JP2002532558A - 粘膜線毛クリアランスの速度を促進する方法 - Google Patents

粘膜線毛クリアランスの速度を促進する方法

Info

Publication number
JP2002532558A
JP2002532558A JP2000589209A JP2000589209A JP2002532558A JP 2002532558 A JP2002532558 A JP 2002532558A JP 2000589209 A JP2000589209 A JP 2000589209A JP 2000589209 A JP2000589209 A JP 2000589209A JP 2002532558 A JP2002532558 A JP 2002532558A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
bikunin
seq
kunitz
amino acid
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2000589209A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3819239B2 (ja
Inventor
ロデリック ホール、
クリストファー ティー． ポール、
ベンジャミン ビー． ニュートン、
ウィリアム ジェイ．エイ． テイラー、
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Publication of JP2002532558A publication Critical patent/JP2002532558A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3819239B2 publication Critical patent/JP3819239B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/10—Expectorants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/12—Mucolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、膿胞性腺維症等の粘膜腺毛機能不全に罹った対象の気道中の粘液および痰の粘膜腺毛クリアランスの速度を刺激するために、Ｋｕｎｉｔｚ型（Ｋｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅ）セリンプロテアーゼ阻害剤、例えば、アプロチニンまたはビクニンを使用する組成物および方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 相互参照 本出願は、１９９８年１２月２２日に提出された米国特許出願号第０９／２１
８，９１３号の一部継続である。
【０００２】 発明の分野 本発明は、肺気道中の粘液および痰の粘液毛様体クリアランスの速度を促進す
るセリンプロテアーゼ阻害剤タンパク質を含む組成物に関する。本発明は、哺乳
類における粘膜線毛クリアランスの速度を刺激する方法にも関する。
【０００３】 発明の背景 委ねられた問題 肺気道での粘液および痰を排除する線毛上皮の不能によって特徴づけられる粘
膜線毛機能不全は、慢性気管支炎（ＣＢ）、気管支拡張症（ＢＥ）、喘息および
特に膿胞性腺維症（ＣＦ）等の慢性の閉鎖性肺疾患の重大な合併症である。粘膜
線毛機能不全に罹っている患者は、二次的細菌感染に対して特に傷つきやすい。
粘膜線毛機能不全に関連したＣＦおよび呼吸器疾患についての治療および維持適
用様式および治療の必要が記載された。例えば、Ｂｒａｇａ「Ｄｒｕｇｓ ｉｎ
Ｂｒｏｎｃｈｉｎａｌ Ｍｕｃｏｌｏｇｙ（気管支の粘液学における薬剤）」、
Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｌｅｔｈｅｒｍら、Ａ
ｍ Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４２：１０５３−１０５８、１９９０；
米国特許第５，８３０，４３６号参照。
【０００４】 膿胞性腺維症 膿胞性腺維症（ＣＦ）は、外分泌上皮中の流動体および電解質輸送での異常を
引き起こす常染色体劣性疾患である。膿胞性腺維症膜貫通コンダクタンスレギュ
レータ（ＣＦＴＲ）と称されるタンパク質をコードするＤＮＡ内での突然変異が
、事実上全てのＣＦ患者で見られた。肺の細胞は、特に影響される。Ｄｉ Ｓａ
ｎｔａｇｒｅｓｅら、Ａｍ Ｊ．Ｍｅｄ．６６：１２１−１３２（１９７９）。
【０００５】 ＣＦでは、気道粘膜細胞の層の境界は、膜の塩化物チャネルのｃＡＭＰ依存性
タンパク質キナーゼ活性化に反応性でない。Ｃｌ−に対する細胞透過性は、損傷
を受け、そして細胞を超えたＮａ＋吸収は促進される。これらの電解質不均衡の
両方は、気道粘膜の水和のレベルを減少させる傾向にあり、したがって、これに
よりＣＦの粘性肺分泌特性に貢献する。Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｓｔ
．Ｍｅｄ．１１：７５（１９８６）。外因性細菌およびマイコプラズマは、肺気
道に入り、そしてその粘膜内にコロニーを確立する。ＣＦに関連した厚い粘膜は
、免疫系からこれらの病原体を単離する。粘膜毛様体クリアランスは、ＣＦ患者
で減じられるので、細菌クリアランスも減じられる。したがって、肺うっ血およ
び感染は共通する。これらの病原体の長期化した存在は、肺機能を危うくする炎
症反応を常に開始する。Ｂｅｄｒｏｓｓｉａｎら、Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌ．
７：１９５−２０４、１９７６。
【０００６】 ＣＦ肺での粘膜粘性は、一部には、気道粘膜毛様体クリアランス（ＭＣＣ）の
速度を変化させる気道表面流動体（ＡＳＬ）でのＣｌ−チャネル機能不全および
ナトリウム（Ｎａ−）イオン濃度の修正に関連したときに粘膜の水和が減少され
ることによる。粘膜輸送に関与した機構は、インビトロおよびインビボで研究さ
れてきた。ＣＢ、ＣＦおよびＢＥ痰は、粘膜除去ウシ気管（ＭＤＥＴ）の哺乳類
の線毛上皮によってゆっくりと輸送される（Ｗｉｌｌｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．９７（１）：９−１３、１９９５）。ＭＤＳＴ上の減少した痰の輸送
能力がゆっくりなのは、その電解質／透過溶解物の含有量が低いことに関連し得
る（Ｗｉｌｌｓら、Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５１（４）
：１２５５−１２５８、１９９７）。実際に、病気の痰は、血漿に対して低い電
解質含有量を示すことが知られている（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒ
ｅｓｐ．Ｄｉｓ．８８：１９９−２０４、１９６３；Ｐｏｔｔｅｒら、Ａｍ．Ｒ
ｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．６７（１）：８３−８７、１９６７；Ｔｏｍｋｉｅｗ
ｉｃｚら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．１４８（４、Ｐｔ．１）：１００
２−１００７、１９９３）。
【０００７】 ＭＤＥＴにおけるさらなる研究は、病気の痰の輸送能力が、塩化ナトリウムを
用いた以下の治療を改善するということを示した（Ｗｉｌｌｓら、１９９５）。
さらに、臨床研究は、高張性生理食塩水の、または上皮のナトリウムチャネル（
ＥＮａＣ）ブロッカーアミロライドの吸入は、病気の患者におけるＭＣＣを明ら
かに増大させ得ることを示した（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｔｈｏｒａｘ ５２（１
０）：９００−９０３、１９９７；Ａｐｐら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ
．１４１、６０５−６１２、１９９０）。最近、気管の粘膜速度（ＴＭＶ）のモ
ルモット・モデルでのインビボでの粘膜クリアランスとそのイオン性組成物との
関係が解明された。インビボでの研究は、高張性生理食塩水の５分間のエアロゾ
ルが、ＴＭＶを一過的に増大することを示した。ＴＭＶでの増大が、高張性生理
食塩水（１４．４％）エアロゾルの１分後に観察された。ＴＭＶは、高張性生理
食塩水露出動物で５．１±１．０ｍｍ．ｍｉｎ−１（ｎ＝９）であった（ｎ＝９
；ｐ≦０．００１）（Ｎｅｗｔｏｎ ＆ Ｈａｌｌ、１９９７）。吸入されたア
ミロライドも、ＴＭＶでの増大を引き起こした。ＴＭＶでの明らかな増大は、ア
ミロライド（１０ｍＭ）の２０分のエアロゾルの１５分後に観察された。ＴＭＶ
は、アミロライド露出動物（ｎ＝８；ｐ≦０．０５）で８．１±０．３ｍｍ．ｍ
ｉｎ−１に比較して３．２±２．５ｍｍ．ｍｉｎ−１（ｎ＝９）であった（Ｎｅ
ｗｔｏｎら、Ｐｅｄ．Ｐｕｌｍ．Ｓ１７、Ａｂｓ．３６４、１９９８）。これら
の剤は、気道表面流動体（ＡＳＬ）のイオン性含有量を増大させることによって
作用するようである。
【０００８】 全身性の偽性アルドステロン低下症（ＳＰＨＡ）を有する対象からの臨床上の
遺伝的証拠も、気道上皮のナトリウムチャネルの活性の下降調節が、肺での粘膜
毛様体クリアランスを増大するという見解を支持する。上皮のナトリウムチャネ
ル副単位についての遺伝子での機能突然変異の損失を示すＳＰＨＡ患者は、気道
表面からのナトリウム吸収を示さず、それらは、正常な対象に比較して鼻内表面
流動体でのナトリウムイオン濃度を増大させ、そしてそれらは、４倍の増大した
肺粘膜毛様体クリアランス速度を示した（Ｋｅｒｅｍら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３４１、１５６−１６２、１９９９）。
【０００９】 最近、チャネル活性化プロテアーゼ（ＣＡＰ−１）と称されるセリンプロテア
ーゼは、両生類のツメガエルの腎臓上皮細胞（Ａ６細胞）の先端膜で見出された
（Ｖａｌｌｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６５１）：６０７−６１０、１９
９７）。ＣＡＰ−１は、これらの細胞でのＮａ＋チャネル活性を調節するようで
ある。始原型ウシＫｕｎｉｔｚ阻害剤であるアプロチニンに対する先端膜の露出
は、上皮間のＮａ＋チャネルを減少させた（Ｖａｌｌｅｔら、１９９７；Ｃｈｒ
ａｉｂｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏ．１１１（１）：１２７−１３８、１９
９８）。Ｂｕｋｉｎｉｎ（１−１７０）の効果、２つのＫｕｎｉｔｚドメインヒ
ト相同性のウシアプロチニン（Ｄｅｌａｒｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７２（１８）：１２２０９−１２２１４、１９９７；Ｍａｒｌｏｒら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１８）：１２２０２−１２２０８、１９９７）を、イ
ンビトロでの正常な培養ヒト気管支の上皮細胞（ＨＢＥ）の短電流（Ｉｓｃ）を
用いて評価した（ＭｃＡｕｌａｙら、Ｐｅｄ．Ｐｕｌｍ．Ｓ１７、Ａｂｓ．１４
１、１９９８）。ビクニン（１５ｕｇ．ｍｌ−１：７０ｎＭ）は、正常なＨＢＥ
細胞（ｎ＝５−８；ｐ≦０．０５）で５４％Ｎａ＋Ｉｓｃを明らかに阻害した。
全体的に、ビクニン（７０ｎＭ）は、９０分で基本線Ｉｓｃの５８％を阻害した
。別の研究では、ビクニン（５ｕｇ．ｍｌ−ｌ）は、正常なＨＢＥ細胞（ｎ＝６
；ｐ≦０．０１）で８４％Ｎａ＋Ｉｓｃを明らかに阻害した一方で、セルピンフ
ァミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤アルファ（１）−プロテアーゼ阻害剤（α １ −ＰＩ）（５０μｇ・ｍｌ−１）は、明白な効果がなかった。インビトロで培
養されたヒト膿胞性腺維症の気道上皮細胞で、Ｉｓｃは、ビクニン（１−１７０
）（１μｇ／ｍＬ）によって阻害され、そしてアプロチニン（２０μｇ／ｍＬ）
によって阻害された。
【００１０】 単独の研究群による２つの最近の研究では、ＴＭＶにおけるプロテアーゼ阻害
剤で誘導される効果が示された。抗原感作の３０分前、または感作の１時間後の
いずれかに示されるα１−ＰＩ（１０ｍｇ）は、感作の６時間後に、アレルギー
のヒツジでのＴＭＶにおける抗原誘導還元の力を減じた（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら
、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．９７（５）：１５２２−
１５２８、１９９７）。図１で、Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、１９９７年の文献で、
著者らは、それ自体（非抗原感作）で、アレルギーのヤギの気道に投与されたα １ −ＰＩは、６時間の期間中基本線ＴＭＶでの効果を示さなかった。第２の研究
で、α１−ＰＩは、抗原感作の６時間後に付与され、そして感作の２４時間後に
、抗原誘導の明らかな逆行によってのみ引き起こされた（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら
、Ａｐｐ．Ｐｈｙｓｉｏ．８５（３）：１０８６−１０９１、１９９８）。著者
らは、α１−ＰＩの効果についての機構は、それの抗神経親和性エラスターゼ特
性に関連し、神経親和性エラスターゼは、それらのモデルでの粘膜毛様体クリア
ランスの速度を減少させる原因である酵素であると考えられる。それらは、α１ −ＰＩは、喘息におけるアレルギー誘引神経親和性エラスターゼ放出によって引
き起こされる粘膜毛様体機能不全を治療するために使用され得ると結論づけた（
Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、１９８８）。かれらは、他の呼吸器疾病で潜在的役割を
推測しなかった。
【００１１】 発明の簡単な要約 本発明は、肺の気道中の粘液および痰の粘膜毛様体クリアランス（ＭＣＣ）の
速度を刺激するＫｕｎｉｔｚファミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤の使用に向
けられる。Ｋｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤は、粘膜の滞留および蓄積が、主
要な臨床問題である膿胞性腺維症（ＣＦ）、慢性気管支炎（ＣＳ）および気管支
拡張症（ＢＥ）等の肺疾病を治療するために使用され得る。現在まで、先行技術
は、基本線速度より上のＭＣＣの速度を増大する能力を有するプロテアーゼ阻害
剤に関連しなかった。Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤は、粘液の滞留
および蓄積が臨床的問題である慢性副鼻腔炎および粘性耳を治療するためにも使
用できる。
【００１２】 本発明は、ＭＣＣを刺激する方法に使用するためのＫｕｎｉｔｚドメインまた
はＫｕｎｉｔｚ様ドメインを含むセリンプロテアーゼ阻害剤タンパク質の使用を
意図する。本発明の１つの実施形態では、アプロチニン等のウシセリンプロテア
ーゼ阻害剤タンパク質、および１９９８年１月２８日に刊行されたＥＰ８２１０
０７号に記載されるもののような変異体およびその断片が、本発明を実施する上
で使用され得る。
【００１３】 本発明の別の実施形態では、ヒトセリンプロテアーゼ阻害剤は、ＭＣＣの速度
を刺激する方法に使用することが意図される。ヒトのセリンプロテアーゼ阻害剤
の代表例としては、ビクニンおよび１９９７年９月１８日に刊行されたＷＯ９７
／３３９９６（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．）、および１９９５年４月１８日に発行
された米国特許第５，４０７，９１５号（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）に記載されるもの
のような変異体およびその断片が挙げられ、そしてそれは全体的にここに組み込
まれる。
【００１４】 本発明は、図面と共に以下の詳細な説明および特許請求の重要性からよりよく
理解される。
【００１５】 発明の詳細な説明 本発明は、肺気道中の粘液および痰の粘膜線毛クリアランスの速度を刺激する
Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤タンパク質およびそれの断片を含む組
成物に関する。組成物は、Ｋｕｎｉｔｚクラスの２つのセリンプロテアーゼ阻害
ドメインを含むここでヒト胎盤ビクニンと称される、新たに同定されたヒトタン
パク質も含む。
【００１６】 本発明はまた、生物学的に匹敵するビヒクルでの、有効量の本発明の開示セリ
ンプロテアーゼ阻害剤を、患者に投与することを特徴とする、粘膜線毛機能不全
を示す患者における粘膜線毛クリアランスの速度を刺激する方法を提供する。
【００１７】 胎盤ビクニン、単離ドメイン、および他の異性体の好ましい使用は、疾病療法
および管理の一部としてＣＦ患者での粘膜線毛クリアランスを刺激するためのも
のである。これらの方法および組成物は、慢性閉鎖性肺疾病を示す患者において
肺気道で粘液および痰連続発生を減少または排除し、それにより二次肺感染およ
び他の有害な副作用の危険を減少させ、同様に、ＣＦ患者における肺移植手術の
必要性を避けるか、または遅延させる。
【００１８】 本発明の方法は、ＭＣＣを刺激するためのアプロチニンの使用を意図する。ア
プロチニンは、両生類ツメガエルの腎臓上皮細胞（Ａ６細胞）の先端膜での上皮
内Ｎａ＋輸送を減少させることが示された（Ｖａｌｌｅｔら、１９９７：Ｃｈｒ
ａｉｂｉら、１９９８）。アプロチニン作用の機構は、Ａ６細胞でのＮａ＋チャ
ネル活性を調節することに関与されるプロテアーゼである、ＣＡＰ−１の阻害に
関与することが提案された。ウシアプロチニンの２つのＫｕｎｉｔｚドメインヒ
ト相同体（Ｄｅｌａｒｉａら、１９９７：Ｍａｒｌｏｒら、１９９７）であるビ
クニン（１−１７０）は、インビトロで正常の培養ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥ
）短い電流（Ｉｓｃ）を明らかに阻害することも示された（ＭｃＡｕｌａｙら、
１９９８）。ビクニン（１．５ｕｇ．ｍｌ−１：７０ｎＭ）が、正常なＨＢＥ細
胞での５４％Ｎａ＋Ｉｓｃを明らかに阻害した（ｎ＝５−８；ｐ≦０．０５）。
全般に、ビクニン（７０ｎＭ）は、９０分間で基本線Ｉｓｃの５８％を阻害した
。別の研究では、ビクニン（５０ｕｇ．ｍｌ−ｌ）は、正常なＨＢＥ細胞での８
４％Ｎａ＋Ｉｓｃを明らかに阻害した（ｎ＝６；ｐ≦０．０１）一方で、セルピ
ンファミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤アルファ（１）−プロテアーゼ阻害剤
（α１−ＰＩ）（５０ｕｇ．ｍｌ−ｌ）は、有為な効果がなかった。インビトロ
での培養ヒト膿胞性腺維症気道上皮細胞で、Ｉｓｃは、ビクニン（１−１７０）
（１ｕｇ／ｍＬ）によって阻害され、そしてアプロチニン（２０ｕｇ／ｍＬ）に
よって阻害された。
【００１９】 これらの観察の観点で、アプロチニン、胎盤ビクニンおよびその断片等のＫｕ
ｎｉｔｚ型セリン阻害剤は、膿胞性腺維症を含めた粘膜線毛の機能不全を治療す
るための治療薬として意図される。
【００２０】 「Ｋｕｎｉｔｚ阻害剤」によって、プロテアーゼの阻害剤が意図される；構造
的に、「Ｋｕｎｉｔｚ阻害剤」または「Ｋｕｎｉｔｚドメイン」は、特徴的には
、長さ約６０個のアミノ酸で、そして３個のジスルフィド結合を含むタンパク質
、またはタンパク質ドメインである。（ＬａｓｋｏｗｓｋｅおよびＫａｔｏ、Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９、５９３−６２６、１９８０参照）。
【００２１】 本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤ビクニンおよび断片およびその類似体のＫ
ｕｎｉｔｚドメインの明らかな利点は、それらが、ヒトタンパク質であり、そし
てＴｒａｓｙｌｏｌ（商標）（実施例１）より正に負荷されことが少なく、それ
により大用量のタンパク質の投与で腎臓損傷の危険を減少させることである。ヒ
ト起源のものであるので、したがって、本発明のタンパク質は、Ｔｒａｓｙｌｏ
ｌ（商標）の同様の用量の投与と比較して、望まれていない免疫学的反応の危険
を著しく減少させながら、ヒト患者に投与される。さらに、ビクニン（１０２−
１５９）、ビクニン（７−６４）、およびビクニン（１−１７０）が、インビト
ロでＴｒａｓｙｌｏｌ（商標）より血漿カリクレインの著しく、いっそう強力な
阻害剤であることが分かった（実施例３、４および１０）。したがって、ビクニ
ンおよびその断片は、アプロチニンに対応してインビボでいっそう有効であるこ
とが予測される。使用されるべき医薬阻害剤の量は、治療されるべき享受者およ
び症状に依存する。必要量は、当業者に知られるプロトコルによる不都合な経験
なしに決定され得る。代替的に、必要量は、症状を治療するために阻害されるべ
きプラスミン、カリクレイン、またはプロスタシンのような標的プロテアーゼの
量の測定に基づいて計算され得る。本発明で意図される活性材料として、活性剤
の任意に必要とされる量の過剰を投与することに好ましく関与する毒性のない治
療と考えられる。
【００２２】 慢性の閉鎖性肺疾患を示す患者における粘膜線毛クリアランスの速度を刺激す
るために、本発明のタンパク質は、アプロチニンＴｒａｓｙｌｏｌ（商標）のよ
うに使用できる一方で、大量に取った場合、効力が異なる。Ｔｒａｓｙｌｏｌ（
商標）の使用は、Ｔｒａｓｙｌｏｌ（商標）補足Ａについて列記しているＰｈｙ
ｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（医師の机上参照）、１９９５
年で概説される。簡便には、スピン位置にある患者で、胎盤ビクニン、単離ドメ
インまたは他の変異体の負荷用量は、約２０から３０分かけてゆっくりと流入す
ることによって付与される。一般に、約２×１０６ＫＩＵ（カリクレイン阻害単
位）および約８×１０６ＫＩＵの間の総用量が、患者の体重および症状のような
因子によって、使用される。好ましい負荷用量は、１００から２００カリクレイ
ン阻害単位（ＫＩＵ）の総量を含むものである。
【００２３】 本発明のタンパク質は、当業者に知られる方法で処方された医薬組成物で使用
される。このような組成物は、意図される投与態様および投薬によって、活性成
分（類）に加えて１つまたはそれ以上の医薬上許容し得る担体、希釈剤、充填剤
、結合剤、および他の賦形剤を含有する。当業者に知られる治療上不活性な無機
または有機担体の例は、それに限定されないが、ラクトース、コーンスターチ、
またはその誘導体、タルク、植物性油、蝋、脂肪、ポリエチレングリコール等の
ポリオール、水、サッカロース、アルコール、グリセリン等が挙げられる。種々
の防腐剤、乳化剤、分散剤、香料、湿潤剤、抗酸化剤、甘味料、着色剤、安定剤
、塩、緩衝剤等も、処方の安定性で補助すること、または活性成分（類）の生物
利用性を増大する上で補助すること、または経口、鼻内または肺投与の場合に許
容し得る風味および臭いの処方を生じるが必要とされる場合、添加され得る。こ
のような組成物で使用される阻害剤は、元来の化合物それ自体の形態であるか、
または任意に、医薬上許容し得る塩の形態であり得る。そのように処方された組
成物は、当業者に知られる任意の適切な態様によって、阻害剤の投与のために必
要とされる場合に選択される。
【００２４】 非経口投与態様としては、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（
ｉ． ｐ．）、および筋肉内（ｉ．ｍ．）経路が挙げられる。静脈内投与は、必要とさ
れ得る場合に、薬剤の頂上の血漿中濃度の急性調節を得るために使用され得る。
代替的には、薬剤は、静脈内（ｉ．ｖ．）カテーテルによって連続して所望の速
度で投与され得る。適切なビヒクルとしては、注射用の滅菌水、滅菌緩衝溶液ま
たは滅菌生理食塩水のような無菌で、非発熱物質性水性希釈剤が挙げられる。得
られる組成物は、静脈内注射または注入によって、実験の前におよび／または間
に患者に投与される。
【００２５】 炎症に関与した好中球およびマクロファージのような食胞に対する薬剤の半減
期および標的を改善して、リポソーム中の薬剤の捕捉によって援助され得る。胃
腸管および肺のような標的器官／組織に特異的な巨大分子に結合するリポソーム
リガンドの外側に組み込むことによって、リポソームのターゲティングの選択性
を改善することは可能であるにちがいない。代替的に、薬剤の分解性ミクロスフ
ェア（例えば、ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−クリコライドを含むもの）への封入
を有するかまたは有しないｉｍまたはｓｃ沈降注射またはコラーゲンを含有する
保護処方は、長期化した持続薬剤放出を得るために使用され得る。投薬の便宜が
改善されるために、腹腔内移殖されたリザーバおよび打診システムのような中隔
を使用することが可能である。便宜および患者の苦情が改善されるのも、注射ペ
ン（例えば、Ｎｏｖｏ ｐｉｎまたはＱ−ｐｅｎ）または針のないジェット注入
（例えば、Ｂｉｏｊｅｃｔ、ＭｅｄｉｊｅｃｔまたはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎから得られる）のいずれかの使用によって達成され得る。正確に制御さ
れた放出も、カニューレを介して所望の部位への送出を伴う移殖可能なポンプを
用いて達成され得た。実施例としては、ＡＬＺＥＴ浸透ポンプのようなＡＬＺＡ
から入手可能な皮下で移殖された浸透ポンプが挙げられる。
【００２６】 経口送出は、薬剤を、消化性プロテアーゼ活性が低い回腸に薬剤を放出するよ
うに設計された錠剤、被覆錠剤、糖衣錠、硬質および軟質ゼラチンカプセル、溶
液、乳液、懸濁液または腸溶カプセルに組み込むことによって達成され得た。後
者の例としては、ＡＬＺＡのＯＲＯＳ−ＣＴ／Ｏｓｍｅｔ（商標）システム、お
よびＳｃｈｅｒｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＳｙｓｔｅｍｓのＰＵＬＳ
ＩＮＣＡＰ（商標）システムが挙げられる。他のシステムは、コロニー特異的ア
ゾレダクターゼによって分解されるアゾ架橋高分子、または回腸でのｐＨでの上
昇によって達成されるｐＨ感受性ポリアクリル酸高分子を使用する。上のシステ
ムは、広汎な利用可能な吸収増強剤と接合して使用され得る。直腸送出は、薬剤
を、坐剤に組み込むことによって達成され得る。
【００２７】 鼻内送出は、薬剤を、リン脂質またはアシルカルニチンのような適切な吸収強
化剤と接合して、セルロース、ポリアクリレートまたはポリカルボフィルを含む
もののような生物的粘着性粒子担体（＜２００ｍｍ）に組み込むことによって達
成され得た。市販で入手可能なシステムとしては、Ｄａｎ Ｂｉｏｓｙｓ ａｎ
ｄ Ｓｃｉｏｓ Ｎｏｖａによって開発されたものが挙げられる。
【００２８】 粘膜線毛クリアランスの速度を刺激するために、本発明の胎盤ビクニン変異体
の投与の好ましい態様は、肺送出である。ここに開示されるＫｕｎｉｔｚ型セリ
ンプロテアーゼ阻害剤は、任意の適切な手段によって対象の肺に投与され得るが
、しかし好ましくは、対象が吸い込む、活性化合物からなる吸引可能な粒子のエ
アロゾル懸濁液を投与することによって投与され得る。吸引可能な粒子は、液体
または固体であり得る。マンニトール、ショ糖またはラクトース等の適切な担体
中に医薬品を含有する微細サイズの乾燥粉末は、Ｉｎｈａｌｅ（商標）、Ｄｕｒ
ａ（商標）、Ｆｉｓｏｎｓ（Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ（商標））、およびＧｌａｘｏ
（Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（商標））またはＡｓｔｒａ（Ｔｕｒｂｏｈａｌｅｒ（商
標））噴射剤基本のメータ測定用量吸入器等の乾燥粉末吸入器を用いて肺気道表
面に送出され得る。リポソームを有するか、または有しない溶液処方は、ネブラ
イザを使用して送出され得る。
【００２９】 タンパク質を含む液体粒子のエアロゾルは、圧力起動エアロゾルネブライザま
たは超音波ネブライザを用いるような任意の適切な手段によって生成され得る。
例えば、米国特許第４，５０１，７２９号参照。ネブライザは、狭い換気口を介
して圧縮気体、主に空気または酸素を促進する手段によるか、また超音波曝気の
手段によるかのいずれかによって、活性成分の溶液または懸濁液を、治療用エア
ロゾルミストに変換する市販で入手可能なデバイスである。ネブライザに使用す
るための適切な処方は、液体担体中の活性成分からなる。担体は、主に水（およ
び最も好ましくは滅菌した発熱物質不含の水）または希釈水性アルコール溶液で
あり、好ましくは、例えば、塩化ナトリウムを添加することによって、体液と等
張で作られる。任意の添加剤としては、処方が、無菌にならない場合、ヒドロキ
シ安息香酸メチル等の防腐剤、抗酸化剤、風味剤、揮発性油、緩衝剤および界面
活性剤が挙げられる。
【００３０】 そのタンパク質を含む固形粒子のエアロゾルは、同様に、任意の固形粒子医薬
品エアロゾル発生装置で製造され得る。固形粒子医薬品を対象に投与するための
エアロゾル発生装置は、上に例示されるとおり、吸入可能であり、そしてヒト投
与に適切な速度で、予め決められた計測用量の医薬品を含む多量のエアロゾルを
発生する粒子を生成する。１つの例示型の固形粒子エアロゾル発生装置は、注入
器である。注入器による投与のために適切な処方は、注入器の手段によって送出
されるか、またはスナッフの手段で鼻内空洞に取り込まれ得る微細に粉砕した粉
末が挙げられる。注入器で、粉末（例えば、ここに記載される治療を行うのに有
効なその測定した用量）は、カプセルまたはカートリッジに含有され、主に、そ
の場所に貫入されるか、または開放されるかのいずれかであるゼラチンまたはプ
ラスチック、そして吸入によりデバイスを通して、または手動で操作されるポン
プの手段によって引き込まれる空気によって送出される粉末から作られる。注入
器に使用される粉末は、タンパク質唯一、またはタンパク質、ラクトース等の適
切な粉末希釈剤、および任意の界面活性剤を含む粉末ブレンドからなる。第２の
型の例示エアロゾル発生装置は、計測した用量吸入器を含む。計測した用量吸入
器は、エアロゾル分散剤、主に液体噴射剤中の活性成分の懸濁物または溶液処方
を含む加圧エアロゾル投薬器である。これらのデバイスを使用する間に、特に１
０から２００ｕＬまでの計測した量を送出して、タンパク質を含有する微細な粒
子スプレーを生じるのに適合した値を通して処方を放出する。適切な噴射剤とし
ては、特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えばジクロロジフルオロメタン
、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンおよびその混合物
が挙げられる。処方は、さらに、エタノール等の１つまたはそれ以上の共溶媒、
オレイン酸またはトリオレイン酸ソルビタン等の界面活性剤、抗酸化剤および適
切な風味剤を含み得る。
【００３１】 計測用量注入器または乾燥粉末注入器デバイスとして、エアロゾルは、固形ま
たは液体粒子から形成されるかにかかわらず、分当たり約５から１５０リットル
、さらに好ましくは分当たり約１０から１００リットルまで、そして最も好まし
くは、計測用量吸入器については、分当たり約１０から５０リットル、そして最
も好ましくは、乾燥粉末吸入器については、分当たり約６０リットルの速度で、
エアロゾル発生装置によって生成され得る。ネブライザ、ジェットまたは超音波
によって発生されたエアロゾルは、分当たり約１から約１００リットル、さらに
好ましくは分当たり約４から１０リットルまでの速度でエアロゾル発生装置によ
って生成され得る。多量のタンパク質を含有するエアロゾルは、いっそう迅速に
投与され得る。
【００３２】 プロテアーゼ阻害剤の投与量は、治療されるべき症状、および対象の状態によ
って変化する。毎日用量は、１または数単位用量投与の中で分割され得る。重量
による毎日用量は、対象の年齢および症状によって、ヒト対象に対して約０．０
１から２０ミリグラムまでの吸入可能な粒子の範囲にあり得る。
【００３３】 本発明のプロテアーゼ阻害剤を含有する固体または液体粒子の医薬処方は、吸
入可能なサイズの粒子、すなわち、吸入による口および喉頭を通して、そして肺
の気管支および肺胞まで通過するのに十分に小さなサイズの粒子を包含すべきで
ある。一般に、サイズで約１から８ミクロンまで（さらに詳細には、サイズで約
６ミクロンより低い）の範囲にある粒子は、吸入し得る。エアロゾル中に含まれ
る非吸入可能なサイズの粒子は、喉に沈着され、そして飲み込まれる傾向にあり
、そしてエアロゾル中の非吸入可能な粒子の量は、好ましくは最小限である。鼻
内投与については、１０−５００ミクロンの範囲内の粒子サイズは、鼻内空洞中
の滞留を確保することが好ましい。
【００３４】 本発明による処方の製造で、プロテアーゼ阻害剤は、典型的に、とりわけ許容
し得る担体と混和される。もちろん、担体は、処方中の任意の他の成分に匹敵す
るという点で許容し得るべきであり、そして患者に有毒であってはならない。担
体は、固体または液体、またはその両方でありえ、そして好ましくは、単位用量
処方、例えばカプセルとして化合物で処方され、そしてそれは、０．５重量％か
ら９９重量％の活性化合物を含み得る。１つまたはそれ以上の活性化合物は、そ
の処方が、基本的に、成分を混和することからなる薬学のよく知られた技術のう
ちのいずれかによって製造され得る本発明の処方に組み込まれ得る。
【００３５】 プロテアーゼ阻害剤の吸入可能な乾燥粒子を含む組成物は、乳鉢と乳棒で阻害
剤を粉砕し、そしてその後、微細化組成物に４００メッシュのスクリーンを通過
させて、大きな凝塊を破壊または分離することによって製造され得る。 医薬組
成物は、任意に、エアロゾルの形成を促進するために働く分散剤を含有し得る。
適切な分散剤は、ラクトースであり、そしてそれは、任意の適切な速度（例えば
、重量で１対１の比）で活性剤とブレンドされ得る。
【００３６】 所望の場合、一般のエクスビボおよびインビボでの遺伝子療法攻略法は、ＷＯ
９７／３３９９６（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．）および米国特許第５，４０７，９
１５号（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）に記載されるもののような、ビクニン、アプロチニ
ンまたはその断片および変異体のようなＫｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害
剤タンパク質をコードする核酸構築物を送出するために使用され得る。初発的に
ウイルス基本である遺伝子療法技術は、肺中のＣＦの徴候を治療するための手段
として、そして外部肺組織に関連した肺細胞を形質転換するために使用された。
１９９３年３月３日に刊行された、ＣＦ患者でのＣＦＴＲ遺伝子の適切な発現に
ついて、レトロウイルスおよび非レトロウイルス性ベクター（例えば、アデノウ
イルスおよびアデノ関連ウイルス）の使用を記載するＷＯ９８／０３７０９参照
。代替的には、外因性核酸の送出するための非細菌性方法も、知られており、そ
して本発明に使用することが意図される。哺乳類で機能する配列を調節するため
に操作的に連結されるＣＦＴＲ分子についてのコーディング配列を含む転写また
は発現カセットを記載する、１９９３年６月２４日に刊行されたＷＯ９３／１２
２４０、そしてそこに引用される文献参照。その後、核酸構築物は、エアロゾル
化送出単独、または液体基本の複合体、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）と
組合せて含む多数の方法で、気道および肺の肺胞に供給される。１９９５年１０
月５日に刊行されたＷＯ９５／２６３５６では、形質移入に有用な液体の個々の
例が記載される。したがって、本発明で、ビクニン、アプロチニンまたはその変
異体および断片のようなＫｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする
核酸分子が、このような治療の必要である対象で、粘膜および痰の粘膜線毛クリ
アランスの速度を刺激する手段のような任意の適切な遺伝子療法によって肺気道
に同様に投与され得ることが意図される。
【００３７】 ヒト配列データの検索 アプロチニンに対する機能で相同な区別できるヒトタンパク質の存在は、ＮＣ
Ｂ１（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ（生物学情報のための国立センター）、Ｍａｒｙｌａｎｄ）
で発現配列タグのデータベース（以降、ｄｂＥＳＴと称される）への配列進入の
特徴的な分析に従って推定された。ＴＢｌａｓｔＮアルゴリズム（ＢＬＡＳＴ、
または、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏ
ｌ）を使用するのは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）の、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉ
ｏｌ ２１５、００ ４０３−４１０の方法を使用して、任意の組合せで、デー
タベースのタンパク質または核酸中の照会配列と全ての配列との間の類似性につ
いて調べる）を使用して、データベースを、ウシの前−後アプロチニンＴｒａｓ
ｙｌｏｌ（商標）の配列に相同性を持っているヌクレオチド配列について試験し
た。膨大なクローンのこの調査は、アプロチニンに対する機能で類似性のあるヒ
トタンパク質に対応する推定アミノ酸配列をおそらくコードし得る２つの特定の
クローンに選択的に範囲を限定した。選択された核酸配列は、ヒト胎盤核酸ライ
ブラリーから発生されたＲ３５４６４（配列番号：１２）およびＲ７４５９３（
配列番号：１４）であった。Ｒ３５４６４についての最長のオープンリーディン
グフレームでの翻訳タンパク質配列（配列番号：１３）は、クリッツドメイン共
有結合構造の形成に重要である６つのシステインのうちの１つを欠失しており、
そしてそれは、Ｒ３５４６４の核酸配列が、機能性阻害剤を生じ得ないことを意
味した。同様に、クローンＲ７４５９３（配列番号：１５）から得られる最長翻
訳オープンリーディングフレームは、Ｋｕｎｉｔｚ様タンパク質をコードする領
域に対する終止コドン５’を含み、それによりこの配列が翻訳されて、機能性分
泌クリッツドメインを生じえないことが意味された。これらの配列単独の有為性
は、不明瞭であった。それらが、ａ）偽遺伝子の産物、ｂ）未翻訳ｍＲＮＡの領
域、またはｃ）不正確に配列決定された信頼性のあるｍＲＮＡの産物を表すこと
が可能であった。
【００３８】 ヒトビクニンの知見 実際のヒト配列を特異的に単離および測定するために、ｃＤＮＡプライマーは
、Ｒ３５４６４およびＲ７４５９３内に見られる我々の提案したクリッツ様配列
をコードするｃＤＮＡのセグメントに対して５’および３’に配置される配列に
ハイブリッド形成する能力があるように設計された。Ｒ７４５９３のクリッツ様
配列をコードする断片を増幅するために使用されるプライマーは、
【００３９】
【化１６】 ＣＧＡＡＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＣＣＡＧＡＣＧ
【００４０】 （ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する３’プライマー；配列番号３３）および
【００４１】
【化１７】 ＡＧＧＡＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡ
【００４２】 （ＸｂａＩ部位を有する５’プライマー；配列番号：３４）であった。
【００４３】 これらのプライマーは、ＰＣＲ（３０サイクル）によって、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
からヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ、カタログ番号ＨＬ
４００３ＡＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ、ＣＡ）から得た５００塩基対産物を増幅するために使用され、そしてそれ
は、ブルースクリプト−ＳＫ＋にサブクローニングされ、そしてＳｅｑｕｅｎａ
ｓｅ（商標）キット、バージョン２．０を有するＴ３プライマーで配列決定した
