CN100408094C - 蛋白酶抑制剂在保护肝细胞功能中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Kunitz型蛋白酶抑制剂(KPI/Aβ PP)、其制备方法和应用，特别是涉及Kunitz型蛋白酶抑制剂的肝细胞保护功能，及其在生产用于预防和治疗病理性肝损伤相关疾病的药物中的应用。本发明进一步涉及由作为基本活性成分的Kunitz型蛋白酶抑制剂及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。

Description

蛋白酶抑制剂在保护肝细胞功能中的应用

发明领域

本发明涉及Kunitz型蛋白酶抑制剂(KPI/AβPP)、其制备方法和应用，特别是涉及KPI/AβPP的肝细胞保护功能，及其在生产用于预防和治疗病理性肝损伤相关疾病的药物中的应用。本发明进一步涉及由作为基本活性成分的KPI/AβPP及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。

发明背景

与牛胰蛋白酶抑制剂相似，来源于人淀粉样β蛋白前体(AβPP)的Kunitz型蛋白酶抑制剂区域(KPI)是一种能够与丝氨酸蛋白酶结合并抑制丝氨酸蛋白酶活性的肽。

作为一种由61个氨基酸组成的多肽，KPI/AβPP分子量相对较小且结构稳定。Kunitz型蛋白酶抑制剂区域(简称KPI或KPI/AβPP)对丝氨酸蛋白酶家族有广泛的抑制作用，可被抑制的蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽释放酶、纤溶酶、弹性蛋白酶和凝血因子VIIa IXa Xa XIa XIIa等(例如参见美国专利6,613,890)。作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂和活性药物成分，KPI/AβPP的基本作用在于将病理性升高的蛋白水解酶活性降低到正常水平，缓解与丝氨酸蛋白酶活性升高有关的临床症状，通常可用于预防和治疗心肺转流术(CPB)后的大出血，CPB诱导的炎性反应以及促进伤口愈合等。

然而，迄今为止尚未见有关KPI/AβPP对肝细胞的保护功能以及将其用于预防和治疗各种原因导致的病理性急性肝组织损伤和慢性肝纤维化的报道。

发明目的

本发明的一个目的是提供KPI/AβPP在生产用于预防和治疗病理性肝损伤相关疾病的药物中的应用。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的KPI/AβPP是以DNA重组技术制备的。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的KPI/AβPP是人源的。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的病理性肝损伤选自急性或亚急性肝坏死、急性或慢性病毒性肝炎、慢性肝纤维化、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性慢性肝损伤和肝衰竭。

本发明的另一个目的是提供一种用于肝细胞保护、预防和治疗病理性肝损伤的基础上由KPI/AβPP或其类似物以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的药物组合物还可含有一种或多种具有协同或辅助作用的天然或合成或重组来源的其他活性成分。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的药物组合物被制成适于经胃肠道途径给药的剂型。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的药物组合物被制成适于经胃肠道外途径给药的剂型。

附图说明

图1显示重组人Kunitz型蛋白酶抑制剂(rhKPI/AβPP)对体外原代分离的大鼠肝细胞的保护作用。其中图1a显示培养基中加入rhKPI/AβPP实验组肝细胞的生长状态：可见肝细胞呈单层生长，细胞轮廓清晰，核大，细胞间连接紧密，仍维持肝细胞的典型形态(100×)。图1b显示培养基中未添加rhKPI/AβPP阴性对照组肝细胞的生长状态：细胞数明显减少，仅有大约10％的细胞存活，细胞表面不光滑，结构趋于消失并有融合现象，且有多数细胞死亡(100×)。

图2显示rhKPI/AβPP对CCL₄诱导的急性肝损伤小鼠的肝细胞保护作用。其中图2a显示空白对照组的肝小叶结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列、肝窦结构规整，肝细胞核呈圆形，胞质红染，汇管区无炎性细胞浸润(400×)。图2b显示模型对照组的肝细胞肿大，肝小叶中央区呈弥漫性、多发性片状坏死和脂肪变性，炎性细胞浸润明显(200×)。图2c显示大剂量实验组肝小叶周边部分肝细胞轻度水肿及轻微脂肪变性，但未见其他明显的病理改变(200×)。图2d显示甘利欣(江苏正大天晴药业股份有限公司，批号：200688)组的肝小叶周边部分肝细胞轻度水肿及少数肝细胞脂肪变性(200×)。

