CN1970763A - 一种截短的抑癌基因p53增加人肺癌细胞对抗肿瘤药物敏感性 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种截短的抑癌基因p53及其重组真核细胞表达质粒和转基因人肺癌细胞株。提供了该基因重组的缺陷型腺病毒质粒及制备的腺病毒。相对于全长p53基因，截短的p53基因缺失编码C－末端的第356－393位氨基酸的核苷酸序列及终止密码子后的非编码序列。本发明证明了将其p53转染到肿瘤细胞，能够增强肿瘤对抗肿瘤药物的敏感性，提示出p53C－末端缺失的核苷酸序列可能是抑制抗肿瘤药物作用的部位。从理论上拓宽了对肺癌耐药性(或药物敏感性)的认识，而且在研发增加抗肿瘤药物敏感性的生物药物，以提高肺癌治疗效果方面有着潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种缺失C-末端的p53基因及其重组质粒，将该重组质粒转染到肿瘤细胞能够增强肿瘤对抗肿瘤药物的药物敏感性。
背景技术
肺癌是严重危害人类健康的疾病。从全球范围看，肺癌死亡率居恶性肿瘤第一位(2003年WTO国际癌症中心统计)，每年新增病例120万人。我国流行病学调查资料显示肺癌死亡率急剧上升，肺癌居城镇居民恶性肿瘤死亡率第一(2003年全国恶性肿瘤调查资料)。
手术切除，化学药物及放射是肺癌的三种主要治疗方法。由于大约2/3肺癌病人在诊断时已为晚期，没有施行手术的条件，可采用化学药物及放射治疗。近年来，尽管新药不断问世，但治疗效果仍未得到根本改善，目前仍採用以细胞毒药物—铂类化合物为主的治疗方案，其治疗非小细胞肺癌(NSCLC)有效率仅为20-30％，中位生存期仅6-8个月。以细胞毒药物为主的药物治疗存在的主要问题是：肿瘤对药物产生耐药性，最终导致治疗失败。因此，研究克服肿瘤耐药性，增加药物敏感性的方法和机理是十分必要的。
人癌细胞对细胞毒药物的耐受(或不敏感)机理十分复杂，目前尚不完全清楚。细胞毒药物通过干扰细胞DNA合成及复制，产生自由基，改变细胞膜通透性，影响细胞代谢等多种途径和机制杀伤肿瘤细胞。事实上，癌细胞的分子异常及机体的遗传背景也导致了细胞产生多种因素对抗药物的作用，如：药物靶点的异常改变，存活和生长信号的扩增，药物诱发DNA破坏的修复，细胞膜运输药物出入的障碍等以及机体对药物的活化和减毒所引起的药物杀伤作用和机体的对抗作用之间的不平衡导致细胞存活或死亡的优势，决定了细胞对药物的耐受或敏感性.因此判断药物效果的关键是肿瘤细胞死亡的数量和受抑制程度。细胞程序性死亡(Apoptosis)是细胞重要的死亡途径。Apoptosis的外源和内源性两条信号传导通路分子的异常，是肿瘤细胞产生耐药性(或不敏感)的重要分子基础。
抑癌基因p53在细胞诱导Apoptosis两条信号传导通路上起着重要作用。p53蛋白作为特殊序列转录因子，对刺激的应急反应，可转录活化Apoptosis信号传导通路的分子。P53表现为在多个水平上和以多种机制调节Apoptosis.P53异常所导致的Apoptosis信号传通路的异常，在肿瘤细胞对药物产生耐药性(或不敏感)中起重要作用。在肺癌中p53基因异常率较其它肿瘤高。在NSCLC中，突变率约在50％以上。基础和临床的研究报告均证明了不同p53基因状态的肿瘤细胞对化疗药物具有不同的敏感性。P53突变的瘤细胞明显耐受抗肿瘤药物。将外源重组P53质粒转染到缺失P53的癌细胞可以增加细胞对抗肿瘤药物敏感和经腺病毒界导p53到荷瘤裸鼠也可以增加肿瘤对抗肿瘤药物敏感，显示了p53在克服肿瘤细胞耐药性，增加抗肿瘤药物敏感性中起重要作用。
本发明人在研究中发现p53去除C-末端后比全长-p53在增加肺癌细胞对抗肿瘤药物敏感性的作用更有意义。也就是说业已证明了的癌细胞中由p53基因异常所导致的对抗肿瘤药物耐受可通过外源全长p53改善，而本发明人又发现了在p53去除C-末端后更能增强肺癌细胞对抗肿瘤药物敏感。提示p53C-末端DNA序列与肺癌细胞对抗肿瘤药物敏感性有关。目前，国内外尚未见去除C-末端p53增加非小细胞肺癌细胞对抗肿瘤药物的敏感性的报告。
