mejorar la selectividad del transporte dirigido de los liposomas incorporando en su parte exterior ligandos que se unen a macromoléculas específicas de órganos/tejidos diana, como el tracto gastrointestinal y los pulmones. Como alternativa, puede utilizarse una inyección con depósito intramuscular o subcutánea con o sin encapsulación del fármaco en microsferas degradables (por ejemplo, que comprenden poli-DL-lactida-co-glicólido) o formulaciones protectoras que contienen colágeno, para obtener una liberación del fármaco prolongada y sostenida. Para una mayor conveniencia de la forma de dosificación es posible utilizar un depósito y septo implantados por vía intraperitoneal, como el sistema percuseal. También puede lograrse una mayor conveniencia y cumplimiento por parte del paciente utilizando estilográficas inyectoras (por ejemplo Novo-Pin o Q-pen) o inyectores de chorro sin aguja (por ejemplo, de Bioject, Mediject o Becton Dickinson). También puede lograrse una liberación controlada con precisión utilizando bombas implantables con administración al sitio deseado mediante una cánula. Los ejemplos incluyen las bombas osmóticas implantadas por vía subcutánea disponibles en ALZA, como la bomba osmótica ALZET.

La administración oral puede lograrse incorporando el fármaco en comprimidos, comprimidos revestidos, grageas, cápsulas de gelatina dura y blanda, disoluciones, emulsiones, suspensiones o cápsulas con revestimiento entérico diseñadas para liberar el fármaco en el colon en el que la actividad de proteasas digestivas es baja. Los ejemplos de esto último incluyen el sistema OROS-CT/Osmet^{TM} de ALZA, y el sistema PULSINCAP^{TM} de Scherer Drug Delivery Systems. Otros sistemas utilizan polímeros azoentrecruzados que son degradados por azorreductasas bacterianas específicas del colon, o polímeros de poliacrilato sensibles al pH que se activan por un aumento en el pH en el colon. Los sistemas anteriores pueden utilizarse junto con una amplia gama de potenciadores de la absorción disponibles. La administración rectal puede lograrse incorporando el fármaco en supositorios.

La administración nasal puede lograrse incorporando el fármaco en vehículos en partículas bioadhesivos (<200 mm), como los que comprenden celulosa, poliacrilato o policarbófilo, junto con potenciadores de la absorción adecuados, como fosfolípidos o acilcarnitinas. Los sistemas disponibles en el mercado incluyen los desarrollados por Dan Biosys y Scios Nova.

Para estimular la velocidad de eliminación mucociliar, el modo preferido de administración de los variantes de bikunina placentaria de la presente invención es la administración pulmonar. Los inhibidores de serinproteasas de tipo Kunitz descritos en la presente pueden administrarse a los pulmones de un sujeto mediante cualquier medio adecuado, pero se administran preferiblemente mediante una suspensión en aerosol de partículas respirables formadas por el compuesto activo, que el sujeto inhala. Las partículas respirables pueden ser líquidas o sólidas. Polvos secos de tamaño de micras que contienen el medicamento en un vehículo adecuado como manitol, sacarosa o lactosa pueden administrarse a las superficies de los conductos respiratorios pulmonares utilizando inhaladores de polvo seco como los de Inhale^{TM}, Dura^{TM}, Fisons (Spinhaler^{TM}) y Glaxo (Rotahaler^{TM}), o los inhaladores de dosis medida basados en propelentes de Astra (Turbohaler^{TM}). Las formulaciones en disolución con o sin liposomas pueden administrarse utilizando nebulizadores.

Los aerosoles de partículas líquidas que comprenden las proteínas pueden producirse mediante cualquier medio adecuado, como con un nebulizador de aerosol accionado por presión o en un nebulizador ultrasónico. Véase, por ejemplo, la patente de EEUU nº 4.501.729. Los nebulizadores son dispositivos disponibles en el mercado que transforman disoluciones o suspensiones del ingrediente activo en una niebla de aerosol terapéutica mediante la aceleración de gas comprimido, de forma típica aire u oxígeno, a través de un orificio de Venturi estrecho, o mediante agitación ultrasónica. Las formulaciones adecuadas para utilizar en nebulizadores consisten en el ingrediente activo en un vehículo líquido. El vehículo es, de forma típica, agua (y más preferiblemente agua estéril exenta de pirógenos) o una disolución alcohólica acuosa diluida, que preferiblemente se hace isotónica con los fluidos corporales mediante la adición, por ejemplo, de cloruro de sodio. Otros aditivos opcionales incluyen conservantes si la formulación no se esteriliza, por ejemplo, hidroxibenzoato de metilo, antioxidantes, agentes aromatizantes, aceites volátiles, agentes tamponantes y tensioactivos.

Los aerosoles de partículas sólidas que comprenden la proteína pueden producirse, de forma similar, con cualquier generador de aerosoles de medicamentos en partículas sólidas. Los generadores de aerosoles para administrar medicamentos en partículas sólidas a un sujeto producen partículas que son respirables, como se ha explicado anteriormente, y generan un volumen de aerosol que contiene una dosis medida predeterminada de un medicamento, con una proporción adecuada para la administración humana. Un tipo ilustrativo de generador de aerosoles de partículas sólidas es un insuflador. Las formulaciones adecuadas para la administracion mediante insuflación incluyen polvos finamente divididos que pueden administrarse por medio de un insuflador, o introducidos en la cavidad nasal como si fuera rapé. En el insuflador, el polvo (por ejemplo, una dosis medida del mismo eficaz para realizar los tratamientos descritos en la presente) está contenida en cápsulas o cartuchos fabricados, de forma típica, de gelatina o plástico, que se perforan o abren in situ y el polvo se administra mediante el aire que atraviesa el dispositivo tras una inhalación, o mediante una bomba manipulada de forma manual. El polvo empleado en el insuflador consiste sólo en la proteína, o es una mezcla en polvo que comprende la proteína, un diluyente en polvo adecuado, como lactosa, y un tensioactivo opcional. Un segundo tipo de generador de aerosoles ilustrativo comprende un inhalador de dosis medida. Los inhaladores de dosis medidas son dispensadores en aerosol presurizados que, de forma típica, contienen una formulación en suspensión o disolución del ingrediente activo en un propelente licuado. Durante el uso, estos dispositivos descargan la formulación a través de una válvula adaptada para administrar un volumen medido, de forma típica desde 10 a 200 ul, para producir un pulverizado de partículas finas que contiene la proteína. Los propelentes adecuados incluyen ciertos compuestos clorofluorocarbonados, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano y sus mezclas. La formulación puede contener, además, uno o más codisolventes, por ejemplo, etanol, tensioactivos, como ácido oleico o trioleato de sorbitán, antioxidantes y agentes aromatizantes adecuados.

Para dispositivos inhaladores de dosis medida o de polvo seco, el aerosol, tanto si está formado por partículas sólidas o líquidas, puede ser producidos por el generador de aerosoles con una velocidad de aproximadamente 5 a 150 litros por minutos, más preferiblemente desde aproximadamente 10 a 100 litros por minutos, y lo más preferible para inhaladores de dosis medida desde aproximadamente 10 a 50 litros por minuto, y lo más preferible para inhaladores de polvo seco aproximadamente 60 litros por minuto. Los aeroles generados mediante nebulizadores, chorro o ultrasonido pueden ser producidos por el generador de aerosoles con una velocidad desde aproximadamente 1 a 100 litros por minuto, más preferiblemente desde aproximadamente 4 a 10 litros por minuto. Los aerosoles que contienen cantidades mayores de proteína pueden administrarse con más rapidez.

La dosificación del inhibidor de proteasas variará dependiendo del trastorno que se va a tratar y del estado del sujeto. La dosis diaria puede dividirse en una o varias administraciones de dosis unitarias. La dosis diaria en peso puede variar desde aproximadamente 0,01 a 20 miligramos de partículas respirables para un sujeto humano, dependiendo de la edad y trastorno del sujeto.

Las formulaciones farmacéuticas en partículas sólidas o líquidas que contienen los inhibidores de proteasas de la presente invención deben incluir partículas de tamaño respirable: es decir, partículas de un tamaño lo suficientemente pequeño para pasar a través de la boca y la laringe después de la inhalación, y hacia los bronquios y alvéolos de los pulmones. En general, las partículas que varían desde aproximadamente 1 a 8 micras de tamaño (más en concreto, menos de aproximadamente 6 micras de tamaño) son respirables. Las partículas de tamaño no respirable que se incluyen en el aerosol tienden a depositarse en la garganta y se tragan, y la cantidad de partículas no respirables en el aerosol preferiblemente se minimiza. Para la administración nasal, se prefiere un tamaño de partícula en el intervalo de 10-500 micras para asegurar la retención en la cavidad nasal.

En la fabricación de una formulación según la invención, el inhibidor de proteasas, de forma típica, se mezcla, entre otros, con un vehículo aceptable. El vehículo, por supuesto, debe ser aceptable en el sentido de ser compatible con cualquier otro ingrediente en la formulación y no debe ser perjudicial para el paciente. El vehículo puede ser un sólido o un líquido, o ambos, y preferiblemente se formula con el compuesto como una formulación de dosis unitaria, por ejemplo, una cápsula, que puede contener desde 0,5% a 99% en peso del compuesto activo. Uno o más compuestos activos pueden incorporarse en las formulaciones de la invención, y dichas formulaciones pueden prepararse mediante cualquiera de las técnicas muy conocidas de farmacia, que consisten esencialmente en mezclar los componentes.

Las composiciones que contienen partículas secas respirables del inhibidor de proteasas pueden prepararse triturando el inhibidor con un mortero y una mano de mortero, y después haciendo pasar la composición micronizada a través de un tamiz de malla 400 para romper o separar los aglomerados grandes.

La composición farmacéutica puede contener opcionalmente un dispersante que actúa para facilitar la formación de un aerosol. Un dispersante adecuado es la lactosa, que puede mezclarse con el agente activo en cualquier proporción adecuada (por ejemplo, una proporción de 1 a 1 en peso).

Pueden emplearse estrategias de terapia génica ex vivo e in vivo generales para dirigir los constructos de ácidos nucleicos que codifican las proteínas inhibidoras de serinproteasas de tipo Kunitz, como bikunina, aprotinina o sus fragmentos y variantes, como las descritas en el documento WO 97/33996 (Bayer Corp.) y la patente de EEUU nº 5.407.915 (Bayer AG). Las técnicas de terapia génica que principalmente se basan en virus se han utilizado para transformar células pulmonares, como un medio para tratar las manifestaciones de FQ en el pulmón y los tejidos extrapulmonares asociados. Véase el documento WO 93/03709, publicado el 3 de marzo, 1993, que describe el uso de vectores retrovíricos y no retrovíricos (por ejemplo, adenovirus y virus adenoasociados) para la expresión estable del gen CFTR en paciente con FQ. Como alternativa, también se conocen métodos no víricos para dirigir ácidos nucleicos exógenos. Véase el documento WO 93/12240, publicado el 24 de junio, 1993, y las referencias citadas en él, que describe módulos de transcripción o expresión que incluyen la secuencia codificadora de una molécula CFTR unida operablemente a secuencias reguladoras funcionales en mamíferos. Los constructos de ácido nucleico se suministran entonces a los conductos respiratorios y los alvéolos del pulmón mediante una serie de formas, incluyendo la administración en aerosol por sí sola o junto con complejos basados en lípidos, por ejemplo Lipofectin^{TM}. El documento WO 95/26356, publicado el 5 de octubre, 1995, describe ejemplos representativos de lípidos útiles para la transfección.

Búsqueda de datos de secuencias humanas

La existencia de una proteína humana diferenciada homóloga en su función con la aprotinina se dedujo después de un análisis exclusivo de las entradas de secuencias en la base de datos de secuencia expresada marcada (denominada en lo sucesivo dbEST) en el NCBI (National Center for Biological Information, Maryland). Utilizando el algoritmo TBlastN (BLAST, o Basic Local Alignment Search Tool, que utiliza el método de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215, 00 403-410, para buscar similitudes entre una secuencia problema y todas las secuencias en una base de datos, proteínas o ácidos nucleicos en cualquier combinación), se estudió la base de datos para detectar secuencias de nucleótidos que presentan homología con la secuencia de la pre-pro-aprotinina bovina, Trasylol®. Esta búsqueda de numerosos clones se redujo, de forma selectiva, a dos clones concretos que probablemente codificaban una secuencia de aminoácidos deducida que se corresponde con una proteína humana homóloga en función con la aprotinina. Las secuencias de ácidos nucleicos elegidas son R35464 (SEQ ID NO:12) y R74593 (SEQ ID NO:14), que se generaron a partir de un banco de ácidos nucleicos placentarios humanos. En la secuencia de la proteína traducida, en el marco de lectura abierto más largo de R35464 (SEQ ID NO:13), faltaba una de las 6 cisteínas que son críticas para la formación de la estructura covalente del dominio de Kunitz, lo que significa que la secuencia del ácido nucleico de R35464 no produce un inhibidor funcional. De forma similar, el marco de lectura abierto más largo del clon R74593 (SEQ ID NO:15) contiene un codón de terminación 5' con respecto a la región que codifica la secuencia de tipo Kunitz, lo que significa que esta secuencia no puede traducirse para producir un dominio de Kunitz segregado funcional. El significado de estas secuencias por sí solas no está claro. Es posible que representen a) los productos de pseudogenes, b) regiones de mRNA sin traducir, o c) los productos de mRNA viable que se han secuenciado de forma incorrecta.

Descubrimiento de la bikunina humana

Para aislar y determinar de forma específica la secuencia humana real, se diseñaron cebadores de cDNA que son capaces de hibridarse con secuencias colocadas 5' y 3' con respecto al segmento de cDNA que codifica las secuencias de tipo Kunitz propuestas por los inventores que se encuentran dentro de R35464 y R74593. Los cebadores utilizados para amplificar un fragmento que codifica la secuencia de tipo Kunitz de R74593 son:

CGAAGCTTCATCTCCGAAGCTCCAGACG	(el cebador 3' con un sitio HindIII;	SEQ ID NO:33), y
AGGATCTAGACAATAATTACCTGACCAAGGA	(el cebador 5' con un sitio XbaI;	SEQ ID NO:34).

Estos cebadores se utilizaron para amplificar mediante PCR (30 ciclos) un producto de 500 pares de bases a partir de un banco de cDNA placentario humano de Clontech (MATCHMAKER, nº de catálogo HL4003AB, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA), que se subclonó en Bluescript-SK+ y se secuenció con el cebador T3 con un kit Sequenase^{TM} versión 2.0. De forma sorprendente, la secuencia del fragmento obtenida utilizando los cebadores de los inventores es diferente de la secuencia listada en la base de datos dbEST para el clon R74593. En concreto, la nueva secuencia de los inventores contenía otra base guanosina insertada 3' con respecto al codón de terminación putativo, pero 5' con respecto al segmento que codifica la secuencia de tipo Kunitz (figura 3). La inserción de otra G desplaza el codón de terminación fuera del marco de lectura para el dominio de tipo Kunitz (G en el par de bases 114 de la secuencia corregida de R74593; figura 3).

Posteriores indagaciones en el dbEST para detectar secuencias homólogas con la secuencia peptídica de tipo Kunitz de R74593 produjeron H94519, derivado de un banco de retina humana, y N39798. Estas secuencias contienen una secuencia de tipo Kunitz que es casi idéntica al dominio de tipo Kunitz codificado en R35464, excepto que contiene todas las seis cisteínas características. Se utilizó la superposición de cada una de las secuencias de nucleótidos con la de R74593 (corregida por la inserción de G en pb 114) y R35464 para obtener una secuencia de nucleótidos consenso para una bikunina placentaria humana parcial (SEQ ID NO:9; figura 3). La secuencia consenso traducida produce un marco de lectura abierto que se extiende desde el resto -18 a +179 (figura 3; traducción completa de SEQ ID NO:10) que contiene dos secuencias de dominio de tipo Kunitz completas, dentro de la región de los restos aminoácidos 17-64 y 102-159, respectivamente.

Posteriormente se intentaron obtener otras secuencias 5' indagando en el dbEST con la secuencia R35464. Los posibles apareamientos de esta búsqueda, que poseen otra secuencia 5', se utilizaron, a su vez, para reindagar en el dbEST. De esta manera iterativa se identificaron una serie de secuencias 5' solapantes, que incluían los clones H16866, T66058, R34808, R87894, N40851 y N39876 (figura 4). El alineamiento de algunas de estas secuencias sugiere la presencia de un ATG 5' que puede actuar como un sitio de inicio para la síntesis de la secuencia de proteína traducida consenso. A partir de esta información seleccionada, ahora es posible la búsqueda selectiva y la determinación de secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos de una proteína humana con una función homóloga a la de la aprotinina.

La reinvestigación del dbEST reveló un número de nuevas entradas EST que se muestran de forma esquemática en la figura 4B. El solapamiento con estas otras EST permite la construcción de una secuencia de oligonucleótido consenso mucho más larga (figura 4C), que se extiende 5' y 3' más allá de la secuencia de oligonucleótido original representada en la figura 3. De hecho, la nueva secuencia, con una longitud total de 1,6 kilobases, se extiende hasta la cola de poli-A 3'. El mayor número de EST solapantes en cada posición de pares de bases a lo largo de la secuencia mejora el nivel de confianza en ciertas regiones, como la secuencia que se solapa con el extremo 3' de EST R74593 (figura 3). Varios EST solapantes en esta región corroboran dos deleciones de bases críticas con relación a R74593 (que aparecen en negrita subrayadas en la figura 4C, posiciones del mapa 994 y 1005). La traducción de la nueva secuencia consenso (figura 4D) en el marco que codifica la bikunina produce una forma de bikunina placentaria que es mayor (248 aminoácidos) que la secuencia madura (179 aminoácidos) codificada a partir del consenso original (SEQ ID NO:1), y se termina con un codón de terminación dentro del marco dentro del oligonucleótido consenso. El aumento del tamaño es debido a un desplazamiento en el marco en la región codificadora 3' que aparece como resultado de la eliminación de dos inserciones de bases exclusivas de EST R74593. El desplazamiento del marco mueve el codón de terminación del consenso original (figura 3) fuera del marco, permitiendo la lectura de un nuevo marco que codifica la secuencia de aminoácidos adicional. El nuevo producto de la traducción (figura 4D) es idéntico a la secuencia consenso de la proteína original (SEQ ID NO:1) entre los restos +1 a +175 (que codifica los dominios de Kunitz), pero que contiene una nueva extensión C-terminal que muestra un dominio transmembrana largo de 24 restos putativo (subrayado en la figura 4D), seguido de un dominio citoplásmico corto de 31 restos. La secuencia concreta alrededor del iniciador metionina y el péptido señal es, de alguna manera, provisional, debido a la considerable heterogeneidad entre los EST solapantes en esta región.

El análisis de la secuencia de la proteína mediante Geneworks^{TM} resalta los restos asparagina en las posiciones 30 y 67 como sitios consenso para la glicosilación N-unida putativa. La asparagina 30 no se observó durante la secuenciación N-terminal de la proteína de longitud completa aislada a partir de placenta humana, que resulta coherente con que está glicosilada.

Clonación de bikunina humana

La existencia de un mRNA humano correspondiente a la secuencia de nucleótidos de bikunina humana putativa inferida a partir del análisis de la figura 3 se confirmó como sigue. El cebador de ácido nucleico que se hibrida 5' con la secuencia de cDNA que codifica los dominios de Kunitz de R35464 (p.b. 3-27 de la secuencia de nucleótidos consenso en la figura 3):

GGTCTAGAGGCCGGGTCGTTTCTCGCCTGGCTGGGA (un cebador 5' derivado de la secuencia R35464 con un sitio XbaI; SEQ ID NO:35), y el cebador de ácido nucleico que se hibrida 3' con la secuencia que codifica los dominios de Kunitz de R74593 (p.b. 680-700 de la secuencia de nucleótidos consenso en la figura 3), se utilizaron para amplificar mediante PCR, a partir de un banco placentario humano de Clontech, un fragmento del tamaño esperado (aproximadamente 670 p.b.) de una secuencia de nucleótidos consenso de cDNA que codifica la secuencia de la bikunina placentaria de la figura 3 (mostrada de forma esquemática en la figura 4A).

Utilizando un cebador 5' que se hibrida con una secuencia en R87894 que está 126 p.b. 5' con respecto al sitio de inicio ATG putativo analizado anteriormente (que se muestra de forma esquemática en la figura 4A en p.b. 110), más el mismo cebador 3' de R74593 que se utilizó anteriormente, es posible amplificar un fragmento procedente de un banco placentario humano de Clontech con el tamaño esperado (aproximadamente 872 p.b.) predicho mediante el solapamiento de EST (que se muestra de forma esquemática en la figura 4).

La secuenciación del fragmento de 872 p.b. demostró que contenía un segmento de nucleótidos que se corresponde con p.b 110 a 218 de EST R87894 en su extremo 5', y con p.b. 310 a 542 de la secuencia consenso para la bikunina placentaria inferida a partir del análisis del solapamiento de EST (de la figura 3) en su extremo 3'. Esta secuencia de nucleótidos 3' contiene todos los dominios de tipo Kunitz codificados por la bikunina placentaria (102-159).

Para obtener un cDNA que codifica la región extracelular completa de la proteína, se utilizó el siguiente cebador de PCR 5':

CACCTGATCGCGAGACCCC (SEQ ID NO:36), diseñado para hibridarse con una secuencia dentro de EST R34808, con el mismo cebador 3' de EST R74595, para amplificar (30 ciclos) un producto de cDNA de aproximadamente 780 pares de bases procedente del banco de cDNA placentario. Este producto se purificó en gel y se clonó en el vector TA (Invitrogen) para la secuenciación del DNA mediante el método didesoxi (Sanger F. et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, pp. 5463-5467) con los siguientes cebadores:

Específico del vector:

GATTTAGGTGACACTATAG (SP6)

(SEQ ID NO:37)

TAATACGACTCACTATAGGG (T7)

(SEQ ID NO:38)

\vskip1.000000\baselineskip

Específico del gen:

TTACCTGACCAAGGAGGAGTGC

(SEQ ID NO:39)

AATCCGCTGCATTCCTGCTGGTG

(SEQ ID NO:40)

CAGTCACTGGGCCTTGCCGT

(SEQ ID NO:41)

La secuencia de cDNA resultante aparece en la figura 4E junto con el producto de su traducción. Al nivel de nucleótidos, la secuencia muestra sólo pequeñas diferencias de la secuencia EST consenso (figura 4D). La traducción de la secuencia produce una secuencia codificadora que contiene un sitio ATG iniciador dentro del marco, un péptido señal y una secuencia de bikunina placentaria madura y un dominio transmembrana. A la secuencia traducida del producto de PCR le faltaban los últimos 12 restos aminoácidos del dominio citoplásmico, como consecuencia de elegir el cebador 3' para la amplificación PCR. Esta elección del cebador de PCR 3' (diseñado basándose en la secuencia de R74593) también es responsable de la introducción de una mutación de S a F artefactual en la posición del aminoácido 211 de la secuencia derivada de PCR traducida. El péptido señal deducido de la traducción del fragmento PCR es un poco diferente al del EST consenso.