图3显示rhKPI/AβPP对CCL₄诱导的慢性肝损伤大鼠的肝细胞保护作用。其中图3a显示空白对照组的肝小叶结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列、肝窦结构规整，肝细胞核呈圆形，胞质红染，汇管区无炎性细胞浸润(200×)。图3b显示模型对照组的肝纤维增生明显，将肝小叶分割为大小不等的假小叶，假小叶内中央静脉缺如或偏位，肝细胞脂肪变性，胞浆内可见大小不等的空泡，呈典型肝硬化表现(200×)。图3c显示大剂量实验组的肝细胞轻度脂肪变性，在肝小叶内只见有散在的脂肪变性(200×)。图3d显示促肝细胞生长素组的肝小叶结构模糊，肝小叶周边及汇管区周围肝细胞中度脂肪变性，相互连接成片，小叶中央肝细胞病变较轻(200×)。

发明内容

本发明涉及Kunitz型蛋白酶抑制剂(KPI/AβPP)、其制备方法和应用，特别是涉及KPI/AβPP的肝细胞保护功能，及其在生产用于预防和治疗病理性肝损伤相关疾病的药物中的应用。本发明进一步涉及由作为基本活性成分的KPI/AβPP及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。

可以利用常规的DNA重组和分子克隆技术制备重组人Kunitz型蛋白酶抑制剂(rhKPI/AβPP)。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的rhKPI/AβPP可以是由原核、真核或酵母表达系统产生的。然而，为了本发明目的，优选的表达系统是巴斯德毕赤酵母表达系统。

以下简单地描述使用优化的发酵培养条件，在80L发酵罐中工业化大规模生产rhKPI/AβPP的方法。

(1)酵母表达载体的构建：以人胎盘组织来源的基因组DNA为模板，使用合成的引物1：5′-CTCTgAATTCAggTCTgCAgTgAACAAgCC-3′和引物2：5′-gAAgTCTAgATTAAATggCgCTgCCACACAC-3′，经聚合酶链反应(PCR)扩增得到长度约200bp的产物。酶切后与用同种酶消化的pPICZα载体连接，得到重组质粒pPICZα/prekpi。然后，分别合成一段寡核苷酸单链5′- TCgAgAAgAgAgAggTTgTTAgAgAggTCTgCA-3′和5′-gACCTCTCTAACAACCTCTCTCTTC-3′(其中包括编码KPI氨基端四个氨基酸和α因子信号肽切割位点Lys-Arg的密码子)。用PstI和XhoI消化重组质粒pPICZα/prekpi并与退火后的寡核苷酸双链连接，得到重组质粒pPICZα/kpi。酶切分析和测序鉴定表明，pPICZα/kpi，重组质粒携带了预期的α因子信号肽和rhKPI/AβPP基因序列。

(2)重组质粒的转化、阳性克隆的筛选和表达：采用电转化法将pPICZα/kpi转化到酵母菌株X-33中。在YPD zeocin阳性培养基中28℃培养36小时后，挑取单克隆菌落接种于BMGY培养基中，待细菌处于对数生长期(OD₆₀₀＝2～6)时，重悬于BMMY培养基中继续培养。每隔24小时补加100％甲醇至终浓度为0.5％，以诱导rhKPI/AβPP的表达。诱导后，每隔24小时取上清，用胰蛋白酶和底物盐酸苯甲酰-精氨酸-4-硝基酰基苯胺进行活性测定，筛选相对高表达量的菌株。

(3)大规模发酵工艺：将高密度的(OD₆₀₀＝10)酵母工程菌接种于含甘油(5％，V/V)加痕量盐(4.34ml PTM1/L)和生物素(0.08mg/L)的FM21培养基中，在温度28℃、pH 3.3、溶解氧浓度20％、搅拌速度600转/分钟，罐内压力12psi条件下，在发酵罐罐内发酵培养30小时。当湿细胞重量＞180～220g/L时，以渐增的速度添加含1.2％PTM1的100％甲醇，诱导rhKPI/AβPP的表达，其甲醇补加速率为3.6ml/小时/L→7.3ml/小时/L→10.9ml/小时/L，直至发酵结束。

(4)表达产物的纯化：70L发酵液离心取上清，用NaOH(1mol/L)调pH4.0，添加NaAc-HAc缓冲液(终浓度为20mmol/L)和去离子水稀释后，通过预先用缓冲液A(20mmol/L NaAc-HAc，pH 4.0)平衡过的Sepharose SP阳离子交换柱。然后连续加样，检测穿透液的活性，待树脂饱和后用3倍于柱体积的缓冲液A洗柱。用缓冲液B(20mmol/L NaAc-HAc加1mol/L NaCl，pH 4.0)洗脱。洗脱液用3000(3K)中空纤维柱除盐和浓缩。

