ES2318075T3 - Metodo para acelerar la velocidad de eliminacion mucociliar. - Google Patents
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Abstract
El uso de un inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz para preparar un medicamento para tratar una enfermedad pulmonar asociada con la retención y acumulación de moco, seleccionada del grupo de enfermedades que consiste en fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, bronquietasis, sinusitis crónica y otitis media con efusión, comprendiendo el medicamento una cantidad eficaz de un inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz humanas y un vehículo fisiológicamente aceptable para él, en el que el inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz comprende la secuencia de aminoácidos:
Description
Método para acelerar la velocidad de eliminación
mucociliar.
Esta solicitud es una continuación en parte de
la solicitud de patente de EEUU nº de serie 09/218.918, presentada
el 22 de diciembre, 1998.
La presente invención se refiere a composiciones
que comprenden proteínas inhibidoras de serinproteasas, según se
especifica en la presente, en la producción de medicamentos que
estimulan la velocidad de eliminación mucociliar de moco y esputo
en los conductos respiratorios pulmonares.
La disfunción mucociliar, caracterizada por la
incapacidad del epitelio ciliar para eliminar el moco y el esputo
en los conductos respiratorios pulmonares, es una complicación grave
de enfermedades pulmonares obstructivas crónicas, como la
bronquitis crónica (BC), bronquiectasis (BE), asma y, en especial,
fibrosis quística (FQ). Los pacientes que padecen una disfunción
mucociliar son particularmente vulnerables a infecciones bacterianas
secundarias. Se han descrito modalidades de tratamiento y
mantenimiento para la FQ y otras enfermedades respiratorias
asociadas con una disfunción mucociliar y la necesidad de mejores
tratamientos. Véase, por ejemplo, Braga, "Drugs in Bronchial
Mucology", Raven Press, Nueva York, 1989; Lethem et al.,
Am. Rev. Respir. Dis., 142:1053-1058, 1990; patente
de EEUU nº 5.830.436.
La fibrosis quística (FQ) en una enfermedad
recesiva autosómica que provoca anomalías en los fluidos y el
transporte de electrolitos en los epitelios exocrinos. Se han
descubierto mutaciones en el DNA que codifica una proteína
denominada regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis
quística ("cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator", CFTR) en casi todos los pacientes con FQ. Las células
pulmonares se encuentran particularmente afectadas (Di Santagrese
et al., Am. J. Med., 66:121-132 (1979)).
En la FQ, la frontera luminal de las células
mucosas de los conductos respiratorios no responde a la activación
por proteína-quinasas dependientes de cAMP de los
canales de iones cloruro de la membrana. La permeabilidad celular
al Cl^{-} es defectuosa, y se acelera la absorción de Na^{+} a
través de la membrana celular. Estos dos desequilibrios de los
electrolitos tienden a reducir el nivel de hidratación del moco de
los conductos respiratorios, contribuyendo con ello a las
secrecciones pulmonares viscosas características de la FQ (Knowles,
Clin. Chest. Med., 11:75 (1986)). Bacterias y micoplasmas
adventicios entran en los conductos respiratorios y establecen
colonias dentro del moco. El moco espeso asociado con la FQ aísla
estos patógenos del sistema inmunológico. Puesto que la eliminación
mucociliar es menor en pacientes con FQ, también se reduce la
eliminación bacteriana. Por tanto, son habituales la congestión e
infección pulmonares. La presencia prolongada de estos agentes
patógenos invariablemente inicia reacciones inflamatorias que
comprometen la función pulmonar (Bedrossian et al., Human
Pathol., 7:195-204, 1976).
La viscosidad del moco en pulmones con FQ es, en
parte, debida a una menor hidratación del moco, relacionada con el
funcionamiento defectuoso del canal de Cl^{-} y la modificación de
la concentración de iones sodio (Na~) en el líquido de la
superficie de los conductos respiratorios (LSCR), que cambia la
velocidad de eliminación mucociliar (EMC) de los conductos
respiratorios. Los mecanismos implicados en el transporte de moco se
han estudiado in vitro e in vivo. Los esputos de BC,
FQ y BE son transportados lentamente por el epitelio ciliar de
mamíferos en la tráquea bovina con poco moco (TBPM) (Wills et
al., J. Clin. Invest., 97(1):9-13, 1995).
El transporte lento del esputo enfermo en la TBPM puede estar
conectado con su bajo contenido en electrolitos/osmolitos (Wills
et al., J. Resp. Crit. Care Med.,
151(4):1255-1258, 1997). En efecto, se sabe
que el esputo enfermo tiene un bajo contenido en electrolitos con
relación al plasma (Matthews et al., Am. Rev. Resp. Dis.,
88:199-240, 1963; Potter et al., Am. Rev.
Resp. Dis., 67(1):83-87, 1967; Tomkiewicz
et al., Am. Rev. Resp. Dis., 148(4, pt.
1):1002-1007, 1993).
Otros estudios de la TBPM han demostrado que el
transporte del moco enfermo mejora mucho después de un tratamiento
con cloruro de sodio (Wills et al., 1995). Además, estudios
clínicos han demostrado que la inhalación de disolución salina
hipertónica, o del bloqueante del canal de sodio epitelial (CNaE)
amilorida puede aumentar la EMC significativamente en pacientes
enfermos (Robinson et al., Thorax,
52(10):900-903, 1997; App et al., Am.
Rev. Resp. Dis., 141, 605-612, 1990). En fecha
reciente, se ha esclarecido la relación entre la eliminación del
moco y su composición iónica in vivo en el modelo de cobaya
de la velocidad del moco traqueal (VMT). Estudios in vivo han
demostrado que 5 minutos con un aerosol de disolución salina
hipertónica aumenta la VMT de forma transitoria. Se observó un
aumento en la VMT 1 minuto después de administrar un aerosol de
disolución salina hipertónica (al 14,4%). La VMT era 5,1 \pm 1,0
mm.min^{-1} (n=9) en animales expuestos a disolución salina al
0,9%, comparada con 11,3 \pm 1,3 mm.min^{-1} en animales
expuestos a disolución salina hipertónica (n=9; p \leq 0,001)
(Newton y Hall, 1997). La amilorida inhalada también provocó un
aumento en la VMT. Se observó un aumento significativo en la VMT 15
minutos después de una administración de 20 minutos de aerosol de
amilorida (10 mM). La VMT era 3,2 \pm 2,5 mm.min^{-1} (n=9) en
animales expuestos a agua, comparada con 8,1 \pm 0,3 mm.min^{-1}
en animales expuestos a amilorida (n=8; p \leq 0,05) (Newton
et al., Ped. Pulm., S17, resumen 364, 1998). Estos agentes
parecen actuar aumentando el contenido iónico del líquido de la
superficie de los conductos respiratorios (LSCR).
Las pruebas genéticas clínicas procedentes de
sujetos con pseudohipoaldosteronismo sistémico (PHAS) también
apoyan la opinión de que la infrarregulación de la actividad de los
canales de sodio epiteliales de los conductos respiratorios
aumentará la eliminación mucociliar en el pulmón. Los pacientes con
PHAS con mutaciones de pérdida de función en los genes de las
subunidades del canal de sodio epitelial no tenían absorción de
sodio desde las superficies de los conductos respiratorios,
presentaban una mayor concentración de iones sodio en el líquido de
la superficie nasal comparada con sujetos normales, y tenían una
velocidad de eliminación mucociliar pulmonar 4 veces mayor
comparada con los sujetos normales (Kerem et al., New England
J. Med., 341, 156-162, 1999).
En fechas recientes, se ha descubierto una
serinproteasa denominada proteasa activadora del
canal-1 (CAP-1) en la membrana
apical de células epiteliales renales del anfibio Xenopus (células
A6) (Vallet et al., Nature,
389(6651):607-610, 1997). La
CAP-1 parece controlar la actividad del canal de
Na^{+} en estas células. La exposición de la membrana apical al
inhibidor de Kunitz bovino prototípico, la aprotinina, reduce el
transporte de Na^{+} transepitelial (Vallet et al., 1997;
Chraibi et al., J. Gen. Physio.,
111(1):127-138, 1998). El efecto de la
bikunina (1-170), un homólogo humano con dos
dominios de Kunitz de la aprotinina bovina (Delaria et al.,
J. Biol. Chem., 272(18):12209-12214, 1997;
Marlor et al., J. Biol. Chem.,
272(18):12202-12208, 1997) se evaluó
utilizando la corriente en cortocircuito (Icc) de células
epiteliales bronquiales humanas cultivadas normales (HBE) in
vitro (McAulay et al., Ped. Pulm., S17, resumen 141,
1998). La bikunina (1,5 ug.ml^{-1}; 70 nM) inhibió
significativamente en 54% la Icc de Na^{+} en células HBE normales
(n=5-8; p \leq 0,05). En general, la bikunina (70
nM) inhibió 58% de la línea de base de Icc en 90 minutos. En otro
estudio, la bikunina (5 ug.ml^{-1}) inhibió significativamente
(84%) la Icc de Na^{+} en células HBE normales (n=6; p \leq
0,01), mientras que el inhibidor de serinproteasas de la familia de
la serpina, el inhibidor de alfa(1)-proteasa
(\alpha_{1}-PI) (50 ug.ml^{-1}) no produjo un
efecto significativo. En células epiteliales de los conductos
respiratorios de fibrosis quística humanas cultivadas in
vitro, la Icc fue inhibida por la bikunina
(1-170) (1 ug/ml), y fue inhibida por la
aprotinina
(20 ug/ml).
(20 ug/ml).
Dos estudios recientes realizados por un único
equipo investigador han demostrado un efecto inducido por
inhibidores de proteasas sobre la VMT. La
\alpha_{1}-PI (10 mg) administrada 30 minutos
antes de la exposición al antígeno, o 1 hora después de la
exposición, atenúa la reducción inducida por el antígeno en la VMT
en ovejas alérgicas, 6 horas después de la exposición (O'Riordan
et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med.,
97(5):1522-1528, 1997). En la figura 1 del
artículo de O'Riordan et al., 1977, los autores demuestran
que la \alpha_{1}-PI administrada por sí sola
(sin exposición al antígeno) en los conductos respiratorios de
ovejas alérgicas no producía efecto en la línea de base de VMT a lo
largo de un periodo de 6 horas. En un segundo estudio, la
\alpha_{1}-PI se administró 6 horas después de
la exposición al antígeno y sólo provocó una reversión
significativa de la reducción inducida por el antígeno en la VMT
después de 24 horas de la exposición (O'Riordan et al., J.
App. Physio., 85(3):1086-1091, 1998). Los
autores sostienen que el mecanismo para el efecto de la
\alpha_{1}-PI está asociado con su propiedad
antielastasa de neutrófilos, puesto que se cree que la elastasa de
neutrófilos es la enzima responsable de la menor velocidad de
eliminación mucociliar en su modelo. Razonaron que
\alpha_{1}-PI puede utilizarse para tratar la
disfunción mucociliar producida por la liberación de elastasa de
neutrófilos inducida por alergia en el asma (O'Riordan et
al., 1998); no especularon sobre el papel potencial en otras
enfermedades respiratorias.
La presente invención se refiere al uso de
inhibidores de serinproteasas de la familia Kunitz, según se
especifica en la presente, en la producción de medicamentos que
estimulan la velocidad de eliminación mucociliar (EMC) de moco y
esputo en los conductos respiratorios del pulmón. Los inhibidores de
serinproteasas de tipo Kunitz pueden utilizarse para tratar
enfermedades pulmonares como la fibrosis quística (FQ), la
bronquitis crónica (BC) y la bronquiectasis (BE), en las que la
retención y acumulación de moco es un problema clínico importante.
Hasta la fecha, la técnica anterior no ha asociado a los inhibidores
de proteasas con la capacidad para aumentar la velocidad de EMC por
encima de la línea de base de la velocidad. Los inhibidores de
serinproteasas de tipo Kunitz también pueden utilizarse para tratar
la sinutis crónica y la otitis media mucoide, en las que la
retención y acumulación de moco es un problema clínico.
En una realización, la invención proporciona el
uso de un inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz humanas, para
preparar un medicamento para tratar una enfermedad pulmonar asociada
con la retención y acumulación de moco, seleccionada del grupo de
enfermedades que consiste en fibrosis quística, enfermedad pulmonar
obstructiva crónica, bronquitis crónica, bronquietasis, sinusitis
crónica y otitis media con efusión, comprendiendo el medicamento
una cantidad eficaz de un inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz
humanas y un vehículo fisiológicamente aceptable para él, en el que
el inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz comprende una
secuencia de aminoácidos, según se especifica en la reivindicación
1.
Los ejemplos de inhibidores de serinproteasas
humanas incluyen la bikunina y sus variantes y fragmentos, como los
descritos en el documento WO 97/33996, publicado el 18 de
septiembre, 1997 (Bayer Corp.), y la patente de EEUU nº 5.407.915,
otorgada el 18 de abril, 1995 (Bayer AG).
La invención se entenderá mejor tomando en
consideración la siguiente descripción detallada y reivindicaciones,
junto con los dibujos, en los que:
La figura 1 representa la secuencia de
nucleótidos de EST R35464 (SEQ ID NO:12) y la traducción de esta
secuencia de DNA (denominada "ORF") que produce un marco de
lectura abierto con cierta similitud de secuencia con la
aprotinina. Los aminoácidos 1-110 de la traducción
se corresponden con la SEQ ID NO:13, y los aminoácidos
112-130 se corresponden con la SEQ ID NO:72. El
producto de la traducción contiene 5 de las 6 cisteínas con el
espaciamiento correcto que es característico de los dominios de
inhibidores de tipo Kunitz (indicadas en negrita). La posición
normalmente ocupada por la otra cisteína (en el codón 38) contiene,
en su lugar, una fenilalanina (indicada por un asterisco).
La figura 2 representa la secuencia de
nucleótidos de EST R74593 (SEQ ID NO:14) y la traducción de esta
secuencia de DNA (denominada "ORF") que produce un marco de
lectura abierto con homología con la clase Kunitz de dominios de
inhibidores de serinproteasas. Los aminoácidos 3-22
de la traducción se corresponden con la SEQ ID NO:15, los
aminoácidos 24-131 se corresponden con la SEQ ID
NO:73, y los aminoácidos 136-166 se corresponden con
la SEQ ID NO:74. El producto de la traducción contiene las 6
cisteínas con el espaciamiento correcto que es característico de
los dominios de inhibidores de tipo Kunitz (indicadas en negrita).
Sin embargo, la secuencia del marco de lectura incluye codones de
terminación en el codón 3 y 23.
La figura 3 representa una secuencia de ácido
nucleico deducida de la bikunina placentaria humana (SEQ ID NO:9)
denominada "consenso", y apareada con la secuencia de
aminoácidos de la proteína traducida denominada "traducida".
Los aminoácidos -18-179 de la traducción se
corresponden con la SEQ ID NO:10, y los aminoácidos
184-214 se corresponden con la SEQ ID NO:76. También
se muestra la comparación de la secuencia del ácido nucleico de los
EST H94519 (SEQ ID NO:16), N39798 (SEQ ID NO:17), R74593 (corregida
para la inserción de G en la posición 114) (SEQ ID NO:75) y R35464
(SEQ ID NO:12). Los nucleótidos subrayados en la secuencia consenso
se corresponden con el sitio de los cebadores de PCR descritos en
los ejemplos. Los aminoácidos subrayados en la secuencia consenso
traducida son restos cuya identidad se ha confirmado mediante
secuenciación de aminoácidos de la bikunina placentaria humana
nativa purificada. El código de los nucleótidos y aminoácidos es el
código de una letra estándar, "N" en el código de ácidos
nucleicos indica un ácido nucleico sin asignar, y "*" indica
un codón de terminación o un aminoácido sin asignar en la secuencia
de aminoácidos.
La figura 4A representa las capas superpuestas
originales de una serie de EST que presentan algo de homología de
secuencia de aminoácidos con EST que codifican la bikunina
placentaria humana, o sus porciones. Como referencia se muestran
las posiciones relativas de la bikunina (7-64) y la
bikunina (102-159), denominadas KID1 y KID2,
respectivamente.
La figura 4B representa otras capas superpuestas
de EST más completas, que incorporan más EST. Los números del
eje-X superior se refieren a la longitud en pares de
bases, comenzando desde la primera base de la secuencia EST más 5'.
La longitud de cada barra está en proporción con la longitud en
pares de bases de los EST individuales incluyendo los huecos. Los
números de registro de EST se indican a la derecha de sus
respectivas barras EST.
La figura 4C representa el alineamiento
correspondiente de las secuencias de oligonucleótidos de cada EST
solapante que se muestran de forma esquemática en la figura 4B. La
secuencia superior (SEQ ID NO:51), denominada bikunina, representa
la secuencia del oligonucleótido consenso derivada de los
nucleótidos solapantes en cada posición. Los números se refieren a
la posición de pares de bases dentro del mapa del EST. Los
oligonucleótidos en los EST R74593 (SEQ ID NO:89) que están en
negrita y subrayados (en las posiciones del mapa 994 y 1005) son
inserciones de bases observadas en R74593 que estaban siempre
ausentes en cada uno de los otros EST solapantes. En la figura 4C,
N40851 se corresponde con la SEQ ID NO:77, N39876 se corresponde con
la SEQ ID NO:78, R87894 se corresponde con la SEQ ID NO:79, H16866
se corresponde con la SEQ ID NO:80, R34808 se corresponde con la
SEQ ID NO:81, T66058 se corresponde con la SEQ ID NO:82, N57450 se
corresponde con la SEQ ID NO:83, N57374 se corresponde con la SEQ
ID NO:84, R35464 se corresponde con la SEQ ID NO:85, H94519 se
corresponde con la SEQ ID NO:86, N39798 se corresponde con la SEQ
ID NO:87, H87300 se corresponde con la SEQ ID NO:88, R74593 se
corresponde con la SEQ ID NO:89, R31730 se corresponde con la SEQ ID
NO:90, R34701 se corresponde con la SEQ ID NO:91, H02982 se
corresponde con la SEQ ID NO:92, R32676 se corresponde con la SEQ ID
NO:93, T47439 se corresponde con la SEQ ID NO:94, R73968 se
corresponde con la SEQ ID NO:95, H39840 se corresponde con la SEQ
ID NO:96, H95233 se corresponde con la SEQ ID NO:97, H39841 se
corresponde con la SEQ ID NO:98, N30199 se corresponde con la SEQ
ID NO:99, T52966 se corresponde con la SEQ ID NO:100, N29508 se
corresponde con la SEQ ID NO:101, N26919 se corresponde con la SEQ
ID NO:102, N26910 se corresponde con la SEQ ID NO:103, H16757 se
corresponde con la SEQ ID NO:104, y N27732 se corresponde con la SEQ
ID NO:105.
La figura 4D representa la traducción en
aminoácidos de la secuencia del oligonucleótido consenso para la
bikunina que aparece en la figura 4C (SEQ ID NO:45).
La figura 4E representa la secuencia de
nucleótidos (SEQ ID NO:46) y la correspondiente traducción en
aminoácidos (SEQ ID NO:47) de una secuencia codificadora de
bikunina placentaria que se derivó a partir de un banco de cDNA
placentario humano mediante amplificación basada en PCR.
La figura 4F representa la secuencia de
nucleótidos (SEQ ID NO:48) y la correspondiente traducción en
aminoácidos (SEQ ID NO:49) de un clon codificador de bikunina
placentaria humana nativa que se aisló a partir de un banco de cDNA
lambda placentario humano mediante hibridación de colonias.
La figura 4G compara el alineamiento de las
secuencias de oligonucleótidos traducidas en aminoácidos para la
bikunina placentaria obtenida mediante capas superpuestas de EST
(SEQ ID NO:45), clonación basada en PCR (SEQ ID NO:47) e hibridacón
de colonias lambda convencional (SEQ ID NO:49).
La figura 5 muestra una gráfica de purificación
de bikunina placentaria humana a partir de tejido placentario
después de una filtración en gel Superdex 75. La gráfica es una
superposición del perfil de elución de la proteína medido mediante
DO 280 nm (línea continua), la actividad de la proteína eluida en un
ensayo de inhibición de tripsina (el porcentaje de inhibición se
muestra con círculos) y la actividad de la proteína eluida en un
ensayo de inhibición de calicreína (el porcentaje de inhibición se
muestra con cuadrados).
La figura 6 muestra una gráfica que representa
la purificación de bikunina placentaria humana a partir de tejido
placentario utilizando una cromatografía de fase inversa C18. La
gráfica es una superposición del perfil de elución de la proteína
medido mediante DO 215 nm (línea continua), la actividad de la
proteína eluida en un ensayo de inhibición de tripsina (el
porcentaje de inhibición se muestra con círculos) y la actividad de
la proteína eluida en un ensayo de inhibición de calicreína (el
porcentaje de inhibición se muestra con cuadrados).
La figura 7 representa un gel de
SDS-PAGE teñido con plata de bikunina placentaria
muy purificada (carril 2) y una serie de proteínas marcadoras de
tamaño molecular (carril 1) de los tamaños indicados en kilodaltons.
La migración se realizó de arriba abajo.
La figura 8 representa la cantidad de actividad
inhibidora de tripsina presente en el caldo de fermentación exento
de células procedente del crecimiento de las cepas de levaduras
SC101 (panel 8A) o WHL341 (panel 8B) que se transformaron, de forma
estable, con un plásmido (pS604) que dirige la expresión de la
bikunina placentaria (102-159).
La figura 9 representa un
SDS-PAGE teñido con plata (figura 9A) y un análisis
de la transferencia Western con pAb antibikunina placentaria
(102-159) (figura 9B) de un caldo de fermentación
exento de células procedente del crecimiento de las cepa de
levaduras SC101 (recombinantes 2.4 y 2.5) que se transformó, de
forma estable, con un plásmido que dirige la expresión de la
aprotinina bovina o de la bikunina placentaria
(102-159). La migración se realizó de arriba
abajo.
La figura 10 es una fotografía que muestra un
SDS-PAGE teñido con plata de bikunina placentaria
muy purificada (102-159) (carril 2) y una serie de
proteínas marcadoras de peso molecular (carril 1) de los tamaños
indicados en kilodaltons. La migración se realizó de arriba
abajo.
La figura 11 es una fotografía que muestra los
resultados del análisis de la transferencia Northern de mRNA
procedente de diversos tejidos humanos que se hibridó con una sonda
de cDNA marcada con ^{32}P que codifica la bikunina placentaria
(102-159) (figura 11A), o que codifica la bikunina
placentaria (1-213) (figura 11B). La migración se
realizó de arriba abajo. Los números a la derecha de cada análisis
de la transferencia se refieren al tamaño en kilobases de los
marcadores de RNA adyacentes. Los órganos a partir de los cuales se
obtiene el mRNA se describen bajo cada carril del análisis de la
transferencia.
La figura 12 representa un inmunoanálisis de la
transferencia de bikunina placentaria derivada de placenta con
antisuero de conejo producido contra bikunina placentaria reducida
sintética (7-64) (figura 12A) o
102-159 (figura 12b). En cada panel, los contenidos
son: marcadores de tamaño molecular (carriles 1); bikunina
placentaria nativa aislada a partir de placenta humana (carriles
2); bikunina placentaria sintética (7-64) (carriles
3); y bikunina placentaria sintética (102-159)
(carriles 4). Geles de SDS-PAGE con tricina al
10-20% se analizaron mediante transferencia y se
revelaron con un anticuerpo policlonal primario purificado de
proteína A (8 ug de IgG en 20 ml de BSA al 0,1%/disolución salina
tamponada con Tris (pH 7,5)), seguido de un anticuerpo secundario
anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa
alcalina. La migración se realizó de arriba abajo.
La figura 13 representa un gel de
SDS-PAGE con tricina al 10-20%
teñido con azul de Coomassie de 3 microgramos de bikunina
placentaria muy purificada (1-170) derivada de un
sistema de expresión de baculovirus/Sf9 (carril 2). El carril 1
contiene marcadores de peso molecular. La migración se realizó de
arriba abajo.
La figura 14 representa una comparación del
efecto de concentraciones crecientes de bikunina placentaria humana
derivada de Sf9 (1-170) (círculos negros), bikunina
placentaria sintética (102-159) (círculos blancos) o
aprotinina (cuadrados blancos) sobre el tiempo de tromboplastina
parcial activada de plasma humano. La coagulación se inició con
CaCl_{2}. La concentración de las proteínas se representó frente a
la prolongación (en número de veces) del tiempo de coagulación. El
tiempo de coagulación sin inhibición era 30,8 segundos.
La figura 15 ilustra el efecto de la bikunina
con unos niveles de dosificación de 2 uM y 0,2 uM con relación a la
amilorida (100 uM) y un vehículo de disolución salina equilibrada de
Hank (HBSS) (control) sobre las diferencias de potencial en tráquea
de cobaya 3 horas después del tratamiento.
La figura 16 ilustra (a) la colocación de la
jeringa de instilación y la sonda beta con relación a la tráquea de
cobaya; (b) una gráfica representativa para la medida de la
velocidad media de la tráquea (VMT) utilizando S. cerevisiae
marcado con ^{32}P; y (c) el aumento sostenido en la VMT in
vivo en cobayas en respuesta a la bikunina (5 ug) con relación
al vehículo control de HBSS a las 1,5, 1,75, 2,0, 2,25 y 2,5 horas
después de la instilación traqueal.
La figura 17 ilustra que la bikunina (70 nM)
disminuye la corriente de sodio en células epiteliales bronquiales
humanas cultivadas in vitro con relación a la amilorida (10
uM).
La figura 18 ilustra el efecto de 5 min de un
aerosol de disolución salina hipertónica (al 14,4%) sobre el
aumento de la VMT, después de un tratamiento con aerosol en tráquea
de cobaya.
La figura 19 ilustra el efecto de 20 min de un
aerosol de amilorida (10 mM) sobre la VMT, después de un tratamiento
con aerosol en tráquea de cobaya.
La figura 20 ilustra que la bikunina (5 ug/ml),
la aprotinina (5 ug/ml) y la muteína doble de aproteína (0,5 ug/ml,
1,5 ug/ml y 5 ug/ml) disminuyen la corriente en cortocircuito de
sodio en células bronquiales humanas cultivadas in
vitro.
La figura 21 ilustra que la aprotinina (1 mg/ml)
inhibe la Icc in vitro en células epiteliales bronquiales de
FQ humanas.
La figura 22 ilustra que un aerosol de bikunina
(3 ml de 3 mg/ml) aumenta significativamente la VMT en ovejas con
relación al control de PBS.
La figura 23 ilustra que la bikunina (50 ug/ml)
inhibe la corriente de sodio in vitro en células epiteliales
traqueales de cobaya durante un periodo de 30 minutos.
La figura 24 ilustra que la bikunina (100 ug/ml)
inhibe significativamente la corriente de sodio in vitro en
células epiteliales traqueales ovinas durante un periodo de 90
minutos.
La figura 25 ilustra que (a) la exposición a LPS
provoca un influjo de PMN significativo, y que (b) la bikunina
inhibe significativamente la diferencia de potencial en cobayas
preexpuestas a LPS.