Para obtener un cDNA de bikunina placentaria de longitud completa, el producto derivado de la PCR (figura 4E) se purificó en gel y se utilizó para aislar un clon de longitud completa no basado en PCR que representa la secuencia de la bikunina. La secuencia de cDNA derivada de PCR se marcó con ^{32}P-CTP mediante High Prime (Boehringer Mannheim) y se utilizó para sondar un banco de cDNA placentario (Stratagene, banco \lambda Unizap^{TM}) utilizando técnicas de hibridación de colonias. Aproximadamente 20 x 10^{6} placas de fagos se sometieron a 3 rondas de búsqueda y purificación en placas. Se consideró que dos clones eran de longitud completa (aproximadamente 1,5 kilobases), según se determinó mediante análisis de enzimas de restricción y basándose en la comparación con el tamaño de la secuencia consenso EST (véase anteriormente). La secuenciación de uno de estos clones mediante el método didesoxi produjo la secuencia de oligonucleótido que aparece en la figura 4F. El producto de la traducción de esta secuencia produce una proteína con la metionina iniciadora dentro del marco, el péptido señal y la secuencia de bikunina placentaria madura. La secuencia de bikunina placentaria madura es idéntica a la secuencia de la proteína madura obtenida mediante traducción de la secuencia consenso EST, aunque la secuencia y longitud del péptido señal difieren. A diferencia del producto de PCR, el cDNA obtenido mediante hibridación de colonias contiene el ectodominio, el dominio transmembrana, el dominio citoplásmico y el codón de terminación dentro del marco completos. De hecho, el clon se extiende toda la longitud hasta la cola de poli-A. A la metionina iniciadora le sigue un péptido señal hidrófobo que es idéntico al péptido señal codificado en el clon derivado de PCR. Posteriormente, se expresaron y purificaron fragmentos solubles de la bikunina placentaria, la bikunina (1-170), a partir de células Sf9 (ejemplo 9) y células CHO (ejemplo 17), y se descubrió que eran inhibidores de proteasas funcionales (ejemplos 10 y 18). Además, se aisló, a partir de placenta humana, un fragmento soluble de bikunina placentaria que también era un inhibidor de proteasas activo (ejemplo 7).

Basándose en las anteriores observaciones, parece que la bikunina placentaria de longitud completa tiene la capacidad para existir como una proteína transmembrana sobre la superficie de células, así como en forma de proteína soluble. Se sabe que otras proteínas transmembrana que contienen dominios de Kunitz sufren un procesamiento proteolítico para producir mezclas de formas asociadas a membranas y solubles. Éstas incluyen dos formas de una proteína precursora de amiloides denominada APP751 (Esch F. et al., 1990, Science, 248, pp. 1122-1124) y APP770 (Wang R. et al., 1991, J. Biol. Chem., 266, pp. 16960-16964).

La activación por contacto es un proceso que se activa mediante la exposición de superficies vasculares dañadas a los componentes de la cascada de la coagulación. La angiogénesis es un proceso que implica la activación local de plasmina en las superficies endoteliales. La especificidad de la bikunina placentaria y su capacidad putativa para anclarse a superficies celulares sugiere que las funciones fisiológicas de la bikunina placentaria transmembrana pueden incluir la regulación de la activación por contacto y la angiogénesis.

Las secuencias de aminoácidos de la bikunina placentaria (7-64), la bikunina (102-159) y la bikunina placentaria de longitud completa (figura 4F) se buscaron frente a las bases de datos de proteínas PIR (versión 46.0) y PatchX (versión 46.0), así como la base de datos de proteínas GeneSeq (versión 20.0) de secuencias patentadas utilizando el programa Fast A de Genetics Computer Group. Utilizando el programa TFast A de Genetics Computer Group (Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448), y estas mismas secuencias de proteínas se buscaron frente a las traducciones de seis marcos de las bases de datos de nucleótidos GenBank (versión 92.0 con actualizaciones hasta 26/1/96) y EMBL (versión modificada 45.0), así como la base de datos de nucleótidos GeneSeq (versión 20.0) de secuencias patentadas. Las subseries EST y STS de GenBank y EMBL no se incluyeron en esta serie de búsquedas. Los mejores emparejamientos resultantes de estas búsquedas contenían secuencias que sólo eran 50% idénticas en su longitud completa a la secuencia de proteína de 58 aminoácidos derivada del análisis de los inventores de los clones R74593 y R35464.

Aislamiento de la bikunina humana

Tal como se mencionó anteriormente, los péptidos sintéticos que se correponden con la bikunina (7-64) y la bikunina (102-159), según se determinan a partir de la secuencia consenso traducida para la bikunina (figura 3), pudieron ser replegados (ejemplos 2 y 1, respectivamente) para producir la proteína inhibidora calicreína activa (ejemplo 4 y 3, respectivamente). Los inventores han aprovechado esta propiedad inesperada para diseñar un esquema de purificación para aislar la bikunina placentaria nativa a partir de tejido humano.

Utilizando un esquema de purificación que emplea la cromatografía de afinidad de sefarosa-calicreína como primera etapa, se aisló un potente inhibidor de calicreína nativo muy purificado. La bikunina humana nativa aislada tiene un N-terminal idéntico (secuenciado para 50 restos aminoácidos) que la secuencia predicha mediante la traducción de la secuencia de ácido nucleico consenso (figura 3), restos aminoácidos +1 a +50 (ejemplo 7). Esto confirma, por primera vez, la existencia de un nuevo inhibidor de calicreína nativo aislado a partir de placenta humana.

Los dominios de tipo Kunitz conocidos se listan a continuación. Los restos que se cree que se ponen en contacto con las proteasas diana se indican como de especial interés (negrita/subrayado). Estos restos concretos se denominan posiciones Xaa^{1-16} para la referencia específica, según se muestra mediante el marcador Xaa.

\vskip1.000000\baselineskip

Bikunina (7-64) (SEQ ID NO:4)

500

\vskip1.000000\baselineskip

Bikunina (102-159) (SEQ ID NO:6)

501

\vskip1.000000\baselineskip

Precursor 1 del inhibidor de la vía del factor tisular (SEQ ID NO:18)

502

\vskip1.000000\baselineskip

Precursor 1 del inhibidor de la vía del factor tisular (SEQ ID NO:19)

503

\vskip1.000000\baselineskip

Precursor del inhibidor de la vía del factor tisular (SEQ ID NO:20)

504

\vskip1.000000\baselineskip

Precursor 2 del inhibidor de la vía del factor tisular (SEQ ID NO:21)

505

\vskip1.000000\baselineskip

Precursor 2 del inhibidor de la vía del factor tisular (SEQ ID NO:22)

506

\newpage

Homólogo de la proteína precursora de amiloides (SEQ ID NO:23)

507

\vskip1.000000\baselineskip

Aprotinina (SEQ ID NO:24)

508

\vskip1.000000\baselineskip

Precursor del inhibidor de inter-\alpha-tripsina (SEQ ID NO:25)

509

\vskip1.000000\baselineskip

Precursor del inhibidor de inter-\alpha-tripsina (SEQ ID NO:26)

510

\vskip1.000000\baselineskip

Proteína precursora de amiloides (SEQ ID NO:27)

511

\vskip1.000000\baselineskip

Precursor del colágeno \alpha3(VI) (SEQ ID NO:28)

512

\vskip1.000000\baselineskip

HKI-B9 (SEQ ID NO:29)

513

La bikunina placentaria, los dominios aislados u otros variantes de la presente invención pueden producirse mediante síntesis peptídica en fase sólida convencional, utilizando la química de t-Boc según describen Merrifield R.B. y Barany G., en: The peptides, Analysis, Synthesis, Biology, 2, Gross E. et al., eds., Academic Press, 1980, capítulo 1; o utilizando la química de F-moc, según describen Carpino L.A. y Han G.Y., 1970, J. Amer. Chem. Soc., 92, 5748-5749, y se ilustra en el ejemplo 2. Como alternativa, la expresión de un DNA que codifica el variante de bikunina placentaria puede utilizarse para producir variantes de bikunina placentaria recombinantes.

La presente invención proporciona el uso de un inhibidor de serinproteasas humanas purificado que puede inhibir, de forma específica, la calicreína, que se ha aislado a partir de tejido placentario humano mediante cromatografía de afinidad. El inhibidor de serinproteínas humanas, denominado en la presente bikunina placentaria humana, contiene dos dominios de inhibidor de serinproteasas de la clase Kunitz. En una realización concreta, la presente invención proporciona el uso de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos:

1

(SEQ ID NO:1), en la fabricación de un medicamento para acelerar la velocidad de EMC.

\vskip1.000000\baselineskip

En una realización preferida, la presente invención proporciona el uso de una proteína bikunina (bikunina (1-170)) que tiene la secuencia de aminoácidos:

2

(SEQ ID NO:52), en la fabricación de un medicamento para acelerar la velocidad de EMC.

\vskip1.000000\baselineskip

En un aspecto, la actividad biológica de la proteína útil en la práctica de la presente invención es que puede unirse a la tripsina, las calicreínas plasmáticas y tisulares humanas, la plasmina humana y el factor XIIa e inhibir sustancialmente su actividad biológica. En una realización preferida, la presente invención proporciona la proteína bikunina placentaria humana nativa en forma glicosilada. En otra realización, la presente invención incluye la proteína bikunina humana nativa que se ha formado de forma que contiene al menos un enlace disulfuro cisteína-cisteína. En una realización preferida, la proteína contiene al menos un enlace disulfuro cisteína-cisteína dentro de la cadena formado entre un par de cisteínas seleccionadas del grupo que consiste en CYS11-CYS61, CYS20-CYS44, CYS36-CYS57, CYS106-CYS156, CYS115-CYS139 y CYS131-CYS152, en las que las cisteínas se numeran según la secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa. Un experto en la técnica reconocerá que la proteína de la presente invención puede plegarse en la conformación tridimensional apropiada, de forma que se mantiene la actividad biológica de la bikunina humana nativa, en la que ninguno, uno o más, o todos los enlaces disulfuro cisteína-cisteína dentro de la cadena están presentes. En una realización más preferida, la proteína de la presente invención se pliega de forma apropiada y se forma con todos los enlaces disulfuro cisteína-cisteína nativos apropiados.

La proteína activa para utilizar en la presente invención puede obtenerse mediante purificación a partir de un tejido humano, como placenta, o mediante técnicas de química de proteínas sintéticas, según se ilustra en los ejemplos a continuación. También se entiende que la proteína que se va a utilizar en la presente invención puede obtenerse utilizando técnicas de biología molecular, en las que vectores autorreplicables son capaces de expresar la proteína de la presente invención a partir de células transformadas. Esta proteína puede fabricarse como forma no segregada, o segregada a partir de células transformadas. Para facilitar la secreción a partir de las células transformadas, para mejorar la estabilidad funcional de la proteína traducida, o para ayudar al plegamiento de la proteína bikunina, pueden añadirse ciertas secuencias de péptido señal a la porción NH2-terminal de la proteína bikunina humana nativa.

En una realización, el uso de la presente invención, por tanto, proporciona el uso de la proteína bikunina humana nativa con al menos una porción de la secuencia del péptido señal nativa intacta. Por tanto, una realización del uso de la invención proporciona el uso de la bikunina humana nativa con al menos parte del péptido señal, que tiene la secuencia de aminoácidos:

3

(SEQ ID NO:2).

En una realización preferida, el uso de la presente invención proporciona el uso de una proteína bikunina placentaria humana nativa con parte de la secuencia conductora intacta, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52 con un segmento conductor intacto que tiene la secuencia de aminoácidos:

4

(SEQ ID NO:53).

En otra realización, el uso de la presente invención proporciona el uso de una proteína bikunina con parte de la secuencia conductora intacta, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52 con el segmento conductor intacto que tiene la secuencia de aminoácidos:

5

(SEQ ID NO:54).

En un sistema de numeración preferido utilizado en la presente, el aminoácido numerado +1 se asigna al NH2-terminal de la secuencia de aminoácidos para la bikunina placentaria humana nativa. Se reconoce con facilidad que pueden derivarse fragmentos de proteína funcionales a partir de la bikunina placentaria humana nativa, que mantienen al menos parte de la actividad biológica de la bikunina placentaria humana nativa, y actúan como inhibidores de serinproteasas.

En una realización, la proteína para utilizar en el uso de la presente invención comprende un fragmento de la bikunina placentaria humana nativa, que contiene al menos un dominio de tipo Kunitz funcional, que tiene la secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa de los aminoácidos 7-159, en lo sucesivo denominada "bikunina (7-159)". Por tanto, el uso de la presente invención incluye un uso de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos:

6

(SEQ ID NO:3), en la que la numeración de los aminoácidos se corresponde con la de la secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa. Otro variante funcional de esta realización puede ser el fragmento de bikunina placentaria humana nativa, que contiene al menos un dominio de tipo Kunitz funcional, que tiene la secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa de los aminoácidos 11-156, la bikunina (11-156):

7

8

(SEQ ID NO:50).

Puede reconocerse que los dominios de tipo Kunitz individuales también son fragmentos de la bikunina placentaria nativa. En concreto, el uso de la presente invención contempla el uso de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de un primer dominio de tipo Kunitz que consiste en la secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa de los aminoácidos 7-64, en lo sucesivo denominada "bikunina (7-64)". Por tanto, en una realización, el uso de la presente invención incluye el uso de una proteína que contiene al menos un dominio de tipo Kunitz que tiene la secuencia de aminoácidos:

9

(SEQ ID NO:4), en la que la numeración de los aminoácidos se corresponde con la de la secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa. Otra forma de la proteína utilizada en la presente invención puede ser un primer dominio de tipo Kunitz que consiste en la secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa de los aminoácidos 11-61, la "bikunina (11-61)", que tiene la secuencia de aminoácidos:

10

(SEQ ID NO:5).

El uso de la presente invención también proporciona el uso de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de tipo Kunitz que consiste en la secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa de los aminoácidos 102-159, en lo sucesivo denominada "bikunina (102-159)". Por tanto, una realización del uso de la presente invención incluye el uso de una proteína que contiene al menos un dominio de tipo Kunitz que tiene la secuencia de aminoácidos:

11

(SEQ ID NO:6), en la que la numeración de los aminoácidos se corresponde con la de la secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa. Otra forma de este dominio puede ser un dominio de tipo Kunitz que consiste en la secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa de los aminoácidos 106-156, la "bikunina (106-156)", que tiene la secuencia de aminoácidos:

12

(SEQ ID NO:7).

Por tanto, un experto en la técnica reconocerá que pueden fabricarse fragmentos de la proteína bikunina humana nativa que mantengan al menos parte de la actividad biológica de la proteína nativa. Estos fragmentos también pueden combinarse en orientaciones diferentes o múltiples combinaciones para proporcionar proteínas alternativas que mantienen parte, la misma o más actividad biológica que la proteína bikunina humana nativa.

Se reconoce con facilidad que la proteína biológicamente activa empleada en el uso de la presente invención puede comprender uno o más de los presentes dominios de tipo Kunitz junto con otros dominios de tipo Kunitz procedentes de otras fuentes. La proteína biológicamente activa para usar en la presente invención puede comprender uno o más de los presentes dominios de tipo Kunitz junto con otros dominios de proteínas procedentes de otras fuentes con una diversidad de actividades biológicas. La actividad biológica de la proteína útil para la práctica de la presente invención puede combinarse con la de otra proteína o proteínas conocidas para proporcionar proteínas de fusión multifuncionales que tienen una actividad biológica predecible.

Un marco de lectura abierto que termina en un codón de terminación temprano todavía puede codificar una proteína funcional. El uso de la presente invención incluye esta terminación alternativa, y en una realización proporciona el uso de una proteína con la secuencia de aminoácidos:

13

(SEQ ID NO:8).

Una realización del uso de la invención proporciona el uso de la bikunina humana nativa, con una secuencia conductora intacta, y con al menos parte del dominio transmembrana (subrayado), que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

14

15

en las que EST es la secuencia consenso derivada de EST de SEQ ID NO:45, PCR es el clon de PCR de SEQ ID NO:47, y \lambdacDNA es el clon de cDNA lambda SEQ ID NO:49. En una realización preferida, una proteína para utilizar en la presente invención comprende una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:45, 47 ó 49, en las que la proteína se ha roto en la región entre el final del último dominio de Kunitz y la región transmembrana (subrayada).

La proteína también puede utilizarse cuando el péptido señal se deleciona, por ejemplo una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52 continua con una secuencia de aminoácidos transmembrana:

16

(SEQ ID NO:69)

\vskip1.000000\baselineskip

una secuencia de aminoácidos transmembrana:

17

(SEQ ID NO:68)

\vskip1.000000\baselineskip

o una secuencia de aminoácidos transmembrana:

18

(SEQ ID NO:67).

\vskip1.000000\baselineskip

La invención también incluye el uso de las siguientes proteínas:

19

(SEQ ID NO:71);

o

20

(SEQ ID NO:70).

Las secuencias de aminoácidos para utilizar en la presente invención indican claramente a un experto en la técnica las secuencias de ácidos nucleicos apropiadas que pueden utilizarse en técnicas de biología molecular para producir las proteínas para utilizar en la presente invención. La descripción describe el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una bikunina human que tiene la secuencia de DNA consenso de la figura 3 (SEQ ID NO:9), que se traduce en la secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa de la figura 3 (SEQ ID NO:10). La descripción también describe una secuencia de ácido nucleico consenso de la figura 4C (SEQ ID NO:51) que codifica una secuencia de aminoácidos de la figura 4D (SEQ ID NO:45).

También se describe el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica la bikunina placentaria humana nativa que tiene la secuencia de DNA de la figura 4F (SEQ ID NO:48) que codifica la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO:49, y una secuencia de ácido nucleico de la figura 4E (SEQ ID NO:46) que codifica la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO:47.

También se describen métodos para estimular la EMC en un paciente que sufre una disfunción mucociliar, en los que una cantidad eficaz de los inhibidores de serinproteasas humanas descritos de la presente invención en un vehículo biológicamente compatible se administran al paciente.

La presente descripción también describe un método para estimular la EMC que emplea variantes de la bikunina placentaria, y los dominios de Kunitz específicos descritos anteriormente, que contienen sustituciones de aminoácidos que alteran la especificidad de la proteasa. Los sitios preferidos de sustitución se indican a continuación como las posición Xaa^{1} a Xaa^{32} en la secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria nativa. Las sustituciones en Xaa^{1} a Xaa^{16} también son preferidas para los variantes de la bikunina (7-64), mientras que las sustituciones Xaa^{17} a Xaa^{32} son preferidas para los variantes de la bikunina (102-159).

Por tanto, la descripción describe el uso de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos:

21

(SEQ ID NO:11),

en la que Xaa^{1}-Xaa^{32} representa cada uno independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos uno de los restos aminoácidos Xaa^{1}-Xaa^{32} es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

En el presente contexto, la expresión "aminoácido que aparece en la naturaleza" pretende indicar cualquiera de los 20 aminoácidos que aparecen de forma habitual, es decir, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.

Sustituyendo uno o más aminoácidos en una o más de las posiciones indicadas anteriormente es posible cambiar el perfil de especificidad inhibidora de la bikunina placentaria nativa, o el de los dominios de tipo Kunitz individuales, la bikunina (7-64) o la bikunina (102-159), de forma que inhiba con preferencia otras serinproteasas como por ejemplo, aunque no se limitan a las enzimas de la cascada del complemento, TF/FVIIa, FXa, prostatina, trombina, elastasa de neutrófilos, catepsina G o proteinasa-3.