(5)表达产物的活性测定：以胰蛋白酶活性抑制方法测定表达产物的活性。将如上纯化的rhKPI/AβPP稀释成不同浓度并与同浓度的胰蛋白酶反应，加入底物(盐酸苯甲酰-精氨酸-4-硝基酰基苯胺)后测定残余的胰蛋白酶量。结果可见，如上得到的rhKPI/AβPP对胰蛋白酶有明显的可逆性抑制作用。

为了深入研究rhKPI/AβPP对大鼠肝细胞的保护作用，在体外细胞学实验中，本发明人首先发现，与无血清培养的对照组肝细胞相比，rhKPI/AβPP能够使大鼠的肝细胞在无血清培养条件下的存活期明显延长，并保持原代肝细胞的完整的细胞形态。

在体外细胞实验的基础上，我们进一步观察了rhKPI/AβPP对活体急性肝损伤及慢性肝纤维化动物模型的血清中酶含量及生化指标的影响，同时对各实验组动物的肝脏组织进行了病理学观察和统计学分析。在急性肝损伤的实验中发现，与对照组相比，接受rhKPI/AβPP治疗的实验组动物血清转氨酶和肝重系数显著降低。另外，实验组动物血清及肝组织中的丙氨酸氨基转换酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、胆红素(T-BIL)、γ谷氨酰转肽酶(γ-GT)、羟脯氨酸(HYP)水平明显降低；而白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、白蛋白比总蛋白(A/G)、唾液酸(SA)、胆碱酯酶(CHE)则升高。病理学检查结果可见，实验组动物肝小叶周边部分肝细胞水肿和脂肪变性程度较模型对照组明显减轻，汇管区炎细胞浸润也明显减少。在慢性肝损伤的实验中，与模型对照组相比，发现接受rhKPI/AβPP治疗的动物肝纤维化程度较轻，同时肝细胞脂肪变性和炎性细胞浸润也明显减轻。

基于这些实验结果，我们初步认定rhKPI/AβPP有可能作为一种新的肝细胞保护剂，用于预防和治疗各种原因特别是毒性因子导致的急性及慢性肝细胞损伤。

因此，本发明的一个目的是提供KPI/AβPP在生产用于预防和治疗病理性肝损伤相关疾病的药物中的应用。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的病理性肝损伤包括但不只限于急性或亚急性肝坏死、急性和慢性病毒性肝炎、活动期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭。

本发明的另一个目的是提供一种具有肝细胞保护活性的基础上由rhKPI/AβPP及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。

用于本发明的rhKPI/AβPP可以是具有天然野生序列的生物学活性多肽，但也可以是为改善产物的生物学活性，或为提高产物的产率或药物动力学性质目的而在基因水平上进行了必要的修饰的rhKPI/AβPP类似物或突变体。这里所说的修饰可以是内部或N末端个别或部分氨基酸的加入、缺失或取代。

本发明涉及的rhKPI/AβPP可以单独使用，也可以作为有各种不同剂型的药物组合物的形式使用。可以使用制药工业领域已知的方法(参见Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.，1980)，以适于口服或非口服给药的单位计量形式制备本发明的药物组合物。例如，可将作为活性成分的有效量的rhKPI/AβPP与医药上可接受的载体或赋形剂均匀地混合，制成溶液或悬浮液形式的适于静脉内、肌肉内、器官腔内、皮内和皮下等胃肠道外途径给药的药物组合物；或者也可以制成片剂、胶囊剂、粉末剂、乳剂、颗粒剂等形式的适于经胃肠道途径给药的药物组合物。

根据本发明的药物组合物，其中所使用的医药上可接受的载体或赋形剂将依据所制备的本发明药物组合物的剂型而有不同的选择。

适于胃肠道外给药的制剂可含有无菌水或盐水、聚乙二醇、油和氢化萘等常用的赋形剂。特别是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作为赋形剂，以控制活性成分的缓慢释放。在其他适于胃肠道外给药的制剂中，还包括含有水杨酸的直肠给药制剂和含有甘胆酸盐的含服给药制剂。