。驚くべきことに、我々のプライマーを用いて得られた断片の配列は、クローン
Ｒ７４５９３についてのｄｂＥＳＴデータベースに列記される配列と異なった。
特に、我々の新たな配列は、推定終止コドンに３’で挿入されるが。Ｋｕｎｉｔ
ｚ様配列をコードするセグメントに５’で挿入される追加のグアノシン塩基を含
有した（図３）。追加のＧの挿入は、Ｋｕｎｉｔｚ様ドメインについてのリーデ
ィングフレームの外に終止コドンを移行させた（Ｒ７４５９３についての訂正配
列の塩基対１１４でＧ；図３）。
【００４４】 Ｒ７４５９３のクリッツ様ペプチド配列に相同な配列についてのｄｂＥＳＴの
連続照会は、ヒト網膜ライブラリーから誘導されるＨ９４５１９およびＮ３９７
９８を生じた。これらの配列は、特徴的システインのうちの全ての６つを含有す
ること以外は、Ｒ３５４６４でコードされるＫｕｎｉｔｚ様ドメインにほとんど
一致するＫｕｎｉｔｚ様配列を含んだ。Ｒ７４５９３（塩基対１１４でＧの挿入
により訂正された）およびＲ３５４６４のものとの各々のヌクレオチド配列の重
複は、部分的ヒト胎盤ビクニン（配列番号：９；図３）についての共通ヌクレオ
チド配列を生じるために使用した。翻訳共通配列は、それぞれ、アミノ酸残渣１
７−６４および１０２−１５９の領域内に、２つの完全なＫｕｎｉｔｚ様ドメイ
ン配列を含有した残渣―１８と＋１７９からから拡張するオープンリーディング
フレームを生じた（図３；全翻訳配列番号：１０）。
【００４５】 さらなる努力は、ｄｂＥＳＴをＲ３５４６４の配列と照合することによって別
の５’配列を得るために試みられた。その後、別の５’配列を保持する各調査か
ら可能なマッチは、ｄｂＥＳＴを再照会するために順次使用された。このような
反復の形態では、Ｈ１６８６６、Ｔ６６０５８、Ｒ３４８０８、Ｒ８７８９４、
Ｎ４０８５１およびＮ３９８７６を含めた一連の重複５’配列が同定された（図
４）。これらの配列のうちのいくつかの配列は、共通翻訳タンパク質配列の合成
のための出発部位として働き得る５’ＡＴＧの存在が示唆された。この選択され
た情報から、ここで選択的にスクリーニングし、そしてアプロチニンと相同なヒ
トタンパク質の核酸およびポリペプチド配列を決定することが可能であった。
【００４６】 ｄｂＥＳＴの再取り調べは図４Ｂに模式図で示される、多くの新たなＥＳＴを
表した。これらの追加のＥＳＴとの重複は、我々に、図３で描かれる元来のオリ
ゴヌクレオチド配列に属す５’および３’の両方を延長するより大きな共通オリ
ゴヌクレオチド配列（図４Ｃ）を構築させた。実際に、総長さ１．６キロ塩基の
新たな配列は、３’ポリ−Ａ尾部まで全ての方法を拡張した。各塩基対位置で、
ＥＳＴを重複する増大した数は、ＥＳＴ Ｒ７４５９３の３’末端と重複する配
列のような特定の領域での信頼のレベルを改善した（図３）。この領域でのいく
つかの重複ＥＳＴは、Ｒ７４５９３に対する２つの重要な塩基欠失を確証した（
図４Ｃで下線付の太字として配置され、地図の位置９９４および１００５）。枠
をコードするビクニンでの新たな共通配列（図４Ｄ）の翻訳は、生来の共通（配
列番号：１）からコードされる成熟配列（１７９アミノ酸）より大きい（２４８
アミノ酸）である胎盤ビクニンの形態を生じ、そしてオリゴヌクレオチド共通内
の枠内終止コドンによって終了された。サイズ増大は、ＥＳＴ Ｒ７４５９３に
特徴的な２つの塩基挿入を取除くことから生じる３’コーディング領域での枠シ
フトによった。枠シフトは、別のアミノ酸配列をコードする新規の枠に読み取る
ことができる枠の外に生来の共通の終止コドン（図３）を移動した。新たな翻訳
産物（図４Ｄ）は、（Ｋｕｎｉｔｚドメインをコードする）残渣＋１から＋１７
５までの間の生来のタンパク質共通配列（配列番号：１）に一致したが、推定２
４の残渣の長い粘膜貫通ドメイン（図４Ｄに下線付き）、続いて短い３１残渣の
細胞質ドメインを示す新たなＣ末端延長を含んだ。開始メチオニンおよびシグナ
ルペプチドの回りの精密な配列は、この領域での重複ＥＳＴはもとより、相当の
異質性によりある程度一次的であった。
【００４７】 Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ（商標）によるタンパク質配列の分析は、推定Ｎ−結合グ
リコシル化についての共通部位として位置３０および６７でアスパラギン残渣を
目立たせた。アスパラギン３０は、グリコシル化されるべきものと一致して、ヒ
ト胎盤から単離される全長のタンパク質のＮ−末端配列決定の間には観察されな
かった。
【００４８】 ヒトビクニンのクローニング 図３の分析から結論される推定ヒトビクニンヌクレオチド配列に対応するヒト
ｍＲＮＡの存在は、以下のとおり確認された。図３の胎盤ビクニン配列をコード
するｃＤＮＡ共通ヌクレオチド配列から予測されるサイズ（約６７０塩基対）の
断片である、Ｃｌｏｎｔｅｃｈのヒト胎盤ライブラリーから得られる、Ｒ３５４
６４のｃＤＮＡ配列（図３中で共通ヌクレオチド配列の塩基対３−２７）をコー
ドするＫｕｎｉｔｚに５’をハイブリッド形成する核酸プライマー：
【００４９】
【化１８】 ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＧＧＴＣＧＴＴＴＣＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴ ＧＧＧＡ
【００５０】 （Ｘｂａｌ部位を有するＲ３５４６４配列から誘導される５’プライマー；配列
番号：３５）、およびＲ３５４６４のｃＤＮＡ配列（図３中で共通ヌクレオチド
配列の塩基対６８０−７００）をコードするＫｕｎｉｔｚに３’をハイブリッド
形成する核酸プライマーが、ＰＣＲ増幅に使用された（図４Ａで概略的に示され
た）。上に使用されるとおり、Ｒ７４５９３に同じ３’プライマーに加えて、上
に開示される推定ＡＴＧ出発部位に対する５’で１２６塩基対であるＲ３５４６
４での配列にハイブリッド形成する５’プライマーを使用して、ＥＳＴ重複によ
って推定される予測サイズ（およそ８７２塩基対）のＣｌｏｎｔｅｃｈのヒト胎
盤ライブラリーから得られる断片を増幅することが可能である（図４で概略的に
示された）。
【００５１】 ８７２塩基対の断片の配列決定は、それの５’末端でＥＳＴ Ｒ８７８９４の
塩基対１１０から２１８まで、そしてその３’末端で（図３の）ＥＳＴ重複分析
から結論づけられる胎盤ビクニンについての共通配列の３１０から５４２塩基対
に対応するヌクレオチドセグメントを含有することを示した。この３’ヌクレオ
チド配列は、胎盤ビクニン（１０２−１５９）によってＫｕｎｉｔｚ様ドメイン
の全てを含んだ。
【００５２】 タンパク質の全体の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを得るために、ＥＳＴ
Ｒ３４８０８内の配列にハイブリッド形成するように設計された以下の５’ＰＣ
Ｒプライマー：
【００５３】
【化１９】 ＣＡＣＣＴＧＡＴＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＣ
【００５４】 （配列番号：３６）は、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから得られるおよそ７
８０塩基対のｃＤＮＡ産物を増幅（３０サイクル）するＥＳＴ７４５９３と同じ
３’プライマーと共に使用した。この産物は、ゲル精製され、そしてジデオキシ
法（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．ら、（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ（ＵＳＡ）、７４、５４６３−５４６７頁）によって、以下のプライマー：
【００５５】
【化２０】
【００５６】
【化２１】
【００５７】 を用いてＤＮＡ配列決定のためのＴＡベクター（インビトロゲン）にクローン
化した。
【００５８】 生じるｃＤＮＡ配列は、その翻訳産物と共に図４Ｅに描かれる。ヌクレオチド
濃度で、配列は、共通ＥＳＴ配列（図４Ｄ）からわずかな差異のみを示した。そ
の配列の翻訳は、枠内開始剤ＡＴＧ部位、シグナルペプチドおよび成熟した胎盤
ビクニン配列および膜貫通ドメインを含むコーディング配列を生じた。ＰＣＲ産
物の翻訳配列は、ＰＣＲ増幅についての３’プライマーの選択の選択の結果とし
て細胞質ドメインから最後の１２のアミノ酸残渣を欠失していた。３’ＰＣＲプ
ライマー（Ｒ７４５９３の配列に基づいて設計された）のこの選択は、翻訳ＰＣ
Ｒ誘導配列のアミノ酸位置２１１で人工的ＳからＦまでの突然変異の導入に起因
もした。ＰＣＲ断片の翻訳から推定されるシグナルペプチドは、ＥＳＴ共通のも
のにある程度異なった。
【００５９】 全長の胎盤ビクニンｃＤＮＡを得るために、ＰＣＲ由来産物（図４Ｅ）を、ゲ
ル精製し、そしてビクニン配列を表す非ＰＣＲ基本の全長クローンを単離するの
に使用した。ＰＣＲ誘導ｃＤＮＡ配列を、ハイプライム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって３２Ｐ−ＣＴＰで標識し、そしてコロニーハイブリ
ッド形成技術を使用して、胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、
Ｕｎｉｚａｐ（商標）λライブラリー）をプローブするために使用した。およそ
２×１０６ファージプラークは、３回のスクリーニングおよびプラーク精製を受
けた。２つのクローンは、制限酵素分析によって測定され、そしてＥＳＴ共通配
列（上記参照）のサイズでの比較に基づいて、全長（−１．５キロベース）と思
われた。ジデオキシ方法によるこれらのクローンのうちの１つの配列決定は、図
４Ｆで描かれるオリゴヌクレオチド配列を生じた。この配列から得られる翻訳産
物は、枠内開始剤メチオニン、シグナルペプチドおよび成熟胎盤ビクニン配列を
伴うタンパク質を生じた。シグナルペプチド配列長および配列が異なるが、成熟
骨盤ビクニン配列は、ＥＳＴ共通の翻訳によって誘導される成熟タンパク質の配
列に一致した。ＰＣＲ誘導産物と異なり、コロニーハイブリッド形成によって誘
導されるｃＤＮＡは、全体の外側ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメインお
よび枠内終止コドンを含んだ。実際に、クローンは、ポリ−Ａ尾部に全ての方法
で伸びた。開始剤メチオニンは、ＰＣＲ誘導クローンでコードされたシグナルペ
プチドに一致する疎水性シグナルペプチドに続いた。続いて、我々は、Ｓｆ９細
胞（実施例９）およびＣＨＯ細胞（実施例１７）から得られる、胎盤ビクニン、
ビクニン（１−１７０）の可溶性断片を発現および精製し、そしてそれらは、機
能性プロテアーゼ阻害剤（実施例１０および１８）であることが分かった。さら
に、我々は、活性プロテアーゼ阻害剤（実施例７）としても胎盤ビクニンの可溶
性断片であるヒト胎盤から単離した。上の観察に基づいて、可溶性タンパク質と
同様に細胞の表面に膜貫通タンパク質として存在する能力を有する。Ｋｕｎｉｔ
ｚドメインを含む他の膜貫通タンパク質は、蛋白分解性プロセシングを受けて、
可溶性で膜関連形態の混合物を得ることが知られている。これらは、ＡＰＰ７５
１（Ｅｓｃｈ Ｆ．ら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、１１２２−１１
２４頁）およびＡＰＰ７７０（Ｗａｎｇ Ｒ．ら（１９９１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ、２６６、１６９６０−１６９６４頁）と称されるアミロイド前駆体タ
ンパク質の２つの形態を含む。
【００６０】 接触活性化は、凝固カスケードの成分に、損傷を受けた血管表面の露出によっ
て達成されるプロセスである。脈管形成は、内皮表面でプラスミンの局所活性化
に関与するプロセスである。細胞表面に固定する胎盤ビクニンの特異性およびそ
の推定許容量は、膜貫通胎盤ビクニンの生理学的機能が、接触活性化および脈管
形成の調節を含み得ることを示唆する。
【００６１】 胎盤ビクニン（７−６４）、ビクニン（１０２−１５９）、および全長胎盤ビ
クニン（図４Ｆ）についてのアミノ酸配列を、ＰＩＲ（バージョン４６．０）お
よびＰａｔｃｈＸ（バージョン４６．０）タンパク質データベース、並びにＧｅ
ｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐプログラム ＦａｓｔＡを用いて
特許を受けたデータベースのＧｅｎｅＳｕｑ（バージョン２０．０）タンパク質
データベースについて調べた。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕ
ｐプログラム ＴＦａｓｔＡ（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４−２４４８）
を使用して、これらの同じタンパク質配列を、ＧｅｎＢａｎｋ（９６年１月２６
日までの最新版バージョン９２．０）およびＥＭＢＬ（修正されたバージョン４
５．０）ヌクレオチドデータベース、並びに特許を受けた配列のＧｅｎｅＳｕｑ
（バージョン２０．０）ヌクレオチドデータベースの６つの枠の翻訳に対して調
べた。ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬのＥＳＴおよびＳＴＳ副組は、この組の調
査に含まれなかった。これらの調査から得られる最高のマッチは、クローンＲ７
４５９３およびＲ３５４６４の我々の分析から誘導される５８のアミノ酸タンパ
ク質配列までそれらの全長より約５０％の同一性のみがある配列を含んだ。
【００６２】 ヒトビクニンの単離 上述されたように、ビクニン（図３）について翻訳された共通配列から測定さ
れるとおり、ビクニン（７−６４）およびビクニン（１０２−１５９）に対応す
る合成ペプチドは、再び畳み込んで（それぞれ、実施例２および１）、活性なカ
リクレイン阻害剤タンパク質（それぞれ、実施例４および３）を生じえた。我々
は、精製模式図を工夫して、ヒト組織からの生来の胎盤ビクニンを単離するこの
予測されない特性を利用した。
【００６３】 最初の工程として、カリクレイン−セファロース親和性クロマトグラフィを使
用する精製模式図を用いて、非常に精製された生来の強力なカリクレイン阻害剤
を単離した。単離した生来のヒトビクニンは、共通核酸配列（図３）アミノ酸残
渣＋１から＋５０（実施例７）の翻訳によって推定される配列と同一のＮ末端を
有した。これは、ヒト胎盤から単離される新規の生来のカリクレイン阻害剤の存
在を最初に確認した。
【００６４】 公知であるＫｕｎｉｔｚ様ドメインは、以下に挙げられる。標的プロテアーゼ
と接触させるべきであると信じられる残渣は、特別の興味のもの（太字／下線付
）として目立たせる。これらの特定の残渣は、標識Ｘａａによって示されるとお
り特定の文献について位置Ｘａａ１−１６と名付けられる。
【００６５】 ビクニン（７−６４）（配列番号：４）
【００６６】
【化２２】
【００６７】 ビクニン（１０２−１５９）（配列番号：６）
【００６８】
【化２３】
【００６９】 組織因子経路阻害剤前駆体１（配列番号：１８）
【００７０】
【化２４】
【００７１】 組織因子経路阻害剤前駆体１（配列番号：１９）
【００７２】
【化２５】
【００７３】 組織因子経路阻害剤前駆体（配列番号：２０）
【００７４】
【化２６】
【００７５】 組織因子経路阻害剤前駆体２（配列番号：２１）
【００７６】
【化２７】
【００７７】 組織因子経路阻害剤前駆体２（配列番号：２２）
【００７８】
【化２８】
【００７９】 アミロイド前駆体タンパク質相同体（配列番号：２３）
【００８０】
【化２９】
【００８１】 アプロチニン（配列番号：２４）
【００８２】
【化３０】
【００８３】 内部−α−トリプシン阻害剤前駆体（配列番号：２５）
【００８４】
【化３１】
【００８５】 内部−α−トリプシン阻害剤前駆体（配列番号：２６）
【００８６】
【化３２】
【００８７】 アミロイド前駆体タンパク質（配列番号：２７）
【００８８】
【化３３】
【００８９】 コラーゲンα−３（ＶＩ）前駆体（配列番号：２８）
【００９０】
【化３４】
【００９１】 ＨＫＩ−Ｂ９（配列番号：２９）
【００９２】
【化３５】
【００９３】 本発明の単離ドメインまたは他の変異体である胎盤ビクニンは、Ｔｈｅ ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，２（
ペプチド、分析、合成、生物学、２）における、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ．Ｂ
．およびＢａｒａｎｙ Ｇ、Ｇｒｏｓｓ Ｅ．ら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ（１９８０）第１章によって記載されるとおりｔ−Ｂｏｃ化学を使用するか
、またはＣａｒｐｉｎｏ Ｌ．Ａ．およびＨａｎ Ｇ．Ｙ．、（１９７０）Ｊ．
Ａｍｅｒ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ、９２、５７４８−５７４９によって記載され、そ
して実施例２に例示されるＦ−ｍｏｃ化学を使用するかのいずれかで標準固相ペ
プチド合成によって産生され得る。代替的に、胎盤ビクニン変異体をコードする
ＤＮＡの発現は、組換え胎盤ビクニン変異体を産生するために使用され得る。
【００９４】 本発明は、カリクレインを特異的に阻害できる精製ヒトセリンプロテアーゼ阻
害剤の使用を提供し、そしてそれは、親和性クロマトグラフィを介してヒト胎盤
組織から単離された。ここで、ヒト胎盤ビクニンと称されるヒトセリンタンパク
質阻害剤は、Ｋｕｎｉｔｚクラスの２つのセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインを
含む。１つの特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を有するタンパク質
を具体化する：
【００９５】
【化３６】
【００９６】 （配列番号：１）。
【００９７】 特に好ましい実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を有するビクニンタンパ
ク質（ビクニン（１−１７０））を提供する。
【００９８】
【化３７】
【００９９】 （配列番号：５２）。
【０１００】 １つの態様では、本発明を行う上で有用なタンパク質の生物学的活性は、それ
が、トリプシン、ヒト血漿および組織カリクレイン、ヒトプラスミンおよびファ
クターＸＩＩａの生物学的活性に結合でき、そして実質的に阻害できることであ
る。好ましい実施形態では、本発明は、グリコシル化形態で生来のヒト胎盤ビク
ニンタンパク質を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、それが少なくと
も１つのシステイン−システインジスルフィド結合を含有するように形成された
生来のヒトビクニンタンパク質を含む。好ましい実施形態では、タンパク質は、
ＣＹＳ１１−ＣＹＳ６１、ＣＹＳ２０−ＣＹＳ４４、ＣＹＳ３６−ＣＹＳ５７、
ＣＹＳ１０６−ＣＹＳ１５６、ＣＹＳ１１５−ＣＹＳ１３９、およびＣＹＳ１３
１−ＣＹＳ１５２からなる群から選択される１対のシステインの間に形成される
少なくとも１つの鎖内システイン−システインジスルフィド結合を含み、システ
インは、生来のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸配列によって数字をつけられる。通
常の技術を有する者は、本発明のタンパク質が、生来のヒトビクニンの生物学的
活性が、維持され、生来の鎖内システイン−システインジスルフィド結合のいず
れもが存在しないか、１つまたはそれ以上または全てが存在する適切な三次元コ
ンフォメーションに折り畳まれ得ることを認識する。最も好ましい実施形態では
、本発明のタンパク質は、適切に折り畳まれ、そして適切な生来のシステイン−
システインジスルフィド結合の全てと形成される。
【０１０１】 本発明に使用するための活性なタンパク質は、胎盤のようなヒト組織から、ま
たは以下の実施例によって例示されるとおり、合成タンパク質化学技術を介して
精製することによって得られる。本発明に使用するためのタンパク質が、分子生
物学技術を用いて得られ、自己複製ベクターが、本発明のタンパク質を、形質転
換細胞から発現させる能力のあることも分かる。このようなタンパク質は、形質
転換細胞から非分泌または分泌形態として作成され得る。形質転換細胞からの分
泌を促進するか、翻訳タンパク質の機能的安定性を増強するか、またはビクニン
タンパク質の畳込みを助けるために、特定のシグナルペプチド配列を、生来のヒ
トビクニンタンパク質のＮＨ２−末端部分に添加し得る。
【０１０２】 １つの実施形態において、本発明は、したがって無傷の生来のシグナルペプチ
ド配列の少なくとも一部と共に生来のヒトビクニンタンパク質を供給する。この
ように、本発明の１つの実施形態は、アミノ酸配列：
【０１０３】
【化３８】
【０１０４】 （配列番号：２）を有するシグナルペプチドの少なくとも一部と共に生来のヒ
トビクニンを提供する。
【０１０５】 好ましい実施形態では、本発明は、アミノ酸配列：
【０１０６】
【化３９】
【０１０７】 （配列番号：５３）を有する無傷の先導セグメントと共に、配列番号：５２のア
ミノ酸配列を有する無傷の先導配列の一部と共に、生来のヒトビクニンの使用を
提供する。
【０１０８】 好ましい実施形態では、本発明は、アミノ酸配列：
【０１０９】
【化４０】
【０１１０】 （配列番号：５４）を有する無傷の先導セグメントと共に、配列番号：５２のア
ミノ酸配列を有する無傷の先導配列の一部と共に、ビクニンタンパク質の使用を
提供する。
【０１１１】 ここに使用される好ましい番号付けシステムでは、＋１と番号付けされたアミ
ノ酸は、生来のヒト胎盤ビクニンについてのアミノ酸配列のＮＨ２末端に付与さ
れる。誰もが、機能性タンパク質断片が、生来のヒト胎盤ビクニンから誘導され
得ることを十分に認識し、そして生来のヒト胎盤ビクニンの少なくとも生物学的
活性の一部を維持し、そしてセリンプロテアーゼ阻害剤として作用する。
【０１１２】 １つの実施形態では、本発明の方法に使用するためのタンパク質は、以下「ビ
クニン（７−１５９）」と称される、生来のヒト胎盤ビクニンアミノ酸７−１５
９のアミノ酸配列を有する、少なくとも１つの機能性Ｋｕｎｉｔｚ様ドメインを
含有する生来のヒト胎盤ビクニンの断片を含む。したがって、本発明は、アミノ
酸配列：
【０１１３】
【化４１】
【０１１４】 （配列番号：３）を有するタンパク質を使用する方法を具体化する。式中、ア
ミノ酸番号付けは、生来のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸配列のものに対応する。
この実施形態の別の機能性異性体は、生来のヒト胎盤ビクニンの断片であり得て
、そしてそれは、生来のヒト胎盤ビクニンアミノ酸１１−１５６のアミノ酸配列
、ビクニン（１１−１５６）
【０１１５】
【化４２】
【０１１６】 （配列番号：５０）を有する少なくとも１つの機能性Ｋｕｎｉｔｚ様ドメイン
を含む。
【０１１７】 個々のＫｕｎｉｔｚ様ドメインが生来の胎盤ビクニンの断片でもあることを、
誰もが認識できる。特に、本発明は、以下「ビクニン（７−６４）」と称される
、生来のヒト胎盤ビクニンアミノ酸７−６４のアミノ酸配列からなる最初のＫｕ
ｎｉｔｚ様ドメインのアミノ酸配列を有するタンパク質の使用を意図する。した
がって、１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列：
【０１１８】
【化４３】
【０１１９】 （配列番号：４）を有する少なくとも１つのＫｕｎｉｔｚ様ドメインを含有す
るタンパク質を含む。式中、アミノ酸番号付けは、生来のヒト胎盤ビクニンのア
ミノ酸配列のものに対応する。この実施形態の別の形態のタンパク質は、生来の
ヒト胎盤ビクニンアミノ酸１１−６１のアミノ酸配列からなる最初のＫｕｎｉｔ
ｚ様ドメインである、アミノ酸配列：
【０１２０】
【化４４】
【０１２１】 （配列番号：５）を有する「ビクニン（１１−６１）」であり得る。
【０１２２】 本発明は、以後「ビクニン（１０２−１５９）」と称される、生来のヒト胎盤
ビクニンアミノ酸１０２−１５９のアミノ酸配列からなるＫｕｎｉｔｚ様ドメイ
ンのアミノ酸配列を有するタンパク質をも提供する。したがって、１つの実施形
態では、本発明は、アミノ酸配列：
【０１２３】
【化４５】
【０１２４】 （配列番号：６）を有する少なくとも１つのＫｕｎｉｔｚ様ドメインを含有す
るタンパク質を含む。式中、アミノ酸番号付けは、生来のヒト胎盤ビクニンのア
ミノ酸配列のものに対応する。このドメインの別の形態は、アミノ酸配列：
【０１２５】
【化４６】
【０１２６】 （配列番号：７）を有する「ビクニン（１０６−１５６）」である、生来のヒ
ト胎盤ビクニンアミノ酸１０６−１５６のアミノ酸配列からなるＫｕｎｉｔｚ様
ドメインであり得る。
【０１２７】 したがって、通常の技術の者は、生来のヒトビクニンタンパク質の断片が、少
なくともある程度の生来のタンパク質生物学的活性を保持するように作り得るこ
とを認識する。このような断片は、異なる配向で組合せて、または複数組合せて
、生来のヒトビクニンタンパク質の同じ、またはそれ以上の生物学的活性のいく
らかを保持する代替のタンパク質を提供し得る。
【０１２８】 本発明の方法で使用される生物学的に活性なタンパク質が、他の源から別のＫ
ｕｎｉｔｚ様ドメインと組合せて１つまたはそれ以上の本発明のＫｕｎｉｔｚ様
ドメインを包含し得ることを、誰もが容易に認識し得る。本発明の方法の生物学
的に活性なタンパク質は、多様な生物学的活性を示す他の源から別のＫｕｎｉｔ
ｚ様ドメインと組合せて１つまたはそれ以上の本発明のＫｕｎｉｔｚ様ドメイン
を包含し得る。本発明を行う上で有用な本発明の生物学的活性は、検出可能な生
物学的活性を示す多機能融合タンパク質を準備するために、公知である他のタン
パク質またはタンパク質類のものと組合せ得る。したがって、１つの実施形態で
は、本発明の方法は、配列番号：５または配列番号：７のいずれかのアミノ酸配
列と同じか、または機能的に等価である少なくとも１つのアミノ酸配列セグメン
トを含むタンパク質の使用を含む。
【０１２９】 早期の終止コドンで終了するオープンリーディングフレームは、さらに、機能
性タンパク質をコードし得る。本発明は、このような代替終止を包含し、そして
１つの実施形態では、アミノ酸配列：
【０１３０】
【化４７】
【０１３１】 （配列番号：８）のタンパク質の使用のために提供する。
【０１３２】 １つの実施形態では、本発明は、先導配列の無傷のセグメント、および少なく
とも無傷の生来の膜貫通領域の一部と共に、実質的に精製されるか、または組換
えて産生される生来のヒトビクニンタンパク質の使用のために提供する。したが
って、本発明の１つの実施形態は、
【０１３３】
【化４８】
【０１３４】 から選択されるアミノ酸配列を示す、無傷の先導配列と共に、そして膜貫通ド
メインの少なくとも一部（下線付き）と共に、生来のヒトビクニンの使用のため
に提供する。式中、ＥＳＴは、共通の配列番号：４５から誘導されるＥＳＴであ
り、ＰＣＲは、ＰＣＲクローン配列番号：４７であり、そしてλｃＤＮＡは、ラ
ムダｃＤＮＡクローン配列番号：４９である。好ましい実施形態では、本発明の
方法のタンパク質は、タンパク質が、最後のＫｕｎｉｔｚドメインおよび膜貫通
領域（下線付き）の末端の間の領域に切断された配列番号４５、４７または４９
のアミノ酸配列のうちの１つを含む。
【０１３５】 本発明は、シグナルペプチドが欠失されたタンパク質の使用を具体化もする。
したがって、本発明の方法は、膜貫通アミノ酸配列：
【０１３６】
【化４９】
【０１３７】 （配列番号：６９） 膜貫通アミノ酸配列：
【０１３８】
【化５０】
【０１３９】 （配列番号：６８）または膜貫通アミノ酸配列：
【０１４０】
【化５１】
【０１４１】 （配列番号：６７）に継続する配列番号：５２のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質を提供する。
【０１４２】 本発明に使用するためのタンパク質アミノ酸配列は、本発明に使用するための
タンパク質を産生するための分子生物学技術に使用できる適切な核酸配列を、当
業者に明確に教示する。したがって、本発明の１つの実施形態は、図３の生来の
ヒト胎盤ビクニン配列（配列番号：１０）についてのアミノ酸配列に翻訳する図
３の共通ＤＮＡ配列（配列番号：９）を示すヒトビクニンをコードする核酸配列
の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、図４Ｄのアミノ酸配列（配列
番号：４５）をコードする図４Ｃの共通核酸配列（配列番号：５１）を提供する
。
【０１４３】 好ましい実施形態では、本発明は、配列番号：４９のタンパク質配列をコード
する図４ＦのＤＮＡ配列（配列番号：４８）を有する生来のヒト胎盤ビクニンを
コードする核酸配列の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号
：４７のタンパク質配列をコードする図４Ｅの核酸配列（配列番号：４６）を提
供する。
【０１４４】 核酸配列でなされる特定の対立遺伝子突然変異、および保存的置換が、行われ
得て、そしてそれは本発明の方法によって包含されるさらにタンパク質アミノ酸
配列を生じることを、誰もが容易に認識できる。当業者は、本発明のタンパク質
の特定の自然の対立遺伝子の突然変異、および本発明のタンパク質中のアミノ酸
の保存的置換が、そのタンパク質の生物学的活性を明らかに修正させず、そして
本発明によって包含されないことを認識できる。
【０１４５】 本発明は、粘膜腺毛機能不全によって損傷を受けた患者でＭＣＣを刺激するた
めに有用であるヒト胎盤ビクニンおよびその断片を含む医薬組成物をも提供する
。
【０１４６】 本発明は、生理学的に適合するビヒクル中の本発明の有効量の開示されたヒト
セリンプロテアーゼ阻害剤が、患者に投与されることを特徴とする、粘膜腺毛機
能不全に罹っている患者でのＭＣＣを刺激する方法をも提供する。
【０１４７】 本発明は、プロテアーゼ特異性を修正するアミノ酸置換を含む胎盤ビクニンの
変異体、および上に記載される特異的Ｋｕｎｉｔｚドメインを使用するＭＣＣを
刺激する方法をも提供する。置換の好ましい部位は、生来の胎盤ビクニンについ
てのアミノ酸配列でのＸａａ１からＸａａ３２までの位置として以下に示され。
Ｘａａ１からＸａａ１６まででの置換はまた、Ｘａａ１７からＸａａ３２までで
の置換がビクニン（１０２−１５９）の変異体にとって好ましい一方で、ビクニ
ン（７−６４）の変異体にとって好ましい。
【０１４８】 したがって、本発明の方法は、アミノ酸配列：
【０１４９】
【化５２】
【０１５０】 を有するタンパク質の使用を具体化する。式中、Ｘａａ１−Ｘａａ３２は、各
々、独立に、Ｃｙｓ以外の自然に発生するアミノ酸残渣を表すが、ただし、アミ
ノ酸残渣Ｘａａ１−Ｘａａ３２の少なくとも１つが、生来の配列の対応するアミ
ノ酸残渣と異なる。
【０１５１】 本発明の内容で、語句「自然に発生するアミノ酸残渣」は、２０の一般的に生
じるアミノ酸、すなわち、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、
Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌのうちのいずれか１つを示すこと
が意図される。
【０１５２】 上に示される１つまたはそれ以上の位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸を置
換することによって、生来の胎盤ビクニンの阻害剤特異性プロファイル、または
個々のＫｕｎｉｔｚ様ドメイン、ビクニン（７−６４）またはビクニン（１０２
−１５９）のものを変化して、その結果それに限定されないが、補体カスケード
の酵素、ＴＦ／ＦＶＩＩａ、ＦＸａ、プロスタシン、トロンビン、好中球エラス
ターゼ、カテプシンＧまたはプロテイナーゼ−３のような他のセリンプロテアー
ゼを優先的に阻害することが可能であり得る。
【０１５３】 胎盤ビクニンの好ましい変異体の例は、Ｘａａ１が、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ
、Ａｌａ、ＶａｌまたはＬｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるも
の、特に、Ｘａａ１が、ＨｉｓまたはＰｒｏであるもの；またはＸａａ２が、Ｖ
ａｌ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓから
なる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２が、Ｖａｌまた
はＴｈｒであるもの；またはＸａａ３が、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔ
ｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ３が、Ａ
ｒｇまたはＰｒｏであるもの；またはＸａａ４が、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＳｅｒ
、Ｇｌｎからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ４が
、ＡｒｇまたはＬｙｓであるもの；Ｘａａ５が、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｔｈ
ｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ５が、Ａｌ
ａであるもの；またはＸａａ６が、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、
Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｐｈｅからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特
に、Ｘａａ６が、ＳｅｒまたはＡｒｇであるもの；またはＸａａ７が、Ｍｅｔ、
Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＶａｌからなる群から選択され
るアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ７が、ＭｅｔまたはＩｌｅであるもの
；またはＸａａ８が、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｓｅ
ｒ、またはＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘ
ａａ８が、ＰｒｏまたはＩｌｅであるもの；またはＸａａ９が、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
またはＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ
９が、Ａｒｇであるもの；またはＸａａ１０が、Ｖｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｌ
ａ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、ＬｅｕおよびＴｈｒからなる群から選択
されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ１０が、Ｖａｌであるもの；また
はＸａａ１１が、Ｇｌｙ、ＳｅｒおよびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ
酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ１１が、Ｇｌｙであるもの；またはＸａａ１２
が、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎからなる群から選択されるアミノ
酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ１２が、ＡｓｐまたはＡｒｇであるもの；また
はＸａａ１３が、ＧｌｙおよびＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸残渣で
あるもの；Ｘａａ１４が、ＡｓｎまたはＬｙｓからなる群から選択されるアミノ
酸残渣であるもの；またはＸａａ１５が、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｇ
ｌｕ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＶａｌおよびＬｙｓからなる群から選択されるアミノ酸
残渣であるもの、特に、Ｘａａ１５が、ＬｅｕまたはＬｙｓであるもの；または
Ｘａａ１６が、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、お
よびＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ１
６が、ＶａｌまたはＡｌａであるもの；またはＸａａ１７が、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、
Ｐｒｏ、Ａｌａ、ＬｙｓまたはＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸残渣で
あるもの、特に、Ｘａａ１７が、ＧｌｕまたはＰｒｏであるもの；またはＸａａ
１８が、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｌａま
たはＬｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ１
８が、Ｔｈｒであるもの；またはＸａａ１９が、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅ
ｕまたはＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａ
ａ１９が、Ｐｒｏであるもの；またはＸａａ２０が、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎお
よびＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２
０が、ＡｒｇまたはＬｙｓであるもの；またはＸａａ２１が、Ａｌａ、Ａｓｐ、
ＴｈｒまたはＧｌｙからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、
Ｘａａ２１が、Ａｌａであるもの；またはＸａａ２２が、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｔｙ
ｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＡｒｇまたはＰｈｅからなる群から選択されるア
ミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２２が、ＳｅｒまたはＡｒｇであるもの；
またはＸａａ２３が、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒまたは
Ｖａｌからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２３が
、ＰｈｅまたはＩｌｅであるもの；またはＸａａ２４が、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｈ
ｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、ＳｅｒまたはＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸残
渣であるもの、特に、Ｘａａ２４が、ＰｒｏまたはＩｌｅであるもの；またはＸ
ａａ２５が、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸残
渣であるもの、特に、Ｘａａ２５が、Ａｒｇであるもの；またはＸａａ２６が、
Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ，Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ，Ｔｒｐお
よびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２
６が、ＶａｌまたはＩｌｅであるもの；またはＸａａ２７が、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、
およびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ
２７が、Ｇｌｙであるもの；またはＸａａ２８が、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｌ
ｅｕ、ＧｌｙまたはＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、
特に、Ｘａａ２８が、Ａｒｇであるもの；またはＸａａ２９が、ＧｌｙおよびＡ
ｌａからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの；またはＸａａ３０が、
ＡｓｎまたはＬｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの；または
Ｘａａ３１が、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖ
ａｌおよびＬｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘ
ａａ３１が、ＡｒｇまたはＬｙｓであるもの；またはＸａａ３２が、Ｖａｌ、Ｇ
ｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、ＭｅｔおよびＴｈｒからなる群から選
択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ３２が、ＧｌｎまたはＡｌａで
あるものが挙げられる。
【０１５４】 本発明は、本発明の胎盤ビクニンタンパク質変異体をコードするＤＮＡ構築物
にも関する。これらの構築物は、Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．およびＣａｒｕｔ
ｈｅｒｓ Ｍ．Ｈ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、２２、
１８５９−１８６２頁；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ Ｍ．ＤおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ
Ｍ．Ｈ．（１９８１）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３、３１８５頁で記
載されるもののような合成法によって；またはＤＮＡ配列をコードする胎盤ビク
ニンとハイブリッド形成するように設計されたｃＤＮＡプローブでゲノムまたは
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得られたゲノムまたは
ｃＤＮＡから製造され得る。ゲノムまたはｃＤＮＡ配列は、１つまたはそれ以上
の部位で修正して、この開示で記載されるアミノ酸置換または欠失のいずれかを
コードするｃＤＮＡを得ることができる。
【０１５５】 本発明は、組換え胎盤ビクニン変異体の産生に使用され得る本発明の胎盤ビク
ニンをコードするＤＮＡ構築物、単離ドメインまたは他の変異体を含む発現ベク
ターにも関する。ｃＤＮＡは、選択の宿主での転写活性を示し、適切なターミネ
ータおよびポリアデニル化シグナルを保有する適切なプロモータ配列に接触させ
るべきである。胎盤ビクニン変異体をコードするｃＤＮＡは、ｃＤＮＡによって
コードされるタンパク質を生じて、分泌を受ける５’シグナルペプチドに融合さ
れ得る。シグナルペプチドは、宿主生物によって認識されるものであり得る。哺
乳類宿主の場合には、シグナルペプチドは、全長の胎盤ビクニンに存在する天然
のシグナルペプチドでもあり得る。胎盤ビクニン変異体の発現のためにこのよう
なベクターを製造するために使用される手段は、当業界においてよく知られ、そ
して例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング；実験室マニュアル）
、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記
載される。
【０１５６】 本発明は、組換え胎盤ビクニン異性体の産生のために使用できる胎盤ビクニン
、単離ドメインまたは本発明の他の変異体をコードするＤＮＡ構築物を含む形質
転換細胞にも関する。胎盤ビクニン異性体の産生のために使用され得た発現ベク
ターおよび宿主生物の多様な組合せが存在する。適切な宿主細胞としては、バキ
ュロウイルス感染Ｓｆ９昆虫細胞、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＨｅｌａおよびＣ−１２７
のような哺乳類細胞、大腸菌等の細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖ
ｉｓｉａｅ等の酵母が挙げられる。胎盤ビクニンの発現を達成するために必要と
される哺乳類、昆虫および微生物発現系を使用する方法は、当業界においてよく
知られ、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学におけ
る最近のプロトコル）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９５）第１
６章に記載される。ビクニン（７−６４）および（１０２−１５９）、酵母およ
び大腸菌発現系等の単独のＫｕｎｉｔｚ阻害剤ドメインを含有する胎盤ビクニン
の断片については、好ましく、そして酵母系は、最も好ましい。典型的には、酵
母発現は、アプロチニン変異体については米国特許第５，１６４，４８２号に、
記載されるとおり行われ、そして胎盤ビクニン（１０２−１５９）について本明
細書の実施例５で適合した。大腸菌発現は、米国特許第５，０３２，５７３号に
記載される方法を用いて行い得る。哺乳類および酵母系の使用が、変異体ビクニ
ン（７−１５９）等の両方の阻害剤ドメインを含む大きな胎盤ビクニン変異体の
発現のために最も好ましい。
【０１５７】 天然のアミノ酸配列のアミノ酸置換を保有する胎盤ビクニンのＤＮＡコード変
異体は、Ｋｕｎｋｅｌ Ｔ．Ａ．、（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８２、４８８−４９２頁の方法を用いた組換えタンパク質
の発現のために製造され得る。簡便には、突然変異誘発されるべきＤＮＡを、Ｍ
１３等の一本鎖バクテリオファージベクターにクローニングする。変化されるべ
きその領域を貫通し、置換をコードするオリゴヌクレオチドを、一本鎖ＤＮＡに
ハイブリッド形成され、そして標準的な分子生物学技術によって二重鎖にする。
その後、このＤＮＡは、適切な細菌性宿主に形質転換させ、そしてジデオキシヌ
クレオチド配列決定によって確認する。その後、正しいＤＮＡを、発現プラスミ
ドにクローニングする。代替的に、標的ＤＮＡは、標準ＰＣＲ技術によって突然
変異誘発でき、配列決定し、そして適切な発現プラスミドに挿入し得る。
【０１５８】 以下の特定の実施例は、本発明の特定の態様および好ましい実施形態を示す例
示の方法によって提供され、そして限定されない。この出願に引用された全ての
特許、特許出願および学術文献は、それらの全体で参照して組み込まれる。
【０１５９】 実施例１ 合成胎盤ビクニン（１０２−１５９）の製造 使用した材料および方法／試薬。蛍光作用性基質Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｙｓ−ＡＭＣは、Ｂａｃｈｅｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ（Ｋｉｎｇ ｏ
ｆ Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）から購入した。ＰＮＧＢ、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−ＡＭＣ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ＡＭＣ、ウシトリプシン（ＩＩＩ
型）、ヒト血漿カリクレイン、およびヒトプラスミンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
【０１６０】 組換えアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ（商標））は、Ｂａｙｅｒ ＡＧ（Ｗ
ｕｐｐｅｒｔａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。予備負荷したＧｌｎワン樹脂は
、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から得た。チオアニソー
ル、エタンジチオールおよびｔ−ブチルメチルエーテルは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍ
ｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から得た。
【０１６１】 機能性胎盤ビクニン（７−６４）（配列番号：４）および（１０２−１５９）
の定量精製の種々の段階にある再折り畳み試料に存在するトリプシン阻害活性の
量は、基質としてＧＰＫ−ＡＭＣを用いて測定した。ウシトリプシン（２００ピ
コモル）を、緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、０．１ＭのＮａＣ
ｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２および０．０１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００）中の種々の
段階の精製からビクニン（７−６４）または（１０２−１５９）を用いて、３７
％Ｃで、５分間インキュベートした。ＧＰＫ−ＡＭＣを、添加（最終２０μＭ）
し、そして産生されたクマリンの量は、２分間かけて、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ ＬＳ−５０Ｂ蛍光測定装置で蛍光物質（ｅｘ＝３７０ｎｍ、ｅｍ＝４３２ｎ
ｍ）を測定することによって測定される。試験されるべき試料については、各々
についての阻害率（％）は、方程式１（式中、Ｒ０は、阻害剤の存在下での蛍光
物質増大の速度であり、そしてＲ１は、添加した試料の不在下で測定された速度
である）によって計算された。阻害剤についての活性の１単位は、記載されたと
おりの条件を用いて、アッセイで５０％阻害を達成するために必要とされる量と
して定義される。
【０１６２】
【数１】 阻害率（％）＝１００×［１−Ｒ０／Ｒ１］ （１）
【０１６３】 合成。胎盤ビクニン（１０２−１５９）（配列番号：６）を、ＮＭＰ−ＨＢＴ
ＵＦｍｏｃ化学を用いたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのモデル４２０
Ａペプチド合成装置で合成した。ペプチドを、各結合のために８倍過剰のアミノ
酸を用いて、予備負荷Ｇｌｎ樹脂で合成した。切断および脱保護を、室温で、２
時間、８４．６％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、４．４％トリアニソール、２．
２％エタンジチオール、４．４％液化フェノール、および４．４％Ｈ２Ｏで行っ
た。粗ペプチドを沈殿させ、遠心分離し、そして２回ｔ−ブチルメチルエーテル
で洗浄した。ペプチドを、ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を用いて、Ｄｙｎａｍａ
ｘ ６０Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。最終製品（６１．０ｍｇ）
は、正しいアミノ酸組成物を生じ、そして推定配列：
【０１６４】
【化５３】
【０１６５】 （配列番号：６）について分子量を、エレクトロスプレー質量分子学（ＭＨ＋
＝６８３６．１；測定値＝６８３５．５）によって得た。
【０１６６】 精製。胎盤ビクニン（１０２−１５９）の再折り畳みを、Ｔａｍら、（Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９１、１１３：６６５７−６２）の方法によって
行った。精製ペプチドの一部（１５．２ｍｇ）を、４．０ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ（ｐＨ６．０）および８Ｍ尿素に溶解させた。ジスルフィドの酸化は、２３
％ＤＭＳＯ、および０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）を含有する溶液の滴下の
添加によって達成して、２０％ＤＭＳＯ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）お
よび１Ｍ尿素中の０．５ｍｇ／ｍｌペプチドの最終濃度を得た。それを、５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および０．１ＭのＮａＣｌを含む緩衝液中で１：１
０に希釈した後に、溶液を、２５℃で２４時間攪拌させた。材料を、製造業者の
指示によって、３．５ｍｌのＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）に３０ｍｇのウシ脾臓カリクレイン（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）に共有結合で付着さ
せることによって、カリクレイン親和性カラムを用いて精製した。再折り畳み材
料を、１ｍｌ／分の流速で、親和性カラムに負荷し、そして洗浄の２８０ｎｍで
の吸光度が、もはや検出されなくなるまで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）
および０．１ＭのＮａＣｌで洗浄した。カラムは、３倍量の各々の０．２Ｍ酢酸
（ｐＨ４．０および１．７）で溶出させた。活性画分を、貯蔵し（以下参照）、
そして溶液のｐＨを、２．５に調節した。材料を、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８逆相カラ
ム（５ミクロン、０．４６×２５ｃｍ）に直接使用し、そして、０．１％ＴＦＡ
中の２２．５％アセトニトリルで平衡にした。分離は、４０分かけて、１．０ｍ
ｌ／分で０．１％ＴＦＡ中の２２．５から４０％のアセトニトリルの線状勾配を
用いて達成した。活性画分を、貯蔵し、凍結乾燥し、０．１％ＴＦＡで再溶解し
、そして必要とされるまで−２０℃で保存した。
【０１６７】 結果。合成胎盤ビクニン（１０２−１５９）を、上記のように酸化剤として２
０％ＤＭＳＯを用いて、再折り畳みし、そして下に示される２段階の精製プロト
コルによって精製して、活性トリプシン阻害剤を得た（下の表１）。
【０１６８】
【表１】
【０１６９】 免疫化ウシ脾臓カリクレインカラム上の粗再折り畳み材料のクロマトグラフィ
は、存在する６．０％のタンパク質および９７％のトリプシン阻害活性を選択的
に分離した。Ｃ１８逆相を用いた連続クロマトグラフィは、７４％の全体の回収
率で２倍の別の精製を生じた。ＲＰＨＰＬＣで、還元および再折り畳み胎盤ビク
ニン（１０２−１５９）は、それぞれ２６．３および２０．１分の溶出時間を表
した。精製した材料の質量分子学分析は、６８２９．８の分子量を表した。出発
材料から６質量単位の損失。これは、ペプチド配列から推定された３つのジフス
ルフィドの完全な形成を示す。
【０１７０】 精製され、再折り畳みされた合成胎盤ビクニン（１０２−１５９）の等電点は
、プレキャストＡｍｐｈｏｌｉｎｅ（商標）ＰＡＧプレート（ｐＨ３．５から９
．５）を用いて、ｐＩ標準と共に、製造業者の示唆によって起動されるＭｕｌｔ
ｉｐｈｏｒ ＩＩ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（電気泳動
システム）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて測定し、そして１．５時間焦点を合
わせた。染色後、ゲルの陽極から異なるタンパク質バンドまでの移動距離を、測
定した。各未知のｐＩを、標準対対応のｐＩの移動距離のプロットによって生じ
た標準曲線を用いて測定した。この技術で、胎盤ビクニン（１０２−１５９）の
ｐＩを、アミノ酸配列から推定される値と一致して、８．３と測定した。これは
、アプロチニンのｐＩについて樹立された１０．５の値より低い（Ｔｅｎｓｔａ
ｄら、１９９４、Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１５２：３３−５０
）。
【０１７１】 実施例２ 合成胎盤ビクニン（７−６４）の製造 胎盤ビクニン（７−６４）（配列番号：４）を合成し、再折り畳み、そして以
下の修正を示す以外は、実施例１で胎盤ビクニン（１０２−１５９）（配列番号
：６）について基本的に記載されるとおり精製した：再折り畳みの間中、合成ペ
プチドを、２５℃で、２０％ＤＭＳＯ中の溶液として３０時間攪拌した；Ｃ１８
ＰＲ−ＨＰＬＣによる精製は、４０分間かけて０．１％ＴＦＡ中の２５から４５
％までのアセトニトリルの線状勾配（１ｍｌ／分）で達成された。最初のＣ１８
操作から得た活性画分は、カラムに再度入れられ、そして０．１％ＴＦＡ中の２
０から４０％アセトニトリルの線状勾配（６０分、１ｍｌ／分）で分画した。結
果。最終精製還元ペプチドは、配列：
【０１７２】
【化５４】
【０１７３】 （配列番号：４）に一致するＭＨ＋＝６５６３を示した。
【０１７４】 再折り畳みおよび精製は、トリプシンの阻害剤として活性である機能性Ｋｕｎ
ｉｔｚドメインを生じた（以下の表２）。
【０１７５】
【表２】
【０１７６】 精製された再折り畳みタンパク質は、ＭＨ＋＝６５５８、すなわち、還元ペプ
チドについてより少ない５±１質量単位を示した。これは、再畳込みが、少なく
とも１つの適切なジスルフィド結合の形成を引き起こすことを示す。胎盤ビクニ
ン（７−６４）のｐＩは、胎盤ビクニン（１０２−１５９）のｐＩを測定するた
めに使用された方法を使用して測定された。胎盤ビクニン（７−６４）は、予測
値（ｐＩ＝７．９）よりいっそう高いｐＩを示した。再度折り畳んだ胎盤ビクニ
ン（７−６４）は、ゲル（ｐＨ９．５）の陽性末端まで移動し、そして正確なｐ
Ｉは、これらの条件下で測定できなかった。
【０１７７】 合成胎盤ビクニン（７−６４）の連続製造法 合成胎盤ビクニン（７−６４）が、精製および再折り畳みの前に、完全な脱保
護を受けてはいけないので、再折り畳みは、完全に脱保護されたことが確かであ
るタンパク質を用いて繰り返された。胎盤ビクニン（７−６４）は、合成され、
再畳込みされ、そして、以下の修正を伴い以外は、胎盤ビクニン（１０２−１５
９）について基本的に記載されるとおりに精製された：再折り畳みの間中、合成
ペプチド（０．２７ｍｇ／ｍｌ）を、２５℃で、２０％ＤＭＳＯ中の溶液として
３０時間攪拌した；Ｃ１８ＰＲ−ＨＰＬＣによる精製は、４０分間かけて０．１
％ＴＦＡ中の２２．５から５０％までのアセトニトリルの線状勾配（１ｍｌ／分
）で達成された。
【０１７８】 結果。最終精製還元ペプチドは、配列：
【０１７９】
【化５５】
【０１８０】 （配列番号：４）に一致するＭＨ＋＝６５６７．５を示した。
【０１８１】 再折り畳みおよび精製は、トリプシンの阻害剤として活性である機能性Ｋｕｎ
ｉｔｚドメインを生じた（以下の表２Ｂ）。
【０１８２】
【表３】
【０１８３】 精製した再折り畳みタンパク質は、ＭＨ＋＝６５６１．２、すなわち、還元ペ
プチドについてより少ない６．３質量単位を示した。これは、再折り畳みが、予
測される３つのジスルフィド結合の形成を引き起こすことを示す。
【０１８４】 再折り畳み胎盤ビクニン（７−６４）のｐＩは、胎盤ビクニン（１０２−１５
９）のｐＩを測定するために使用された方法を用いて測定された。再折り畳み胎
盤ビクニン（７−６４）は、検出値（ｐＩ＝７．９）よりわずかに高い８．８５
のｐＩを示した。
【０１８５】 実施例３ 機能的胎盤ビクニン断片（１０２−１５９）のインビトロ特異性 プロテアーゼ。ウシトリプシン、ヒトプラスミンおよびウシ膵臓カリクレイン
定量を、既に記載したように（Ｃｈａｓｅ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓｈａｗ，Ｅ．，（
１９７０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９，２０−２７）、Ｐ−ニトロ
フェニルｐ’−グアニジノベンゾエートＨＣｌを用いて活性部位滴定によって行
った。ヒトカリクレインを、標準としてウシアプロチニン、および１：１複合体
形成を呈する基質としてＰＦＲ−ＡＭＣを使用して活性部位滴定によって定量し
た。それぞれの酵素に関して使用した条件下でのトリプシンおよびプラスミンで
のＧＰＫ−ＡＭＣに対するＫｍはそれぞれ２９μＭおよび７２６μＭであり、ヒ
ト血漿カリクレインおよびウシ脾臓カリクレインでのＰＦＲ−ＡＭＣに対するＫ
ｍはそれぞれ４５７μＭおよび８１．５μＭであり、エラスターゼによるＡＡＰ
Ｒ−ＡＭＣに対するＫｍは１６００μＭであった。ヒト組織カリクレイン（Ｂａ
ｙｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）定量を、既に記載したように（Ｃｈａｓｅ，Ｔ．，ａ
ｎｄ Ｓｈａｗ，Ｅ．，（１９７０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９，
２０−２７）、ｐ’ニトロフェニル ｐ’−グアニジノベンゾエートＨＣｌを用
いて活性部位滴定によって行った。
【０１８６】 阻害速度論。（実施例１で記載した）胎盤ビクニン（１０２−１５９）または
アプロチニンによるトリプシンの阻害を、総容量１．０ｍｌでの緩衝液Ａ中の胎
盤ビクニン（１０２−１５９）（０−２ｎＭ）またはアプロチニン（０−３ｎＭ
）との５０ｐＭトリプシンのインキュベーションで測定した。３７℃にて５分後
、１５μｌの２ｍＭ ＧＰＫ−ＡＭＣを添加し、（上記のような）蛍光の変化を
モニターした。胎盤ビクニン（１０２−１５９）およびアプロチニンによるヒト
プラスミンの阻害を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ
ＮａＣｌおよび０．０２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液中のプラスミ
ン（５０ｐＭ）と胎盤ビクニン（１０２−１５９）（０−１０ｎＭ）またはアプ
ロチニン（０−４ｎＭ）で測定した。３７℃でのインキュベーションの５分後、
２５μｌの２０ｍＭ ＧＰＫ−ＡＭＣを添加し、蛍光の変化をモニターした。胎
盤ビクニン（１０２−１５９）またはアプロチニンによるヒト血漿カリクレイン
の阻害を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌお
よび０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中のカリクレイン（２．５ｎＭ）および
胎盤ビクニン（１０２−１５９）（０−３ｎＭ）またはアプロチニン（０−４５
ｎＭ）を用いて測定した。３７℃で５分後、１５μｌの２０ｍＭ ＰＦＲ−ＡＭ
Ｃを添加し、蛍光の変化をモニターした。胎盤ビクニン（１０２−１５９）およ
びアプロチニンによるウシ脾臓カリクレインの阻害を、カリクレイン（９２ｐＭ
）、胎盤ビクニン（１０２−１５９）（０−１．６ｎＭ）およびアプロチニン（
０−１４ｐＭ）および１００μＭの最終基質濃度で、同様の様式で測定した。み
かけの阻害定数Ｋｉ ＊を、非線形回帰データ解析プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒ
ソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて決定した
。それぞれの実験からの速度論データを、強い結合阻害剤に関する方程式によっ
て解析した。
【０１８７】
【数２】 Ｖｉ／Ｖ０＝１−（Ｅ０＋Ｉ０＋Ｋｉ ＊−［（Ｅ０＋Ｉ０＋Ｋｉ ＊）２ −４Ｅ０Ｉ０］１／２）／２Ｅ０ （２）
【０１８８】 式中Ｖｉ／Ｖ０は分数酵素活性（阻害対非阻害比）であり、Ｅ０およびＩ０は
それぞれ酵素および阻害剤の総濃度であり、Ｋｉ値は方程式
【０１８９】
【数３】 Ｋｉ＝Ｋｉ ＊／（１＋［Ｓ０］／Ｋｍ） （３）
【０１９０】 による基質の効果に関する補正によって得た。（Ｂｏｕｄｉｅｒ，Ｃ．，ａｎ
ｄ Ｂｉｅｔｈ，Ｊ．Ｇ．，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａ
ｃｔａ．９９５：３６−４１）。
【０１９１】 胎盤ビクニン（１０２−１５９）およびアプロチニンによるヒト好中球エラス
ターゼの阻害に関して、エラスターゼ（１９ｎＭ）を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）および０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液中
の胎盤ビクニン（１０２−１５９）（１５０ｎＭ）またはアプロチニン（０−７
．５μＭ）と共にインキュベートした。３７℃での５分後、ＡＡＰＭ−ＡＭＣ（
５００μＭまたは１０００μＭ）を添加し、２分間にわたって蛍光を測定した。
Ｋｉ値を２つの異なる基質濃度で行った形式１／Ｖ対［Ｉ］のＤｉｘｏｎプロッ
トより決定した（Ｄｉｘｏｎら，１９７９）。
【０１９２】 アプロチニン、胎盤ビクニン断片（７−６４）または胎盤ビクニン断片（１０
２−１５９）によるヒト組織カリクレインの阻害を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液ｐＨ９．０、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００を含む１ｍｌの反応容量中で、胎盤ビクニン（７−６４）（０−４０ｎＭ）
または胎盤ビクニン（１０２−１５９）（０−２．５ｎＭ）、またはアプロチニ
ン（０−０．５ｎＭ）とともに０．３５ｎＭのヒト組織カリクレインをインキュ
ベーションすることで測定した。３７℃にて５分後、５μｌの２ｍＭ ＰＦＲ−
ＡＭＣを最終濃度１０ｕＭになるように添加し、蛍光の変化をモニターした。使
用した条件下でのヒト組織カリクレインでのＰＦＲ−ＡＭＣに対するＫｍは５．
７ｕＭであった。合成胎盤ビクニン（１０２−１５９）、組換え体胎盤ビクニン
およびアプロチニンによるヒト第Ｘａ因子（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｎｏｓｔ
ｉｃａ，Ｉｎｃ，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）の阻害を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（
ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌおよび０．１％ＢＳＡを含む緩衝液中で、阻
害剤の量を増加させて、０．８７ｎＭのヒト第Ｘａ因子をインキュベートするこ
とで測定した。３７℃での５分後、３０ｕｌの２０ｍＭ ＬＧＲ−ＡＭＣ（Ｓｉ
ｇｍａ）を添加し、蛍光の変化をモニターした。Ｋｕｎｉｔｚ阻害剤によるヒト
ウロキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）の阻害を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む、総
量量１ｍｌの緩衝液中でのウロキナーゼ（２．７ｎｇ）の阻害剤とのインキュベ
ーションによって測定した。３７℃での５分後、３５μｌの２０ｍＭのＧＧＲ−
ＡＭＣ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、蛍光の変化をモニターした。第ＸＩａ因子（Ｅ
ｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｓｏｕｔｈｂｅｎｄ，ＩＮから）の
阻害を、ＦＸＩａ（０．１ｎＭ）を、総容量１ｍｌ中での５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０１％ Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００および１％ＢＳＡを含む緩衝液中で、０−８００ｎＭ胎盤ビ
クニン（７−６４）、０−１４０ｎＭ胎盤ビクニン（１０２−１５９）または０
−４０ｕＭアプロチニンいずれかと共にインキュベートすることで測定した。３
７℃での５分後、１０ｕｌの４０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−
Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐ
ｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）を添加し、蛍光の変化をモニターした。
【０１９３】 結果：胎盤ビクニン（１０２−１５９）およびアプロチニンの阻害特性の直接
比較を、同一の条件下での様々なプロテアーゼによるそれらの阻害定数の測定に
よって行った。Ｋｉ値を以下表３に挙げる。
【０１９４】
【表４】
【０１９５】 胎盤ビクニン（１０２−１５９）およびアプロチニンは、実施した条件下で比
較可能な程度までウシトリプシンおよびヒトプラスミンを阻害した。アプロチニ
ンは、８．５μＭのＫｉでエラスターゼを阻害した。胎盤ビクニン（１０２−１
５９）は３２３ｎＭのＫｉでエラスターゼを阻害した。ウシ膵臓カリクレインの
胎盤ビクニン（１０２−１５９）阻害に対するＫｉ値はアプロチニン阻害のもの
よりも２０倍高かった。一方で胎盤ビクニン（１０２−１５９）はアプロチニン
よりもより強力なヒト血漿カリクレインの阻害剤であり、５６倍高い親和性で結
合する。
【０１９６】 胎盤ビクニン（１０２−１５９）は、カリクレインの阻害剤としてＴｒａｓｙ
ｌｏｌ（商標）よりも５０倍強力であるので、ＫＩＵにおいて阻害剤の効果的患
者用量を保持するためには、ヒト胎盤ビクニンまたはその断片（すなわち、胎盤
ビクニン（１０２−１５９））の必要な量は、Ｔｒａｙｌｏｌ（商標）よりもよ
り少量である。このことは、薬物の用量あたりの経費を削減し、患者への薬物へ
の再暴露における腎毒性副作用の可能性を減少させる。さらに、このタンパク質
はヒト由来であり、したがって、ウシ由来のアプロチニンよりもヒトにおいて免
疫源が少ない。このことは結果として、患者への薬の再暴露における免疫学的副
作用を招くリスクを減少させることになる。
【０１９７】 実施例４ 機能的胎盤ビクニン断片（７−６４）のインビトロ特異性 実施例２で記載した機能的ヒト胎盤ビクニン（７−６４）のインビトロ特異性
を、以上の実施例で記載したような物質および方法を用いて決定した。
【０１９８】 結果：以下の表は、インビトロでの様々なセリンプロテアーゼの阻害剤として
の胎盤ビクニン（７−６４）の効力を示している。データは、胎盤ビクニン（１
０２−１５９）またはアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ（商標））どちらかを使
用した阻害のスクリーニングのために得たデータに対して比較して示している。
【０１９９】
【表５】
【０２００】 結果は、胎盤ビクニン（７−６４）をコードしているアミノ酸配列は、少なく
とも４つのトリプシン様セリンプロテアーゼに対して効果的である活性セリンプ
ロテアーゼ阻害剤を得るために再折り畳みできることを示している。
【０２０１】 以下の表４Ｂはまた、インビトロでの様々なセリンプロテアーゼの阻害剤とし
ての再折り畳み胎盤ビクニン（７−６４）の効力を示している。再折り畳みした
胎盤ビクニン（７−６４）は、精製および再折り畳みの前に完全に脱保護される
ことが確かなタンパク質から調製した。データは、胎盤ビクニン（１０２−１５
９）またはアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ（商標））のいずれかを用いた阻害
のスクリーニングのために得たデータに対する比較を示している。
【０２０２】
【表６】
【０２０３】 驚くべきことに、胎盤ビクニン（７−６４）は、ヒト血漿カリクレインを阻害
することにおいてアプロチニンよりも強力であり、プラスミン阻害剤としての効
力は少なくとも同様である。これらのデータは、胎盤ビクニン（７−６４）は、
インビトロアッセイで使用する、アプロチニンと同程度の効果であり、インビボ
ではよりよいか、または同様の効力が予想されたことを示している。
【０２０４】 実施例５ 酵母での胎盤ビクニン変異体（１０２−１５９）の発現 胎盤ビクニン１０２−１５９（配列番号：６）をコードしているＤＮＡを、合
成オリゴヌクレオチドを用いて作製した。最終ＤＮＡ産物は、インフレーム終止
コドンが続く、インフレームで胎盤ビクニン（１０２−１５９）をコードしてい
るｃＤＮＡ配列に融合した酵母α−交配因子プロペプチドからの１５ヌクレオチ
ドの（５’から３’）からなる。酵母発現ベクターｐＳ６０４内へのクローニン
グに際し、ｃＤＮＡは、胎盤ビクニン（１０２−１５９）の５８アミノ酸配列に
融合したＮ−末端α−交配因子プロペプチドを含む融合タンパク質の発現を指向
する。この融合タンパク質のα−交配因子とＫｕｎｉｔｚドメインの間でのＫＥ
Ｘ−２開裂部位での処理は、その天然のＮ−末端でのＫｕｎｉｔｚドメインを遊
離させるように消化した。
【０２０５】 以下の配列であり、クローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む５’セン
スオリゴヌクレオチドを合成した。
【０２０６】
【化５６】
【０２０７】 （配列番号：４２）
【０２０８】 以下の配列であり、クローニングのためのＢａｍＨＩ部位および終止コドン両
方を含む３’アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。
【０２０９】
【化５７】
【０２１０】 （配列番号：４３）
【０２１１】 オリゴヌクレオチドを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ
８．０中に溶解し、１２ｕｇのそれぞれのオリゴを加えて混合し、０．２５Ｍ
ＮａＣｌを加えた。ハイブリッド形成するために、オリゴヌクレオチドを５分間
沸騰させて変性させ、６５℃から室温まで２時間かけて冷却した。重複をＫｌｅ
ｎｏｗ断片を用いて伸張させ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化した。得
られた消化した二本鎖断片をｐＵＣ１９内にクローン化し、配列を確認した。正
確な配列の断片を含むクローンをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、以下
の＋鎖配列を持つ断片を含むビクニンを遊離させ、
【０２１２】
【化５８】
【０２１３】 （配列番号：４４）
【０２１４】 次いでゲル精製し、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＳ６０４内にライゲー
ションした。ライゲーション混合液をフェノール／クロロホルム内に抽出し、Ｓ
−２００ミニスピンカラム上で精製した。ライゲーション産物を酵母株ＳＣ１０
１およびＷＨＬ３４１内にトランスフォームし、ｕｒａ選別プレート上にプレー
トした。それぞれの株からの１２コロニーをｕｒａドロップアウトプレート上で
再画線培養した。単一コロニーを２ｍｌのｕｒａＤＯ培地内に植え付け、３０℃
にて一晩増殖させた。細胞を２分間、１４０００×ｇで沈殿させ、上清をその胎
盤ビクニン（１０２−１５９）の含量に関して評価した。
【０２１５】 形質転換した酵母内での胎盤ビクニン（１０２−１５９）の発現の検出 まず、上清（アッセイあたり５０ｕｌ）を、実施例１で記載したようなアッセ
イ方法（１ｍｌアッセイ容量）を使用してトリプシンのインビトロ活性を阻害す
るその能力に関して評価した。未使用の培地のみの試料、およびアプロチニンの
不活性変異体を発現している酵母クローンを陰性対照として使用した。天然のア
プロチニンを発現している酵母クローンを陽性対照として使用し、比較を示した
。
【０２１６】 胎盤ビクニン（１０２−１５９）発現の定量の第２の方法は、ウエスタンブロ
ットを使用した組換え体ペプチドの蓄積をモニターするために、合成ペプチドに
対するポリクローナル抗体（ｐＡｂｓ）を使用することで行った。これらの研究
は、株ＷＨＬ３４１に由来する組換え体よりもより大きい阻害活性を産出したの
で、株ＳＣ１０１に由来した組み換え体でのみ行った。
【０２１７】 ｐＡｂを産出するために、２匹の６−８週齢ニュージーランドホワイト（Ｎｅ
ｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ）メスウサギ（Ｈａｚｅｌｔｏｎ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｐａ）を、フロイント完全アジュバント中の
２５０ｕｇの精製した還元合成胎盤ビクニン（１０２−１５９）で第０日に免役
し、続いて第１４，３５、５６および７７日に、フロイント不完全アジュバント
中の１２５ｕｇの同様の抗原でブーストした。本研究で使用した抗血清は、確立
された手順によって第３ブースト後に回収した。ポリクローナル抗体はプロテイ
ンＡ上で抗血清より精製した。
【０２１８】 酵母ＳＣ１０１の形質転換からのコロニー２．４および２．５（図８）および
アプロチニン対照を、３０℃にて５０ｍｌのｕｒａ ＤＯ培地内で一晩培養した
。細胞をペレット化し、上清をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ３（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅ
ｖｅｒｌｙ，ＭＡ）濃縮器を使用して１００倍濃縮した。それぞれの試料（３０
μｌ）を、取扱手順を使用して１０−２０％トリシン緩衝ゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。二重ゲルを、銀染色
キット（Ｉｎｔｅｒｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎ
ａｎｔｉｃｋ，ＭＡ）で染色するか、またはニトロセルロースに写し、合成ビク
ニン（１０２−１５９）を顕在化させる精製ポリクローナル抗体で染色した。ア
ルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ウサギ抗体を取り扱い指示にしたがって第２抗
体として使用した（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ，Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。
【０２１９】 ＳＣ１０１の形質導入株からの胎盤ビクニン（１０２−１５９）の精製 ＳＣ１０１株２．４の１Ｌ培養液からの発酵液を遠心（４，０００ｇ×３０分
間）にて回収し、次いで先に０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２および０
．０１％（ｖ／ｖ）ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝
液ｐＨ７．５で平衡化したアンヒドロキモトリプシン−セファロース（Ｔａｋａ
ｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．，ＣＡ）の１．０ｍｌカラムにのせた
。カラムをＡ２８０ｎｍがゼロに下がるまで、１．０Ｍ ＮａＣｌを含む同様の
緩衝液で洗浄し、その上でカラムを０．１Ｍ ギ酸ｐＨ２．５で溶出した。溶出
した画分をため、先に０．１％ＴＦＡで平衡化したＣ１８カラム（Ｖｙｄａｃ、
５ｕｍ、４．６×２５０ｍｍ）にのせ、０．１％ ＴＦＡ中の２０−８０％アセ
トニトリル５０分間直線勾配で溶出した。胎盤ビクニン（１０２−１５９）を含
む画分をため、０．１％ＴＦＡ中の直線２２．５−５０％アセトニトリル勾配で
の溶出を用いてＣ１８で再クロマトグラムした。
【０２２０】 結果。図８は、ＳＣ１０１およびＷＨＬ３４１それぞれの株の形質導入に由来
する１２のコロニーによって阻害されたパーセントトリプシン活性を示している
。この結果は、トリプシン阻害剤胎盤ビクニン（１０２−１５９）で形質導入し
た酵母株ＳＣ１０１の１２のすべてのコロニーが、トリプシンを阻害する能力を
示さない両方の陰性対照と比較して、統計学的量のトリプシン阻害活性を産出す
る能力を持っていたことを示している。したがってこの活性は、胎盤ビクニン変
異体（１０２−１５９）形質導入細胞での特異的阻害剤の発現に関係する。酵母
ＷＨＬ３４１試料が、最小のトリプシン阻害活性を含んだ。このことは、使用し
た条件下でのこの株で観察された低増殖に関連する可能性がある。
【０２２１】 図９は、酵母ＳＣ１０１上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン解析を示し
ている。胎盤ビクニン（１０２−１５９）を発現している組換え体酵母２．４お