Los ejemplos de variantes preferidos de la bikunina placentaria incluyen aquellos en los que Xaa^{1} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en His, Glu, Pro, Ala, Val o Lys, en particular en los que Xaa^{1} es His o Pro; o en los que Xaa^{2} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Thr, Asp, Pro, Arg, Tyr, Gly, Ala, Lys, en particular en los que Xaa^{2} es Val o Thr; o en los que Xaa^{3} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Pro, Ile, Leu, Thr, en particular en los que Xaa^{3} es Arg o Pro; o en los que Xaa^{4} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys y Ser, Gln, en particular en los que Xaa^{4} es Arg o Lys; o en los que Xaa^{5} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Gly, Asp, Thr, en particular en los que Xaa^{5} es Ala; o en los que Xaa^{6} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Ile, Tyr, Asn, Leu, Val, Arg, Phe, en particular en los que Xaa^{6} es Ser o Arg; o en los que Xaa^{7} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Phe, Ile, Glu, Leu, Thr y Val, en particular en los que Xaa^{7} es Met o Ile; o en los que Xaa^{8} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Pro, Lys, Thr, Gln, Asn, Leu, Ser o Ile, en particular en los que Xaa^{8} es Pro o Ile; o en los que Xaa^{9} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys o Leu, en particular en los que Xaa^{9} es Arg; o en los que Xaa^{10} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Ile, Lys, Ala, Pro, Phe, Trp, Gln, Leu y Thr, en particular en los que Xaa^{10} es Val; o en los que Xaa^{11} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly, Ser y Thr, en particular en los que Xaa^{11} es Gly; o en los que Xaa^{12} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp, Arg, Glu, Leu, Gln, Gly, en particular en los que Xaa^{12} es Asp o Arg; o en los que Xaa^{13} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly y Ala; o en los que Xaa^{14} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asn o Lys; o en los que Xaa^{15} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly, Asp, Leu, Arg, Glu, Thr, Tyr, Val y Lys, en particular en los que Xaa^{15} es Leu o Lys; o en los que Xaa^{16} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Gln, Asp, Gly, Ile, Ala, Met y Val, en particular en los que Xaa^{16} es Val o Ala; o en los que Xaa^{17} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en His, Glu, Pro, Ala, Lys y Val, en particular en los que Xaa^{17} es Glu o Pro; o en los que Xaa^{18} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Thr, Asp, Pro, Arg, Tyr, Gly, Ala o Lys, en particular en los que Xaa^{18} es Thr; o en los que Xaa^{19} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Pro, Ile, Leu o Thr, en particular en los que Xaa^{19} es Pro; o en los que Xaa^{20} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys, Gln y Ser, en particular en los que Xaa^{20} es Arg o Lys; o en los que Xaa^{21} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Asp, Thr o Gly, en particular en los que Xaa^{21} es Ala; o en los que Xaa^{22} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Ile, Tyr, Asn, Leu, Val, Arg o Phe, en particular en los que Xaa^{22} es Ser o Arg; o en los que Xaa^{23} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Phe, Ile, Glu, Leu, Thr y Val, en particular en los que Xaa^{23} es Phe o Ile; o en los que Xaa^{24} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Pro, Lys, Thr, Asn, Leu, Gln, Ser o Ile, en particular en los que Xaa^{24} es Pro o Ile; o en los que Xaa^{25} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys o Leu, en particular en los que Xaa^{25} es Arg; o en los que Xaa^{26} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Ile, Lys, Leu, Ala, Pro, Phe, Gln, Trp y Thr, en particular en los que Xaa^{26} es Val o Ile; o en los que Xaa^{27} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly, Ser y Thr, en particular en los que Xaa^{27} es Gly; o en los que Xaa^{28} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp, Arg, Glu, Leu, Gly o Gln, en particular en los que Xaa^{28} es Arg; o en los que Xaa^{29} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly y Ala; o en los que Xaa^{30} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asn o Lys; o en los que Xaa^{31} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly, Asp, Leu, Arg, Glu, Thr, Tyr, Val y Lys, en particular en los que Xaa^{31} es Arg o Lys; o en los que Xaa^{32} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Gln, Asp, Gly, Ile, Ala, Met y Thr, en particular en los que Xaa^{32} es Gln o Ala.

También se describen constructos de DNA que codifican los variantes de la proteína bikunina placentaria de la presente invención. Estos constructos pueden prepararse mediante métodos sintéticos, como los descritos en Beaucage S.L. y Carruthers M.H., 1981, Tetrahedron Lett., 22, pp. 1859-1862; Matteucci M.D y Carruthers M.H, 1981, J. Am. Chem. Soc., 103, p. 3185; o de DNA genómico o cDNA que puede haberse obtenido seleccionando bancos genómicos o de cDNA con sondas de cDNA diseñadas para hibridarse con la secuencia de DNA que codifica la bikunina placentaria. La secuencia de DNA genómico o cDNA puede modificarse en uno o más sitios para obtener un cDNA que codifica cualquier sustitución o deleción de aminoácidos descrita en esta descripción.

También se describen vectores de expresión que contienen los constructos de DNA que codifican la bikunina placentaria, dominios aislados u otros variantes del asunto descrito, que pueden utilizarse para la producción de variantes de bikunina placentaria recombinante. El cDNA debe conectarse a una secuencia promotora adecuada que muestra actividad transcripcional en la célula hospedante elegida, y debe poseer una terminación de la transcripción y una señal de poliadenilación adecuados. El cDNA que codifica el variante de bikunina placentaria puede condensarse con un péptido señal 5' que produce la proteína codificada por el cDNA para ser segregada. El péptido señal puede ser uno reconocido por el organismo hospedante. En el caso de una célula hospedante de mamífero, el péptido señal también puede ser el péptido señal natural presente en la bikunina placentaria de longitud completa. Los procedimientos utilizados para preparar estos vectores para la expresión de los variantes de bikunina placentaria son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989).

También se describen células transformadas que contienen los constructos de DNA que codifican la bikunina placentaria, los dominios aislados u otros variantes de la presente invención que pueden utilizarse para la producción de variantes de bikunina placentaria recombinante. Existe una diversidad de combinaciones de vectores de expresión y organismos hospedantes que pueden utilizarse para la producción de los variantes de bikunina placentaria. Las células hospedantes adecuadas incluyen células de insecto Sf9 infectadas con baculovirus, células de mamífero como BHK, CHO, Hela y C-127, bacterias como E. coli, y levaduras como Saccharomyces cerevisiae. Los métodos para utilizar los sistemas de expresión de mamífero, insecto y microbianos necesarios para lograr la expresión de la bikunina placentaria son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1995), capítulo 16. Para los fragmentos de bikunina placentaria que contienen un único dominio inhibidor de Kunitz, como la bikunina (7-64) y (102-159), se prefieren los sistemas de expresión de levaduras y E. coli, siendo los sistemas de levaduras más preferidos. De forma típica, la expresión en levaduras se realiza como se describe en la patente de EEUU 5.164.482 para variantes de aprotinina, y adaptada en el ejemplo 5 de la presente descripción para la bikunina placentaria (102-159). La expresión en E. coli puede realizarse utilizando los métodos descritos en la patente de EEUU 5.032.573. El uso de sistemas de mamíferos y levaduras es más preferido para la expresión de variantes de bikunina placentaria más grandes, que contienen ambos dominios inhibidores, como el variante de bikunina (7-159).

El DNA que codifica los variantes de la bikunina placentaria que posee sustituciones de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos natural puede prepararse para la expresión de la proteína recombinante utilizando los métodos de Kunkel T.A., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, pp. 488-492. De forma breve, el DNA que se va mutagenizar se clona en un vector bacteriófago monocatenario, como M13. Un oligonucleótido que abarca la región que se va a cambiar y que codifica la sustitución se hibrida con el DNA monocatenario, y se hace bicatenario mediante técnicas de biología molecular convencionales. Este DNA se transforma entonces en un hospedante bacteriano apropiado y se verifica mediante secuenciación de didesoxinucleótidos. El DNA correcto entonces se clona en el plásmido de expresión. Como alternativa, el DNA diana puede mutagenizarse utilizando técnicas de PCR convencionales, secuenciarse e insertarse en el plásmido de expresión apropiado.

Los siguientes ejemplos concretos se ofrecen como ilustración, y no limitación, de ciertos aspectos y realizaciones preferidas de la presente invención.

Ejemplo 1 Preparación de bikunina placentaria sintética (102-159)

Materiales y métodos/Reactivos utilizados. El sustrato fluorogénico Tos-Gly-Pro-Lys-AMC se obtuvo en Bachem BioScience Inc. (King of Prussia, PA). El PNGB, Pro-Phe-Arg-AMC, Ala-Ala-Pro-Met-AMC, la tripsina bovina (tipo III), la calicreína plasmática humana y la plasmina humana son de Sigma (St. Louis, MO).

La aprotinina recombinante (Trasylol®) es de Bayer AG (Wuppertal, Alemania). La resina Wang Gln precargada es de Novabiochem (La Jolla, Ca). El tioanisol, el etanditiol y el t-butil metil éter son de Aldrich (Milwaukee, WI).

Cuantificación de la bikunina placentaria funcional (7-64) (SEQ ID NO:4) y (102-159)

Se midió la cantidad de actividad inhibidora de tripsina presente en la muestra replegada en diversas etapas de purificación utilizando GPK-AMC como sustrato. La tripsina bovina (200 pmoles) se incubó durante 5 minutos a 37ºC con bikunina (7-64) o (102-159), en diversas etapas de purificación, en tampón A (Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,1 M, CaCl_{2} 2 mM y Triton X-100 al 0,01%). Se añadió GPK-AMC (20 \muM final) y la cantidad de cumarina producida se determinó midiendo la fluorescencia (excit. = 370 nm, emis. = 432 nm) en un fluorímetro Perkin-Elmer LS-50B durante un periodo de 2 minutos. Para las muestras que se están ensayando se calculó, para cada una, el porcentaje de inhibición según la ecuación 1; en la que R_{0} es la proporción de aumento de la fluorescencia en presencia del inhibidor, y R_{1} es la proporción determinada en ausencia de muestra añadida. Una unidad de actividad para el inhibidor se define como la cantidad necesaria para lograr 50% de inhibición en el ensayo utilizando las condiciones descritas.

% de inhibición = 100 x [1 – R_{0}/R_{1}]

Síntesis. La bikunina placentaria (102-159 (SEQ ID NO:6) se sintetizó en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems modelo 420A utilizando la química de NMP-HBTU Fmoc. El péptido se sintetizó sobre una resina Gln precargada con un exceso de 8 veces del aminoácido para cada acoplamiento. La ruptura y la desprotección se realizó en ácido trifluoroacético (TFA) al 84,6%, tioanisol al 4,4%, etanditiol al 2,2%, fenol licuado al 4,4% y H_{2}O al 4,4% durante 2 horas a temperatura ambiente. El péptido bruto se precipitó, se centrifugó y se lavó dos veces en t-butil metil éter. El péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa Dynamax 60A C18 utilizando un gradiente de TFA/acetonitrilo. La preparación final (61,0 mg) produjo la correcta composición de aminoácidos y masa molecular mediante espectroscopía de masa de electronebulización (MH+ = 6836,1; calc. = 6835,5) para la secuencia predicha:

22

Purificación. El replegamiento de la bikunina placentaria (102-159) se realizó según el método de Tam et al. (J. Am. Chem. Soc., 1991, 113:6657-6662). Una porción del péptido purificado (15,2 mg) se disolvió en 4,0 ml de Tris 0,1 M, pH 6,0 y urea 8 M. La oxidación de los disulfuros se realizó mediante la adición gota a gota de una disolución que contenía DMSO al 23% y Tris 0,1 M, pH 6,0, para obtener una concentración final de 0,5 mg/ml de péptido en DMSO al 20%, Tris 0,1 M, pH 6,0, y urea 1 M. La disolución se dejó en agitación durante 24 horas a 25ºC, después de lo cual se diluyó 1:10 en tampón que contenía Tris 50 mM, pH 8,0, y NaCl 0,1 M. El material se purificó utilizando una columna de afinidad de calicreína mediante la unión covalente de 30 mg de calicreína pancreática bovina (Bayer AG) a 3,5 ml de sefarosa activada con CNBr (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante. El material replegado se cargó sobre la columna de afinidad con un caudal de 1 ml/min y se lavó con Tris 50 mM, pH 8,0 y NaCl 0,1 M hasta que la absorbancia a 280 nm del lavado ya no podía detectarse. La columna se eluyó con 3 volúmenes de ácido acético 0,2 M, pH 4,0 y 1,7. Las fracciones activas se reunieron (véase a continuación), y el pH de la disolución se ajustó a 2,5. El material se aplicó directamente a una columna de fase inversa Vydac C18 (5 micras, 0,46 x 25 cm) que se había equilibrado en acetonitrilo al 22,5% en TFA al 0,1%. La separación se logró utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo desde 22,5% al 40% en TFA al 0,1% a 1,0 ml/min durante 40 minutos. Las fracciones activas se reunieron, se liofilizaron, se redisolvieron en TFA al 0,1% y se conservaron a -20ºC hasta que fueron necesarias.

Resultados. La bikunina placentaria sintética (102-159) se replegó utilizando DMSO al 20% como agente oxidante como se describió anteriormente, y se purificó mediante un protocolo de purificación en 2 etapas como se muestra a continuación, para producir un inhibidor de tripsina activo (tabla 1, a continuación).

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TABLA 1 Tabla de purificación para el aislamiento de la bikunina placentaria sintética (102-159)

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^{a} Proteína determinada mediante AAA.

^{b} Proteína determinada mediante DO280 nm utilizando el coeficiente de extinción determinado para la proteína purificada (1,7 x 10^{4} Lmol^{-1}cm^{-1}).

^{c} Una unidad se define como la cantidad de material requerido para inhibir 50% de la actividad tripsina en un ensayo convencional.

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Una cromatografía del material replegado bruto sobre una columna de calicreína pancreática bovina inmovilizada aisló, de forma selectiva, 6,0% de la proteína y 97% de la actividad inhibidora de tripsina presente. Una posterior cromatografía utilizando C18 de fase inversa produjo una mayor purificación en 2 veces, con una recuperación global de 74%. En RPHPLC, la bikunina placentaria reducida y replegada (102-159) muestra unos tiempos de elución de 26,3 y 20,1 minutos, respectivamente. Un análisis de espectroscopía de masas del material purificado reveló una masa molecular de 6829,8; una pérdida de 6 unidades de masa a partir del material de partida. Esto demuestra la formación completa de los 3 disulfuros predichos a partir de la secuencia peptídica.

Los puntos isoeléctricos de la bikunina placentaria sintética replegada y purificada (102-159) se determinaron utilizando un sistema de electroforesis Multiphor II (Pharmacia) realizado según las sugerencias del fabricante, junto con patrones de pI, utilizando una placa PAG Ampholine® premoldeada (pH 3,5 a 9,5) y enfocada durante 1,5 horas. Después de la tinción, se midió la distancia de migración desde el extremo catódico del gel hasta las diferentes bandas de proteínas. Se determinó el pI de cada proteína desconocida utilizando una curva patrón generada mediante la representación gráfica de la distancia de migración de los patrones frente a los correspondientes pI. Con esta técnica se determinó que el pI de la bikunina placentaria (102-159) es 8,3, de acuerdo con el valor predicho a partir de la secuencia de aminoácidos. Es un valor inferior a 10,5, establecido para el pI de la aprotinina (Tenstad et al., 1994, Acta Physiol. Scand., 152:33-50).

Ejemplo 2 Preparación de bikunina placentaria sintética (7-64)

La bikunina placentaria (7-64) (SEQ ID NO:4) se sintetizó, se replegó y se purificó esencialmente como se describe para la bikunina placentaria (102-159) (SEQ ID NO:6) en el ejemplo 1, pero con las siguientes modificaciones: durante el replegamiento, el péptido sintético se agitó durante 30 horas como una disolución en DMSO al 20% a 25ºC; se logró la purificación mediante RP-HPLC C18 con un gradiente lineal de acetonitrilo desde 25% al 45% en TFA al 0,1% durante 40 min (1 ml/min). Las fracciones activas del primer ensayo C18 se reaplicaron a la columna y se fraccionaron con un gradiente lineal (60 min, 1 ml/min) de acetonitrilo desde 20% al 40% en TFA al 0,1%.

Resultados. El péptido reducido purificado final muestra un MH+ = 6563, coherente con la secuencia:

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El replegamiento y la purificación produjo un dominio de Kunitz funcional que es activo como inhibidor de tripsina (tabla 2A a continuación).

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TABLA 2A Tabla de purificación para el aislamiento de la bikunina placentaria sintética (7-64)

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La proteína replegada purificada muestra un MH+ = 6558, es decir, 5\pm1 unidades de masa menos que el péptido reducido. Esto demuesetra que el replegamiento provocó la formación de al menos un enlace disulfuro apropiado.

El pI de la bikunina placentaria (7-64) se determinó utilizando los métodos empleados para determinar el pI de la bikunina placentaria (102-159). La bikunina placentaria (7-64) muestra un pI mucho mayor que el valor predicho (pI = 7,9). La bikunina placentaria replegada (7-64) migra hasta el extremo catódico del gel (pH 9,5) y no se puede determinar un pI preciso en estas condiciones.

Preparación continua de la bikunina placentaria sintética (7-64)

Debido a que es posible que la bikunina placentaria sintética (7-64) no haya sufrido una desprotección completa antes de la purificación y replegamiento se repitió el replegamiento utilizando proteína de la cual se sabe que estaba completamente desprotegida. Se sintetizó la bikunina placentaria (7-64), se replegó y se purificó esencialmente como se describe para la bikunina placentaria (102-159), pero con las siguientes modificaciones: durante el replegamiento, el péptido sintético (0,27 mg/ml) se agitó durante 30 horas como una disolución en DMSO al 20% a 25ºC; se logró la purificación mediante RP-HPLC C18 con un gradiente lineal de acetonitrilo desde 22,5% al 50% en TFA al 0,1% durante 40 min (1 ml/min).

Resultados. El péptido reducido purificado final muestra un MH+ = 6567,5, coherente con la secuencia:

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El replegamiento y la purificación produjo un dominio de Kunitz funcional que es activo como inhibidor de tripsina (tabla 2B a continuación).

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TABLA 2B Tabla de purificación para el aislamiento de la bikunina placentaria sintética (7-64)

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La proteína replegada purificada muestra un MH+ = 6561,2, es decir, 6,3 unidades de masa menos que el péptido reducido. Esto demuestra que el replegamiento provoca la formación de los tres enlaces disulfuro esperados.

El pI de la bikunina placentaria replegada (7-64) se determinó utilizando los métodos empleados para determinar el pI de la bikunina placentaria (102-159). La bikunina placentaria repletada (7-64) muestra un pI de 8,85, ligeramente mayor que el valor predicho (pI = 7,9).

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Ejemplo 3 Especificidad in vitro de un fragmento de bikunina placentaria funcional (102-159)

Proteasas. La cuantificación de la tripsina bovina, la plasmina humana y la calicretína pancreática bovina se realizó mediante valoración del sitio activo utilizando HCl de p'-guanidinobenzoato de p-nitrofenilo, según se describió previamente (Chase, T., y Shaw, E., 1970, Methods Enzmol., 19, 20-27). La calicreína humana se cuantificó mediante valoracón del sitio activo utilizando aprotinina bovina como patrón, y PFR-AMC como sustrato, suponiendo una formación de complejo 1:1. La K_{m} para GPK-AMC con tripsina y plasmina bajo las condiciones utilizadas para cada enzima es 29 \muM y 726 \muM, respectivamente; la K_{m} para PFR-AMC con calicreína plasmática humana y calicreína pancreática bovina es 457 M y 81,5 \muM, respectivamente; la K_{m} para AAPR-AMC con elastasa es 1600 \muM. La cuantificación de la calicreína tisular humana (Bayer, Alemania) se realizó mediante valoración del sitio activo utilizando HCl de p'-guanidinobenzoato de p-nitrofenilo, según se describió previamente (Chase, T., y Shaw, E., 1970, Methods Enzmol., 19, 20-27).

Cinética de inhibición. La inhibición de la tripsina por la bikunina placentaria (102-159) (descrita en el ejemplo 1) o la aprotinina se midió mediante incubación de tripsina 50 pM con bikunina placentaria (102-159) (0-2 nM) o aprotinina (0-3 nM) en tampón A, en un volumen total de 1,0 ml. Después de 5 minutos a 37ºC se añadieron 15 \mul de GPK-AMC 2 mM y se controló el cambio en la fluorescencia (como anteriormente). La inhibición de la plasmina humana por la bikunina placentaria (102-159) y la aprotinina se determinó con plasmina (50 pm) y bikunina placentaria (102-159) (0-10 nM) o aprotinina (0-4 nM) en tampón que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 0,1 M, y Triton X-100 al 0,02%. Después de 5 minutos de incubación a 37ºC se añadieron 25 \mul de GPK-AMC 20 mM y se controló el cambio en la fluorescencia. La inhibición de la calicreína plasmática humana por la bikunina placentaria (102-159) o la aprotinina se determinó utilizando calicreína (2,5 nM) y bikunina placentaria (102-159) (0-3 nM) o aprotinina (0-45 nM) en Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 50 mM y Triton X-100 al 0,02%. Después de 5 min a 37ºC se añadieron 15 \mul de PFR-AMC 20 mM y se controló el cambio en la fluorescencia. La inhibición de la calicreína pancreática bovina por la bikunina placentaria (102-159) y la aprotinina se determinó de una manera similar con calicreína (92 pM), bikunina placentaria (102-159) (0-1,6 nM) y aprotinina (0-14 pM), y una concentración final de sustrato de 100 \muM. La constante de inhibición aparente K_{i}* se determinó utilizando el programa de análisis de datos de regresión no lineal Enzfitter (Biosoft, Cambridge, Reino Unido). Los dados cinéticos de cada experimento se analizaron en términos de la ecuación para un inhibidor de unión fuerte:

(2)V_{i}/V_{0} = 1 - (E_{0} + I_{0} - K_{i}\text{*} - [(E_{0} + I_{0} - K_{i}\text{*})^{2} - 4 E_{0}I_{0}]^{1/2})/2 E_{0}

en la que V_{i}/V_{0} es la actividad enzimática fraccionaria (proporción de inhibición frente a no inhibición), y E_{0} e I_{0} son las concentraciones totales de la enzima y el inhibidor, respectivamente. Los valores de K_{i} se obtuvieron corrigiendo para el efecto del sustrato según la ecuación:

(3)K_{i} = K_{i}\text{*}/(1 + [S_{0}]/K_{m})

(Boudier, C. y Bieth, J.G., 1989, Biochim. Biophys. Acta, 995, 36-41).

Para la inhibición de la elatasa de neutrófilos humana por la bikunina placentaria (102-159) y la aprotinina se incubó elastasa (19 nM) con bikunina placentaria (102-159) (150 nM) o aprotinina (0-7,5 \muM) en tampón que contenía Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0) y Triton X-100 al 0,05%. Después de 5 min a 37ºC se añadió AAPM-AMC (500 \muM o 1000 \muM) y se midió la fluorescencia a lo largo de un periodo de dos minutos. Se determinaron los valores de K_{i} a partir de gráficas de Dixon de la forma 1/V frente a [I] realizadas a dos concentraciones del sustrato diferentes (Dixon et al., 1979).