具体地说，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纤维素等赋形剂，淀粉、海藻酸钠、羧甲基纤维素钙和结晶纤维素等崩解剂，硬脂酸镁和滑石等润滑剂，明胶、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素和羟丙基纤维素等黏结剂，和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性剂，以及着色剂、甜味剂、香料、分散剂等辅助成分，以常规方法制备片剂。

可以使用乳糖和甘露醇等赋形剂，淀粉等崩解剂，明胶等黏结剂，以常规方法制备颗粒剂。

或者，可以使用乳糖和蔗糖等赋形剂，以常规方法制备粉末剂。使用明胶、水、蔗糖、阿拉伯胶、山梨醇、甘油、结晶纤维素、硬脂酸镁和滑石等，以常规方法制备胶囊剂。

可以使用水、生理盐水、植物油(如橄榄油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇等溶剂，苯甲酸钠，水杨酸钠和氨基甲酸乙酯等增溶剂，氯化钠和葡萄糖等等渗剂，青霉素和链霉素及其他抗真菌剂等抗生素，苯酚、甲酚、对位羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐剂，抗坏血酸和焦磷酸钠等抗氧化剂，以常规方法制备注射剂。

在任何情况下，所说的可注射制剂均应是无菌和可流动并适于通过注射器注射给药的。另外，在生产、运输和储存条件下，所说的制剂还必须是稳定的，并且能够对抗细菌和真菌等微生物的污染。

另外，也可使用制药工业中已知的方法和辅助成份，将本发明的药物组合物制成微胶囊剂或脂质体包裹剂。

本发明的药物组合物除含有作为基本活性成分rhKPI/AβPP或其类似物或突变体外，还可含有一种或多种合成的、天然的或重组来源的具有协同或辅助作用的其他活性成分。这些活性成分包括但不只限于具有免疫刺激或调节活性、病毒复制抑制活性、功能性肝细胞修复活性的其他成分，例如可以是干扰素、白介素、胸腺素、肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子等。

本发明的药物组合物对功能性肝细胞具有良好的保护作用。虽然有关作用机理目前尚不明确，但我们推测可能与rhKPI/AβPP或其类似物作用于肝细胞并抑制细胞表面上的丝氨酸蛋白酶类有关。

可使用本发明的药物组合物预防或治疗的疾病包括但不只限于人或哺乳动物的急性或亚急性肝坏死、急性或慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭。

基于以上的描述，本领域技术人员完全可以理解到，rhKPI/AβPP除具有其固有的蛋白酶抑制活性并因此可用于治疗丝氨酸活性升高相关疾病外，也可以用于预防和治疗病理性肝损伤及相关疾病。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的rhKPI/AβPP或其类似物通过抑制肝细胞膜表面的丝氨酸蛋白酶提高肝细胞的存活性。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的病理性肝损伤包括但不只限于急性或亚急性肝坏死、急性或慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭。

一般说来，本发明药物组合物的给药剂量约为0.01-500mg/kg，较好为0.1-100mg/kg。可以以口服、皮下或肌肉注射、腹腔注射、静脉内注射等多种途径药给。当然，本领域技术人员可以理解到，为有效地治疗病人所需的确切的给药剂量，应根据待治疗的病症或病理状态的性质、严重程度、病人的年龄、体重和一般健康状态，所用药物的剂型、病人对所用药物的敏感性和耐受性，以及所使用给药途径等因素，按照个体化的原则由临床医生确定。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例说明而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。

实施例1：rhKPI/AβPP对体外原代分离的大鼠肝细胞的保护作用

本实施例举例说明rhKPI/AβPP对分离的原代大鼠肝细胞存活期的影响。

采用在Seglen法基础上改进的两步原位灌流法，分离Wistar大鼠(150g-200g)肝细胞。将肝细胞用培养液A〔含8％新生牛血清(NBCS)、地塞米松(1μM)和胰岛素(0.1μM)的Williams’E培养液〕悬浮后，接种在96孔培养板的小孔(10⁵个细胞/孔)中，并置于37℃，5％CO₂环境下培养。6小时后待细胞完全贴壁时，依次更换培养液B〔含2％NBCS、地塞米松(1μM)，胰岛素(0.1μM)的Williams’E培养液〕、培养液A、添加rhKPI/AβPP(10μg/ml)的培养液B和添加牛蛋白酶抑制剂(BPTI，10μg/ml)的培养液B继续培养。每间隔24小时分别在相差倒置显微镜下观察细胞形态和数量的变化，并用MTT法检测存活的细胞数。同时；接种相同密度的鼠肝细胞，用添加不同浓度的rhKPI/AβPP的培养液B分别连续培养3天，同时用含不同血清浓度的培养液B和相同密度的鼠肝细胞作为对照，观察和评价rhKPI/AβPP对大鼠肝细胞的存活性的影响及量效关系。结果如下列表1和2所示。

表1  rhKPI/AβPP对原代大鼠肝细胞的保护作用(x±s)

与2％NBCS的对照组比较，*P＜0.05.