よび２．５から、およびアプロチニンを発現している酵母からの上清の銀染色し
たＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、およそ６ｋＤａのタンパク質バンドが得られ、これ
はそれぞれの組換え体Ｋｕｎｉｔｚ阻害剤領域に対して予想された大きさに相当
する。ウエスタン解析は、株２．４および２．５によって発現した６ｋＤａバン
ドが、胎盤ビクニン（１０２−１５９）に結合するｐＡｂと反応したことを示し
た。アプロチニン対照での同様の６ｋＤａのバンドは、この抗体に反応はせず、
このことは胎盤ビクニン変異体（１０２−１５９）に対する抗体の特異性を示唆
している。胎盤ビクニンＣ−末端領域の最終調製品は、銀染色したＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによって、非常に純粋であった（図１０）。最終調製品での培養液由来トリ
プシン阻害活性の全回収は３１％であった。精製した阻害剤のＮ−末端配列は、
４０％のタンパク質が正確に処理されて、正確な胎盤ビクニン（１０２−１５９
）に対するＮ−末端を生成し、一方約６０％の物質は、酵母α−交配因子を含ん
でいたことを示唆した。精製した物質は、血漿カリクレインのインビトロ阻害に
関して０．３５ｎＭの明らかなＫｉを示している活性セリンプロテアーゼ阻害剤
を含んだ。
【０２２２】 結論として、発酵培地中のプロテアーゼ阻害剤活性および合成ビクニン（１０
２−１５９）に免疫化学的に関連したタンパク質両方の蓄積と、形質転換した株
の１つからの胎盤ビクニン（１０２−１５９）の単離により、本明細書で記載し
た組換え体酵母株での胎盤ビクニンの発現の証拠が得られ、このことは、胎盤ビ
クニン断片の産出に対する酵母の有用性をはじめて示している。
【０２２３】 さらなる構造物を、胎盤ビクニン１０２−１５９内に含まれるＫｕｎｉｔｚド
メインの発現レベルを増加させ、正確なＮ−末端を持つタンパク質の産出を増加
させるために調製した。本発明者らは、胎盤ビクニン１０２−１５９のＮ−末端
残基（ＹＥＥＹ−−）が、酵素的に酵母ａ−因子プロ領域を取り除く酵母ＫＥＸ
−２プロテアーゼによってほんのわずかしか認識される開裂部位を表している可
能性があると仮定した。したがって、本発明者らは、ＫＥＸ−２開裂部位の周り
のＰ’サブ部位を修正するために、胎盤ビクニン１０３−１５９（ＥＥＹ…のＮ
−末端）、１０１−１５９（ＮＹＥＥＹ…のＮ−末端）および９８−１５９（Ｄ
ＭＦＮＹＥＥＹ…）の産出に対する酵母発現構造物を調製した。組換え体タンパ
ク質発現のレベルを増加させることを試みるために、本発明者らはまた、以下で
記載した構造物のいくつかを調製するときに、哺乳動物が好むコドンではなく、
酵母が好むコドンを使用した。構造物は、本質的には胎盤ビクニン１０２−１５
９（構造番号１として定義した）に関して以上で記載したように調製したが、以
下の修正にしたがった。
【０２２４】 構造番号２ 胎盤ビクニン１０３−１５９、酵母コドン使用５’センスオリゴ
ヌクレオチド
【０２２５】
【化５９】
【０２２６】 （配列番号：５５）
【０２２７】 および３’アンチセンスオリゴヌクレオチド
【０２２８】
【化６０】
【０２２９】 （配列番号：５６）
【０２３０】 を、胎盤ビクニン１０２−１５９の発現のための発現構造物（上記構造番号１
）の産出に関して記載したように処理した。
【０２３１】 構造番号３ 胎盤ビクニン１０１−１５９、酵母コドン使用５’センスオリゴ
ヌクレオチド
【０２３２】
【化６１】
【０２３３】 （配列番号：５７）
【０２３４】 および構造物番号２のために使用したような３’アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを、胎盤ビクニン１０２−１５９の発現のための発現構造物（上記構造番号
１）の産出に関して記載したように処理した。
【０２３５】 構造物番号４ 胎盤ビクニン９８−１５９、酵母コドン使用５’センスオリゴ
ヌクレオチド
【０２３６】
【化６２】
【０２３７】 （配列番号：５８）
【０２３８】 および構造物番号２のために使用したような３’アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを、発現構造物（上記構造番号１）の産出に関して記載したように処理した
。
【０２３９】 酵母株ＳＣ１０１（ＭＡＴα、ｕｒａ３−５２、ｓｕｃ２）に、以上のｃＤＮ
Ａそれぞれを含むプラスミドを形質導入し、タンパク質を、ヒトコドン使用での
胎盤ビクニン１０２−１５９の産出に関して以上で記載した方法を使用して発現
させた。およそ２５０ｍｌのそれぞれの酵母培養液を回収し、遠心（１５分間×
３０００ＲＰＭ）からの上清を、上記のようにカリクレイン−セファロースの１
ｍｌカラムでの精製に別々にかけた。適用物のトリプシン阻害活性の相対量、再
生した精製したタンパク質の量および精製したタンパク質のＮ−末端配列を決定
し、表７にて以下に挙げる。
【０２４０】
【表７】
【０２４１】 結果は、Ｃ−末端Ｋｕｎｉｔｚドメインを含む異なる長さの胎盤ビクニン断片
が、機能的な分泌したタンパク質を発現する能力において広い変動を示すことを
示している。断片１０１−１５９および１０３−１５９を発現している構造物は
精製前上清中に待った少しの、または小さな酵素活性を産出し、それぞれの精製
した画分の０．０５ｍｌの部分のＮ−末端配列決定によっては、阻害剤の検出可
能な量は産出されなかった。一方、胎盤ビクニン１０２−１５９および９８−１
５９のどちらかの発現によって、精製前に明らかな量のプロテアーゼ活性が産出
された。しかしながら、Ｎ−末端配列決定は、１０２−１５９の発現より回収し
た精製タンパク質は、ほとんど不正確に処理され、酵母α−交配因子プロ配列内
の部位におけるプレタンパク質の大部分の処理と一致したＮ−末端を示している
ことが示された。しかしながら、胎盤ビクニン９８−１５９の発現から回収した
精製タンパク質は、全体として正しい部位で処理され、正しいＮ−末端を産出し
た。さらに、胎盤ビクニン１０２−１５９の回収と比較してほぼ２倍のタンパク
質が回収された。したがって胎盤ビクニン９８−１５９は、Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉ
ａｅのα−交配因子プレ−プロ配列／ＫＥＸ−２処理系による胎盤ビクニンのＣ
−末端Ｋｕｎｉｔｚドメインの産出に関する好ましい断片長を表している。
【０２４２】 実施例６ 酵母発現の他の手順 Ｒ７４５９３翻訳産物由来の５８アミノ酸ペプチドをまた、ＤＮＡ配列決定の
後にＴＡ ｖｅｃｔｏｒ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
，ＣＡ）内にクローン化したＲ８７８９４−Ｒ７４５９３ ＰＣＲ産物から、ま
たはヒト胎盤ｃＤＮＡからどちらかよりＰＣＲ増幅することができる。増幅した
ＤＮＡ産物は、インフレームで翻訳産物を作製しするようにＹＥＥＹ−−ＣＦＲ
Ｑ（５８残基）についてコードしているＲ７４５９３配列に相当した酵母α−交
配因子リーダー配列からの１９ヌクレオチドからなる可能性があり、α−交配因
子／Ｋｕｎｉｔｚドメイン融合タンパク質を構築している。タンパク質配列はま
た、その天然のＮ−末端においてＫｕｎｉｔｚドメインを遊離させる可能性のあ
るｋｅｘ２開裂も含む。
【０２４３】 クローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩを含む５’センスオリゴヌクレオチドは
以下の配列を含む可能性がある。
【０２４４】
【化６３】
【０２４５】 （配列番号：３０）
【０２４６】 ３’アンチセンスオリゴヌクレオチドはクローニングのためのＢａｍＨＩおよ
び終止コドンを含み、以下の配列である。
【０２４７】
【化６４】
【０２４８】 （配列番号：３１）
【０２４９】 酵母発現ベクター内にクローン化すべき全２０６ヌクレオチドｃＤＮＡ配列は
以下の配列である。
【０２５０】
【化６５】
【０２５１】 （配列番号：３２）
【０２５２】 ＰＣＲ増幅の後、このＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで消化し、これも
またＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化した酵母発現ベクターｐＭＴ１５（
参照して全体に組み込まれた、米国特許第５，１６４，４８２号を参照）内にク
ローン化した。得られたプラスミドベクターを、米国特許第５，１６４，４８２
号で記載した方法を用いて酵母株ＳＣ１０６に形質導入するのに使用した。ＵＲ
Ａ３＋酵母形質導入体を単離し、誘導条件下で培養した。組換え体胎盤ビクニン
変異体の産出を、上述したインビトロアッセイ方法を用いて時間を追って培養液
上清で蓄積したトリプシン阻害活性の量にしたがって測定した。発酵液を９００
０ｒｐｍにて３０分間遠心した。次いで上清を０．４、次いで０．２μｍフィル
タを通して濾過し、７．５ｍｓの伝導率まで希釈し、クエン酸にてｐＨ３にあわ
せた。次いで試料を５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３中のＳ−ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅファーストフロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２００ｍｌ上にバッチ吸収させ、
６０分間攪拌した。続いてゲルをそれぞれ２Ｌの、５０ｍＭクエン酸ナトリウム
ｐＨ３．０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、２０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ ｐＨ６．０で連続的に洗浄した。洗浄したゲルを好適なカラムに移し、２０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．０中の０−１Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配で溶出し
た。次いでインビトロでトリプシン阻害活性を持っている溶出した画分をため、
さらに、ａ）（基本的に実施例２で記載したような）固定化したアンヒドロトリ
プシンのカラム上でのクロマトグラフィ、ｂ）固定化したウシカリクレインのカ
ラム上でのクロマトグラフィ、またはｃ）ゲル濾過および／または陰イオン交換
クロマトグラフィを含む従来のカラムクロマトグラフ工程の組合せのいずれかに
よって精製した。
【０２５３】 実施例７ 胎盤からの天然のヒト胎盤ビクニンの単離と特性化 ビクニンタンパク質を、全凍結胎盤（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）からの明白
な均質性を得るまで精製した。胎盤（７４０ｍｇ）を室温まで解凍し、０．５−
１．０ｃｍ断片に切断し、氷上におき、６００ｍｌのＰＢＳ緩衝液で洗浄した。
洗浄物をデカントし、２４０ｍｌの胎盤断片をＷａｒｉｎｇブレンダーに入れた
。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および０．１Ｍ ＮａＣｌを含む３００ｍ
ｌの緩衝液を添加した後に、混合液を高速度で２分間混和し、７５０．０ｍｌの
遠心チューブ内にデカントし、氷上に置いた。この手順をすべての物質を処理す
るまで繰り返した。スラリーを混合し、４５００×ｇにて６０分間、４℃にて遠
心した。上清を、チーズ状の布を通して濾過し、胎盤ビクニンを、取扱説明書に
したがって、７０ｍｇのウシ膵臓カリクレイン（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）を５．０ｍ
ｌのＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に共有結合させ
て作製したカリクレイン親和性カラムを用いて精製した。物質を２．０ｍｌ／分
の流速で親和性カラム上にのせ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ
ＮａＣｌで、洗浄液の２８０ｎｍでの吸光度がもはや検出されなくなるまで洗
浄した。さらにカラムを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌで洗浄し、次いで３倍量の０．２Ｍ酢酸、ｐＨ４．０で溶出した。カリクレイ
ンおよびトリプシン阻害（以下参照）活性を含む画分をため、冷凍し、凍結乾燥
した。さらに胎盤ビクニンを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ ＨＰ
ＬＣ型に接続したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィによって精製した。簡便には、カラム
を、流速０．５ｍｌ／分にて０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび
０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で平衡化した。凍結乾燥試料を１．０ｍｌの０
．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中で元に戻し、２００μｌ分液にてゲル濾過カラ
ム上の注入した。画分を回収し（０．５ｍｌ）、トリプシンおよびカリクレイン
阻害活性に関してアッセイした。活性画分をため、溶液のｐＨをＴＦＡの添加に
よって２．５に合わせた。この物質を、０．１％ＴＦＡ中の２０％アセトニトリ
ル中で平衡化したＶｙｄａｃ Ｃ１８ 逆相カラム（５ミクロン、０．４６×２
５ｃｍ）に直接のせた。分離を、０．１％ＴＦＡ中２０％のアセトニトリルでの
初期２０分間洗浄の後に、５０分間かけて１．０ｍｌ／分にて０．１％ＴＦＡ中
の２０−８０％アセトニトリルの直線勾配を用いて行った。画分（１ｍｌ）を回
収し、トリプシンおよびカリクレイン阻害活性に関してアッセイした。阻害活性
を含んでいる画分をｓｐｅｅｄ−ｖａｃ濃縮器（Ｓａｖａｎｔ）を用いて濃縮し
、Ｎ−末端配列解析にかけた。
【０２５４】 胎盤ビクニンの機能的アッセイ 機能的胎盤ビクニンの同定を、ウシトリプシンおよびヒト血漿カリクレインを
阻害するその能力を測定することで行った。トリプシン阻害活性は、基質として
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−アミノメチルクマリンを使用して９６−ウェルマイク
ロタイタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にて、室温でアッセイ緩衝液
（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２．０ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ２、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で行った。トリプシンによって産
出されたクマリンの量を、プレートリーダーを備えたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
ＬＳ−５０Ｂ蛍光計にて蛍光（ｅｘ＝３７０ｎｍ、ｅｍ＝４３２ｎｍ）を測定す
ることで決定した。トリプシン（１００μｌ緩衝液中２３μｇ）を２０μｌの試
験すべき試料と混合し、２５℃にて１０分間インキュベートした。反応をアッセ
イ緩衝液中の５０μｌの基質ＧＰＫ−ＡＭＣ（最終濃度３３μＭ）の添加で開始
した。蛍光強度を測定し、それぞれの画分の％阻害を
【０２５５】
【数４】 ％阻害＝１００×［１−Ｆ０／Ｆ１］
【０２５６】 により決定した。式中Ｆ０は未知の蛍光であり、Ｆ１はトリプシンのみの対照
の蛍光である。この画分のカリクレイン阻害活性を、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００）中の７．０ｎＭ カリクレインおよび基質としての６６．０μＭ Ｐｒ
ｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣを使用して同様に測定した。
【０２５７】 胎盤ビクニンのインビトロ特異性の決定 天然のヒト胎盤ビクニンのインビトロ特異性を、以上の実施例での処理で記載
したような物質および方法を用いて決定した。胎盤ビクニンを、基質としてＧＰ
Ｋ−ＡＭＣを用いて既知濃度のトリプシンに対する活性部位滴定によって定量し
非結合トリプシンの画分をモニターした。
【０２５８】 タンパク質配列決定 １ｍｌ画分（Ｃ１８−２９ Ｄｅｌａｒｉａ）を容量にして３００ｍｌまで、
Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ上で濃縮し、有機溶媒の量を減らした。次いで試料をＨｅｗ
ｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ小型二相反応カラム上にのせ、１ｍｌの２％トリフル
オロ酢酸で洗浄した。試料をＥｄｍａｎ分解を用いて、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃ
ｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ Ｇ１００５Ａタンパク質配列決定系上で配列決定した。
バージョン３．０配列決定法およびすべての試薬は、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋ
ａｒｄより供給された。配列は５０サイクルで確認した。
【０２５９】 結果。胎盤ビクニンを連続的なカリクレイン親和性、ゲル濾過および逆相カラ
ムクロマトグラフィによって明白な均質性を得るまで精製した（以下の精製表を
参照）。
【０２６０】
【表８】
【０２６１】 大部分のカリクレインおよびトリプシン阻害活性は、ｐＨ４．０溶出でのカリ
クレイン親和性カラムより溶出した。続くゲル濾過クロマトグラフィ（図５）に
より、同一の条件下での分子量標準を流したことで得られた標準曲線によって判
断したところ、分子量１０−４０ｋＤａの範囲でカリクレインおよびトリプシン
阻害活性のピークが得られた。逆相Ｃ１８クロマトグラフィ（図６）によって、
およそ３０％のアセトニトリルの時点での最も強力な溶出で、阻害活性の４ピー
クが得られた。Ｃ１８から溶出した第１ピーク（画分２９）に関連した活性は、
胎盤ビクニン（ＡＤＲＥＲ…；配列番号：１）の予想されるアミノ酸配列のアミ
ノ酸１より始まるアミノ酸配列を表しており、５０サイクルの配列決定に対して
予想された配列と同一であった（図３の下線アミノ酸）。この配列長内のシステ
イン残基は、酸化したタンパク質の配列決定に関して予想されたようにサイレン
トであった。成熟胎盤ビクニンのアミノ酸位置１１および２０でのシステイン残
基は、そこでＰＴＨ−ピリジルエチル−システインがサイクル１１および２０で
回収されたＳ−ピリジルエチル化タンパク質の配列決定より後に同定された。
【０２６２】 興味深いことに、配列のアミノ酸残基番号３０でのアスパラギン（図３）はサ
イレントであり、この部位が糖付加される可能性があることを示している。画分
２９は、残基番号１の時点で開始している（サイクル１で２７ｐｍｏｌ）胎盤ビ
クニンに相当する１つの主要配列＋残基６で開始している胎盤ビクニン（ＳＩＨ
Ｄ…）より由来した副次的な配列を産出した。このことは、画分２９内で配列決
定した最終調製品はとても純粋であり、この画分に関連するプロテアーゼ阻害活
性に最も感受性であり得ることを示している（図６）。
【０２６３】 したがって、Ｃ１８クロマトグラフィからの胎盤ビクニンの最終調製品は、銀
染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に基づいてとても純粋であり（図７）、そこでタンパ
ク質は、以下の分子量マーカ、インスリン（２．９ｋＤａ）、ウシトリプシン阻
害剤（５．８ｋＤａ）、リソザイム（１４．７ｋＤａ）、β−ラクトグロブリン
（１８．４ｋＤａ）、炭酸アンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）、オバルブミン（４３
ｋＤａ）によって目盛りを定めた１０−２０％アクリルアミドトリシンゲル（Ｎ
ｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上で２４ｋＤａの明らかなＭｒで移動し
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の胎盤ビクニンの上記の大きさは、全長コード配列から
予想されるものと一致した（図４Ｆ）。
【０２６４】 上述したＮ−末端配列決定結果に基づいて予想すると、精製したタンパク質は
、胎盤ビクニン（７−４６）に対する抗体と反応し、銀染色にてゲル上で検出さ
れた（図７）精製した調製品で観察されたのと同一のＭｒのバンドを産出した（
図１２Ａ）。しかしながら、同様の調製品を、合成胎盤ビクニン（１０２−１５
９）に対する抗体と反応させた場合、全長タンパク質に相当するバンドは観察さ
れなかった。むしろ、およそ６ｋＤａの合成ビクニン（１０２−１５９）と共に
移動した断片が観察された。これらの結果の最も単純な解釈は、精製した調製品
が、精製の後に分解を起こし、Ｎ−末端領域を含むＮ−末端断片とＣ−末端領域
を含むＣ−末端断片を産出したと考えることである。胎盤ビクニン（７−６４）
への抗血清に対する断片応答性は、全長タンパク質のＣ−末端を欠いていると仮
定すると、大きさ（２４ｋＤａ）は高段階の糖付加を示唆している。
【０２６５】 以下の表６は、胎盤ビクニンによる様々なセリンプロテアーゼのインビトロ阻
害の効力を示している。データはアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ（商標））で
得たものと比較した。
【０２６６】
【表９】
【０２６７】 結果は、天然の供給源（ヒト胎盤）から単離した胎盤ビクニンがトリプシン−
類似セリンプロテアーゼの強力な阻害剤であることを示している。
【０２６８】 実施例８ 異なるヒト器官および組織間での胎盤ビクニンの発現パターン ヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓からの２μｇのｐｏ
ｌｙＡ＋ＲＮＡを含む多数の組織のノザンを Ｃｌｏｎｔｅｃｈより購入した。
２つの異なるｃＤＮＡプローブを使用した。１）胎盤ビクニン（１０２−１５９
）をコードしているゲル精製したｃＤＮＡ、２）ＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製
したＴＡクローンより遊離させた７８０塩基対ＰＣＲ−由来ｃＤＮＡ（図４Ｅ）
である。それぞれのプローブをＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａ）からの３２Ｐ−ｄＣＴＰおよびランダ
ムプライミング標識化キットを用いて標識化し、次いで取扱説明書にしたがって
多数の組織に対してハイブリッド形成するのに使用した。オートラジオグラフィ
を１８時間の露光時間でＢｉｏｍａｘフィルムを用いて作製し、Ｕｍａｘ Ｓｃ
ａｎｎｅｒを用いて感光し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いてスキャン
した。
【０２６９】 結果。胎盤ビクニン（１０２−１５９）プローブ（図１１Ａ）または胎盤ビク
ニンの両方のＫｕｎｉｔｚドメインを含むより大きなプローブ（図１１Ｂ）を用
いて観察した組織発現のパターンは、予想したものと本質的に同一であった。胎
盤ビクニンｍＲＮＡは、膵臓および胎盤で最も豊富であった。有意なレベルが肺
、脳および腎臓でも観察されたが、心臓および肝臓では低いレベルであり、骨格
筋ではｍＲＮＡは検出されなかった。転写物の大きさは、すべての場合で１．９
５キロ塩基であり、ＥＳＴオーバーレイおよび以上の項で記載した全長ｃＤＮＡ
クローニング両方から予想した胎盤ビクニンの予想サイズと一致した。
【０２７０】 ｍＲＮＡの広い組織分布は、胎盤ビクニンが幅広く発現していることを示して
いる。タンパク質がまた、リーダー配列を含んでいるので、ヒト免疫系へ広く暴
露されている可能性があり、それが単独のタンパク質として認識されるようにな
ることが必要である。胎盤ビクニンｍＲＮＡの広い組織分布に関するさらなる証
拠が、胎盤ビクニンに対する相同性で登録したいくつかのＥＳＴ（図４Ｂ）が、
ヒト成人および幼児脳、ヒト網膜、乳、子宮、嗅覚上皮および胎盤から由来した
という事実より得られる。したがって、天然のヒトタンパク質のヒト患者への投
与が、免疫応答を誘発する可能性はないと結論づけた。
【０２７１】 興味深いことに、胎盤ビクニンの発現パターンは、ウシ肺および膵臓で高いレ
ベルで見られるウシアプロチニンに関するものを思い起こさせるものである。胎
盤ビクニンの発現パターンをさらにはっきりさせるために、以下のヒト細胞から
のトータルＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを行った。未刺激ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶ
ＥＣｓ）、ＨＫ−２（腎臓近位細管由来の株）、ＴＦ−１（赤白血病株）および
ホルボールエステル（ＰＭＡ）−刺激ヒト末梢血白血球である。使用したプロー
ブ、
【０２７２】
【化６６】
【０２７３】 （センス；配列番号：５９）
【０２７４】
【化６７】
【０２７５】 （アンチセンス；配列番号：６０）
【０２７６】 は、ｃＤＮＡ断片をコードしている６００ｂｐ胎盤ビクニンを増幅するために
設計した。比較対照を、８００ｂｐアクチン断片を増幅するのにアクチンプライ
マーを加えることによって標準化した。エチジウムブロマイドによってアガロー
スゲル上で同定された８００ｂｐの断片がすべてのレーンで同等の強度であった
一方で、６００ｂｐの胎盤ビクニン断片はＨＵＶＥＣｓには存在せず、しかし他
の細胞株それぞれには有意な量存在した。本発明者らは、胎盤亜ビクニンは少な
くともいくつかの内皮細胞には発現していないが、いくつかの白血球集団には発
現していると結論づけた。
【０２７７】 実施例９ バキュロウイルス／Ｓｆ９発現系よりよく精製された胎盤ビクニン（１−１７
０）の精製および特性 両方のＫｕｎｉｔｚドメインを含んでいる胎盤ビクニン
（ビクニン（１−１７０））（配列番号：５２）の大きな断片を以下のようにＳ
ｆ９に発現させた。ＰＣＲ（図４Ｅ）より得、ＴＡベクター内に含まれる（以上
の実施例を参照）胎盤ビクニンｃＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩでの
消化によって遊離させ、５’ＸｂａＩ部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位によっ
て隣接した断片を産出した。この断片をゲル精製し、次いでＭ１３ｍｐ１９ベク
ター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）内に
クローン化した。インビトロ変異導入（Ｋｕｎｋｅｌ Ｔ．Ａ．，（１９８５）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８−４９２）を使
用して、５‘末端でのＸｂａＩ部位に対してＰｓｔＩ３’部位を作製し、一方で
ＡＴＧ開始部位をコードしている配列、天然の胎盤ビクニンシグナルペプチドお
よび成熟胎盤ビクニンコード配列に対して５‘を作製した。変異導入のために使
用したオリゴヌクレオチドは配列
【０２７８】
【化６８】
【０２７９】 （配列番号：６１）
【０２８０】 を持った。終止コドン（ＴＡＧ）およびＢｇｌＩＩ／ＸｍａＩ部位を同様にオ
リゴヌクレオチド：
【０２８１】
【化６９】
【０２８２】 （配列番号：６２）
【０２８３】 を使用してｃＤＮＡの３’末端に作製した。終止コドンは胎盤ンビクニンをコ
ードしている配列とインフレームであり、アミノ酸残基１７０のリシンの直後で
終了となり、したがって短くした胎盤ビクニン断片をコードすることは、推定さ
れる膜貫通領域が欠けている。ＰｓｔＩおよびＢｇｌＩＩによる消化からの産物
を単離し、両方のＫｕｎｉｔｚドメインを含むが、予想される膜貫通区画に対す
るＮ末端後で短くなっている胎盤ビクニン断片（１−１７０）の発現のためにＢ
ａｃＰａｃ８ベクター内にクローン化した。
【０２８４】 Ｓｆ９昆虫細胞によるビクニンの発現は、培地を感染後７２時間回収した場合
、１対１の感染の多重感染において最適であった。回収後、バキュロウイルス細
胞培養上清（２Ｌ）をＴｒｉｓ−ＨＣｌの添加によってｐＨ８．０に合わせた。
ビクニンを、胎盤からの天然の胎盤ビクニンの精製に関して実施例７で既に記載
したように、５ｍｌのウシ膵臓カリクレイン親和性カラムを使用したカラムクロ
マトグラフィによって精製した。溶出した物質をＴＦＡによってｐＨ２．５にあ
わせ、１ｍｌ／分の流速にて、０．１％ＴＦＡ中の１０％アセトニトリルで平衡
化したＣ１８逆相カラム（１．０×２５ｃｍ）上のカラムクロマトグラフィにか
けた。ビクニンを４０分間かけて、０．１％ＴＦＡ中の１０−８０％アセトニト
リルの直線勾配で溶出した。活性画分をため、凍結乾燥し、５０ｍＭ Ｈｅｐｅ
ｓ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２および０．１％Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に再懸濁させ、必要になるまで−２０℃にて保存した
。組換え体ビクニンの濃度をアミノ酸解析により決定した。
【０２８５】 結果。組換え体ビクニンを、以下に示したような２段階精製プロトコルを用い
てバキュロウイルス細胞培養上清より精製し、活性トリプシン阻害剤を得た（以
下の表８）。
【０２８６】
【表１０】
【０２８７】 固定化ウシ膵臓カリクレイン親和性カラム上での未精製物質のカラムクロマト
グラフィは、０．０１３％のタンパク質および０．６７％の存在しているトリプ
シン阻害剤活性を選択的に単離した。開始上清に存在したトリプシン阻害活性の
大部分は、固定化したカリクレインに結合せず、ビクニンと関連しなかった（結
果は示さず）。続くＣ１８逆相を使用したクロマトグラフィにより、５倍のさら
なる精製が行われ、収率は０．２％であった。最終調製品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって非常に純粋であり（図１３）、２１．３ｋＤａのＭｒを示しており、ウ
サギ抗胎盤ビクニン１０２−１５９への免疫ブロットで反応した（示していない
）。Ｎ−末端配列決定（２６サイクル）により、残基＋１より始まる（ＡＤＲＥ
Ｒ…）成熟胎盤ビクニン（図４Ｆ）に関する予想された配列が得られ、これはシ
グナルペプチドがＳｆ９細胞内で正確に処理されていたことを示している。
【０２８８】 Ｓｆ９細胞からの精製した胎盤ビクニン（１００ｐｍｏｌ）をピリジルエチル
−アルキル化し、ＣＮＢｒ消化し、次いで得られた断片の分解なしに配列決定し
た。２０サイクルの配列決定によって以下のＮ−末端が得られた。
【０２８９】
【化７０】
【０２９０】 このようにして、予想された４つの断片のそれぞれに相当しているＮ−末端を
回収した。これは、Ｓｆ９発現タンパク質は、胎盤ビクニン（１−１７０）の全
エクトドメイン配列を含むことを確かにした。
【０２９１】 実施例１０ Ｓｆ９細胞由来の精製した胎盤ビクニン（１−１７０）の阻害特異性 組換え体ビクニンのインビトロ特異性を、実施例３、４および７で記載したよ
うな物質および方法で決定した。さらに、ヒト組織カリクレインのビクニンによ
る阻害を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．
０１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む緩衝液中で０．３５ｎＭのヒト組織カ
リクレイン組換え体ビクニンをインキュベートすることで測定した。３７℃にて
５分後、５μｌの２ｍＭ ＰＥＲ−ＡＭＣを添加し、蛍光の変化をモニターした
。
【０２９２】 組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）の阻害もまた以下のように測定した
。ｔＰＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから
の、ヒトメラノーマ細胞培養液からの単鎖形態）を阻害剤と共に、１５０ｍＭ
ＮａＣｌおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐ
Ｈ７．２中で室温にて２時間、前インキュベートした。反応を続けて以下の初期
成分濃度を含む反応系に移して開始した。０．００４％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００および０．００５％（ｖ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む２８ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５中、ｔＰＡ（７．５ｎＭ）、阻害剤０−６．６μＭ、Ｄ
Ｉｌｅ−Ｌｐｒｏ−Ｌａｒｇ−ｐニトロアニリン（１ｍＭ）。ｐ−ニトロアニリ
ンの形成を、３７℃での２時間のインキュベーションの後にＡ４０５ｎｍを測定
して決定した。
【０２９３】 以下の表は、インビトロでの様々なセリンプロテアーゼの阻害剤としての組換
え体ビクニンの効力を示している。データは、組換え体ビクニンまたはアプロチ
ニンどちらかを使用した阻害のスクリーニングに関して得たデータと比較して示
した。
【０２９４】
【表１１】
【０２９５】 この結果は、組換え体ビクニンが、少なくとも５つの異なるセリンプロテアー
ゼ阻害剤として効果的な活性プロテアーゼ阻害剤を産出するために昆虫細胞に発
現されることができることを示している。組換え体ビクニンは、ヒト血漿カリク
レイン、トリプシンおよびプラスミンに対してアプロチニンよりも強力であった
。驚くべきことに、組換え体ビクニンは、試験したすべての酵素に対して、合成
的に誘導したビクニン断片（７−６４）および（１０２−１５９）より強力であ
った。これらのデータは、組換え体ビクニンが、インビトロアッセイで使用され
ているアプロチニンよりも効果的であり、インビボ効力がよりよいことが期待さ
れることを示している。
【０２９６】 特定のプロテアーゼに対する効力の測定に加えて、活性化部分的トロンボプラ
スチン時間（ＡＰＴＴ）を引き延ばす胎盤ビクニン（１−１７０）の能力を評価
し、アプロチニンに関連した活性と比較した。阻害剤を１５０ｍＭ ＮａＣｌお
よび０．０２％アジ化ナトリウムを含んでいる２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７
．２中に希釈し、ＭＬＡ ＥｌｅｃｔｒａＲ８００ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｃｏ
ａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅｒ凝固測定器（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｌｅａｓａｎｔｖｉｌｌｅ，Ｎ．
Ｙ．）内に含まれたキュベットに加えた（０．１ｍｌ）。この器具を、３００秒
活性時間および二重モードでのＡＰＴＴモードにセットした。０．１ｍｌの血漿
（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ａｓｓａｙｅｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｌａｓｍａロ
ット１−６−５１８５，Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｅａｕｍ
ｏｎｔ，ＴＸ）を添加した後に、ＡＰＴＴ試薬（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＡＰＴＴ
−ロット１０２３４５、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．，Ｄｕｒ
ｈａｎ，ＮＣより）および２５ｍＭ ＣａＣｌ２を自動的に初期凝固に施し、凝
固時間を自動的にモニターした。結果（図１４）は凝固時間を２倍にするにはお
よそ２μＭの最終アプロチニンが必要であるが、Ｓｆ９誘導胎盤ビクニンは０．
３μＭのみ必要であったことを示した。これらのデータは、胎盤ビクニンが効果
的な抗凝固剤であり、凝固の内因性経路の病理学的活性化を含む疾患に対する薬
剤として有用であることを示している。
【０２９７】 実施例１１ モルモットでの気管電位差の測定 本研究の目的は、処置後３時間のモルモット気管電位差におけるＫｕｎｉｔｚ
セリンプロテアーゼ阻害剤ビクニン、およびナトリウムチャネルブロッカーアミ
ロリドの効果を調査することであった。これらの薬剤は、局所滴下によって頭方
向の気管内に伝送した。ＴＰＤを２時間後に６０分間モニターした。本実施例で
使用した手順は、「Ｃｉｌｉａ，Ｍｕｃｕｓ ａｎｄ Ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｅｄ．，Ｂａｕｍ，Ｇ．Ｌ．ら，Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８；Ｎｅｗｔｏｎら，Ｐｅｄ．Ｐｕｌ
ｍ．Ｓ１７，Ａｂｓ．３６４，１９９８においてＮｅｗｔｏｎらで記載されてい
る。
【０２９８】 使用した物質および方法／薬剤 （以下の実施例１７で記載したような）ビクニン（１−１７０）（５および５
０ｕｇ／ｍＬ（配列番号：５２））および（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉａｌｓ，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡから入手した）アミロリド（１００ｕＭ）の水様
処方を調製し、使用の前に無菌濾過してエンドトキシン試験を行った。これらの
処方は、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）内で調製し、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、
３ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２％
Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ７．１を含むように調製し、本実施例での使用のために
無菌濾過し、エンドトキシン試験した。ＨＢＳＳを対照溶液として使用した。Ｈ
ｙｐｎｏｒｍ（商標）（クエン酸フェンタニル０．３１５ｍｇ／ｍＬ）およびフ
ルアニゾン１０ｍｇ／ｍＬ）はＪａｎｓｓｅｎ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈか
ら入手し、Ｈｙｐｎｏｖｅｌ（商標）（ミダゾラム５ｍｇ／ｍＬ）はＲｏｃｈｅ
から入手した。オスＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（５５０−７５０
ｇ）はＤａｖｉｄ Ｈａｌｌ，ＵＫより供給された。サーミスタプローブはＫａ
ｎｅ−Ｍａｙ Ｌｔｄ，ＵＫより入手した。
【０２９９】 気管気道内への麻酔の導入とビクニンの投与動物をハロタンを使用して麻酔し
た。一旦麻酔が十分なレベル導入されたならば、小切開を下顎の下で行った。気
管をさらし、１００ｕｌ容量のビヒクル、ビクニン（０．５ｕｇまたは５ｕｇ）
またはアミロリド（１００ｕＭ）をニードルおよびシリンジを用いて気管表面上
に一滴ずつ垂らした。一旦注入したならば、皮膚切開をＶｅｔｂｏｎｄ（商標）
（シアノカクリレート組織接着剤）を用いて閉じた。次いで動物を回復させた。
【０３００】 気管電位差の測定のためのモルモットの調製 薬剤処理の２時間後、モルモットをＨｙｐｎｏｒｍ（商標）およびＨｙｐｎｏ
ｖｅｌ（商標）で２回目の麻酔をし、仰向けの状態で固定化した。直腸温度を、
サーミスタプローブで測定し、熱ランプの手動調節によって３７℃に保った。腹
部中線切開を、下顎から鎖骨までで行った。鈍解剖具を用いて、気管の全長を曝
露し、カニューレを挿入した。外部頸動脈をさらし、カニューレを挿入した。次
いで尾側の気管にカニューレを挿入し、動物に部屋の空気で自発的に呼吸させた
。次いで動物を仰向けに置き、その体温を熱ランプを用いて保った。筋肉内麻酔
の導入後２０分、気管寒天電極を頭側の気管に挿入し、気管電位差を６０分間測
定した。対照電極は、気管軟骨に結合させて頭側気管の下に配置した。傷部分を
乾燥を防ぐために覆った。
【０３０１】 結果 図１５に示したように、ビクニン（５ｕｇ）は、賦形剤に関する処理の３時間
後、インビボで、モルモット気管の電位差を阻害した。アミロリド（１００ｕＭ