La inhibición de la calicreína tisular humana por la aprotinina, un fragmento de bikunina placentaria (7-64) o un fragmento de bikunina placentaria (102-159) se midió mediante la incubación de calicreína tisular humana 0,35 nM con bikunina placentaria (7-64) (0-40 nM) o bikunina placentaria (102-159) (0-2,5 nM) o aprotinina (0-0,5 nM) en un volumen de reacción de 1 ml que contiene tampón Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, NaCl 50 mM y Triton X-100 al 0,1%. Después de 5 min a 37ºC se añadieron 5 ul de PFR-AMC 2 mM logrando una concentración final de 10 uM y se controló el cambio en la fluorescencia. La Km para PFR-AMC con calicreína tisular humana bajo las condiciones empleadas es 5,7 uM. La inhibición del factor Xa humano (American Diagnostica, Inc., Greenwich, CT) por la bikunina placentaria sintética (102-159), la bikunina placentaria recombinante y la aprotinina se midió mediante la incubación de factor Xa humano 0,87 nM con cantidades crecientes de inhibidor en tampón que contenía Tris 20 mM (pH 7,5), NaCl 0,1 M, y BSA al 0,1%. Después de 5 min a 37ºC se añadieron 30 ul de LGR-AMC 20 mM (Sigma) y se controló el cambio en la fluorescencia. La inhibición de la uroquinasa humana (Sigma) por inhibidores de Kunitz se midió mediante la incubación'de uroquinasa (2,7 ng) con inhibidor en un volumen total de 1 ml de tampón que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 50 mM y Triton X-100 al 0,1%. Después de 5 min a 37ºC se añadieron 35 ul de GGR-AMC 20 mM (Sigma) y se controló el cambio en la fluorescencia. La inhibición del factor XIa (de Enzyme Research Labs, Southbend, IN) se midió incubando FXIa (0,1 nM) con bikunina placentaria (7-64) 0 a 800 nM, bikunina placentaria (102-159) 0 a 140 nM, o aprotinina 0 a 40 uM en tampón que contenía Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl2 2 mM, Triton X-100 al 0,01% y BSA al 1% en un volumen total de 1 ml. Después de 5 min a 37ºC se añadieron 10 ul de Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-AMC 40 mM (Bachem Biosciences, King of Prussia, PA) y se controló el cambio en la fluorescencia.

Resultados. Una comparación directa de los perfiles de inhibición de la bikunina placentaria (102-159) y la aprotinina se realizó midiendo sus constantes de inhibición con diversas proteasas bajo condiciones idénticas. Los valores de K_{i} aparecen en la tabla 3 a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Valores de Ki para la inhibición de diversas proteasas por la bikunina (102-159)

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La bikunina placentaria (102-159) y la aprotinina inhiben la tripsina bovina y la plasmina humana en un grado comparable bajo las condiciones empleadas. La aprotinina inhibe la elastasa con una Ki de 8,5 \muM. La bikunina placentaria (120-159) inhibe la elastasa con una Ki de 323 nM. El valor de K_{i} para la inhibición por la bikunina placentaria (102-159) de la calicreína pancreática bovina es 20 veces mayor que la del inhibidor de aprotinina. Por contraste, la bikunina placentaria (102-159) es un inhibidor más potente de la calicrína plasmática humana que la aprotinina y se une con una afinidad 56 veces mayor.

Debido a que la bikunina placentaria (102-159) es más de 50 veces más potente que Trasylol® como inhibidor de calicreína, se necesitan cantidades menores de bikunina placentaria humana o sus fragmentos (es decir, bikunina placentaria (102-159)) que de Trasylol® para mantener las dosis eficaces en pacientes del inhibidor en KIU. Esto reduce el coste por dosis del fármaco y reduce la probabilidad de efectos nefrotóxicos adversos después de la reexposición del medicamento a los pacientes. Además la proteína es de origen humano y, por tanto, es mucho menos inmunogénica para el ser humano que la aprotinina, que deriva de vacas. Esto produce una reducción significativa en el riesgo de aparición de acontecimientos inmunológicos adversos tras la reexposición del medicamento a los pacientes.

Ejemplo 4 Especificidad in vitro de un fragmento de bikunina placentaria funcional (7-64)

La especificidad in vitro de la bikunina placentaria humana funcional (7-64) descrita en el ejemplo 2 se determinó utilizando los materiales y métodos como se describe en los ejemplos anteriores.

Resultados. La tabla a continuación muestra la eficacia de la bikunina placentaria (7-64) como inhibidor de diversas serinproteasas in vitro. Se muestran los datos comparados con otros datos obtenidos para la búsqueda de inhibición utilizando bikunina placentaria (102-159) o aprotinina (Trasylol®).

TABLA 4A Valores de Ki para la inhibición de diversas proteasas por la bikunina (7-64)

30

Los resultados demuestran que la secuencia de aminoácidos que codifica la bikunina placentaria (7-64) puede replegarse para obtener un inhibidor de serinproteasas activo que es eficaz contra al menos cuatro serinproteasas de tipo tripsina.

La tabla 4B a continuación también muestra la eficacia de la bikunina placentaria (7-64) replegada como inhibidor de diversas serinproteasas in vitro. La bikunina placentaria (7-64) replegada se preparó a partir de una proteína de la cual se sabe con certeza que está completamente desprotegida antes de la purificación y replegamiento. Los datos se muestran comparados con los datos obtenidos para la búsqueda de inhibición utilizando bikunina placentaria (102-159) o aprotinina (Trasylol®).

TABLA 4B Valores de Ki para la inhibición de diversas proteasas por la bikunina (7-64) replegada

32

De forma sorprendente, la bikunina placentaria (7-64) es más potente que la aprotinina para inhibir la calicreína plasmática humana, y tiene una eficacia al menos similar que un inhibidor de plasmina. Estos datos demuestran que la bikunina placentaria (7-64) es al menos tan eficaz como la aprotinina, utilizando ensayos in vitro, y que puede esperarse una potencia mejor o similar in vivo.

Ejemplo 5 Expresión de un variante de bikunina placentaria (102-159) en levaduras

La secuencia de DNA que codifica la bikunina placentaria (102-159) (SEQ ID NO:6) se generó utilizando oligonucleótidos sintéticos. El DNA producto final consiste en (5' a 3') 15 nucleótidos de la secuencia de propéptido del factor de \alpha-apareamiento de levaduras condensada con una secuencia de cDNA dentro del marco que codifica la bikunina placentaria (102-159), seguida de un codón de terminación dentro del marco. Después de la clonación en el vector de expresión de levaduras pS604, el cDNA dirige la expresión de una proteína de fusión que comprende un propéptido del factor de \alpha-apareamiento de levaduras N-terminal condensado con la secuencia de 58 aminoácidos de la bikunina placentaria (102-159). Se diseñó el procesamiento de esta proteína de fusión en el sitio de ruptura KEX-2 en la unión entre el factor de \alpha-apareamiento y el dominio de Kunitz, para liberar el dominio de Kunitz en su N-terminal nativo.

Se sintetizó un oligonucleótido sentido 5' con la siguiente secuencia y que contenía un sitio HindIII para la clonación:

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Se sintetizó un oligonucleótido sentido 3' con la siguiente secuencia y que contenía un sitio BamHI para la clonación y un codón de terminación:

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Los oligonucleótidos se disolvieron en tampón Tris 10 mM, pH 8,0, que contenía EDTA 1 mM y se añadieron 12 ug de cada oligonucleótido combinados y se llevó hasta NaCl 0,25 M. Para la hibridación, los oligonucleótidos se desnaturalizaron hirviendo durante 5 minutos y dejando enfriar desde 65ºC hasta la temperatura ambiente durante 2 horas. Se extendieron los solapamientos utilizando el fragmento de Klenow y se digirieron con HindIII y BamHI. El fragmento bicatenario digerido resultante se clonó en pUC19 y se confirmó su secuencia. Un clon que contenía el fragmento con la secuencia correcta se digirió con BamHI/HindIII para liberar el fragmento que contenía bikunina con la siguiente secuencia de la hebra +:

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que entonces se purificó en gel y se acopló con pS604 cortado con BamHI/HindIII. La mezcla de acoplamiento se extrajo en fenol/cloroformo y se purificó sobre una columna de miniespín S-200. El producto del acoplamiento se transformó de modo dirigido en las cepas de levaduras SC101 y WHL341, y se colocó en placas de selección de ura. Doce colonias de cada cepa se volvieron a colocar en placas de separación de ura. Se inoculó una única colonia en 2 ml de medio DO de ura y se cultivó durante la noche a 30ºC. Las células se sedimentaron durante 2 minutos a 14000 x g y los sobrenadantes se evaluaron para determinar su contenido en bikunina placentaria (102-159).

Detección de la expresión de bikunina placentaria (102-159) en levaduras transformadas

En primer lugar, los sobrenadantes (50 ul por ensayo) se evaluaron para determinar su capacidad para inhibir la actividad in vitro de tripsina, utilizando los métodos de ensayo según se describe en el ejemplo 1 (1 ml de volumen de ensayo). Como controles negativos se utilizó una muestra con medio sin usar y un clon de levadura que expresa un variante inactivo de la aprotinina. Un clon de levadura que expresa la aprotinina natural actúa como control positivo y se muestra como comparación.

El segundo método para cuantificar la expresión de bikunina placentaria (102-159) aprovecha el uso de anticuerpos policlonales (pAb) contra el péptido sintético para controlar la acumulación del péptido recombinante usando análisis de la transferencia Western. Estos estudios se realizaron sólo con recombinantes derivados de la cepa SC101, puesto que producen una mayor actividad inhibidora que los recombinantes derivados de la cepa WHL341.

Para producir el pAb, se inmunizaron dos conejos hembra New Zealand White de 6-8 semanas (Hazelton Research Labs, Denver, PA) en el día cero con 250 ug de bikunina placentaria sintética reducida purificada (102-159) en adyuvante de Freund completo, seguido de reinmunizaciones en los días 14, 35, 56 y 77 cada una con 125 ug del mismo antígeno en adyuvante de Freund incompleto. El antisuero utilizado en los presentes estudios se recogió después de la tercera reinmunización mediante procedimientos establecidos. Los anticuerpos policlonales se purificaron a partir del antisuero frente a proteína A.

Las colonias 2.4 y 2.5 de la transformación de la levadura SC101 (figura 8), así como un control de aprotinina se cultivaron durante la noche en 50 ml de medio DO de ura a 30ºC. Las células se sedimentaron y el sobrenadante se concentró 100 veces utilizando un concentrador Centriprep 3 (Amicon, Beverly, MA). Se sometieron muestras de cada una (30 \mul) a SDS-PAGE en geles tamponados con tricina al 10-20% (Novex, San Diego, CA) utilizando los procedimientos de los fabricantes. Los geles por duplicado se revelaron con un kit de tinción de plata (Integrated Separation Systems, Nantick, MA) o se transfirieron a nitrocelulosa y se revelaron con el anticuerpo policlonal purificado producido contra la bikunina placentaria (102-159). Se utilizó un anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina como anticuerpo secundario según las instrucciones del fabricante (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD).

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Purificación de la bikunina placentaria (102-159) a partir de una cepa transformada de SC101

Un caldo de fermentación procedente de un cultivo de 1 l de la cepa SC101 2.4 se recogió mediante centrifugación (4.000 g x 30 min) y después se aplicó a una columna de 1,0 ml de anhidroquimotripsina-sefarosa (Takara Biochemical Inc., CA) que se había equilibrado previamente con tampón Hepes 50 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 0,1 M, CaCl_{2} 2 mM y Triton X-100 al 0,01% (v/v). La columna se lavó con el mismo tampón pero que contenía NaCl 1,0 M hasta que la A280 nm disminuyó a cero, tras lo cual la columna se eluyó con ácido fórmico 0,1 M, pH 2,5. Las fracciones eluidas se reunieron y se aplicaron a una columna C18 (Vydac, 5 um, 4,6 x 250 mm) previamente equilibrada con TFA al 0,1%, y se eluyeron con un gradiente lineal de acetonitrilo desde 20% al 80% en TFA al 0,1% durante 50 min. Las fracciones que contenían la bikunina placentaria (102-159) se reunieron y se recromatografiaron en C18 empleando una elución con un gradiente lineal de acetonitrilo desde 22,5% al 50% en TFA al 0,1%.

Resultados. La figura 8 muestra el porcentaje de actividad tripsina inhibida por doce colonias derivadas de la transformación de cada una de las cepas SC101 y WHL341. Los resultados demuestran que las doce colonias de la cepa de levadura SC101 transformada con el inhibidor de tripsina bikunina placentaria (102-159) tenían la capacidad de producir una cantidad sustancial de actividad inhibidora de tripsina, comparadas con los controles negativos que no mostraron capacidad para inhibir la tripsina. La actividad, por tanto, está relacionada con la expresión de un inhibidor específico en células transformadas con el variante de bikunina placentaria (102-159). Las muestras de levadura WHL341 contenían una actividad inhibidora de tripsina mínima. Esto puede correlacionarse con el crecimiento lento observado en esta cepa bajo las condiciones empleadas.

La figura 9 muestra el SDS-PAGE y el análisis de la transferencia Western de los sobrenadantes de la levadura SC101. Los SDS-PAGE teñidos con plata de sobrenadantes derivados de las levaduras recombinantes 2.4 y 2.5 que expresan bikunina placentaria (102-159), así como de levaduras que expresan aprotinina producen una banda de proteína que se mueve a aproximadamente 6 kDa, que se corresponde con el tamaño esperado para cada dominio inhibidor de Kunitz recombinante. Un análisis de la transferencia Western muestra que las bandas de 6 kDa expresadas por las cepas 2.4 y 2.5 reaccionan con el pAb producido contra la bikunina placentaria (102-159). La misma banda de 6 kDa en el control de aprotinina no reaccionó con el mismo anticuerpo, demostrando la especificidad del anticuerpo por el variante de bikunina placentaria (102-159).

La preparación final del dominio C-terminal de bikunina placentaria era muy pura según un SDS-PAGE teñido con plata (figura 10). La recuperación global de la actividad inhibidora de tripsina derivada del caldo en la preparación final era de 31%. La secuenciación N-terminal del inhibidor purificado indica que 40% de la proteína está correctamente procesada para producir el N-terminal correcto para la bikunina placentaria (102-159), mientras que aproximadamente 60% del material contiene una porción del factor de \alpha-apareamiento de levaduras. El material purificado comprende un inhibidor de serinproteasas activo que muestra una Ki aparente de 0,35 nM para la inhibición in vitro de la calicreína plasmática.

En conclusión, la acumulación de una actividad inhibidora de proteasas y una proteína inmunoquímicamente relacionada con la bikunina sintética (102-159) en el caldo de fermentación, así como el aislamiento de bikunina placentaria (102-159) de una de las líneas transformadas proporciona pruebas de la expresión de la bikunina placentaria en cepas de levaduras recombinantes descritas en la presente, mostrando, por primera vez, la utilidad de las levaduras para la producción de fragmentos de bikunina placentaria.

Se prepararon otros constructos para intentar aumentar el nivel de expresión del dominio de Kunitz contenido dentro de la bikunina placentaria (102-159), así como para aumentar el rendimiento de la proteína con el N-terminal correcto. Los inventores tienen la hipótesis de que los restos N-terminales de la bikunina placentaria (102-159) (YEEY--) pueden presentar un sitio de ruptura que no es bien reconocido por la proteasa KEX-2 de levaduras, que elimina de forma enzimática la región pro del factor a de levaduras. Por tanto, se prepararon constructos de expresión de levaduras para la producción de bikunina placentaria (103-159) (N-terminal de EEY...), 101-159 (N-terminal de NYEEY...) y 98-159 (DMFNYEEY..) para modificar los subsitios P' que rodean el sitio de ruptura KEX-2. Para intentar aumentar los niveles de expresión de proteína recombinante, también se utilizaron los codones preferidos de levaduras, en lugar de los codones preferidos de mamífero, para preparar algunos constructos descritos a continuación. Los constructos se preparan esencialmente como se describe anteriormente para la bikunina placentaria (102-159) (definida como el constructo nº 1), pero con las siguientes modificaciones:

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Constructo nº 2

Bikunina placentaria (103-159), utilización de codones de levaduras

Un oligonucleótido 5' sentido

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y un oligonucleótido 3' antisentido

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se manipularon como se describe para la producción de un constructo de expresión (constructo nº 1 anterior) para la expresión de bikunina placentaria (102-159).

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Constructo nº 3

Bikunina placentaria (101-159), utilización de codones de levadura

Un oligonucleótido 5' sentido

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y el mismo oligonucleótido 3' antisentido utilizado para el constructo nº 2 se manipularon como se describió para la producción de un constructo de expresión (constructo nº 1 anterior) para la expresión de la bikunina placentaria
(102-159).

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Constructo nº 4

Bikunina placentaria (98-159), utilización de codones de levaduras

Un oligonucleótido 5' sentido

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y el mismo oligonucleótido 3' antisentido utilizado para el constructo nº 2 se manipularon como se describió para la producción de un constructo de expresión (constructo nº 1 anterior).

La cepa de levaduras SC101 (MAT\alpha, ura 3-52, suc 2) se transformó con los plásmidos que contienen cada uno de los anteriores cDNA y las proteínas se expresaron utilizando los métodos que se describieron anteriormente para la producción de bikunina placentaria (120-159) con utilización de codones humanos. Aproximadamente 250 ml de cada cultivo de levaduras se recogió y el sobrenadante procedente de la centrifugación (15 min x 3000 rpm) se sometió, por separado, a una purificación en columnas de 1 ml de calicreína-sefarosa como se describió anteriormente. Se determinó la cantidad relativa de actividad inhibidora de tripsina en el aplisato, la cantidad de proteína purificada recuperada y la secuencia N-terminal de la proteína purificada, y se lista a continuación en la tabla 7.

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TABLA 7 Niveles de producción relativa de diferentes proteínas que contienen el dominio de Kunitz C-terminal de la bikunina placentaria

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Los resultados demuestran que los fragmentos de bikunina placentaria de diferentes longitudes que contienen el dominio de Kunitz C-terminal muestran una amplia variación en la capacidad para expresar la proteína segregada funcional. Los constructos que expresan los fragmentos (101-159) y (103-159) producen poca o baja actividad enzimática en los sobrenadantes antes de la purificación, y la secuenciación N-terminal de alícuotas de 0,05 ml de cada fracción purificada producen cantidades indetectables de inhibidor. Por otra parte, la expresión de bikunina placentaria (102-159) o (98-159) produce cantidades significativas de actividad proteasa antes de la purificación. Sin embargo, la secuenciación N-terminal demuestra que la proteína purificada recuperada de la expresión de (102-159) de nuevo estaba procesada de forma muy incorrecta, mostrando un N-terminal coherente con el procesamiento de la mayor parte de la preproteína en un sitio dentro de la secuencia pro del factor de \alpha-apareamiento de levaduras. Sin embargo, la proteína purificada recuperada de la expresión de bikunina placentaria (98-159) se procesó por completo en el sitio correcto para producir el N-terminal correcto. Además, se recuperó casi el doble de proteína comparada con la recuperación de bikunina placentaria (102-159). La bikunina placentaria (98-159), por tanto, representa una longitud de fragmento preferida para la producción del dominio de Kunitz C-terminal de la bikunina placentaria por el sistema de procesamiento secuencia pre-pro del factor de \alpha-apareamiento/KEX-2 de S. cerevisiae.

Ejemplo 6 Procedimiento alternativo para la expresión en levaduras

El péptido de 58 aminoácidos derivado del producto de traducción de R74593 también puede amplificarse mediante PCR a partir del producto de PCR R87894-R74593 clonado en el vector TA^{TM} (Invitrogen, San Diego, CA) después de la secuenciación de DNA, o a partir de cDNA placentario humano. El producto de DNA amplificado consiste en 19 nucleótidos de la secuencia conductora del factor de \alpha-apareamiento de levaduras apareado con la secuencia de R74593 que codifica YEEY--CFRQ (58 restos), para que el producto de la traducción esté dentro del marco, construyendo una proteína de fusión factor de \alpha-apareamiento/dominio de Kunitz. La secuencia de la proteína también contiene un sitio de ruptura kex 2 que libera el dominio de Kunitz en su N-terminal nativo.

El oligonucleótido 5' sentido que contiene un sitio HindIII para la clonación contiene la siguiente secuencia:

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El oligonucleótido 3' antisentido contiene un sitio BamHI para la clonación, así como un codón de terminación, y tiene la siguiente secuencia:

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La secuencia de cDNA de 206 nucleótidos completa para clonar en el vector de expresión de levaduras tiene la siguiente secuencia:

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Después de la amplificación mediante PCR, este DNA se digiere con HindIII, BamHI y se clona en el vector de expresión de levaduras pMT15 (véase la patente de EEUU 5.164.482, incorporada como referencia en su totalidad) también digerido con HindIII y BamHI. El vector plásmido resultante se utiliza para transformar la cepa de levaduras SC106 utilizando los métodos descritos en la patente de EEUU 5.164.482. Los transformantes de levaduras URA 3+ se aíslan y se cultivan bajo condiciones inductoras. El rendimiento de los variantes de bikunina placentaria recombinante se determina según la cantidad de actividad inhibidora de tripsina que se acumula en los sobrenadantes del cultivo a lo largo del tiempo utilizando el método de ensayo in vitro descrito anteriormente. Los caldos de cultivo de fermentación se centrifugan a 9000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante entonces se filtra a través de un filtro de 0,4 \mum, después a través de un filtro de 0,2 \mum, se diluye hasta una conductividad de 7,5 ms, y se ajusta a pH 3 con ácido cítrico. La muestra entonces se absorbe de forma discontinua sobre 200 ml de S-sepharose Fast Flow (Pharmacia) en citrato de sodio 50 mM, pH 3, y se agita durante 60 minutos. El gel se lava posteriormente de forma secuencial con 2 l de cada: citrato de sodio 50 mM, pH 3,0; Tris-HCl 50 mM, pH 9,0; HEPES 20 mM, pH 6,0. El gel lavado se traslada a una columna adecuada y se eluye con un gradiente lineal de cloruro de sodio desde 0 a 1 M en HEPES 20 mM, pH 6,0. Las fracciones eluidas que contienen la actividad inhibidora de tripsina in vitro entonces se reúnen y se purifican aún más mediante a) cromatografía sobre una columna de anhidrotripsina inmovilizada (esencialmente como se describe en el ejemplo 2); b) cromatografía en una columna de calicreína bovina inmovilizada; o c) una combinación de etapas cromatográficas convencionales, incluyendo filtración en gel y/o cromatografía de intercambio aniónico.