从表1所示的结果可以看出，rhKPI/AβPP体外培养第四天的大鼠肝细胞存活数显著高于2％NBCS对照组(P＜0.05)。肝细胞呈单层生长，细胞轮廓清晰，核大，细胞间连接紧密，仍维持肝细胞的典型形态。MTT值与镜下观察的结果相一致(参见图1a和1b)。

表2  rhKPI/AβPP对大鼠肝细胞保护作用的量效关系(x±s)

从表2所示的结果可以看出，rhKPI/AβPP在浓度为2.5μg/ml时开始发挥作用，10μg/ml时达到最高水平，显示了较好的量效关系。最小有效剂量与5％血清浓度的MTT值在统计学无显著性差别(P＞0.05数据未给出)。

实施例2：rhKPI/AβPP对急性肝损伤小鼠模型的肝细胞保护作用

本实施例举例说明rhKPI/AβPP对四氯化碳诱导的急性肝损伤小鼠模型的功能性肝细胞保护作用。

将健康昆明种小鼠60只(6～8周龄，平均体重20g～22g，雌雄各半)随机分为6组，每组10只动物。(1)空白对照组；(2)模型对照组(腹腔注射生理盐水)；(3～5)分别为rhKPI/AβPP小、中、大三个不同剂量组(分别按4.5mg/kg、9mg/kg、18mg/kg腹腔注射)；(6)甘利欣注射液组(江苏正大天晴药业股份有限公司生产，25mg/kg腹腔注射)。每天给药一次，连续7天。末次给药后1小时，第1组小鼠腹腔注射花生油(10ml/kg)，第2～6组小鼠按10ml/kg腹腔注射含0.2％CCL₄的花生油，造成急性肝损伤。禁食，不禁水。16小时后再给药1次，末次给药1小时后摘眼球取血，按改良赖氏法测定血清中ALT、AST含量。然后，处死小鼠，称取肝脏总重量，测定肝重系数的变化；取肝大叶相同部位的肝组织固定于10％甲醛溶液中，按常规方法制备病理切片并进行HE染色。所Dunnet T检验进行比较。

从下列表3所示的结果可以看出，与空白对照组相比较，模型对照组动物的血清ALT和AST活力水平均明显升高(p＜0.01)。投用rhKPI/AβPP后，可见治疗组动物的ALT和AST活力水平均显著降低(与模型对照组比较差别有统计学意义p＜0.05或p＜0.01)。

表3  rhKPI/AβPP对CCL4诱导的急性肝损伤小鼠的肝保护作用(x±s，n＝10)

与空白对照组比较^##P＜0.01；与模型对照组比较*p＜0.05  **p＜0.01

另一方面，各组动物肝脏组织病理检查结果显示：空白对照组所有小鼠的肝组织结构均未见任何病理改变。模型对照组肝细胞肿大，肝小叶中央区呈现弥漫性多发性片状坏死，肝细胞呈弥漫性脂肪变性，炎性细胞浸润明显。rhKPI/AβPP小剂量组肝小叶中央区部分肝细胞坏死，肝小叶弥漫性水肿、脂肪变性，炎性细胞浸润较轻。rhKPI/AβPP中剂量组肝小叶周边部分少数肝细胞轻度坏死，肝小叶周边部少量脂肪变性，其坏死和脂肪变性程度比模型组明显减轻，炎性细胞浸润更轻。rhKPI/AβPP大剂量组肝小叶周边部少数肝细胞轻度水肿及轻微脂肪变性，炎性细胞浸润不明显。甘利欣注射液组肝小叶周边部肝细胞坏死及轻度水肿，少数肝细胞脂肪变性，炎性细胞浸润不明显(参见表4和图2)。

这些结果表明，大剂量组rhKPI/AβPP对小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用，而且保护作用可以与甘利欣注射液(25mg/kg)相比。

表4  rhKPI/AβPP对CCL4诱导的急性肝损伤小鼠肝组织病理改变的影响(n＝10)