）およびビクニン（０．５ｕｇ）の効果を比較として示した。
【０３０２】 実施例１２ モルモットでの気管粘液速度におけるビクニンの効果 本研究の目的は、処理の１．５時間後のモルモット気管粘液速度におけるＫｕ
ｎｉｔｚファミリーセリンプロテアーゼ阻害剤ビクニンの効果を調査することで
あった。この薬剤は、局所滴下によって頭側気管に伝送した。ＴＭＶを１．５時
間後、６０分間モニターした。本実施例で使用した手順は、「Ｃｉｌａ，Ｍｕｃ
ｕｓ ａｎｄ Ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｅｄ．
，Ｂａｕｍ，Ｇ．Ｌ．ら，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１
９９８；Ｎｅｗｔｏｎら，Ｐｅｄ．Ｐｕｌｍ．Ｓ１７，Ａｂｓ．３６４，１９９
８においてＮｅｗｔｏｎらで記載されている。
【０３０３】 使用した物質および方法／薬剤 （以下の実施例１７で記載したような）ビクニン（１−１７０）処方（５０ｕ
ｇ／ｍＬ（配列番号：５２））を１３７ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、３ｍ
Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２％ Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐ
Ｈ７．１を含むＨＢＢＳ中で調製した。この処方を本実施例での使用の前に無菌
濾過し、エンドトキシン試験した。ＨＢＳＳを対照溶液として使用した。Ｈｙｐ
ｎｏｒｍ（商標）（クエン酸フェンタニル０．３１５ｍｇ／ｍＬおよびフルアニ
ゾン１０ｍｇ／ｍＬ）はＪａｎｓｓｅｎ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈから入手
し、Ｈｙｐｎｏｖｅｌ（商標）（ミダゾラム５ｍｇ／ｍＬ）はＲｏｃｈｅから入
手した。オスＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（５５０−７５０ｇ）は
Ｄａｖｉｄ Ｈａｌｌ，ＵＫより供給された。サーミスタプローブはＫａｎｅ−
Ｍａｙ Ｌｔｄ，ＵＫより入手した。
【０３０４】 気管気道内への麻酔の導入とビクニンの投与 動物をハロタンを使用して麻酔した。一旦麻酔が十分なレベル導入されたなら
ば、小切開を下顎の下で行った。気管をさらし、１００ｕｌ容量のビヒクルまた
はビクニン（５ｕｇ）をニードルおよびシリンジを用いて気管表面上に一滴ずつ
垂らした。一旦注入したならば、皮膚切開をＶｅｔｂｏｎｄ（商標）（シアノカ
クリレート組織接着剤）を用いて閉じた。次いで動物を回復させた。
【０３０５】 気道粘液速度（ＴＭＶ）の測定 ＴＭＶを、実際には麻酔したモルモットの気管粘膜繊毛層上に移動させ、３２
Ｐ−標識化したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの注入部分
から放射された放射活性を検出するように配置した小型ベータ粒子検出検出器プ
ローブで平行にした導線を用いてモニターした（Ｎｅｗｔｏｎ ａｎｄ Ｈａｌ
ｌ１９９８）。図１６（ａ）は、シリンジおよびベータプローブの配置を図示し
ている。図１６（ｂ）は、３２Ｐ−標識化Ｓ．セルビシエを気管粘膜繊毛層にそ
って移動させたときにプローブによって検出したカウントを示している。
【０３０６】 ビクニンの滴下後７０分に、それぞれの動物にＨｙｐｏｎｏｒｍ（商標）およ
びＨｙｐｏｎｏｖｅｌ（商標）で２回目の麻酔をし、仰向けの状態で固定した。
最初のＴＭＶ測定を２０分後に行った。続く測定を１５分ごとに行った。ＴＭＶ
測定の手順は、Ｎｅｗｔｏｎら、「Ｃｉｌｉａ，Ｍｕｃｕｓ ａｎｄ Ｍｕｃｏ
ｃｉｌｉａｒｙＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｅｄ．，Ｂａｕｍ，Ｇ．Ｌ．，Ｐ
ｒｅｉｌ，Ｚ．，Ｒｏｔｈ，Ｙ．，Ｌｉｒｏｎ．，Ｏｓｔｆｉｅｌｄ，Ｅ．，Ｍ
ａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０およびＰｅｄｉａｔｒ
ｉｃ Ｐｕｌｍｏｎｏｌｏｇｙ Ｓ１７，Ａｂｓ ３６４，１９９８でのＮｅｗ
ｔｏｎらにて詳細に記載されている。
【０３０７】 結果。図１６（ｃ）で示したように、ビクニン（５ｕｇ）は、投与後１．５−
２．５時間の保持時間にわたって、食塩水と比較して、インビボでモルモットの
ＴＭＶを増加させた。
【０３０８】 実施例１３ ビクニンは、インビトロでの培養ヒト気管支上皮（ＨＢＥ）細胞短回路電流に
おけるナトリウム電流を減少させる交会まで増殖させた三次ＨＢＥ細胞単層を修
正Ｕｓｓｉｎｇチャンバー上に載せ、Ｋｒｅｂｓ緩衝液（ＫＢＲ）溶液内に浸し
、３７℃に暖めた９５％Ｏ２／５％ＣＯ２でバブリングした。
【０３０９】 細胞を、バックグラウンドノイズおよび流体抵抗に関する較正の前２０分間平
衡のままにした。次いで経上皮電位差異をＷＰＩ ＥＶＣ ４０００電圧クラン
プを使用して０ｍＶまでクランプした。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を使用しＩｓｃをモ
ニターした。一旦安定した基準線が得られたら（典型的には１０−２０分）、細
胞をアミロリド（１０ｕＭ）で処理した。一旦アミロリドに対する応答が見られ
たならば、ＫＢＲ溶液で洗浄した。基準線および平衡が戻った後、（以下の実施
例１７で記載したような）ビクニン（１−１７０）（ＰＢＳ中０．５−５０ｕｇ
／ｍＬ）またはＰＢＳ対照を加えた。薬剤処理の９０分後、アミロリド（１０ｕ
Ｍ）を添加した。電流が一旦安定になったならば、フォルスコリン（１０ｕＭ）
、次いでブメタニド（１００ｕＭ）を添加した。
【０３１０】 結果 図１７に示したように、ビクニン（７０ｎＭ）は、インビトロで９０分にわた
って間、ヒト気管上皮細胞でのナトリウム電流を阻害した。Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ
はｃＡＭＰ誘導塩素分泌を誘導し、単層抵抗性には影響を与えなかった。
【０３１１】 実施例１４ モルモットでのＴＭＶにおける高張食塩水（１４．４％）の効果 本比較研究の目的は、モルモット気管粘液速度における高張食塩水（１４．４
％×５分間）の効果を調査することであった。この薬剤は、エアロゾルによって
頭側気管内に伝送した。ＴＭＶを、直後および毎１５分ごと、３０分間モニター
した。本実施例で使用した手順は、「Ｃｉｌｉａ，Ｍｕｃｕｓ ａｎｄ Ｍｕｃ
ｏｃｉｌｉａｒｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｅｄ．，Ｂａｕｍ，Ｇ．Ｌ．
ら，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８；Ｎｅｗｔｏｎ
ら，Ｐｅｄ．Ｐｕｌｍ．Ｓ１７，Ａｂｓ．３６４，１９９８においてＮｅｗｔｏ
ｎらで記載されている。
【０３１２】 使用した物質および方法／薬剤 Ｈｙｐｎｏｒｍ（商標）（クエン酸フェンタニル０．３１５ｍｇ／ｍＬおよび
フルアニゾン１０ｍｇ／ｍＬ）はＪａｎｓｓｅｎ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ
から入手し、Ｈｙｐｎｏｖｅｌ（商標）（ミダゾラム５ｍｇ／ｍＬ）はＲｏｃｈ
ｅから入手した。オスＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（５５０−７５
０ｇ）はＤａｖｉｄ Ｈａｌｌ，ＵＫより供給された。サーミスタプローブはＫ
ａｎｅ−Ｍａｙ Ｌｔｄ，ＵＫより入手した。
【０３１３】 気道粘液速度の測定 動物をＨｙｐｎｏｒｍ（商標）およびＨｙｐｎｏｖｅｌ（商標）を用いて麻酔
した。ＴＭＶを、実際には麻酔したモルモットの気管粘膜繊毛層上に移動させ、
３２Ｐ−標識化したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの注入
部分から放射された放射活性を検出するように配置した小型ベータ粒子検出検出
器プローブで平行にした導線を用いてモニターした（Ｎｅｗｔｏｎ ａｎｄ Ｈ
ａｌｌ １９９８）。
【０３１４】 最初のＴＭＶ測定（ラン１）を投与後２０分で行った。続く測定を、１５分ご
とに行った。第２ランの前６分の時点で、５分間食塩水（０．９％）または高張
食塩水（１４．４％）のエアロゾルを投与した。放射標識化トレーサ粒子を気管
に作製した０．５ｕｍの穴を介して与えた。食塩水（０．９％）または高張食塩
水（１４．４％）どちらかのエアロゾルは、Ｐａｒｉ加圧噴霧器によって作製し
た。エアロゾルを第２ランの前１分でスイッチを切った。ＴＭＶ測定に関する手
順は、Ｎｅｗｔｏｎら，「Ｃｉｌｉａ，Ｍｕｃｕｓ ａｎｄ Ｍｕｃｏｃｉｌｉ
ａｒｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｅｄ．，Ｂａｕｍ，Ｇ．Ｌ．，Ｐｒｅｉ
ｌ，Ｚ．，Ｒｏｔｈ，Ｙ．，Ｌｉｒｏｎ．，Ｏｓｔｆｉｅｌｄ，Ｅ．，Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０およびＰｅｄｉａｔｒｉｃ
Ｐｕｌｍｏｎｏｌｏｇｙ Ｓ１７，Ａｂｓ ３６４，１９９８でのＮｅｗｔｏｎ
らにて詳細に記載されている。
【０３１５】 結果 図１８に示したように、高張食塩水（１４．４％×５分間）は、エアロゾル直
後のＴＭＶの一過性の増加を引き起こした。
【０３１６】 実施例１５ モルモットでのＴＭＶにおけるアミロリドの効果 本研究の目的は、麻酔した自発的呼吸を行っているモルモットでのモルモット
気管粘液におけるアミロリド（１０ｍＭ×２０分間）の効果を調査することであ
った。この薬剤は、実施例１４で記載したように、エアロゾル化によって頭側気
管内に伝送した。本実施例で使用したＴＭＶ測定手順は、「Ｃｉｌｉａ，Ｍｕｃ
ｕｓ ａｎｄ Ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｅｄ．
，Ｂａｕｍ，Ｇ．Ｌ．ら，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１
９９８；Ｎｅｗｔｏｎら，Ｐｅｄ．Ｐｕｌｍ．Ｓ１７，Ａｂｓ．３６４，１９９
８においてＮｅｗｔｏｎらで記載されている。
【０３１７】 使用した物質および方法／薬剤 水中のアミロイド処方（１０ｍＭ）を本実施例のために調製した。Ｈｙｐｎｏ
ｒｍ（商標）（クエン酸フェンタニル０．３１５ｍｇ／ｍＬおよびフルアニゾン
１０ｍｇ／ｍＬ）はＪａｎｓｓｅｎ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈから入手し、
Ｈｙｐｎｏｖｅｌ（商標）（ミダゾラム５ｍｇ／ｍＬ）はＲｏｃｈｅから入手し
た。オスＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（５５０−７５０ｇ）はＤａ
ｖｉｄ Ｈａｌｌ，ＵＫより供給された。サーミスタプローブはＫａｎｅ−Ｍａ
ｙ Ｌｔｄ，ＵＫより入手した。
【０３１８】 気道粘液速度の測定 動物をＨｙｐｎｏｒｍ（商標）およびＨｙｐｎｏｖｅｌ（商標）を用いて麻酔
した。ＴＭＶを、実際には麻酔したモルモットの気管粘膜繊毛層上に移動させ、
３２Ｐ−標識化したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの注入
部分から放射された放射活性を検出するように配置した小型ベータ粒子検出検出
器プローブで平行にした導線を用いてモニターした。モルモットは０時点でＨｙ
ｐｎｏｒｍ（商標）およびＨｙｐｏｎｏｖｅｌ（商標）で麻酔した。アミロリド
（１０ｍＭ×２０分間）はエアロゾルによって投与した。最初のＴＭＶ測定を、
その直後に行い、続く測定を１５分ごとに行った。
【０３１９】 結果 図１９に示すように、アミロリド（１０ｍＭ×２０分間）は、エアロゾルの１
５分後にＴＭＶの統計学的に有意な増加を引き起こした。
【０３２０】 実施例１６ アプロチニン二重ムテインは培養ヒト気道上皮（ＨＢＥ）細胞短回路電流（Ｉ
ｓｃ）におけるナトリウム電流を減少させる。
【０３２１】 本研究の目的は、インビトロで、ＩｓｃにおけるＫｕｎｉｔｚファミリーセリ
ンプロテアーゼ阻害剤アプロチニン二重ムテインの効果を調査することであった
。交会まで増殖させ三次ＨＢＥ細胞単層を修正Ｕｓｓｉｎｇチャンバー上に載せ
、Ｋｒｅｂｓ緩衝液（ＫＢＲ）溶液内に浸し、３７℃まで暖めた９５％Ｏ２／５
％ＣＯ２でバブリングした。アプロチニン二重ムテインは、参照して全体に組み
込まれた、１９９８年１月２８日に発行された欧州特許第ＥＰ８２１ ００７号
の実施例１で記載されたＤｅｓ Ｐｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ａｒｇ１５−Ａｓｐ２
４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンである。
【０３２２】 細胞をバックグラウンドノイズおよび流体抵抗に関して較正する前に２０分間
平衡にさせたままにした。次いで経内皮電位差を、ＷＰＩ ＥＶＣ４０００電圧
クランプを用いて０ｍＶまでクランプした。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を使用してＩｓ
ｃをモニターした。一旦安定した基準線が得られたならば（典型的には１０−２
０分間）、細胞をアミロリド（１０ｕＭ）で処理した。一旦アミロリドへの応答
が見られたならば、ＫＢＲ溶液で洗浄した。基準線および平衡に戻った後、ビク
ニン（５ｕｇ／ｍＬ）、アプロチニン二重ムテイン（０．５−５ｕｇ／ｍＬ）、
アプロチニン（１．５−５ｕｇ／ｍＬ）またはＰＢＳを添加した。薬物処理の９
０分後、アミロリド（１０ｕＭ）を添加した。
【０３２３】 結果 図２０に示したように、アプロチニン二重ムテイン（０．５−５ｕｇ／ｍＬ）
は、９０分の期間にわたって、ヒト気管上皮細胞で、インビトロにおいてナトリ
ウム電流を用量依存的に阻害した。
【０３２４】 実施例１７ チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現した胎盤ビクニン（１−１
７０）の発現、精製および比較プロテアーゼ阻害活性 （ａ）ビクニンを発現する安定な、高産出ＣＨＯ細胞株の発展 多量のビクニンを分泌する安定産出細胞株を、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞に実
施例２７で示した発現ベクターをトランスフェクトして確立した。ベクターは標
準の組換え体ＤＮＡ技術を使用して構築した。発現ベクターおよびＣＨＯ細胞発
現系の構造の記載は、発明者Ｓａｍ Ｃｈａｎによる「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ
Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｂｉｋｕｎｉｎ（糖付加ビク
ニン産出の方法）」という題名で１９９９年１１月１２日に発行されたＵ．Ｓ．
Ｓ．Ｎ．０９／４４１，６５４号で見ることができる。簡便には、発現ベクター
ｐＢＣ−ＢＫは、早期プロモータのサイトメガロウイルスすぐ下流、およびポリ
アデニル化シグナル配列の上流にビクニンｃＤＮＡをクローニングすることで構
築した。発現ベクターｐＢＣ−ＢＫは、ビクニン、ジヒドロ葉酸リダクターゼお
よびアンピシリン耐性の転写単位からなる。ビクニンｃＤＮＡを制限酵素によっ
てクローニングベクターより放出させ、平滑末端化し、直線化したｐＢＣへライ
ゲーションした。ｐＢＣの直線化は、単一制限酵素消化によって行った。ビクニ
ンｃＤＮＡの方向を配列決定によって確認した。
【０３２５】 約１×１０６ ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞に、取扱説明書に
したがってＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ薬剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて１０μｇのｐＢＣ−ＢＫをトランス
フェクトした。次いで細胞を５０ｎＭメトトレキサートの存在下で選別し、チミ
ジンおよびヒポキサンチン＋５％透析したウシ胎児血清欠失ＤＭＥ／Ｆ１２培地
で増殖させた。細胞集団を発色アッセイでビクニン産出に関して選別した。簡単
には、ビクニン標準または培養液を、連続希釈し、等容量のカリクレインと共に
、発色基質Ｎ−ベンゾイル−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡを添加した後３０
分間、３７℃にてインキュベートした。反応液を５０％酢酸の添加前１５分間イ
ンキュベートした。放出されたｐ−ニトロアニリドの量を４０５ｎＭにて測定し
た。多量産出集団をさらに、増加させたメトトレキサートの濃度（１００−４０
０ｎＭメトトレキサート）を含んでいる培地中で選択し、ビクニンの産出につい
て選別した。次いで限界希釈クローニングを、高く、安定な産出性を持つクロー
ンを得るために適用した。クローニングを、９６ウェルプレート内に１細胞／ウ
ェルを入れることで、標準組織培養技術を用いてメトトレキサートのない状態で
行った。ＦＤ３−１と命名したクローンを、バイオリアクターでの生産性評価に
関して選択し、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに１９９９年１１月１２日に寄
託し、Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＰＴＡ−９４
０を割り当てられた。
【０３２６】 （ｂ）灌流バイオリアクターでのビクニンの血清なしでの産出 ビクニンの連続的産出を、連続的な灌流発酵によって行った。１．５リッター
Ｗｈｅａｔｏｎ発酵物に安定ＣＨＯ細胞株を２×１０６細胞／ｍｌ接種し、０．
５リッター／日の培地交換速度にて灌流した。産出培地は、インスリン（１０μ
ｇ／ｍｌ）およびＦｅＳＯ４・ＥＤＴＡ（５０μＭ）を含むＤＭＥ／Ｆ−１２基
礎培地であった。培養物の平均日収量は−２０ｍｇ／日であった。ビクニンの産
出は２１日間安定に保たれた。
【０３２７】 （ｃ）ＣＨＯ細胞発現系から産出したビクニン（１−１７０）の精製 ＣＨＯ細胞から産出したビクニンを、実施例２９にて概略したようなイオン交
換、金属キレートおよびサイズ排除クロマトグラフィを含む標準のクロマトグラ
フィ技術を用いて精製した。
【０３２８】 ＳＰカラム（１８×１０ｃｍ、２．５Ｌ）を、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ
ａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で調製し、平衡化した。冷えた濾過し
たＣＨＯ細胞採取物（ＴＣＦ）を、冷滅菌水で１：２．５に希釈し、ｐＨを５．
０にあわせた。クロマトグラフィを、冷緩衝液にて、室温にて行った。冷開始物
質を８００ｍＬ／分（１８９ｃｍ／時間）にてカラム上にのせた。カラムに載せ
たビクニンの量は０．８８８−１．９３８ｇ（およそ１４ｍｇ／Ｌ）の範囲であ
った。ローディングの後、カラムを平衡化緩衝液にて洗浄し、ビクニンを溶出緩
衝液で溶出した。溶出液を２−８℃（氷浴中）にて回収し、すぐに６Ｎ ＮａＯ
ＨでｐＨ７にあわせた。カラムを洗浄し、次いで冷（２−８℃）１Ｎ ＮａＯＨ
にて殺菌し、次回に使用するまで２０％エタノール中で２−８℃にて保存した。
平衡化および洗浄緩衝液は５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐ
Ｈ５．０を含み、溶出緩衝液は３５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ ４ 、ｐＨ５．０を含み、ｐＨ調節緩衝液は１Ｍクエン酸、１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４ 、ｐＨ２．４であった。
【０３２９】 陰イオン交換クロマトグラフィのための調製で行った、ダイアフィルトレーシ
ョン（ＤＦ）で容量を５−７倍まで少なくする前に、解凍したＳＰ−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ溶出液を、超濾過（ＵＦ）にておよそ１０倍まで濃縮した。すべての作
業は、水平フローフード内で、室温で行った。ＵＦ／ＤＦは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）からのＰｅｌｌｉｃｏｎ２「ミニ」フィルタ系およ
び２つの１０ｋＤａ再生セルロースカートリッジ（Ｐ２Ｃ０１０Ｃ０１）を使用
した。流速は、２−カートリッジ系に関しておよそ１３０±２０ｍＬ／分であり
、流入圧および流出圧をそれぞれ２２−２６ｐｓｉおよび１２−１６ｐｓｉに調
節することで維持した。循環は蠕動性ポンプで行い、再循環は、膜圧調節の前に
、５００−６００ｍＬ／分まで設定した。ダイアフィルトレーションは冷１０ｍ
Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ８．１で行った。
【０３３０】 Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィを以下のように行った。Ｑ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１３×９ｃ
ｍ、１．２Ｌカラムを５倍容量（ＣＶ）の滅菌水で洗浄し、およそ１０ＣＶの平
衡化緩衝液で平衡化した。ダイアフィルタ化したＳＰ溶出液をｐＨ８．１に合わ
せ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上に１００ｍＬ／分（４５ｃｍ／時間）で載
せた。カラム上にのせたビクニンの量は１１２１−２６０７ｍｇ（およそ１５ｍ
ｇ／ｍＬ）の範囲であった。ローディングの後、カラムをＡ２８０のＵＶ吸収が
基準線に達するまで平衡化緩衝液で洗浄し、次いでビクニンを溶出した。溶出液
を収集し、Ｚｎ−ＩＭＡＣ、亜鉛固定化金属イオン吸着クロマトグラフィのため
の種物質として使用した。カラムを１Ｍ ＮａＯＨで洗浄し、滅菌水ですすぎ、
２０％エタノール中で保存した。すべての操作は２−８℃にて行った。Ｑ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅカラムのための平衡化および洗浄緩衝液は１０ｍＭ ＮａＨ２Ｐ
Ｏ４、ｐＨ８．１を含んだ。溶出緩衝液は１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．１を含んだ。
【０３３１】 およそ２００ｍＬのベット容量のＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含んでいるＺｎ−ＩＭＡＣカラム
（５×１０ｃｍ）を、３容量のＺｎＳＯ４溶液（以下参照）で帯電させ、以下で
記載したような２容量の滅菌水で洗浄し、６容量の緩衝液で平衡化した。Ｑ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液をｐＨ７．４および（ＮａＣｌ固体の添加によって）３
００ｍＭ ＮａＣｌまで合わせ、３０ｍＬ／分（９２ｃｍ／時間直線速度）でＺ
ｎ−ＩＭＡＣにのせ、次いでカラムをＵＶ吸収が基準線に達するまで平衡化緩衝
液で洗浄した。カラムにのせたビクニンの量は０．０９７−１．６８１ｇ（およ
そ０．６３ｍｇ／ｍＬ）の範囲であった。フロースルーおよび洗浄液をＵＦのた
めに回収した。カラムを解体し、０．５Ｍ ＮａＯＨで殺菌した。この工程のす
べての操作は２−８℃にて行った。Ｚｎ−ＩＭＣＡのための平衡化緩衝液は１０
ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を含み、解体緩衝液
は５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．４を含み、帯電溶液は２ｍｇ／ｍＬ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏであった。
【０３３２】 Ｚｎ−ＩＭＡＣフロー−スルーをＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００クロマトグ
ラフィのためにＰｅｌｌｉｃｏｎ２系（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）での超濾過５倍に
よって濃縮した。浸透流速はおよそ６０−７０ｍＬ／分であり、上述したように
維持した。再循環は４００−５００ｍＬ／分であった。
【０３３３】 ４．５９ＬのＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉ
ｏｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むカラム（１０×５８．５ｃｍ）を、１３７ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、２．９ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｎ
ａＨ２ＰＯ４、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７
．２で平衡化した。流速は３０ｍＬ／分（２３ｃｍ／時間）であった。典型的な
ランでは、９５ｍＬの容量での１４７５ｍｇのビクニンをカラムにのせた。 Ｓ
−２００後のプールを、潜在的な発熱物質を取り除くためにバッチ法でＥｔｏｘ
樹脂で処理した。ＡｃｔｉＣｌｅａｎ Ｅｔｏｘ，２７０５樹脂（Ｓｔｅｒｏｇ
ｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を１Ｍ ＮａＯＨですすぎ
、室温で攪拌しながら１Ｍ ＮａＯＨ中で５時間インキュベートした。樹脂を洗
浄し、ＰＢＳ、ｐＨ７．２で平衡化した。８０ｍＬの濾過し、平衡化した樹脂を
１０６３ｍＬのビクニンＳ２００プール（５４６０．１１ｍｇ）に加え、一晩２
−８℃で攪拌した。次いでＥＴＯＸ樹脂を０．２ミクロンＮａｌｇｅｎｅフラス
コフィルタで濾過して取り除いた。
【０３３４】 結果、表１０は各工程によって供給された平均収率である。
【０３３５】
【表１２】
【０３３６】 ビクニンの総収率は９５％の純度で約３０％であった。質量分析データがまた
、全長ビクニン（１−１７０）分子に加えて、ビクニン（１−１７０）のカルボ
キシ末端からの３つ（Ｇ−Ｓ−Ｋ）および４つ（Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｋ）のアミノ酸を
欠く種が、純粋なタンパク質プール中に存在することを示唆した。産出された物
質は、室温または３７℃、中性ｐＨでの７２時間インキュベーションにさらした
時に分解に安定であることが示された。Ｎ−末端配列決定、ゲル電気泳動、免疫
ブロッティングおよびアミノ酸解析により、ビクニンは本質的に純粋（他の配列
が検出されない）ことが示唆された。さらなる逆相クロマトグラフィ工程は、Ｃ
ＨＯ由来精製ビクニンが、まだいくつかの種類に分画できることを明らかにした
（図３０Ａ）。ＣＨＯビクニン（８．５ｍｇ）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、０
．１％最終濃度）でｐＨ２．５まで合わせ、１７．５％アセトニトリルおよび０
．１％ＴＦＡで平衡化したＣ１８逆相カラム（Ｖｙｄａｃ、２．５×２５ｃｍ）
上で、流速２ｍｌ／分でのクロマトグラフィにかけた。ＣＨＯビクニンを、６０
分間かけて０．１％ ＴＦＡ中の１７．５−４０％アセトニトリルの直線勾配で
溶出した。図３０Ｂはこれらの画分の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ図を示している（
５４と５５の間のレーンは分子量マーカを示している）。
【０３３７】 予備的な糖鎖解析を、約２１ｋＤａ−約３８ｋＤａの範囲のＭＷを持つＣＨＯ
ビクニンの糖付加アイソフォームで行った。総糖鎖含量は７．５％であるとわか
った。両方のＮ−型結合部位（Ａｓｎ−３０およびＡｓｎ−６７）が、糖構造に
よって占有されていることがわかった。クロマトグラフィおよび質量分析解析で
、高い異質性および精製ビクニンに関して観察された大きさの異質性に寄与して
いる高分岐オリゴサッカライド構造の存在が確かめられた。約９０％のオリゴサ
ッカライドがシアル酸付加しており、残りの構造は中性であった。Ｎ−グリコシ
ダーゼＦで処理した場合、ＣＨＯビクニンの糖付加アイソフォーム（図３０Ｂ）
は単一の１８ｋＤａアイソフォームに変換された（図３１参照）。
【０３３８】 ビクニンのシアル酸含量を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０中でシ
アリダーゼと一緒の、ふたをしたマイクロヒュージチューブ内での１８時間のイ
ンキュベーションによって解析した。シアル酸を、１ｍｌ／分の流速での５０分
間の１００ｍＭ ＮａＯＨ中の２０−２５０ｍＭ酢酸ナトリウムの緩衝液勾配を
用いたＣａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ１陰イオン交換カラム上で分離した。検出は、
パルス電気化学検出器で行い、試料の保持時間およびピーク面積の標準シアル酸
（Ｎ−アセチルノイラミン酸およびＮ−グルタリルノイラミン酸）に対する比較
で定量した。結果は表１１に示している。
【０３３９】
【表１３】
【０３４０】 実施例１８ チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に発現した胎盤ビクニン（１−１
７０）の比較プロテアーゼ阻害活性 概要。組換え体ビクニンのインビトロ特異性を、実施例３、４、７および１０
に記載したような物質および方法を用いて測定した。以下の表１２は、インビト
ロでの様々なセリンプロテアーゼの阻害剤としての組換え体ビクニンの効力を示
している。データは、組換え体ビクニンまたはアプロチニンのどちらかを用いて
示している。
【０３４１】 プロテアーゼ。ヒトプラスミンおよびヒト血漿カリクレイン定量を、既に記載
したように（Ｃｈａｓｅ，Ｔ．，およびＳｈａｗ，Ｅ．，（１９７０）Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｍｏｌ．１９，２０−２７）、ｐ−ニトロフェニルｐ’−グアニ
ジンベンゾエートＨＣｌを用いて活性部位滴定で実施した。ヒト組織カリクレイ
ン（Ｂａｙｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、標準としてウシアプロチニン、１：１複
合体形成をとる基質としてＰＦＲ−ＡＭＣを使用して活性部位滴定によって定量
した。使用した条件下でのプラスミンによるＧＰＫ−ＡＭＣに対するＫｍは７２
６μＭであり、ヒト血漿カリクレインでのＰＦＲ−ＡＭＣに対するＫｍは４５７
ｍＭであり、ヒト組織カリクレインでのＰＦＲ−ＡＭＣに対するＫｍは５．７μ
Ｍであった。
【０３４２】 阻害速度論。ヒトププラスミンのＣＨＯ発現胎盤ビクニン（１−１７０）およ
びアプロチニンによる阻害を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０
．１Ｍ ＮａＣｌ、および０．０２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液中
のプラスミン（５０ｐＭ）およびＣＨＯ発現胎盤ビクニン（１−１７０）（０−
２ｎＭ）またはアプロチニン（０−４ｎＭ）で測定した。３７℃でのインキュベ
ーションの３０分後、２５μｌの２０ｍＭ ＧＰＫ−ＡＭＣを添加し、蛍光の変
化をモニターした。ＣＨＯ発現胎盤ビクニン（１−１７０）またはアプロチニン
によるヒト血漿カリクレインの阻害を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中のカ
リクレイン（０．２ｎＭ）およびＣＨＯ発現胎盤ビクニン（１−１７０）（０−
４ｎＭ）またはアプロチニン（０−４５ｎＭ）を用いて測定した。３７℃での３
０分後、５μｌの２０ｍＭ ＰＦＲ−ＡＭＣを添加し、蛍光の変化をモニターし
た。
【０３４３】 アプロチニンまたはＣＨＯ発現胎盤ビクニン（１−１７０）によるヒト組織カ
リクレインの阻害を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、および０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１ｍｌ反応容量
中で、０．３５ｎＭヒト組織カリクレインをＣＨＯ発現胎盤ビクニン（１−１７
０）（０−１０ｎＭ）またはアプロチニン（０−０．５ｎＭ）とインキュベーシ
ョンすることで測定した。３７℃にて５分後、最終濃度１０ｕＭになるように５
ｕｌの２ｍＭ ＰＦＲ−ＡＭＣを添加し、蛍光の変化をモニターした。
【０３４４】 第ＸＩａ因子（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｂ
ｅｎｄ，ＩＮ）の阻害を、総容量１ｍｌの５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、
１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎｘ−１
００および１％ ＢＡＳを含む緩衝液内で、ＦＸＩａを０−４ｕＭのＣＨＯ発現
胎盤ビクニン（１−１７０）または０−４ｕＭのアプロチニンと共にインキュベ
ーションすることで測定した。３７℃にて３０分後、１０ｕｌの４０ｍＭ Ｂｏ
ｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）を添加し、蛍光の変化
をモニターした。
【０３４５】 明白な阻害定数Ｋｉ＊を非直線回帰データ解析プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒ
ソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｎｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて決定した
。それぞれの実験からの速度論的データは、強い結合阻害剤に関する方程式によ
って解析した。
【０３４６】
【数５】 Ｖｉ／Ｖ０＝１−（Ｅ０＋Ｉ０＋Ｋｉ ＊−［（Ｅ０＋Ｉ０＋Ｋｉ ＊）２ −４Ｅ０Ｉ０］１／２）／２Ｅ０ （２）
【０３４７】 式中Ｖｉ／Ｖ０は分数酵素活性（阻害対非阻害比）であり、Ｅ０およびＩ０は
それぞれ酵素および阻害剤の総濃度であり、Ｋｉ値は方程式
【０３４８】
【数６】 Ｋｉ＝Ｋｉ ＊／（１＋［Ｓ０］／Ｋｍ） （３）
【０３４９】 による基質の効果に関する補正によって得た。（Ｂｏｕｄｉｅｒ，Ｃ．，ａｎ
ｄ Ｂｉｅｔｈ，Ｊ．Ｇ．，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａ
ｃｔａ．９９５：３６−４１）。
【０３５０】 結果：Ｋｉ値は以下の表１２に挙げる。
【０３５１】
【表１４】
【０３５２】 結果は、少なくとも３つの異なるセリンプロテアーゼに対して効果的な活性プ
ロテアーゼ阻害剤を産出するために、組換え体ビクニンをＣＨＯ細胞に発現させ
ることができることを示している。組換え体ビクニンは、ヒト血漿カリクレイン
およびヒトＦＸＩａに対して、アプロチニンよりも強力であった。ヒト血漿を阻
害する点は、アプロチニンと等しい効力を持った。
【０３５３】 実施例１９ アプロチニンは、インビトロで、ヒト培養嚢胞性線維症気管上皮細胞短回路電
流（Ｉｓｃ）でのナトリウム電流を減少させる。 ＨＢＥ細胞をＣＦ患者肺移植組織から単離し、１週間コラーゲンコートしたフ
ラスコで培養した。次いで細胞を継代し、コラーゲンコートしたＣｏｓｔａｒ
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌフィルタ（０．３３ｃｍ２）上にまき、２％ Ｕｌｔｒｏｓ
ｅｒ Ｇを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で増殖させた。細胞を空気液体境界にて
培養させ、播種後２−４週間使用した。
【０３５４】 Ｔｒａｎｓｗｅｌｌフィルタ上の細胞を、修正Ｃｏｓｔｅｒ Ｕｓｓｉｎｇチ
ャンバー内にのせ、Ｉｓｃ条件下で試験した。基準線Ｉｓｃ値を記録し（０−１
０分間）、次いでアプロチニン（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）をアピカル側に添加し
た。Ｉａｃを１００分間記録し、次いでアピカル側浴流体を新鮮な培養液に交換
した。トリプシン（１００ＢＡＥＥ単位／ｍＬ）をアピカル側に添加し、Ｉｓｃ
をさらに１０分間記録した。次いで、アミロリド（１０ｕＭ）をアピカル側に添
加し、Ｉｓｃをさらに１０分間記録した。
【０３５５】 結果 図２１に示したように、アプロチニン（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）は、１００分
間にわたってヒトＣＦ気管上皮細胞でインビトロにてＩｓｃを阻害した。洗浄後
、Ｉｓｃはセリンプロテアーゼであるトリプシンでのアピカル表面の処理によっ
て増加した。最終的に、アミロリド（１０ｕＭ）の添加が、Ｉｓｃの変化が、ナ
トリウム依存電流での変化の結果であったことを示唆していた。
【０３５６】 実施例２０ 噴霧化後のビクニン（１−１７０）の活性の査定 本研究の目的は、噴霧化後の実施例１７に記載したビクニン（１−１７０）の
抗プロテアーゼ活性を査定することであった。すべての研究は、リン酸緩衝食塩
水、ｐＨ７．４（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ ４ 、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０２ｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ８０）内で処方した
ビクニンで行った。
【０３５７】 噴霧化の方法 Ｒａｉｎｄｒｏｐ（商標）薬剤噴霧器：ビクニンを１および３ｍｇ／ｍＬの濃
度でエアロゾル化した。噴霧器のふたを２．５ｍＬのビクニン溶液で満たした。
エアロゾル化を７．３５Ｌ／分または３５ｐｓｉで行った。
【０３５８】 Ｃｏｌｌｉｓｏｎ噴霧器：ビクニンを４．７ｍｇ／ｍＬの濃度でエアロゾル化
した。噴霧器のふたを２．５ｍＬのビクニン溶液で満たした。エアロゾル化を３
５ｐｓｉで行った。
【０３５９】 噴霧した試料の回収 エアロゾル化したビクニンを、対のインピンジャー（６０Ｌ／分で本系を通し
た、６．４ｕｍ平均空気力学粒子カットオフサイズ）を使用して回収した。イン
ピンジャーは、液体衝撃の原理で働き、エアロゾルを呼吸不可能な画分（段階１
で回収した＞６．４ｕｍ）および呼吸可能な画分（段階２で回収した＜６．４ｕ
ｍ）に分けた。
【０３６０】 抗プロテアーゼ活性の測定 ビクニン活性を、ヒト血漿カリクレインのその阻害によってインビトロで測定
した。
【０３６１】 結果 Ｒａｉｎｄｒｏｐ（商標）薬剤噴霧器：噴霧化前後試料に対する活性（Ｋｉ）
値は以下のようであった。１ｍｇ／ｍＬビクニン：Ｋｉ値はそれぞれ０．４７（
±０．０２）および０．７６（±０．０４）であり、３ｍｇ／ｍＬビクニン（１
−１７０）に関して、Ｋｉ値はそれぞれ０．５２（±０．０３）および０．６２
（±０．０３）であった。
【０３６２】 Ｃｏｌｌｉｓｏｎ噴霧器：噴霧化前後試料に対する活性（Ｋｉ）値はそれぞれ
０．２７（±０．０３）および０．４５（±０．０３）であった。
【０３６３】 結論： ＲａｉｎｄｒｏｐおよびＣｏｌｌｉｓｏｎ噴霧器からの噴霧化前後ビ
クニン試料は、同様の活性（アッセイ量内で同様のＫｉ値）を示し、このことは
ビクニン（１−１７０）が、エアロゾル化で安定であり、噴霧後その抗プロテア
ーゼ活性を残していることを示唆している。
【０３６４】 実施例２１ ヒツジでの気管粘液流速におけるビクニンの効果 本研究の目的は、処置後８時間にわたるヒツジ気管粘液流速における、実施例
１７で記載したＫｕｎｉｔｚファミリーセリンプロテアーゼ阻害剤ビクニン（１
−１７０）の効果を調査することであった。この薬剤を噴霧化エアロゾル投与に
よって気道に伝送した。本実施例で使用した手順は、Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら，Ｊ
．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５（３），１０８６−１０９１，１９９
８に記載されている。
【０３６５】 ＴＭＶの測定 成体オスヒツジを特殊化した体装置で頭を固定化し、直立状態にしたままにし
た。これらに声帯の直下に配置したカフスにて鼻から気管内管で挿管した。吸気
を暖め、湿らせた。膨張させたカフスによって引き起こされたＴＭＶの可能性あ
る障害を最小化するために、残っている気管内管カフスを、エアロゾル投与の期
間を除いて、研究を通して収縮させた。