Ejemplo 7 Aislamiento y caracterización de la bikunina placentaria humana nativa a partir de placenta

La proteína bikunina se purificó hasta una homogeneidad aparente a partir de placenta congelada completa (Analytical Biological Services, Inc., Wilmington, DE). La placenta (740 g) se descongeló hasta la temperatura ambiente y se cortó en trozos de 0,5 a 1,0 cm, se colocó sobre hielo y se lavó con 600 ml de tampón PBS. El lavado se decantó y 240 ml de trozos de placenta se colocaron en un mezclador Waring. Después de añadir 300 ml de tampón que consistía en Tris 0,1 M (pH 8,0) y NaCl 0,1 M, la mezcla se mezcló a alta velocidad durante 2 min, se decantó en tubos de centrífuga de 750,0 ml y colocó en hielo. Este procedimiento se repitió hasta que todo el material se procesó. La suspensión reunida se centrifugó a 4500 x g durante 60 minutos a 4ºC. El sobrenadante se filtró a través de un trapo para quesos y la bikunina placentaria se purificó utilizando una columna de afinidad de calicreína fabricada uniendo de forma covalente 70 mg de calicreína pancreática bovina (Bayer AG) a 5,0 ml de sefarosa activada con CNBr (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante. El material se cargó sobre la columna de afinidad con un caudal de 2,0 ml/min y se lavó con Tris 0,1 M (pH 8,0), NaCl 0,1 M hasta que la absorbancia a 280 nm del lavado ya no pudo detectarse. La columna se volvió a lavar con Tris 0,1 M (pH 8,0), NaCl 0,5 M y después se eluyó con 3 volúmenes de ácido acético 0,2 M, pH 4,0. Las fracciones que contenían actividad inhibidora de tripsina y calicreína (véase a continuación) se reunieron, se congelaron y se liofilizaron. La bikunina placentaria se purificó aún más mediante cromatografía de filtración en gel utilizando una columna Superdex 75 10/30 (Pharmacia) unida a un sistema HPLC Beckman System Gold. De forma breve, la columna se equilibró en Tris 0,1 M, NaCl 0,15 M, y Triton X-100 al 0,1% con un caudal de 0,5 ml/min. La muestra liofilizada se reconstituyó en 1,0 ml de Tris 0,1 M, pH 8,0 y se inyectó en la columna de filtración en gel en partes alícuotas de 200 \mul. Las fracciones se recogieron (0,5 ml) y se ensayaron para detectar actividad inhibidora de tripsina y de calicreína. Las fracciones activas se reunieron, y el pH de la disolución se ajustó a 2,5 mediante la adición de TFA. El material se aplicó directamente sobre una columna de fase inversa C18 Vydac (5 micras, 0,46 x 25 cm) que se había equilibrado en acetonitrilo al 20% en TFA al 0,1%.

La separación se logró utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo desde 20% al 80% en TFA al 0,1% a 1,0 ml/min durante 50 minutos después de un lavado inicial de 20 minutos con acetonitrilo al 20% en TFA al 0,1%. Las fracciones (1 ml) se recogieron y se ensayaron para detectar actividad inhibidora de tripsina y calicreína. Las fracciones que contenían actividad inhibidora se concentraron utilizando un concentrador Speed-vac (Savant) y se sometieron a un análisis de secuencia N-terminal.

Ensayos funcionales para la bikunina placentaria

Se logró la identificación de la bikunina placentaria funcional midiendo su capacidad para inhibir la tripsina bovina y la calicreína plasmática humana. La actividad inhibidora de tripsina se realizó en tampón de ensayo (Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,1 M, CaCl2 2,0 mM, Triton X-100 al 0,1%) a temperatura ambiente en una placa de microvaloración de 96 pocillos (Perkin Elmer) utilizando Gly-Pro-Lys-aminometilcumarina como sustrato. La cantidad de cumarina producida por la tripsina se determinó midiendo la fluorescencia (excit. = 370 nm, emis. = 432 nm) en un fluorímetro LS-50B de Perkin-Elmer equipado con un lector de placas. La tripsina (23 \mug en 100 \mul de tampón) se mezcló con 20 \mul de la muestra que se va a ensayar y se incubó durante 10 minutos a 25ºC. La reacción comenzó mediante la adición de 50 \mul del sustrato GPK-AMC (33 \muM final) en tampón de ensayo. La intensidad de la fluorescencia se midió y se determinó el porcentaje de inhibición para cada fracción mediante:

% de inhibición = 100 x [1 – F0/F1]

en la que F0 es la fluorescencia desconocida, y F1 es la fluorescencia del control que sólo contiene tripsina. La actividad inhibitoria de la calicreína de las fracciones se midió de forma similar utilizando calicreína 7,0 nM en tampón de ensayo (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, Triton X-100 al 0,1%) y Pro-Phe-Arg-AMC 66,0 \muM como sustrato.

Determinación de la especificidad in vitro de la bikunina placentaria

La especificidad in vitro de la bikunina placentaria humana nativa se determinó utilizando los materiales y métodos según se describió en los ejemplos anteriores. La bikunina placentaria se cuantificó mediante valoración de sitio activo contra una concentración conocida de tripsina utilizando GPK-AMC como sustrato para controlar la fracción de tripsina sin unir.

Secuenciación de la proteína

La fracción de 1 ml (C18-29 Delaria) se redujo hasta un volumen de 300 ml en un Speed Vac para reducir la cantidad de disolvente orgánico. La muestra entonces se cargó sobre una columna de reacción bifásica en miniatura Hewlett-Packard, y se lavó con 1 ml de ácido trifluoroacético al 2%. La muestra se secuenció sobre un sistema de secuenciación de proteínas de Hewlett-Packard modelo G1005A utilizando una degradación de Edman. Los métodos de secuenciación version 3.0 y todos los reactivos fueron suministrados por Hewlett-Packard. La secuencia se confirmó para 50 ciclos.

Resultados. La bikunina placentaria se purificó hasta una homogeneidad aparente mediante afinidad por calicreína, filtración en gel y cromatografía de fase inversa secuenciales (véase la tabla de purificación a continuación):

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TABLA 5 Tabla de purificación para la bikunina placentaria nativa (1-179)

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La mayor parte de la actividad inhibidora de calicreína y tripsina eluye de la columna de afinidad de calicreína en la elución de pH 4,0. La posterior cromatografía de filtración en gel (figura 5) produce un pico de actividad inhibidora de calicreína y tripsina con un intervalo de peso molecular desde 10 a 40 kDa, según se considera a partir de una curva patrón generada ensayando patrones de peso molecular bajo condiciones idénticas. La cromatografía en fase inversa C18 (figura 6) produce 4 picos de actividad inhibidora, y la más potente eluye a aproximadamente acetonitrilo al 30%. La actividad asociada con el primer pico que eluye de C18 (fracción 29) muestra una secuencia de aminoácidos que comienza con el aminoácido 1 de la secuencia de aminoácidos predicha de la bikunina placentaria (ADRER...; SEQ ID NO:1), y es idéntica a la secuencia predicha para 50 ciclos de secuenciación (aminoácidos subrayados en la figura 3). Los restos cisteína en este tramo de secuencia son silenciosos, como se espera para la secuenciación de la proteína oxidada. Los restos cisteína en las posiciones de los aminoácidos 11 y 20 de la bikunina placentaria madura se identificaron más tarde a partir de la secuenciación de la proteína S-piridiletilada, después de lo cual se recuperó la PTH-piridiletilcisteína en los ciclos 11 y 20.

De forma interesante, la asparagina en el resto aminoácido número 30 de la secuencia (figura 3) es silenciosa, demostrando que es probable que este sitio se vaya a glicosilar. La fracción 29 produjo una secuencia principal que se corresponde con la de la bikunina placentaria que empieza en el resto nº 1 (27 pmol en el ciclo 1) más una secuencia minoritaria (2 pmol), que deriva de la bikunina placentaria que comienza en el resto 6 (SIHD...). Esto demuestra que la preparación final secuenciada en la fracción 29 es muy pura y que, con mucha probabilidad, es responsable de la actividad inhibidora de proteasas asociada con esta fracción (figura 6).

Por consiguiente, la preparación final de bikunina placentaria de la cromatografía C18 es muy pura basándose en un análisis de SDS-PAGE teñido con plata (figura 7), en el que la proteína migra con una Mr aparente de 24 kDa en un gel de tricina-acrilamida desde 10% al 20% (Novex, San Diego, CA) calibrado con los siguientes marcadores de peso molecular: insulina (2,9 kDa); inhibidor de tripsina bovina (5,8 kDa); lisozima (14,7 kDa); \beta-lactaglobulina (18,4 kDa); anhidrasa carbónica (29 kDa); y ovoalbúmina (43 kDa). El tamaño anterior de la bikunina placentaria en SDS-PAGE es coherente con el predicho a partir de la secuencia codificadora de longitud completa (figura 4F).

Tal como se espera, basándose en los resultados de la secuenciación N-terminal descritos anteriormente, la proteína purificada reacciona con un anticuerpo producido contra la bikunina placentaria (7-64) para producir una banda con la misma Mr (figura 12A) que la observada para la preparación purificada detectada en los geles mediante tinción de plata (figura 7). Sin embargo, cuando la misma preparación se hace reaccionar con un anticuerpo producido contra la bikunina placentaria sintética (102-159) no se observó una banda que correspondiese a la proteína de longitud completa. En lugar de esto, se observó un fragmento que comigra con la bikunina sintética (102-159) de aproximadamente 6 kDa. La interpretación más sencilla de estos resultados es que la preparación purificada ha sufrido una degradación posterior a la purificación para producir un fragmento N-terminal que comprende el dominio N-terminal y un fragmento C-terminal que comprende el dominio C-terminal. Suponiendo que el fragmento reactivo contra el antisuero contra la bikunina placentaria (7-64) no tiene el extremo C-terminal de la proteína de longitud completa, el tamaño (24 kDa) sugiere un alto estado de glicosilación.

La tabla 6, a continuación, muestra la potencia de la inhibición in vitro de diversas serinproteasas por la bikunina placentaria. Los datos se comparan con los obtenidos con aprotinina (Trasylol®).

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TABLA 6 Valores de Ki para la inhibición de diversas proteasas por la bikunina placentaria

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Los resultados demuestran que la bikunina placentaria aislada a partir de una fuente natural (placenta humana) es un potente inhibidor de las serinproteasas de tipo tripsina.

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Ejemplo 8 Patrón de expresión de la bikunina placentaria entre diferentes órganos y tejidos humanos

Un análisis de la transferencia Northern de múltiples tejidos se adquirió en Clontech, que contenía 2 \mug de RNA poli-A+ de corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas humanos. Se utilizaron dos sondas de cDNA diferentes: 1) un cDNA purificado en gel que codifica la bikunina placentaria (102-159); 2) el cDNA de 780 pares de bases derivado de la PCR (figura 4E) liberado de un clon TA mediante digestión con EcoRI y purificado en gel. Cada sonda se marcó utilizando ^{32}P-dCTP y un kit de marcaje de cebado aleatorio de Boehringer Mannheim Biochemicals (Indiana), después se utilizó para hibridarse al análisis de la transferencia Northern de múltiples tejidos según las instrucciones del fabricante. Se generaron autorradiografías utilizando una película Biomax con un tiempo de exposición de 18 horas, se revelaron utilizando un dispositivo explorador Umax y se realizó un barrido utilizando Adobe Photoshop.

Resultados. El patrón de expresión tisular observado utilizando una sonda de bikunina placentaria (102-159) (figura 11A) o una sonda mayor que contiene ambos dominios de Kunitz de la bikunina placentaria (figura 11B) es esencialmente el mismo que se esperaba. El mRNA de la bikunina placentaria era más abundante en el páncreas y la placenta. También se observaron niveles significativos en pulmón, cerebro y riñón, mientras que se observaron niveles menores en corazón e hígado, y el mRNA no fue detectado en el músculo esquelético. El tamaño del transcripto es de 1,95 kilobases en todos los casos, de acuerdo en gran medida con el tamaño predicho de la bikunina placentaria deducida del solapamiento de EST y de la clonación del cDNA de longitud completa descritos en las secciones anteriores.

La amplia distribución tisular del mRNA demuestra que la bikunina placentaria se expresa con amplitud. Puesto que la proteína también contiene una secuencia conductora tendrá amplia exposición al sistema inmunológico humano, lo cual requiere que sea reconocida como una autoproteína. Se obtuvieron más pruebas de la amplia distribución tisular de la expresión del mRNA de la bikunina placentaria del hecho de que algunas de las entradas de EST con homología con la bikunina placentaria (figura 4B) se derivaron de cerebro de adulto e infante humano, y de retina, mama, ovario, epitelio olfativo y placenta humanos. Por tanto, se concluye que no es probable que la administración de la proteína humana nativa a pacientes humanos produzca una respuesta inmunológica.

De forma interesante, el patrón de expresión de la bikunina placentaria recuerda, de algún modo, al de la aprotinina bovina, que se encuentra en niveles altos en el pulmón y páncreas bovinos. Para aclarar mejor el patrón de expresión de la bikunina placentaria, se determinó el RT-PCR del RNA total de las siguientes células humanas: células endoteliales de vena umbilical humana no estimuladas (HUVEC), HK-2 (línea derivada del túbulo proximal del riñón), TF-1 (línea de eritroleucemia); y leucocitos de sangre periférica humana estimulados con éster de forbol (PMA). Las sondas utilizadas:

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se diseñaron para amplificar un fragmento de cDNA que codifica la bikunina placentaria de 600 p.b. Las comparaciones se normalizaron mediante la inclusión de cebadores de actina para amplificar un fragmento de actina de 800 p.b. Mientras que el fragmento de 800 p.b. identificado en geles de agarosa con bromuro de etidio tenía la misma intensidad en todos los carriles, el fragmento de bikunina placentaria de 600 p.b. estaba ausente en las HUVEC, pero presente en cantidades significativas en todas las otras líneas celulares. Se concluyó que la bikunina placentaria no se expresa en al menos algunas células endoteliales pero sí en algunas poblaciones de leucocitos.

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Ejemplo 9 Purificación y propiedades de la bikunina placentaria (1-170) muy purificada a partir de un sistema de expresión de baculovirus/Sf9

Un fragmento grande de bikunina placentaria que contenía ambos dominios de Kunitz (bikunina (1-170); SEQ ID NO:52) se expresó en células Sf9 como sigue. El cDNA de bikunina placentaria obtenido mediante PCR (figura 4E) y contenido dentro de un vector TA (véanse los ejemplos previos) se liberó mediante digestión con HindIII y XbaI, produciendo un fragmento flanqueado por un sitio XbaI 5' y un sitio HindIII 3'. Este fragmento se purificó en gel y después se clonó en el vector M13mp19 (New England Biolabs, Beverly, MA). Se utilizó una mutagénesis in vitro (Kunkel T.A., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492) para generar un sitio PstI 3' al sitio XbaI en el extremo 5', pero 5' a la secuencia que codifica el sitio de inicio ATG, el péptido señal de la bikunina placentaria natural y la secuencia codificadora de la bikunina placentaria madura. El oligonucleótido utilizado para la mutagénesis tiene la secuencia:

49

Un codón de terminación (TAG) y un sitio BgIII/XmaI se introdujeron de forma similar en el extremo 3' del cDNA utilizando el oligonucleótido:

50

El codón de terminación está dentro del marco con la secuencia que codifica la bikunina placentaria y que provoca una terminación inmediatamente después de la lisina en el resto aminoácido 170, codificando, por tanto, un fragmento de bikunina placentaria truncado sin el dominio transmembrana putativo. El producto de la digestión con PstI y BgIII se aisló y se clonó en el vector BacPac8 para la expresión del fragmento de bikunina placentaria (1-170) que contiene ambos dominios de Kunitz pero que está truncado inmediatamente N-terminal al segmento transmembrana
putativo.

La expresión de la bikunina por células de insecto Sf9 resulta óptima con una multiplicidad de infección de 1 a 1 cuando el medio se recoge 72 h después de la infección. Después de la recolección, el sobrenadante del cultivo celular de baculovirus (2 l) se ajusta a pH 8,0 mediante la adición de Tris-HCl. La bikunina se purificó mediante cromatografía utilizando una columna de afinidad por calicreína pancreática bovina de 5 ml, como se ha descrito previamente en el ejemplo 7 para la purificación de la bikunina placentaria nativa a partir de la placenta. El material eluido se ajustó a pH 2,5 con TFA y se sometió a una cromatografía en una columna de fase inversa C18 (1,0 x 25 cm) equilibrada en acetonitrilo al 10% en TFA al 0,1% con un caudal de 1 ml/min. La bikunina se eluyó con un gradiente lineal de acetonitrilo desde 10% al 80% en TFA al 0,1% durante 40 min. Las fracciones activas se reunieron, se liofilizaron, se redisolvieron en Hepes 50 mM (pH 7,5), NaCl 0,1 M, CaCl2 2 mM, y Triton X-100 al 0,1%, y se conservaron a -20ºC hasta que se necesitaron. La concentración de la bikunina recombinante se determinó mediante análisis de aminoácidos.

Resultados. La bikunina recombinante se purificó a partir del sobrenadante de un cultivo celular de baculovirus utilizando un protocolo de purificación en 2 etapas como se muestra a continuación, para producir un inhibidor de tripsina activo (tabla 8, a continuación).

TABLA 8 Purificación de bikunina recombinante a partir del sobrenadante de un cultivo transformado

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La cromatografía del material bruto sobre una columna de afinidad por calicreína pancreática bovina inmovilizada aisló, de forma selectiva, 0,013% de la proteína y 0,67% de la actividad inhibidora de tripsina presente. La mayor parte de la actividad inhibidora de tripsina presente en el sobrenadante de partida no se une a la calicreína inmovilizada y no está relacionada con la bikunina (los resultados no aparecen). Una posterior cromatografía utilizando C18 de fase inversa produjo una mayor purificación en 5 veces, con una recuperación de 0,2%. La preparación final era muy pura mediante SDS-PAGE (figura 13), muestra una Mr de 21,3 kDa, y reacciona en inmunotransferencias con la anti-bikunina placentaria (102-159) de conejo (no se muestra). La secuenciación N-terminal (26 ciclos) produce la secuencia esperada para la bikunina placentaria madura (figura 4F) que comienza en el resto +1 (ADRER...), mostrando que el péptido señal se procesa de forma correcta en células Sf9.

La bikunina placentaria purificada a partir de células Sf9 (100 pmol) se piridiletilalquiló, se digirió con CNBr y después se secuenció sin la resolución de los fragmentos resultantes. La secuenciación durante 20 ciclos produjo los siguientes N-terminales:

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Por tanto, se recuperaron los N-terminales que se corresponden con los cuatro fragmentos esperados. Esto confirma que la proteína expresada por Sf9 contiene la secuencia del ectodominio completo de la bikunina placentaria (1-170).

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Ejemplo 10 Especificidad de inhibición de la bikunina placentaria (1-170) purificada derivada de células Sf9

Se determinó la especificidad in vitro de la bikunina recombinante utilizando los materiales y métodos descritos en los ejemplos 3, 4 y 7. Además se midió la inhibición de la calicreína tisular humana por la bikunina mediante la incubación de calicreína tisular humana 0,35 nM y bikunina recombinante en un tampón que contiene Tris 50 mM (pH 9,0), NaCl 50 mM, y Triton X-100 al 0,01%. Después de 5 minutos a 37ºC se añadieron 5 \mul de PFR-AMC 2 mM y se controló el cambio en la fluorescencia.

También se determinó la inhibición del activador de plasminógeno tisular (tPA) como sigue: el tPA (forma monocatenaria a partir de un cultivo celular de melanoma humano de Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) se preincubó con inhibidor durante 2 horas a temperatura ambiente en tampón Tris 20 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM, y azida de sodio al 0,02%. Las reacciones se iniciaron posteriormente mediante transferencia a un sistema de reaccíon que comprende las siguientes concentraciones iniciales de componentes: tPA (7,5 nM), inhibidor desde 0 a 6,6 \muM, DIle-Lpro-Larg-p-nitroanilina (1 mM) en tampón Tris 28 mM, pH 8,5, que contiene Triton X-100 al 0,004% (v/v) y azida de sodio al 0,005% (v/v). La formación de p-nitroanilina se determinó a partir de la A405nm medida después de una incubación a 37ºC durante 2 horas.

La tabla a continuación muestra la eficacia de la bikunina recombinante como inhibidor de diversas serinproteasas in vitro. Los datos se muestran comparados con datos obtenidos de una selección de inhibición utilizando bikunina recombinante o aprotinina.

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TABLA 9 Comparación de los valores de Ki para la inhibición de diversas proteasas por la bikunina placentaria recombinante (1-170) o la aprotinina

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Los resultados demuestran que la bikunina recombinante puede expresarse en células de insecto para producir un inhibidor de proteasas activo que es eficaz contra al menos cinco inhibidores de serinproteasas diferentes. La bikunina recombinante es más potente que la aprotinina contra la calicreína plasmática humana, la tripsin y la plasmina. De forma sorprendente, la bikunina recombinante es más potente que los fragmentos de bikunina derivados sintéticamente (7-64) y (102-159) contra todas las enzimas ensayadas. Estos datos demuestran que la bikunina recombinante es más eficaz que la aprotinina, utilizando ensayos in vitro, y que puede esperarse una mejor potencia in vivo.

Además de medir las potencias contra proteasas específicas, se evaluó la capacidad de la bikunina placentaria (1-170) para prolongar el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) y se comparó con la actividad asociada con la aprotinina. El inhibidor se diluyó en tampón Tris 20 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM y azida de sodio al 0,02%, y se añadió (0,1 ml) a una cubeta que contenía en su interior un coagulómetro MLA Electra® 800 Automatic Coagulation Timer (Medical Laboratory Automation, Inc., Pleasantville, NY). El instrumento se ajustó al modo APTT con un tiempo de activación de 300 segundos y el modo por duplicado. Después de la adición de 0,1 ml de plasma (Specialty Assayed Reference Plasma, lote 1-6-5185, Helena Laboratories, Beaumont, TX), el reactivo APTT (Automated APTT, lote 102345, de Organon Teknika Corp., Durhan, NC) y CaCl2 25 mM se dispensaron automáticamente para iniciar la coagulación, y el tiempo de coagulación se controló de forma automática. Los resultados (figura 14) demuestran que para doblar el tiempo de coagulación se requiere aprotinina con una concentración final de aproximadamente 2 \muM, pero para la bikunina placentaria derivada de Sf9 sólo 0,3 \muM. Estos datos demuestran que la bikunina placentaria es un anticoagulante eficaz, y resulta útil como medicamento para enfermedades que implican la activación patológica de la vía intrínseca de la coagulación.