实施例3：rhKPI/AβPP对小鼠慢性肝损伤模型的肝细胞保护作用

本实施例举例说明rhKPI/AβPP对四氯化碳诱导的慢性肝损伤小鼠模型的功能性肝细胞保护作用。

Wistar大鼠体重190g～210g，雌雄各半。首次给予皮下注射40％CCL₄(5ml/kg)，以后每周注射25％CCL₄2次，连续12周。空白对照组注射花生油。于实验第8周时，由眼眶静脉丛取血测定ALT、TP、A、A/G。根据ALT活力和A/G比值将动物分层随机分为6组：小、中、大三个剂量组(分别腹腔注射rhKPI/AβPP 3mg/kg、6mg/kg和12mg/kg)，促肝细胞生长素组(腹腔注射阳性对照药物促肝细胞生长素100mg/kg)。正常组与慢性肝损伤模型组(腹腔注射等容量生理盐水)。各组均连续给药4周。末次给药后24小时，从腹主动脉取血，测定血清ALT、AST、TP、ALB、γ-GT、T-BIL、ALP、CHE、SA、A/G值。然后处死大鼠，取肝组织加冷生理盐水制成10％肝组织匀浆，采用比色法测定Hyp的含量。同时，取肝大叶的相同部位的肝组织固定于10％福尔马林，常规法制做切片后分别进行HE染色和胶原纤维染色，在光镜下观察肝细胞变性坏死和肝间质纤维增生程度，并进行分级统计。

从下列表5所示的结果可以看出，与空白对照组相比较，模型组动物的血清学及生化学指标的水平均明显不同，且有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)，说明慢性肝损伤模型的建立成功。投用rhKPI/AβPP后，可见治疗组动物血清中ALT、AST、ALP、T-BIL、γ-GT显著降低，而ALB、SA、CHE、A/G显著升高；肝组织中Hyp活力水平显著降低(与模型组比较差别有统计学意义p＜0.05或p＜0.01)(参见表5)。

表5  rhKPI/AβPP对CCL₄所致慢性肝损伤大鼠的肝保护作用(x±s，n＝10)

与空白对照组比较#P＜0.05##P＜0.01；与模型对照组比较*p＜0.05  **p＜0.01

从肝脏组织病理检查结果显示(见表6图3)，空白对照组：大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列、肝窦结构规整，肝细胞核圆形，胞质红染，肝汇管区无炎细胞浸润，为正常肝脏组织结构。模型对照组：肝纤维组织增生明显，将肝小叶分割为大小不等的假小叶，假小叶内中央静脉缺如或偏位。可见肝细胞坏死，肝细胞脂肪变性，胞浆内可见大小不等的圆形空泡，炎性细胞浸润较轻。小剂量实验组：肝小叶结构模糊，肝细胞索不连续，部分肝细胞崩解坏死，汇管区周围肝细胞脂肪变性较重，肝细胞内可见多数大小不等的圆形空泡，部分肝细胞水样变性较重，炎性细胞浸润较轻。中剂量实验组：肝小叶结构模糊，少数肝细胞坏死，肝小叶中央区及部分汇管区可见中度脂肪变性，肝细胞内可见大小不等的圆形空泡，炎性细胞浸润更轻。大剂量实验组：肝纤维化程度轻，10只大鼠未见肝细胞坏死。肝轻度脂肪变性，在肝小叶内可见散在脂肪变性，炎性细胞浸润更轻。促肝细胞生长素组：部分肝小叶结构模糊，肝细胞坏死较轻，肝小叶周边区及汇管区周围肝细胞中度脂肪变性，相互连接成片，小叶中央肝细胞病变较轻，炎性细胞浸润较轻。

表6  rhKPI/AβPP对CCL4诱导的慢性肝损伤大鼠肝组织病理改变的影响(n＝10)

由以上的实验结果可见，rhKPI/AβPP具有肝细胞的保护功能，因此可用于预防和治疗各种原因导致的病理性急性肝组织损伤和慢性肝纤维化。

Claims (4)

1. Kunitz型蛋白酶抑制剂在生产用于预防和治疗病理性肝损伤相关疾病的药物中的应用。

2. 根据权利要求1的应用，其中所说的Kunitz型蛋白酶抑制剂是以DNA重组技术制备的。

3. 根据权利要求1的应用，其中所说的Kunitz型蛋白酶抑制剂是人源的。

4. 根据权利要求1的应用，其中所说的病理性肝损伤选自急性或亚急性肝坏死、急性或慢性病毒性肝炎、慢性肝纤维化、中毒性肝炎以及各种原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭。

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