【０３６６】 ＴＭＶを測定するために５−１０放射パックＴｅｆｌｏｎ粒子（直径およそ１
ｍｍ、厚さ０．８ｍｍ、重さ１．５−２ｍｇ）を気管内管内に配置したカテーテ
ルを介して気管内に挿管した。次いでＴｅｆｌｏｎ粒子の移動を１分間隔にわた
って測定した。本実施例で使用した手順は、Ｒｕｓｓｉら，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｐｙｓｉｏｌ．５９（５），１４１６−１４２２，１９８５に記載されている
。既知の長さの放射パックマーカを含む首輪を動物の外部に適用し、ビデオスク
リーン上で粒子によって横断した距離を移動した実際の距離に変換するのに標準
として使用した。ＴＭＶを、５−１０のＴｅｆｌｏｎ粒子に関して分あたりに移
動した頭側方向での平均距離より計算した。基準線ＴＭＶをエアロゾルの投与直
前に測定した。
【０３６７】 試験基質；ＰＢＳ、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬビクニンまたはＰＢＳ中３ｍｇ／ｍ
Ｌビクニンを、３．６ｕｍの重量メディアン空気力学直径の小滴を産出する流速
にて操作されたＲａｉｎｄｏｒｏｐジェット噴霧器を使用して作製されたエアロ
ゾル（３ｍＬ）として、ヒツジ気道に伝送した。ＴＭＶを、試験基質を投与した
直後（０時）に測定、次いで０．５、１、２、３、４、５、６、７および８時に
測定した。
【０３６８】 結果 図２２に示したように、ヒツジ気道に伝送された９ｍｇのビクニンエアロゾル
（３ｍｇ／ｍＬの３ｍＬ）は、ＰＢＳ賦形剤エアロゾルを与えた動物の群に対す
る同時点と比較して、０、０．５、１、２、３、４、５、６、７および８時間の
時点で有意にＴＭＶを増加させた。２４時間の時点でＴＭＶは、ビクニン処理お
よびＰＢＳ賦形剤群両方で基準線速度まで戻った。
【０３６９】 より低用量（３ｍｇ ビクニンエアロゾル（１ｍｇ／ｍＬの３ｍＬ）では、試
験したどの時間点でも処理および賦形剤群管でＴＭＶは観察されなかった。
【０３７０】 実施例２２ ビクニン（５０ｕｇ／ｍＬ）は、培養モルモット気道上皮（ＧＰＴＥ）細胞短
回路電流（Ｉｓｃ）でのナトリウム電流を減少させる
【０３７１】 本研究の目的は、インビトロでのＧＰＴＥ細胞上のＩｓｃにおけるビクニン（
１−１７０）（実施例１７を参照）の効果を調査することであった。ＧＰＴＥ細
胞を１．２ｃｍ直径、０．４ｕｍポアサイズＳｎａｐｗｅｌｌ（商標）インサー
ト（Ｃｏｓｔａｒ ＵＫ）上にまいた。細胞を交会まで増殖させ、空気−液体境
界上に置いた後に２−４日、修正Ｕｓｓｉｎｇチャンバー内にのせた。インサー
トをＫｒｅｂｓ緩衝（ＫＢＲ）溶液内に浸し、３７℃まで暖めた９５％ Ｏ２／
５％ ＣＯ２でバブリングした。
【０３７２】 ２０分の平衡期間の後、経上皮電圧差を、ＷＰＩ ＥＶＣ４０００電圧クラン
プを用いて０ｍＶまでクランプした。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を、Ｉｓｃをモニター
するのに使用した。一旦安定な基準線が得られたならば（一般的に２０−３０分
間）、細胞をアミロリド（３０ｕＭ）で処理した。一旦アミロリドへの反応を得
られたならば、ＫＢＲ溶液で洗浄した。基準線および平衡へ戻ったならば、実施
例１７で記載したビクニン（１−１７０）（１０−５０ｕｇ／ｍＬ）またはＰＢ
Ｓを添加した。薬剤処理後３０分間、アミロリド（３０ｕＭ）を添加した。
【０３７３】 結果 図２３に示したように、ビクニン（１−１７０）（５０ｕｇ／ｍＬ）は、３０
分間にわたってモルモット気管上皮細胞でのインビトロのナトリウム電流を阻害
した。
【０３７４】 実施例２３ ビクニン（１−１７０）（１００ｕｇ／ｍＬ）は、培養ヒツジ気道上皮（ＯＴ
Ｅ）細胞短回路電流（Ｉｓｃ）でのナトリウム電流を減少させる 本研究の目的は、インビトロでのＯＴＥ細胞中のＩｓｃにおける、ビクニン（
１−１７０）（実施例１７を参照）の効果を調査することであった。ＯＴＥ細胞
を１．２ｃｍ直径、０．４ｕｍポアサイズＳｎａｐｗｅｌｌ（商標）インサート
（Ｃｏｓｔａｒ ＵＫ）上にまいた。細胞を交会まで増殖させ、空気−液体境界
上に置いた後に３−５日、修正Ｕｓｓｉｎｇチャンバー内にのせた。インサート
をＫｒｅｂｓ緩衝（ＫＢＲ）溶液内に浸し、３７℃まで暖めた９５％Ｏ２／５％
ＣＯ２でバブリングした。
【０３７５】 ２０分の平衡期間の後、経上皮電圧差を、ＷＰＩ ＥＶＣ４０００電圧クラン
プを用いて０ｍＶまでクランプした。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を、Ｉｓｃをモニター
するのに使用した。一旦安定な基準線が得られたならば（一般的に３０分間）、
細胞をアミロリド（１０ｕＭ）で処理した。一旦アミロリドへの反応を得られた
ならば、ＫＢＲ溶液で洗浄した。基準線および平衡へ戻ったならば、実施例１７
で記載したビクニン（２５、５０または１００ｕｇ／ｍＬ）またはＰＢＳを添加
した。薬剤処理後９０分間、アミロリド（１０ｕＭ）を再び添加した。
【０３７６】 結果 図２４に示したように、ビクニン（１−１７０）（１００ｕｇ／ｍＬ）は、９
０分間にわたってヒツジ気管上皮細胞でのインビトロのナトリウム電流を阻害し
た。
【０３７７】 実施例２４ ＬＰＳで前処理したモルモットでの気管電位差におけるビクニン（１−１７０
）の効果 気道炎症を支配する多形核（ＰＭＮ）白血球（好中球）はしばしばＣ
Ｆ肺疾患の特徴である。モルモットにおいて、大腸菌リポポリサッカライド（Ｌ
ＰＳ）のエアロゾルへの曝露は、チャレンジの後２４時間での気管支肺胞洗浄液
での明らかなＰＭＮ流入を誘導する。本研究の目的は、ＬＰＳのエアロゾルに前
曝露したモルモットにおける気管電位差における、実施例１７に記載したビクニ
ン（１−１７０）の効果を調査することであった。薬剤は局所滴下によって頭側
気管内へ伝送した。ＴＰＤをＬＰへの曝露２３時間後、６０分間モニターした。
【０３７８】 物質／薬剤 ビクニン（１−１７０）を、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）内で処方した。
アミロリドはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓより得、ＨＢＳＳ内に処方した。
ビヒクル対照はＨＢＳＳであった。Ｈｙｐｎｏｒｍ（フェンタニルクエン酸０．
３１５ｍｇ／ｍＬおよびフルアニゾン１０ｍｇ／ｍＬ）はＪａｎｓｓｅｎ Ａｎ
ｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈから入手し、Ｈｙｐｎｏｖｅｌ（商標）（ミダゾラム５
ｍｇ／ｍＬ）はＲｏｃｈｅから入手した。オスＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモ
ルモット（６００−７５０ｇ）はＤａｖｉｄ Ｈａｌｌ，ＵＫより供給された。
サーミスタプローブはＫａｎｅ−Ｍａｙ Ｌｔｄ，ＵＫより入手した。
【０３７９】 ＰＭＮ流入の誘導 個々の動物を１０分間、０．０３ｍｇ／ｍＬのＬＰＳまたはＰＢＳのエアロゾ
ルに曝露した。
【０３８０】 気管電位差に対する測定のためのモルモットの調製 ＬＰＳ処理の２３．４時間後、モルモットをＨｙｐｏｒｍとＨｙｐｎｏｖｅｌ
で麻酔し、仰向け状態で固定した。腹部中線切開を、下顎から鎖骨までで行った
。鈍解剖具を用いて、気管の全長を曝露し、鎖骨の上端で二等分した。外部頸動
脈をさらしてカニューレを挿入した。次いで尾側の気管にカニューレを挿入し、
動物に部屋の空気で自発的に呼吸させた。次いで動物を仰向けに置き、体温を熱
ランプを用いて３７℃に保った。直腸温度をサーミスタプローブでモニターした
。
【０３８１】 麻酔の導入後２０分、ビクニン（５０ｕｇ／ｍＬ）またはアミロリド（１００
ｕＭ）を頭側気管内に局所的に滴下した。次いで気管寒天電極を頭側の気管に挿
入し、気管電位差を６０分間測定した。対照電極は、気管軟骨に結合させて頭側
気管の下に配置した。傷部分を乾燥を防ぐために覆った。
【０３８２】 結果 図２５（ａ）に示すように、ＬＰＳへの曝露は、有意なＰＭＮ流入を引き起こ
した。ビクニンは、図２５（ｂ）で示したように、ＬＰＳに前曝露したモルモッ
トでの電位差異を有意に阻害した。
【０３８３】 実施例２５ モルモットでの気管粘液速度におけるアプロチニン二重ムテインの効果 本研究の目的は、処理１５．時間後でのモルモット気管粘液速度における実施
例１６で記載したアプロチニン二重ムテインの効果を調査することであった。こ
の薬剤は局所滴下によって頭側気道内に伝送した。ＴＭＶを１．５時間後に６０
分間モニターした。
【０３８４】 物質／薬剤 アプロチニン二重ムテイン（実施例１６を参照）は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅ、Ｂａｙｅｒ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ ＵＳＡより入手し、ハンクス平衡
溶液（ＨＢＳＳ）内で処方した。Ｈｙｐｎｏｒｍ（フェンタニルクエン酸０．３
１５ｍｇ／ｍＬおよびフルアニゾン１０ｍｇ／ｍＬ）はＪａｎｓｓｅｎ Ａｎｉ
ｍａｌ Ｈｅａｌｔｈから入手し、Ｈｙｐｎｏｖｅｌ（商標）（ミダゾラム５ｍ
ｇ／ｍＬ）はＲｏｃｈｅから入手した。オスＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモル
モット（６００−７５０ｇ）はＤａｖｉｄ Ｈａｌｌ，ＵＫより供給された。サ
ーミスタプローブはＫａｎｅ−Ｍａｙ Ｌｔｄ，ＵＫより入手した。
【０３８５】 麻酔の導入 動物をハロタンを使用して麻酔した。一旦麻酔が十分なレベル導入されたなら
ば、小切開を下顎の下で行った。気管をさらし、１００ｕｌ容量の賦形剤、アプ
ロチニン二重ムテイン（１０ｕｇ）をニードルおよびシリンジを用いて気管表面
上に一滴ずつ垂らした。一旦注入したならば、気管注入部位を覆う皮膚を修繕し
た。次いで動物を回復させた。
【０３８６】 気道粘液速度（ＴＭＶ）の測定 気管粘液速度（ＴＭＶ）を、実際には麻酔したモルモットの気管粘膜繊毛層上
に移動させ、リン３２Ｐ−標識化したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅの注入部分から放射された放射活性を検出するように配置した小型ベ
ータ粒子検出検出器プローブで平行にした導線を用いてモニターした（Ｎｅｗｔ
ｏｎおよびＨａｌｌ １９９８）。試験薬剤の滴下後７０分に、モルモットをＨ
ｙｐｎｏｒｍおよびＨｙｐｎｏｖｅｌで第２麻酔し、仰向け状態に固定した。第
１ＴＭＶ測定をその後２０分間行った。
【０３８７】 結果 図２６で示したように、アプロチニン二重ムテイン（１０ｕｇ）は、投与後１
．５−２．５時間の保持期間にわたって、ＨＢＳＳに対して、インビボで、モル
モットでのＴＭＶを増加させた。
【０３８８】 実施例２６ ビクニン（１−１７０）は、インビトロでの培養ヒト嚢胞性線維症気管上皮細
胞短回路電流（Ｉｓｃ）でのナトリウム電流を減少させる ＨＢＥ細胞をＣＦ患者肺移植組織から単離し、１週間コラーゲンコートしたフ
ラスコで培養した。次いで細胞を継代し、コラーゲンコートしたＣｏｓｔａｒ
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌフィルタ（０．３３ｃｍ２）上にまき、２％ Ｕｌｔｒｏｓ
ｅｒ Ｇを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で増殖させた。細胞を空気液体境界にて
培養させ、播種後２−４週間使用した。
【０３８９】 Ｔｒａｎｓｗｅｌｌフィルタ上の細胞を、修正Ｃｏａｓｔｅｒ Ｕｓｓｉｎｇ
チャンバー内にのせ、Ｉｓｃ条件下で試験した。基準線Ｉｓｃ値を記録し（０−
２０分間）、次いでビクニン（１−１７０）（実施例１７を参照のこと）（ＰＢ
Ｓ中１０ｕｇ／ｍＬ）をアピカル側に添加した。Ｉａｃを９０分間記録し、次い
でアミロリド（１０ｕＭ）を添加し、Ｉｓｃをさらに１０分間記録した。次いで
アピカル側浴流体を新鮮な培養液に交換し、Ｉｓｃをさらに１５分間記録した。
トリプシン（１ｕＭ）をアピカル側に添加し、Ｉｓｃを１５分間記録した。次い
でアミロリド（１０ｕＭ）をアピカル側に加え、Ｉｓｃをさらに１０分間記録し
た。
【０３９０】 結果 図２８（ａ）で示すように、ビクニン（１−１７０）（ＰＢＳ中１０ｕｇ／ｍ
Ｌ）は、９０分の期間にわたってヒトＣＦ気管上皮細胞でのインビトロでのＩｓ
ｃを阻害した。Ｉｓｃはさらにアミロリド（１０ｕＭ）の添加によって減少した
。洗浄に際し、Ｉｓｃはアミロリドの添加前の電流まで増加して戻った。さらに
１５分後、アピカル側表面をトリプシン（１ｕＭ）で処理し、これによりさらに
Ｉｓｃが基準線電流レベルまで増加した（すなわち、２０分の時点で観察された
）。最後に、アミロリド（１０ｕＭ）の添加により大部分の電流が阻害され、Ｉ
ｓｃの変化がナトリウム依存電流の変化の結果とあることが示唆された。
【０３９１】 図２８（ｂ）は、１、５および１０ｕｇ／ｍＬでのビクニン（１−１７０）お
よび２０ｕｇ／ｍＬのアプロチニンが、インビトロでヒトＣＦ気管上皮細胞への
アピカル適用後９０分の時点でＩｓｃを阻害したことを示している。
【０３９２】 本発明の特定の実施様態を例示の目的で詳述したが、本明細書で記載した方法
および処方は、本発明の意図および範囲を逸脱しない限り修正されてよいことが
当業者に容易に明らかになるであろう。したがって、本発明は付随する特許請求
によること以外で制限されない。
【０３９３】 配列表のフリーテキスト
【０３９４】 ＜２１０＞９ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”６２２，６７９，７０７のｎはヌクレオチドのいず
れかの部位”
【０３９５】 ＜２１０＞１０ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”２０１，２２６，及び２３３のＸａａはナンセンス
コドンあるは終結コドン”
【０３９６】 ＜２１０＞１１ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”８，１７，２１−２６，４０，４２，４５−４７，
５２，６４，１０３，１１２，１１４，１１６−１２１，１３５，１３７，１４
０−１４２，１４７，及び１５９のＸａａはアミノ酸残渣のいずれか”
【０３９７】 ＜２１０＞１２ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”３６１の残渣はヌクレオチドのいずれかの部位” ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”３６７の残渣はヌクレオチドのいずれかの部位” ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”３８４の残渣はヌクレオチドのいずれかの部位” ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”３９０の残渣はヌクレオチドのいずれかの部位”
【０３９８】 ＜２１０＞１３ ＜２２３＞／ｌａｂｅｌ＝シグナルペプチド ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”１１１，１２０，１２２，１２８，及び１３０のＸ
ａａはナンセンスコドンあるは終結コドンを表す”
【０３９９】 ＜２１０＞１４ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”４２５，４８２，及び５１０のｎはのヌクレオチド
のいずれかの部位”
【０４００】 ＜２１０＞１５ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”２，２３，１３２，１６０，及び１６７のＸａａは
ナンセンスコドンあるは終結コドンを表す”
【０４０１】 ＜２１０＞１６ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”３，１１，１２，１７，５１，及び４２９のｎはヌ
クレオチドのいずれかの部位を表す”
【０４０２】 ＜２１０＞１７ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”６，３１０，及び４０８のｎはヌクレオチドのいず
れかの部位を表す”
【０４０３】 ＜２１０＞１８ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”組織因子経路阻害剤前駆対１”
【０４０４】 ＜２１０＞１９ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”組織因子経路阻害剤前駆対１”
【０４０５】 ＜２１０＞２０ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”組織因子経路阻害剤前駆対”
【０４０６】 ＜２１０＞２１ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”組織因子経路阻害剤前駆対２”
【０４０７】 ＜２１０＞２２ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”組織因子経路阻害剤前駆対２”
【０４０８】 ＜２１０＞２３ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”アミロイド前駆体タンパク質相同体”
【０４０９】 ＜２１０＞２４ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”アプロチニン”
【０４１０】 ＜２１０＞２５ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”内部−α−トリプシン阻害剤前駆体”
【０４１１】 ＜２１０＞２６ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”内部−α−トリプシン阻害剤前駆体”
【０４１２】 ＜２１０＞２７ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”アミロイド前駆体タンパク質”
【０４１３】 ＜２１０＞２８ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”コラーゲンα−３（ＶＩ）前駆体”
【０４１４】 ＜２１０＞２９ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ＨＫＩ−Ｂ９”
【０４１５】 ＜２１０＞３２ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
【０４１６】 ＜２１０＞４５ ＜２２３＞／ｌａｂｅｌ＝シグナルペプチド
【０４１７】 ＜２１０＞４７ ＜２２３＞／ｌａｂｅｌ＝シグナルペプチド
【０４１８】 ＜２１０＞４９ ＜２２３＞／ｌａｂｅｌ＝シグナルペプチド
【０４１９】 ＜２１０＞５０ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
【０４２０】 ＜２１０＞５１ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
【０４２１】 ＜２１０＞５２ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
【０４２２】 ＜２１０＞５３ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質のシグナルペプチド”
【０４２３】 ＜２１０＞５４ ＜２２３＞ヒトビクニンタンパク質断片
【０４２４】 ＜２１０＞５５ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”構造表示開始のためのオリゴマー”
【０４２５】 ＜２１０＞５６ ＜２２３＞構造表示開始のためのオリゴマー
【０４２６】 ＜２１０＞５７ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”構造発現開始のためのオリゴマー”
【０４２７】 ＜２１０＞５８ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”構造発現開始のためのオリゴマー”
【０４２８】 ＜２１０＞６１ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ビクニン構造発現開始のためのオリゴマー”
【０４２９】 ＜２１０＞６２ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ビクニン構造開始のためのオリゴマー”
【０４３０】 ＜２１０＞６３ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
【０４３１】 ＜２１０＞６４ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
【０４３２】 ＜２１０＞６５ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
【０４３３】 ＜２１０＞６６ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
【０４３４】 ＜２１０＞６７ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
【０４３５】 ＜２１０＞６８ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
【０４３６】 ＜２１０＞６９ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
【０４３７】 ＜２１０＞７０ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
【０４３８】 ＜２１０＞７１ ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＥＳＴ Ｒ３５４６４（配列番号：１２）のヌクレオチド配列および
このＤＮＡ配列の翻訳（配列番号：１３）を描き、アプロチニンに対して同じ配
列類似性を示すオープンリーディングフレームを生じる。翻訳産物は、Ｋｕｎｉ
ｔｚ様阻害剤ドメイン（太字で示される）についての特徴である訂正空間中に６
つのシステインのうちの５つを含む。残りのシステイン（コドン３８で）によっ
て正常に占められる部分は、代わりにフェニルアラニン（＊によって示される）
を含有した。
【図２】 図２は、ＥＳＴ Ｒ７４５９３（配列番号：１４）のヌクレオチド配列および
このＤＮＡ配列の翻訳（配列番号：１５）を描き、Ｋｕｎｉｔｚクラスのセリン
プロテアーゼ阻害剤ドメインに類似を示すオープンリーディングフレームを生じ
る。翻訳産物は、Ｋｕｎｉｔｚ様阻害剤ドメイン（太字で示される）についての
特徴である訂正空間中に６つのシステインを含む。しかし、このリーディングフ
レーム配列は、コドン３および２３で終止コドンを示す。
【図３】 図３は、ヒト胎盤ビクニン（配列番号：９）標識「共通」の推定核酸配列を描
き、そして翻訳タンパク質アミノ酸配列標識「翻訳物」（配列番号：１０）に適
合した。さらに、比較されるとおり、ＥＳＴ Ｈ９４５１９（配列番号：１６）
、Ｎ３９７９８（配列番号：１７）、Ｒ７４５９３（配列番号：１４）およびＲ
３５４６４（配列番号：１２）についての核酸配列と示された。共通配列中の下
線付きヌクレオチドは、実施例で記載されるＰＣＲプライマーの部位に対応する
。翻訳共通配列中の下線付きアミノ酸は、その認識が、精製された生来のヒト胎
盤ビクニンのアミノ酸配列決定によって確認された残渣である。ヌクレオチドお
よびアミノ酸コードは、標準単独文字コードであり、核酸コード中の「Ｎ」は、
未付与核酸を示し、そして「＊」は、アミノ酸配列中の終止コドンを示す。
【図４Ａ】 図４Ａは、ヒト胎盤ビクニンまたはその部分をコードするＥＳＴに相同なある
種の核酸配列を有する一連のＥＳＴの元来の重複を描く。資料について見られる
のは、ビクニン（７−６４）およびビクニン（１０２−１５９）の相対的位置、
それぞれ、標識ＫＩＤ１およびＫＩＤ２である。
【図４Ｂ】 図４Ｂは、別のＥＳＴを組み込む連続のより複雑なＥＳＴ重複を描く。上部Ｘ
軸上の数は、最も５’のＥＳＴ配列から最初の塩基で出発して塩基対での長さに
該当する。各棒の長さは、個々のＥＳＴの塩基対での長さに比例している。ＥＳ
Ｔ評価数は、それらの個々のＥＳＴ棒の右に示される。
【図４Ｃ】 図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド
配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で
重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、
ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１０
０５で）付されたＥＳＴ Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の
重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｄ】 図４Ｄは、図４Ｃ（配列番号：４５）で描かれたビクニンについての共通オリ
ゴヌクレオチド配列のアミノ酸翻訳を描く。
【図４Ｅ】 図４Ｅは、ＰＣＲ基本増幅によるヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから誘導され
た胎盤ビクニンコード配列のヌクレオチド配列（配列番号：４６）および対応の
アミノ酸翻訳（配列番号：４７）を描く。
【図４Ｆ】 図４Ｆは、コロニーハイブリッド形成によるヒト胎盤ラムダｃＤＮＡライブラ
リーから単離された生来のヒト胎盤ビクニンコード化クローンのヌクレオチド配
列（配列番号：４８）および対応のアミノ酸翻訳（配列番号：４９）を描く。
【図４Ｇ】 図４Ｇは、ＥＳＴ重複（配列番号：４５）により得られる胎盤ビクニンについ
てのアミノ酸翻訳オリゴヌクレオチド配列、ＰＣＲ基本クローニング（配列番号
：４７）、および従来のラムダコロニーハイブリッド形成（配列番号：４９）の
配列を比較する。
【図５】 図５は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲル濾過後の胎盤組織から得られるヒト胎盤
ビクニンの精製のグラフを示す。プロットは、ＯＤ２８０ｎｍによって測定され
るとおりのタンパク質溶出プロファイル（実線）、トリプシン阻害アッセイでの
溶出タンパク質の活性（円によって示される阻害率（％））およびカリクレイン
阻害アッセイでの溶出タンパク質の活性（四角によって示される阻害率（％））
の重複である。
【図６】 図６は、Ｃ１８逆相クロマトグラフィを用いて胎盤組織から得られるヒト胎盤
ビクニンをプロット取りするグラフを示す。プロットは、ＯＤ２１５ｎｍによっ
て測定されるとおりのタンパク質溶出プロファイル（実線）、トリプシン阻害ア
ッセイでの溶出タンパク質の活性（円によって示される阻害率（％））およびカ
リクレイン阻害アッセイでの溶出タンパク質の活性（四角によって示される阻害
率（％））の重複である。
【図７】 図７は、高度に精製された胎盤ビクニン（レーン２）、およびキロダルトンで
の指標サイズの一連の分子サイズのマーカタンパク質（レーン１）の銀染色した
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを描く。移動は、頂部から底部までであった。
【図８】 図８は、胎盤ビクニン（１０２−１５９）の発現を指示するプラスミド（ｐＳ
６０４）で安定に形質転換された酵母株ＳＣ１０１（パネル８Ａ）またはＷＨＬ
３４１（パネル８Ｂ）の成長から得られる細胞不含発酵ブロスに存在するトリプ
シン阻害活性の量を示す。
【図９】 図９は、ウシアプロチニン、または胎盤ビクニン（１０２−１５９）の発現を
指示するプラスミドで安定に形質転換された酵母株ＳＣ１０１（組換え体２．４
および２．５）の成長から得られる細胞不含発酵ブロスの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（図９Ａ）および抗胎盤ビクニン（１０２−１５９）ｐＡｂを用いたウエスタ
ンブロット（図９Ｂ）の両方を示す。移動は、頂部から底部までであった。
【図１０】 図１０は、キロダルトンで示されたサイズの高度に精製した胎盤ビクニン（１
０２−１５９）（レーン２）および一連の分子サイズマーカタンパク質（レーン
１）の銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す写真である。
【図１１】 図１１は、胎盤ビクミン（１０２−１５９）（図１１Ａ）をコードするか、胎
盤ビクニン（１−２１３）（図１１Ｂ）をコードするかのいずれかである３２Ｐ
標識ｃＤＮＡプローブにハイブリッド形成された種々のヒト組織から得られるｍ
ＲＮＡのノザンブロットの結果を示す写真である。移動は、頂部から底部までで
あった。各ブロットの右にある数は、隣接ＲＮＡマーカのキロベースでのサイズ
に該当する。ｍＲＮＡが誘導される器官は、ブロットの各レーンの下に記載され
る。
【図１２】 図１２は、合成の還元胎盤ビクニン（７−６４）（図１２Ａ）または１０２−
１５９（図１２ｂ）のいずれかに対して生じたウサギ抗血清を用いた胎盤由来の
胎盤ビクニンの免疫ブロットを描く。各パネルについては、内容は、分子サイズ
マーカ（レーン１）であった；ヒト胎盤から単離される生来の胎盤ビクニン（レ
ーン２）；合成胎盤ビクニン（７−６４）（レーン３）および合成胎盤ビクニン
（１０２−１５９）（レーン４）であった。トリシン１０−２０％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲルを、ブロットし、そしてプロテインＡ精製一次ポリクローナル抗体（２
０ｍｌの０．１％ＢＳＡ／Ｔｒｉｓ−緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）中に８ｕｇ ＩｇＧ）で、続いてアルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ウサギ二次抗体で展
開させた。移動は、頂部から底部までであった。
【図１３】 図１３は、バキュロウイルス／Ｓｆ９発現システム（レーン２）から誘導され
る高度に精製した胎盤ビクニン（１−１７０）の３マイクログラムのクマシン青
染色した１０−２０％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを描く。レーン１は、分子
サイズマーカを含む。移動は、頂部から底部までであった。
【図１４】 図１４は、ヒト血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間におけるＳｆ９由来
のヒト胎盤ビクニン（１−１７０）（黒抜き円形）、合成胎盤ビクニン（１０２
−１５９）（白抜き円形）、またはアプロチニン（白抜き四角形）のいずれかの
濃度を増大する効果の比較を描く。凝固は、ＣａＣｌ２で開始された。タンパク
質の濃度は、凝固時間でのブロット対支持延長である。非阻害凝固時間は、３０
．８秒であった。
【図１５】 図１５は、３時間処理後のモルモット気管での潜在的差異におけるアミロライ
ド（１００ｕＭ）およびハンクス平衡塩生理食塩水（ＨＢＳＳ）ビヒクル（対照
）に対応して２ｕＭおよび０．２ｕＭの投与レベルでビクニンの効果を例示する
。
【図１６】 図１６は、（ａ）モルモットの気管に対応する点滴シリンジおよびベータプロ
ーブの位置決め；（ｂ）３２Ｐ標識Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅを用いた気管平均速
度（ＴＭＶ）の測定についての個々のグラフ；および（ｃ）気管点滴に続く１．
５、１．７５、２．０、２．２５および２．５時間でのＨＢＳＳビヒクル対照に
対応するビクニン（５μｇ）に対応してモルモットでのインビボでのＴＭＶでの
持続的増大を例示する。
【図１７】 図１７は、ビクニン（７０ｎＭ）が、アミロライド（１０ｕＭ）に対して培養
したヒト気管支上皮細胞でのナトリウムの流れを減少させることを例示する。
【図１８】 図１８は、モルモット気管中のＴＭＶ増大、続いてエアロゾル処理での高張性
生理食塩水（１４．４％）の５分のエアロゾルの効果を例示する。
【図１９】 図１９は、モルモット気管中のＴＭＶにおけるアミロイド（１０ｍＭ）の２０
分のエアロゾル、続いてエアロゾル処理での効果を例示する。
【図２０】 図２０は、ビクニン（５ｕｇ／ｍＬ）、アプロチニン（５ｕｇ／ｍＬ）、およ
びアプロチニン二重ムテイン（０．５ｕｇ／ｍＬ、１．５ｕｇ／ｍＬ、および５
ｕｇ／ｍＬ）が、インビトロでの培養したヒト気管支細胞でのナトリウム短期電
流を減少させることを例示する。
【図２１】 図２１は、アプロチニン（１ｍｇ／ｍＬ）が、ヒトＣＦ気管支上皮細胞でのイ
ンビトロでのＩｓｃを阻害したことを例示する。
【図２２】 図２２は、ビクニンエアロゾル（３ｍＬの３ｍｇ／ｍＬ）が、ＰＢＳ対照に対
応するヒツジでのＴＭＶを明らかに増大したことを例示する。
【図２３】 図２３は、ビクニン（５０ｕｇ／ｍＬ）が、３０分間かけてモルモットの気管
上皮細胞中のインビトロでのナトリウム流を阻害したことを例示する。
【図２４】 図２４は、ビクニン（１００ｕｇ／ｍＬ）が、９０分間かけてヒツジの気管上
皮細胞中のインビトロでのナトリウム流を著しく阻害したことを例示する。
【図２５】 図２５は、（ａ）ＬＰＳに対する露出が、明らかなＰＭＮ流入を引き起こした
こと、そして（ｂ）ビクニンが、ＬＰＳに予め露出したモルモットでの潜在的差
異を明らかに阻害したことを例示する。
【図２６】 図２６は、アプロチニン二重ムテイン（１０ｕｇ）が、投与に続く１．５から
２．５時間の持続期間をかけてＨＢＳＳに対応してモルモットでのインビボでＴ
ＭＶを増大したことを例示する。
【図２７】 図２７は、ｐＢＣ−ＢＫのプラスミド地図を表す（ＣＭＶ−ＩＥ＝サイトメガ
ロウイルス即時；ＤＨＦＲ＝ジヒドロホレートレダクターゼ；ＡＭＰ−ｒ＝アン
ピシリン耐性）。
【図２８】 図２８は、（ａ）ＣＨＯ発現ビクニン（１−１７０）（１０ｕｇ／ｍＬ）が、
９０分の期間をかけてヒトＣＦ気管支上皮細胞でインビトロでのナトリウムの流
れを減少させたこと、および（ｂ）１、５、および１０ｕｇ／ｍＬでのＣＨＯビ
クニン（１−７０）、および２０ｕｇ／ｍＬでのアプロチニンが、インビトロで
のヒトＣＦ気管支上皮細胞に先端使用後９０分でのナトリウムの流れを減少させ
ることを例示する。
【図２９】 図２９は、ＣＨＯ細胞発現系からビクニン（１−１７０）を精製するプロセス
の工程を例示する。
【図３０Ａ】 図３０Ａは、Ｃ１８逆相クロマトグラフィを用いた精製ＣＨＯビクニン（１−
１７０）の異性形態の移動のグラフを示す。プロットは、２８０ｎｍでの吸光度
（実線）によって測定されるときのタンパク質溶出プロファイルの重複、および
タンパク質を溶出するのに使用される０．１％トリフルオロ酢酸でのアセトニト
リルの含有率（ダイヤモンド）である。
【図３０Ｂ】 図３０Ｂは、ＣＨＯ細胞発現系から発現される精製ビクニン（１−１７０）グ
リコシル化異性形態（レーン４５−５５）の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびキ
ロダルトンで例示されたサイズの一連の分子サイズマーカタンパク質（レーン５
４および５５の間）を示す写真である。移動は、頂部から底部までであった。
【図３１】 図３１は、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理した（レーン２および４）および未処理
（レーン１および３）のＣＨＯ精製ビクニン（１−１７０）異性形態の銀染色Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ、およびキロダルトンで例示されたサイズの一連の分子サイズマ
ーカタンパク質を示す写真である。移動は、頂部から底部までであった。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１月１２日（２００１．１．１２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 （配列番号：４９） を含む請求項１に記載の使用法。
【化２】 （配列番号：２）、
【化３】 （配列番号：４５）、
【化４】 （配列番号：４７）、
【化５】 （配列番号：７０）、 または
【化６】 （配列番号：７１） を含む請求項１に記載の使用法。
【化７】 （配列番号：４）、
【化８】 （配列番号：５）、
【化９】 （配列番号：６）、
【化１０】 （配列番号：７）、
【化１１】 （配列番号：３）、
【化１２】 （配列番号：５０）、
【化１３】 （配列番号：１） または
【化１４】 （配列番号：５２） を含む請求項１に記載の使用法。
【化１５】 （配列番号：８） を含む請求項１に記載の使用法。
【化７１】 （配列番号：４９） に示されるような有効な粘膜腺毛クリアランス刺激量のＫｕｎｉｔｚ型セリンプ
ロテアーゼ阻害剤および生理学上許容し得る担体を含む、そのような治療を必要
とする対象に粘膜腺毛クリアランスの速度を促進するための薬剤を生成するため
のＫｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤の使用法。
【化７２】 （配列番号：２）、
【化７３】 （配列番号：４５）、
【化７４】 （配列番号：４７）、
【化７５】 （配列番号：７０）、 または
【化７６】 （配列番号：７１） に示されるような有効な粘膜腺毛クリアランス刺激量のＫｕｎｉｔｚ型セリンプ
ロテアーゼ阻害剤および生理学上許容し得る担体を含む、そのような治療を必要
とする対象に粘膜腺毛クリアランスの速度を促進するための薬剤を生成するため
のＫｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤の使用法。
【化７７】 （配列番号：４）、
【化７８】 （配列番号：５）、
【化７９】 （配列番号：６）、
【化８０】 （配列番号：７）、
【化８１】 （配列番号：３）、
【化８２】 （配列番号：５０）、
【化８３】 （配列番号：１）、 または
【化８４】 （配列番号：５２） に示されるような有効な粘膜腺毛クリアランス刺激量のＫｕｎｉｔｚ型セリンプ
ロテアーゼ阻害剤および生理学上許容し得る担体を含む、そのような治療を必要
とする対象に粘膜腺毛クリアランスの速度を促進するための薬剤を生成するため
のＫｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤の使用法。
【化８５】 （配列番号：８） に示されるような有効な粘膜腺毛クリアランス刺激量のＫｕｎｉｔｚ型セリンプ
ロテアーゼ阻害剤および生理学上許容し得る担体を含む、そのような治療を必要
とする対象に粘膜腺毛クリアランスの速度を促進するための薬剤を生成するため
のＫｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤の使用法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】 （配列番号：６７）に継続する配列番号：５２のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質を提供する。本発明はまた、以下のタンパク質の使用法を具体化する。
【化８６】
【化８７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/02 Ａ６１Ｐ 11/06 11/06 27/16 27/16 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/81 ＺＮＡ // Ｃ０７Ｋ 14/81 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/64 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ニュートン、 ベンジャミン ビー． イギリス国 アールジー１ ３キューエイ バークシャー レディング セイント バーソロミューズ ロード 35 (72)発明者 テイラー、 ウィリアム ジェイ．エイ． イギリス国 エスエル４ ５ユービー ウ インザー メイドンヘッド ロード ワイ ンディン ザ ウイローズ （番地なし) Ｆターム(参考） 4C076 AA24 AA93 BB27 CC15 DD23 DD26 EE23 FF12 FF61 FF68 4C084 AA01 AA02 AA03 BA01 BA20 BA22 BA26 CA18 CA20 CA29 CA53 DC03 DC32 MA13 MA17 MA56 NA14 ZA34 ZA59 ZA63 ZC20 4H045 AA30 BA10 BA53 CA40 DA56 EA20 FA72 FA74