Ejemplo 11 Medida de la diferencia de potencial traqueal en cobayas

El objetivo de este estudio es investigar el efecto de un inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz, la bikunina, y de un bloqueador del canal de sodio, la amilorida, sobre la diferencia de potencial traqueal en cobayas 3 horas después del tratamiento. Estos agentes se administraron en la tráquea cefalada mediante instilación tópica. La diferencia de potencial traqueal se controló 2 horas después durante 60 minutos. El procedimiento utilizado en este ejemplo se describe en Newton et al., en "Cilia, Mucus and Mucociliary Interactions", ed. Baum, G.L. et al., Marcel Dekker, Nueva York, 1998; Newton et al., Ped. Pulm. S17, resumen 364, 1998.

Materiales y métodos/reactivos utilizados

Se prepararon formulaciones acuosas de bikunina (1-170) (5 y 50 ug/ml (SEQ ID NO:52)) (como se describe en el ejemplo 17 a continuación) y amilorida (obtenida a partir de Sigma Chemicals, St. Louis, MO, EEUU) (100 uM), se esterilizaron mediante filtración y se ensayaron para detectar endotoxinas antes de su utilización. Estas formulaciones se prepararon en disolución salina equilibrada de Hank (HBSS), que contenía NaCl 137 mM, KCl 3 mM, KH_{2}PO_{4} 3 mM, Na_{2}HPO_{4} 8 mM, Tween-80 al 0,2%, pH 7,1), se estilizaron mediante filtración y se ensayaron para detectar endotoxinas para su utilización en este ejemplo. El HBSS se utilizó como disolución control. Se obtuvo Hypnorm® (citrato de fentanilo 0,315 mg/ml y fluanisona 10 mg/ml) de Janssen Animal Health, e Hypnovel® (midazolam 5 mg/ml) de Roche. Las cobayas macho Dunkin-Hartley (550-750 g) se obtuvieron de David Hall, Reino Unido. Las sondas con termistor se obtuvieron en Kane-May Ltd., Reino Unido.

Inducción de anestesia y administración de bikunina en los conductos respiratorios traqueales

Los animales se anestesiaron utilizando halotano. Cuando se indujo un nivel satisfactorio de anestesia se realizó una pequeña incisión por debajo de la mandíbula inferior. La tráquea se expuso y se instiló un volumen de 100 \mul de vehículo, bikunina (0,5 \mug o 5 ug) o amilorida (100 uM) en la superficie traqueal utilizando una aguja y una jeringa. Después de la inyección se selló la incisión en la piel utilizando Vetbond® (pegamento de tejidos de cianoacrilato). Entonces se dejó que los animales se recuperasen.

Preparación de cobayas para medir la diferencia de potencial traqueal

Dos horas después del tratamiento con el agente, los cobayas se anestesiaron por segunda vez con Hypnom® e Hypnovel®, y se inmovilizaron en posición supina. La temperatura rectal, medida con una sonda con termistor, se mantuvo a 37ºC mediante el ajuste manual de una lámpara de calor. Se realizó una incisión en la línea media ventral desde la mandíbula inferior a las clavículas. Utilizando disección roma se expuso una longitud de la tráquea y se biseccionó en el extremo superior del esternón. Se expuso la vena yugular externa y se canuló. La parte caudal de la tráquea se canuló entonces para que el animal pudiese respirar el aire ambiental de forma espontánea. Entonces se colocó el animal en posición supina y se mantuvo la temperatura corporal utilizando una lámpara de calor. Veinte minutos después de la inducción de la anestesia por vía intramuscular se insertó un electrodo de agar traqueal en la tráquea cefalada y se midió la diferencia de potencial traqueal durante 60 minutos. El electrodo de referencia se colocó bajo la tráquea cefalada en contacto con el cartílago de la tráquea. El sitio de la herida se cubrió para evitar que se secase.

Resultados

Tal como se muestra en la figura 15, la bikunina (5 ug) inhibe la diferencia de potencial en la tráquea de cobaya in vivo después de tres horas de tratamiento, con relación al vehículo. Se muestra el efecto de la amilorida (100 uM) y la bikunina (0,5 ug) como comparación.

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Ejemplo 12 Efecto de la bikunina sobre la velocidad del moco traqueal en cobayas

El objetivo de este estudio es investigar el efecto de un inhibidor de serinproteasas de la familia Kunitz, la bikunina, sobre la velocidad del moco traqueal de cobayas 1,5 horas después del tratamiento. Este agente se administró en la tráquea cefalada mediante instilación tópica. La VMT se controló 1,5 horas después durante 60 minutos. El procedimiento utilizado en este ejemplo se describe en Newton et al., en "Cilia, Mucus and Mucociliary Interactions", ed. Baum, G.L. et al., Marcel Dekker, Nueva York, 1998; Newton et al., Ped. Pulm. S17, resumen 364, 1998.

Materiales y métodos/reactivos utilizados

Se preparó una formulación de bikunina (1-170) (bikunina 50 ug/ml (SEQ ID NO:52)) (como se describe en el ejemplo 17 a continuación) en HBBS que contenía NaCl 137 mM, KCl 3 mM, KH_{2}PO_{4} 3 mM, Na_{2}HPO_{4} 8 mM, Tween-80 al 0,2%, pH 7,1). La formulación se esterilizó mediante filtración y se ensayó para detectar endotoxinas antes de su utilización en este ejemplo. El HBSS se utilizó como disolución control. Se obtuvo Hypnorm® (citrato de fentanilo 0,315 mg/ml y fluanisona 10 mg/ml) de Janssen Animal Health, e Hypnovel® (midazolam 5 mg/ml) de Roche. Las cobayas macho Dunkin-Hartley (550-750 g) se obtuvieron de David Hall, Reino Unido. Las sondas con termistor se obtuvieron en Kane-May Ltd., Reino Unido.

Inducción de anestesia y administración de bikunina en los conductos respiratorios traqueales

Los animales se anestesiaron utilizando halotano. Cuando se indujo un nivel satisfactorio de anestesia se realizó una pequeña incisión por debajo de la mandíbula inferior. La tráquea se expuso y se instiló un volumen de 100 ul de vehículo o bikunina (5 ug) en la superficie traqueal utilizando una aguja y una jeringa. Después de la instilación se selló la incisión en la piel utilizando Vetbond® (pegamento de tejidos de cianoacrilato). Entonces se dejó que los animales se recuperasen.

Medida de la velocidad del moco traqueal (VMT)

La VMT se controló utilizando una sonda detectora de partículas beta en miniatura colimada de plomo dispuesta para detectar la radiactividad emitida a partir de una parte alícuota inyectada de Saccharomyces cerevisiae marcado con ^{32}P, según era transportado sobre la capa mucociliar traqueal de una cobaya anestesiada (Newton y Hall, 1998). La figura 16(a) ilustra la disposición de la jeringa y la sonda beta. La figura 16(b) ilustra las cuentas detectadas por la sonda a medida que S. cerevisiae marcado con ^{32}P es transportado a lo largo de la capa mucociliar traqueal.

Setenta minutos después de la instilación de la bikunina, cada animal se anestesió por segunda vez utilizando Hyponorm® e Hyponovel®, y se inmovilizó en posición supina. La primera medida de VMT se tomó 20 minutos después. Se realizaron posteriores medidas cada 15 minutos. El procedimiento para las medidas de VMT se describe, en detalle, en Newton et al., "Cilia, Mucus and Mucociliary Interactions", ed. Baum, G.L., Preil, Z., Roth, Y., Liron., Ostfield, E., Marcel Dekker, Nueva York, 1990; y Newton et al., en Pediatric Pulmonology S17, resumen 364, 1998.

Resultados

Tal como se muestra en la figura 16(c), la bikunina (5 ug) aumenta la VMT in vivo en cobayas con relación a la disolución salina, durante un periodo sostenido de 1,5 a 2,5 horas después de la administración.

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Ejemplo 13 La bikunina disminuye la corriente de sodio de la corriente en cortocircuito (Icc) en células epiteliales bronquiales humanas (HBE)

Monocapas de células HBE terciarias cultivadas hasta la confluencia se montaron en cámaras Ussing modificadas, se sumergieron en una disolución de tampón de Krebs (KBR) y se burbujearon con 95% de O_{2}/5% de CO_{2} calentado hasta 37ºC.

Se dejó que las células se equilibrasen durante 20 minutos antes de calibrar el ruido de fondo y la resistencia de fluidos. Entonces la diferencia de potencial transepitelial se fijó a 0 mV utilizando un fijador del voltaje WPI EVC 4000. Se utilizaron electrodos Ag/AgCl para controlar la Icc. Cuando se alcanzó una línea de base estable (de forma típica a los 10-20 min), las células se trataron con amilorida (10 uM). Cuando se observó una respuesta a la amilorida se lavó con una disolución de KBR. Después de volver a la línea de base y al equilibrio se añadió bikunina (1-170) (como se describe en el ejemplo 17 a continuación) (0,5-50 ug/ml en PBS) o control de PBS. Noventa minutos después del tratamiento con el agente se añade amilorida (10 uM). Cuando la corriente es estable se añade forskolina (10 uM) y después bumetanida (100 uM).

Resultados

Tal como aparece en la figura 17, la bikunina (70 nM) inhibe la corriente de sodio in vitro en células epiteliales bronquiales humanas a lo largo de un periodo de 90 minutos. La secreción de cloruro mediada por cAMP inducida por forskolina y la resistencia de las monocapas no se vieron afectadas.

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Ejemplo 14 Efecto de una disolución salina hipertónica (al 14,4%) sobre la VMT en cobayas

El objetivo de este estudio comparativo es investigar el efecto de una disolución salina hipertónica (al 14,4% x 5 min) sobre la velocidad del moco traqueal en cobayas. Este agente se administró a la tráquea cefalada mediante un aerosol. La VMT se controló inmediatamente y cada 15 minutos durante 30 minutos. El procedimiento utilizado en este ejemplo se describe en Newton et al., en "Cilia, Mucus and Mucociliary Interactions", ed. Baum, G.L. et al., Marcel Dekker, Nueva York, 1998; Newton et al., Ped. Pulm. S17, resumen 364, 1998.

Materiales y métodos/reactivos utilizados

Se obtuvo Hypnorm® (citrato de fentanilo 0,315 mg/ml y fluanisona 10 mg/ml) de Janssen Animal Health, e Hypnovel® (midazolam 5 mg/ml) de Roche. Las cobayas macho Dunkin-Hartley (550-750 g) se obtuvieron de Harlan UK Ltd. Las sondas con termistor se obtuvieron en Kane-May Ltd., Reino Unido.

Medida de la velocidad del moco traqueal

Los animales se anestesiaron utilizando Hypnorm® e Hypnovel®. La VMT se controló utilizando una sonda detectora de partículas beta en miniatura colimada de plomo dispuesta para detectar la radiactividad emitida a partir de una parte alícuota inyectada de Saccharomyces cerevisiae marcado con ^{32}P, según era transportado sobre la capa mucociliar traqueal de una cobaya anestesiada (Newton y Hall, 1998).

La primera medida de VMT (ensayo 1) se realizó 20 minutos después de la administración. Se realizaron medidas posteriores cada 15 minutos. En el momento correspondiente a los 6 minutos antes del segundo ensayo se administró un aerosol durante 5 minutos de disolución salina (al 0,9%) o disolución salina hipertónica (al 14,4%). Las partículas marcadoras marcadas con radiactividad se administraron a través de un orificio de 0,5 um realizado en la tráquea. Un aerosol de disolución salina (al 0,9%) o disolución salina hipertónica (al 14,4%) se generó mediante un nebulizador de presión Pari. El aerosol se desconectó un minuto antes del segundo ensayo. El procedimiento para medir la VMT se describe, en detalle, en Newton et al., "Cilia, Mucus and Mucociliary Interactions", ed. Baum, G.L., Preil, Z., Roth, Y., Liron., Ostfield, E., Marcel Dekker, Nueva York, 1990; y Newton et al., en Pediatric Pulmonology S17, resumen 364, 1998.

Resultados

Tal como se muestra en la figura 18, la disolución salina hipertónica (al 14,45 x 5 min) provocó un aumento transitorio en la VMT inmediatamente después del aerosol.

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Ejemplo 15 Efecto de la amilorida sobre la VMT en cobayas

El objetivo de este estudio es investigar el efecto de la amilorida (10 mM x 20 min) sobre el moco traqueal de cobayas en cobayas anestesiadas que respiran de forma espontánea. Este agente se administró a la tráquea cefalada mediante un aerosol como se describe en el ejemplo 4. El procedimiento de medida de la VMT utilizado en este ejemplo se describe en Newton et al., "Cilia, Mucus and Mucociliary Interactions", ed. Baum, G.L. et al., Marcel Dekker, Nueva York, 1998; Newton et al., Ped. Pulm. S17, resumen 364, 1998.

Materiales y métodos/reactivos utilizados

Se preparó una formulación de amilorida (10 mM) en agua para este ejemplo. Se obtuvo Hypnorm® (citrato de fentanilo 0,315 mg/ml y fluanisona 10 mg/ml) de Janssen Animal Health, e Hypnovel® (midazolam 5 mg/ml) de Roche. Las cobayas macho Dunkin-Hartley (550-750 g) se obtuvieron de Harlan UK Ltd. Las sondas con termistor se obtuvieron en Kane-May Ltd., Reino Unido.

Medida de la velocidad del moco traqueal

Los animales se anestesiaron utilizando Hypnorm® e Hypnovel®. La VMT se controló utilizando una sonda detectora de partículas beta en miniatura colimada de plomo dispuesta para detectar la radiactividad emitida a partir de una parte alícuota inyectada de Saccharomyces cerevisiae marcado con ^{32}P, según era transportado sobre la capa mucociliar traqueal de una cobaya anestesiada. Las cobayas se anestesiaron con Hypnorm® e Hypnovel® en el momento 0. Se administró amilorida (10 mM x 20 min) mediante aerosol. La primera medida de VMT se realizó inmediatamente después y se realizaron medidas posteriores cada 15 minutos.

Resultados

Tal como se muestra en la figura 19, la amilorida (10 mM x 20 min) provoca un aumento estadísticamente significativo en la VMT 15 minutos después del aerosol.

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Ejemplo 16 La muteína doble de aprotinina disminuye la corriente de sodio de la corriente en cortocircuito (Icc) en células epiteliales bronquiales humanas cultivadas

El objetivo de este estudio es investigar el efecto de un inhibidor de serinproteasas de la familia Kunitz, la muteína doble de aprotinina, sobre la Icc in vitro. Monocapas de células HBE terciarias cultivadas hasta la confluencia se montaron en cámaras Ussing modificadas, se sumergieron en una disolución de tampón de Krebs (KBR) y se burbujearon con 95% de O_{2}/5% de CO_{2} calentado hasta 37ºC. La muteína doble de aprotinina es Des Pro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina que se describe en el ejemplo 1 del documento EP 821007, publicado el 28 de enero, 1998, incorporado como referencia en su totalidad.

Se dejó que las células se equilibrasen durante 20 minutos antes de calibrar el ruido de fondo y la resistencia de fluidos. Entonces la diferencia de potencial transepitelial se fijó a 0 mV utilizando un fijador del voltaje WPI EVC 4000. Se utilizaron electrodos Ag/AgCl para controlar la Icc. Cuando se alcanzó una línea de base estable (de forma típica a los 10-20 min), las células se trataron con amilorida (10 uM). Cuando se observó una respuesta a la amilorida se lavó con una disolución de KBR. Después de volver a la línea de base y al equilibrio se añadió bikunina (5 ug/ml), muteína doble de aprotinina (0,5 a 5 ug/ml), aprotinina (1,5 a 5 ug/ml) o PBS. Noventa minutos después del tratamiento con el agente se añade amilorida (10 uM).

Resultados

Tal como aparecen en la figura 20, la muteína doble de aprotinina (0,5 a 5 ug/ml) inhibe, de una forma dependiente de la dosis, la corriente de sodio in vitro en células epiteliales bronquiales a lo largo de un periodo de 90 minutos.

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Ejemplo 17 Expresión, purificación y actividad inhibidora de proteasas comparativa de la bikunina placentaria (1-170) expresada en células de ovario de hámster chino (CHO) (a) Desarrollo de líneas celulares de CHO estables de alta producción que expresan bikunina

Se desarrollaron líneas celulares de producción estable que segregan grandes cantidades de bikunina mediante la transfección de células CHO (dhrf-) con el vector de expresión que aparece en la figura 27. El vector se construye utilizando técnicas de DNA recombinante convencionales. Una descripción de la construcción del vector de expresión y el sistema de expresión de células CHO puede encontrarse en el documento U.S.S.N 09/441.654, presentado el 12 de noviembre, 1999, titulado "Method of Producing Glycosylated Bikunin", por el inventor Sam Chan. Brevemente, el vector de expresión pBC-BK se construyó clonando cDNA de bikunina inmediatamente cadena abajo del promotor temprano inmediato de citomegalovirus y cadena arriba de la secuencia señal de poliadenilación. El vector de expresión pBC-BK consiste en una unidad transcripcional para la bikunina, dihidrofolato-reductasa y resistencia a la ampicilina. El cDNA de bikunina se retira del vector de clonación mediante enzimas de restricción, se crean extremos romos y se acopla con pBC linealizado. La linealización de pBC se realiza mediante una única digestión con enzimas de restricción. La orientación del cDNA de bikunina se confirma mediante secuenciación.

Aproximadamente 1 x 10^{6} células CHO (ovario de hámster chino) se transfectaron con 10 \mug de pBC-BK utilizando reactivos de lipofectina (Life Technolgy, Bethesda, Martyland) según las instrucciones del fabricante. Las células entonces se seleccionaron en presencia de metotrexato 50 nM y se cultivaron en medio DME/F12 deficiente en timidina e hipoxantina, más suero bovino fetal dializado al 5%. Las poblaciones celulares se seleccionaron para detectar producción de bikunina con un ensayo cromogénico. Brevemente, patrones de bikunina o fluido de cultivo se diluyeron en serie y se incubaron con un volumen igual de calicreína a 37ºC durante 30 minutos, después de lo cual se añadió un sustrato cromogénico, N-benzoil-Pro-Phr-Arg-pNA. La reacción se incubó durante 15 minutos antes de la adición de ácido acético al 50%. La cantidad de p-nitroanilida liberada se midió a 405 nM. Las poblaciones de alta producción se volvieron a seleccionar en medio que contenía concentraciones crecientes de metotrexato (metotrexato desde 100 a 400 nM) y se seleccionaron para detectar la producción de bikunina. Entonces se aplicó una clonación de dilución limitante para obtener clones con una productividad alta y estable. La clonación se realiza en ausencia de metotrexato empleando técnicas de cultivo tisular convencionales depositando 1 célula/pocillo en placas de 96 pocillos. Se eligió un clon denominado FD3-1 para la evaluación de la productividad en un biorreactor y se depositó el 12 de noviembre, 1999, en American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, y se asignó la denominación de depósito de patentes PTA-940.

(b) Producción exenta de suero de bikunina en un biorreactor de perfusión

Se realizó una producción continua de bikunina mediante una fermentación de perfusión continua. Un fermentador Wheaton de 1,5 litros se inoculó con una línea celular CHO estable a 2 x 10^{6} células/ml y se perfusionó con una velocidad de intercambio de medio de 0,5 litros/día. El medio de producción es un medio basado en DME/F12 suplementado con insulina (10 \mug/ml) y FeSO_{4}\cdotEDTA (50 \muM). La densidad celular se mantiene a 4 x 10^{6} células/ml. El rendimiento diario medio del fermentador era aproximadamente 20 mg/día. La producción de bikunina se mantuvo de forma estable durante 21 días.

(c) Purificación de bikunina (1-170) producida a partir de un sistema de expresión de células CHO

La bikunina producida a partir de células CHO se purificó utilizando técnicas de cromatografía convencionales que implican un intercambio iónico, un quelado de metales y una cromatografía de exclusión molecular como se indica en la figura 29.

La columna SP (18 x 10 cm, 2,5 l) se preparó con SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) y se equilibró. Las células CHO recogidas y filtradas en frío (TCF) se diluyeron 1:2,5 con agua estéril fría, y el pH se ajustó a 5,0. Se realizó una cromatografía a temperatura ambiente con tampones fríos. El material de partida frío se cargó en la columna a 800 ml/min (189 cm/hora). La cantidad de bikunina cargada en la columna varía desde 0,888-1,938 g (aproximadamente 14 mg/l). Después de cargar, la columna se lava con tampón de equilibrio y la bikunina se eluye con tampón de elución. El eluato se recoge a 2-8ºC (en un baño de hielo) y se ajusta inmediatamente a pH 7 con NaOH 6 N. La columna se lava, después se sanea con NaOH 1 N frío (2-8ºC) y se conserva a 2-8ºC en etanol al 20% hasta que se vuelve a utilizar. El tampón de equilibrio y lavado contiene NaCl 50 mM, NaH_{2}PO_{4} 30 mM, pH 5,0; el tampón de elución contiene NaCl 350 mM, NaH_{2}PO_{4} 30 mM, pH 5,0; y el tampón de ajuste del pH es ácido cítrico 1 M, NaH_{2}PO_{4} 1 M, pH 2,4.

El eluato de SP-Sepharose descongelado se concentra mediante ultrafiltración (UF) aproximadamente 10 veces para reducir el volumen antes de realizar una diafiltración (DF) de 5 a 7 veces en preparación para la cromatografía de intercambio aniónico. Todas las operaciones se realizaron a temperatura ambiente en una campana de flujo horizontal. La UF/DF utilizan un sistema de "mini"-filtro Pellicon 2 de Millipore (Bedford, MA) y dos cartuchos de celulosa regenerada de 10 kDa (P2C010C01). Las velocidades de flujo son aproximadamente 130 \pm 20 ml/min para el sistema de dos cartuchos y se mantuvieron regulando las presiones de entrada y salida entre 151,68 y 179,26 kPa, y 82,74 y 110,31 kPa, respectivamente. La circulación se realiza con una bomba peristáltica; la recirculación se ajustó desde 500 a 600 ml por minuto antes del ajuste de la presión transmembrana. La diafiltración se realizó con tampón NaH_{2}PO_{4} 10 mM frío, pH 8,1.