p53蛋白由393个氨基酸构成(N端1~99，蛋白中心区99~291，C端291~393)。中心区与特殊DNA序列结合转录活化下游靶基因，是实现p53抑癌功能和诱导Apoptosis的最重要基础。中央区连结特殊DNA序列和转录活化靶基因受到多个水平的调节。其中p53C-末端对中央区有负性调节作用。因此干扰或去除p53C-术端负性调节，有可能增加p53活性。当C-末端被抗体封闭，被磷酸化，或去除C-末端等都能在体外试验条件下增强中央区与特殊DNA的结合和转录能力，增强p53抑癌功能。合成的C末端肽可恢复癌细胞中突变p53活性。近来，有作者报告影响Apoptosis的重要分子IGFβ-3转录活化的作用，证明了p53C-末端抑制p53的活化和诱导Apoptosis。体外试验证明，合成的p53C-末端多肽，与全长-p53相比更能增强携带野生型p53和携带突变型p53癌细胞诱导的Apoptosis的能力。但去除C-末端p53和C末端肽作用的机理复杂，仍不清楚。但从理论上，去除C-末端后，增加p53 apoptosis功能从而增加抗肿瘤药物敏感性是可能的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种截短的抑癌基因p53及其重组质粒，和转基因人肺癌细胞株。提供了该基因重组的缺陷型腺病毒质粒及制备的腺病毒。证明了将该重组质粒及腺病毒转染到肿瘤细胞能够增强肿瘤对抗肿瘤药物药物的敏感性，提示了p53C-末端缺失的编码核苷酸和终止密码子后非编码核苷酸序列，可能是抑制抗肿瘤药物作用的部位，从理论上拓宽了对肺癌耐药性(或药物敏感性)的认识。而且在研发增加抗肿瘤药物敏感性的相关分子，以提高肺癌治疗效果方面有很好的应用前景。
本发明提供的技术方案是：一种截短的抑癌基因p53，相对于全长p53基因，去掉了编码C-末端的第356-393位37个氨基酸的核苷酸序列，并同时缺失终止密码子后的非编码序列。缺失的C-末端编码的第356-393位氨基酸的核苷酸序列如下：aaggagccaggggggag cagggctcac tccagccacc tgaagtccaa aaagggtcag tctacctccc gccataaaaa actcatgttcaagacagaag ggcctgactc agac。
本发明还提供一种重组的真核细胞表达质粒，该质粒含有上述截短的p53基因。
本发明还提供一种转基因人肺癌单克隆细胞株，它是由上述重组质粒通过转染人肺癌细胞系获得。
本发明还提供一种含有上述截短的抑癌基因p53的缺陷型腺病毒重组质粒，该质粒的制备方法包括如下步骤：
(1)将上述截短的抑癌基因p53与pAd-Track质粒联接，构建pAd-Track-p53重组质粒；
(2)将步骤(1)中的pAd-Track-p53重组质粒与E1、E3联合缺失的5型腺病毒骨架Easy共转染大肠杆菌，通过在大肠杆菌中质粒间同源重组得到缺陷型重组腺病毒质粒Tracd-eazy-p53。
同时，本发明还提供一种缺陷型腺病毒，它是由上述制备方法得到的缺陷型重组腺病毒质粒Tracd-eazy-p53转染293包装细胞制得。
本发明还提供一种p53的C-末端DNA序列，它是全长抑癌基因p53的编码位于C-末端的第356-393位氨基酸的核苷酸序列，具体地是：aaggagc caggggggag cagggctcactccagccacc tgaagtccaa aaagggtcag tctacctccc gccataaaaa actcatgttc aagacagaagggcctgactc agac。
同时，本发明还提供一种p53蛋白的C-末端356-393位37个氨基酸多肽，它是由上述p53的C-末端DNA序列编码，该多肽是：
KEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD。
本发明具有如下优点：本发明证明了去C-末端P53与增加人肺癌细胞对抗肿瘤药物敏感性有关，拓宽了对肺癌耐药性(或药物敏感性)的认识，具有重要的理论意义，而且在研发增加抗肿瘤药物敏感性的相关分子，以提高肺癌治疗效果方面有很好的应用前景。
附图说明
图1.pEGFP-p53(del)测序结果。
图2.pEGFP-p53(total)测序结果。
图3.检测转染细胞株pEGFP801D重组质粒上GFP(绿色荧光蛋白)表达的结果。
图4.检测转染细胞株外源p53基因结果，图中，1.分子标记，2.pEGFPp53(total)，3.pEGFPp53(del)，4.pEGFP。
图5.Adp53(del)增加了荷肺癌裸鼠对顺伯(DDP)的敏感性结果。
图6.Adp53(del)增加了荷肺癌裸鼠对诺维本(NVB)的敏感性结果。