La figura 26 ilustra que la muteína doble de
aprotinina (10 ug) aumenta la VMT in vivo en cobayas con
relación a HBSS durante un periodo sostenido de 1,5 a 2,5 horas
después de la administración.
La figura 27 representa un mapa de plásmido de
pBC-BK (CMV-IE = inmediato temprano
de citomegalovirus; DHFR = dihidrofolato-reductasa;
AMP-r = resistencia a la ampicilina).
La figura 28 ilustra que (a) la bikunina
(1-170) expresada por CHO (10 ug/ml) disminuye la
corriente de sodio in vitro en células epiteliales
bronquiales de FQ humanas durante un periodo de 90 minutos, y (b) la
bikunina (1-170) de CHO a 1, 5 y 10 ug/ml, y la
aprotinina a 20 ug/ml, disminuyen la corriente de sodio a los 90
minutos después de la aplicación apical a células epiteliales
bronquiales de FQ humanas in vitro.
La figura 29 ilustra las etapas del proceso para
purificar la bikunina (1-170) a partir de un sistema
de expresión de células CHO.
La figura 30A muestra una gráfica de la
migración de las isoformas de bikunina (1-170) de
CHO purificada utilizando una cromatografía de fase inversa C18. La
gráfica es una superposición del perfil de elución de la proteína
medido mediante DO 280 nm (línea continua) y el porcentaje de
acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1% utilizado para eluir
la proteína (diamantes).
La figura 30B es una fotografía que muestra un
SDS-PAGE teñido con plata de las isoformas
glicosiladas de la bikunina purificada (1-170)
(carriles 45-55) expresadas a partir de un sistema
de expresión de células CHO, y una serie de proteínas marcadoras de
tamaño molecular (entre los carriles 54 y 55) de los tamaños
indicados en kilodaltons. La migración se realizó de arriba
abajo.
La figura 31 es una fotografía que muestra un
SDS-PAGE teñido con plata de isoformas de bikunina
purificada (1-170) de CHO tratadas con
N-glicosidasa F (carriles 2 y 4) y sin tratar
(carriles 1 y 3), y una serie de proteínas marcadoras de tamaño
molecular de los tamaños indicados en kilodaltons. La migración se
realizó de arriba abajo.
La presente invención se refiere al uso de un
inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz humanas para preparar un
medicamento para tratar una enfermedad pulmonar asociada con la
retención y acumulación de moco, seleccionada del grupo de
enfermedades que consiste en el fibrosis quística, enfermedad
pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, bronquietasis,
sinusitis crónica y otitis media con efusión, comprendiendo el
medicamento una cantidad eficaz de un inhibidor de serinproteasas
de tipo Kunitz humanas y un vehículo fisiológicamente aceptable para
él, en el que el inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz
comprende una secuencia de aminoácidos, según se especifica en la
reivindicación 1.
Una aplicación preferida para la bikunina
placentaria, los dominios aislados y otros variantes es para
estimular la eliminación mucociliar en pacientes con FQ como parte
de la terapia y gestión de la enfermedad. Estos medicamentos
reducen o eliminan la acumulación de moco y esputo en los conductos
respiratorios pulmonares en pacientes con enfermedad pulmonar
obstructiva crónica, reduciendo con ello el riesgo de infecciones
pulmonares secundarias y otros efectos secundarios adversos, así
como evitando o retrasando la necesidad de cirugía de trasplante de
pulmón en pacientes con FQ.
Se ha demostrado que la aprotinina reduce el
transporte de Na^{+} transepitelial en la membrana apical de
células epiteliales renales del anfibio Xenopus (células A6) (Vallet
et al., 1997; Chraibi et al., 1998). Se ha propuesto
que el mecanismo de la acción de la aprotinina implica la inhibición
de CAP-1, una proteasa implicada en el control de
la actividad del canal de Na^{+} en células A6. También se ha
demostrado que la bikunina (1-170), un homólogo
humano con dos dominios de Kunitz de la aprotinina bovina (Delaria
et al., 1997; Marlor et al., 1997) inhibe
significativamente in vitro la corriente en cortocircuito
(Icc) de células epiteliales bronquiales humanas (HBE) cultivadas
normales (McAulay et al., 1998). La bikunina (1,5
ug.ml^{-1}; 70 nM) inhibe significativamente en 54% la Icc de
Na^{+} en células HBE normales (n=5-8; p \leq
0,05). En general, la bikunina (70 nM) inhibió 58% de la línea de
base de Icc en 90 minutos. En otro estudio, la bikunina (5
ug.ml^{-1}) inhibió significativamente (84%) la Icc de Na^{+} en
células HBE normales (n=6; p \leq 0,01), mientras que el
inhibidor de serinproteasas de la familia de la serpina, el
inhibidor de alfa(1)-proteasa
(\alpha_{1}-PI) (50 ug.ml^{-1}) no produjo un
efecto significativo. En células epiteliales de los conductos
respiratorios de fibrosis quística humanas cultivadas, la Icc fue
inhibida por la bikunina (1-170) (1 ug/ml), y fue
inhibida por la aprotinina
(20 ug/ml).
(20 ug/ml).
A la luz de estas observaciones, los inhibidores
de serinprotesas de tipo Kunitz, como la aprotinina, la bikunina
placentaria y sus fragmentos, se contemplan como productos
terapéuticos para tratar la disfunción mucociliar, incluyendo la
fibrosis quística.
Un "inhibidor de Kunitz" significa un
inhibidor de proteasas; desde el punto de vista estructural, un
"inhibidor de Kunitz" o "dominio de Kunitz" es una
proteína, o dominio de proteína, de forma típica con una longitud
de aproximadamente 60 aminoácidos y que contiene tres enlaces
disulfuro (véase Laskowske y Kato, Ann. Rev. Biochem.,
49, 593-626, 1980).
Una ventaja significativa de los dominios de
Kunitz del inhibidor de serinproteasas bikunina y sus fragmentos y
análogos de la presente invención es que son proteínas humanas, y
también tienen menos carga positiva que Trasylol® (ejemplo 1),
reduciendo con ello el riesgo de lesiones renales tras la
administración de grandes dosis de las proteínas. Como es de origen
humano, la proteína de la presente invención puede administrarse,
por tanto, a pacientes humanos con un riesgo significativamente
reducido de reacciones inmunológicas no deseadas, comparado con la
administración de dosis similares de Trasylol®. Además, se ha
descubierto que la bikunina (102-159), la bikunina
(7-64) y la bikunina (1-170) son
inhibidores significativamente más potentes de la calicreína
plasmática que Trasylol® in vitro (ejemplo 3, 4 y 10). Por
tanto, se espera que la bikunina y sus fragmentos sean más eficaces
in vivo con relación a la aprotinina.
La cantidad de composición farmacéutica empleada
dependerá del receptor y del trastorno que se va a tratar. La
cantidad precisa puede calcularse sin experimentos indebidos
mediante protocolos conocidos por los expertos en la técnica. Como
alternativa, la cantidad precisa puede calcularse basándose en la
determinación de la cantidad de proteasa diana, como plasmina,
calicreína o prostasina, que debe inhibirse para tratar el
trastorno. Como se considera que los materiales activos
contemplados en esta invención no son tóxicos, el tratamiento
implica preferiblemente la administración de un exceso de la
cantidad óptimamente requerida del agente activo.
Para estimular las velocidades de eliminación
mucociliar en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva
crónica, las proteínas de la presente invención pueden utilizarse
como la aprotinina Trasylol®, tomando en cuenta las diferencias en
la potencia. El uso de Trasylol® se indica en Physicians Desk
Reference, 1995, que lista el suplemento A de Trasyolo®.
Brevemente, con el paciente en posición supina, la dosis de carga de
bikunina placentaria, el dominio aislado u otro variante se
administra mediante infusión lentamente durante aproximadamente 20
a 30 minutos. En general, se utilizará una dosis total desde
aproximadamente 2x10^{6} KIU (unidades inhibidoras de calicreína)
y 8x10^{6} KIU, dependiendo de factores como el peso y trastorno
del paciente. Las dosis de carga preferidas son las que contienen
un total de 1 a 2 millones de unidades inhibidoras de calicreína
(KIU).
Las proteínas de la presente invención se
emplean en composiciones farmacéuticas formuladas de la manera
conocida en la técnica. Estas composiciones contienen un(os)
ingrediente(s) activo(s) más uno o más vehículos,
diluyentes, cargas, ligantes y otros excipientes farmacéuticamente
aceptables, dependiendo de la vía de administración y la forma de
dosificación contemplada. Los ejemplos de vehículos orgánicos e
inorgánicos terapeúticamente inertes conocidos por los expertos en
la técnica incluyen, pero no se limitan a lactosa, almidón de maíz o
sus derivados, talco, aceites vegetales, ceras, grasas, polioles
como polietilenglicol, agua, sacarosa, alcoholes, glicerina y
similares. También pueden añadirse diversos conservantes,
emulsionantes, dispersantes, aromatizantes, agentes humectantes,
antioxidantes, edulcorantes, colorantes, estabilizantes, sales,
tampones y similares, según se requiera para ayudar a la
estabilización de la formulación, o para ayudar a aumentar la
biodisponibilidad del(los) ingrediente(s)
activo(s), o para producir una formulación de aroma u olor
aceptable en el caso de una dosificación oral, nasal o pulmonar. El
inhibidor empleado en estas composiciones puede estar en forma del
compuesto original en sí mismo u, opcionalmente, en forma de una sal
farmacéuticamente aceptable. Las composiciones formuladas de esta
manera se seleccionan según sea necesario para la administración del
inhibidor mediante cualquier vía adecuada conocida por los expertos
en la técnica.
Las vías de administración parenteral incluyen
la vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal e intramuscular. La
administración intravenosa puede utilizarse para obtener la
regulación aguda de las concentraciones pico plasmáticas del
fármaco, según sea necesario. Como alternativa, el fármaco puede
administrarse a una velocidad deseada de forma constante mediante
catéter intravenoso. Los vehículos adecuados incluyen diluyentes
acuosos estériles sin pirógenos, como agua estéril para inyección,
disoluciones tamponadas estériles o disolución salina estéril. La
composición resultante se administra al paciente antes y/o durante
la cirugía mediante infusión o inyección intravenosa.
Una mejora en la semivida y el transporte del
fármaco a los fagosomas, como neutrófilos y macrófagos, implicados
en la inflamación puede facilitarse encerrando el fármaco en
liposomas. Debe ser posible mejorar la selectividad del transporte
dirigido de los liposomas incorporando en su parte exterior ligandos
que se unen a macromoléculas específicas de órganos/tejidos diana,
como el tracto gastrointestinal y los pulmones. Como alternativa,
puede utilizarse una inyección con depósito intramuscular o
subcutánea con o sin encapsulación del fármaco en microsferas
degradables (por ejemplo, que comprenden
poli-DL-lactida-co-glicólido)
o formulaciones protectoras que contienen colágeno, para obtener
una liberación del fármaco prolongada y sostenida. Para una mayor
conveniencia de la forma de dosificación es posible utilizar un
depósito y septo implantados por vía intraperitoneal, como el
sistema percuseal. También puede lograrse una mayor conveniencia y
cumplimiento por parte del paciente utilizando estilográficas
inyectoras (por ejemplo Novo-Pin o
Q-pen) o inyectores de chorro sin aguja (por
ejemplo, de Bioject, Mediject o Becton Dickinson). También puede
lograrse una liberación controlada con precisión utilizando bombas
implantables con administración al sitio deseado mediante una
cánula. Los ejemplos incluyen las bombas osmóticas implantadas por
vía subcutánea disponibles en ALZA, como la bomba osmótica
ALZET.
La administración oral puede lograrse
incorporando el fármaco en comprimidos, comprimidos revestidos,
grageas, cápsulas de gelatina dura y blanda, disoluciones,
emulsiones, suspensiones o cápsulas con revestimiento entérico
diseñadas para liberar el fármaco en el colon en el que la actividad
de proteasas digestivas es baja. Los ejemplos de esto último
incluyen el sistema OROS-CT/Osmet^{TM} de ALZA, y
el sistema PULSINCAP^{TM} de Scherer Drug Delivery Systems. Otros
sistemas utilizan polímeros azoentrecruzados que son degradados por
azorreductasas bacterianas específicas del colon, o polímeros de
poliacrilato sensibles al pH que se activan por un aumento en el pH
en el colon. Los sistemas anteriores pueden utilizarse junto con una
amplia gama de potenciadores de la absorción disponibles. La
administración rectal puede lograrse incorporando el fármaco en
supositorios.
La administración nasal puede lograrse
incorporando el fármaco en vehículos en partículas bioadhesivos
(<200 mm), como los que comprenden celulosa, poliacrilato o
policarbófilo, junto con potenciadores de la absorción adecuados,
como fosfolípidos o acilcarnitinas. Los sistemas disponibles en el
mercado incluyen los desarrollados por Dan Biosys y Scios Nova.
Para estimular la velocidad de eliminación
mucociliar, el modo preferido de administración de los variantes de
bikunina placentaria de la presente invención es la administración
pulmonar. Los inhibidores de serinproteasas de tipo Kunitz
descritos en la presente pueden administrarse a los pulmones de un
sujeto mediante cualquier medio adecuado, pero se administran
preferiblemente mediante una suspensión en aerosol de partículas
respirables formadas por el compuesto activo, que el sujeto inhala.
Las partículas respirables pueden ser líquidas o sólidas. Polvos
secos de tamaño de micras que contienen el medicamento en un
vehículo adecuado como manitol, sacarosa o lactosa pueden
administrarse a las superficies de los conductos respiratorios
pulmonares utilizando inhaladores de polvo seco como los de
Inhale^{TM}, Dura^{TM}, Fisons (Spinhaler^{TM}) y Glaxo
(Rotahaler^{TM}), o los inhaladores de dosis medida basados en
propelentes de Astra (Turbohaler^{TM}). Las formulaciones en
disolución con o sin liposomas pueden administrarse utilizando
nebulizadores.
Los aerosoles de partículas líquidas que
comprenden las proteínas pueden producirse mediante cualquier medio
adecuado, como con un nebulizador de aerosol accionado por presión o
en un nebulizador ultrasónico. Véase, por ejemplo, la patente de
EEUU nº 4.501.729. Los nebulizadores son dispositivos disponibles en
el mercado que transforman disoluciones o suspensiones del
ingrediente activo en una niebla de aerosol terapéutica mediante la
aceleración de gas comprimido, de forma típica aire u oxígeno, a
través de un orificio de Venturi estrecho, o mediante agitación
ultrasónica. Las formulaciones adecuadas para utilizar en
nebulizadores consisten en el ingrediente activo en un vehículo
líquido. El vehículo es, de forma típica, agua (y más
preferiblemente agua estéril exenta de pirógenos) o una disolución
alcohólica acuosa diluida, que preferiblemente se hace isotónica
con los fluidos corporales mediante la adición, por ejemplo, de
cloruro de sodio. Otros aditivos opcionales incluyen conservantes
si la formulación no se esteriliza, por ejemplo, hidroxibenzoato de
metilo, antioxidantes, agentes aromatizantes, aceites volátiles,
agentes tamponantes y tensioactivos.
Los aerosoles de partículas sólidas que
comprenden la proteína pueden producirse, de forma similar, con
cualquier generador de aerosoles de medicamentos en partículas
sólidas. Los generadores de aerosoles para administrar medicamentos
en partículas sólidas a un sujeto producen partículas que son
respirables, como se ha explicado anteriormente, y generan un
volumen de aerosol que contiene una dosis medida predeterminada de
un medicamento, con una proporción adecuada para la administración
humana. Un tipo ilustrativo de generador de aerosoles de partículas
sólidas es un insuflador. Las formulaciones adecuadas para la
administracion mediante insuflación incluyen polvos finamente
divididos que pueden administrarse por medio de un insuflador, o
introducidos en la cavidad nasal como si fuera rapé. En el
insuflador, el polvo (por ejemplo, una dosis medida del mismo eficaz
para realizar los tratamientos descritos en la presente) está
contenida en cápsulas o cartuchos fabricados, de forma típica, de
gelatina o plástico, que se perforan o abren in situ y el
polvo se administra mediante el aire que atraviesa el dispositivo
tras una inhalación, o mediante una bomba manipulada de forma
manual. El polvo empleado en el insuflador consiste sólo en la
proteína, o es una mezcla en polvo que comprende la proteína, un
diluyente en polvo adecuado, como lactosa, y un tensioactivo
opcional. Un segundo tipo de generador de aerosoles ilustrativo
comprende un inhalador de dosis medida. Los inhaladores de dosis
medidas son dispensadores en aerosol presurizados que, de forma
típica, contienen una formulación en suspensión o disolución del
ingrediente activo en un propelente licuado. Durante el uso, estos
dispositivos descargan la formulación a través de una válvula
adaptada para administrar un volumen medido, de forma típica desde
10 a 200 ul, para producir un pulverizado de partículas finas que
contiene la proteína. Los propelentes adecuados incluyen ciertos
compuestos clorofluorocarbonados, por ejemplo,
diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano
y sus mezclas. La formulación puede contener, además, uno o más
codisolventes, por ejemplo, etanol, tensioactivos, como ácido oleico
o trioleato de sorbitán, antioxidantes y agentes aromatizantes
adecuados.
Para dispositivos inhaladores de dosis medida o
de polvo seco, el aerosol, tanto si está formado por partículas
sólidas o líquidas, puede ser producidos por el generador de
aerosoles con una velocidad de aproximadamente 5 a 150 litros por
minutos, más preferiblemente desde aproximadamente 10 a 100 litros
por minutos, y lo más preferible para inhaladores de dosis medida
desde aproximadamente 10 a 50 litros por minuto, y lo más preferible
para inhaladores de polvo seco aproximadamente 60 litros por
minuto. Los aeroles generados mediante nebulizadores, chorro o
ultrasonido pueden ser producidos por el generador de aerosoles con
una velocidad desde aproximadamente 1 a 100 litros por minuto, más
preferiblemente desde aproximadamente 4 a 10 litros por minuto. Los
aerosoles que contienen cantidades mayores de proteína pueden
administrarse con más rapidez.
La dosificación del inhibidor de proteasas
variará dependiendo del trastorno que se va a tratar y del estado
del sujeto. La dosis diaria puede dividirse en una o varias
administraciones de dosis unitarias. La dosis diaria en peso puede
variar desde aproximadamente 0,01 a 20 miligramos de partículas
respirables para un sujeto humano, dependiendo de la edad y
trastorno del sujeto.
Las formulaciones farmacéuticas en partículas
sólidas o líquidas que contienen los inhibidores de proteasas de la
presente invención deben incluir partículas de tamaño respirable: es
decir, partículas de un tamaño lo suficientemente pequeño para
pasar a través de la boca y la laringe después de la inhalación, y
hacia los bronquios y alvéolos de los pulmones. En general, las
partículas que varían desde aproximadamente 1 a 8 micras de tamaño
(más en concreto, menos de aproximadamente 6 micras de tamaño) son
respirables. Las partículas de tamaño no respirable que se incluyen
en el aerosol tienden a depositarse en la garganta y se tragan, y la
cantidad de partículas no respirables en el aerosol preferiblemente
se minimiza. Para la administración nasal, se prefiere un tamaño de
partícula en el intervalo de 10-500 micras para
asegurar la retención en la cavidad nasal.
En la fabricación de una formulación según la
invención, el inhibidor de proteasas, de forma típica, se mezcla,
entre otros, con un vehículo aceptable. El vehículo, por supuesto,
debe ser aceptable en el sentido de ser compatible con cualquier
otro ingrediente en la formulación y no debe ser perjudicial para el
paciente. El vehículo puede ser un sólido o un líquido, o ambos, y
preferiblemente se formula con el compuesto como una formulación de
dosis unitaria, por ejemplo, una cápsula, que puede contener desde
0,5% a 99% en peso del compuesto activo. Uno o más compuestos
activos pueden incorporarse en las formulaciones de la invención, y
dichas formulaciones pueden prepararse mediante cualquiera de las
técnicas muy conocidas de farmacia, que consisten esencialmente en
mezclar los componentes.
Las composiciones que contienen partículas secas
respirables del inhibidor de proteasas pueden prepararse triturando
el inhibidor con un mortero y una mano de mortero, y después
haciendo pasar la composición micronizada a través de un tamiz de
malla 400 para romper o separar los aglomerados grandes.
La composición farmacéutica puede contener
opcionalmente un dispersante que actúa para facilitar la formación
de un aerosol. Un dispersante adecuado es la lactosa, que puede
mezclarse con el agente activo en cualquier proporción adecuada
(por ejemplo, una proporción de 1 a 1 en peso).
Pueden emplearse estrategias de terapia génica
ex vivo e in vivo generales para dirigir los
constructos de ácidos nucleicos que codifican las proteínas
inhibidoras de serinproteasas de tipo Kunitz, como bikunina,
aprotinina o sus fragmentos y variantes, como las descritas en el
documento WO 97/33996 (Bayer Corp.) y la patente de EEUU nº
5.407.915 (Bayer AG). Las técnicas de terapia génica que
principalmente se basan en virus se han utilizado para transformar
células pulmonares, como un medio para tratar las manifestaciones de
FQ en el pulmón y los tejidos extrapulmonares asociados. Véase el
documento WO 93/03709, publicado el 3 de marzo, 1993, que describe
el uso de vectores retrovíricos y no retrovíricos (por ejemplo,
adenovirus y virus adenoasociados) para la expresión estable del
gen CFTR en paciente con FQ. Como alternativa, también se conocen
métodos no víricos para dirigir ácidos nucleicos exógenos. Véase el
documento WO 93/12240, publicado el 24 de junio, 1993, y las
referencias citadas en él, que describe módulos de transcripción o
expresión que incluyen la secuencia codificadora de una molécula
CFTR unida operablemente a secuencias reguladoras funcionales en
mamíferos. Los constructos de ácido nucleico se suministran
entonces a los conductos respiratorios y los alvéolos del pulmón
mediante una serie de formas, incluyendo la administración en
aerosol por sí sola o junto con complejos basados en lípidos, por
ejemplo Lipofectin^{TM}. El documento WO 95/26356, publicado el 5
de octubre, 1995, describe ejemplos representativos de lípidos
útiles para la transfección.
La existencia de una proteína humana
diferenciada homóloga en su función con la aprotinina se dedujo
después de un análisis exclusivo de las entradas de secuencias en
la base de datos de secuencia expresada marcada (denominada en lo
sucesivo dbEST) en el NCBI (National Center for Biological
Information, Maryland). Utilizando el algoritmo TBlastN (BLAST, o
Basic Local Alignment Search Tool, que utiliza el método de Altschul
et al., 1990, J. Mol. Biol., 215, 00
403-410, para buscar similitudes entre una secuencia
problema y todas las secuencias en una base de datos, proteínas o
ácidos nucleicos en cualquier combinación), se estudió la base de
datos para detectar secuencias de nucleótidos que presentan
homología con la secuencia de la
pre-pro-aprotinina bovina,
Trasylol®. Esta búsqueda de numerosos clones se redujo, de forma
selectiva, a dos clones concretos que probablemente codificaban una
secuencia de aminoácidos deducida que se corresponde con una
proteína humana homóloga en función con la aprotinina. Las
secuencias de ácidos nucleicos elegidas son R35464 (SEQ ID NO:12) y
R74593 (SEQ ID NO:14), que se generaron a partir de un banco de
ácidos nucleicos placentarios humanos. En la secuencia de la
proteína traducida, en el marco de lectura abierto más largo de
R35464 (SEQ ID NO:13), faltaba una de las 6 cisteínas que son
críticas para la formación de la estructura covalente del dominio de
Kunitz, lo que significa que la secuencia del ácido nucleico de
R35464 no produce un inhibidor funcional. De forma similar, el
marco de lectura abierto más largo del clon R74593 (SEQ ID NO:15)
contiene un codón de terminación 5' con respecto a la región que
codifica la secuencia de tipo Kunitz, lo que significa que esta
secuencia no puede traducirse para producir un dominio de Kunitz
segregado funcional. El significado de estas secuencias por sí
solas no está claro. Es posible que representen a) los productos de
pseudogenes, b) regiones de mRNA sin traducir, o c) los productos
de mRNA viable que se han secuenciado de forma incorrecta.
Para aislar y determinar de forma específica la
secuencia humana real, se diseñaron cebadores de cDNA que son
capaces de hibridarse con secuencias colocadas 5' y 3' con respecto
al segmento de cDNA que codifica las secuencias de tipo Kunitz
propuestas por los inventores que se encuentran dentro de R35464 y
R74593. Los cebadores utilizados para amplificar un fragmento que
codifica la secuencia de tipo Kunitz de R74593 son:
CGAAGCTTCATCTCCGAAGCTCCAGACG | (el cebador 3' con un sitio HindIII; | SEQ ID NO:33), y |
AGGATCTAGACAATAATTACCTGACCAAGGA | (el cebador 5' con un sitio XbaI; | SEQ ID NO:34). |
Estos cebadores se utilizaron para amplificar
mediante PCR (30 ciclos) un producto de 500 pares de bases a partir
de un banco de cDNA placentario humano de Clontech (MATCHMAKER, nº
de catálogo HL4003AB, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA), que se
subclonó en Bluescript-SK+ y se secuenció con el
cebador T3 con un kit Sequenase^{TM} versión 2.0. De forma
sorprendente, la secuencia del fragmento obtenida utilizando los
cebadores de los inventores es diferente de la secuencia listada en
la base de datos dbEST para el clon R74593. En concreto, la nueva
secuencia de los inventores contenía otra base guanosina insertada
3' con respecto al codón de terminación putativo, pero 5' con
respecto al segmento que codifica la secuencia de tipo Kunitz
(figura 3). La inserción de otra G desplaza el codón de terminación
fuera del marco de lectura para el dominio de tipo Kunitz (G en el
par de bases 114 de la secuencia corregida de R74593; figura 3).
Posteriores indagaciones en el dbEST para
detectar secuencias homólogas con la secuencia peptídica de tipo
Kunitz de R74593 produjeron H94519, derivado de un banco de retina
humana, y N39798. Estas secuencias contienen una secuencia de tipo
Kunitz que es casi idéntica al dominio de tipo Kunitz codificado en
R35464, excepto que contiene todas las seis cisteínas
características. Se utilizó la superposición de cada una de las
secuencias de nucleótidos con la de R74593 (corregida por la
inserción de G en pb 114) y R35464 para obtener una secuencia de
nucleótidos consenso para una bikunina placentaria humana parcial
(SEQ ID NO:9; figura 3). La secuencia consenso traducida produce un
marco de lectura abierto que se extiende desde el resto -18 a +179
(figura 3; traducción completa de SEQ ID NO:10) que contiene dos
secuencias de dominio de tipo Kunitz completas, dentro de la región
de los restos aminoácidos 17-64 y
102-159, respectivamente.