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤および生理学上許
    容し得る担体を含む組成物の、有効な粘膜毛様体クリアランス刺激量を、対象に
    投与することを含む、そのような治療を必要とする対象での粘膜毛様体クリアラ
    ンスの速度を促進する方法。
  2. 【請求項２】 前記組成物が肺気道に投与される請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記組成物が、エアロゾル化によって直接投与される請求項
    １に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記組成物が、エアロゾル懸濁液として、哺乳類の呼吸器に
    直接投与される請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記エアロゾル懸濁液が、約１から約１０ミクロンまでのサ
    イズに入る吸気可能な粒子を含む請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記エアロゾル懸濁液が、約１から約５ミクロンまでのサイ
    ズに入る吸気可能な粒子を含む請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記エアロゾル懸濁液が、圧力起動ネブライザによって前記
    対象に送出される請求項４に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記エアロゾル懸濁液が、超音波ネブライザによって前記対
    象に送出される請求項４に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記エアロゾル懸濁液が、非毒性噴射剤によって前記対象に
    送出される請求項４に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記担体が、生理学上の緩衝溶液、等張性生理食塩水、通
    常の生理食塩水、およびその組合せからなる群から選択される一員である請求項
    １に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤が、アプロチニ
    ンである請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤が、アミノ酸配
    列： 【化１】 （配列番号：４９） を含む請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤が、アミノ酸配
    列： 【化２】 （配列番号：２）、 【化３】 （配列番号：４５）、 【化４】 （配列番号：４７）、 【化５】 （配列番号：７０）、 および 【化６】 （配列番号：７１） を含む請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤が、アミノ酸配
    列： 【化７】 （配列番号：４）、 【化８】 （配列番号：５）、 【化９】 （配列番号：６）、 【化１０】 （配列番号：７）、 【化１１】 （配列番号：３）、 【化１２】 （配列番号：５０）、 【化１３】 （配列番号：１） および 【化１４】 （配列番号：５２） を含む請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤が、アミノ酸配
    列： 【化１５】 （配列番号：８） を含む請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤が、グリコシル
    化されている請求項１２、１３、１４または１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤が、少なくとも
    １つの鎖内システイン−システインジスルフィド結合を含む請求項１２、１３、
    １４または１５に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ阻害剤が、ＣＹＳ１１
    −ＣＹＳ６１、ＣＹＳ２０−ＣＹ４４、ＣＹＳ３６−ＣＹＳ５７、ＣＹＳ１０６
    −ＣＹＳ１５６、ＣＹＳ１１５−ＣＹＳ１３９およびＣＹＳ１３１−ＣＹＳ１５
    ２からなるシステイン−システイン対の群選択される少なくとも１つの鎖内シス
    テンイ−システインジスルフィド結合を含み、前記システイン残渣が、生来のヒ
    ト胎盤ビクニンのアミノ酸配列によって数えられる請求項１２、１３、１４また
    は１５に記載の方法。
JP2000589209A 1998-12-22 1999-12-22 粘膜線毛クリアランスの速度を促進する方法 Expired - Fee Related JP3819239B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21891398A 1998-12-22 1998-12-22
US09/218,913 1998-12-22
US44196699A 1999-11-17 1999-11-17
US09/441,966 1999-11-17
PCT/GB1999/004381 WO2000037099A2 (en) 1998-12-22 1999-12-22 Method for accelerating the rate of mucociliary clearance by using a kunitz-type serine protease inhibitor