La cromatografía en columna de Q-Sepharose se realizó como sigue. Una columna de 13 x 9 cm de 1,2 l de Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) se lavó con 5 volúmenes de columna (VC) de agua estéril y se equilibró con aproximadamente 10 VC de tampón de equilibrio. El eluato SP diafiltrado se ajustó a pH 8,1 y se aplicó a la columna de Q-Sepharose a 100 ml/min (45 cm/hora). La cantidad de bikunina cargada en la columna varía desde 1121-2607 mg (aproximadamente 15 mg/ml). Después de cargar, la columna se lavó con tampón de equilibrio hasta que la absorbancia de UV a A280 alcanza la línea de base; después se eluye la bikunina. El eluato se recoge y se utiliza como material de alimentación para Zn-IMCA, una cromatografía de adsorción de iones metálicos inmovilizada con cinc. La columna se lavó con NaOH 1 M, se enjuagó con agua estéril y se conservó en etanol al 20%. Todas las operaciones se realizaron a 2-8ºC. El tampón de equilibrio y lavado para la columna de Q-Sepharose contiene NaH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 8,1. El tampón de elución contiene NaH_{2}PO_{4} 10 mM, NaCl 100 mM, pH 8,1.

Una columna de Zn-IMAC (5 x 10 cm) que contiene un volumen de lecho de aproximadamente 200 ml de Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia) se cargó con 3 volúmenes de disolución de ZnSO_{4} (véase a continuación), se lavó con 2 volúmenes de agua estéril, y se equilibró con 6 volúmenes de tampón como se describe a continuación. El eluato de Q-Sepharose se ajustó a pH 7,4 y se aplicó NaCl 300 mM (mediante la adición de NaCl sólido) a Zn-IMAC a 30 ml/min (92 cm/hora de velocidad lineal), y después la columna se lavó con tampón de equilibrio hasta que la absorbancia de UV alcanza la línea de base. La cantidad de bikunina cargada en la columna varía desde 0,097-1,681 g (aproximadamente 0,63 mg/ml). La corriente y el lavado se recogieron para UF. La columna se destiló y se saneó con NaOH 0,5 M. Todas las operaciones de esta etapa se realizaron a 2-8ºC. El tampón de equilibrio para Zn-IMAC contiene NaH_{2}PO_{4} 10 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4; el tampón de destilado contiene EDTA 50 mM, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4; y la disolución de carga es ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O 2 mg/ml.

La corriente de Zn-IMAC se concentró mediante ultrafiltración en 5 veces con el sistema Pellicon 2 (Millipore) para una cromatografía en Sephacryl S-200. Los caudales del permeato eran aproximadamente 60 a 70 ml/min, y se mantuvieron como se describió anteriormente. La recirculación era desde 400 a 500 ml/min.

Una columna (10 x 58,5 cm) que contiene 4,59 l de Sephacryl S-200 High Resolution (Pharmacia) se equilibró con NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, KH_{2}PO_{4} 2,9 mM, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, Na_{2}H_{2}PO_{4} 8 mM, Tween 80 2 mg/l, pH 7,2. El caudal es de 30 ml/min (23 cm/hora). En un ensayo típico se aplican a la columna 1475 mg de bikunina en un volumen de 95 ml.

La agrupación post-S-200 se trató con resina Etox de un modo discontinuo para la eliminación de cualquier pirógeno potencial. La resina ActiClean Etox 2705 (Sterogene Bioseparations, Inc.) se enjuagó con NaOH 1 M y se incubó durante 5 horas en NaOH 1 M a temperatura ambiente con agitación. La resina se lavó y se equilibró con PBS, pH 7,2. Se añadieron 80 ml de la resina filtrada y equilibrada a 1063 ml de la agrupación de bikunina S200 (5460,11 mg) y se agitó durante la noche a 2-8ºC. La resina Etox después se eliminó mediante filtración con un filtro de matraz Nalgene de 0,2 micras.

Resultados. La tabla 10 muestra el rendimiento medio conseguido en cada etapa.

TABLA 10

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El rendimiento global de bikunina es aproximadamente 30% con una pureza de 95%. Los datos de espectroscopía de masas también sugieren que además de las moléculas de bikunina de longitud completa (1-170), las especies que carecen de tres (G-S-K) y cuatro (L-G-S-K) aminoácidos del extremo carboxi de la bikunina (1-170) estaban presentes en la agrupación de proteínas puras. El material producido era estable a la degradación cuando se expuso a una incubación durante 72 horas a temperatura ambiente, o a 37ºC en pH neutro. La secuenciación N-terminal, la electroforesis en gel, la inmunotransferencia y el análisis de aminoácidos indican que la bikunina era sustancialmente pura (no se detectaron otras secuencias). Otra etapa de cromatografía de fase inverse reveló que la bikunina purificada derivada de CHO todavía podía fraccionarse en varias especies (figura 30A). La bikunina de CHO (8,5 mg) se ajustó a pH 2,5 con ácido trifluoroacético (TFA, concentración final al 0,1%) y se sometió a una cromatografía en una columna de fase inversa C18 (Vydac, 2,5 x 25 cm) equilibrada en acetonitrilo al 17,5% y TFA al 0,1% con un caudal de 2 ml/min. La bikunina de CHO se eluyó con un gradiente lineal de acetonitrilo al 17,5-40% en TFA al 0,1% durante 60 min. La figura 30B muestra el perfil de SDS-PAGE teñido con plata de estas fracciones (el carril entre 54 y 55 representa los marcadores de peso molecular).

El análisis de carbohidratos preliminar se realizó con las formas glicosiladas de la bikunina de CHO que tienen un PM que varía desde aproximadamente 21 kDa a aproximadamente 38 kDa. El contenido en azúcar total era 7,5%. Ambos sitios N-unidos (Asn-30 y Asn-67) estaban ocupados por estructuras de carbohidratos. Los análisis cromatográficos y espectrométricos de masas confirman la presencia de estructuras de oligosacáridos muy heterogéneas y ramificadas que contribuyen a la heterogeneidad de tamaño observada para la bikunina purificada. Aproximadamente 90% de los oligosacáridos estaban sialilados y el resto de las estructuras son neutras. Cuando se tratan con N-glicosidasa F, las isoformas glicosiladas de bikunina de CHO (figura 30B) se convirtieron en una única isoforma de 18 kDa (véase la figura 31).

El contenido en ácido siálico de la bikunina se analizó mediante incubación con sialidasa en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,0, durante 18 horas en un tubo de microcentrífuga tapado. Los ácidos siálicos se separaron en una columna de intercambio aniónico Carbo Pac PA1 utilizando un gradiente de tampón de acetato de sodio 20-250 mM en NaOH 100 mM durante 50 minutos con un caudal de 1 ml/min. La detección se realizó con un detector electroquímico pulsado y se cuantificó comparando los tiempos de retención y las áreas de los picos de las muestras con patrones de ácidos siálicos (ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glutarilneuramínico). Los resultados se muestran en la
tabla 11.

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TABLA 11 Composición de ácido siálico de la bikunina

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Ejemplo 18 Actividad inhibidora de proteasas comparativa de la bikunina placentaria (1-170) expresada en células de ovario de hámster chino (CHO)

General. La especificidad in vitro de la bikunina recombinante se determinó utilizando los materiales y métodos según se describió en los ejemplos 3, 4, 7 y 10. La tabla 12 a continuación muestra la eficacia de la bikunina recombinante como inhibidor de diversas serinproteasas in vitro. Los datos se muestran utilizando bikunina recombinante o aprotinina.

Proteasas. La cuantificación de plasmina humana y calicreína plasmática humana se realizó mediante valoración de sitio activo utilizando HCl de p'-guanidinobenzoato de p-nitrofenilo como se describió previamente (Chase, T. y Shaw, E., 1970, Methods Enzmol., 19, 20-27). La calicreína tisular humana (Bayer, Alemania) se cuantificó mediante valoración de sitio activo utilizando aprotinina bovina como patrón y PFR-AMC como sustrato, suponiendo una formación de complejo 1:1. La K_{m} para GPK-AMC con plasmina con las condiciones utilizadas es 726 \muM; la K_{m} para PRF-AMC con calicreína plasmática humana es 457 \muM; y la K_{m} para PFR-AMC con calicreína tisular humana es 5,7 \muM.

Cinética de inhibición. La inhibición de la plasmina humana por bikunina placentaria (1-170) expresada por CHO y aprotinina se determinó con plasmina (50 pM) y bikunina placentaria (1-170) expresada por CHO (0-2 nM) o aprotinina (0-4 nM) en tampón que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 0,1 M, y Triton X-100 al 0,02%. Después de 30 minutos de incubación a 37ºC se añadieron 25 \mul de GPK-AMC 20 mM y se controló el cambio en la fluorescencia. La inhibición de la calicreína plasmática humana por la bikunina placentaria (1-170) expresada por CHO o la aprotinina se determinó utilizando calicreína (0,2 nM) y bikunina placentaria (1-170) expresada por CHO (0-4 nM) o aprotinina (0-45 nM) en Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 50 mM, y Triton X-100 al 0,02%. Después de 30 minutos a 37ºC se añadieron 5 \mul de PFR-AMC 20 mM y se controló el cambio en la fluorescencia.

La inhibición de la calicreína tisular humana por la aprotinina o la bikunina placentaria (1-170) expresada por CHO se midió mediante la incubación de calicreína tisular humana 0,35 nM con bikunina placentaria (1-170) expresada por CHO (0-10 nM) o aprotinina (0-0,5 nM) en un volumen de reacción de 1 ml que contenía tampón Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, NaCl 50 mM, y Triton X-100 al 0,1%. Después de 5 minutos a 37ºC se añadieron 5 ul de PFR-AMC 2 mM logrando una concentración final de 10 uM, y se controló el cambio en la fluorescencia.

La inhibición del factor XIa (de Enzyme Research Labs, South Bend, IN) se midió incubando FXIa (0,1 nM) con bikunina placentaria (1-170) expresada por CHO desde 0 a 40 nM, o aprotinina desde 0 a 4 uM, en tampón que contiene Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl2 2 mM, Triton X-100 al 0,01%, y BSA al 1% en un volumen total de 1 ml. Después de 30 minutos a 37ºC se añadieron 10 ul de Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-AMC 40 mM (Bachem Biosciences, King of Prussia, PA), y se controló el cambio en la fluorescencia.

La constante de inhibición aparente K_{i}* se determinó utilizando el programa de análisis de datos de regresión no lineal Enzfitter (Biosoft, Cambridge, Reino Unido). Los datos cinéticos de cada experimento se analizaron en términos de la ecuación para un inhibidor de unión fuerte:

(2)V_{i}/V_{0} = 1 - (E_{0} + I_{0} + K_{i}\text{*} - [(E_{0} + I_{0} + K_{i}\text{*})^{2} - 4E_{0}I_{0}]^{1/2})/2E_{0}

en la que V_{i}/V_{0} es la actividad enzimática fraccionaria (proporción de inhibición frente a no inhibición), y E_{0} e I_{0} son las concentraciones totales de la enzima y el inhibidor, respectivamente. Los valores de K_{i} se obtuvieron corrigiendo para el efecto del sustrato según la ecuación:

(3)K_{i} = K_{i}\text{*}/(1 + [S_{0}]/K_{m})

(Boudier, C. y Bieth, J.G., 1989, Biochim. Biophys. Acta, 995:36-41).

Resultados. Los valores de K_{i} se listan en la tabla 12 a continuación.

TABLA 12 Comparación de los valores de Ki para la inhibición de diversas proteasas por la bikunina (1-170) de CHO o la aprotinina

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Los resultados demuestran que la bikunina recombinante puede expresarse en células CHO para producir un inhibidor de proteasas activo que es eficaz contra al menos tres serinproteasas diferentes. La bikunina recombinante es más potente que la aprotinina contra la calicreína plasmática humana y la FXIa humana. Era equipotente con la aprotinina para inhibir la plasmina humana.

Ejemplo 19 La aprotinina disminuye in vitro la corriente de sodio de la corriente en cortocircuito (Icc) en células epiteliales bronquiales de fibrosis quística humanas cultivadas

Se aislaron células HBE a partir de tejido de trasplante de pulmón de pacientes con FQ y se cultivaron en matraces revestidos con colágeno durante una semana. Las células entonces se subcultivaron y se sembraron sobre filtros revestidos de colágeno Transwell Costar (0,33 cm^{2}) y se cultivaron en medio DMEM/F12 suplementado con Ultroser G al 2%. Las células se cultivaron en una interfase aire-líquido y se utilizaron de 2 a 4 semanas después de la siembra.

Las células en los filtros Transwell se montaron en cámaras Costar Ussing modificadas y se estudiaron bajo conciones Icc. Los valores de la línea de base de Icc se registraron (desde 0 a 10 minutos) y después se añadió aprotinina (1 mg/ml en PBS) en el lado apical. Se registró la Icc durante 100 minutos y después el fluido del baño apical se cambió por tampón fresco. Se añadió tripsina (100 unidades BAEE/ml) al lado apical y se registró la Icc durante 10 minutos. Entonces se añadió amilorida (10 uM) al lado apical y se registó la Icc durante 10 minutos más.

Resultados. Tal como se muestra en la figura 21, la aprotinina (1 mg/ml en PBS) inhibe la Icc in vitro en células epiteliales bronquiales de FQ humanas a lo largo de un periodo de 100 minutos. Después de lavar, la Icc aumenta mediante el tratamiento de la superficie apical con la serinproteasa tripsina. Por último, la adición de amilorida (10 uM) demuestra que los cambios en la Icc son el resultado de cambios en la corriente dependiente de sodio.

Ejemplo 20 Evaluación de la actividad de la bikunina (1-170) después de una nebulización

El objetivo de este estudio es evaluar la actividad antiproteasa de la bikunina (1-170) descrita en el ejemplo 17, después de una nebulización. Todos los estudios se realizaron con bikunina formulada en disolución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 (NaCl 137 mM, KCl 3 mM, KH_{2}PO_{4} 3 mM, Na_{2}HPO_{4} 8 mM, Tween 80 0,02 g/l).

Métodos de nebulización

Nebulizador de medicación Raindrop®: La bikunina se transformó en aerosol a concentraciones de 1 y 3 mg/ml. La copa del nebulizador se llenó con 2,5 ml de disolución de bikunina. La aerosolización se realizó a 7,35 l/min o 241,32 kPa.

Nebulizador de colisión: La bikunina se transformó en aerosol a una concentración de 4,7 mg/ml. La copa del nebulizador se llenó con 2,5 ml de disolución de bikunina. La aerosolización se realizó a 241,32 kPa.

Recogida de las muestras nebuilizadas

La bikunina aerosolizada se recogió utilizando un colisionador doble (6,4 um de tamaño de límite de exclusión de partículas aerodinámico a 60 l/min a través del sistema). El colisionador actúa basándose en el principio de la colisión de líquidos, y divide el aerosol en una fracción no respirable (> 6,4 um recogidos en la etapa 1) y una fracción respirable (< 6,4 um recogidos en la etapa 2).

Medida de la actividad antiproteasa

Se midió la actividad de la bikunina in vitro mediante su inhibición de la calicreína plasmática humana.

Resultados

Nebulizador de medicación Raindrop®: Los valores de actividad (Ki) de las muestras de pre- y postnebulización son como sigue: bikunina 1 mg/ml, los valores de Ki son 0,48(\pm0,02) y 0,76(\pm0,04), respectivamente; y bikunina (1-170) 3 mg/ml, los valores de Ki son 0,52(\pm0,03) y 0,62(\pm0,03), respectivamente.

Nebulizador de colisión: Los valores de actividad (Ki) de las muestras de pre- y postnebulización son 0,27(\pm0,03) y 0,45(\pm0,03), respectivamente.

Conclusión

Las muestras de bikunina de pre- y postnebulización de los nebulizadores Raindrop® y de colisión muestran actividades similares (valores de Ki similares dentro de la variabilidad del ensayo), indicando que la bikunina (1-170) es estable frente a la aerosolización y mantiene su actividad antiproteasa después de la nebulización.

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Ejemplo 21 El efecto de la bikunina sobre la velocidad del moco traqueal en ovejas

El objetivo de este estudio es investigar el efecto de un inhibidor de serinproteasas de la familia Kunitz, la bikunina (1-170), descrito en el ejemplo 17, sobre la velocidad del moco traqueal de ovejas a lo largo de 8 horas después del tratamiento. Este agente se administró mediante aerosol nebulizado a los conductos respiratorios. El procedimiento utilizado en este ejemplo se describe en O'Riordan et al., J. Applied Physiol., 85(3), 1086-1091, 1998.

Medida de la VMT

Se sujetaron ovejas adultas en posición erguida, con las cabeza inmovilizadas, con un arnés corporal especializado. Se intubaron nasalmente con un tubo endotraqueal, con el manguito colocado justo por debajo de las cuerdas vocales. El aire inspirado se calentó y humidificó. Para minimizar la posible disminución de la VMT provocada por los manguitos inflados, el manguito del tubo endotraqueal permanece desinflado a lo largo del estudio, excepto durante el periodo de la administración del aerosol.

Para medir la VMT se insuflaron 5 a 10 partículas de teflón radiopacas (aproximadamente 1 mm de diámetro, 0,8 mm de espesor, y un peso desde 1,5 a 2 mg) en la tráquea a través de un catéter colocado dentro del tubo endotraqueal. El movimiento de las partículas de teflón se midió entonces durante un periodo de 1 minuto. El procedimiento utilizado en este ejemplo se describe en Russi et al., J. Applied Physiol., 59(5), 1416-1422, 1985. Un collar que contiene marcadores radiopacos de longitud conocida se aplicó al exterior de los animales y se utilizó como patrón para convertir la distancia atravesada por las partículas en la pantalla de video en la distancia real recorrida. La VMT se calculó a partir de la distancia media en una dirección cefalada recorrida por minuto para 5 a 10 partículas de teflón. La línea de base de la VMT se midió inmediatamente antes de la administración del aerosol.

Sustancias de ensayo: PBS, bikunina 1 mg/ml en PBS, o bikunina 3 mg/ml en PBS; se administraron a los conductos respiratorios de las ovejas como un aerosol (3 ml) generado utilizando un nebulizador de chorro Raindrop® que funcionaba con un caudal que produce gotas de diámetro aerodinámico mediano de masa de 3,6 um. La VMT se midió inmediatamente después de la administración de la sustancia de ensayo (0 horas), y después a las 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 horas.

Resultados

Tal como se muestra en la figura 22, 9 mg de aerosol de bikunina (3 ml de 3 mg/ml) administrados a los conductos respiratorios de las ovejas aumentan significativamente la VMT a las 0, 0,5, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 horas, comparado con los mismos momentos para un grupo de animales que reciben un aerosol con el vehículo PBS. A las 24 horas, la VMT había vuelto a unas velocidades de línea de base en el grupo de tratamiento con bikunina y en el grupo con vehículo PBS.

A una dosis menor (3 mg de aerosol de bikunina (3 ml de 1 mg/ml)) no se observaron diferencias significativas en la VMT entre los grupos de tratamiento y vehículo en cualquier momento estudiado.

Ejemplo 22 La bikunina (50 ug/ml) disminuye la corriente de sodio de la corriente en cortocircuito (Icc) en células epiteliales traqueales de cobaya (GPTE) cultivadas

El objetivo de este estudio es investigar el efecto de la bikunina (1-170) (véase el ejemplo 17) sobre la Icc en células GPTE in vitro. Las células GPTE se sembraron sobre insertos de 1,2 cm de diámetro y tamaño de poro 0,4 um Snapwell^{TM} (Costar UK). Las células se cultivaron hasta la confluencia y se montaron en cámaras Ussing modificadas 2-4 días después de colocarlas en la interfase aire-líquido. Los insertos se sumergieron en disolución de tampón de Krebs (KBR) y se burbujearon con 95% de O_{2}/5% de CO_{2} calentado hasta 37ºC.

Después de un periodo de equilibrio de 20 minutos, la la diferencia de potencial transepitelial se fijó a 0 mV utilizando un fijador del voltaje WPI EVC 4000. Se utilizaron electrodos Ag/AgCl para controlar la Icc. Cuando se alcanzó una línea de base estable (de forma típica a los 20-30 min), las células se trataron con amilorida (30 uM). Cuando se obtuvo una respuesta a la amilorida se lavó con una disolución de KBR. Después de volver a la línea de base y al equilibrio se añadió bikunina (1-170) descrita en el ejemplo 17 (10 a 50 ug/ml) o PBS. Treinta minutos después del tratamiento con el agente se añade amilorida (30 uM).

Resultados

Tal como se muestra en la figura 23, la bikunina (1-170) (50 ug/ml) inhibe la corriente de sodio in vitro en células epiteliales traqueales de cobaya a lo largo de un periodo de 30 minutos.

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Ejemplo 23 La bikunina (1-170) (100 ug/ml) disminuye la corriente de sodio de la corriente en cortocircuito (Icc) en células epiteliales traqueales ovinas (OTE) cultivadas

El objetivo de este estudio es investigar el efecto de la bikunina (1-170) (véase el ejemplo 17) sobre la Icc en células OTE in vitro. Las células OTE se sembraron sobre insertos de 1,2 cm de diámetro y tamaño de poro 0,4 um Snapwell^{TM} (Costar UK). Las células se cultivaron hasta la confluencia y se montaron en cámaras Ussing modificadas 3-5 días después de colocarlas en la interfase aire-líquido. Los insertos se sumergieron en disolución de tampón de Krebs (KBR) y se burbujearon con 95% de O_{2}/5% de CO_{2} calentado hasta 37ºC.

Después de un periodo de equilibrio de 20 minutos, la la diferencia de potencial transepitelial se fijó a 0 mV utilizando un fijador del voltaje WPI EVC 4000. Se utilizaron electrodos Ag/AgCl para controlar la Icc. Cuando se alcanzó una línea de base estable (de forma típica a los 30 min), las células se trataron con amilorida (10 uM). Cuando se obtuvo una respuesta a la amilorida se lavó con una disolución de KBR. Después de volver a la línea de base se añadió bikunina (1-170) descrita en el ejemplo 17 (25, 50 ó 100 ug/ml) o PBS. Noventa minutos después del tratamiento con el agente se añade de nuevo amilorida (10 uM).