Posteriormente se intentaron obtener otras
secuencias 5' indagando en el dbEST con la secuencia R35464. Los
posibles apareamientos de esta búsqueda, que poseen otra secuencia
5', se utilizaron, a su vez, para reindagar en el dbEST. De esta
manera iterativa se identificaron una serie de secuencias 5'
solapantes, que incluían los clones H16866, T66058, R34808, R87894,
N40851 y N39876 (figura 4). El alineamiento de algunas de estas
secuencias sugiere la presencia de un ATG 5' que puede actuar como
un sitio de inicio para la síntesis de la secuencia de proteína
traducida consenso. A partir de esta información seleccionada, ahora
es posible la búsqueda selectiva y la determinación de secuencias
de ácidos nucleicos y polipéptidos de una proteína humana con una
función homóloga a la de la aprotinina.
La reinvestigación del dbEST reveló un número de
nuevas entradas EST que se muestran de forma esquemática en la
figura 4B. El solapamiento con estas otras EST permite la
construcción de una secuencia de oligonucleótido consenso mucho más
larga (figura 4C), que se extiende 5' y 3' más allá de la secuencia
de oligonucleótido original representada en la figura 3. De hecho,
la nueva secuencia, con una longitud total de 1,6 kilobases, se
extiende hasta la cola de poli-A 3'. El mayor número
de EST solapantes en cada posición de pares de bases a lo largo de
la secuencia mejora el nivel de confianza en ciertas regiones, como
la secuencia que se solapa con el extremo 3' de EST R74593 (figura
3). Varios EST solapantes en esta región corroboran dos deleciones
de bases críticas con relación a R74593 (que aparecen en negrita
subrayadas en la figura 4C, posiciones del mapa 994 y 1005). La
traducción de la nueva secuencia consenso (figura 4D) en el marco
que codifica la bikunina produce una forma de bikunina placentaria
que es mayor (248 aminoácidos) que la secuencia madura (179
aminoácidos) codificada a partir del consenso original (SEQ ID
NO:1), y se termina con un codón de terminación dentro del marco
dentro del oligonucleótido consenso. El aumento del tamaño es debido
a un desplazamiento en el marco en la región codificadora 3' que
aparece como resultado de la eliminación de dos inserciones de bases
exclusivas de EST R74593. El desplazamiento del marco mueve el
codón de terminación del consenso original (figura 3) fuera del
marco, permitiendo la lectura de un nuevo marco que codifica la
secuencia de aminoácidos adicional. El nuevo producto de la
traducción (figura 4D) es idéntico a la secuencia consenso de la
proteína original (SEQ ID NO:1) entre los restos +1 a +175 (que
codifica los dominios de Kunitz), pero que contiene una nueva
extensión C-terminal que muestra un dominio
transmembrana largo de 24 restos putativo (subrayado en la figura
4D), seguido de un dominio citoplásmico corto de 31 restos. La
secuencia concreta alrededor del iniciador metionina y el péptido
señal es, de alguna manera, provisional, debido a la considerable
heterogeneidad entre los EST solapantes en esta región.
El análisis de la secuencia de la proteína
mediante Geneworks^{TM} resalta los restos asparagina en las
posiciones 30 y 67 como sitios consenso para la glicosilación
N-unida putativa. La asparagina 30 no se observó
durante la secuenciación N-terminal de la proteína
de longitud completa aislada a partir de placenta humana, que
resulta coherente con que está glicosilada.
La existencia de un mRNA humano correspondiente
a la secuencia de nucleótidos de bikunina humana putativa inferida
a partir del análisis de la figura 3 se confirmó como sigue. El
cebador de ácido nucleico que se hibrida 5' con la secuencia de
cDNA que codifica los dominios de Kunitz de R35464 (p.b.
3-27 de la secuencia de nucleótidos consenso en la
figura 3):
GGTCTAGAGGCCGGGTCGTTTCTCGCCTGGCTGGGA (un cebador
5' derivado de la secuencia R35464 con un sitio XbaI; SEQ ID
NO:35), y el cebador de ácido nucleico que se hibrida 3' con la
secuencia que codifica los dominios de Kunitz de R74593 (p.b.
680-700 de la secuencia de nucleótidos consenso en
la figura 3), se utilizaron para amplificar mediante PCR, a partir
de un banco placentario humano de Clontech, un fragmento del tamaño
esperado (aproximadamente 670 p.b.) de una secuencia de nucleótidos
consenso de cDNA que codifica la secuencia de la bikunina
placentaria de la figura 3 (mostrada de forma esquemática en la
figura 4A).
Utilizando un cebador 5' que se hibrida con una
secuencia en R87894 que está 126 p.b. 5' con respecto al sitio de
inicio ATG putativo analizado anteriormente (que se muestra de forma
esquemática en la figura 4A en p.b. 110), más el mismo cebador 3'
de R74593 que se utilizó anteriormente, es posible amplificar un
fragmento procedente de un banco placentario humano de Clontech con
el tamaño esperado (aproximadamente 872 p.b.) predicho mediante el
solapamiento de EST (que se muestra de forma esquemática en la
figura 4).
La secuenciación del fragmento de 872 p.b.
demostró que contenía un segmento de nucleótidos que se corresponde
con p.b 110 a 218 de EST R87894 en su extremo 5', y con p.b. 310 a
542 de la secuencia consenso para la bikunina placentaria inferida
a partir del análisis del solapamiento de EST (de la figura 3) en su
extremo 3'. Esta secuencia de nucleótidos 3' contiene todos los
dominios de tipo Kunitz codificados por la bikunina placentaria
(102-159).
Para obtener un cDNA que codifica la región
extracelular completa de la proteína, se utilizó el siguiente
cebador de PCR 5':
CACCTGATCGCGAGACCCC (SEQ ID NO:36), diseñado
para hibridarse con una secuencia dentro de EST R34808, con el
mismo cebador 3' de EST R74595, para amplificar (30 ciclos) un
producto de cDNA de aproximadamente 780 pares de bases procedente
del banco de cDNA placentario. Este producto se purificó en gel y se
clonó en el vector TA (Invitrogen) para la secuenciación del DNA
mediante el método didesoxi (Sanger F. et al., 1977, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 74, pp. 5463-5467) con los
siguientes cebadores:
Específico del vector:
- GATTTAGGTGACACTATAG (SP6)
- (SEQ ID NO:37)
- TAATACGACTCACTATAGGG (T7)
- (SEQ ID NO:38)
\vskip1.000000\baselineskip
Específico del gen:
- TTACCTGACCAAGGAGGAGTGC
- (SEQ ID NO:39)
- AATCCGCTGCATTCCTGCTGGTG
- (SEQ ID NO:40)
- CAGTCACTGGGCCTTGCCGT
- (SEQ ID NO:41)
La secuencia de cDNA resultante aparece en la
figura 4E junto con el producto de su traducción. Al nivel de
nucleótidos, la secuencia muestra sólo pequeñas diferencias de la
secuencia EST consenso (figura 4D). La traducción de la secuencia
produce una secuencia codificadora que contiene un sitio ATG
iniciador dentro del marco, un péptido señal y una secuencia de
bikunina placentaria madura y un dominio transmembrana. A la
secuencia traducida del producto de PCR le faltaban los últimos 12
restos aminoácidos del dominio citoplásmico, como consecuencia de
elegir el cebador 3' para la amplificación PCR. Esta elección del
cebador de PCR 3' (diseñado basándose en la secuencia de R74593)
también es responsable de la introducción de una mutación de S a F
artefactual en la posición del aminoácido 211 de la secuencia
derivada de PCR traducida. El péptido señal deducido de la
traducción del fragmento PCR es un poco diferente al del EST
consenso.
Para obtener un cDNA de bikunina placentaria de
longitud completa, el producto derivado de la PCR (figura 4E) se
purificó en gel y se utilizó para aislar un clon de longitud
completa no basado en PCR que representa la secuencia de la
bikunina. La secuencia de cDNA derivada de PCR se marcó con
^{32}P-CTP mediante High Prime (Boehringer
Mannheim) y se utilizó para sondar un banco de cDNA placentario
(Stratagene, banco \lambda Unizap^{TM}) utilizando técnicas de
hibridación de colonias. Aproximadamente 20 x 10^{6} placas de
fagos se sometieron a 3 rondas de búsqueda y purificación en
placas. Se consideró que dos clones eran de longitud completa
(aproximadamente 1,5 kilobases), según se determinó mediante
análisis de enzimas de restricción y basándose en la comparación
con el tamaño de la secuencia consenso EST (véase anteriormente). La
secuenciación de uno de estos clones mediante el método didesoxi
produjo la secuencia de oligonucleótido que aparece en la figura
4F. El producto de la traducción de esta secuencia produce una
proteína con la metionina iniciadora dentro del marco, el péptido
señal y la secuencia de bikunina placentaria madura. La secuencia de
bikunina placentaria madura es idéntica a la secuencia de la
proteína madura obtenida mediante traducción de la secuencia
consenso EST, aunque la secuencia y longitud del péptido señal
difieren. A diferencia del producto de PCR, el cDNA obtenido
mediante hibridación de colonias contiene el ectodominio, el dominio
transmembrana, el dominio citoplásmico y el codón de terminación
dentro del marco completos. De hecho, el clon se extiende toda la
longitud hasta la cola de poli-A. A la metionina
iniciadora le sigue un péptido señal hidrófobo que es idéntico al
péptido señal codificado en el clon derivado de PCR. Posteriormente,
se expresaron y purificaron fragmentos solubles de la bikunina
placentaria, la bikunina (1-170), a partir de
células Sf9 (ejemplo 9) y células CHO (ejemplo 17), y se descubrió
que eran inhibidores de proteasas funcionales (ejemplos 10 y 18).
Además, se aisló, a partir de placenta humana, un fragmento soluble
de bikunina placentaria que también era un inhibidor de proteasas
activo (ejemplo 7).
Basándose en las anteriores observaciones,
parece que la bikunina placentaria de longitud completa tiene la
capacidad para existir como una proteína transmembrana sobre la
superficie de células, así como en forma de proteína soluble. Se
sabe que otras proteínas transmembrana que contienen dominios de
Kunitz sufren un procesamiento proteolítico para producir mezclas
de formas asociadas a membranas y solubles. Éstas incluyen dos
formas de una proteína precursora de amiloides denominada APP751
(Esch F. et al., 1990, Science, 248, pp.
1122-1124) y APP770 (Wang R. et al., 1991,
J. Biol. Chem., 266, pp. 16960-16964).
La activación por contacto es un proceso que se
activa mediante la exposición de superficies vasculares dañadas a
los componentes de la cascada de la coagulación. La angiogénesis es
un proceso que implica la activación local de plasmina en las
superficies endoteliales. La especificidad de la bikunina
placentaria y su capacidad putativa para anclarse a superficies
celulares sugiere que las funciones fisiológicas de la bikunina
placentaria transmembrana pueden incluir la regulación de la
activación por contacto y la angiogénesis.
Las secuencias de aminoácidos de la bikunina
placentaria (7-64), la bikunina
(102-159) y la bikunina placentaria de longitud
completa (figura 4F) se buscaron frente a las bases de datos de
proteínas PIR (versión 46.0) y PatchX (versión 46.0), así como la
base de datos de proteínas GeneSeq (versión 20.0) de secuencias
patentadas utilizando el programa Fast A de Genetics Computer
Group. Utilizando el programa TFast A de Genetics Computer Group
(Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
85:2444-2448), y estas mismas secuencias de
proteínas se buscaron frente a las traducciones de seis marcos de
las bases de datos de nucleótidos GenBank (versión 92.0 con
actualizaciones hasta 26/1/96) y EMBL (versión modificada 45.0), así
como la base de datos de nucleótidos GeneSeq (versión 20.0) de
secuencias patentadas. Las subseries EST y STS de GenBank y EMBL no
se incluyeron en esta serie de búsquedas. Los mejores
emparejamientos resultantes de estas búsquedas contenían secuencias
que sólo eran 50% idénticas en su longitud completa a la secuencia
de proteína de 58 aminoácidos derivada del análisis de los
inventores de los clones R74593 y R35464.
Tal como se mencionó anteriormente, los péptidos
sintéticos que se correponden con la bikunina (7-64)
y la bikunina (102-159), según se determinan a
partir de la secuencia consenso traducida para la bikunina (figura
3), pudieron ser replegados (ejemplos 2 y 1, respectivamente) para
producir la proteína inhibidora calicreína activa (ejemplo 4 y 3,
respectivamente). Los inventores han aprovechado esta propiedad
inesperada para diseñar un esquema de purificación para aislar la
bikunina placentaria nativa a partir de tejido humano.
Utilizando un esquema de purificación que emplea
la cromatografía de afinidad de sefarosa-calicreína
como primera etapa, se aisló un potente inhibidor de calicreína
nativo muy purificado. La bikunina humana nativa aislada tiene un
N-terminal idéntico (secuenciado para 50 restos
aminoácidos) que la secuencia predicha mediante la traducción de la
secuencia de ácido nucleico consenso (figura 3), restos aminoácidos
+1 a +50 (ejemplo 7). Esto confirma, por primera vez, la existencia
de un nuevo inhibidor de calicreína nativo aislado a partir de
placenta humana.
Los dominios de tipo Kunitz conocidos se listan
a continuación. Los restos que se cree que se ponen en contacto con
las proteasas diana se indican como de especial interés
(negrita/subrayado). Estos restos concretos se denominan posiciones
Xaa^{1-16} para la referencia específica, según se
muestra mediante el marcador Xaa.
\vskip1.000000\baselineskip
Bikunina (7-64) (SEQ ID
NO:4)
\vskip1.000000\baselineskip
Bikunina (102-159) (SEQ ID
NO:6)
\vskip1.000000\baselineskip
Precursor 1 del inhibidor de la vía del factor
tisular (SEQ ID NO:18)
\vskip1.000000\baselineskip
Precursor 1 del inhibidor de la vía del factor
tisular (SEQ ID NO:19)
\vskip1.000000\baselineskip
Precursor del inhibidor de la vía del factor
tisular (SEQ ID NO:20)
\vskip1.000000\baselineskip
Precursor 2 del inhibidor de la vía del factor
tisular (SEQ ID NO:21)
\vskip1.000000\baselineskip
Precursor 2 del inhibidor de la vía del factor
tisular (SEQ ID NO:22)
\newpage
Homólogo de la proteína precursora de amiloides
(SEQ ID NO:23)
\vskip1.000000\baselineskip
Aprotinina (SEQ ID NO:24)
\vskip1.000000\baselineskip
Precursor del inhibidor de
inter-\alpha-tripsina (SEQ ID
NO:25)
\vskip1.000000\baselineskip
Precursor del inhibidor de
inter-\alpha-tripsina (SEQ ID
NO:26)
\vskip1.000000\baselineskip
Proteína precursora de amiloides (SEQ ID
NO:27)
\vskip1.000000\baselineskip
Precursor del colágeno \alpha3(VI) (SEQ
ID NO:28)
\vskip1.000000\baselineskip
HKI-B9 (SEQ ID NO:29)
La bikunina placentaria, los dominios aislados u
otros variantes de la presente invención pueden producirse mediante
síntesis peptídica en fase sólida convencional, utilizando la
química de t-Boc según describen Merrifield R.B. y
Barany G., en: The peptides, Analysis, Synthesis, Biology, 2, Gross
E. et al., eds., Academic Press, 1980, capítulo 1; o
utilizando la química de F-moc, según describen
Carpino L.A. y Han G.Y., 1970, J. Amer. Chem. Soc., 92,
5748-5749, y se ilustra en el ejemplo 2. Como
alternativa, la expresión de un DNA que codifica el variante de
bikunina placentaria puede utilizarse para producir variantes de
bikunina placentaria recombinantes.
La presente invención proporciona el uso de un
inhibidor de serinproteasas humanas purificado que puede inhibir,
de forma específica, la calicreína, que se ha aislado a partir de
tejido placentario humano mediante cromatografía de afinidad. El
inhibidor de serinproteínas humanas, denominado en la presente
bikunina placentaria humana, contiene dos dominios de inhibidor de
serinproteasas de la clase Kunitz. En una realización concreta, la
presente invención proporciona el uso de una proteína que tiene la
secuencia de aminoácidos:
(SEQ ID NO:1), en la fabricación de un
medicamento para acelerar la velocidad de EMC.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, la presente
invención proporciona el uso de una proteína bikunina (bikunina
(1-170)) que tiene la secuencia de aminoácidos:
(SEQ ID NO:52), en la fabricación de un
medicamento para acelerar la velocidad de EMC.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto, la actividad biológica de la
proteína útil en la práctica de la presente invención es que puede
unirse a la tripsina, las calicreínas plasmáticas y tisulares
humanas, la plasmina humana y el factor XIIa e inhibir
sustancialmente su actividad biológica. En una realización
preferida, la presente invención proporciona la proteína bikunina
placentaria humana nativa en forma glicosilada. En otra realización,
la presente invención incluye la proteína bikunina humana nativa
que se ha formado de forma que contiene al menos un enlace disulfuro
cisteína-cisteína. En una realización preferida, la
proteína contiene al menos un enlace disulfuro
cisteína-cisteína dentro de la cadena formado entre
un par de cisteínas seleccionadas del grupo que consiste en
CYS11-CYS61, CYS20-CYS44,
CYS36-CYS57, CYS106-CYS156,
CYS115-CYS139 y CYS131-CYS152, en
las que las cisteínas se numeran según la secuencia de aminoácidos
de la bikunina placentaria humana nativa. Un experto en la técnica
reconocerá que la proteína de la presente invención puede plegarse
en la conformación tridimensional apropiada, de forma que se
mantiene la actividad biológica de la bikunina humana nativa, en la
que ninguno, uno o más, o todos los enlaces disulfuro
cisteína-cisteína dentro de la cadena están
presentes. En una realización más preferida, la proteína de la
presente invención se pliega de forma apropiada y se forma con todos
los enlaces disulfuro cisteína-cisteína nativos
apropiados.
La proteína activa para utilizar en la presente
invención puede obtenerse mediante purificación a partir de un
tejido humano, como placenta, o mediante técnicas de química de
proteínas sintéticas, según se ilustra en los ejemplos a
continuación. También se entiende que la proteína que se va a
utilizar en la presente invención puede obtenerse utilizando
técnicas de biología molecular, en las que vectores autorreplicables
son capaces de expresar la proteína de la presente invención a
partir de células transformadas. Esta proteína puede fabricarse
como forma no segregada, o segregada a partir de células
transformadas. Para facilitar la secreción a partir de las células
transformadas, para mejorar la estabilidad funcional de la proteína
traducida, o para ayudar al plegamiento de la proteína bikunina,
pueden añadirse ciertas secuencias de péptido señal a la porción
NH2-terminal de la proteína bikunina humana
nativa.
En una realización, el uso de la presente
invención, por tanto, proporciona el uso de la proteína bikunina
humana nativa con al menos una porción de la secuencia del péptido
señal nativa intacta. Por tanto, una realización del uso de la
invención proporciona el uso de la bikunina humana nativa con al
menos parte del péptido señal, que tiene la secuencia de
aminoácidos:
(SEQ ID NO:2).
En una realización preferida, el uso de la
presente invención proporciona el uso de una proteína bikunina
placentaria humana nativa con parte de la secuencia conductora
intacta, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52 con
un segmento conductor intacto que tiene la secuencia de
aminoácidos:
(SEQ ID NO:53).
En otra realización, el uso de la presente
invención proporciona el uso de una proteína bikunina con parte de
la secuencia conductora intacta, que tiene la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO:52 con el segmento conductor intacto que
tiene la secuencia de aminoácidos:
(SEQ ID NO:54).
En un sistema de numeración preferido utilizado
en la presente, el aminoácido numerado +1 se asigna al
NH2-terminal de la secuencia de aminoácidos para la
bikunina placentaria humana nativa. Se reconoce con facilidad que
pueden derivarse fragmentos de proteína funcionales a partir de la
bikunina placentaria humana nativa, que mantienen al menos parte de
la actividad biológica de la bikunina placentaria humana nativa, y
actúan como inhibidores de serinproteasas.
En una realización, la proteína para utilizar en
el uso de la presente invención comprende un fragmento de la
bikunina placentaria humana nativa, que contiene al menos un dominio
de tipo Kunitz funcional, que tiene la secuencia de aminoácidos de
la bikunina placentaria humana nativa de los aminoácidos
7-159, en lo sucesivo denominada "bikunina
(7-159)". Por tanto, el uso de la presente
invención incluye un uso de una proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos:
(SEQ ID NO:3), en la que la numeración de los
aminoácidos se corresponde con la de la secuencia de aminoácidos de
la bikunina placentaria humana nativa. Otro variante funcional de
esta realización puede ser el fragmento de bikunina placentaria
humana nativa, que contiene al menos un dominio de tipo Kunitz
funcional, que tiene la secuencia de aminoácidos de la bikunina
placentaria humana nativa de los aminoácidos 11-156,
la bikunina (11-156):
(SEQ ID NO:50).
Puede reconocerse que los dominios de tipo
Kunitz individuales también son fragmentos de la bikunina
placentaria nativa. En concreto, el uso de la presente invención
contempla el uso de una proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos de un primer dominio de tipo Kunitz que consiste en la
secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa
de los aminoácidos 7-64, en lo sucesivo denominada
"bikunina (7-64)". Por tanto, en una
realización, el uso de la presente invención incluye el uso de una
proteína que contiene al menos un dominio de tipo Kunitz que tiene
la secuencia de aminoácidos:
(SEQ ID NO:4), en la que la numeración de los
aminoácidos se corresponde con la de la secuencia de aminoácidos de
la bikunina placentaria humana nativa. Otra forma de la proteína
utilizada en la presente invención puede ser un primer dominio de
tipo Kunitz que consiste en la secuencia de aminoácidos de la
bikunina placentaria humana nativa de los aminoácidos
11-61, la "bikunina (11-61)",
que tiene la secuencia de aminoácidos:
(SEQ ID NO:5).
El uso de la presente invención también
proporciona el uso de una proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos de un dominio de tipo Kunitz que consiste en la
secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa
de los aminoácidos 102-159, en lo sucesivo
denominada "bikunina (102-159)". Por tanto, una
realización del uso de la presente invención incluye el uso de una
proteína que contiene al menos un dominio de tipo Kunitz que tiene
la secuencia de aminoácidos:
(SEQ ID NO:6), en la que la numeración de los
aminoácidos se corresponde con la de la secuencia de aminoácidos de
la bikunina placentaria humana nativa. Otra forma de este dominio
puede ser un dominio de tipo Kunitz que consiste en la secuencia de
aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa de los
aminoácidos 106-156, la "bikunina
(106-156)", que tiene la secuencia de
aminoácidos:
(SEQ ID NO:7).
Por tanto, un experto en la técnica reconocerá
que pueden fabricarse fragmentos de la proteína bikunina humana
nativa que mantengan al menos parte de la actividad biológica de la
proteína nativa. Estos fragmentos también pueden combinarse en
orientaciones diferentes o múltiples combinaciones para proporcionar
proteínas alternativas que mantienen parte, la misma o más
actividad biológica que la proteína bikunina humana nativa.
Se reconoce con facilidad que la proteína
biológicamente activa empleada en el uso de la presente invención
puede comprender uno o más de los presentes dominios de tipo Kunitz
junto con otros dominios de tipo Kunitz procedentes de otras
fuentes. La proteína biológicamente activa para usar en la presente
invención puede comprender uno o más de los presentes dominios de
tipo Kunitz junto con otros dominios de proteínas procedentes de
otras fuentes con una diversidad de actividades biológicas. La
actividad biológica de la proteína útil para la práctica de la
presente invención puede combinarse con la de otra proteína o
proteínas conocidas para proporcionar proteínas de fusión
multifuncionales que tienen una actividad biológica predecible.
Un marco de lectura abierto que termina en un
codón de terminación temprano todavía puede codificar una proteína
funcional. El uso de la presente invención incluye esta terminación
alternativa, y en una realización proporciona el uso de una
proteína con la secuencia de aminoácidos:
(SEQ ID NO:8).
Una realización del uso de la invención
proporciona el uso de la bikunina humana nativa, con una secuencia
conductora intacta, y con al menos parte del dominio transmembrana
(subrayado), que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada
de:
en las que EST es la secuencia
consenso derivada de EST de SEQ ID NO:45, PCR es el clon de PCR de
SEQ ID NO:47, y \lambdacDNA es el clon de cDNA lambda SEQ ID
NO:49. En una realización preferida, una proteína para utilizar en
la presente invención comprende una de las secuencias de aminoácidos
de SEQ ID NO:45, 47 ó 49, en las que la proteína se ha roto en la
región entre el final del último dominio de Kunitz y la región
transmembrana
(subrayada).
La proteína también puede utilizarse cuando el
péptido señal se deleciona, por ejemplo una proteína que tiene la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52 continua con una secuencia
de aminoácidos transmembrana:
(SEQ ID NO:69)
\vskip1.000000\baselineskip
una secuencia de aminoácidos transmembrana:
(SEQ ID NO:68)
\vskip1.000000\baselineskip
o una secuencia de aminoácidos
transmembrana:
(SEQ ID NO:67).
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también incluye el uso de las
siguientes proteínas:
(SEQ ID NO:71);
o
(SEQ ID NO:70).
Las secuencias de aminoácidos para utilizar en
la presente invención indican claramente a un experto en la técnica
las secuencias de ácidos nucleicos apropiadas que pueden utilizarse
en técnicas de biología molecular para producir las proteínas para
utilizar en la presente invención. La descripción describe el uso de
una secuencia de ácido nucleico que codifica una bikunina human que
tiene la secuencia de DNA consenso de la figura 3 (SEQ ID NO:9),
que se traduce en la secuencia de aminoácidos de la bikunina
placentaria humana nativa de la figura 3 (SEQ ID NO:10). La
descripción también describe una secuencia de ácido nucleico
consenso de la figura 4C (SEQ ID NO:51) que codifica una secuencia
de aminoácidos de la figura 4D (SEQ ID NO:45).
También se describe el uso de una secuencia de
ácido nucleico que codifica la bikunina placentaria humana nativa
que tiene la secuencia de DNA de la figura 4F (SEQ ID NO:48) que
codifica la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO:49, y una
secuencia de ácido nucleico de la figura 4E (SEQ ID NO:46) que
codifica la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO:47.
También se describen métodos para estimular la
EMC en un paciente que sufre una disfunción mucociliar, en los que
una cantidad eficaz de los inhibidores de serinproteasas humanas
descritos de la presente invención en un vehículo biológicamente
compatible se administran al paciente.
La presente descripción también describe un
método para estimular la EMC que emplea variantes de la bikunina
placentaria, y los dominios de Kunitz específicos descritos
anteriormente, que contienen sustituciones de aminoácidos que
alteran la especificidad de la proteasa. Los sitios preferidos de
sustitución se indican a continuación como las posición Xaa^{1} a
Xaa^{32} en la secuencia de aminoácidos de la bikunina placentaria
nativa. Las sustituciones en Xaa^{1} a Xaa^{16} también son
preferidas para los variantes de la bikunina
(7-64), mientras que las sustituciones Xaa^{17} a
Xaa^{32} son preferidas para los variantes de la bikunina
(102-159).
Por tanto, la descripción describe el uso de una
proteína que tiene la secuencia de aminoácidos:
(SEQ ID NO:11),
en la que
Xaa^{1}-Xaa^{32} representa cada uno
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos uno de los restos
aminoácidos Xaa^{1}-Xaa^{32} es diferente del
correspondiente resto aminoácido de la secuencia
nativa.
En el presente contexto, la expresión
"aminoácido que aparece en la naturaleza" pretende indicar
cualquiera de los 20 aminoácidos que aparecen de forma habitual, es
decir, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys,
Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
Sustituyendo uno o más aminoácidos en una o más
de las posiciones indicadas anteriormente es posible cambiar el
perfil de especificidad inhibidora de la bikunina placentaria
nativa, o el de los dominios de tipo Kunitz individuales, la
bikunina (7-64) o la bikunina
(102-159), de forma que inhiba con preferencia otras
serinproteasas como por ejemplo, aunque no se limitan a las enzimas
de la cascada del complemento, TF/FVIIa, FXa, prostatina, trombina,
elastasa de neutrófilos, catepsina G o
proteinasa-3.
Los ejemplos de variantes preferidos de la
bikunina placentaria incluyen aquellos en los que Xaa^{1} es un
resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en His, Glu,
Pro, Ala, Val o Lys, en particular en los que Xaa^{1} es His o
Pro; o en los que Xaa^{2} es un resto aminoácido seleccionado del
grupo que consiste en Val, Thr, Asp, Pro, Arg, Tyr, Gly, Ala, Lys,
en particular en los que Xaa^{2} es Val o Thr; o en los que
Xaa^{3} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste
en Arg, Pro, Ile, Leu, Thr, en particular en los que Xaa^{3} es
Arg o Pro; o en los que Xaa^{4} es un resto aminoácido
seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys y Ser, Gln, en
particular en los que Xaa^{4} es Arg o Lys; o en los que Xaa^{5}
es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala,
Gly, Asp, Thr, en particular en los que Xaa^{5} es Ala; o en los
que Xaa^{6} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Ser, Ile, Tyr, Asn, Leu, Val, Arg, Phe, en particular
en los que Xaa^{6} es Ser o Arg; o en los que Xaa^{7} es un
resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Phe,
Ile, Glu, Leu, Thr y Val, en particular en los que Xaa^{7} es Met
o Ile; o en los que Xaa^{8} es un resto aminoácido seleccionado
del grupo que consiste en Pro, Lys, Thr, Gln, Asn, Leu, Ser o Ile,
en particular en los que Xaa^{8} es Pro o Ile; o en los que
Xaa^{9} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste
en Arg, Lys o Leu, en particular en los que Xaa^{9} es Arg; o en
los que Xaa^{10} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Val, Ile, Lys, Ala, Pro, Phe, Trp, Gln, Leu y Thr, en
particular en los que Xaa^{10} es Val; o en los que Xaa^{11} es
un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly, Ser
y Thr, en particular en los que Xaa^{11} es Gly; o en los que
Xaa^{12} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Asp, Arg, Glu, Leu, Gln, Gly, en particular en los que
Xaa^{12} es Asp o Arg; o en los que Xaa^{13} es un resto
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly y Ala; o en
los que Xaa^{14} es un resto aminoácido seleccionado del grupo
que consiste en Asn o Lys; o en los que Xaa^{15} es un resto
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly, Asp, Leu,
Arg, Glu, Thr, Tyr, Val y Lys, en particular en los que Xaa^{15}
es Leu o Lys; o en los que Xaa^{16} es un resto aminoácido
seleccionado del grupo que consiste en Val, Gln, Asp, Gly, Ile,
Ala, Met y Val, en particular en los que Xaa^{16} es Val o Ala; o
en los que Xaa^{17} es un resto aminoácido seleccionado del grupo
que consiste en His, Glu, Pro, Ala, Lys y Val, en particular en los
que Xaa^{17} es Glu o Pro; o en los que Xaa^{18} es un resto
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Thr, Asp,
Pro, Arg, Tyr, Gly, Ala o Lys, en particular en los que Xaa^{18}
es Thr; o en los que Xaa^{19} es un resto aminoácido seleccionado
del grupo que consiste en Arg, Pro, Ile, Leu o Thr, en particular
en los que Xaa^{19} es Pro; o en los que Xaa^{20} es un resto
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys, Gln y
Ser, en particular en los que Xaa^{20} es Arg o Lys; o en los que
Xaa^{21} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Ala, Asp, Thr o Gly, en particular en los que
Xaa^{21} es Ala; o en los que Xaa^{22} es un resto aminoácido
seleccionado del grupo que consiste en Ser, Ile, Tyr, Asn, Leu,
Val, Arg o Phe, en particular en los que Xaa^{22} es Ser o Arg; o
en los que Xaa^{23} es un resto aminoácido seleccionado del grupo
que consiste en Met, Phe, Ile, Glu, Leu, Thr y Val, en particular
en los que Xaa^{23} es Phe o Ile; o en los que Xaa^{24} es un
resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Pro, Lys,
Thr, Asn, Leu, Gln, Ser o Ile, en particular en los que Xaa^{24}
es Pro o Ile; o en los que Xaa^{25} es un resto aminoácido
seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys o Leu, en
particular en los que Xaa^{25} es Arg; o en los que Xaa^{26} es
un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val,
Ile, Lys, Leu, Ala, Pro, Phe, Gln, Trp y Thr, en particular en los
que Xaa^{26} es Val o Ile; o en los que Xaa^{27} es un resto
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly, Ser y Thr,
en particular en los que Xaa^{27} es Gly; o en los que Xaa^{28}
es un resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp,
Arg, Glu, Leu, Gly o Gln, en particular en los que Xaa^{28} es
Arg; o en los que Xaa^{29} es un resto aminoácido seleccionado
del grupo que consiste en Gly y Ala; o en los que Xaa^{30} es un
resto aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asn o Lys; o
en los que Xaa^{31} es un resto aminoácido seleccionado del grupo
que consiste en Gly, Asp, Leu, Arg, Glu, Thr, Tyr, Val y Lys, en
particular en los que Xaa^{31} es Arg o Lys; o en los que
Xaa^{32} es un resto aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Val, Gln, Asp, Gly, Ile, Ala, Met y Thr, en particular
en los que Xaa^{32} es Gln o Ala.
También se describen constructos de DNA que
codifican los variantes de la proteína bikunina placentaria de la
presente invención. Estos constructos pueden prepararse mediante
métodos sintéticos, como los descritos en Beaucage S.L. y
Carruthers M.H., 1981, Tetrahedron Lett., 22, pp.
1859-1862; Matteucci M.D y Carruthers M.H, 1981, J.
Am. Chem. Soc., 103, p. 3185; o de DNA genómico o cDNA que puede
haberse obtenido seleccionando bancos genómicos o de cDNA con
sondas de cDNA diseñadas para hibridarse con la secuencia de DNA que
codifica la bikunina placentaria. La secuencia de DNA genómico o
cDNA puede modificarse en uno o más sitios para obtener un cDNA que
codifica cualquier sustitución o deleción de aminoácidos descrita en
esta descripción.
También se describen vectores de expresión que
contienen los constructos de DNA que codifican la bikunina
placentaria, dominios aislados u otros variantes del asunto
descrito, que pueden utilizarse para la producción de variantes de
bikunina placentaria recombinante. El cDNA debe conectarse a una
secuencia promotora adecuada que muestra actividad transcripcional
en la célula hospedante elegida, y debe poseer una terminación de la
transcripción y una señal de poliadenilación adecuados. El cDNA que
codifica el variante de bikunina placentaria puede condensarse con
un péptido señal 5' que produce la proteína codificada por el cDNA
para ser segregada. El péptido señal puede ser uno reconocido por
el organismo hospedante. En el caso de una célula hospedante de
mamífero, el péptido señal también puede ser el péptido señal
natural presente en la bikunina placentaria de longitud completa.
Los procedimientos utilizados para preparar estos vectores para la
expresión de los variantes de bikunina placentaria son muy
conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook
et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring
Harbor, Nueva York (1989).
También se describen células transformadas que
contienen los constructos de DNA que codifican la bikunina
placentaria, los dominios aislados u otros variantes de la presente
invención que pueden utilizarse para la producción de variantes de
bikunina placentaria recombinante. Existe una diversidad de
combinaciones de vectores de expresión y organismos hospedantes que
pueden utilizarse para la producción de los variantes de bikunina
placentaria. Las células hospedantes adecuadas incluyen células de
insecto Sf9 infectadas con baculovirus, células de mamífero como
BHK, CHO, Hela y C-127, bacterias como E.
coli, y levaduras como Saccharomyces cerevisiae. Los
métodos para utilizar los sistemas de expresión de mamífero, insecto
y microbianos necesarios para lograr la expresión de la bikunina
placentaria son muy conocidos en la técnica y se describen, por
ejemplo, en Ausubel F.M. et al., Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons (1995), capítulo 16. Para
los fragmentos de bikunina placentaria que contienen un único
dominio inhibidor de Kunitz, como la bikunina (7-64)
y (102-159), se prefieren los sistemas de expresión
de levaduras y E. coli, siendo los sistemas de levaduras más
preferidos. De forma típica, la expresión en levaduras se realiza
como se describe en la patente de EEUU 5.164.482 para variantes de
aprotinina, y adaptada en el ejemplo 5 de la presente descripción
para la bikunina placentaria (102-159). La
expresión en E. coli puede realizarse utilizando los métodos
descritos en la patente de EEUU 5.032.573. El uso de sistemas de
mamíferos y levaduras es más preferido para la expresión de
variantes de bikunina placentaria más grandes, que contienen ambos
dominios inhibidores, como el variante de bikunina
(7-159).
El DNA que codifica los variantes de la bikunina
placentaria que posee sustituciones de aminoácidos de la secuencia
de aminoácidos natural puede prepararse para la expresión de la
proteína recombinante utilizando los métodos de Kunkel T.A., 1985,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, pp. 488-492. De
forma breve, el DNA que se va mutagenizar se clona en un vector
bacteriófago monocatenario, como M13. Un oligonucleótido que abarca
la región que se va a cambiar y que codifica la sustitución se
hibrida con el DNA monocatenario, y se hace bicatenario mediante
técnicas de biología molecular convencionales. Este DNA se
transforma entonces en un hospedante bacteriano apropiado y se
verifica mediante secuenciación de didesoxinucleótidos. El DNA
correcto entonces se clona en el plásmido de expresión. Como
alternativa, el DNA diana puede mutagenizarse utilizando técnicas
de PCR convencionales, secuenciarse e insertarse en el plásmido de
expresión apropiado.
Los siguientes ejemplos concretos se ofrecen
como ilustración, y no limitación, de ciertos aspectos y
realizaciones preferidas de la presente invención.
Materiales y métodos/Reactivos
utilizados. El sustrato fluorogénico
Tos-Gly-Pro-Lys-AMC
se obtuvo en Bachem BioScience Inc. (King of Prussia, PA). El PNGB,
Pro-Phe-Arg-AMC,
Ala-Ala-Pro-Met-AMC,
la tripsina bovina (tipo III), la calicreína plasmática humana y la
plasmina humana son de Sigma (St. Louis, MO).
La aprotinina recombinante (Trasylol®) es de
Bayer AG (Wuppertal, Alemania). La resina Wang Gln precargada es de
Novabiochem (La Jolla, Ca). El tioanisol, el etanditiol y el
t-butil metil éter son de Aldrich (Milwaukee,
WI).
Se midió la cantidad de actividad inhibidora de
tripsina presente en la muestra replegada en diversas etapas de
purificación utilizando GPK-AMC como sustrato. La
tripsina bovina (200 pmoles) se incubó durante 5 minutos a 37ºC con
bikunina (7-64) o (102-159), en
diversas etapas de purificación, en tampón A (Hepes 50 mM, pH 7,5,
NaCl 0,1 M, CaCl_{2} 2 mM y Triton X-100 al
0,01%). Se añadió GPK-AMC (20 \muM final) y la
cantidad de cumarina producida se determinó midiendo la
fluorescencia (excit. = 370 nm, emis. = 432 nm) en un fluorímetro
Perkin-Elmer LS-50B durante un
periodo de 2 minutos. Para las muestras que se están ensayando se
calculó, para cada una, el porcentaje de inhibición según la
ecuación 1; en la que R_{0} es la proporción de aumento de la
fluorescencia en presencia del inhibidor, y R_{1} es la proporción
determinada en ausencia de muestra añadida. Una unidad de actividad
para el inhibidor se define como la cantidad necesaria para lograr
50% de inhibición en el ensayo utilizando las condiciones
descritas.
% de inhibición
= 100 x [1 –
R_{0}/R_{1}]
Síntesis. La bikunina placentaria
(102-159 (SEQ ID NO:6) se sintetizó en un
sintetizador de péptidos Applied Biosystems modelo 420A utilizando
la química de NMP-HBTU Fmoc. El péptido se sintetizó
sobre una resina Gln precargada con un exceso de 8 veces del
aminoácido para cada acoplamiento. La ruptura y la desprotección se
realizó en ácido trifluoroacético (TFA) al 84,6%, tioanisol al 4,4%,
etanditiol al 2,2%, fenol licuado al 4,4% y H_{2}O al 4,4%
durante 2 horas a temperatura ambiente. El péptido bruto se
precipitó, se centrifugó y se lavó dos veces en
t-butil metil éter. El péptido se purificó sobre una
columna de HPLC de fase inversa Dynamax 60A C18 utilizando un
gradiente de TFA/acetonitrilo. La preparación final (61,0 mg)
produjo la correcta composición de aminoácidos y masa molecular
mediante espectroscopía de masa de electronebulización (MH+ =
6836,1; calc. = 6835,5) para la secuencia predicha:
Purificación. El replegamiento de la
bikunina placentaria (102-159) se realizó según el
método de Tam et al. (J. Am. Chem. Soc., 1991,
113:6657-6662). Una porción del péptido purificado
(15,2 mg) se disolvió en 4,0 ml de Tris 0,1 M, pH 6,0 y urea 8 M.
La oxidación de los disulfuros se realizó mediante la adición gota
a gota de una disolución que contenía DMSO al 23% y Tris 0,1 M, pH
6,0, para obtener una concentración final de 0,5 mg/ml de péptido
en DMSO al 20%, Tris 0,1 M, pH 6,0, y urea 1 M. La disolución se
dejó en agitación durante 24 horas a 25ºC, después de lo cual se
diluyó 1:10 en tampón que contenía Tris 50 mM, pH 8,0, y NaCl 0,1
M. El material se purificó utilizando una columna de afinidad de
calicreína mediante la unión covalente de 30 mg de calicreína
pancreática bovina (Bayer AG) a 3,5 ml de sefarosa activada con CNBr
(Pharmacia) según las instrucciones del fabricante. El material
replegado se cargó sobre la columna de afinidad con un caudal de 1
ml/min y se lavó con Tris 50 mM, pH 8,0 y NaCl 0,1 M hasta que la
absorbancia a 280 nm del lavado ya no podía detectarse. La columna
se eluyó con 3 volúmenes de ácido acético 0,2 M, pH 4,0 y 1,7. Las
fracciones activas se reunieron (véase a continuación), y el pH de
la disolución se ajustó a 2,5. El material se aplicó directamente a
una columna de fase inversa Vydac C18 (5 micras, 0,46 x 25 cm) que
se había equilibrado en acetonitrilo al 22,5% en TFA al 0,1%. La
separación se logró utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo
desde 22,5% al 40% en TFA al 0,1% a 1,0 ml/min durante 40 minutos.
Las fracciones activas se reunieron, se liofilizaron, se
redisolvieron en TFA al 0,1% y se conservaron a -20ºC hasta que
fueron necesarias.
Resultados. La bikunina placentaria
sintética (102-159) se replegó utilizando DMSO al
20% como agente oxidante como se describió anteriormente, y se
purificó mediante un protocolo de purificación en 2 etapas como se
muestra a continuación, para producir un inhibidor de tripsina
activo (tabla 1, a continuación).
\vskip1.000000\baselineskip
^{a} Proteína determinada mediante AAA.
^{b} Proteína determinada mediante DO280 nm
utilizando el coeficiente de extinción determinado para la proteína
purificada (1,7 x 10^{4} Lmol^{-1}cm^{-1}).
^{c} Una unidad se define como la cantidad de
material requerido para inhibir 50% de la actividad tripsina en un
ensayo convencional.
\vskip1.000000\baselineskip
Una cromatografía del material replegado bruto
sobre una columna de calicreína pancreática bovina inmovilizada
aisló, de forma selectiva, 6,0% de la proteína y 97% de la actividad
inhibidora de tripsina presente. Una posterior cromatografía
utilizando C18 de fase inversa produjo una mayor purificación en 2
veces, con una recuperación global de 74%. En RPHPLC, la bikunina
placentaria reducida y replegada (102-159) muestra
unos tiempos de elución de 26,3 y 20,1 minutos, respectivamente. Un
análisis de espectroscopía de masas del material purificado reveló
una masa molecular de 6829,8; una pérdida de 6 unidades de masa a
partir del material de partida. Esto demuestra la formación
completa de los 3 disulfuros predichos a partir de la secuencia
peptídica.
Los puntos isoeléctricos de la bikunina
placentaria sintética replegada y purificada
(102-159) se determinaron utilizando un sistema de
electroforesis Multiphor II (Pharmacia) realizado según las
sugerencias del fabricante, junto con patrones de pI, utilizando
una placa PAG Ampholine® premoldeada (pH 3,5 a 9,5) y enfocada
durante 1,5 horas. Después de la tinción, se midió la distancia de
migración desde el extremo catódico del gel hasta las diferentes
bandas de proteínas. Se determinó el pI de cada proteína desconocida
utilizando una curva patrón generada mediante la representación
gráfica de la distancia de migración de los patrones frente a los
correspondientes pI. Con esta técnica se determinó que el pI de la
bikunina placentaria (102-159) es 8,3, de acuerdo
con el valor predicho a partir de la secuencia de aminoácidos. Es
un valor inferior a 10,5, establecido para el pI de la aprotinina
(Tenstad et al., 1994, Acta Physiol. Scand.,
152:33-50).
La bikunina placentaria (7-64)
(SEQ ID NO:4) se sintetizó, se replegó y se purificó esencialmente
como se describe para la bikunina placentaria
(102-159) (SEQ ID NO:6) en el ejemplo 1, pero con
las siguientes modificaciones: durante el replegamiento, el péptido
sintético se agitó durante 30 horas como una disolución en DMSO al
20% a 25ºC; se logró la purificación mediante
RP-HPLC C18 con un gradiente lineal de acetonitrilo
desde 25% al 45% en TFA al 0,1% durante 40 min (1 ml/min). Las
fracciones activas del primer ensayo C18 se reaplicaron a la
columna y se fraccionaron con un gradiente lineal (60 min, 1 ml/min)
de acetonitrilo desde 20% al 40% en TFA al 0,1%.
Resultados. El péptido reducido
purificado final muestra un MH+ = 6563, coherente con la
secuencia:
El replegamiento y la purificación produjo un
dominio de Kunitz funcional que es activo como inhibidor de
tripsina (tabla 2A a continuación).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína replegada purificada muestra un MH+
= 6558, es decir, 5\pm1 unidades de masa menos que el péptido
reducido. Esto demuesetra que el replegamiento provocó la formación
de al menos un enlace disulfuro apropiado.
El pI de la bikunina placentaria
(7-64) se determinó utilizando los métodos empleados
para determinar el pI de la bikunina placentaria
(102-159). La bikunina placentaria
(7-64) muestra un pI mucho mayor que el valor
predicho (pI = 7,9). La bikunina placentaria replegada
(7-64) migra hasta el extremo catódico del gel (pH
9,5) y no se puede determinar un pI preciso en estas
condiciones.
Debido a que es posible que la bikunina
placentaria sintética (7-64) no haya sufrido una
desprotección completa antes de la purificación y replegamiento se
repitió el replegamiento utilizando proteína de la cual se sabe que
estaba completamente desprotegida. Se sintetizó la bikunina
placentaria (7-64), se replegó y se purificó
esencialmente como se describe para la bikunina placentaria
(102-159), pero con las siguientes modificaciones:
durante el replegamiento, el péptido sintético (0,27 mg/ml) se agitó
durante 30 horas como una disolución en DMSO al 20% a 25ºC; se
logró la purificación mediante RP-HPLC C18 con un
gradiente lineal de acetonitrilo desde 22,5% al 50% en TFA al 0,1%
durante 40 min (1 ml/min).
Resultados. El péptido reducido
purificado final muestra un MH+ = 6567,5, coherente con la
secuencia:
El replegamiento y la purificación produjo un
dominio de Kunitz funcional que es activo como inhibidor de
tripsina (tabla 2B a continuación).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína replegada purificada muestra un MH+
= 6561,2, es decir, 6,3 unidades de masa menos que el péptido
reducido. Esto demuestra que el replegamiento provoca la formación
de los tres enlaces disulfuro esperados.
El pI de la bikunina placentaria replegada
(7-64) se determinó utilizando los métodos empleados
para determinar el pI de la bikunina placentaria
(102-159). La bikunina placentaria repletada
(7-64) muestra un pI de 8,85, ligeramente mayor que
el valor predicho (pI = 7,9).
\vskip1.000000\baselineskip
Proteasas. La cuantificación de la
tripsina bovina, la plasmina humana y la calicretína pancreática
bovina se realizó mediante valoración del sitio activo utilizando
HCl de p'-guanidinobenzoato de
p-nitrofenilo, según se describió previamente
(Chase, T., y Shaw, E., 1970, Methods Enzmol., 19,
20-27). La calicreína humana se cuantificó mediante
valoracón del sitio activo utilizando aprotinina bovina como patrón,
y PFR-AMC como sustrato, suponiendo una formación
de complejo 1:1. La K_{m} para GPK-AMC con
tripsina y plasmina bajo las condiciones utilizadas para cada
enzima es 29 \muM y 726 \muM, respectivamente; la K_{m} para
PFR-AMC con calicreína plasmática humana y
calicreína pancreática bovina es 457 M y 81,5 \muM,
respectivamente; la K_{m} para AAPR-AMC con
elastasa es 1600 \muM. La cuantificación de la calicreína tisular
humana (Bayer, Alemania) se realizó mediante valoración del sitio
activo utilizando HCl de p'-guanidinobenzoato de
p-nitrofenilo, según se describió previamente
(Chase, T., y Shaw, E., 1970, Methods Enzmol., 19,
20-27).
Cinética de inhibición. La inhibición de
la tripsina por la bikunina placentaria (102-159)
(descrita en el ejemplo 1) o la aprotinina se midió mediante
incubación de tripsina 50 pM con bikunina placentaria
(102-159) (0-2 nM) o aprotinina
(0-3 nM) en tampón A, en un volumen total de 1,0 ml.
Después de 5 minutos a 37ºC se añadieron 15 \mul de
GPK-AMC 2 mM y se controló el cambio en la
fluorescencia (como anteriormente). La inhibición de la plasmina
humana por la bikunina placentaria (102-159) y la
aprotinina se determinó con plasmina (50 pm) y bikunina placentaria
(102-159) (0-10 nM) o aprotinina
(0-4 nM) en tampón que contenía
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 0,1 M, y Triton
X-100 al 0,02%. Después de 5 minutos de incubación a
37ºC se añadieron 25 \mul de GPK-AMC 20 mM y se
controló el cambio en la fluorescencia. La inhibición de la
calicreína plasmática humana por la bikunina placentaria
(102-159) o la aprotinina se determinó utilizando
calicreína (2,5 nM) y bikunina placentaria
(102-159) (0-3 nM) o aprotinina
(0-45 nM) en Tris-HCl 50 mM (pH
8,0), NaCl 50 mM y Triton X-100 al 0,02%. Después
de 5 min a 37ºC se añadieron 15 \mul de PFR-AMC 20
mM y se controló el cambio en la fluorescencia. La inhibición de la
calicreína pancreática bovina por la bikunina placentaria
(102-159) y la aprotinina se determinó de una
manera similar con calicreína (92 pM), bikunina placentaria
(102-159) (0-1,6 nM) y aprotinina
(0-14 pM), y una concentración final de sustrato de
100 \muM. La constante de inhibición aparente K_{i}* se
determinó utilizando el programa de análisis de datos de regresión
no lineal Enzfitter (Biosoft, Cambridge, Reino Unido). Los dados
cinéticos de cada experimento se analizaron en términos de la
ecuación para un inhibidor de unión fuerte:
(2)V_{i}/V_{0}
= 1 - (E_{0} + I_{0} - K_{i}\text{*} - [(E_{0} + I_{0} -
K_{i}\text{*})^{2} - 4 E_{0}I_{0}]^{1/2})/2
E_{0}
en la que V_{i}/V_{0} es la
actividad enzimática fraccionaria (proporción de inhibición frente a
no inhibición), y E_{0} e I_{0} son las concentraciones totales
de la enzima y el inhibidor, respectivamente. Los valores de
K_{i} se obtuvieron corrigiendo para el efecto del sustrato según
la
ecuación:
(3)K_{i} =
K_{i}\text{*}/(1 +
[S_{0}]/K_{m})
(Boudier, C. y Bieth, J.G., 1989,
Biochim. Biophys. Acta, 995,
36-41).
Para la inhibición de la elatasa de neutrófilos
humana por la bikunina placentaria (102-159) y la
aprotinina se incubó elastasa (19 nM) con bikunina placentaria
(102-159) (150 nM) o aprotinina
(0-7,5 \muM) en tampón que contenía
Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0) y Triton
X-100 al 0,05%. Después de 5 min a 37ºC se añadió
AAPM-AMC (500 \muM o 1000 \muM) y se midió la
fluorescencia a lo largo de un periodo de dos minutos. Se
determinaron los valores de K_{i} a partir de gráficas de Dixon
de la forma 1/V frente a [I] realizadas a dos concentraciones del
sustrato diferentes (Dixon et al., 1979).
La inhibición de la calicreína tisular humana
por la aprotinina, un fragmento de bikunina placentaria
(7-64) o un fragmento de bikunina placentaria
(102-159) se midió mediante la incubación de
calicreína tisular humana 0,35 nM con bikunina placentaria
(7-64) (0-40 nM) o bikunina
placentaria (102-159) (0-2,5 nM) o
aprotinina (0-0,5 nM) en un volumen de reacción de
1 ml que contiene tampón Tris-HCl 50 mM, pH 9,0,
NaCl 50 mM y Triton X-100 al 0,1%. Después de 5 min
a 37ºC se añadieron 5 ul de PFR-AMC 2 mM logrando
una concentración final de 10 uM y se controló el cambio en la
fluorescencia. La Km para PFR-AMC con calicreína
tisular humana bajo las condiciones empleadas es 5,7 uM. La
inhibición del factor Xa humano (American Diagnostica, Inc.,
Greenwich, CT) por la bikunina placentaria sintética
(102-159), la bikunina placentaria recombinante y la
aprotinina se midió mediante la incubación de factor Xa humano 0,87
nM con cantidades crecientes de inhibidor en tampón que contenía
Tris 20 mM (pH 7,5), NaCl 0,1 M, y BSA al 0,1%. Después de 5 min a
37ºC se añadieron 30 ul de LGR-AMC 20 mM (Sigma) y
se controló el cambio en la fluorescencia. La inhibición de la
uroquinasa humana (Sigma) por inhibidores de Kunitz se midió
mediante la incubación'de uroquinasa (2,7 ng) con inhibidor en un
volumen total de 1 ml de tampón que contiene
Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 50 mM y Triton
X-100 al 0,1%. Después de 5 min a 37ºC se añadieron
35 ul de GGR-AMC 20 mM (Sigma) y se controló el
cambio en la fluorescencia. La inhibición del factor XIa (de Enzyme
Research Labs, Southbend, IN) se midió incubando FXIa (0,1 nM) con
bikunina placentaria (7-64) 0 a 800 nM, bikunina
placentaria (102-159) 0 a 140 nM, o aprotinina 0 a
40 uM en tampón que contenía Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM,
CaCl2 2 mM, Triton X-100 al 0,01% y BSA al 1% en un
volumen total de 1 ml. Después de 5 min a 37ºC se añadieron 10 ul
de
Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-AMC
40 mM (Bachem Biosciences, King of Prussia, PA) y se controló el
cambio en la fluorescencia.
Resultados. Una comparación directa de
los perfiles de inhibición de la bikunina placentaria
(102-159) y la aprotinina se realizó midiendo sus
constantes de inhibición con diversas proteasas bajo condiciones
idénticas. Los valores de K_{i} aparecen en la tabla 3 a
continuación.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La bikunina placentaria
(102-159) y la aprotinina inhiben la tripsina bovina
y la plasmina humana en un grado comparable bajo las condiciones
empleadas. La aprotinina inhibe la elastasa con una Ki de 8,5
\muM. La bikunina placentaria (120-159) inhibe la
elastasa con una Ki de 323 nM. El valor de K_{i} para la
inhibición por la bikunina placentaria (102-159) de
la calicreína pancreática bovina es 20 veces mayor que la del
inhibidor de aprotinina. Por contraste, la bikunina placentaria
(102-159) es un inhibidor más potente de la
calicrína plasmática humana que la aprotinina y se une con una
afinidad 56 veces mayor.
Debido a que la bikunina placentaria
(102-159) es más de 50 veces más potente que
Trasylol® como inhibidor de calicreína, se necesitan cantidades
menores de bikunina placentaria humana o sus fragmentos (es decir,
bikunina placentaria (102-159)) que de Trasylol®
para mantener las dosis eficaces en pacientes del inhibidor en KIU.
Esto reduce el coste por dosis del fármaco y reduce la probabilidad
de efectos nefrotóxicos adversos después de la reexposición del
medicamento a los pacientes. Además la proteína es de origen humano
y, por tanto, es mucho menos inmunogénica para el ser humano que la
aprotinina, que deriva de vacas. Esto produce una reducción
significativa en el riesgo de aparición de acontecimientos
inmunológicos adversos tras la reexposición del medicamento a los
pacientes.
La especificidad in vitro de la bikunina
placentaria humana funcional (7-64) descrita en el
ejemplo 2 se determinó utilizando los materiales y métodos como se
describe en los ejemplos anteriores.
Resultados. La tabla a continuación
muestra la eficacia de la bikunina placentaria
(7-64) como inhibidor de diversas serinproteasas
in vitro. Se muestran los datos comparados con otros datos
obtenidos para la búsqueda de inhibición utilizando bikunina
placentaria (102-159) o aprotinina (Trasylol®).
Los resultados demuestran que la secuencia de
aminoácidos que codifica la bikunina placentaria
(7-64) puede replegarse para obtener un inhibidor
de serinproteasas activo que es eficaz contra al menos cuatro
serinproteasas de tipo tripsina.
La tabla 4B a continuación también muestra la
eficacia de la bikunina placentaria (7-64) replegada
como inhibidor de diversas serinproteasas in vitro. La
bikunina placentaria (7-64) replegada se preparó a
partir de una proteína de la cual se sabe con certeza que está
completamente desprotegida antes de la purificación y replegamiento.
Los datos se muestran comparados con los datos obtenidos para la
búsqueda de inhibición utilizando bikunina placentaria
(102-159) o aprotinina (Trasylol®).
De forma sorprendente, la bikunina placentaria
(7-64) es más potente que la aprotinina para inhibir
la calicreína plasmática humana, y tiene una eficacia al menos
similar que un inhibidor de plasmina. Estos datos demuestran que la
bikunina placentaria (7-64) es al menos tan eficaz
como la aprotinina, utilizando ensayos in vitro, y que puede
esperarse una potencia mejor o similar in vivo.
La secuencia de DNA que codifica la bikunina
placentaria (102-159) (SEQ ID NO:6) se generó
utilizando oligonucleótidos sintéticos. El DNA producto final
consiste en (5' a 3') 15 nucleótidos de la secuencia de propéptido
del factor de \alpha-apareamiento de levaduras
condensada con una secuencia de cDNA dentro del marco que codifica
la bikunina placentaria (102-159), seguida de un
codón de terminación dentro del marco. Después de la clonación en
el vector de expresión de levaduras pS604, el cDNA dirige la
expresión de una proteína de fusión que comprende un propéptido del
factor de \alpha-apareamiento de levaduras
N-terminal condensado con la secuencia de 58
aminoácidos de la bikunina placentaria (102-159). Se
diseñó el procesamiento de esta proteína de fusión en el sitio de
ruptura KEX-2 en la unión entre el factor de
\alpha-apareamiento y el dominio de Kunitz, para
liberar el dominio de Kunitz en su N-terminal
nativo.
Se sintetizó un oligonucleótido sentido 5' con
la siguiente secuencia y que contenía un sitio HindIII para la
clonación:
Se sintetizó un oligonucleótido sentido 3' con
la siguiente secuencia y que contenía un sitio BamHI para la
clonación y un codón de terminación:
Los oligonucleótidos se disolvieron en tampón
Tris 10 mM, pH 8,0, que contenía EDTA 1 mM y se añadieron 12 ug de
cada oligonucleótido combinados y se llevó hasta NaCl 0,25 M. Para
la hibridación, los oligonucleótidos se desnaturalizaron hirviendo
durante 5 minutos y dejando enfriar desde 65ºC hasta la temperatura
ambiente durante 2 horas. Se extendieron los solapamientos
utilizando el fragmento de Klenow y se digirieron con HindIII y
BamHI. El fragmento bicatenario digerido resultante se clonó en
pUC19 y se confirmó su secuencia. Un clon que contenía el fragmento
con la secuencia correcta se digirió con BamHI/HindIII para liberar
el fragmento que contenía bikunina con la siguiente secuencia de la
hebra +:
que entonces se purificó en gel y
se acopló con pS604 cortado con BamHI/HindIII. La mezcla de
acoplamiento se extrajo en fenol/cloroformo y se purificó sobre una
columna de miniespín S-200. El producto del
acoplamiento se transformó de modo dirigido en las cepas de
levaduras SC101 y WHL341, y se colocó en placas de selección de
ura. Doce colonias de cada cepa se volvieron a colocar en placas de
separación de ura. Se inoculó una única colonia en 2 ml de medio DO
de ura y se cultivó durante la noche a 30ºC. Las células se
sedimentaron durante 2 minutos a 14000 x g y los sobrenadantes se
evaluaron para determinar su contenido en bikunina placentaria
(102-159).
En primer lugar, los sobrenadantes (50 ul por
ensayo) se evaluaron para determinar su capacidad para inhibir la
actividad in vitro de tripsina, utilizando los métodos de
ensayo según se describe en el ejemplo 1 (1 ml de volumen de
ensayo). Como controles negativos se utilizó una muestra con medio
sin usar y un clon de levadura que expresa un variante inactivo de
la aprotinina. Un clon de levadura que expresa la aprotinina
natural actúa como control positivo y se muestra como
comparación.
El segundo método para cuantificar la expresión
de bikunina placentaria (102-159) aprovecha el uso
de anticuerpos policlonales (pAb) contra el péptido sintético para
controlar la acumulación del péptido recombinante usando análisis
de la transferencia Western. Estos estudios se realizaron sólo con
recombinantes derivados de la cepa SC101, puesto que producen una
mayor actividad inhibidora que los recombinantes derivados de la
cepa WHL341.
Para producir el pAb, se inmunizaron dos conejos
hembra New Zealand White de 6-8 semanas (Hazelton
Research Labs, Denver, PA) en el día cero con 250 ug de bikunina
placentaria sintética reducida purificada (102-159)
en adyuvante de Freund completo, seguido de reinmunizaciones en los
días 14, 35, 56 y 77 cada una con 125 ug del mismo antígeno en
adyuvante de Freund incompleto. El antisuero utilizado en los
presentes estudios se recogió después de la tercera reinmunización
mediante procedimientos establecidos. Los anticuerpos policlonales
se purificaron a partir del antisuero frente a proteína A.
Las colonias 2.4 y 2.5 de la transformación de
la levadura SC101 (figura 8), así como un control de aprotinina se
cultivaron durante la noche en 50 ml de medio DO de ura a 30ºC. Las
células se sedimentaron y el sobrenadante se concentró 100 veces
utilizando un concentrador Centriprep 3 (Amicon, Beverly, MA). Se
sometieron muestras de cada una (30 \mul) a
SDS-PAGE en geles tamponados con tricina al
10-20% (Novex, San Diego, CA) utilizando los
procedimientos de los fabricantes. Los geles por duplicado se
revelaron con un kit de tinción de plata (Integrated Separation
Systems, Nantick, MA) o se transfirieron a nitrocelulosa y se
revelaron con el anticuerpo policlonal purificado producido contra
la bikunina placentaria (102-159). Se utilizó un
anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con
fosfatasa alcalina como anticuerpo secundario según las
instrucciones del fabricante (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg,
MD).
\vskip1.000000\baselineskip
Un caldo de fermentación procedente de un
cultivo de 1 l de la cepa SC101 2.4 se recogió mediante
centrifugación (4.000 g x 30 min) y después se aplicó a una columna
de 1,0 ml de anhidroquimotripsina-sefarosa (Takara
Biochemical Inc., CA) que se había equilibrado previamente con
tampón Hepes 50 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 0,1 M, CaCl_{2} 2
mM y Triton X-100 al 0,01% (v/v). La columna se lavó
con el mismo tampón pero que contenía NaCl 1,0 M hasta que la A280
nm disminuyó a cero, tras lo cual la columna se eluyó con ácido
fórmico 0,1 M, pH 2,5. Las fracciones eluidas se reunieron y se
aplicaron a una columna C18 (Vydac, 5 um, 4,6 x 250 mm) previamente
equilibrada con TFA al 0,1%, y se eluyeron con un gradiente lineal
de acetonitrilo desde 20% al 80% en TFA al 0,1% durante 50 min. Las
fracciones que contenían la bikunina placentaria
(102-159) se reunieron y se recromatografiaron en
C18 empleando una elución con un gradiente lineal de acetonitrilo
desde 22,5% al 50% en TFA al 0,1%.
Resultados. La figura 8 muestra el
porcentaje de actividad tripsina inhibida por doce colonias
derivadas de la transformación de cada una de las cepas SC101 y
WHL341. Los resultados demuestran que las doce colonias de la cepa
de levadura SC101 transformada con el inhibidor de tripsina bikunina
placentaria (102-159) tenían la capacidad de
producir una cantidad sustancial de actividad inhibidora de
tripsina, comparadas con los controles negativos que no mostraron
capacidad para inhibir la tripsina. La actividad, por tanto, está
relacionada con la expresión de un inhibidor específico en células
transformadas con el variante de bikunina placentaria
(102-159). Las muestras de levadura WHL341
contenían una actividad inhibidora de tripsina mínima. Esto puede
correlacionarse con el crecimiento lento observado en esta cepa
bajo las condiciones empleadas.
La figura 9 muestra el SDS-PAGE
y el análisis de la transferencia Western de los sobrenadantes de la
levadura SC101. Los SDS-PAGE teñidos con plata de
sobrenadantes derivados de las levaduras recombinantes 2.4 y 2.5
que expresan bikunina placentaria (102-159), así
como de levaduras que expresan aprotinina producen una banda de
proteína que se mueve a aproximadamente 6 kDa, que se corresponde
con el tamaño esperado para cada dominio inhibidor de Kunitz
recombinante. Un análisis de la transferencia Western muestra que
las bandas de 6 kDa expresadas por las cepas 2.4 y 2.5 reaccionan
con el pAb producido contra la bikunina placentaria
(102-159). La misma banda de 6 kDa en el control de
aprotinina no reaccionó con el mismo anticuerpo, demostrando la
especificidad del anticuerpo por el variante de bikunina
placentaria (102-159).
La preparación final del dominio
C-terminal de bikunina placentaria era muy pura
según un SDS-PAGE teñido con plata (figura 10). La
recuperación global de la actividad inhibidora de tripsina derivada
del caldo en la preparación final era de 31%. La secuenciación
N-terminal del inhibidor purificado indica que 40%
de la proteína está correctamente procesada para producir el
N-terminal correcto para la bikunina placentaria
(102-159), mientras que aproximadamente 60% del
material contiene una porción del factor de
\alpha-apareamiento de levaduras. El material
purificado comprende un inhibidor de serinproteasas activo que
muestra una Ki aparente de 0,35 nM para la inhibición in
vitro de la calicreína plasmática.
En conclusión, la acumulación de una actividad
inhibidora de proteasas y una proteína inmunoquímicamente
relacionada con la bikunina sintética (102-159) en
el caldo de fermentación, así como el aislamiento de bikunina
placentaria (102-159) de una de las líneas
transformadas proporciona pruebas de la expresión de la bikunina
placentaria en cepas de levaduras recombinantes descritas en la
presente, mostrando, por primera vez, la utilidad de las levaduras
para la producción de fragmentos de bikunina placentaria.
Se prepararon otros constructos para intentar
aumentar el nivel de expresión del dominio de Kunitz contenido
dentro de la bikunina placentaria (102-159), así
como para aumentar el rendimiento de la proteína con el
N-terminal correcto. Los inventores tienen la
hipótesis de que los restos N-terminales de la
bikunina placentaria (102-159) (YEEY--) pueden
presentar un sitio de ruptura que no es bien reconocido por la
proteasa KEX-2 de levaduras, que elimina de forma
enzimática la región pro del factor a de levaduras. Por tanto, se
prepararon constructos de expresión de levaduras para la producción
de bikunina placentaria (103-159)
(N-terminal de EEY...), 101-159
(N-terminal de NYEEY...) y 98-159
(DMFNYEEY..) para modificar los subsitios P' que rodean el sitio de
ruptura KEX-2. Para intentar aumentar los niveles
de expresión de proteína recombinante, también se utilizaron los
codones preferidos de levaduras, en lugar de los codones preferidos
de mamífero, para preparar algunos constructos descritos a
continuación. Los constructos se preparan esencialmente como se
describe anteriormente para la bikunina placentaria
(102-159) (definida como el constructo nº 1), pero
con las siguientes modificaciones:
\vskip1.000000\baselineskip
Constructo nº
2
Un oligonucleótido 5' sentido
\vskip1.000000\baselineskip
y un oligonucleótido 3'
antisentido
se manipularon como se describe
para la producción de un constructo de expresión (constructo nº 1
anterior) para la expresión de bikunina placentaria
(102-159).
\vskip1.000000\baselineskip
Constructo nº
3
Un oligonucleótido 5' sentido
y el mismo oligonucleótido 3'
antisentido utilizado para el constructo nº 2 se manipularon como se
describió para la producción de un constructo de expresión
(constructo nº 1 anterior) para la expresión de la bikunina
placentaria
(102-159).
(102-159).
\newpage
Constructo nº
4
Un oligonucleótido 5' sentido
y el mismo oligonucleótido 3'
antisentido utilizado para el constructo nº 2 se manipularon como se
describió para la producción de un constructo de expresión
(constructo nº 1
anterior).
La cepa de levaduras SC101 (MAT\alpha, ura
3-52, suc 2) se transformó con los plásmidos que
contienen cada uno de los anteriores cDNA y las proteínas se
expresaron utilizando los métodos que se describieron anteriormente
para la producción de bikunina placentaria (120-159)
con utilización de codones humanos. Aproximadamente 250 ml de cada
cultivo de levaduras se recogió y el sobrenadante procedente de la
centrifugación (15 min x 3000 rpm) se sometió, por separado, a una
purificación en columnas de 1 ml de
calicreína-sefarosa como se describió
anteriormente. Se determinó la cantidad relativa de actividad
inhibidora de tripsina en el aplisato, la cantidad de proteína
purificada recuperada y la secuencia N-terminal de
la proteína purificada, y se lista a continuación en la tabla
7.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados demuestran que los fragmentos de
bikunina placentaria de diferentes longitudes que contienen el
dominio de Kunitz C-terminal muestran una amplia
variación en la capacidad para expresar la proteína segregada
funcional. Los constructos que expresan los fragmentos
(101-159) y (103-159) producen poca
o baja actividad enzimática en los sobrenadantes antes de la
purificación, y la secuenciación N-terminal de
alícuotas de 0,05 ml de cada fracción purificada producen
cantidades indetectables de inhibidor. Por otra parte, la expresión
de bikunina placentaria (102-159) o
(98-159) produce cantidades significativas de
actividad proteasa antes de la purificación. Sin embargo, la
secuenciación N-terminal demuestra que la proteína
purificada recuperada de la expresión de (102-159)
de nuevo estaba procesada de forma muy incorrecta, mostrando un
N-terminal coherente con el procesamiento de la
mayor parte de la preproteína en un sitio dentro de la secuencia pro
del factor de \alpha-apareamiento de levaduras.
Sin embargo, la proteína purificada recuperada de la expresión de
bikunina placentaria (98-159) se procesó por
completo en el sitio correcto para producir el
N-terminal correcto. Además, se recuperó casi el
doble de proteína comparada con la recuperación de bikunina
placentaria (102-159). La bikunina placentaria
(98-159), por tanto, representa una longitud de
fragmento preferida para la producción del dominio de Kunitz
C-terminal de la bikunina placentaria por el sistema
de procesamiento secuencia pre-pro del factor de
\alpha-apareamiento/KEX-2 de S.
cerevisiae.
El péptido de 58 aminoácidos derivado del
producto de traducción de R74593 también puede amplificarse mediante
PCR a partir del producto de PCR R87894-R74593
clonado en el vector TA^{TM} (Invitrogen, San Diego, CA) después
de la secuenciación de DNA, o a partir de cDNA placentario humano.
El producto de DNA amplificado consiste en 19 nucleótidos de la
secuencia conductora del factor de
\alpha-apareamiento de levaduras apareado con la
secuencia de R74593 que codifica YEEY--CFRQ (58 restos), para que el
producto de la traducción esté dentro del marco, construyendo una
proteína de fusión factor de
\alpha-apareamiento/dominio de Kunitz. La
secuencia de la proteína también contiene un sitio de ruptura kex 2
que libera el dominio de Kunitz en su N-terminal
nativo.
El oligonucleótido 5' sentido que contiene un
sitio HindIII para la clonación contiene la siguiente secuencia:
El oligonucleótido 3' antisentido contiene un
sitio BamHI para la clonación, así como un codón de terminación, y
tiene la siguiente secuencia:
La secuencia de cDNA de 206 nucleótidos completa
para clonar en el vector de expresión de levaduras tiene la
siguiente secuencia:
Después de la amplificación mediante PCR, este
DNA se digiere con HindIII, BamHI y se clona en el vector de
expresión de levaduras pMT15 (véase la patente de EEUU 5.164.482,
incorporada como referencia en su totalidad) también digerido con
HindIII y BamHI. El vector plásmido resultante se utiliza para
transformar la cepa de levaduras SC106 utilizando los métodos
descritos en la patente de EEUU 5.164.482. Los transformantes de
levaduras URA 3+ se aíslan y se cultivan bajo condiciones
inductoras. El rendimiento de los variantes de bikunina placentaria
recombinante se determina según la cantidad de actividad inhibidora
de tripsina que se acumula en los sobrenadantes del cultivo a lo
largo del tiempo utilizando el método de ensayo in vitro
descrito anteriormente. Los caldos de cultivo de fermentación se
centrifugan a 9000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante entonces
se filtra a través de un filtro de 0,4 \mum, después a través de
un filtro de 0,2 \mum, se diluye hasta una conductividad de 7,5
ms, y se ajusta a pH 3 con ácido cítrico. La muestra entonces se
absorbe de forma discontinua sobre 200 ml de
S-sepharose Fast Flow (Pharmacia) en citrato de
sodio 50 mM, pH 3, y se agita durante 60 minutos. El gel se lava
posteriormente de forma secuencial con 2 l de cada: citrato de sodio
50 mM, pH 3,0; Tris-HCl 50 mM, pH 9,0; HEPES 20 mM,
pH 6,0. El gel lavado se traslada a una columna adecuada y se eluye
con un gradiente lineal de cloruro de sodio desde 0 a 1 M en HEPES
20 mM, pH 6,0. Las fracciones eluidas que contienen la actividad
inhibidora de tripsina in vitro entonces se reúnen y se
purifican aún más mediante a) cromatografía sobre una columna de
anhidrotripsina inmovilizada (esencialmente como se describe en el
ejemplo 2); b) cromatografía en una columna de calicreína bovina
inmovilizada; o c) una combinación de etapas cromatográficas
convencionales, incluyendo filtración en gel y/o cromatografía de
intercambio aniónico.
La proteína bikunina se purificó hasta una
homogeneidad aparente a partir de placenta congelada completa
(Analytical Biological Services, Inc., Wilmington, DE). La placenta
(740 g) se descongeló hasta la temperatura ambiente y se cortó en
trozos de 0,5 a 1,0 cm, se colocó sobre hielo y se lavó con 600 ml
de tampón PBS. El lavado se decantó y 240 ml de trozos de placenta
se colocaron en un mezclador Waring. Después de añadir 300 ml de
tampón que consistía en Tris 0,1 M (pH 8,0) y NaCl 0,1 M, la mezcla
se mezcló a alta velocidad durante 2 min, se decantó en tubos de
centrífuga de 750,0 ml y colocó en hielo. Este procedimiento se
repitió hasta que todo el material se procesó. La suspensión
reunida se centrifugó a 4500 x g durante 60 minutos a 4ºC. El
sobrenadante se filtró a través de un trapo para quesos y la
bikunina placentaria se purificó utilizando una columna de afinidad
de calicreína fabricada uniendo de forma covalente 70 mg de
calicreína pancreática bovina (Bayer AG) a 5,0 ml de sefarosa
activada con CNBr (Pharmacia) según las instrucciones del
fabricante. El material se cargó sobre la columna de afinidad con
un caudal de 2,0 ml/min y se lavó con Tris 0,1 M (pH 8,0), NaCl 0,1
M hasta que la absorbancia a 280 nm del lavado ya no pudo
detectarse. La columna se volvió a lavar con Tris 0,1 M (pH 8,0),
NaCl 0,5 M y después se eluyó con 3 volúmenes de ácido acético 0,2
M, pH 4,0. Las fracciones que contenían actividad inhibidora de
tripsina y calicreína (véase a continuación) se reunieron, se
congelaron y se liofilizaron. La bikunina placentaria se purificó
aún más mediante cromatografía de filtración en gel utilizando una
columna Superdex 75 10/30 (Pharmacia) unida a un sistema HPLC
Beckman System Gold. De forma breve, la columna se equilibró en
Tris 0,1 M, NaCl 0,15 M, y Triton X-100 al 0,1% con
un caudal de 0,5 ml/min. La muestra liofilizada se reconstituyó en
1,0 ml de Tris 0,1 M, pH 8,0 y se inyectó en la columna de
filtración en gel en partes alícuotas de 200 \mul. Las fracciones
se recogieron (0,5 ml) y se ensayaron para detectar actividad
inhibidora de tripsina y de calicreína. Las fracciones activas se
reunieron, y el pH de la disolución se ajustó a 2,5 mediante la
adición de TFA. El material se aplicó directamente sobre una columna
de fase inversa C18 Vydac (5 micras, 0,46 x 25 cm) que se había
equilibrado en acetonitrilo al 20% en TFA al 0,1%.
La separación se logró utilizando un gradiente
lineal de acetonitrilo desde 20% al 80% en TFA al 0,1% a 1,0 ml/min
durante 50 minutos después de un lavado inicial de 20 minutos con
acetonitrilo al 20% en TFA al 0,1%. Las fracciones (1 ml) se
recogieron y se ensayaron para detectar actividad inhibidora de
tripsina y calicreína. Las fracciones que contenían actividad
inhibidora se concentraron utilizando un concentrador
Speed-vac (Savant) y se sometieron a un análisis de
secuencia N-terminal.
Se logró la identificación de la bikunina
placentaria funcional midiendo su capacidad para inhibir la tripsina
bovina y la calicreína plasmática humana. La actividad inhibidora
de tripsina se realizó en tampón de ensayo (Hepes 50 mM, pH 7,5,
NaCl 0,1 M, CaCl2 2,0 mM, Triton X-100 al 0,1%) a
temperatura ambiente en una placa de microvaloración de 96 pocillos
(Perkin Elmer) utilizando
Gly-Pro-Lys-aminometilcumarina
como sustrato. La cantidad de cumarina producida por la tripsina se
determinó midiendo la fluorescencia (excit. = 370 nm, emis. = 432
nm) en un fluorímetro LS-50B de
Perkin-Elmer equipado con un lector de placas. La
tripsina (23 \mug en 100 \mul de tampón) se mezcló con 20
\mul de la muestra que se va a ensayar y se incubó durante 10
minutos a 25ºC. La reacción comenzó mediante la adición de 50 \mul
del sustrato GPK-AMC (33 \muM final) en tampón de
ensayo. La intensidad de la fluorescencia se midió y se determinó el
porcentaje de inhibición para cada fracción mediante:
% de inhibición
= 100 x [1 –
F0/F1]
en la que F0 es la fluorescencia
desconocida, y F1 es la fluorescencia del control que sólo contiene
tripsina. La actividad inhibitoria de la calicreína de las
fracciones se midió de forma similar utilizando calicreína 7,0 nM
en tampón de ensayo (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, Triton
X-100 al 0,1%) y
Pro-Phe-Arg-AMC 66,0
\muM como
sustrato.
La especificidad in vitro de la bikunina
placentaria humana nativa se determinó utilizando los materiales y
métodos según se describió en los ejemplos anteriores. La bikunina
placentaria se cuantificó mediante valoración de sitio activo
contra una concentración conocida de tripsina utilizando
GPK-AMC como sustrato para controlar la fracción de
tripsina sin unir.
La fracción de 1 ml (C18-29
Delaria) se redujo hasta un volumen de 300 ml en un Speed Vac para
reducir la cantidad de disolvente orgánico. La muestra entonces se
cargó sobre una columna de reacción bifásica en miniatura
Hewlett-Packard, y se lavó con 1 ml de ácido
trifluoroacético al 2%. La muestra se secuenció sobre un sistema de
secuenciación de proteínas de Hewlett-Packard modelo
G1005A utilizando una degradación de Edman. Los métodos de
secuenciación version 3.0 y todos los reactivos fueron suministrados
por Hewlett-Packard. La secuencia se confirmó para
50 ciclos.
Resultados. La bikunina placentaria se
purificó hasta una homogeneidad aparente mediante afinidad por
calicreína, filtración en gel y cromatografía de fase inversa
secuenciales (véase la tabla de purificación a continuación):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La mayor parte de la actividad inhibidora de
calicreína y tripsina eluye de la columna de afinidad de calicreína
en la elución de pH 4,0. La posterior cromatografía de filtración en
gel (figura 5) produce un pico de actividad inhibidora de
calicreína y tripsina con un intervalo de peso molecular desde 10 a
40 kDa, según se considera a partir de una curva patrón generada
ensayando patrones de peso molecular bajo condiciones idénticas. La
cromatografía en fase inversa C18 (figura 6) produce 4 picos de
actividad inhibidora, y la más potente eluye a aproximadamente
acetonitrilo al 30%. La actividad asociada con el primer pico que
eluye de C18 (fracción 29) muestra una secuencia de aminoácidos que
comienza con el aminoácido 1 de la secuencia de aminoácidos predicha
de la bikunina placentaria (ADRER...; SEQ ID NO:1), y es idéntica a
la secuencia predicha para 50 ciclos de secuenciación (aminoácidos
subrayados en la figura 3). Los restos cisteína en este tramo de
secuencia son silenciosos, como se espera para la secuenciación de
la proteína oxidada. Los restos cisteína en las posiciones de los
aminoácidos 11 y 20 de la bikunina placentaria madura se
identificaron más tarde a partir de la secuenciación de la proteína
S-piridiletilada, después de lo cual se recuperó la
PTH-piridiletilcisteína en los ciclos 11 y 20.
De forma interesante, la asparagina en el resto
aminoácido número 30 de la secuencia (figura 3) es silenciosa,
demostrando que es probable que este sitio se vaya a glicosilar. La
fracción 29 produjo una secuencia principal que se corresponde con
la de la bikunina placentaria que empieza en el resto nº 1 (27 pmol
en el ciclo 1) más una secuencia minoritaria (2 pmol), que deriva
de la bikunina placentaria que comienza en el resto 6 (SIHD...).
Esto demuestra que la preparación final secuenciada en la fracción
29 es muy pura y que, con mucha probabilidad, es responsable de la
actividad inhibidora de proteasas asociada con esta fracción (figura
6).
Por consiguiente, la preparación final de
bikunina placentaria de la cromatografía C18 es muy pura basándose
en un análisis de SDS-PAGE teñido con plata (figura
7), en el que la proteína migra con una Mr aparente de 24 kDa en un
gel de tricina-acrilamida desde 10% al 20% (Novex,
San Diego, CA) calibrado con los siguientes marcadores de peso
molecular: insulina (2,9 kDa); inhibidor de tripsina bovina (5,8
kDa); lisozima (14,7 kDa); \beta-lactaglobulina
(18,4 kDa); anhidrasa carbónica (29 kDa); y ovoalbúmina (43 kDa). El
tamaño anterior de la bikunina placentaria en
SDS-PAGE es coherente con el predicho a partir de la
secuencia codificadora de longitud completa (figura 4F).
Tal como se espera, basándose en los resultados
de la secuenciación N-terminal descritos
anteriormente, la proteína purificada reacciona con un anticuerpo
producido contra la bikunina placentaria (7-64) para
producir una banda con la misma Mr (figura 12A) que la observada
para la preparación purificada detectada en los geles mediante
tinción de plata (figura 7). Sin embargo, cuando la misma
preparación se hace reaccionar con un anticuerpo producido contra
la bikunina placentaria sintética (102-159) no se
observó una banda que correspondiese a la proteína de longitud
completa. En lugar de esto, se observó un fragmento que comigra con
la bikunina sintética (102-159) de aproximadamente
6 kDa. La interpretación más sencilla de estos resultados es que la
preparación purificada ha sufrido una degradación posterior a la
purificación para producir un fragmento N-terminal
que comprende el dominio N-terminal y un fragmento
C-terminal que comprende el dominio
C-terminal. Suponiendo que el fragmento reactivo
contra el antisuero contra la bikunina placentaria
(7-64) no tiene el extremo
C-terminal de la proteína de longitud completa, el
tamaño (24 kDa) sugiere un alto estado de glicosilación.
La tabla 6, a continuación, muestra la potencia
de la inhibición in vitro de diversas serinproteasas por la
bikunina placentaria. Los datos se comparan con los obtenidos con
aprotinina (Trasylol®).
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Los resultados demuestran que la bikunina
placentaria aislada a partir de una fuente natural (placenta humana)
es un potente inhibidor de las serinproteasas de tipo tripsina.
\vskip1.000000\baselineskip
Un análisis de la transferencia Northern de
múltiples tejidos se adquirió en Clontech, que contenía 2 \mug de
RNA poli-A+ de corazón, cerebro, placenta, pulmón,
hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas humanos. Se
utilizaron dos sondas de cDNA diferentes: 1) un cDNA purificado en
gel que codifica la bikunina placentaria (102-159);
2) el cDNA de 780 pares de bases derivado de la PCR (figura 4E)
liberado de un clon TA mediante digestión con EcoRI y purificado en
gel. Cada sonda se marcó utilizando ^{32}P-dCTP y
un kit de marcaje de cebado aleatorio de Boehringer Mannheim
Biochemicals (Indiana), después se utilizó para hibridarse al
análisis de la transferencia Northern de múltiples tejidos según
las instrucciones del fabricante. Se generaron autorradiografías
utilizando una película Biomax con un tiempo de exposición de 18
horas, se revelaron utilizando un dispositivo explorador Umax y se
realizó un barrido utilizando Adobe Photoshop.
Resultados. El patrón de expresión
tisular observado utilizando una sonda de bikunina placentaria
(102-159) (figura 11A) o una sonda mayor que
contiene ambos dominios de Kunitz de la bikunina placentaria (figura
11B) es esencialmente el mismo que se esperaba. El mRNA de la
bikunina placentaria era más abundante en el páncreas y la
placenta. También se observaron niveles significativos en pulmón,
cerebro y riñón, mientras que se observaron niveles menores en
corazón e hígado, y el mRNA no fue detectado en el músculo
esquelético. El tamaño del transcripto es de 1,95 kilobases en
todos los casos, de acuerdo en gran medida con el tamaño predicho de
la bikunina placentaria deducida del solapamiento de EST y de la
clonación del cDNA de longitud completa descritos en las secciones
anteriores.
La amplia distribución tisular del mRNA
demuestra que la bikunina placentaria se expresa con amplitud.
Puesto que la proteína también contiene una secuencia conductora
tendrá amplia exposición al sistema inmunológico humano, lo cual
requiere que sea reconocida como una autoproteína. Se obtuvieron más
pruebas de la amplia distribución tisular de la expresión del mRNA
de la bikunina placentaria del hecho de que algunas de las entradas
de EST con homología con la bikunina placentaria (figura 4B) se
derivaron de cerebro de adulto e infante humano, y de retina, mama,
ovario, epitelio olfativo y placenta humanos. Por tanto, se concluye
que no es probable que la administración de la proteína humana
nativa a pacientes humanos produzca una respuesta inmunológica.
De forma interesante, el patrón de expresión de
la bikunina placentaria recuerda, de algún modo, al de la
aprotinina bovina, que se encuentra en niveles altos en el pulmón y
páncreas bovinos. Para aclarar mejor el patrón de expresión de la
bikunina placentaria, se determinó el RT-PCR del RNA
total de las siguientes células humanas: células endoteliales de
vena umbilical humana no estimuladas (HUVEC), HK-2
(línea derivada del túbulo proximal del riñón),
TF-1 (línea de eritroleucemia); y leucocitos de
sangre periférica humana estimulados con éster de forbol (PMA). Las
sondas utilizadas:
se diseñaron para amplificar un
fragmento de cDNA que codifica la bikunina placentaria de 600 p.b.
Las comparaciones se normalizaron mediante la inclusión de
cebadores de actina para amplificar un fragmento de actina de 800
p.b. Mientras que el fragmento de 800 p.b. identificado en geles de
agarosa con bromuro de etidio tenía la misma intensidad en todos
los carriles, el fragmento de bikunina placentaria de 600 p.b.
estaba ausente en las HUVEC, pero presente en cantidades
significativas en todas las otras líneas celulares. Se concluyó que
la bikunina placentaria no se expresa en al menos algunas células
endoteliales pero sí en algunas poblaciones de
leucocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
Un fragmento grande de bikunina placentaria que
contenía ambos dominios de Kunitz (bikunina (1-170);
SEQ ID NO:52) se expresó en células Sf9 como sigue. El cDNA de
bikunina placentaria obtenido mediante PCR (figura 4E) y contenido
dentro de un vector TA (véanse los ejemplos previos) se liberó
mediante digestión con HindIII y XbaI, produciendo un fragmento
flanqueado por un sitio XbaI 5' y un sitio HindIII 3'. Este
fragmento se purificó en gel y después se clonó en el vector
M13mp19 (New England Biolabs, Beverly, MA). Se utilizó una
mutagénesis in vitro (Kunkel T.A., 1985, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 82:488-492) para generar un sitio PstI 3'
al sitio XbaI en el extremo 5', pero 5' a la secuencia que codifica
el sitio de inicio ATG, el péptido señal de la bikunina placentaria
natural y la secuencia codificadora de la bikunina placentaria
madura. El oligonucleótido utilizado para la mutagénesis tiene la
secuencia:
Un codón de terminación (TAG) y un sitio
BgIII/XmaI se introdujeron de forma similar en el extremo 3' del
cDNA utilizando el oligonucleótido:
El codón de terminación está dentro del marco
con la secuencia que codifica la bikunina placentaria y que provoca
una terminación inmediatamente después de la lisina en el resto
aminoácido 170, codificando, por tanto, un fragmento de bikunina
placentaria truncado sin el dominio transmembrana putativo. El
producto de la digestión con PstI y BgIII se aisló y se clonó en el
vector BacPac8 para la expresión del fragmento de bikunina
placentaria (1-170) que contiene ambos dominios de
Kunitz pero que está truncado inmediatamente
N-terminal al segmento transmembrana
putativo.
putativo.
La expresión de la bikunina por células de
insecto Sf9 resulta óptima con una multiplicidad de infección de 1
a 1 cuando el medio se recoge 72 h después de la infección. Después
de la recolección, el sobrenadante del cultivo celular de
baculovirus (2 l) se ajusta a pH 8,0 mediante la adición de
Tris-HCl. La bikunina se purificó mediante
cromatografía utilizando una columna de afinidad por calicreína
pancreática bovina de 5 ml, como se ha descrito previamente en el
ejemplo 7 para la purificación de la bikunina placentaria nativa a
partir de la placenta. El material eluido se ajustó a pH 2,5 con
TFA y se sometió a una cromatografía en una columna de fase inversa
C18 (1,0 x 25 cm) equilibrada en acetonitrilo al 10% en TFA al 0,1%
con un caudal de 1 ml/min. La bikunina se eluyó con un gradiente
lineal de acetonitrilo desde 10% al 80% en TFA al 0,1% durante 40
min. Las fracciones activas se reunieron, se liofilizaron, se
redisolvieron en Hepes 50 mM (pH 7,5), NaCl 0,1 M, CaCl2 2 mM, y
Triton X-100 al 0,1%, y se conservaron a -20ºC hasta
que se necesitaron. La concentración de la bikunina recombinante se
determinó mediante análisis de aminoácidos.
Resultados. La bikunina recombinante se
purificó a partir del sobrenadante de un cultivo celular de
baculovirus utilizando un protocolo de purificación en 2 etapas
como se muestra a continuación, para producir un inhibidor de
tripsina activo (tabla 8, a continuación).
La cromatografía del material bruto sobre una
columna de afinidad por calicreína pancreática bovina inmovilizada
aisló, de forma selectiva, 0,013% de la proteína y 0,67% de la
actividad inhibidora de tripsina presente. La mayor parte de la
actividad inhibidora de tripsina presente en el sobrenadante de
partida no se une a la calicreína inmovilizada y no está
relacionada con la bikunina (los resultados no aparecen). Una
posterior cromatografía utilizando C18 de fase inversa produjo una
mayor purificación en 5 veces, con una recuperación de 0,2%. La
preparación final era muy pura mediante SDS-PAGE
(figura 13), muestra una Mr de 21,3 kDa, y reacciona en
inmunotransferencias con la anti-bikunina
placentaria (102-159) de conejo (no se muestra). La
secuenciación N-terminal (26 ciclos) produce la
secuencia esperada para la bikunina placentaria madura (figura 4F)
que comienza en el resto +1 (ADRER...), mostrando que el péptido
señal se procesa de forma correcta en células Sf9.
La bikunina placentaria purificada a partir de
células Sf9 (100 pmol) se piridiletilalquiló, se digirió con CNBr y
después se secuenció sin la resolución de los fragmentos
resultantes. La secuenciación durante 20 ciclos produjo los
siguientes N-terminales:
Por tanto, se recuperaron los
N-terminales que se corresponden con los cuatro
fragmentos esperados. Esto confirma que la proteína expresada por
Sf9 contiene la secuencia del ectodominio completo de la bikunina
placentaria (1-170).
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la especificidad in vitro de
la bikunina recombinante utilizando los materiales y métodos
descritos en los ejemplos 3, 4 y 7. Además se midió la inhibición de
la calicreína tisular humana por la bikunina mediante la incubación
de calicreína tisular humana 0,35 nM y bikunina recombinante en un
tampón que contiene Tris 50 mM (pH 9,0), NaCl 50 mM, y Triton
X-100 al 0,01%. Después de 5 minutos a 37ºC se
añadieron 5 \mul de PFR-AMC 2 mM y se controló el
cambio en la fluorescencia.
También se determinó la inhibición del activador
de plasminógeno tisular (tPA) como sigue: el tPA (forma
monocatenaria a partir de un cultivo celular de melanoma humano de
Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) se preincubó con inhibidor
durante 2 horas a temperatura ambiente en tampón Tris 20 mM, pH 7,2,
que contenía NaCl 150 mM, y azida de sodio al 0,02%. Las reacciones
se iniciaron posteriormente mediante transferencia a un sistema de
reaccíon que comprende las siguientes concentraciones iniciales de
componentes: tPA (7,5 nM), inhibidor desde 0 a 6,6 \muM,
DIle-Lpro-Larg-p-nitroanilina
(1 mM) en tampón Tris 28 mM, pH 8,5, que contiene Triton
X-100 al 0,004% (v/v) y azida de sodio al 0,005%
(v/v). La formación de p-nitroanilina se determinó a
partir de la A405nm medida después de una incubación a 37ºC durante
2 horas.
La tabla a continuación muestra la eficacia de
la bikunina recombinante como inhibidor de diversas serinproteasas
in vitro. Los datos se muestran comparados con datos
obtenidos de una selección de inhibición utilizando bikunina
recombinante o aprotinina.
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Los resultados demuestran que la bikunina
recombinante puede expresarse en células de insecto para producir
un inhibidor de proteasas activo que es eficaz contra al menos cinco
inhibidores de serinproteasas diferentes. La bikunina recombinante
es más potente que la aprotinina contra la calicreína plasmática
humana, la tripsin y la plasmina. De forma sorprendente, la
bikunina recombinante es más potente que los fragmentos de bikunina
derivados sintéticamente (7-64) y
(102-159) contra todas las enzimas ensayadas. Estos
datos demuestran que la bikunina recombinante es más eficaz que la
aprotinina, utilizando ensayos in vitro, y que puede
esperarse una mejor potencia in vivo.
Además de medir las potencias contra proteasas
específicas, se evaluó la capacidad de la bikunina placentaria
(1-170) para prolongar el tiempo de tromboplastina
parcial activada (APTT) y se comparó con la actividad asociada con
la aprotinina. El inhibidor se diluyó en tampón Tris 20 mM, pH 7,2,
que contenía NaCl 150 mM y azida de sodio al 0,02%, y se añadió
(0,1 ml) a una cubeta que contenía en su interior un coagulómetro
MLA Electra® 800 Automatic Coagulation Timer (Medical Laboratory
Automation, Inc., Pleasantville, NY). El instrumento se ajustó al
modo APTT con un tiempo de activación de 300 segundos y el modo por
duplicado. Después de la adición de 0,1 ml de plasma (Specialty
Assayed Reference Plasma, lote
1-6-5185, Helena Laboratories,
Beaumont, TX), el reactivo APTT (Automated APTT, lote 102345, de
Organon Teknika Corp., Durhan, NC) y CaCl2 25 mM se dispensaron
automáticamente para iniciar la coagulación, y el tiempo de
coagulación se controló de forma automática. Los resultados (figura
14) demuestran que para doblar el tiempo de coagulación se requiere
aprotinina con una concentración final de aproximadamente 2 \muM,
pero para la bikunina placentaria derivada de Sf9 sólo 0,3 \muM.
Estos datos demuestran que la bikunina placentaria es un
anticoagulante eficaz, y resulta útil como medicamento para
enfermedades que implican la activación patológica de la vía
intrínseca de la coagulación.
El objetivo de este estudio es investigar el
efecto de un inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz, la
bikunina, y de un bloqueador del canal de sodio, la amilorida,
sobre la diferencia de potencial traqueal en cobayas 3 horas
después del tratamiento. Estos agentes se administraron en la
tráquea cefalada mediante instilación tópica. La diferencia de
potencial traqueal se controló 2 horas después durante 60 minutos.
El procedimiento utilizado en este ejemplo se describe en Newton
et al., en "Cilia, Mucus and Mucociliary Interactions",
ed. Baum, G.L. et al., Marcel Dekker, Nueva York, 1998;
Newton et al., Ped. Pulm. S17, resumen 364, 1998.
Se prepararon formulaciones acuosas de bikunina
(1-170) (5 y 50 ug/ml (SEQ ID NO:52)) (como se
describe en el ejemplo 17 a continuación) y amilorida (obtenida a
partir de Sigma Chemicals, St. Louis, MO, EEUU) (100 uM), se
esterilizaron mediante filtración y se ensayaron para detectar
endotoxinas antes de su utilización. Estas formulaciones se
prepararon en disolución salina equilibrada de Hank (HBSS), que
contenía NaCl 137 mM, KCl 3 mM, KH_{2}PO_{4} 3 mM,
Na_{2}HPO_{4} 8 mM, Tween-80 al 0,2%, pH 7,1),
se estilizaron mediante filtración y se ensayaron para detectar
endotoxinas para su utilización en este ejemplo. El HBSS se utilizó
como disolución control. Se obtuvo Hypnorm® (citrato de fentanilo
0,315 mg/ml y fluanisona 10 mg/ml) de Janssen Animal Health, e
Hypnovel® (midazolam 5 mg/ml) de Roche. Las cobayas macho
Dunkin-Hartley (550-750 g) se
obtuvieron de David Hall, Reino Unido. Las sondas con termistor se
obtuvieron en Kane-May Ltd., Reino Unido.
Los animales se anestesiaron utilizando
halotano. Cuando se indujo un nivel satisfactorio de anestesia se
realizó una pequeña incisión por debajo de la mandíbula inferior. La
tráquea se expuso y se instiló un volumen de 100 \mul de
vehículo, bikunina (0,5 \mug o 5 ug) o amilorida (100 uM) en la
superficie traqueal utilizando una aguja y una jeringa. Después de
la inyección se selló la incisión en la piel utilizando Vetbond®
(pegamento de tejidos de cianoacrilato). Entonces se dejó que los
animales se recuperasen.
Dos horas después del tratamiento con el agente,
los cobayas se anestesiaron por segunda vez con Hypnom® e
Hypnovel®, y se inmovilizaron en posición supina. La temperatura
rectal, medida con una sonda con termistor, se mantuvo a 37ºC
mediante el ajuste manual de una lámpara de calor. Se realizó una
incisión en la línea media ventral desde la mandíbula inferior a
las clavículas. Utilizando disección roma se expuso una longitud de
la tráquea y se biseccionó en el extremo superior del esternón. Se
expuso la vena yugular externa y se canuló. La parte caudal de la
tráquea se canuló entonces para que el animal pudiese respirar el
aire ambiental de forma espontánea. Entonces se colocó el animal en
posición supina y se mantuvo la temperatura corporal utilizando una
lámpara de calor. Veinte minutos después de la inducción de la
anestesia por vía intramuscular se insertó un electrodo de agar
traqueal en la tráquea cefalada y se midió la diferencia de
potencial traqueal durante 60 minutos. El electrodo de referencia
se colocó bajo la tráquea cefalada en contacto con el cartílago de
la tráquea. El sitio de la herida se cubrió para evitar que se
secase.
Tal como se muestra en la figura 15, la bikunina
(5 ug) inhibe la diferencia de potencial en la tráquea de cobaya
in vivo después de tres horas de tratamiento, con relación al
vehículo. Se muestra el efecto de la amilorida (100 uM) y la
bikunina (0,5 ug) como comparación.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de este estudio es investigar el
efecto de un inhibidor de serinproteasas de la familia Kunitz, la
bikunina, sobre la velocidad del moco traqueal de cobayas 1,5 horas
después del tratamiento. Este agente se administró en la tráquea
cefalada mediante instilación tópica. La VMT se controló 1,5 horas
después durante 60 minutos. El procedimiento utilizado en este
ejemplo se describe en Newton et al., en "Cilia, Mucus and
Mucociliary Interactions", ed. Baum, G.L. et al., Marcel
Dekker, Nueva York, 1998; Newton et al., Ped. Pulm. S17,
resumen 364, 1998.
Se preparó una formulación de bikunina
(1-170) (bikunina 50 ug/ml (SEQ ID NO:52)) (como se
describe en el ejemplo 17 a continuación) en HBBS que contenía NaCl
137 mM, KCl 3 mM, KH_{2}PO_{4} 3 mM, Na_{2}HPO_{4} 8 mM,
Tween-80 al 0,2%, pH 7,1). La formulación se
esterilizó mediante filtración y se ensayó para detectar
endotoxinas antes de su utilización en este ejemplo. El HBSS se
utilizó como disolución control. Se obtuvo Hypnorm® (citrato de
fentanilo 0,315 mg/ml y fluanisona 10 mg/ml) de Janssen Animal
Health, e Hypnovel® (midazolam 5 mg/ml) de Roche. Las cobayas macho
Dunkin-Hartley (550-750 g) se
obtuvieron de David Hall, Reino Unido. Las sondas con termistor se
obtuvieron en Kane-May Ltd., Reino Unido.
Los animales se anestesiaron utilizando
halotano. Cuando se indujo un nivel satisfactorio de anestesia se
realizó una pequeña incisión por debajo de la mandíbula inferior. La
tráquea se expuso y se instiló un volumen de 100 ul de vehículo o
bikunina (5 ug) en la superficie traqueal utilizando una aguja y una
jeringa. Después de la instilación se selló la incisión en la piel
utilizando Vetbond® (pegamento de tejidos de cianoacrilato).
Entonces se dejó que los animales se recuperasen.
La VMT se controló utilizando una sonda
detectora de partículas beta en miniatura colimada de plomo
dispuesta para detectar la radiactividad emitida a partir de una
parte alícuota inyectada de Saccharomyces cerevisiae marcado
con ^{32}P, según era transportado sobre la capa mucociliar
traqueal de una cobaya anestesiada (Newton y Hall, 1998). La figura
16(a) ilustra la disposición de la jeringa y la sonda beta.
La figura 16(b) ilustra las cuentas detectadas por la sonda
a medida que S. cerevisiae marcado con ^{32}P es
transportado a lo largo de la capa mucociliar traqueal.
Setenta minutos después de la instilación de la
bikunina, cada animal se anestesió por segunda vez utilizando
Hyponorm® e Hyponovel®, y se inmovilizó en posición supina. La
primera medida de VMT se tomó 20 minutos después. Se realizaron
posteriores medidas cada 15 minutos. El procedimiento para las
medidas de VMT se describe, en detalle, en Newton et al.,
"Cilia, Mucus and Mucociliary Interactions", ed. Baum, G.L.,
Preil, Z., Roth, Y., Liron., Ostfield, E., Marcel Dekker, Nueva
York, 1990; y Newton et al., en Pediatric Pulmonology
S17, resumen 364, 1998.
Tal como se muestra en la figura 16(c),
la bikunina (5 ug) aumenta la VMT in vivo en cobayas con
relación a la disolución salina, durante un periodo sostenido de
1,5 a 2,5 horas después de la administración.
\vskip1.000000\baselineskip
Monocapas de células HBE terciarias cultivadas
hasta la confluencia se montaron en cámaras Ussing modificadas, se
sumergieron en una disolución de tampón de Krebs (KBR) y se
burbujearon con 95% de O_{2}/5% de CO_{2} calentado hasta
37ºC.
Se dejó que las células se equilibrasen durante
20 minutos antes de calibrar el ruido de fondo y la resistencia de
fluidos. Entonces la diferencia de potencial transepitelial se fijó
a 0 mV utilizando un fijador del voltaje WPI EVC 4000. Se
utilizaron electrodos Ag/AgCl para controlar la Icc. Cuando se
alcanzó una línea de base estable (de forma típica a los
10-20 min), las células se trataron con amilorida
(10 uM). Cuando se observó una respuesta a la amilorida se lavó con
una disolución de KBR. Después de volver a la línea de base y al
equilibrio se añadió bikunina (1-170) (como se
describe en el ejemplo 17 a continuación) (0,5-50
ug/ml en PBS) o control de PBS. Noventa minutos después del
tratamiento con el agente se añade amilorida (10 uM). Cuando la
corriente es estable se añade forskolina (10 uM) y después
bumetanida (100 uM).
Tal como aparece en la figura 17, la bikunina
(70 nM) inhibe la corriente de sodio in vitro en células
epiteliales bronquiales humanas a lo largo de un periodo de 90
minutos. La secreción de cloruro mediada por cAMP inducida por
forskolina y la resistencia de las monocapas no se vieron
afectadas.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de este estudio comparativo es
investigar el efecto de una disolución salina hipertónica (al 14,4%
x 5 min) sobre la velocidad del moco traqueal en cobayas. Este
agente se administró a la tráquea cefalada mediante un aerosol. La
VMT se controló inmediatamente y cada 15 minutos durante 30 minutos.
El procedimiento utilizado en este ejemplo se describe en Newton
et al., en "Cilia, Mucus and Mucociliary Interactions",
ed. Baum, G.L. et al., Marcel Dekker, Nueva York, 1998;
Newton et al., Ped. Pulm. S17, resumen 364, 1998.
Se obtuvo Hypnorm® (citrato de fentanilo 0,315
mg/ml y fluanisona 10 mg/ml) de Janssen Animal Health, e Hypnovel®
(midazolam 5 mg/ml) de Roche. Las cobayas macho
Dunkin-Hartley (550-750 g) se
obtuvieron de Harlan UK Ltd. Las sondas con termistor se obtuvieron
en Kane-May Ltd., Reino Unido.
Los animales se anestesiaron utilizando Hypnorm®
e Hypnovel®. La VMT se controló utilizando una sonda detectora de
partículas beta en miniatura colimada de plomo dispuesta para
detectar la radiactividad emitida a partir de una parte alícuota
inyectada de Saccharomyces cerevisiae marcado con ^{32}P,
según era transportado sobre la capa mucociliar traqueal de una
cobaya anestesiada (Newton y Hall, 1998).
La primera medida de VMT (ensayo 1) se realizó
20 minutos después de la administración. Se realizaron medidas
posteriores cada 15 minutos. En el momento correspondiente a los 6
minutos antes del segundo ensayo se administró un aerosol durante 5
minutos de disolución salina (al 0,9%) o disolución salina
hipertónica (al 14,4%). Las partículas marcadoras marcadas con
radiactividad se administraron a través de un orificio de 0,5 um
realizado en la tráquea. Un aerosol de disolución salina (al 0,9%)
o disolución salina hipertónica (al 14,4%) se generó mediante un
nebulizador de presión Pari. El aerosol se desconectó un minuto
antes del segundo ensayo. El procedimiento para medir la VMT se
describe, en detalle, en Newton et al., "Cilia, Mucus and
Mucociliary Interactions", ed. Baum, G.L., Preil, Z., Roth, Y.,
Liron., Ostfield, E., Marcel Dekker, Nueva York, 1990; y Newton
et al., en Pediatric Pulmonology S17, resumen 364,
1998.
Tal como se muestra en la figura 18, la
disolución salina hipertónica (al 14,45 x 5 min) provocó un aumento
transitorio en la VMT inmediatamente después del aerosol.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de este estudio es investigar el
efecto de la amilorida (10 mM x 20 min) sobre el moco traqueal de
cobayas en cobayas anestesiadas que respiran de forma espontánea.
Este agente se administró a la tráquea cefalada mediante un aerosol
como se describe en el ejemplo 4. El procedimiento de medida de la
VMT utilizado en este ejemplo se describe en Newton et al.,
"Cilia, Mucus and Mucociliary Interactions", ed. Baum, G.L.
et al., Marcel Dekker, Nueva York, 1998; Newton et
al., Ped. Pulm. S17, resumen 364, 1998.
Se preparó una formulación de amilorida (10 mM)
en agua para este ejemplo. Se obtuvo Hypnorm® (citrato de fentanilo
0,315 mg/ml y fluanisona 10 mg/ml) de Janssen Animal Health, e
Hypnovel® (midazolam 5 mg/ml) de Roche. Las cobayas macho
Dunkin-Hartley (550-750 g) se
obtuvieron de Harlan UK Ltd. Las sondas con termistor se obtuvieron
en Kane-May Ltd., Reino Unido.
Los animales se anestesiaron utilizando Hypnorm®
e Hypnovel®. La VMT se controló utilizando una sonda detectora de
partículas beta en miniatura colimada de plomo dispuesta para
detectar la radiactividad emitida a partir de una parte alícuota
inyectada de Saccharomyces cerevisiae marcado con ^{32}P,
según era transportado sobre la capa mucociliar traqueal de una
cobaya anestesiada. Las cobayas se anestesiaron con Hypnorm® e
Hypnovel® en el momento 0. Se administró amilorida (10 mM x 20 min)
mediante aerosol. La primera medida de VMT se realizó
inmediatamente después y se realizaron medidas posteriores cada 15
minutos.
Tal como se muestra en la figura 19, la
amilorida (10 mM x 20 min) provoca un aumento estadísticamente
significativo en la VMT 15 minutos después del aerosol.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de este estudio es investigar el
efecto de un inhibidor de serinproteasas de la familia Kunitz, la
muteína doble de aprotinina, sobre la Icc in vitro. Monocapas
de células HBE terciarias cultivadas hasta la confluencia se
montaron en cámaras Ussing modificadas, se sumergieron en una
disolución de tampón de Krebs (KBR) y se burbujearon con 95% de
O_{2}/5% de CO_{2} calentado hasta 37ºC. La muteína doble de
aprotinina es Des
Pro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina
que se describe en el ejemplo 1 del documento EP 821007, publicado
el 28 de enero, 1998, incorporado como referencia en su
totalidad.
Se dejó que las células se equilibrasen durante
20 minutos antes de calibrar el ruido de fondo y la resistencia de
fluidos. Entonces la diferencia de potencial transepitelial se fijó
a 0 mV utilizando un fijador del voltaje WPI EVC 4000. Se
utilizaron electrodos Ag/AgCl para controlar la Icc. Cuando se
alcanzó una línea de base estable (de forma típica a los
10-20 min), las células se trataron con amilorida
(10 uM). Cuando se observó una respuesta a la amilorida se lavó con
una disolución de KBR. Después de volver a la línea de base y al
equilibrio se añadió bikunina (5 ug/ml), muteína doble de aprotinina
(0,5 a 5 ug/ml), aprotinina (1,5 a 5 ug/ml) o PBS. Noventa minutos
después del tratamiento con el agente se añade amilorida (10
uM).
Tal como aparecen en la figura 20, la muteína
doble de aprotinina (0,5 a 5 ug/ml) inhibe, de una forma dependiente
de la dosis, la corriente de sodio in vitro en células
epiteliales bronquiales a lo largo de un periodo de 90 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se desarrollaron líneas celulares de producción
estable que segregan grandes cantidades de bikunina mediante la
transfección de células CHO (dhrf-) con el vector de expresión que
aparece en la figura 27. El vector se construye utilizando técnicas
de DNA recombinante convencionales. Una descripción de la
construcción del vector de expresión y el sistema de expresión de
células CHO puede encontrarse en el documento U.S.S.N 09/441.654,
presentado el 12 de noviembre, 1999, titulado "Method of Producing
Glycosylated Bikunin", por el inventor Sam Chan. Brevemente, el
vector de expresión pBC-BK se construyó clonando
cDNA de bikunina inmediatamente cadena abajo del promotor temprano
inmediato de citomegalovirus y cadena arriba de la secuencia señal
de poliadenilación. El vector de expresión pBC-BK
consiste en una unidad transcripcional para la bikunina,
dihidrofolato-reductasa y resistencia a la
ampicilina. El cDNA de bikunina se retira del vector de clonación
mediante enzimas de restricción, se crean extremos romos y se
acopla con pBC linealizado. La linealización de pBC se realiza
mediante una única digestión con enzimas de restricción. La
orientación del cDNA de bikunina se confirma mediante
secuenciación.
Aproximadamente 1 x 10^{6} células CHO (ovario
de hámster chino) se transfectaron con 10 \mug de
pBC-BK utilizando reactivos de lipofectina (Life
Technolgy, Bethesda, Martyland) según las instrucciones del
fabricante. Las células entonces se seleccionaron en presencia de
metotrexato 50 nM y se cultivaron en medio DME/F12 deficiente en
timidina e hipoxantina, más suero bovino fetal dializado al 5%. Las
poblaciones celulares se seleccionaron para detectar producción de
bikunina con un ensayo cromogénico. Brevemente, patrones de bikunina
o fluido de cultivo se diluyeron en serie y se incubaron con un
volumen igual de calicreína a 37ºC durante 30 minutos, después de
lo cual se añadió un sustrato cromogénico,
N-benzoil-Pro-Phr-Arg-pNA.
La reacción se incubó durante 15 minutos antes de la adición de
ácido acético al 50%. La cantidad de p-nitroanilida
liberada se midió a 405 nM. Las poblaciones de alta producción se
volvieron a seleccionar en medio que contenía concentraciones
crecientes de metotrexato (metotrexato desde 100 a 400 nM) y se
seleccionaron para detectar la producción de bikunina. Entonces se
aplicó una clonación de dilución limitante para obtener clones con
una productividad alta y estable. La clonación se realiza en
ausencia de metotrexato empleando técnicas de cultivo tisular
convencionales depositando 1 célula/pocillo en placas de 96
pocillos. Se eligió un clon denominado FD3-1 para la
evaluación de la productividad en un biorreactor y se depositó el
12 de noviembre, 1999, en American Type Culture Collection (ATCC),
Rockville, MD, y se asignó la denominación de depósito de patentes
PTA-940.
Se realizó una producción continua de bikunina
mediante una fermentación de perfusión continua. Un fermentador
Wheaton de 1,5 litros se inoculó con una línea celular CHO estable a
2 x 10^{6} células/ml y se perfusionó con una velocidad de
intercambio de medio de 0,5 litros/día. El medio de producción es un
medio basado en DME/F12 suplementado con insulina (10 \mug/ml) y
FeSO_{4}\cdotEDTA (50 \muM). La densidad celular se mantiene
a 4 x 10^{6} células/ml. El rendimiento diario medio del
fermentador era aproximadamente 20 mg/día. La producción de
bikunina se mantuvo de forma estable durante 21 días.
La bikunina producida a partir de células CHO se
purificó utilizando técnicas de cromatografía convencionales que
implican un intercambio iónico, un quelado de metales y una
cromatografía de exclusión molecular como se indica en la figura
29.
La columna SP (18 x 10 cm, 2,5 l) se preparó con
SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) y se equilibró.
Las células CHO recogidas y filtradas en frío (TCF) se diluyeron
1:2,5 con agua estéril fría, y el pH se ajustó a 5,0. Se realizó
una cromatografía a temperatura ambiente con tampones fríos. El
material de partida frío se cargó en la columna a 800 ml/min (189
cm/hora). La cantidad de bikunina cargada en la columna varía desde
0,888-1,938 g (aproximadamente 14 mg/l). Después de
cargar, la columna se lava con tampón de equilibrio y la bikunina
se eluye con tampón de elución. El eluato se recoge a
2-8ºC (en un baño de hielo) y se ajusta
inmediatamente a pH 7 con NaOH 6 N. La columna se lava, después se
sanea con NaOH 1 N frío (2-8ºC) y se conserva a
2-8ºC en etanol al 20% hasta que se vuelve a
utilizar. El tampón de equilibrio y lavado contiene NaCl 50 mM,
NaH_{2}PO_{4} 30 mM, pH 5,0; el tampón de elución contiene NaCl
350 mM, NaH_{2}PO_{4} 30 mM, pH 5,0; y el tampón de ajuste del
pH es ácido cítrico 1 M, NaH_{2}PO_{4} 1 M, pH 2,4.
El eluato de SP-Sepharose
descongelado se concentra mediante ultrafiltración (UF)
aproximadamente 10 veces para reducir el volumen antes de realizar
una diafiltración (DF) de 5 a 7 veces en preparación para la
cromatografía de intercambio aniónico. Todas las operaciones se
realizaron a temperatura ambiente en una campana de flujo
horizontal. La UF/DF utilizan un sistema de "mini"-filtro
Pellicon 2 de Millipore (Bedford, MA) y dos cartuchos de celulosa
regenerada de 10 kDa (P2C010C01). Las velocidades de flujo son
aproximadamente 130 \pm 20 ml/min para el sistema de dos
cartuchos y se mantuvieron regulando las presiones de entrada y
salida entre 151,68 y 179,26 kPa, y 82,74 y 110,31 kPa,
respectivamente. La circulación se realiza con una bomba
peristáltica; la recirculación se ajustó desde 500 a 600 ml por
minuto antes del ajuste de la presión transmembrana. La
diafiltración se realizó con tampón NaH_{2}PO_{4} 10 mM frío, pH
8,1.
La cromatografía en columna de
Q-Sepharose se realizó como sigue. Una columna de 13
x 9 cm de 1,2 l de Q-Sepharose Fast Flow
(Pharmacia) se lavó con 5 volúmenes de columna (VC) de agua estéril
y se equilibró con aproximadamente 10 VC de tampón de equilibrio.
El eluato SP diafiltrado se ajustó a pH 8,1 y se aplicó a la columna
de Q-Sepharose a 100 ml/min (45 cm/hora). La
cantidad de bikunina cargada en la columna varía desde
1121-2607 mg (aproximadamente 15 mg/ml). Después de
cargar, la columna se lavó con tampón de equilibrio hasta que la
absorbancia de UV a A280 alcanza la línea de base; después se eluye
la bikunina. El eluato se recoge y se utiliza como material de
alimentación para Zn-IMCA, una cromatografía de
adsorción de iones metálicos inmovilizada con cinc. La columna se
lavó con NaOH 1 M, se enjuagó con agua estéril y se conservó en
etanol al 20%. Todas las operaciones se realizaron a
2-8ºC. El tampón de equilibrio y lavado para la
columna de Q-Sepharose contiene NaH_{2}PO_{4}
10 mM, pH 8,1. El tampón de elución contiene NaH_{2}PO_{4} 10
mM, NaCl 100 mM, pH 8,1.
Una columna de Zn-IMAC (5 x 10
cm) que contiene un volumen de lecho de aproximadamente 200 ml de
Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia) se cargó con 3 volúmenes
de disolución de ZnSO_{4} (véase a continuación), se lavó con 2
volúmenes de agua estéril, y se equilibró con 6 volúmenes de tampón
como se describe a continuación. El eluato de
Q-Sepharose se ajustó a pH 7,4 y se aplicó NaCl 300
mM (mediante la adición de NaCl sólido) a Zn-IMAC a
30 ml/min (92 cm/hora de velocidad lineal), y después la columna se
lavó con tampón de equilibrio hasta que la absorbancia de UV
alcanza la línea de base. La cantidad de bikunina cargada en la
columna varía desde 0,097-1,681 g (aproximadamente
0,63 mg/ml). La corriente y el lavado se recogieron para UF. La
columna se destiló y se saneó con NaOH 0,5 M. Todas las operaciones
de esta etapa se realizaron a 2-8ºC. El tampón de
equilibrio para Zn-IMAC contiene NaH_{2}PO_{4}
10 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4; el tampón de destilado contiene EDTA 50
mM, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4; y la disolución de
carga es ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O 2 mg/ml.
La corriente de Zn-IMAC se
concentró mediante ultrafiltración en 5 veces con el sistema
Pellicon 2 (Millipore) para una cromatografía en Sephacryl
S-200. Los caudales del permeato eran
aproximadamente 60 a 70 ml/min, y se mantuvieron como se describió
anteriormente. La recirculación era desde 400 a 500 ml/min.
Una columna (10 x 58,5 cm) que contiene 4,59 l
de Sephacryl S-200 High Resolution (Pharmacia) se
equilibró con NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, KH_{2}PO_{4} 2,9 mM,
NaH_{2}PO_{4} 10 mM, Na_{2}H_{2}PO_{4} 8 mM, Tween 80 2
mg/l, pH 7,2. El caudal es de 30 ml/min (23 cm/hora). En un ensayo
típico se aplican a la columna 1475 mg de bikunina en un volumen de
95 ml.
La agrupación
post-S-200 se trató con resina Etox
de un modo discontinuo para la eliminación de cualquier pirógeno
potencial. La resina ActiClean Etox 2705 (Sterogene Bioseparations,
Inc.) se enjuagó con NaOH 1 M y se incubó durante 5 horas en NaOH 1
M a temperatura ambiente con agitación. La resina se lavó y se
equilibró con PBS, pH 7,2. Se añadieron 80 ml de la resina filtrada
y equilibrada a 1063 ml de la agrupación de bikunina S200 (5460,11
mg) y se agitó durante la noche a 2-8ºC. La resina
Etox después se eliminó mediante filtración con un filtro de matraz
Nalgene de 0,2 micras.
Resultados. La tabla 10 muestra el
rendimiento medio conseguido en cada etapa.
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento global de bikunina es
aproximadamente 30% con una pureza de 95%. Los datos de
espectroscopía de masas también sugieren que además de las
moléculas de bikunina de longitud completa (1-170),
las especies que carecen de tres
(G-S-K) y cuatro
(L-G-S-K)
aminoácidos del extremo carboxi de la bikunina
(1-170) estaban presentes en la agrupación de
proteínas puras. El material producido era estable a la degradación
cuando se expuso a una incubación durante 72 horas a temperatura
ambiente, o a 37ºC en pH neutro. La secuenciación
N-terminal, la electroforesis en gel, la
inmunotransferencia y el análisis de aminoácidos indican que la
bikunina era sustancialmente pura (no se detectaron otras
secuencias). Otra etapa de cromatografía de fase inverse reveló que
la bikunina purificada derivada de CHO todavía podía fraccionarse en
varias especies (figura 30A). La bikunina de CHO (8,5 mg) se ajustó
a pH 2,5 con ácido trifluoroacético (TFA, concentración final al
0,1%) y se sometió a una cromatografía en una columna de fase
inversa C18 (Vydac, 2,5 x 25 cm) equilibrada en acetonitrilo al
17,5% y TFA al 0,1% con un caudal de 2 ml/min. La bikunina de CHO se
eluyó con un gradiente lineal de acetonitrilo al
17,5-40% en TFA al 0,1% durante 60 min. La figura
30B muestra el perfil de SDS-PAGE teñido con plata
de estas fracciones (el carril entre 54 y 55 representa los
marcadores de peso molecular).
El análisis de carbohidratos preliminar se
realizó con las formas glicosiladas de la bikunina de CHO que tienen
un PM que varía desde aproximadamente 21 kDa a aproximadamente 38
kDa. El contenido en azúcar total era 7,5%. Ambos sitios
N-unidos (Asn-30 y
Asn-67) estaban ocupados por estructuras de
carbohidratos. Los análisis cromatográficos y espectrométricos de
masas confirman la presencia de estructuras de oligosacáridos muy
heterogéneas y ramificadas que contribuyen a la heterogeneidad de
tamaño observada para la bikunina purificada. Aproximadamente 90% de
los oligosacáridos estaban sialilados y el resto de las estructuras
son neutras. Cuando se tratan con N-glicosidasa F,
las isoformas glicosiladas de bikunina de CHO (figura 30B) se
convirtieron en una única isoforma de 18 kDa (véase la figura
31).
El contenido en ácido siálico de la bikunina se
analizó mediante incubación con sialidasa en tampón de acetato de
sodio 50 mM, pH 5,0, durante 18 horas en un tubo de microcentrífuga
tapado. Los ácidos siálicos se separaron en una columna de
intercambio aniónico Carbo Pac PA1 utilizando un gradiente de tampón
de acetato de sodio 20-250 mM en NaOH 100 mM
durante 50 minutos con un caudal de 1 ml/min. La detección se
realizó con un detector electroquímico pulsado y se cuantificó
comparando los tiempos de retención y las áreas de los picos de las
muestras con patrones de ácidos siálicos (ácido
N-acetilneuramínico y ácido
N-glutarilneuramínico). Los resultados se muestran
en la
tabla 11.
tabla 11.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
General. La especificidad in vitro
de la bikunina recombinante se determinó utilizando los materiales
y métodos según se describió en los ejemplos 3, 4, 7 y 10. La tabla
12 a continuación muestra la eficacia de la bikunina recombinante
como inhibidor de diversas serinproteasas in vitro. Los datos
se muestran utilizando bikunina recombinante o aprotinina.
Proteasas. La cuantificación de plasmina
humana y calicreína plasmática humana se realizó mediante valoración
de sitio activo utilizando HCl de
p'-guanidinobenzoato de
p-nitrofenilo como se describió previamente (Chase,
T. y Shaw, E., 1970, Methods Enzmol., 19,
20-27). La calicreína tisular humana (Bayer,
Alemania) se cuantificó mediante valoración de sitio activo
utilizando aprotinina bovina como patrón y PFR-AMC
como sustrato, suponiendo una formación de complejo 1:1. La K_{m}
para GPK-AMC con plasmina con las condiciones
utilizadas es 726 \muM; la K_{m} para PRF-AMC
con calicreína plasmática humana es 457 \muM; y la K_{m} para
PFR-AMC con calicreína tisular humana es 5,7
\muM.
Cinética de inhibición. La inhibición de
la plasmina humana por bikunina placentaria (1-170)
expresada por CHO y aprotinina se determinó con plasmina (50 pM) y
bikunina placentaria (1-170) expresada por CHO
(0-2 nM) o aprotinina (0-4 nM) en
tampón que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl
0,1 M, y Triton X-100 al 0,02%. Después de 30
minutos de incubación a 37ºC se añadieron 25 \mul de
GPK-AMC 20 mM y se controló el cambio en la
fluorescencia. La inhibición de la calicreína plasmática humana por
la bikunina placentaria (1-170) expresada por CHO o
la aprotinina se determinó utilizando calicreína (0,2 nM) y bikunina
placentaria (1-170) expresada por CHO
(0-4 nM) o aprotinina (0-45 nM) en
Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 50 mM, y Triton
X-100 al 0,02%. Después de 30 minutos a 37ºC se
añadieron 5 \mul de PFR-AMC 20 mM y se controló el
cambio en la fluorescencia.
La inhibición de la calicreína tisular humana
por la aprotinina o la bikunina placentaria (1-170)
expresada por CHO se midió mediante la incubación de calicreína
tisular humana 0,35 nM con bikunina placentaria
(1-170) expresada por CHO (0-10 nM)
o aprotinina (0-0,5 nM) en un volumen de reacción de
1 ml que contenía tampón Tris-HCl 50 mM, pH 9,0,
NaCl 50 mM, y Triton X-100 al 0,1%. Después de 5
minutos a 37ºC se añadieron 5 ul de PFR-AMC 2 mM
logrando una concentración final de 10 uM, y se controló el cambio
en la fluorescencia.
La inhibición del factor XIa (de Enzyme Research
Labs, South Bend, IN) se midió incubando FXIa (0,1 nM) con bikunina
placentaria (1-170) expresada por CHO desde 0 a 40
nM, o aprotinina desde 0 a 4 uM, en tampón que contiene Hepes 50
mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl2 2 mM, Triton X-100 al
0,01%, y BSA al 1% en un volumen total de 1 ml. Después de 30
minutos a 37ºC se añadieron 10 ul de
Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-AMC
40 mM (Bachem Biosciences, King of Prussia, PA), y se controló el
cambio en la fluorescencia.
La constante de inhibición aparente K_{i}* se
determinó utilizando el programa de análisis de datos de regresión
no lineal Enzfitter (Biosoft, Cambridge, Reino Unido). Los datos
cinéticos de cada experimento se analizaron en términos de la
ecuación para un inhibidor de unión fuerte:
(2)V_{i}/V_{0}
= 1 - (E_{0} + I_{0} + K_{i}\text{*} - [(E_{0} + I_{0} +
K_{i}\text{*})^{2} -
4E_{0}I_{0}]^{1/2})/2E_{0}
en la que V_{i}/V_{0} es la
actividad enzimática fraccionaria (proporción de inhibición frente a
no inhibición), y E_{0} e I_{0} son las concentraciones totales
de la enzima y el inhibidor, respectivamente. Los valores de
K_{i} se obtuvieron corrigiendo para el efecto del sustrato según
la
ecuación:
(3)K_{i} =
K_{i}\text{*}/(1 +
[S_{0}]/K_{m})
(Boudier, C. y Bieth, J.G., 1989,
Biochim. Biophys. Acta,
995:36-41).
Resultados. Los valores de K_{i} se
listan en la tabla 12 a continuación.
Los resultados demuestran que la bikunina
recombinante puede expresarse en células CHO para producir un
inhibidor de proteasas activo que es eficaz contra al menos tres
serinproteasas diferentes. La bikunina recombinante es más potente
que la aprotinina contra la calicreína plasmática humana y la FXIa
humana. Era equipotente con la aprotinina para inhibir la plasmina
humana.
Se aislaron células HBE a partir de tejido de
trasplante de pulmón de pacientes con FQ y se cultivaron en
matraces revestidos con colágeno durante una semana. Las células
entonces se subcultivaron y se sembraron sobre filtros revestidos
de colágeno Transwell Costar (0,33 cm^{2}) y se cultivaron en
medio DMEM/F12 suplementado con Ultroser G al 2%. Las células se
cultivaron en una interfase aire-líquido y se
utilizaron de 2 a 4 semanas después de la siembra.
Las células en los filtros Transwell se montaron
en cámaras Costar Ussing modificadas y se estudiaron bajo conciones
Icc. Los valores de la línea de base de Icc se registraron (desde 0
a 10 minutos) y después se añadió aprotinina (1 mg/ml en PBS) en el
lado apical. Se registró la Icc durante 100 minutos y después el
fluido del baño apical se cambió por tampón fresco. Se añadió
tripsina (100 unidades BAEE/ml) al lado apical y se registró la Icc
durante 10 minutos. Entonces se añadió amilorida (10 uM) al lado
apical y se registó la Icc durante 10 minutos más.
Resultados. Tal como se muestra en la
figura 21, la aprotinina (1 mg/ml en PBS) inhibe la Icc in
vitro en células epiteliales bronquiales de FQ humanas a lo
largo de un periodo de 100 minutos. Después de lavar, la Icc
aumenta mediante el tratamiento de la superficie apical con la
serinproteasa tripsina. Por último, la adición de amilorida (10 uM)
demuestra que los cambios en la Icc son el resultado de cambios en
la corriente dependiente de sodio.
El objetivo de este estudio es evaluar la
actividad antiproteasa de la bikunina (1-170)
descrita en el ejemplo 17, después de una nebulización. Todos los
estudios se realizaron con bikunina formulada en disolución salina
tamponada con fosfato, pH 7,4 (NaCl 137 mM, KCl 3 mM,
KH_{2}PO_{4} 3 mM, Na_{2}HPO_{4} 8 mM, Tween 80 0,02
g/l).
Métodos de
nebulización
Nebulizador de medicación Raindrop®: La bikunina
se transformó en aerosol a concentraciones de 1 y 3 mg/ml. La copa
del nebulizador se llenó con 2,5 ml de disolución de bikunina. La
aerosolización se realizó a 7,35 l/min o 241,32 kPa.
Nebulizador de colisión: La bikunina se
transformó en aerosol a una concentración de 4,7 mg/ml. La copa del
nebulizador se llenó con 2,5 ml de disolución de bikunina. La
aerosolización se realizó a 241,32 kPa.
Recogida de las muestras
nebuilizadas
La bikunina aerosolizada se recogió utilizando
un colisionador doble (6,4 um de tamaño de límite de exclusión de
partículas aerodinámico a 60 l/min a través del sistema). El
colisionador actúa basándose en el principio de la colisión de
líquidos, y divide el aerosol en una fracción no respirable (>
6,4 um recogidos en la etapa 1) y una fracción respirable (< 6,4
um recogidos en la etapa 2).
Medida de la actividad
antiproteasa
Se midió la actividad de la bikunina in
vitro mediante su inhibición de la calicreína plasmática
humana.
Resultados
Nebulizador de medicación Raindrop®: Los valores
de actividad (Ki) de las muestras de pre- y postnebulización son
como sigue: bikunina 1 mg/ml, los valores de Ki son
0,48(\pm0,02) y 0,76(\pm0,04), respectivamente; y
bikunina (1-170) 3 mg/ml, los valores de Ki son
0,52(\pm0,03) y 0,62(\pm0,03),
respectivamente.
Nebulizador de colisión: Los valores de
actividad (Ki) de las muestras de pre- y postnebulización son
0,27(\pm0,03) y 0,45(\pm0,03),
respectivamente.
Conclusión
Las muestras de bikunina de pre- y
postnebulización de los nebulizadores Raindrop® y de colisión
muestran actividades similares (valores de Ki similares dentro de
la variabilidad del ensayo), indicando que la bikunina
(1-170) es estable frente a la aerosolización y
mantiene su actividad antiproteasa después de la nebulización.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de este estudio es investigar el
efecto de un inhibidor de serinproteasas de la familia Kunitz, la
bikunina (1-170), descrito en el ejemplo 17, sobre
la velocidad del moco traqueal de ovejas a lo largo de 8 horas
después del tratamiento. Este agente se administró mediante aerosol
nebulizado a los conductos respiratorios. El procedimiento
utilizado en este ejemplo se describe en O'Riordan et al., J.
Applied Physiol., 85(3), 1086-1091,
1998.
Medida de la
VMT
Se sujetaron ovejas adultas en posición erguida,
con las cabeza inmovilizadas, con un arnés corporal especializado.
Se intubaron nasalmente con un tubo endotraqueal, con el manguito
colocado justo por debajo de las cuerdas vocales. El aire inspirado
se calentó y humidificó. Para minimizar la posible disminución de la
VMT provocada por los manguitos inflados, el manguito del tubo
endotraqueal permanece desinflado a lo largo del estudio, excepto
durante el periodo de la administración del aerosol.
Para medir la VMT se insuflaron 5 a 10
partículas de teflón radiopacas (aproximadamente 1 mm de diámetro,
0,8 mm de espesor, y un peso desde 1,5 a 2 mg) en la tráquea a
través de un catéter colocado dentro del tubo endotraqueal. El
movimiento de las partículas de teflón se midió entonces durante un
periodo de 1 minuto. El procedimiento utilizado en este ejemplo se
describe en Russi et al., J. Applied Physiol., 59(5),
1416-1422, 1985. Un collar que contiene marcadores
radiopacos de longitud conocida se aplicó al exterior de los
animales y se utilizó como patrón para convertir la distancia
atravesada por las partículas en la pantalla de video en la
distancia real recorrida. La VMT se calculó a partir de la distancia
media en una dirección cefalada recorrida por minuto para 5 a 10
partículas de teflón. La línea de base de la VMT se midió
inmediatamente antes de la administración del aerosol.
Sustancias de ensayo: PBS, bikunina 1 mg/ml en
PBS, o bikunina 3 mg/ml en PBS; se administraron a los conductos
respiratorios de las ovejas como un aerosol (3 ml) generado
utilizando un nebulizador de chorro Raindrop® que funcionaba con un
caudal que produce gotas de diámetro aerodinámico mediano de masa de
3,6 um. La VMT se midió inmediatamente después de la administración
de la sustancia de ensayo (0 horas), y después a las 0,5, 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7 y 8 horas.
Resultados
Tal como se muestra en la figura 22, 9 mg de
aerosol de bikunina (3 ml de 3 mg/ml) administrados a los conductos
respiratorios de las ovejas aumentan significativamente la VMT a las
0, 0,5, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 horas, comparado con los mismos momentos
para un grupo de animales que reciben un aerosol con el vehículo
PBS. A las 24 horas, la VMT había vuelto a unas velocidades de
línea de base en el grupo de tratamiento con bikunina y en el grupo
con vehículo PBS.
A una dosis menor (3 mg de aerosol de bikunina
(3 ml de 1 mg/ml)) no se observaron diferencias significativas en
la VMT entre los grupos de tratamiento y vehículo en cualquier
momento estudiado.
El objetivo de este estudio es investigar el
efecto de la bikunina (1-170) (véase el ejemplo 17)
sobre la Icc en células GPTE in vitro. Las células GPTE se
sembraron sobre insertos de 1,2 cm de diámetro y tamaño de poro 0,4
um Snapwell^{TM} (Costar UK). Las células se cultivaron hasta la
confluencia y se montaron en cámaras Ussing modificadas
2-4 días después de colocarlas en la interfase
aire-líquido. Los insertos se sumergieron en
disolución de tampón de Krebs (KBR) y se burbujearon con 95% de
O_{2}/5% de CO_{2} calentado hasta 37ºC.
Después de un periodo de equilibrio de 20
minutos, la la diferencia de potencial transepitelial se fijó a 0
mV utilizando un fijador del voltaje WPI EVC 4000. Se utilizaron
electrodos Ag/AgCl para controlar la Icc. Cuando se alcanzó una
línea de base estable (de forma típica a los 20-30
min), las células se trataron con amilorida (30 uM). Cuando se
obtuvo una respuesta a la amilorida se lavó con una disolución de
KBR. Después de volver a la línea de base y al equilibrio se añadió
bikunina (1-170) descrita en el ejemplo 17 (10 a 50
ug/ml) o PBS. Treinta minutos después del tratamiento con el agente
se añade amilorida (30 uM).
Resultados
Tal como se muestra en la figura 23, la bikunina
(1-170) (50 ug/ml) inhibe la corriente de sodio
in vitro en células epiteliales traqueales de cobaya a lo
largo de un periodo de 30 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de este estudio es investigar el
efecto de la bikunina (1-170) (véase el ejemplo 17)
sobre la Icc en células OTE in vitro. Las células OTE se
sembraron sobre insertos de 1,2 cm de diámetro y tamaño de poro 0,4
um Snapwell^{TM} (Costar UK). Las células se cultivaron hasta la
confluencia y se montaron en cámaras Ussing modificadas
3-5 días después de colocarlas en la interfase
aire-líquido. Los insertos se sumergieron en
disolución de tampón de Krebs (KBR) y se burbujearon con 95% de
O_{2}/5% de CO_{2} calentado hasta 37ºC.
Después de un periodo de equilibrio de 20
minutos, la la diferencia de potencial transepitelial se fijó a 0
mV utilizando un fijador del voltaje WPI EVC 4000. Se utilizaron
electrodos Ag/AgCl para controlar la Icc. Cuando se alcanzó una
línea de base estable (de forma típica a los 30 min), las células se
trataron con amilorida (10 uM). Cuando se obtuvo una respuesta a la
amilorida se lavó con una disolución de KBR. Después de volver a la
línea de base se añadió bikunina (1-170) descrita en
el ejemplo 17 (25, 50 ó 100 ug/ml) o PBS. Noventa minutos después
del tratamiento con el agente se añade de nuevo amilorida (10
uM).
Resultados
Tal como se muestra en la figura 24, la bikunina
(1-170) (100 ug/ml) inhibe significativamente la
corriente de sodio in vitro en células epiteliales
traqueales ovinas a lo largo de un periodo de 90 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
La inflamación de los conductos respiratorios
dominada por leucocitos polimorfonucleares (PMN) (neutrófilos) a
menudo es una característica de la enfermedad pulmonar FQ. En
cobayas, la exposición a un aerosol de lipopolisacáridos (LPS) de
E. coli induce un marcado influyo de PMN en el fluido de
lavado broncoalveolar 24 horas después de la exposición. El
objetivo de este estudio es investigar el efecto de la bikunina
(1-170) descrita en el ejemplo 17 sobre la
diferencia de potencial traqueal en cobayas preexpuestas a un
aerosol de LPS. Los agentes se administraron a la tráquea cefalada
mediante instilación tópica. La diferencia de potencial traqueal se
controló a lo largo de 60 minutos, 23 horas después de la
exposición a LPS.
Materiales/reactivos
La bikunina (1-170) se formuló
en disolución salina equilibrada de Hank (HBSS). La amilorida se
obtuvo en Sigma Chemicals y se formuló en HBSS. El vehículo control
es HBSS. Se obtuvo Hypnorm® (citrato de fentanilo 0,315 mg/ml y
fluanisona 10 mg/ml) de Janssen Animal Health, e Hypnovel®
(midazolam 5 mg/ml) de Roche. Las cobayas macho
Dunkin-Hartley (600-700 g) se
obtuvieron de Harlan UK. Las sondas con termistor se obtuvieron en
Kane-May Ltd., Reino Unido.
Inducción de un influjo de
PMN
Los animales individuales se expusieron a un
aerosol de 0,03 mg/ml de LPS o PBS durante 10 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de los cobayas para
medir la diferencia de potencial
traqueal
A las 23,4 horas después del tratamiento con
LPS, los cobayas se anestesiaron con Hypnorm® e Hypnovel®, y se
inmovilizaron en posición supina. Se realizó una incisión en la
línea media ventral desde la mandíbula inferior a las clavículas.
Utilizando disección roma se expuso una longitud de la tráquea y se
biseccionó en el extremo superior del esternón. Se expuso la vena
yugular externa y se canuló. La parte caudal de la tráquea se
canuló entonces para que el animal pudiese respirar el aire
ambiental de forma espontánea. Entonces se colocó el animal en
posición supina y se mantuvo la temperatura corporal a 37ºC mediante
ajuste manual de una lámpara de calor. La temperatura rectal se
controló con una sonda con termistor.
Veinte minutos después de la inducción de la
anestesia se instiló por vía tópica bikunina (50 mg/ml) o amilorida
(100 uM) a la tráquea cefalada. Entonces se insertó el electrodo de
agar traqueal en la tráquea cefalada y se midió la diferencia de
potencial traqueal durante 60 minutos. El electrodo de referencia se
colocó bajo la tráquea cefalada en contacto con el cartílago de la
tráquea. El sitio de la herida se cubrió para evitar que se
secase.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
Tal como se muestra en la figura 25(a),
la exposición a LPS provoca un influjo de PMN significativo. La
bikunina inhibe de forma significativa la diferencia de potencial
en cobayas preexpuestas a LPS, como se muestra en la figura
25(b).
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de este estudio es investigar el
efecto de la muteína doble de aprotinina descrita en el ejemplo 16
sobre la velocidad del moco traqueal de cobaya 1,5 horas después del
tratamiento. Este agente se administró a la tráquea cefalada
mediante instilación tópica. La VMT se controló 1,5 horas después
durante 60 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Materiales/reactivos
La muteína doble de aprotinina (véase el ejemplo
16) se obtuvo de Biotechnologie, Bayer AG, Alemania, EEUU, y se
formuló en disolución salina equilibrada de Hank (HBSS). Se obtuvo
Hypnorm® (citrato de fentanilo 0,315 mg/ml y fluanisona 10 mg/ml)
de Janssen Animal Health, e Hypnovel® (midazolam 5 mg/ml) de Roche.
Las cobayas macho Dunkin-Hartley
(600-750 g) se obtuvieron de Harlan UK. Las sondas
con termistor se obtuvieron en Kane-May Ltd., Reino
Unido.
\vskip1.000000\baselineskip
Inducción de la
anestesia
Los animales se anestesiaron utilizando
halotano. Cuando se indujo un nivel satisfactorio de anestesia, se
realizó una pequeña incisión bajo la mandíbula inferior. La tráquea
se expuso y se inyectaron 100 ul de vehículo o muteína doble de
aprotinina (10 ug) en el lumen de los conductos respiratorios
utilizando una aguja y una jeringa. Después de la inyección, la
piel sobre el sitio de inyección traqueal se reparó. Entonces se
dejó que los animales se recuperasen.
\vskip1.000000\baselineskip
Medida de la velocidad del moco
traqueal
La velocidad del moco traqueal (VMT) se controló
utilizando una sonda detectora de partículas beta en miniatura
colimada de plomo dispuesta para detectar la radiactividad emitida a
partir de una parte alícuota inyectada de Saccharomyces
cerevisiae marcado con ^{32}P, según era transportado sobre la
capa mucociliar traqueal de una cobaya anestesiada (Newton y Hall,
1998). Setenta minutos después de la instilación del agente de
ensayo, los cobayas se anestesiaron por segunda vez con Hyponorm® e
Hyponovel®, y se inmovilizaron en posición supina. La primera
medida de VMT se tomó 20 minutos después.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
Tal como se muestra en la figura 26, la muteína
doble de aprotinina (10 ug) aumenta la VMT in vivo en
cobayas, con relación al HBSS, durante un periodo sostenido de 1,5
a 2,5 horas después de la administración.
Las células HBE se aislaron a partir de tejido
de trasplante de pulmón de pacientes con FQ y se cultivaron en
matraces revestidos con colágeno durante una semana. Las células
entonces se subcultivaron y se sembraron sobre filtros revestidos
de colágeno Transwell Costar (0,33 cm^{2}) y se cultivaron en
medio DMEM/F12 suplementado con Ultroser G al 2%. Las células se
cultivaron en una interfase aire-líquido y se
utilizaron de 2 a 4 semanas después de la siembra.
Las células en los filtros Transwell se montaron
en cámaras Costar Ussing modificadas y se estudiaron bajo conciones
Icc. Los valores de la línea de base de Icc se registraron (desde 0
a 20 minutos) y después se añadió bikunina (1-170)
(véase el ejemplo 17) (10 ug/ml en PBS) en el lado apical. Se
registó la Icc durante 90 minutos y después se añadió amilorida (10
uM) y se registró la Icc durante 10 minutos más. Después el fluido
del baño apical se cambió por tampón fresco, y la Icc se registró
durante 15 minutos más. Se añadió tripsina (1 uM) al lado apical y
se registró la Icc durante 15 minutos. Entonces se añadió amilorida
(10 uM) al lado apical y se registró la Icc durante 10 minutos
más.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
Tal como se muestra en la figura 28(a),
la bikunina (1-170) (10 ug/ml en PBS) inhibe la Icc
in vitro en células epiteliales bronquiales de FQ humanas a
lo largo de un periodo de 90 minutos. La Icc se volvió a reducir por
la adición de amilorida (10 uM). Después de lavar, la Icc aumentó
hasta alcanzar de nuevo la corriente antes de la adición de
amilorida. Después de 15 minutos más, la superficie apical se trata
con tripsina (1 uM), y esto aumenta aún más la Icc hasta el nivel
de corriente de la línea de base (es decir, la observada a los 20
minutos). Por último, la adición de amilorida (10 uM) inhibe la
mayor parte de la corriente, y demuestra que los cambios en la Icc
son el resultado de cambios en la corriente dependiente de
sodio.
La figura 28(a) demuestra que la bikunina
(1-170) a 1, 5 y 10 ug/ml, y la aprotinina a 20
ug/ml, inhibe la Icc al menos 90 minutos después de la aplicación
apical a células epiteliales bronquiales de FQ humanas in
vitro.
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 9
<223> /nota = "n en las posiciones 622,
679, 707 es cualquier ácido nucleico"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 10
<223> /nota = "Xaa en las posiciones
210, 226 y 233 son codones de terminación o sin sentido"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 11
<223> /nota = "Xaa en las posiciones 8,
17, 21-26, 40, 42, 45-47, 52, 64,
103, 112, 114, 116-121, 135, 137,
140-142, 147 y 159 es cualquier resto
aminoácido"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 9
<223> /nota = "el resto 361 es cualquier
aminoácido"
<223> /nota = "el resto 367 es cualquier
aminoácido"
<223> /nota = "el resto 384 es cualquier
aminoácido"
<223> /nota = "el resto 390 es cualquier
aminoácido"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 13
<223> /marcador = péptido señal
<223> /nota = "Xaa en las posiciones
111, 120, 122, 128 y 130 representa un codón de terminación o sin
sentido"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 14
<223> /nota = "n en las posiciones 425,
482 y 510 es cualquier ácido nucleico"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 15
<223> /nota = "Xaa en las posiciones 2,
23, 132, 160 y 167 representa un codón de terminación o sin
sentido"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 16
<223> /nota = "n en las posiciones 3,
11, 12, 17, 51 y 429 representa cualquier ácido nucleico"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 17
<223> /nota = "n en las posiciones 6,
310 y 408 representa cualquier ácido nucleico"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 18
<223> /nota = "precursor 1 del inhibidor
de la vía del factor tisular"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 19
<223> /nota = "precursor 1 del inhibidor
de la vía del factor tisular"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 20
<223> /nota = "precursor del inhibidor
de la vía del factor tisular"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 21
<223> /nota = "precursor 2 del inhibidor
de la vía del factor tisular"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 22
<223> /nota = "precursor 2 del inhibidor
de la vía del factor tisular"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 23
<223> /nota = "homólogo de la proteína
precursora de amiloides"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 24
<223> /nota = "aprotinina"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 25
<223> /nota = "precursor del inhibidor
de inter-alfa-tripsina"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 26
<223> /nota = "precursor del inhibidor
de inter-alfa-tripsina"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 27
<223> /nota = "proteína precursora de
amiloides"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 28
<223> /nota = "precursor del colágeno
alfa-3 (VI)"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 29
<223> /nota =
"HKI-B9"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 32
<223> /nota = "cDNA de un fragmento de
la proteína bikunina humana"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 45
<223> /marcador = péptido señal
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 47
<223> /marcador = péptido señal
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 49
<223> /marcador = péptido señal
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 50
<223> /nota = "fragmento de la proteína
bikunina humana"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 51
<223> /nota = "fragmento de la proteína
bikunina humana"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 52
<223> /nota = "fragmento de la proteína
bikunina humana"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 53
<223> /nota = "péptido señal de la
proteína bikunina humana"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 54
<223> fragmento de la proteína bikunina
humana
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 55
<223> /nota = "oligómero para preparar
un constructo de expresión"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 56
<223> oligómero para preparar un
constructo de expresión
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 57
<223> /nota = "oligómero para preparar
un constructo de expresión"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 58
<223> /nota = "oligómero para preparar
un constructo de expresión"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 61
<223> /nota = "oligómero para preparar
un constructo de expresión de bikunina"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 62
<223> /nota = "oligómero para preparar
un constructo de bikunina"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 63
<223> /nota = "fragmento de la proteína
bikunina humana"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 64
<223> /nota = "fragmento de la proteína
bikunina humana"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 65
<223> /nota = "fragmento de la proteína
bikunina humana"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 66
<223> /nota = "fragmento de la proteína
bikunina humana"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 67
<223> /nota = "fragmento de la proteína
bikunina humana"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 68
<223> /nota = "fragmento de la proteína
bikunina humana"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 69
<223> /nota = "fragmento de la proteína
bikunina humana"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 70
<223> /nota = "fragmento de la proteína
bikunina humana"
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 71
<223> /nota = "fragmento de la proteína
bikunina humana"
<110> Bayer Aktiengesellschaft
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para acelerar la velocidad de
la eliminación mucociliar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 89.71942/001.cpp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 99963636.8
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
22-12-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> documento PCT/GB99/04381
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
22-12-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> documento US 09/441.966
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-11-1999
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<150> documento US 09/218.913
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<151>
22-12-1998
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<160> 105
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 179
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 197
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> SEÑAL
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<222> (1)..(18)
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<223>
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<400> 2
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<211> 153
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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<211> 58
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<210> 5
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<211> 58
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<211> 51
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<211> 92
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<211> 708
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia de DNA consenso de la
bikunina humana (figura 3)
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<220>
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<221> característica_misc
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<222> (622)..(622)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<220>
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<221> característica_misc
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<222> (679)..(679)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
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<222> (707)..(707)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<211> 197
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Aminoácidos -18 a 179 de la
traducción de la secuencia de DNA consenso en la figura 3
\newpage
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 179
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Variantes de la bikunina humana
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<220>
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<221> CARACTERÍSTICA_MISC
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<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42)..(42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (45)..(47)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (52)..(52)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
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<222> (64)..(64)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
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<222> (103)..(103)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
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<222> (112)..(112)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
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<222> (114)..(114)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (116)..(121)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (135)..(135)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (137)..(137)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
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<222> (140)..(142)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
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<220>
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<221> CARACTERÍSTICA_MISC
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<222> (147)..(147)
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<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
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<220>
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<221> CARACTERÍSTICA_MISC
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<222> (159)..(159)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cada "Xaa" representa
independientemente un resto aminoácido que aparece en la naturaleza
excepto Cys, con la condición de que al menos un "Xaa" en SEQ
ID NO:11 es diferente del correspondiente resto aminoácido de la
secuencia nativa.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<221> característica_misc
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<222> (361)..(361)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
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<222> (367)..(367)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
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<222> (384)..(384)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
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<222> (390)..(390)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<221> SEÑAL
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<222> (1)..(18)
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<223>
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 510
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> característica_misc
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<222> (424)..(424)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> característica_misc
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<222> (481)..(481)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<220>
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<221> característica_misc
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<222> (509)..(509)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<220>
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<221> característica_misc
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<222> (17)..(17)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<220>
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<221> característica_misc
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<222> (48)..(48)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<220>
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<221> característica_misc
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<222> (425)..(425)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
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<400> 16
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<221> característica_misc
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<222> (6)..(6)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (401)..(401)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (407)..(407)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor
1 del inhibidor de la vía del factor tisular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor
1 del inhibidor de la vía del factor tisular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor
del inhibidor de la vía del factor tisular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor
2 del inhibidor de la vía del factor tisular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor
2 del inhibidor de la vía del factor tisular
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de tipo Kunitz del homólogo
de la proteína precursora de amiloides
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de tipo Kunitz de la
aprotinina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor
del inhibidor de
inter-alfa-tripsina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor
del inhibidor de
inter-alfa-tripsina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de tipo Kunitz de la
proteína precursora de amiloides
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de tipo Kunitz del precursor
de colágeno alfa-3(VI)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de tipo Kunitz de
HKI-B9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sentido 5' utilizado
en el ejemplo 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm87
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido 3'
utilizado en el ejemplo 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm88
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de cDNA de bikunina
clonada del ejemplo 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR 3' utilizado para
amplificar EST R74593
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm90
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR 5' utilizado para
amplificar EST R74593
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm91
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR 5' utilizado para
amplificar EST R35464
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm92
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR 5' utilizado para
amplificar EST R34808
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm93
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de secuenciación de DNA
específico de vector (SP6)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm94
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de secuenciación de DNA
específico de vector (T7)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm95
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de secuenciación de DNA
específico de gen
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm96
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de secuenciación de DNA
específico de gen
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1cm97
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de secuenciación de DNA
específico de gen
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1cm98
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sentido 5' utilizado
en el ejemplo 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm99
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido 3'
utilizado en el ejemplo 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 207
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de bikunina clonada del
ejemplo 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia consenso derivada de EST
de la bikunina humana (figuras 4D y 4G)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 782
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1544
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1358)..(1358)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1530
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de bikunina consenso de la
figura 4C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (46)..(46)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (117)..(117)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (313)..(313)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\hskip1cm114
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\hskip1cm115
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sentido 5' utilizado
para el constructo nº 2 del ejemplo 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\hskip1cm116
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido 3'
utilizado para el constructo nº 2 del ejemplo 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\hskip1cm117
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sentido 5' utilizado
para el constructo nº 3 del ejemplo 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip1cm118
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sentido 5' utilizado
para el constructo nº 4 del ejemplo 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\hskip1cm119
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sentido utilizado en
la PCR del ejemplo 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\hskip1cm120
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
utilizado en la PCR del ejemplo 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\hskip1cm121
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido utilizado para la
mutagénesis in vitro del ejemplo 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\hskip1cm122
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido utilizado para la
mutagénesis in vitro del ejemplo 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\hskip1cm123
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\hskip1cm124
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm125
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip1cm126
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip1cm127
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "Xaa" es Ile, Thr, Asn o
Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "Xaa" es Val, Ala, Glu o
Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "Xaa" es Ser, Pro, Thr o
Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "Xaa" es Tyr, His, Asn o
Asp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm134
\hskip1cm135
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "Xaa" es Asp o Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\hskip1cm137
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 511
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Versión corregida de EST R74593
(figura 3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (425)..(425)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (482)..(482)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (510)..(510)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aminoácidos 184-214
de la traducción de la secuencia de DNA consenso en la figura 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "Xaa" es Asp o Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\hskip1cm139
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 312
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (45)..(45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (49)..(49)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (118)..(118)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (231)..(231)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (305)..(305)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (117)..(117)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (123)..(123)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (321)..(321)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 283
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (222)..(222)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (231)..(231)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (262)..(262)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (267)..(267)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (274)..(274)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<400> 98
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<210> 99
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<211> 380
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 99
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<210> 100
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<211> 320
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> característica_misc
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<222> (304)..(304)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es cualquier nucleótido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
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<222> (309)..(309)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<400> 100
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<210> 101
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<211> 397
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<221> característica_misc
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<222> (24)..(24)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<400> 101
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<210> 102
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<212> DNA
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<222> (61)..(61)
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<222> (74)..(74)
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<222> (184)..(184)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<400> 102
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<210> 103
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<211> 311
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<222> (7)..(7)
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<211> 338
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<212> DNA
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<222> (32)..(32)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<220>
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<222> (67)..(67)
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<220>
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<222> (136)..(136)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<400> 104
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<210> 105
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<211> 343
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<212> DNA
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<222> (13)..(13)
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<222> (19)..(19)
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<222> (107)..(107)
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<223> "n" es cualquier nucleótido
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<400> 105
Claims (15)
1. El uso de un inhibidor de serinproteasas de
tipo Kunitz para preparar un medicamento para tratar una enfermedad
pulmonar asociada con la retención y acumulación de moco,
seleccionada del grupo de enfermedades que consiste en fibrosis
quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis
crónica, bronquietasis, sinusitis crónica y otitis media con
efusión, comprendiendo el medicamento una cantidad eficaz de un
inhibidor de serinproteasas de tipo Kunitz humanas y un vehículo
fisiológicamente aceptable para él, en el que el inhibidor de
serinproteasas de tipo Kunitz comprende la secuencia de
aminoácidos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un uso según la reivindicación 1, en el que
la enfermedad es la enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
3. El uso según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el inhibidor de serinproteasas de tipo
Kunitz está glicosilado.
4. El uso según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el inhibidor de serinproteasas de tipo
Kunitz contiene al menos un enlace disulfuro
cisteína-cisteína dentro de la cadena.
\newpage
5. El uso según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el inhibidor de serinproteasas de tipo
Kunitz contiene al menos un enlace disulfuro
cisteína-cisteína dentro de la cadena, seleccionado
de los grupos apareados cisteína-cisteína que
consisten en CYS11-CYS61,
CYS20-CYS44, CYS36-CYS57,
CYS106-CYS156, CYS115-CYS139 y
CYS131-CYS152, en el que los restos cisteína se
numeran según la secuencia de aminoácidos de la bikunina
placentaria humana nativa.
6. El uso según la reivindicación 1, en el que
la composición se va a administrar a los conductos respiratorios
pulmonares.
7. El uso según según la reivindicación 1, en
el que dicha composición se va a administrar directamente mediante
aerosolización.
8. El uso según según la reivindicación 1, en
el que dicha composición se va a administrar directamente como una
suspensión en aerosol hacia el tracto respiratorio de mamíferos.
9. El uso según la reivindicación 8, en el que
dicha suspensión en aerosol incluye partículas respirables que
varían en tamaño desde aproximadamente 1 a aproximadamente 10
micras.
10. El uso según la reivindicación 8, en el
que dicha suspensión en aerosol incluye partículas respirables que
varían en tamaño desde aproximadamente 1 a aproximadamente 5
micras.
11. El uso según la reivindicación 8, en el
que dicha suspensión en aerosol se va a administrar a dicho sujeto
mediante un nebulizador accionado por presión.
12. El uso según la reivindicación 8, en el
que dicha suspensión en aerosol se va a administrar a dicho sujeto
mediante un nebulizador ultrasónico.
13. El uso según la reivindicación 8, en el
que dicha suspensión en aerosol se va a administrar a dicho sujeto
mediante un propelente no tóxico.
14. El uso según según la reivindicación 1, en
el que dicho vehículo es un miembro seleccionado del grupo que
consiste en una disolución fisiológicamente tamponada, una
disolución salina isotónica, una disolución salina normal y sus
combinaciones.
15. El uso según la reivindicación 8, en el
que dicha suspensión en aerosol se va a administrar a dicho sujeto
mediante un inhalador de polvo seco.
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