图7.Adp53(del)增加了荷肺癌裸鼠对泰素(TAX)的敏感性结果。
具体实施方式
1、构建重组质粒和转基因单克隆细胞株：
(1)构建去除C末端的p53和全长p53真核细胞表达质粒。
构建去C末端的p53重组质粒：p53来源于cDNA重组质粒pc-p53-SN(由美国FOXChase癌中心提供)。按照所需去除p53蛋白C未端编码碱基序列，即去除C末端终止密码子前111个碱基和所有非编码碱基序列。设计扩增引物：引物1：5-aagctt(HidIII)ggcacg agc cac cgt cca ggg agc agg tag-3，引物2：3-ggatcc(BamH1)agt ccc agc ctgggc atc ctt gag ttc-5。用PCR方法扩增所需的p53基因片段，定向插入到质粒pEGFP-N1)HidIII和BamH1多克隆位点，测序证明p53基因为正向连接于pEGFP-N1，显示p53的C末端终止密码子前有111个碱基缺失和终止密码子后的所有非编码序列缺失(图2)，获去除C未端的人p53基因重组真核表达质粒pEGFP-p53(del)。
构建含p53全长的真核表达质粒：用BamHI酶切重组质粒PC-p53-SN，获1.8kbp53cDNA，从pEGFP-N1质粒多克隆位点Baml插入，获全长p53真核表达质粒pEGFP-p53(total)。测序证明p53基因为正向连结，pEGFPp53(total)没有p53碱基缺失(图1)
空载质粒为pEGFP。
构建去除C末端p53重组真核表达质粒pEGFP-p53(del)也可用文献报导的方法(汪惠等，中华肿瘤杂志，2003年11月第25卷第6期)
2、建立转染单克隆细胞株
细胞系：人肺癌细胞系801D由解放军第301医院建立和赠送。801D细胞的p53基因在248位密码有杂合缺失和存在CGG→CTT颠换，有p53突变蛋白表答。转染pEGFP、pEGFP-p53(del)和pEGFP-53(total)到801D细胞，经G418筛选耐受集落，每种质粒转染的耐受集落分别经稀释法于96孔板筛选单细胞克隆，扩增培养，传代后建立转染细胞株pEGFP801D、pEGFP-p53(del)801D和pEGFP-53(total)801D.pEGFP801D、pEGFP-p53(del)801D，GFP均表达，pEGFP-53(total)801D不表达，请参见图3。PCR证明外源p53基因存在于pEGFP-p53(del)801D和pEGFP-53(total)801D，请参见图4。
3、体外药物敏感试验
经体外MTT法比较了pEGFP-p53(del)801，DEGFP-p53(total)801D，PEGFP801，801D四种细胞对五种抗肿瘤药物(顺伯(DDP)，泰素(TAX)，诺维本(NVB)，键择(GEM)，五氟尿嘧啶(5FU))敏感性，发现pEGFP-p53(total)801D仅对三种药物(顺伯，泰素，五氟尿嘧啶)敏感。pEGFP-p53(del)对五种药物都敏感，而且凋亡细胞比率增加，具体结果见表1至表5。
表1801D及3种细胞株对各种细胞毒药物的IC50比较
| 801D | pEGFP801D | PEGFPp53(total)801D | PEpGFPp53(del)801D | |
| DDP(ug/ml) | 0.59±0.11 | 0.79±0.07 | 0.488±0.14* | 0.39±0.12*# |
| TAX(ng/ml) | 8.60±1.40 | 6.15±1.85 | 2.40±0.40*# | 2.20±0*# |
| 5FU(ug/ml) | 4.79±1.05 | 3.30±0.80 | 2.07±0.12* | 1.37±0.13*# |
| NVB(ng/ml) | 4.90±0.10 | 4.30±1.20 | 8.25±5.05 | 1.40±0.30Δ |
| GEM(ng/ml) | 20.50±7.50 | 26.00±1.00 | 20.50±6.50 | 1.210±0.95Δ |
所得数据为3-4次实验的平均值。其中，*为与801D相比，P＜0.05 #为与pEGFP801D相比，P＜0.05 Δ为pEGFP-p53(del)801D与801D，pEGFP801D，PEGFPp53(wtp)801D相比，P＜0.05。
表2DDP处理各转染细胞株的细胞周期改变
| 药物处理后24hrs | G1 | S | G2 |
| 801D | 30.9％ | 61.8％ | 7.3％ |
| pEGFP | 31％ | 54.8％ | 13.8％ |
| pEGFPp53(total) | 46.6％ | 46.8％ | 6.6％ |
| pEGFPp53(del) | 31.5％ | 58％ | 10.3％ |
| 药物处理后48hrs | |||
| 801D | 43％ | 44％ | 12.9％ |
| pEGFP | 40.8％ | 40.3％ | 18％ |
| pEGFPp53(total) | 36.9％ | 40.1％ | 23％ |
| pEGFPp53(del) | 35.8％ | 47.6％ | 16％ |
表3TAX处理各转染细胞株的细胞周期改变
| 处理后24hrs | G1 | S | G2 |
| 801D | 16％ | 45.3％ | 38.6％ |
| pEGFP | 15％ | 59.4％ | 25.％ |
| pEGFPp53(total) | 4.50％ | 12％ | 83.6％ |
| pEGFPp53(del) | 3.50 | 19.9％ | 76.6％ |
| 处理后48hrs | |||
| 801D | 18.7％ | 60.4％ | 20％ |
| pEGFP | 14.7％ | 62.4％ | 22％ |
| pEGFPp53(total) | 16.1％ | 41.9％ | 40％ |
| pEGFPp53(del) | 13％ | 36.2％ | 50.8％ |
表45FU处理的细胞周期改变
| 处理后24hrs | G1 | S | G2 |
| 801D | 31.7％ | 58％ | 9.6％ |
| PEGFP | 29.4％ | 60％ | 10.2％ |
| pEGFPp53(total) | 23％ | 63.9％ | 12.9％ |
| pEGFPp53(del) | 37.9％ | 47.3％ | 14.8％ |
| 处理后72hrs | |||
| 801D | 40.4％ | 40.9％ | 18.7％ |
| pEGFP | 39.7％ | 40.8％ | 19.4％ |
| pEGFPp53(total) | 33.6％ | 50％ | 16.4％ |
| pEGFPp53(del) | 41.7％ | 52.8％ | 10.4％ |
表5NVB处理的转染细胞株细胞周期改变
| 处理后24hrs | G1 | S | G2 |
| 801D | 33.5％ | 47.6％ | 18.9％ |
| PEGFP | 35.2％ | 46％ | 18.5％ |
| pEGFPp53(total) | 21.9％ | 16.2％ | 61.9％ |
| pEGFPp53(del) | 25.2％ | 29.2％ | 45.6％ |
4、构建缺陷型重组腺病毒p53
采用He.T.C(1998年)建立的Ad Track-Eazy转基因系统，传递外源基因。质粒由北京肿瘤研究所提供。去C-末端p53重组质粒Track-P53(del)和全长p53(1.8kbp)Track-P53质粒的构建。方法：用HindIII和BamH1酶切重组质粒pEGFP-p53(del)获得去C-末端的P53片段。经TrackHidIII和BigII(BamH1同尾酶)多克隆位点定向插入，测序证明p53基因正向连接于Track，经测序和gene bank公共数数据库blast证明显示p53的C末端终止密码子前有111个碱基缺失和终止密码子后的所有非编码序列缺失，获去除C未端的人p53基因重组质粒，Track-P53(del)。
构建含p53全长的表达质粒：用BamHI酶切重组质粒PEGFP-p53获得去C-末端的P53片段，从Track质粒BamHI多克隆位点插入，获全长p53真核表达质粒Track-p53(total)。测序证明p53基因为正向连结，没有p53碱基缺失.构建去C-末端重组质粒Track-P53(total).Track(空载体)无p53存在。
5、制备缺陷型腺病毒：将三种重组质粒Track-P53(total)，Track-P53(del)，Track，用电转移方法分别与5型腺病毒骨架Easy(已去除E1和E3)共转染大肠杆菌在大肠杆菌中质粒间同源重组，经琼脂电泳DNA分析得到不同构象重组体，进一步用BamH1和pacI酶切重组体，琼脂电泳证明和筛选出Track-Eazy，Track-Eazy-p53(del)，Track-Eazy-p53(total)三种重组体，将其分别转染293包装细胞，得到三种缺陷型腺病毒Ad-，Ad-p53(del)，Ad-p53(total)。
用MOI(Multiplicity of infection)方法测定病毒浓度。
6、进行体外病毒感染人肺癌801D细胞实验
实验证明：50倍于细胞数量的三种病毒，48小时后50％以上细胞被感染。集落形成试验证明，与Ad-P53(tota)l，Ad-感染的细胞相比，Ad-P53(del)集落形成降低。
7、荷瘤裸鼠体内药物敏感性初步试验
每次试验一种药物，方法为体外分别以50倍于细胞数量的三种病毒Ad-，Ad-53(del)，Ad-P53(total)感染801D细胞。行裸鼠移植，共分6组，三组分别为已行裸鼠移植的三种病毒感染细胞，同时腹腔注射同一种药物为试验组，另三组为仅行三种病毒感染细胞裸鼠移植，而无注射药物对照组。以成瘤率，平均瘤重，抑瘤率为药物敏感指标。荷瘤裸鼠体内药物敏感性试验结果见表6、表7和图5至图7。
表6Ad-p53(DEL)与Ad-p53感染801D细胞与药物合并肿瘤移植率的比较
| DDP | 5FU | TAX | NVB | |||||
| - | + | - | + | - | + | - | + | |
| Ad | 6/6 | 8/8 | 6/6 | 6/6 | 4/4 | 6/6 | 5/6 | 4/4 |
| Ad-p53(TOTA)Ad-p53(DEL) | 6/65/6 | 7/84/7 | 6/64/6 | 4/64/6 | 6/65/6 | 8/82/8 | 4/64/6 | 6/60/6 |
表7Ad-p53(DEL)与Ad-p53肿瘤重量和抑瘤率的比较
| 分组 | DDP | TAX | 5FU | NVB | ||||||||
| 平均瘤重(g) | 抑瘤 | 平均瘤重(g) | 抑瘤率 | 平均瘤重(g) | 抑瘤率 | 平均瘤重(g) | 抑瘤率 | |||||
| + | - | + | - | + | - | + | - | |||||
| AdAd-p53(total)Ad-p53(DEL) | 0.450.110.07 | 0.90.880.175 | 50％84％92.2％ | 0.50.790.04 | 0.70.0.780.45 | 28％093％ | 0.40.250.21 | 0.420.60.325 | 0.2％41％50％ | 0.730.730.008 | 0.880.50.04 | 17％17％99％ |
+：加入药物组 -：不加药物组
Claims (9)
1.一种截短的抑癌基因p53，其特征为：相对于全长p53基因，缺失编码C-末端的第356-393位氨基酸的核苷酸序列及同时缺失终止密码子后的非编码序列。
2.一种真核细胞表达重组质粒，其特征为：含有权利要求1所述的基因。
3.一种转基因人肺癌单克隆细胞株，其特征为：它由权利要求2所述的重组质粒通过转染人肺癌细胞系获得。
4.一种缺陷型腺病毒重组质粒，其特征为：含有权利要求1的基因。
5.如权利要求4所述的重组质粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的基因与Track质粒联接，构建Track-P53重组质粒；
(2)将步骤(1)中的Track-P53重组质粒与E1、E3联合缺失的5型腺病毒骨架Easy共转染大肠杆菌，通过在大肠杆菌中质粒间同源重组得到缺陷型腺病毒重组质粒Tracd-eazy-p53。
6.一种缺陷型腺病毒，其特征为：它是由权利要求5得到的重组缺陷型腺病毒质粒Tracd-eazy-p53转染293包装细胞获得。
7.一种截短的p53蛋白，其特征为：由权利要求1的基因所编码。
8.p53基因的C-末端DNA序列，其特征为：它是全长抑癌基因p53的编码位于C-末端的第356-393位氨基酸的核苷酸序列。
9.一种p53蛋白C-末端多肽，其特征在于：是由权利要求8所述的DNA序列编码的p53蛋白C-末端第356-393位37个氨基酸组成。
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