Resultados

Tal como se muestra en la figura 24, la bikunina (1-170) (100 ug/ml) inhibe significativamente la corriente de sodio in vitro en células epiteliales traqueales ovinas a lo largo de un periodo de 90 minutos.

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Ejemplo 24 Efecto de la bikunina (1-170) sobre la diferencia de potencial traqueal en cobayas pretratadas con LPS

La inflamación de los conductos respiratorios dominada por leucocitos polimorfonucleares (PMN) (neutrófilos) a menudo es una característica de la enfermedad pulmonar FQ. En cobayas, la exposición a un aerosol de lipopolisacáridos (LPS) de E. coli induce un marcado influyo de PMN en el fluido de lavado broncoalveolar 24 horas después de la exposición. El objetivo de este estudio es investigar el efecto de la bikunina (1-170) descrita en el ejemplo 17 sobre la diferencia de potencial traqueal en cobayas preexpuestas a un aerosol de LPS. Los agentes se administraron a la tráquea cefalada mediante instilación tópica. La diferencia de potencial traqueal se controló a lo largo de 60 minutos, 23 horas después de la exposición a LPS.

Materiales/reactivos

La bikunina (1-170) se formuló en disolución salina equilibrada de Hank (HBSS). La amilorida se obtuvo en Sigma Chemicals y se formuló en HBSS. El vehículo control es HBSS. Se obtuvo Hypnorm® (citrato de fentanilo 0,315 mg/ml y fluanisona 10 mg/ml) de Janssen Animal Health, e Hypnovel® (midazolam 5 mg/ml) de Roche. Las cobayas macho Dunkin-Hartley (600-700 g) se obtuvieron de Harlan UK. Las sondas con termistor se obtuvieron en Kane-May Ltd., Reino Unido.

Inducción de un influjo de PMN

Los animales individuales se expusieron a un aerosol de 0,03 mg/ml de LPS o PBS durante 10 minutos.

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Preparación de los cobayas para medir la diferencia de potencial traqueal

A las 23,4 horas después del tratamiento con LPS, los cobayas se anestesiaron con Hypnorm® e Hypnovel®, y se inmovilizaron en posición supina. Se realizó una incisión en la línea media ventral desde la mandíbula inferior a las clavículas. Utilizando disección roma se expuso una longitud de la tráquea y se biseccionó en el extremo superior del esternón. Se expuso la vena yugular externa y se canuló. La parte caudal de la tráquea se canuló entonces para que el animal pudiese respirar el aire ambiental de forma espontánea. Entonces se colocó el animal en posición supina y se mantuvo la temperatura corporal a 37ºC mediante ajuste manual de una lámpara de calor. La temperatura rectal se controló con una sonda con termistor.

Veinte minutos después de la inducción de la anestesia se instiló por vía tópica bikunina (50 mg/ml) o amilorida (100 uM) a la tráquea cefalada. Entonces se insertó el electrodo de agar traqueal en la tráquea cefalada y se midió la diferencia de potencial traqueal durante 60 minutos. El electrodo de referencia se colocó bajo la tráquea cefalada en contacto con el cartílago de la tráquea. El sitio de la herida se cubrió para evitar que se secase.

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Resultados

Tal como se muestra en la figura 25(a), la exposición a LPS provoca un influjo de PMN significativo. La bikunina inhibe de forma significativa la diferencia de potencial en cobayas preexpuestas a LPS, como se muestra en la figura 25(b).

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Ejemplo 25 Efecto de la muteína doble de aprotinina sobre la velocidad del moco traqueal en cobaya

El objetivo de este estudio es investigar el efecto de la muteína doble de aprotinina descrita en el ejemplo 16 sobre la velocidad del moco traqueal de cobaya 1,5 horas después del tratamiento. Este agente se administró a la tráquea cefalada mediante instilación tópica. La VMT se controló 1,5 horas después durante 60 minutos.

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Materiales/reactivos

La muteína doble de aprotinina (véase el ejemplo 16) se obtuvo de Biotechnologie, Bayer AG, Alemania, EEUU, y se formuló en disolución salina equilibrada de Hank (HBSS). Se obtuvo Hypnorm® (citrato de fentanilo 0,315 mg/ml y fluanisona 10 mg/ml) de Janssen Animal Health, e Hypnovel® (midazolam 5 mg/ml) de Roche. Las cobayas macho Dunkin-Hartley (600-750 g) se obtuvieron de Harlan UK. Las sondas con termistor se obtuvieron en Kane-May Ltd., Reino Unido.

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Inducción de la anestesia

Los animales se anestesiaron utilizando halotano. Cuando se indujo un nivel satisfactorio de anestesia, se realizó una pequeña incisión bajo la mandíbula inferior. La tráquea se expuso y se inyectaron 100 ul de vehículo o muteína doble de aprotinina (10 ug) en el lumen de los conductos respiratorios utilizando una aguja y una jeringa. Después de la inyección, la piel sobre el sitio de inyección traqueal se reparó. Entonces se dejó que los animales se recuperasen.

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Medida de la velocidad del moco traqueal

La velocidad del moco traqueal (VMT) se controló utilizando una sonda detectora de partículas beta en miniatura colimada de plomo dispuesta para detectar la radiactividad emitida a partir de una parte alícuota inyectada de Saccharomyces cerevisiae marcado con ^{32}P, según era transportado sobre la capa mucociliar traqueal de una cobaya anestesiada (Newton y Hall, 1998). Setenta minutos después de la instilación del agente de ensayo, los cobayas se anestesiaron por segunda vez con Hyponorm® e Hyponovel®, y se inmovilizaron en posición supina. La primera medida de VMT se tomó 20 minutos después.

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Resultados

Tal como se muestra en la figura 26, la muteína doble de aprotinina (10 ug) aumenta la VMT in vivo en cobayas, con relación al HBSS, durante un periodo sostenido de 1,5 a 2,5 horas después de la administración.

Ejemplo 26 La bikunina (1-170) disminuye la corriente de sodio de la corriente en cortocircuito (Icc) in vitro en células epiteliales bronquiales de fibrosis quística humanas cultivadas

Las células HBE se aislaron a partir de tejido de trasplante de pulmón de pacientes con FQ y se cultivaron en matraces revestidos con colágeno durante una semana. Las células entonces se subcultivaron y se sembraron sobre filtros revestidos de colágeno Transwell Costar (0,33 cm^{2}) y se cultivaron en medio DMEM/F12 suplementado con Ultroser G al 2%. Las células se cultivaron en una interfase aire-líquido y se utilizaron de 2 a 4 semanas después de la siembra.

Las células en los filtros Transwell se montaron en cámaras Costar Ussing modificadas y se estudiaron bajo conciones Icc. Los valores de la línea de base de Icc se registraron (desde 0 a 20 minutos) y después se añadió bikunina (1-170) (véase el ejemplo 17) (10 ug/ml en PBS) en el lado apical. Se registó la Icc durante 90 minutos y después se añadió amilorida (10 uM) y se registró la Icc durante 10 minutos más. Después el fluido del baño apical se cambió por tampón fresco, y la Icc se registró durante 15 minutos más. Se añadió tripsina (1 uM) al lado apical y se registró la Icc durante 15 minutos. Entonces se añadió amilorida (10 uM) al lado apical y se registró la Icc durante 10 minutos más.

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Resultados

Tal como se muestra en la figura 28(a), la bikunina (1-170) (10 ug/ml en PBS) inhibe la Icc in vitro en células epiteliales bronquiales de FQ humanas a lo largo de un periodo de 90 minutos. La Icc se volvió a reducir por la adición de amilorida (10 uM). Después de lavar, la Icc aumentó hasta alcanzar de nuevo la corriente antes de la adición de amilorida. Después de 15 minutos más, la superficie apical se trata con tripsina (1 uM), y esto aumenta aún más la Icc hasta el nivel de corriente de la línea de base (es decir, la observada a los 20 minutos). Por último, la adición de amilorida (10 uM) inhibe la mayor parte de la corriente, y demuestra que los cambios en la Icc son el resultado de cambios en la corriente dependiente de sodio.

La figura 28(a) demuestra que la bikunina (1-170) a 1, 5 y 10 ug/ml, y la aprotinina a 20 ug/ml, inhibe la Icc al menos 90 minutos después de la aplicación apical a células epiteliales bronquiales de FQ humanas in vitro.

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Texto libre del listado de secuencias

<210> 9

<223> /nota = "n en las posiciones 622, 679, 707 es cualquier ácido nucleico"

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<210> 10

<223> /nota = "Xaa en las posiciones 210, 226 y 233 son codones de terminación o sin sentido"

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<210> 11

<223> /nota = "Xaa en las posiciones 8, 17, 21-26, 40, 42, 45-47, 52, 64, 103, 112, 114, 116-121, 135, 137, 140-142, 147 y 159 es cualquier resto aminoácido"

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<210> 9

<223> /nota = "el resto 361 es cualquier aminoácido"

<223> /nota = "el resto 367 es cualquier aminoácido"

<223> /nota = "el resto 384 es cualquier aminoácido"

<223> /nota = "el resto 390 es cualquier aminoácido"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 13

<223> /marcador = péptido señal

<223> /nota = "Xaa en las posiciones 111, 120, 122, 128 y 130 representa un codón de terminación o sin sentido"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 14

<223> /nota = "n en las posiciones 425, 482 y 510 es cualquier ácido nucleico"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 15

<223> /nota = "Xaa en las posiciones 2, 23, 132, 160 y 167 representa un codón de terminación o sin sentido"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 16

<223> /nota = "n en las posiciones 3, 11, 12, 17, 51 y 429 representa cualquier ácido nucleico"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 17

<223> /nota = "n en las posiciones 6, 310 y 408 representa cualquier ácido nucleico"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 18

<223> /nota = "precursor 1 del inhibidor de la vía del factor tisular"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 19

<223> /nota = "precursor 1 del inhibidor de la vía del factor tisular"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 20

<223> /nota = "precursor del inhibidor de la vía del factor tisular"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 21

<223> /nota = "precursor 2 del inhibidor de la vía del factor tisular"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 22

<223> /nota = "precursor 2 del inhibidor de la vía del factor tisular"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 23

<223> /nota = "homólogo de la proteína precursora de amiloides"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 24

<223> /nota = "aprotinina"

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<210> 25

<223> /nota = "precursor del inhibidor de inter-alfa-tripsina"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 26

<223> /nota = "precursor del inhibidor de inter-alfa-tripsina"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 27

<223> /nota = "proteína precursora de amiloides"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 28

<223> /nota = "precursor del colágeno alfa-3 (VI)"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 29

<223> /nota = "HKI-B9"

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<210> 32

<223> /nota = "cDNA de un fragmento de la proteína bikunina humana"

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<210> 45

<223> /marcador = péptido señal

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 47

<223> /marcador = péptido señal

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 49

<223> /marcador = péptido señal

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<210> 50

<223> /nota = "fragmento de la proteína bikunina humana"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 51

<223> /nota = "fragmento de la proteína bikunina humana"

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<210> 52

<223> /nota = "fragmento de la proteína bikunina humana"

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<210> 53

<223> /nota = "péptido señal de la proteína bikunina humana"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 54

<223> fragmento de la proteína bikunina humana

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<210> 55

<223> /nota = "oligómero para preparar un constructo de expresión"

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<210> 56

<223> oligómero para preparar un constructo de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 57

<223> /nota = "oligómero para preparar un constructo de expresión"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 58

<223> /nota = "oligómero para preparar un constructo de expresión"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 61

<223> /nota = "oligómero para preparar un constructo de expresión de bikunina"

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<210> 62

<223> /nota = "oligómero para preparar un constructo de bikunina"

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<210> 63

<223> /nota = "fragmento de la proteína bikunina humana"

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<210> 64

<223> /nota = "fragmento de la proteína bikunina humana"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 65

<223> /nota = "fragmento de la proteína bikunina humana"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 66

<223> /nota = "fragmento de la proteína bikunina humana"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 67

<223> /nota = "fragmento de la proteína bikunina humana"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 68

<223> /nota = "fragmento de la proteína bikunina humana"

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 69

<223> /nota = "fragmento de la proteína bikunina humana"

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<210> 70

<223> /nota = "fragmento de la proteína bikunina humana"

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<210> 71

<223> /nota = "fragmento de la proteína bikunina humana"

<110> Bayer Aktiengesellschaft

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<120> Método para acelerar la velocidad de la eliminación mucociliar

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<130> 89.71942/001.cpp

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\vskip0.400000\baselineskip

<140> 99963636.8

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 22-12-1998

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> documento PCT/GB99/04381

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 22-12-1999

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> documento US 09/441.966

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 17-11-1999

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> documento US 09/218.913

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 22-12-1998

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 105

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.1

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 179

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

57

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

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<222> (1)..(18)

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<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

60

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<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 708

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de DNA consenso de la bikunina humana (figura 3)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (622)..(622)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (679)..(679)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (707)..(707)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácidos -18 a 179 de la traducción de la secuencia de DNA consenso en la figura 3

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Variantes de la bikunina humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)..(26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (42)..(42)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (45)..(47)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (52)..(52)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (64)..(64)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (103)..(103)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (112)..(112)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (114)..(114)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (116)..(121)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (135)..(135)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (137)..(137)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (140)..(142)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (147)..(147)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (159)..(159)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cada "Xaa" representa independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la secuencia nativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

67

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 393

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (361)..(361)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (367)..(367)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (384)..(384)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (390)..(390)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 510

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (424)..(424)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (481)..(481)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (509)..(509)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 427

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (48)..(48)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (425)..(425)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 423

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (401)..(401)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (407)..(407)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor 1 del inhibidor de la vía del factor tisular

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor 1 del inhibidor de la vía del factor tisular

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor del inhibidor de la vía del factor tisular

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor 2 del inhibidor de la vía del factor tisular

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor 2 del inhibidor de la vía del factor tisular

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio de tipo Kunitz del homólogo de la proteína precursora de amiloides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio de tipo Kunitz de la aprotinina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor del inhibidor de inter-alfa-tripsina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor del inhibidor de inter-alfa-tripsina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio de tipo Kunitz de la proteína precursora de amiloides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor de colágeno alfa-3(VI)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio de tipo Kunitz de HKI-B9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sentido 5' utilizado en el ejemplo 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido 3' utilizado en el ejemplo 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de cDNA de bikunina clonada del ejemplo 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR 3' utilizado para amplificar EST R74593

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR 5' utilizado para amplificar EST R74593

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR 5' utilizado para amplificar EST R35464

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR 5' utilizado para amplificar EST R34808

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de secuenciación de DNA específico de vector (SP6)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\hskip1cm94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de secuenciación de DNA específico de vector (T7)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de secuenciación de DNA específico de gen

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de secuenciación de DNA específico de gen

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip1cm97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de secuenciación de DNA específico de gen

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip1cm98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sentido 5' utilizado en el ejemplo 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido 3' utilizado en el ejemplo 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de bikunina clonada del ejemplo 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia consenso derivada de EST de la bikunina humana (figuras 4D y 4G)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

102

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 782

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

105

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1544

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1358)..(1358)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

110

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1530

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de bikunina consenso de la figura 4C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (46)..(46)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (117)..(117)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (313)..(313)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip1cm114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\hskip1cm115

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sentido 5' utilizado para el constructo nº 2 del ejemplo 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\hskip1cm116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido 3' utilizado para el constructo nº 2 del ejemplo 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\hskip1cm117

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sentido 5' utilizado para el constructo nº 3 del ejemplo 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\hskip1cm118

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sentido 5' utilizado para el constructo nº 4 del ejemplo 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\hskip1cm119

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sentido utilizado en la PCR del ejemplo 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\hskip1cm120

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido utilizado en la PCR del ejemplo 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\hskip1cm121

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido utilizado para la mutagénesis in vitro del ejemplo 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\hskip1cm122

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido utilizado para la mutagénesis in vitro del ejemplo 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\hskip1cm123

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\hskip1cm124

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\hskip1cm125

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\hskip1cm126

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\hskip1cm127

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

128

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

129

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

130

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

131

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

132

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "Xaa" es Ile, Thr, Asn o Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "Xaa" es Val, Ala, Glu o Gly

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "Xaa" es Ser, Pro, Thr o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "Xaa" es Tyr, His, Asn o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm134

\hskip1cm135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

136

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "Xaa" es Asp o Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\hskip1cm137

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 511

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Versión corregida de EST R74593 (figura 3)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (425)..(425)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (482)..(482)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (510)..(510)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

138

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácidos 184-214 de la traducción de la secuencia de DNA consenso en la figura 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "Xaa" es Asp o Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\hskip1cm139

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (45)..(45)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (49)..(49)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (118)..(118)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (231)..(231)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (305)..(305)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

140

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 330

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (117)..(117)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (123)..(123)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (321)..(321)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

141

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (222)..(222)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (231)..(231)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (262)..(262)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (267)..(267)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (274)..(274)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

142

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 423

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (44)..(44)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (46)..(46)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (76)..(76)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (114)..(114)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (187)..(187)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (268)..(268)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (309)..(309)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (317)..(317)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (332)..(332)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (370)..(370)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

143

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (148)..(148)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (235)..(235)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (261)..(261)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (272)..(272)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (293)..(293)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (300)..(300)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (313)..(313)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (320)..(320)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

144

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (56)..(56)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (137)..(137)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (145)..(145)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (159)..(159)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (233)..(233)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

145

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 419

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (95)..(95)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (292)..(292)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

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<222> (313)..(313)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

146

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 477

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (139)..(139)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (223)..(223)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (232)..(232)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (302)..(302)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (310)..(310)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (322)..(322)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (328)..(328)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

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<222> (357)..(357)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (375)..(375)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (392)..(392)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (398)..(398)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (405)..(405)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

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<222> (427)..(427)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

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<222> (437)..(437)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (449)..(449)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

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<222> (458)..(458)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (474)..(474)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

147

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 393

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (361)..(361)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

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<222> (367)..(367)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (384)..(384)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (390)..(390)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

148

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

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<211> 428

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (48)..(48)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (425)..(425)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

149

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 425

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (403)..(403)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (409)..(409)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

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150

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

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<211> 343

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (48)..(48)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (62)..(62)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (211)..(211)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (232)..(232)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (245)..(245)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (309)..(309)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (318)..(318)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

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151

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 510

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (424)..(424)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (481)..(481)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (509)..(509)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

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<211> 293

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

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<222> (257)..(257)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\newpage

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<400> 90

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153

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<210> 91

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<211> 282

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

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<222> (19)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

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<222> (147)..(147)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

154

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<210> 92

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<211> 390

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

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<222> (33)..(33)

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<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

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<222> (55)..(55)

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<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

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<222> (118)..(118)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (213)..(213)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (228)..(228)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (259)..(259)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (267)..(267)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (324)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (333)..(333)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (344)..(344)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (387)..(387)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 406

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (306)..(306)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (328)..(328)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (342)..(342)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (365)..(365)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (370)..(370)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (377)..(377)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (382)..(382)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (402)..(402)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (142)..(142)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (339)..(339)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (347)..(347)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

157

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 438

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (334)..(334)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (368)..(368)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (376)..(376)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

158

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 448

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (108)..(108)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (261)..(261)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

159

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 331

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)..(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

160

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 373

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (45)..(45)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (102)..(102)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (105)..(105)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (159)..(159)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (174)..(174)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (213)..(213)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (337)..(337)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

161

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 380

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

162

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 320

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (304)..(304)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (309)..(309)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

163

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 397

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)..(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

164

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (61)..(61)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (74)..(74)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (122)..(122)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (184)..(184)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

165

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 311

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

166

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 338

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (32)..(32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (67)..(67)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (136)..(136)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

167

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 343

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (107)..(107)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

168

Claims (15)

1. El uso de un inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz para preparar un medicamento para tratar una enfermedad pulmonar asociada con la retención y acumulación de moco, seleccionada del grupo de enfermedades que consiste en fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, bronquietasis, sinusitis crónica y otitis media con efusión, comprendiendo el medicamento una cantidad eficaz de un inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz humanas y un vehículo fisiológicamente aceptable para él, en el que el inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz comprende la secuencia de aminoácidos:

\vskip1.000000\baselineskip

169

170

171

\vskip1.000000\baselineskip

2. Un uso según la reivindicación 1, en el que la enfermedad es la enfermedad pulmonar obstructiva crónica.

3. El uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz está glicosilado.

4. El uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz contiene al menos un enlace disulfuro cisteína-cisteína dentro de la cadena.

\newpage

5. El uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz contiene al menos un enlace disulfuro cisteína-cisteína dentro de la cadena, seleccionado de los grupos apareados cisteína-cisteína que consisten en CYS11-CYS61, CYS20-CYS44, CYS36-CYS57, CYS106-CYS156, CYS115-CYS139 y CYS131-CYS152, en el que los restos cisteína se numeran según la secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa.

6. El uso según la reivindicación 1, en el que la composición se va a administrar a los conductos respiratorios pulmonares.

7. El uso según según la reivindicación 1, en el que dicha composición se va a administrar directamente mediante aerosolización.

8. El uso según según la reivindicación 1, en el que dicha composición se va a administrar directamente como una suspensión en aerosol hacia el tracto respiratorio de mamíferos.

9. El uso según la reivindicación 8, en el que dicha suspensión en aerosol incluye partículas respirables que varían en tamaño desde aproximadamente 1 a aproximadamente 10 micras.

10. El uso según la reivindicación 8, en el que dicha suspensión en aerosol incluye partículas respirables que varían en tamaño desde aproximadamente 1 a aproximadamente 5 micras.

11. El uso según la reivindicación 8, en el que dicha suspensión en aerosol se va a administrar a dicho sujeto mediante un nebulizador accionado por presión.

12. El uso según la reivindicación 8, en el que dicha suspensión en aerosol se va a administrar a dicho sujeto mediante un nebulizador ultrasónico.

13. El uso según la reivindicación 8, en el que dicha suspensión en aerosol se va a administrar a dicho sujeto mediante un propelente no tóxico.

14. El uso según según la reivindicación 1, en el que dicho vehículo es un miembro seleccionado del grupo que consiste en una disolución fisiológicamente tamponada, una disolución salina isotónica, una disolución salina normal y sus combinaciones.

15. El uso según la reivindicación 8, en el que dicha suspensión en aerosol se va a administrar a dicho sujeto mediante un inhalador de polvo seco.