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006005246A Division JP2006232810A (ja) 1998-12-22 2006-01-12 粘膜線毛クリアランスの速度を促進する方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002532558A true JP2002532558A (ja) 2002-10-02
JP3819239B2 JP3819239B2 (ja) 2006-09-06

Family

ID=26913378

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000589209A Expired - Fee Related JP3819239B2 (ja) 1998-12-22 1999-12-22 粘膜線毛クリアランスの速度を促進する方法
JP2006005246A Pending JP2006232810A (ja) 1998-12-22 2006-01-12 粘膜線毛クリアランスの速度を促進する方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006005246A Pending JP2006232810A (ja) 1998-12-22 2006-01-12 粘膜線毛クリアランスの速度を促進する方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20070086956A1 (ja)
EP (2) EP1140150B1 (ja)
JP (2) JP3819239B2 (ja)
CN (1) CN1229138C (ja)
AR (1) AR030257A1 (ja)
AT (2) ATE407694T1 (ja)
AU (1) AU758832B2 (ja)
CA (1) CA2356404C (ja)
DE (2) DE69912988T2 (ja)
DK (2) DK1374891T3 (ja)
ES (2) ES2318075T3 (ja)
TW (1) TWI249406B (ja)
WO (1) WO2000037099A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010503731A (ja) * 2006-09-19 2010-02-04 ディスカバリー ラボラトリーズ，インコーポレイテッド 肺サーファクタント製剤および粘液クリアランスの促進方法
JP2016204360A (ja) * 2015-02-25 2016-12-08 エー１エム ファーマ エービーＡ１Ｍ Ｐｈａｒｍａ ＡＢ 放射性核種療法における腎臓の保護に用いるためのアルファ−１−ミクログロブリン

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7244616B2 (en) 2003-06-27 2007-07-17 Bayer Pharmaceuticals Corporation Use of molecular chaperones for the enhanced production of secreted, recombinant proteins in mammalian cells
CN1332715C (zh) * 2003-09-09 2007-08-22 王继峰 蛋白酶抑制剂在制备预防和治疗肺部疾病的药物中的用途
EP1586587A1 (en) * 2004-04-16 2005-10-19 Exonhit Therapeutics SA Compositions and methods for detecting angiogenesis
GB0411145D0 (en) * 2004-05-19 2004-06-23 Imp College Innovations Ltd Protease inhibitors and their therapeutic applications
CN100408094C (zh) * 2005-08-29 2008-08-06 吉林圣元科技有限责任公司 蛋白酶抑制剂在保护肝细胞功能中的应用
WO2013175007A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 Inserm Agents for treating cystic fibrosis

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223482A (en) * 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
US5106833A (en) * 1987-07-23 1992-04-21 Washington University Coagulation inhibitors
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5663143A (en) * 1988-09-02 1997-09-02 Dyax Corp. Engineered human-derived kunitz domains that inhibit human neutrophil elastase
ES2066033T3 (es) * 1989-05-13 1995-03-01 Bayer Ag Inhibidores de las proteinasas, procedimiento para su preparacion y composiciones farmaceuticas que los contienen.
DK408089D0 (da) * 1989-08-18 1989-08-18 Novo Nordisk As Proteiner
DE573603T1 (de) * 1991-03-01 1999-05-06 Dyax Corp Hemmstoffe für menschliche neutrophile elastase und menschliches kathepsin g.
RU2054180C1 (ru) * 1991-08-21 1996-02-10 Жирнов Олег Петрович (н/п) Способ лечения вирусных респираторных инфекций
IL104325A (en) * 1992-01-07 2000-10-31 Novo Nordisk As Variants of human kunitz-type protease inhibitor domain II of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) pharmaceutical compositions containing them a DNA construct encoding them their expression vectors a cell containing said DNA constructs and methods for the production of all the above
WO1994001461A1 (en) * 1992-07-13 1994-01-20 Corvas International, Inc. BOVINE PANCREATIC TRYPSIN INHIBITOR DERIVED INHIBITORS OF FACTOR Xa
US5436153A (en) * 1992-12-02 1995-07-25 Sprecher; Cindy A. Human amyloid protein precursor homolog and Kunitz-type inhibitor
AU5684594A (en) * 1992-12-02 1994-06-22 Novo Nordisk A/S Novel human amyloid protein precursor homologue and kunitz-type inhibitors
JP2769083B2 (ja) * 1993-02-22 1998-06-25 日清食品株式会社 エラスターゼ阻害活性を有する新規ペプチドおよびその製造方法
US5455338A (en) * 1993-11-05 1995-10-03 Zymogenetics, Inc. DNA encoding novel human kunitz-type inhibitors and methods relating thereto
WO1995021601A2 (en) * 1994-01-11 1995-08-17 Protein Engineering Corporation Kallikrein-inhibiting 'kunitz domain' proteins and analogues thereof
US5795954A (en) * 1994-03-04 1998-08-18 Genentech, Inc. Factor VIIa inhibitors from Kunitz domain proteins
US5786328A (en) * 1995-06-05 1998-07-28 Genentech, Inc. Use of kunitz type plasma kallikrein inhibitors
EP0758682B1 (en) * 1995-07-24 2004-05-12 Mitsubishi Chemical Corporation Hepatocyte growth factor activator inhibitor
US5736364A (en) * 1995-12-04 1998-04-07 Genentech, Inc. Factor viia inhibitors
HU226419B1 (en) * 1996-03-11 2008-12-29 Aerovance Human bikunin
US20070140979A1 (en) * 1998-12-22 2007-06-21 Bayer Aktiengesellschaft Method for accelerating the rate of mucociliary clearance

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010503731A (ja) * 2006-09-19 2010-02-04 ディスカバリー ラボラトリーズ，インコーポレイテッド 肺サーファクタント製剤および粘液クリアランスの促進方法
JP2016204360A (ja) * 2015-02-25 2016-12-08 エー１エム ファーマ エービーＡ１Ｍ Ｐｈａｒｍａ ＡＢ 放射性核種療法における腎臓の保護に用いるためのアルファ−１−ミクログロブリン

Also Published As

Publication number Publication date
DK1140150T3 (da) 2004-03-22
TWI249406B (en) 2006-02-21
DE69912988D1 (de) 2003-12-24
DE69912988T2 (de) 2004-11-11
CN1334743A (zh) 2002-02-06
AU1987800A (en) 2000-07-12
CA2356404A1 (en) 2000-06-29
ES2318075T3 (es) 2009-05-01
EP1374891A1 (en) 2004-01-02
JP2006232810A (ja) 2006-09-07
DK1374891T3 (da) 2009-01-26
EP1374891B1 (en) 2008-09-10
AR030257A1 (es) 2003-08-20
CN1229138C (zh) 2005-11-30
JP3819239B2 (ja) 2006-09-06
ATE254473T1 (de) 2003-12-15
EP1140150A2 (en) 2001-10-10
DE69939559D1 (de) 2008-10-23
ES2209542T3 (es) 2004-06-16
CA2356404C (en) 2010-03-30
US20070086956A1 (en) 2007-04-19
EP1140150B1 (en) 2003-11-19
WO2000037099A2 (en) 2000-06-29
WO2000037099A3 (en) 2000-10-26
ATE407694T1 (de) 2008-09-15
AU758832B2 (en) 2003-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69735996T2 (de) Menschlicher bikunin
EP0787016B1 (en) Secretory leukocyte protease inhibitor (slpi) as an inhibitor of tryptase
EP2081958B1 (en) Peptide extended insulins
EP1558273B1 (en) Treatment and prevention of pulmonary conditions
JP2006232810A (ja) 粘膜線毛クリアランスの速度を促進する方法
WO1997033996A9 (en) Human bikunin
US20080069798A1 (en) Use of il-22 for the treatment of conditions of metabolic disorders
JPH05503101A (ja) 好中球化学誘引物質
JP2002543219A (ja) 大豆タンパク質栄養補助剤
US20070140979A1 (en) Method for accelerating the rate of mucociliary clearance
MXPA01006510A (en) Method for accelerating the rate of mucociliary clearance by using a kunitz-type serine protease inhibitor
US20230203095A1 (en) Biological peptide for treating lung diseases and application thereof
JP2000007575A (ja) 抗アレルギー剤
KR20170069997A (ko) 미리스토일화된 렙틴-관련된 펩티드 및 이들의 용도
MXPA98007060A (en) Bikunina hum
CA2407668A1 (en) Human bikunin

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20050712

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20051012

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20051019

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060106

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20060207

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060424

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20060523

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20060614

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090623

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100623

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100623

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110623

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120623

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130623

Year of fee payment: 7

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees