CN110248671B - 包含溶瘤痘病毒和nk细胞的治疗剂及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用 - Google Patents
包含溶瘤痘病毒和nk细胞的治疗剂及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
提供了包含溶瘤痘病毒和NK细胞的治疗剂及其在制备治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。所述治疗剂的活性成分包括溶瘤痘病毒和NK细胞，所述溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及包含溶瘤痘病毒和NK细胞的治疗剂及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是导致人类死亡的主要疾病，主要治疗方法有手术、放疗和化疗。生物治疗是近年发展起来的、被称为治疗恶性肿瘤的第四种方法，它包括了肿瘤疫苗疗法、肿瘤非特异性免疫疗法、单抗免疫导向疗法、细胞因子疗法、过继细胞免疫疗法、肿瘤基因疗法等。病毒治疗癌症的方法也属于生物治疗范畴，近二十年来发展相当迅速。目前病毒治疗最大的进展之一是利用肿瘤细胞与正常细胞的差异，对某些病毒结构进行改造，使其能选择性地在肿瘤细胞中复制，最终达到杀死肿瘤细胞的目的。这些被改造后的病毒，根据其功能被统称为溶瘤病毒，其来源自腺病毒、疱疹病毒和痘病毒等。目前发现某些野生型病毒也具有在肿瘤细胞中选择性复制而溶瘤的功能。
在中国上市的一种溶瘤病毒注射液的成分是经基因改造的5型腺病毒H101，从而有利于病毒在肿瘤细胞中的复制。H101主要是删除了人5型腺病毒的E1B区55KD和E3区基因片段，具有在肿瘤细胞中特异性复制而最终导致溶瘤的特性。其机理之一是野生型腺病毒基因中E1B区编码的55KD蛋白可以与p53蛋白相结合，从而抑制p53基因对腺病毒的清除作用。由于病毒不能编码产生E1B-55KD蛋白，使得病毒在p53正常的细胞中不能复制。而在p53基因突变的肿瘤细胞中，因无p53基因的抑制作用，所以病毒可以大量复制。此外，E3区基因片段的删除使得病毒在体内易于被免疫系统(例如NK细胞)识别并清除，增加了临床应用的安全性。目前的观点是，不仅仅p53本身的突变，只要p53通路的缺陷都有利于H101的选择性复制。H101通过瘤内注射给药，在肿瘤细胞中大量复制，最终导致肿瘤细胞的溶解和死亡。
由美国FDA批准的一种溶瘤病毒药T-Vec的成分是基因工程修饰过了的1型单纯疱疹病毒HSV-1。在T-Vec中删除了ICP34.5和ICP47基因并插入了人免疫激活蛋白粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因，它可以在肿瘤细胞内复制并表达GM-CSF。将其直接注射到黑色素瘤病灶中可造成肿瘤细胞的溶解，从而使肿瘤细胞破裂，并释放出肿瘤源性抗原和GM-CSF，加速抗肿瘤的免疫应答。然而据安进公司称，该作用的确切机制尚不清楚。2015年10月27日，FDA批准T-Vec作为首次手术后复发的黑色素瘤患者不可切除病灶的局部治疗方案。
痘病毒是一类体积较大的病毒，由野生型痘病毒通过基因修饰得到的溶瘤病毒在肿瘤细胞中复制的特异性大大提高。其中，有的溶瘤痘病毒中删除了痘病毒DNA中表达胸腺嘧啶激酶(Thymidine kinase(TK))的基因，从而使得该溶瘤病毒不能在正常细胞内复制增殖。与正常细胞不同，肿瘤细胞会合成胸腺嘧啶激酶提供给溶瘤病毒复制使用，因此痘溶瘤病毒可以在肿瘤细胞中大量复制。此外有的溶瘤痘病毒中删除了表达VGF的基因，增强了病毒在肿瘤细胞内的特异增殖，最终导致肿瘤细胞的溶解和死亡。还有的溶瘤痘病毒中既删除了TK基因又删除了VGF基因。目前痘溶瘤病毒尚未有上市的产品。与腺病毒和疱疹病毒来源的溶瘤病毒相比，痘溶瘤病毒是具有可通过静脉注射全身给药并且到达肿瘤靶点的给药优势的。此外，痘病毒基因组庞大，便于进行有助于提高肿瘤杀伤性的基因修饰。
然而，用溶瘤病毒单独治疗肿瘤的疗效有时并不十分理想，溶瘤病毒与化疗药物联合使用治疗肿瘤时，由于化疗药物对正常细胞同等杀伤，会带来强烈的副作用。
NK细胞(自然杀伤细胞)是人体内的一种非特异性的先天免疫细胞，来源于骨髓，在体内几乎所有器官中都有存在，是表型为CD3阴性CD56阳性的单一细胞，主要有CD16阴性CD56bright(亮)和CD16阳性CD56dim(暗)两种亚型，分别有免疫调节和肿瘤杀伤的体内功效。NK细胞缺乏MHCI的免疫抗原簇(组)，因此不会发生针对宿主正常细胞的免疫应激反应(GvHD)。NK细胞的体外培养具有容易质检和可做异体应用的优点。NK细胞在体内含量较T细胞少，但反应时间短，主要起免疫哨兵作用，可直接杀伤癌细胞，尤其是导致复发转移的微小癌变病灶和循环系统肿瘤细胞。NK细胞也可以抑制病毒，例如抑制乙肝病毒和导致宫颈癌的疱疹病毒，还可清除衰老细胞。然而，NK细胞对癌细胞和病毒的杀伤作用是非特异性的，单一使用NK细胞治疗癌症的疗效仍有待提高，目前使用NK与单抗的联合治疗可达到不错的疗效，但是由于单抗具有脱靶的可能，因此其使用有局限性。
目前在肿瘤和/或癌症的免疫治疗中，仍然需要更加有效的治疗方案和由此开发出的药物。
发明内容
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了治疗剂、药物组合物、试剂盒及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用、以及治疗肿瘤和/或癌症的方法。所述治疗剂、组合物、方法和试剂盒可以用多种实施方式实施。
在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗剂或药物组合物，包含：(a)第一药物组合物，其中该第一药物组合物包含位于第一可药用载体中的溶瘤痘病毒；和(b)第二药物组合物，其中该第二药物组合物包含位于第二可药用载体中的NK细胞；其中所述溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制。
在另一个实施方案中，本发明还提供了所述治疗剂或药物组合物在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。
在又一个实施方案中，本发明还提供了一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括：装有溶瘤痘病毒的第一容器和装有NK细胞的第二容器，其中所述第一容器和所述第二容器是独立的；以及载明给药时机和给药方式的说明书；其中所述溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制。
在又一个实施方案中，本发明还提供了一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括以下依次进行的步骤：1)对肿瘤和/或癌症患者施用溶瘤痘病毒，该溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制；2)在施用所述溶瘤痘病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用NK细胞。
具体而言，本发明提供了：
一种药物组合物，其中该药物组合物的活性成分包括溶瘤痘病毒和NK细胞，所述溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制；优选的是，该药物组合物的活性成分由所述溶瘤痘病毒和NK细胞组成。
在一些例子中，所述溶瘤痘病毒和所述NK细胞各自独立地存在于所述药物组合物中而互不混合。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以包含治疗有效量的所述溶瘤痘病毒，并且所述药物组合物可以包含1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。在一些实施方案中，所述溶瘤痘病毒是TK基因和/或VGF基因功能缺陷型的。在一些实施方案中，所述溶瘤痘病毒选自：Pexa-vac、JX-963、JX-929、VSC20、GL-ONC1、和/或TG6002。
在一些实施方案中，所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
所述药物组合物中所包含的溶瘤痘病毒可以通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞可以通过静脉给药。
在某些实施方案中，所述药物组合物的活性成分包含1×105至5×109pfu/天剂量的溶瘤痘病毒和1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞；优选的是，该药物组合物的活性成分由1×105至5×109pfu/天剂量的溶瘤痘病毒和1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞组成。
本发明另一个方面提供了所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。
所述肿瘤和/或癌症可以包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病。
本发明还提供了治疗剂。在一个实施方案中，所述治疗剂可以包含：(a)第一药物组合物，其中该第一药物组合物包含位于第一可药用载体中的溶瘤痘病毒；和(b)第二药物组合物，其中该第二药物组合物包含位于第二可药用载体中的NK细胞；其中所述溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制。
所述第一可药用载体可以与所述第二可药用载体相同或不同。
在一些实施方案中，所述第一药物组合物和所述第二药物组合物各自独立地存在于所述治疗剂中而互不混合。在一个实施方案中，所述第一药物组合物的活性成分为所述溶瘤痘病毒，并且其中所述第二药物组合物的活性成分为所述NK细胞。
可以使用各种合适的剂量。在某些实施方案中，所述第一药物组合物包含治疗有效量的所述溶瘤痘病毒，并且所述第二药物组合物包含1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞。
可以使用各种合适的溶瘤痘病毒。在某些实施方案中，所述溶瘤病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。例如，所述溶瘤痘病毒是TK基因和/或VGF基因功能缺陷型的。在一些实施方案中，所述溶瘤痘病毒选自：Pexa-vac、JX-963、JX-929、VSC20、GL-ONC1、和/或TG6002。
可以使用各种合适的NK细胞。在某些实施方案中，所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞。优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
可以采用各种合适的给药方式。例如，所述溶瘤痘病毒配制成通过瘤内注射给药或静脉给药；并且其中所述NK细胞配制成通过静脉给药。
在所述治疗剂的特定的实施方案中，所述第一药物组合物的活性成分包含1×105至5×109pfu/天剂量的溶瘤痘病毒，并且所述第二药物组合物的活性成分包含1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞。在另一些特定的实施方案中，所述第一药物组合物的活性成分由1×105至5×109pfu/天剂量的溶瘤痘病毒组成，并且其中所述第二药物组合物的活性成分由1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞组成。在另一些特定的实施方案中，所述治疗剂由所述第一药物组合物和所述第二药物组合物组成。
在一些实施方案中，所述治疗剂可以用于制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物。所述肿瘤和/或癌症包括但不限于肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病。
本发明还提供了一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒。在某些实施方案中，所述药盒包括分别独立地装有溶瘤痘病毒和NK细胞的独立容器，以及载明给药时机和给药方式的说明书；所述溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制。
在一些实施方案中，所述药盒的装有溶瘤痘病毒的独立容器包含治疗有效量的所述溶瘤痘病毒，并且所述装有NK细胞的独立容器包含1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。在一些实施方案中，所述溶瘤痘病毒是TK基因和/或VGF基因功能缺陷型的。在一些实施方案中，所述溶瘤痘病毒选自：Pexa-vac、JX-963、JX-929、VSC20、GL-ONC1、和/或TG6002。
所述药盒中的所述NK细胞可以选自自体NK细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
所述肿瘤和/或癌症可以包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘病毒配制成通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞配制成通过静脉给药。
在特定的实施方案中，所述第一容器包含1×105至5×109pfu/天剂量的溶瘤痘病毒，并且所述第二容器包含1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞。
本发明还提供了一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括以下依次进行的步骤：
1)对肿瘤和/或癌症患者施用溶瘤痘病毒，该溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制；
2)在施用所述溶瘤痘病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用NK细胞。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。在一些实施方案中，所述溶瘤痘病毒是TK基因和/或VGF基因功能缺陷型的。在一些实施方案中，所述溶瘤痘病毒选自：Pexa-vac、JX-963、JX-929、VSC20、GL-ONC1、和/或TG6002。
在一些实施方案中，所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
在一些实施方案中，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病。
在某些实施方案中，所述溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，每天1次，连续施用1-6天；所述NK细胞的施用剂量为1×107至1×1010个细胞/天剂量，每天1次，连续施用1-6天。或者，所述溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，每2天1次，连续施用2-6天；所述NK细胞的施用剂量为1×107至1×1010个细胞/天剂量，每2天1次，连续施用2-6天。
可以采用各种合适的给药方式。例如，在一些实施方案中，所述溶瘤痘病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞通过静脉给药。
在所述方法的特定实施方案中，所述溶瘤痘病毒的施用剂量为1×105至5×109pfu/天。
下文还描述了其它实施方案。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
本发明首次提出将溶瘤病毒与NK细胞联用以治疗肿瘤和/或癌症的构思，基于该构思而提供的药物组合物和方法能够充分发挥溶瘤病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞、以及进一步引起随后的机体免疫反应的作用，同时还能够充分发挥NK细胞杀伤肿瘤细胞的功能，并且巧妙地利用了溶瘤病毒选择性地在肿瘤细胞中复制的特点，使得含有溶瘤病毒的肿瘤细胞成为了NK细胞的特异性靶标，从而进一步增强了NK细胞的肿瘤杀伤作用。本发明发现仅将溶瘤病毒与NK细胞联用产生协同效果。此外，溶瘤病毒与NK细胞均有识别肿瘤细胞的特性，对正常细胞基本不会造成杀伤，两者的联合使用在安全性和疗效性上都有显著的优势。
进一步地，本发明通过理论探索和实验研究，使得溶瘤病毒和NK细胞各自的施用剂量、施用顺序和施用间隔能够使两者的联合施用达到最大效率的协同作用，同时避免了两者之间的相互制约，从而达到有效地治疗肿瘤和/或癌症的效果。
定义
在本发明中，词语“肿瘤”、“癌症”、“肿瘤细胞”、“癌细胞”涵盖本领域通常认为的含义。
本文所用的词语“溶瘤病毒”是指能够选择性地在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞的病毒。溶瘤病毒可以为经基因改造的病毒和野生型病毒。
本文所用的词语“治疗有效量”是指功能药剂或药物组合物能够表现出可检测的治疗效果或抑制效果的量，或者起到抗肿瘤效果的量。所述效果可以通过本领域任何已知的检验方法检测。例如，一些治疗有效量列于表1的“临床施用剂量范围或最佳施用剂量”栏中。
本文所用的词语“给药”或“施用”是指向受试者提供化合物、复合物或组合物(包括病毒和细胞)。
本文所用的词语“患者”是指人或非人类生物。因此，本文所述的方法和组合物适用于人类疾病和兽类疾病。在一些实施方案中，患者患有肿瘤。在一些例子中，患者同时患有一种或多种类型的癌症。
本文所用的词语“协同效果”是指两种或多种药剂共同起到的效果，该效果大于其中各药剂的单独效果的总和。
本文所用的术语“pfu”或“蚀斑形成单位”(plague forming unit)是指：产生一个蚀斑的病毒量称为一个蚀斑形成单位(pfu)。
本文所用的术语“VP”是指病毒颗粒的个数。
本文所用的术语“VP/kg”是指病毒颗粒数/千克患者体重。
本文所用的术语“TCID50”是指半数组织培养感染剂量(median tissue cultureinfective dose)，表示使半数组织培养物遭受感染，而发生细胞病变的病毒剂量。
本文所用的术语“MOI”或“感染复数”(Multiplicity of infection)也即，病毒与细胞个数比，是指用以起始病毒感染的每个细胞感染病毒颗粒的粒数。MOI＝pfu/细胞，即细胞个数×MOI＝总PFU。
附图说明
图1示出本申请试验例A1中NK细胞对A549细胞杀伤剂量试验的结果。
图2示出本申请试验例A2中H101对A549细胞杀伤剂量试验的结果。
图3示出本申请实施例A4中H101/NK细胞联合杀伤实验的结果。
图4示出本申请对比例A5中H101与NK细胞同时联合给药的结果。
图5示出本申请实施例A4中H101/NK细胞联合杀伤实验与对比例A5中H101与NK细胞同时联合给药的结果的比对图。
图6示出本申请对比例A6中H101与NK细胞反向联合给药的结果。
图7示出本申请对比例A7中H101/NK细胞联合给药对正常细胞杀伤作用的结果。
图8示出本申请实施例A8中联合给药实验的剂量爬坡实验的结果，其中连接方块的曲线代表先H101后NK给药杀伤A549细胞的结果；连接三角形的曲线代表H101和NK同时给药杀伤A549细胞的结果；连接圆形的曲线代表先NK后H101给药杀伤A549细胞的结果。
图9示出本申请试验例B1中NK细胞对HepG2细胞杀伤剂量试验的结果。
图10示出本申请试验例B2中H101对HepG2细胞杀伤剂量试验的结果。
图11示出本申请实施例B3中H101/NK细胞联合杀伤实验的结果。
图12示出本申请对比例B4中H101与NK细胞同时联合给药的结果。
图13示出本申请实施例B3中H101/NK细胞联合杀伤实验与对比例B4中H101与NK细胞同时联合给药的结果的比对图。
图14示出本申请对比例B5中H101与NK细胞反向联合给药的结果。
图15示出本申请实施例B6中联合给药实验的剂量爬坡实验的结果，其中连接方块的曲线代表先H101后NK给药杀伤HepG2细胞的结果；连接三角形的曲线代表H101和NK同时给药杀伤HepG2细胞的结果；连接圆形的曲线代表先NK后H101给药杀伤HepG2细胞的结果。
图16示出本申请试验例C1中NK细胞对HT29细胞杀伤剂量试验的结果。
图17示出本申请试验例C2中H101对HT29细胞杀伤剂量试验的结果。
图18示出本申请实施例C3中H101/NK细胞间隔24h联合杀伤实验的结果。
图19示出本申请对比例C5中H101与NK细胞同时联合给药的结果。
图20示出本申请实施例C3中H101/NK细胞联合杀伤实验与对比例C5中H101与NK细胞同时联合给药的结果的比对图。
图21示出本申请对比例C7中H101与NK细胞间隔24h反向联合给药的结果。
图22示出本申请实施例C9中联合给药实验的剂量爬坡实验的结果，其中连接方块的曲线代表先H101后NK给药杀伤HT29细胞的结果；连接三角形的曲线代表H101和NK同时给药杀伤HT29细胞的结果；连接圆形的曲线代表先NK后H101给药杀伤HT29细胞的结果。
图23示出本申请实施例C4中H101/NK细胞间隔48h联合杀伤实验的结果。
图24示出本申请对比例C6中H101与NK细胞同时联合给药的结果。
图25示出本申请实施例C4中H101/NK细胞联合杀伤实验与对比例C6中H101与NK细胞同时联合给药的结果的比对图。
图26示出本申请对比例C8中H101与NK细胞间隔48h反向联合给药的结果。
图27示出本申请实施例C10中联合给药实验的剂量爬坡实验的结果，其中连接方块的曲线代表先H101后NK给药杀伤HT29细胞的结果；连接三角形的曲线代表H101和NK同时给药杀伤HT29细胞的结果；连接圆形的曲线代表先NK后H101给药杀伤HT29细胞的结果。
图28示出本申请试验例C11中H101感染HT29细胞并培养至24h后细胞表面NKG2D配体的变化结果。
图29示出本申请试验例C12中H101感染HT29细胞并培养至48h后细胞表面NKG2D配体的变化结果。
图30示出本申请试验例D1中NK细胞对A549细胞杀伤剂量试验的结果。
图31示出本申请试验例D2中ddvv-RFP对A549细胞杀伤剂量试验的结果。
图32示出本申请实施例D3中ddvv-RFP/NK细胞联合杀伤实验的结果。
图33示出本申请对比例D4中ddvv-RFP与NK细胞同时联合给药的结果。
图34示出本申请对比例D5中ddvv-RFP与NK细胞反向联合给药的结果。
图35示出本申请试验例E1中ddvv-RFP对HepG2细胞杀伤剂量试验的结果。
图36示出本申请实施例E2中ddvv-RFP/NK细胞间隔24h联合杀伤实验的结果。
图37示出本申请对比例E4中ddvv-RFP与NK细胞同时联合给药的结果。
图38示出本申请对比例E6中ddvv-RFP与NK细胞间隔24h反向联合给药的结果。
图39示出本申请实施例E3中ddvv-RFP/NK细胞间隔48h联合杀伤实验的结果。
图40示出本申请对比例E5中ddvv-RFP与NK细胞同时联合给药的结果。
图41示出本申请对比例E7中ddvv-RFP与NK细胞间隔48h反向联合给药的结果。
图42示出本申请试验例F1中ddvv-RFP对HT29细胞杀伤剂量试验的结果。
图43示出本申请实施例F2中ddvv-RFP/NK细胞间隔24h联合杀伤实验的结果。
图44示出本申请对比例F4中ddvv-RFP与NK细胞同时联合给药的结果。
图45示出本申请对比例F6中ddvv-RFP与NK细胞间隔24h反向联合给药的结果。
图46示出本申请实施例F3中ddvv-RFP/NK细胞间隔48h联合杀伤实验的结果。
图47示出本申请对比例F5中ddvv-RFP与NK细胞同时联合给药的结果。
图48示出本申请对比例F7中ddvv-RFP与NK细胞间隔48h反向联合给药的结果。
图49示出本申请试验例G1中NK细胞联用对细胞对HCT116细胞杀伤剂量试验的结果。
图50示出本申请试验例G2中ddvv-RFP对HCT116细胞杀伤剂量试验的结果。
图51示出本申请实施例G3中ddvv-RFP/NK细胞联合杀伤实验的结果。
图52示出本申请对比例G4中ddvv-RFP与NK细胞同时联合给药的结果。
图53示出本申请对比例G5中ddvv-RFP与NK细胞反向联合给药的结果。
图54示出本申请试验例H1中NK细胞对FaDu细胞杀伤剂量试验的结果。
图55示出本申请试验例H2中ddvv-RFP对FaDu细胞杀伤剂量试验的结果。
图56示出本申请实施例H3中ddvv-RFP/NK细胞联合杀伤实验的结果。
图57示出本申请对比例H4中ddvv-RFP与NK细胞同时联合给药的结果。
图58示出本申请对比例H5中ddvv-RFP与NK细胞反向联合给药的结果。
图59示出本申请试验例I1中NK细胞对SK-HEP-1细胞杀伤剂量试验的结果。
图60示出本申请试验例I2中ddvv-RFP对SK-HEP-1细胞杀伤剂量试验的结果。
图61示出本申请实施例I3中ddvv-RFP/NK细胞联合杀伤实验的结果。
图62示出本申请对比例I4中ddvv-RFP与NK细胞同时联合给药的结果。
图63示出本申请对比例I5中ddvv-RFP与NK细胞反向联合给药的结果。
图64示出本申请试验例J1中NK细胞对PANC-1细胞杀伤剂量试验的结果。
图65示出本申请试验例J2中ddvv-RFP对PANC-1细胞杀伤剂量试验的结果。
图66示出本申请实施例J3中ddvv-RFP/NK细胞间隔48h联合杀伤实验的结果。
图67示出本申请对比例J4中ddvv-RFP与NK细胞同时联合给药的结果。
图68示出本申请对比例J5中ddvv-RFP与NK细胞间隔48h反向联合给药的结果。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
人体是一个复杂的系统，它是由呼吸、循环、消化等十大系统组成，这些系统协调配合，使人体内各种复杂的生命活动能够正常进行。系统化思考就是从整体观出发，把药物作用、疾病、系统和人体的相互联系、相互作用进行综合考察。
当前很多非细胞毒性抗肿瘤药物，在联合化疗治疗肿瘤时，患者的长期生存结果都不甚理想，其原因是缺少了系统思维的考虑。例如，当肿瘤发生后，机体可通过多种免疫效应机制发挥抗肿瘤作用，机体的抗肿瘤机制包括细胞免疫和体液免疫两个方面。它们联系密切，相互影响，涉及多种免疫效应分子和效应细胞。一般认为，细胞免疫在抗肿瘤过程中起到主导作用，体液免疫在某些情况下起协同作用。然而传统化疗主要是干扰RNA或DNA合成以及有丝分裂等，主要针对生长快速的细胞，在清除肿瘤细胞的同时也打击了人体正常的免疫系统，随着机体免疫力被摧跨，肿瘤细胞势必“抬头”。所以，很多靶向类非细胞毒性抗肿瘤药物，在联合化疗放疗时，应特别注意如何合理安排放化疗的顺序和强度，最大限度的保存机体免疫功能，这是提高疗效的关键。
在上述系统化思维的基础上，本发明认为可以采用其它提高机体免疫的方法，通过系统组合各种治疗手段，以最大可能地提高综合疗效，同时使对免疫系统的伤害最小化。因此，本发明提出了新的联合疗法，将溶瘤病毒与NK细胞联用以治疗肿瘤和/或癌症。特别是，本发明仅将溶瘤病毒与NK细胞联用就能够产生协同效果。
因此，本发明提供了一种治疗剂，包含：(a)第一药物组合物，其中该第一药物组合物包含位于第一可药用载体中的溶瘤病毒；和(b)第二药物组合物，其中该第二药物组合物包含位于第二可药用载体中的NK细胞；其中所述溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制。
在一些情况下，所述治疗剂也可以理解为药物的组合。
在一些实施方案中，所述第一药物组合物的活性成分为所述溶瘤病毒，并且其中所述第二药物组合物的活性成分为所述NK细胞。在一些实施方案中，所述第一药物组合物包含治疗有效量的所述溶瘤病毒，并且所述第二药物组合物包含1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞(优选地，所述第二药物组合物包含1×108至5×109个细胞/天剂量的所述NK细胞；还优选地，所述第二药物组合物包含1×109至4×109个细胞/天剂量的所述NK细胞；更优选地，所述第二药物组合物包含1×109至3×109个细胞/天剂量的所述NK细胞)。
本发明还提供了一种药物组合物，其中该药物组合物的活性成分包括溶瘤病毒和NK细胞，所述溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制。优选的是，该药物组合物的活性成分由所述溶瘤病毒和NK细胞组成。
优选地，所述溶瘤病毒和所述NK细胞各自独立地存在于所述药物组合物中而互不混合。
所有溶瘤病毒杀伤肿瘤细胞的机制都大体相似。在不同实施方案中，通过瘤内注射或静脉给药的方式，溶瘤病毒与肿瘤细胞接触，感染进入肿瘤细胞内。由于溶瘤病毒的特性是，其主要在肿瘤细胞内复制增殖，而在正常细胞内低复制或不复制，因此被感染的肿瘤细胞中会出现大量的溶瘤病毒，造成肿瘤细胞的溶解和死亡。肿瘤细胞的溶解会释放出大量的肿瘤抗原和增殖的溶瘤病毒，抗原会进一步激活体内的免疫系统，刺激体内的NK细胞和T细胞继续攻击尚未死亡的肿瘤细胞，同时新的溶瘤病毒会继续感染尚未被感染的肿瘤细胞。
NK细胞是广谱型杀伤肿瘤细胞的免疫细胞，NK细胞可以辨别肿瘤细胞与正常细胞的区别。NK通过与肿瘤细胞接触，识别确认其为非正常细胞，然后通过受体识别、抗体靶向识别(ADCC)、颗粒酶分泌、穿孔素分泌和分泌干扰素间接杀伤等多种协同手段，达到杀死肿瘤细胞的效果。体外实验显示，一个健康的NK细胞在生命期内可以连续杀死27个肿瘤细胞。
NK细胞还具有抗病毒的功能。当正常细胞感染了病毒后，随着病毒的大量复制，细胞体现出衰老病变，体现在细胞膜上的蛋白簇的组成发生变化，在这个过程中，NK细胞就可以敏锐而高效地识别被感染的细胞，通过类似于杀伤肿瘤细胞的上述手段，杀死被感染的细胞，从而达到抑制病毒复制增殖的目的。随后在抗原刺激和干扰素等因子的作用下，其它免疫细胞会持续作用，抵抗病毒。
本发明考虑了溶瘤病毒和NK细胞各自的特点，巧妙地将其联用，在联用时，NK细胞的抗病毒机制对于被溶瘤病毒感染的肿瘤细胞同样适用，并且与其抗肿瘤机制互补。此外，联用还使得含有溶瘤病毒的肿瘤细胞成为了NK细胞的特异性靶标，从而增强了NK细胞的肿瘤杀伤作用。溶瘤病毒选择性地在癌细胞内增殖，在胞内起作用杀伤癌细胞，同时能够导致癌细胞膜上的蛋白受体簇发生变化，增强NK细胞对癌细胞的识别，NK细胞在癌细胞外攻击，两者联合起来协同杀伤癌细胞，具有更好的治疗效果。
单独的野生型病毒与NK细胞之间具有互相制约的作用。一方面，病毒会通过刺激NK表面的KIR类受体，抑制NK的活性，从而逃脱NK的抗病毒杀伤；另一方面，NK除了识别并杀死被病毒感染的细胞，从而抑制病毒的增殖外，还可以直接分泌干扰素，抑制病毒活性。然而，由于很多溶瘤病毒都经过基因修饰，一方面可增强感染肿瘤细胞的特异性，另一方面减少了对包括NK细胞在内的免疫细胞的抑制。
本发明所述的溶瘤病毒包括具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。所述具有溶瘤作用的经基因突变的病毒包括(但不限于)：腺病毒(adenovirus)、痘病毒(也称痘苗病毒(vaccinia virus))、单纯疱疹病毒(herpes simplexvirus(HSV))、麻疹病毒(measles virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)和逆转录病毒(retrovirus)；所述具有溶瘤作用的野生型病毒包括(但不限于)：呼肠孤病毒(reovirus)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)、脊髓灰质炎病毒、塞内卡谷病毒(Seneca Valley Virus)、埃可型肠道病毒(echo enterovirus)、柯萨奇病毒(Coxsackie virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)和马拉巴病毒(marabavirus)。
所述溶瘤病毒的基因组中可以整合有外源基因，所述外源基因包括外源免疫调节基因、外源筛选基因、外源报告基因等。所述溶瘤病毒的基因组中也可以不整合任何外源基因。
所述腺病毒包括(但不限于)：人5型腺病毒或人嵌合型腺病毒；具体包括(例如)：Onyx-015(可得自Onyx Pharmaceuticals公司)、H101(可得自上海三维生物技术有限公司)、Ad5-yCD/mutTKSR39rep-hIL12(可得自Henry Ford Health System公司)、CG0070(可得自Cold Genesys公司)、DNX-2401(可得自DNAtrix公司)、OBP-301(可得自OncolysBioPharma公司)、ONCOS-102(可得自Targovax Oy公司/Oncos Therapeutics公司)、ColoAd1(可得自PsiOxus Therapeutics公司)、VCN-01(可得自VCN Biosciences公司)、ProstAtakTM(可得自Advantagene公司)等。
优选的是，所述腺病毒为H101。
所述痘病毒可以是惠氏株、WR株、李斯特株或哥本哈根株等。
所述痘病毒可以是TK基因功能缺陷型的、VGF基因功能缺陷型的、TK基因和VGF基因功能缺陷型的。所述痘病毒还可以包含其它基因功能缺陷，其它基因包括(但不限于)：HA、F14.5L、F4L。
优选的是，所述痘病毒是TK基因和VGF基因功能缺陷型的。
所述痘病毒包括(但不限于)：Pexa-vac(可得自Jennerex Biotherapeutics公司)、JX-963(可得自Jennerex Biotherapeutics公司)、JX-929(可得自JennerexBiotherapeutics公司)、VSC20(制备方法可参见科技文献：“McCart,JA,et al.Systemiccancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidinekinase and vaccinia growth factor genes.Cancer Res(2001)61:8751–8757.”)、GL-ONC1(可得自Genelux公司)、TG6002(可得自Transgene公司)等。
所述单纯疱疹病毒包括(但不限于)：HSV-1、HSV-2型单纯疱疹病毒；具体包括(例如)：
(可得自Amgen公司)、G207(可得自Medigene公司)、HF10(可得自TakaraBio公司)、Seprehvir(可得自Virttu Biologics公司)、OrienX010(可得自北京奥源和力生物公司)、NV1020(可得自Catherax公司)等。
上述病毒的具体例子如下表1所示。
表1本发明所述的溶瘤病毒列表
本发明所述的NK细胞包括自体NK细胞和异体NK细胞。所述NK细胞可以为经体外扩增得到的NK细胞。NK细胞的大规模体外扩增培养技术是已知的，并且已经基本成熟(参见(例如)以下科技文献：“Somanchi SS,Lee DA.Ex Vivo Expansion of Human NK CellsUsing K562 Engineered to Express Membrane Bound IL21.Methods Mol Biol.2016；1441:175-93.”或“Phan MT,Lee SH,Kim SK,Cho D.Expansion of NK Cells UsingGenetically Engineered K562 Feeder Cells.Methods Mol Biol.2016；1441:167-74.”)。临床数据证实自体NK细胞、半相合异体NK细胞(属于异体NK细胞)、以及脐血制备NK细胞回输人体后均无毒副作用，无长期依赖性，安全有效。
可用于治疗的NK细胞的纯度范围可以是：自体NK细胞的纯度可为大于等于85％，异体NK细胞的纯度可为大于等于90％；其中的杂质细胞可为NK-T和/或γδT细胞。优选地，NK细胞活性(存活率)大于等于90％，NK细胞杀伤力活性大于等于80％。
在本发明的所述联用治疗方案中，本发明进一步探索优化了溶瘤病毒和NK细胞各自的施用剂量、施用顺序和施用间隔，这几点是至关重要的，其决定了溶瘤病毒的抗肿瘤疗效、NK细胞的抗肿瘤疗效、以及两者对肿瘤细胞的最佳协同杀伤。
因此，优选地，所述药物组合物或治疗剂包含治疗有效量的所述溶瘤病毒，并且所述药物组合物或治疗剂包含1×107-1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞(优选地，所述药物组合物包含1×108至5×109个细胞/天剂量的所述NK细胞；还优选地，所述药物组合物包含1×109至4×109个细胞/天剂量的所述NK细胞；更优选地，所述药物组合物包含1×109至3×109个细胞/天剂量的所述NK细胞)。对于不同的溶瘤病毒，可以采用不同的优选临床剂量范围，例如表1所述的那样。
所述溶瘤病毒可采用其各自的本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。
NK细胞可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如可通过静脉给药。
在特定的实施方案中，本发明的药物组合物或治疗剂所包含的溶瘤病毒为具有溶瘤作用的腺病毒(下文也称为“溶瘤腺病毒”)。在一些例子中，所述具有溶瘤作用的腺病毒的E1区和/或E3区是经基因工程改造的。在一些例子中，所述具有溶瘤作用的腺病毒选自：Onyx-015、H101、Ad5-yCD/mutTKSR39rep-hIL12、CG0070、DNX-2401、OBP-301、ONCOS-102、ColoAd1、VCN-01、和/或ProstAtakTM。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物或治疗剂的活性成分包括5×107至5×1012VP/天剂量的溶瘤腺病毒(例如，5×107至1.5×1012VP/天剂量的溶瘤腺病毒、5×108至1×1012VP/天剂量的溶瘤腺病毒、1×109至5×1011VP/天剂量的溶瘤腺病毒、3×1010至3×1011VP/天剂量的溶瘤腺病毒等)和1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞(例如，1×108至5×109个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×109至4×109个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×109至3×109个细胞/天剂量的所述NK细胞等)；优选的是，该药物组合物或治疗剂的活性成分由5×107至5×1012VP/天剂量的溶瘤腺病毒(例如，5×107至1.5×1012VP/天剂量的溶瘤腺病毒、5×108至1×1012VP/天剂量的溶瘤腺病毒、1×109至5×1011VP/天剂量的溶瘤腺病毒、3×1010至3×1011VP/天剂量的溶瘤腺病毒等)和1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞(例如，1×108至5×109个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×109至4×109个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×109至3×109个细胞/天剂量的所述NK细胞等)组成。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物或治疗剂的活性成分包括5×107至1.5×1012VP/天剂量的溶瘤病毒H101(例如，5×1011至1.5×1012VP/天剂量的溶瘤病毒H101等)和1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞；优选的是，该药物组合物或治疗剂的活性成分由5×107至1.5×1012VP/天剂量的溶瘤病毒H101(例如，5×1011至1.5×1012VP/天剂量的溶瘤病毒H101等)和1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞(例如，1×108至5×109个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×109至4×109个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×109至3×109个细胞/天剂量的所述NK细胞等)组成。
在特定的实施方案中，本发明的药物组合物或治疗剂所包含的溶瘤病毒为具有溶瘤作用的痘病毒(下文也称为“溶瘤痘病毒”)。在一些例子中，所述溶瘤痘病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。在一些例子中，所述溶瘤痘病毒是TK基因和/或VGF基因功能缺陷型的。在一些例子中，所述溶瘤痘病毒选自：Pexa-vac、JX-963、JX-929、VSC20、GL-ONC1、和/或TG6002。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物或治疗剂的活性成分包括1×105至5×109pfu/天剂量的溶瘤痘病毒(例如，1×105至3×109pfu/天剂量的溶瘤痘病毒、1×105至1×108pfu/天剂量的溶瘤痘病毒等)和1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞(例如，1×108至5×109个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×109至4×109个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×109至3×109个细胞/天剂量的所述NK细胞等)；优选的是，该药物组合物或治疗剂的活性成分由1×105至5×109pfu/天剂量的溶瘤痘病毒(例如，1×105至3×109pfu/天剂量的溶瘤痘病毒、1×105至1×108pfu/天剂量的溶瘤痘病毒等)和1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞(例如，1×108至5×109个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×109至4×109个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×109至3×109个细胞/天剂量的所述NK细胞等)组成。
本领域的技术人员可以理解，本发明的药物组合物或治疗剂还可包含合适的可药用的辅料。
本发明的药物组合物或治疗剂还可以包含本领域已知的其它活性成分，例如白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等。
优选的是，本发明的药物组合物或治疗剂不包含硼替佐米。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物或治疗剂包含一种或多种可药用载体。可以通过本领域已知的方法制备药物制剂。例如，可以将化合物等活性成分与常见的赋形剂、稀释剂(例如磷酸盐缓冲液或生理盐水)、组织培养基、和载体(例如自体血浆或人血清白蛋白)进行配制，并作为悬浮剂施用。其它的载体可以包括脂质体、胶团、纳米胶囊、聚合纳米颗粒、固体脂颗粒(例如参见文献“E.Koren and V.Torchilin,Life,63:586-595,2011”)。本发明的药物组合物或治疗剂的具体配制方法可参见科学文献和专利文献中的描述，例如参见最新版雷明登氏药物科学，Maack出版公司，Easton PA("Remington's")。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗剂，包含：(a)第一药物组合物，其中该第一药物组合物包含位于第一可药用载体中的溶瘤病毒；和(b)第二药物组合物，其中该第二药物组合物包含位于第二可药用载体中的NK细胞；其中所述溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制。在一些实施方案中，所述第一可药用载体和第二可药用载体是相同的。在另一些实施方案中，所述第一可药用载体和第二可药用载体是不同的。
本发明的药物组合物或治疗剂可以用于治疗多种肿瘤和/或癌症，包括但不限于：肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病等。
本发明的药物组合物或治疗剂的施用方法为，对肿瘤和/或癌症患者首先施用所述溶瘤病毒(例如溶瘤腺病毒、溶瘤痘病毒或溶瘤单纯疱疹病毒)，然后，在施用所述溶瘤病毒之后的第18-72小时(例如，第20-70小时、第22-48小时、第24-48小时、第30-48小时等)，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述NK细胞。“在施用所述溶瘤病毒之后的第18-72小时(例如，第20-70小时、第22-48小时、第24-48小时、第30-48小时等)，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述NK细胞”是指首次NK细胞的施用与首次溶瘤病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)，或首次NK细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述溶瘤病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)。优选地，首次NK细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述溶瘤病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)。还优选地，首次NK细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述溶瘤病毒施用的时间间隔为24-48小时。
在本发明的一个优选实施方案中，所述溶瘤病毒(例如溶瘤腺病毒、溶瘤痘病毒或溶瘤单纯疱疹病毒)的施用剂量为治疗有效量，每天1次，连续施用1-6天；并且所述NK细胞的施用剂量为1×107至1×1010个细胞/天剂量(例如，1×108至5×109个细胞/天剂量、1×109至4×109个细胞/天剂量、1×109至3×109个细胞/天剂量)，每天1次，连续施用1-6天。在本发明的另一个优选实施方案中，所述溶瘤病毒(例如溶瘤腺病毒、溶瘤痘病毒或溶瘤单纯疱疹病毒)的施用剂量为治疗有效量，每2天1次，连续施用2-6天；并且所述NK细胞的施用剂量为1×107至1×1010个细胞/天剂量(例如，1×108至5×109个细胞/天剂量、1×109至4×109个细胞/天剂量、1×109至3×109个细胞/天剂量)，每2天1次，连续施用2-6天。无论本发明采用上述何种实施方案或其它实施方案，只要满足在施用所述溶瘤病毒(例如溶瘤腺病毒、溶瘤痘病毒或溶瘤单纯疱疹病毒)之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用NK细胞的条件即可。其中溶瘤病毒的施用和NK细胞的施用可以是间隔给药方式(例如，第1天施用溶瘤病毒，第2天施用NK细胞，第3天施用溶瘤病毒，第4天施用NK细胞…以此类推)；或依次给药方式(例如，第1天施用溶瘤病毒，第2天依次施用溶瘤病毒和NK细胞，第3天依次施用溶瘤病毒和NK细胞，第4天依次施用溶瘤病毒和NK细胞…以此类推)；或其它给药方式(例如首先施用溶瘤病毒，每天1次，连续施用1-6天，之后间隔18-72小时再施用NK细胞，每天1次，连续施用1-6天)。优选的是，首先施用溶瘤病毒，在溶瘤病毒全部施用之后间隔18-72小时再施用NK细胞。在本发明的一个优选实施方案中，对肿瘤和/或癌症患者首先施用所述溶瘤病毒，所述溶瘤病毒的施用剂量为治疗有效量，施用1次；并且在施用所述溶瘤病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述NK细胞，所述NK细胞的施用剂量为1×107至1×1010个细胞/天剂量(例如，1×108至5×109个细胞/天剂量、1×109至4×109个细胞/天剂量、1×109至3×109个细胞/天剂量)，施用1次。对于不同的溶瘤病毒，可以采用不同的优选临床剂量范围，例如表1所述的那样。
溶瘤病毒能够在肿瘤或癌症细胞中选择性复制，经过一定时间达到峰值。本发明的发明人发现，在经过一段时间的复制之后，肿瘤细胞里的溶瘤病毒会促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。因此，本发明提出的溶瘤病毒和NK细胞的施用间隔实现了两者作用峰值的双峰重叠。
本发明还提供了本发明所述的药物组合物或治疗剂在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。
所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病等。
本发明还提供了一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括装有本发明所述溶瘤病毒的第一容器和装有本发明所述NK细胞的第二容器，其中所述第一容器和所述第二容器是独立的；以及载明给药时机和给药方式的说明书；其中所述溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制。优选的是，该药盒由分别独立地装有本发明所述的溶瘤病毒和本发明所述的NK细胞的独立容器组成，以及载明给药时机和给药方式的说明书。
所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病等。
优选地，所述装有溶瘤病毒的第一容器包含治疗有效量的所述溶瘤病毒，并且装有NK细胞的第二容器包含足够提供1×107-1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞(例如，1×108至5×109个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×109至4×109个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×109至3×109个细胞/天剂量的所述NK细胞等)。对于不同的溶瘤病毒，可以采用不同的优选临床剂量范围，例如表1所述的那样。
所述溶瘤病毒可采用其各自的本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。
所述NK细胞可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如可通过静脉给药。
在本发明药盒的特定实施方案中，所述溶瘤病毒为具有溶瘤作用的腺病毒。在一些例子中，所述具有溶瘤作用的腺病毒的E1区和/或E3区是经基因工程改造的。在一些例子中，所述具有溶瘤作用的腺病毒选自：Onyx-015、H101、Ad5-yCD/mutTKSR39rep-hIL12、CG0070、DNX-2401、OBP-301、ONCOS-102、ColoAd1、VCN-01、和/或ProstAtakTM。
在本发明药盒的特定实施方案中，所述第一容器包含5×107至5×1012VP/天剂量的溶瘤腺病毒(例如，5×107至1.5×1012VP/天剂量的溶瘤腺病毒、5×108至1×1012VP/天剂量的溶瘤腺病毒、1×109至5×1011VP/天剂量的溶瘤腺病毒、3×1010至3×1011VP/天剂量的溶瘤腺病毒等)。
在一个实施方案中，所述第一容器包含5×107至1.5×1012VP/天剂量的溶瘤病毒H101(例如，5×1011至1.5×1012VP/天剂量的溶瘤病毒H101等)。
在本发明药盒的特定实施方案中，所述溶瘤病毒为溶瘤痘病毒。在一些例子中，所述溶瘤痘病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。在一些例子中，所述溶瘤痘病毒是TK基因和/或VGF基因功能缺陷型的。在一些例子中，所述溶瘤痘病毒选自：Pexa-vac、JX-963、JX-929、VSC20、GL-ONC1、和/或TG6002。
在本发明药盒的特定实施方案中，所述第一容器包含1×105至5×109pfu/天剂量的溶瘤痘病毒(例如，1×105至3×109pfu/天剂量的溶瘤痘病毒、1×105至1×108pfu/天剂量的溶瘤痘病毒等)。
本发明还提供了一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括以下依次进行的步骤：
1)对肿瘤和/或癌症患者施用本发明所述的溶瘤病毒，该溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制；
2)在施用所述溶瘤病毒之后的第18-72小时(例如，第20-70小时、第22-48小时、第24-48小时、第30-48小时等)，对所述肿瘤和/或癌症患者施用本发明所述的NK细胞。
“在施用所述溶瘤病毒之后的第18-72小时(例如，第20-70小时、第22-48小时、第24-48小时、第30-48小时等)，对所述肿瘤和/或癌症患者施用本发明所述的NK细胞”是指首次NK细胞的施用与首次溶瘤病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)，或首次NK细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述溶瘤病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)。优选地，首次NK细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述溶瘤病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)。还优选地，首次NK细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述溶瘤病毒施用的时间间隔为24-48小时。
所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病等。
在本发明的一个优选实施方案中，所述溶瘤病毒的施用剂量为治疗有效量，每天1次，连续施用1-6天；并且所述NK细胞的施用剂量为1×107至1×1010个细胞/天剂量(例如，1×108至5×109个细胞/天剂量、1×109至4×109个细胞/天剂量、1×109至3×109个细胞/天剂量)，每天1次，连续施用1-6天。在本发明的另一个优选实施方案中，所述溶瘤病毒的施用剂量为治疗有效量，每2天1次，连续施用2-6天；并且所述NK细胞的施用剂量为1×107至1×1010个细胞/天剂量(例如，1×108至5×109个细胞/天剂量、1×109至4×109个细胞/天剂量、1×109至3×109个细胞/天剂量)，每2天1次，连续施用2-6天。无论本发明采用上述何种实施方案或其它实施方案，只要满足在施用所述溶瘤病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用NK细胞的条件即可。其中溶瘤病毒的施用和NK细胞的施用可以是间隔给药方式(例如，第1天施用溶瘤病毒，第2天施用NK细胞，第3天施用溶瘤病毒，第4天施用NK细胞…以此类推)；或依次给药方式(例如，第1天施用溶瘤病毒，第2天依次施用溶瘤病毒和NK细胞，第3天依次施用溶瘤病毒和NK细胞，第4天依次施用溶瘤病毒和NK细胞…以此类推)；或其它给药方式(例如首先施用溶瘤病毒，每天1次，连续施用1-6天，之后间隔18-72小时再施用NK细胞，每天1次，连续施用1-6天)。优选的是，首先施用溶瘤病毒，在溶瘤病毒全部施用之后间隔18-72小时再施用NK细胞。在本发明的一个优选实施方案中，对肿瘤和/或癌症患者首先施用所述溶瘤病毒，所述溶瘤病毒的施用剂量为治疗有效量，施用1次；并且在施用所述溶瘤病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述NK细胞，所述NK细胞的施用剂量为1×107至1×1010个细胞/天剂量(例如，1×108至5×109个细胞/天剂量、1×109至4×109个细胞/天剂量、1×109至3×109个细胞/天剂量)，施用1次。对于不同的溶瘤病毒，可以采用不同的优选临床剂量范围，例如表1所述的那样。
可以根据实际情况和需要对患者进行一次或多次本发明的治疗肿瘤和/或癌症的方法。
所述溶瘤病毒可采用其各自的本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。
所述NK细胞可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如可通过静脉给药。
在本发明的方法的特定实施方案中，所述溶瘤病毒为具有溶瘤作用的腺病毒。在一些例子中，所述具有溶瘤作用的腺病毒的E1区和/或E3区是经基因工程改造的。在一些例子中，所述具有溶瘤作用的腺病毒选自：Onyx-015、H101、Ad5-yCD/mutTKSR39rep-hIL12、CG0070、DNX-2401、OBP-301、ONCOS-102、ColoAd1、VCN-01、和/或ProstAtakTM。
在本发明的方法的某些实施方案中，所述溶瘤病毒为溶瘤腺病毒，并且其施用剂量为5×107至5×1012VP/天(例如，5×107至1.5×1012VP/天、5×108至1×1012VP/天、1×109至5×1011VP/天、3×1010至3×1011VP/天等)。
在一个实施方案中，所述溶瘤病毒为溶瘤病毒H101，并且其施用剂量为5×107至1.5×1012VP/天(例如，5×1011至1.5×1012VP/天等)。
在本发明的方法的特定实施方案中，所述溶瘤病毒为溶瘤痘病毒。在一些例子中，所述溶瘤痘病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。在一些例子中，所述溶瘤痘病毒是TK基因和/或VGF基因功能缺陷型的。在一些例子中，所述溶瘤痘病毒选自：Pexa-vac、JX-963、JX-929、VSC20、GL-ONC1、和/或TG6002。
在本发明的方法的某些实施方案中，所述溶瘤病毒为溶瘤痘病毒，并且其施用剂量为1×105至5×109pfu/天(例如，1×105至3×109pfu/天、1×105至1×108pfu/天等)。
示例性实施方案
以下列出本发明的非限制性实施方案。
1.一种治疗剂，包含：
(a)第一药物组合物，其中该第一药物组合物包含位于第一可药用载体中的溶瘤痘病毒；和
(b)第二药物组合物，其中该第二药物组合物包含位于第二可药用载体中的NK细胞；
其中所述溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制。
2.根据实施方案1所述的治疗剂，其中所述第一药物组合物和所述第二药物组合物各自独立地存在于所述治疗剂中而互不混合。
3.根据实施方案1所述的治疗剂，其中所述第一药物组合物的活性成分为所述溶瘤痘病毒，并且其中所述第二药物组合物的活性成分为所述NK细胞。
4.根据实施方案1所述的治疗剂，其中所述第一药物组合物包含治疗有效量的所述溶瘤痘病毒，并且所述第二药物组合物包含1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞。
5.根据实施方案1所述的治疗剂，其中所述溶瘤痘病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。
6.根据实施方案1所述的治疗剂，其中所述溶瘤痘病毒是TK基因和/或VGF基因功能缺陷型的。
7.根据实施方案1所述的治疗剂，其中所述溶瘤痘病毒选自：Pexa-vac、JX-963、JX-929、VSC20、GL-ONC1、和/或TG6002。
8.根据实施方案1所述的治疗剂，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞。
9.根据实施方案8所述的治疗剂，其中所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
10.根据实施方案1所述的治疗剂，其中所述溶瘤痘病毒配制成通过瘤内注射给药或静脉给药；并且其中所述NK细胞配制成通过静脉给药。
11.根据实施方案1所述的治疗剂，其中所述第一药物组合物的活性成分包含1×105至5×109pfu/天剂量的溶瘤痘病毒，并且其中所述第二药物组合物的活性成分包含1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞。
12.根据实施方案1所述的治疗剂，其中所述治疗剂由所述第一药物组合物和所述第二药物组合物组成。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的治疗剂在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。
14.根据实施方案13所述的应用，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病。
15.一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括：装有溶瘤痘病毒的第一容器和装有NK细胞的第二容器，其中所述第一容器和所述第二容器是独立的；以及载明给药时机和给药方式的说明书；其中所述溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制。
16.根据实施方案15所述的药盒，其中所述第一容器包含治疗有效量的所述溶瘤痘病毒，并且所述第二容器包含1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞。
17.根据实施方案15所述的药盒，其中所述溶瘤痘病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。
18.根据实施方案15所述的药盒，其中所述溶瘤痘病毒是TK基因和/或VGF基因功能缺陷型的。
19.根据实施方案15所述的药盒，其中所述溶瘤痘病毒选自：Pexa-vac、JX-963、JX-929、VSC20、GL-ONC1、和/或TG6002。
20.根据实施方案15所述的药盒，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞。
21.根据实施方案20所述的药盒，其中所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
22.根据实施方案15所述的药盒，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病。
23.根据实施方案15所述的药盒，其中所述溶瘤痘病毒配制成通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞配制成通过静脉给药。
24.根据实施方案15所述的药盒，其中所述第一容器包含1×105至5×109pfu/天剂量的溶瘤痘病毒，并且所述第二容器包含1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞。
25.一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括以下依次进行的步骤：
1)对肿瘤和/或癌症患者施用溶瘤痘病毒，该溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制；
2)在施用所述溶瘤痘病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用NK细胞。
26.根据实施方案25所述的方法，其中所述溶瘤痘病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。
27.根据实施方案25所述的方法，其中所述溶瘤痘病毒是TK基因和/或VGF基因功能缺陷型的。
28.根据实施方案25所述的方法，其中所述溶瘤痘病毒选自：Pexa-vac、JX-963、JX-929、VSC20、GL-ONC1、和/或TG6002。
29.根据实施方案25所述的方法，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞。
30.根据实施方案29所述的方法，其中所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
31.根据实施方案25所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病。
32.根据实施方案25所述的方法，其中所述溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，每天1次，连续施用1-6天。
33.根据实施方案25所述的方法，其中所述NK细胞的施用剂量为1×107至1×1010个细胞/天剂量，每天1次，连续施用1-6天。
34.根据实施方案25所述的方法，其中所述溶痘瘤病毒的施用剂量为治疗有效量，每2天1次，连续施用2-6天。
35.根据实施方案25所述的方法，其中所述NK细胞的施用剂量为1×107至1×1010个细胞/天剂量，每2天1次，连续施用2-6天。
36.根据实施方案25所述的方法，其中所述溶瘤痘病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞通过静脉给药。
37.根据实施方案25所述的方法，其中所述溶瘤痘病毒的施用剂量为1×105至5×109pfu/天。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
例子
以下除非特别说明，否则各试剂的百分浓度(％)均指该试剂的体积百分浓度(％(v/v))。
以下例子中所用的材料如下：
1.肿瘤细胞
A549人非小细胞肺癌细胞、HepG-2人肝癌细胞、HT29人结肠癌细胞、HCT116人结直肠癌细胞、FaDu人头颈癌细胞、SK-HEP-1人肝癌细胞、PANC-1人胰腺癌细胞等来源于中国国家实验细胞资源共享平台。细胞培养为正常培养环境DMEM+10％FBS、DMEM:F12(1:1)+10％FBS、McCoy's 5A+10％FBS或MEM+10％FBS。DMEM:F12(1:1)购自Hyclone公司，DMEM、McCoy's5A和MEM购自GIBCO公司。胎牛血清FBS购自GIBCO公司。HUVEC人原代脐静脉内皮细胞及其培养体系均来源于德国ALLCELLS公司。
2.NK细胞
实验中采用的NK细胞来源如下：
1)A组各例子中采用购自杭州鼎云生物技术有限公司的、血样编号为0215111703的人NK细胞。
2)B、C、F、G、H、I、J组各例子中采用杭州康万达医药科技有限公司培养冻存的人NK细胞。该人NK细胞的制备方法如下：采用本领域常规的方法，用采血针穿刺肘部静脉，取健康人的外周静脉血，提取全免疫细胞PBMC。采用经辐照后的K562滋养细胞(购自杭州鼎云生物技术有限公司)，以自体血浆培养法扩增NK细胞，最终NK细胞纯度达到90％，NK细胞存活活性达到90％，NK细胞体外杀伤率达到85％。
3)D、E组各例子中采用购自杭州鼎云生物技术有限公司的、血样编号为0116010805的人NK细胞。
3.溶瘤病毒(OV)
溶瘤腺病毒H101来源于上海三维生物技术有限公司。
溶瘤痘病毒ddvv-RFP是已知的，属于溶瘤痘病毒WR株(可参见(例如)科技文献：“XSong,et al.T-cell Engager-armed Oncolytic Vaccinia Virus SignificantlyEnhances Antitumor TherapyMolecular Therapy.(2014)；22 1,102-111”)，该病毒的TK基因和VGF基因均为功能缺陷型，且携带有外源红色荧光蛋白(RFP)基因。由于RFP基因仅起到筛选/报告作用，因此溶瘤痘病毒ddvv-RFP的抗肿瘤功能基本等同TK基因和VGF基因功能缺陷型的溶瘤痘病毒。溶瘤痘病毒ddvv-RFP也可采用本领域常规技术对VSC20痘病毒进行基因改造而得到。VSC20痘病毒是VGF基因缺失的痘病毒，制备方法可参见科技文献：“McCart,JA,et al.Systemic cancer therapy with a tumor-selective vacciniavirus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.CancerRes(2001)61:8751–8757.”。所述基因改造包括使用人工合成痘病毒早/晚期启动子pSEL调控外源DsRed基因(即RFP基因)，使用体外细胞内重组技术将DsRed基因插入到痘病毒VSC20株的TK基因区中，从而构建得到溶瘤痘病毒ddvv-RFP。
4.培养板
A-J组各例子(除试验例C11和C12外)中采用24孔细胞培养板(每孔培养体积500μl)(来源：Corning(康宁)公司)。试验例C11和C12中采用12孔细胞培养板(每孔培养体积1ml)(来源：Corning(康宁)公司)。
以下例子中所用的细胞计数方法如下：
台盼蓝染色法计数：将细胞用PBS洗后，用胰蛋白酶消化，细胞悬浮在PBS中，加入终浓度为0.04％(w/v)的台盼蓝染液，显微镜下计数，死细胞会染成蓝色，活细胞为透明无色。取活细胞数为最终数据。
以下例子中，在溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤剂量测试实验和杀伤实验中，当先用溶瘤病毒对肿瘤细胞进行感染再进行培养或孵育时，均以加入溶瘤病毒的时间点为0小时。
A：溶瘤腺病毒和NK细胞联用对A549细胞的杀伤作用研究
试验例A1：NK对A549细胞杀伤剂量试验
取A549细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育48小时后，换新鲜DMEM+10％FBS，加入NK细胞，效靶比(E:T，细胞个数比)分别为NK:A549＝20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1。各效靶比的杀伤时间分别为24小时、48小时，在37℃、5％CO2下进行。此后对存活的A549细胞进行台盼蓝染色计数，与不加NK细胞的对照组对比统计NK对A549的杀伤率。杀伤剂量曲线X轴为效靶比，Y轴为抑制率(Inhibition rate(IR))的百分比数值。杀伤时间(即，从将NK细胞加入肿瘤细胞培养物到检测杀伤效果之间的时间段)为48小时的结果如图1所示，当效靶比为5:1时，抑制率为14％左右，剂量合适，取该剂量为联合杀伤实验中NK的使用剂量。杀伤24小时的结果远较48小时弱。因此，NK细胞杀伤适宜时间为约48小时。
试验例A2：H101对A549细胞杀伤剂量测试
取A549细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时后，换新鲜无血清DMEM，加入H101(以加入H101的时间点为0小时，下同)，剂量分别为MOI＝340、170、85、42.5、21.25。感染时间为6小时，在37℃、5％CO2下进行，然后弃去培养基，用PBS清洗后换入DMEM+10％FBS继续培养至72小时。此后对存活的A549细胞进行台盼蓝染色计数，与不加H101的对照组对比统计H101对A549的杀伤率。图2示出杀伤剂量曲线，其中X轴为MOI，Y轴为抑制率的百分比数值，H101对A549细胞的杀伤剂量为约MOI＝85时，抑制率为37％左右，剂量合适，取该剂量为联合杀伤实验中H101的使用剂量。
试验例A3：H101对A549细胞感染时间测试
测试了H101对A549的感染时间，以得到适宜感染效果。取A549细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时后，在DMEM无血清环境下加入H101(MOI＝85)，分别感染2小时、6小时、或在DMEM+10％FBS血清环境下感染24小时，感染在37℃、5％CO2下进行。洗去病毒，加入新鲜DMEM+10％FBS，在37℃、5％CO2下分别培养至24小时、48小时、72小时，此后对存活的A549细胞进行台盼蓝染色计数，比较对A549的抑制率。
由结果可知，H101对A549细胞的感染时间适宜为无血清环境下约6小时，H101在细胞内的增殖时间适宜为约24小时。
实施例A4：H101/NK联合杀伤实验
由上述试验例确定，H101对A549细胞的杀伤剂量适宜为约MOI＝85；H101对A549细胞的感染时间适宜为约6小时；H101在细胞内的增殖时间适宜为约24小时；NK细胞对A549细胞的杀伤剂量适宜为效靶比NK:A549为约5:1；NK细胞对A549细胞的杀伤时间适宜为约48小时。
取A549细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在DMEM的无血清环境下加入MOI＝85的H101，感染6小时，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下培养至24小时。之后换新鲜DMEM+10％FBS，加入NK细胞(效靶比NK:A549＝5:1)，继续孵育至48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活A549细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组A549细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加H101，但不加NK，作为H101组；一组在相应时间点加NK，但不加H101，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图3所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用H101和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对A549杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约78％。而本实验中单用H101的抑制率为约41％，单用NK细胞的抑制率为约20％。
与上述实验方法类似，只是加入H101并感染后培养至48小时而不是24小时，最后得到的结果也显示联合使用H101和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对A549杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约80％。
对比例A5：同时联合给药
取A549细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，换成新鲜DMEM+10％FBS培养基，同时加入H101(MOI＝85)和NK细胞(效靶比NK:A549＝5:1)，继续孵育72小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活A549细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组A549细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加H101，但不加NK，作为H101组；一组在相应时间点加NK，但不加H101，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图4所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中单用H101的抑制率为约47％，单用NK细胞的抑制率为约16％，与单独施用一种药的抑制率相比，NK与H101同时施用的抑制率提高，抑制率约为55％，但是与实施例A4相比，并没有显示出显著的协同效果，两者的对比图见图5(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)。
由上述结果可知，1)H101和NK细胞联合施用的治疗效果比单独施用H101或NK细胞的效果好；2)H101和NK细胞联合给药的时间点不同会对治疗效果带来显著差异，当H101和NK细胞基本同时给药时，联合治疗的效果并没有起到协同效果，而当先施用H101，约24小时-48小时后再施用NK细胞时，治疗显示出显著的协同效果。
对比例A6：联合给药顺序对比
取A549细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在新鲜DMEM+10％FBS环境中加入NK细胞(效靶比NK:A549＝5:1)，在37℃、5％CO2下孵育24小时。之后未换液而加入MOI＝85的H101，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活A549细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组A549细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加H101，但不加NK，作为H101组；一组在相应时间点加NK，但不加H101，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图6所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，先施用NK细胞再施用H101的反向联合给药的抑制率约为38％，单用H101的抑制率为约35％，单用NK细胞的抑制率为约6％。单用NK细胞作用于A549细胞72小时的抑制率低于作用48小时的可能原因是，A549的生长速率快，而对NK细胞的敏感度较差，加之NK细胞杀伤作用的短时效性，因此未被NK细胞杀伤的A549细胞增殖迅速，使得杀伤72小时的抑制率反而低于杀伤48小时的抑制率。反向联合给药的杀伤效果并没有出现协同效果。
对比例A7：对正常细胞联合给药
取HUVEC细胞(脐静脉内皮细胞)种入铺有明胶的培养板，铺满30％，在其适宜的完全培养基中(HUVEC细胞及完全培养基购自ALLCELLS公司，货号H-003)，在37℃、5％CO2下孵育24小时，换新鲜完全培养基，加入MOI＝85的H101，感染6小时，换新鲜完全培养基，在37℃、5％CO2下培养至24小时。之后换新鲜完全培养基，加入NK细胞(效靶比NK:HUVEC＝5:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HUVEC细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HUVEC细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加H101，但不加NK，作为H101组；一组在相应时间点加NK，但不加H101，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图7所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，NK和H101联用对人正常原代细胞HUVEC无杀伤作用。单用H101或单用NK对人正常原代细胞HUVEC也无杀伤作用。
实施例A8：联合给药实验的剂量爬坡实验
取A549细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，第一组在DMEM的无血清环境下加入H101(MOI＝85)感染6小时，换新鲜DMEM+10％FBS后，孵育至24小时后，换新鲜DMEM+10％FBS后，分别加入不同剂量的NK细胞(E:T＝1:1、5:1、10:1、15:1、或20:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活A549细胞进行台盼蓝染色计数；第二组换新鲜DMEM+10％FBS后，同时加入H101(MOI＝85)和NK细胞，NK细胞剂量分别为E:T＝1:1、5:1、10:1、15:1、或20:1，继续孵育72小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活A549细胞进行台盼蓝染色计数；第三组换新鲜DMEM+10％FBS后，先加入不同剂量的NK细胞(E:T＝1:1、5:1、10:1、15:1、或20:1)，孵育24小时后，未换液而加入同样剂量的H101(MOI＝85)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活A549细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组A549细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图8所示(其中X轴为效靶比，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合治疗中NK剂量和杀伤效果是正相关的，在H101和NK施用剂量一致的情况下，先施用H101后施用NK的治疗方案的杀伤效果远大于同时施用H101和NK或先施用NK后施用H101的治疗方案。
B：溶瘤腺病毒和NK细胞联用对HepG2细胞的杀伤作用研究试验例B1：NK对HepG2细胞杀伤剂量试验
取HepG2细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育48小时后，换新鲜DMEM+10％FBS，加入NK细胞，效靶比(E:T，细胞个数比)分别为NK:HepG2＝20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、3:1、1:1。各效靶比的杀伤时间为48小时，在37℃、5％CO2下进行。此后对存活的HepG2细胞进行台盼蓝染色计数，与不加NK细胞的对照组对比统计NK对HepG2的杀伤率。杀伤剂量曲线如图9所示，其中X轴为效靶比，Y轴为抑制率的百分比数值，效靶比为3:1时，抑制率为18％左右，剂量合适，取该剂量为后续联合杀伤实验中NK的使用剂量。
试验例B2：H101对HepG2细胞杀伤剂量测试
取HepG2细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时后，换新鲜无血清DMEM，加入H101，剂量分别为MOI＝136、68、34、17、8.5、4.25、1.7。感染时间为6小时，在37℃、5％CO2下进行，然后弃去培养基，用PBS清洗后换入DMEM+10％FBS继续培养至72小时。此后对存活的HepG2细胞进行台盼蓝染色计数，与不加H101的对照组对比统计H101对HepG2的杀伤率。图10示出杀伤剂量曲线，其中X轴为MOI，Y轴为抑制率的百分比数值，H101对HepG2细胞的杀伤剂量适宜为约MOI＝13.6时，抑制率为27％左右，剂量合适，取该剂量为后续联合杀伤实验中H101的使用剂量。
实施例B3：H101/NK联合杀伤实验
由上述试验例确定，H101对HepG2细胞的杀伤剂量适宜为约MOI＝13.6；NK细胞对HepG2细胞的杀伤剂量适宜为效靶比NK:HepG2为约3:1。
取HepG2细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在DMEM的无血清环境下加入MOI＝13.6的H101，感染6小时，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下培养至48小时。之后换新鲜DMEM+10％FBS，加入NK细胞(效靶比NK:HepG2＝3:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HepG2细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HepG2细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加H101，但不加NK，作为H101组；一组在相应时间点加NK，但不加H101，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图11所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用H101和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对HepG2杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约75％。而本实验中单用H101的抑制率为约44％，单用NK细胞的抑制率为约24％。
对比例B4：同时联合给药
取HepG2细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在DMEM的无血清环境下加入H101(MOI＝13.6)，感染6小时，在DMEM+10％FBS环境中，加入NK细胞(效靶比NK:HepG2＝3:1)，继续孵育至96小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HepG2细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HepG2细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加H101，但不加NK，作为H101组；一组在相应时间点加NK，但不加H101，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图12所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中单用H101的抑制率为约44％，单用NK细胞的抑制率为约17％，与单独施用一种药的抑制率相比，NK与H101同时施用的抑制率提高，抑制率约为54％，但是与实施例B3相比，并没有显示出显著的协同效果，两者的对比图见图13(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)。
由上述结果可知，1)H101和NK细胞联合施用的治疗效果比单独施用H101或NK细胞的效果好；2)H101和NK细胞联合给药的时间点不同会对治疗效果带来显著差异，当H101和NK细胞基本同时给药时，联合治疗的效果并没有起到协同效果，而当先施用H101，而后再施用NK细胞时，治疗显示出显著的协同效果。
对比例B5：联合给药顺序对比
取HepG2细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，换新鲜DMEM+10％FBS后，加入NK细胞(效靶比NK:HepG2＝3:1)，在37℃、5％CO2下孵育48小时。之后未换液加入MOI＝13.6的H101，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HepG2细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HepG2细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加H101，但不加NK，作为H101组；一组在相应时间点加NK，但不加H101，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图14所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，先施用NK细胞再施用H101的反向联合给药的抑制率约为32％，单用H101的抑制率为约18％，单用NK细胞的抑制率为约26％，反向联合给药的杀伤效果并没有出现协同效果。
实施例B6：联合给药实验的剂量爬坡实验
取HepG2细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，第一组在DMEM的无血清环境下加入H101(MOI＝13.6)感染6小时，换新鲜DMEM+10％FBS，孵育至48小时后，换新鲜DMEM+10％FBS，分别加入不同剂量的NK细胞(E:T＝1:1、2:1、3:1、4:1、或5:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HepG2细胞进行台盼蓝染色计数；第二组在DMEM的无血清环境下加入H101(MOI＝13.6)感染6小时，换新鲜DMEM+10％FBS后加入NK细胞，NK细胞剂量分别为E:T＝1:1、2:1、3:1、4:1、或5:1，继续孵育至96小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HepG2细胞进行台盼蓝染色计数；第三组换新鲜DMEM+10％FBS后，先加入不同剂量的NK细胞(E:T＝1:1、2:1、3:1、4:1、或5:1)，孵育48小时后，未换液而加入同样剂量的H101(MOI＝13.6)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HepG2细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HepG2细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图15所示(其中X轴为效靶比，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合治疗中NK剂量和杀伤效果是正相关的，在H101和NK施用剂量一致的情况下，先施用H101后施用NK的治疗方案的杀伤效果远大于同时施用H101和NK或先施用NK后施用H101的治疗方案。
C：溶瘤腺病毒和NK细胞联用对HT29细胞的杀伤作用研究
试验例C1：NK对HT29细胞杀伤剂量试验
取HT29细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育48小时后，换新鲜DMEM+10％FBS，加入NK细胞，效靶比(E:T，细胞个数比)分别为NK:HT29＝40:1、20:1、10:1、5:1、1:1。各效靶比的杀伤时间为48小时，在37℃、5％CO2下进行。此后对存活的HT29细胞进行台盼蓝染色计数，与不加NK细胞的对照组对比统计NK对HT29的杀伤率。图16示出杀伤剂量曲线，其中X轴为效靶比，Y轴为抑制率的百分比数值，当效靶比为3:1时，抑制率为17％左右，剂量合适，取该剂量为后续联合杀伤实验中NK的使用剂量。
试验例C2：H101对HT29细胞杀伤剂量测试
取HT29细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时后，换新鲜无血清DMEM，加入H101，剂量分别为MOI＝136、68、34、17、8.5、1.7。感染时间为6小时，在37℃、5％CO2下进行，然后弃去培养基，用PBS清洗后换入DMEM+10％FBS继续培养至72小时。此后对存活的HT29细胞进行台盼蓝染色计数，与不加H101的对照组对比统计H101对HT29的杀伤率。图17示出杀伤剂量曲线，其中X轴为MOI，Y轴为抑制率的百分比数值，当MOI＝13.6，抑制率为40％左右，剂量合适，取该剂量为后续联合杀伤实验中H101的使用剂量。
实施例C3：H101/NK联合杀伤实验
由上述试验例确定，H101对HT29细胞的杀伤剂量适宜为约MOI＝13.6；NK细胞对HT29细胞的杀伤剂量适宜为效靶比NK:HT29为约3:1。
取HT29细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在DMEM的无血清环境下加入MOI＝13.6的H101，感染6小时，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下培养至24小时。之后换新鲜DMEM+10％FBS，加入NK细胞(效靶比NK:HT29＝3:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HT29细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HT29细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加H101，但不加NK，作为H101组；一组在相应时间点加NK，但不加H101，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图18所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用H101和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对HT29杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约60％。而本实验中单用H101的抑制率为约37％，单用NK细胞的抑制率为约16％。
实施例C4：H101/NK联合杀伤实验
与上述实施例C3实验方法类似，只是实施例C4加入H101并感染后培养至48小时加NK而不是24小时，如图23所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，最后得到的结果也显示联合使用H101和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对HT29杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约76％。而本实验中单用H101的抑制率为约54％，单用NK细胞的抑制率为约14％。
对比例C5：同时联合给药
取HT29细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在DMEM的无血清环境下加入H101(MOI＝13.6)，感染6小时，换新鲜DMEM+10％FBS后，加入NK细胞(效靶比NK:HT29＝3:1)，继续孵育至72小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HT29细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HT29细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加H101，但不加NK，作为H101组；一组在相应时间点加NK，但不加H101，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图19所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中单用H101的抑制率为约36％，单用NK细胞的抑制率为约33％，与单独施用一种药的抑制率相比，NK与H101同时施用的抑制率提高，抑制率约为52％，但是与实施例C3相比，并没有显示出显著的协同效果，两者的对比图见图20(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)。
对比例C6：同时联合给药
与上述对比例C5实验方法类似，只是对比例C6加入H101和NK并培养至96小时而不是72小时，如图24所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中单用H101的抑制率为约46％，单用NK细胞的抑制率为约23％，与单独施用一种药的抑制率相比，NK与H101同时施用的抑制率提高，抑制率约为66％，但是与图23相比，并没有显示出显著的协同效果，两者的对比图见图25(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)。
由上述结果可知，1)H101和NK细胞联合施用的治疗效果比单独施用H101或NK细胞的效果好；2)H101和NK细胞联合给药的时间点不同会对治疗效果带来显著差异，当H101和NK细胞基本同时给药时，联合治疗的效果并没有起到协同效果，而当先施用H101，约24小时至48小时后再施用NK细胞时，治疗显示出显著的协同效果。
对比例C7：联合给药顺序对比
取HT29细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在新鲜DMEM+10％FBS环境中加入NK细胞(效靶比NK:HT29＝3:1)，在37℃、5％CO2下孵育24小时。之后未换液加入MOI＝13.6的H101，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HT29细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HT29细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加H101，但不加NK，作为H101组；一组在相应时间点加NK，但不加H101，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图21所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，先施用NK细胞再施用H101的反向联合给药的抑制率约为42％，单用H101的抑制率为约20％，单用NK细胞的抑制率为约26％，反向联合给药的杀伤效果并没有出现协同效果。
对比例C8：联合给药顺序对比
与上述对比例C7实验方法类似，只是对比例C8加入NK后培养至48小时加H101而不是24小时，如图26所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中先施用NK细胞再施用H101的反向联合给药的抑制率约为38％，单用H101的抑制率为约8％，单用NK细胞的抑制率为约37％，反向联合给药的杀伤效果并没有出现协同效果。
实施例C9：联合给药实验的剂量爬坡实验
取HT29细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，第一组在DMEM的无血清环境下加入H101(MOI＝13.6)感染6小时，换新鲜DMEM+10％FBS后，孵育至24小时后，分别加入不同剂量的NK细胞(E:T＝1:1、2:1、3:1、4:1、或5:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HT29细胞进行台盼蓝染色计数；第二组在DMEM的无血清环境下加入H101(MOI＝13.6)，感染6小时，换新鲜DMEM+10％FBS后，加入NK细胞，NK细胞剂量分别为E:T＝1:1、2:1、3:1、4:1、或5:1，继续孵育至72小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HT29细胞进行台盼蓝染色计数；第三组换新鲜DMEM+10％FBS后，先加入不同剂量的NK细胞(E:T＝1:1、2:1、3:1、4:1、或5:1)，孵育24小时后，未换液而加入同样剂量的H101(MOI＝13.6)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HT29细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HT29细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组。对照组在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图22所示(其中X轴为效靶比，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合治疗中NK剂量和杀伤效果是正相关的，在H101和NK施用剂量一致的情况下，先施用H101后施用NK的治疗方案的杀伤效果显著大于同时施用H101和NK或先施用NK后施用H101的治疗方案。
实施例C10：联合给药实验的剂量爬坡实验
与上述实施例C9实验方法类似，只是实施例C10中的实验组(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)加入H101后培养至48小时加NK而不是24小时，同时联合给药组同时加入H101和NK后培养至96小时而不是72小时，反向联合给药组先加入NK后培养至48小时加H101而不是24小时。结果如图27所示(其中X轴为效靶比，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合治疗中NK剂量和杀伤效果是正相关的，在H101和NK施用剂量一致的情况下，先施用H101后施用NK的治疗方案的杀伤效果显著大于同时施用H101和NK或先施用NK后施用H101的治疗方案。
试验例C11：H101感染HT29细胞后细胞表面NKG2D配体检测
取HT29细胞种入培养板，铺满50％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时后，未换液，加入H101，剂量为MOI＝17。在37℃、5％CO2下感染至24小时。实验中保留一组HT29细胞，不加病毒，作为空白对照组。用胰蛋白酶消化收集细胞，用PBS洗涤一遍后，对HT29细胞进行NKG2D相关配体(ULBP-1，ULBP-4，ULBP-2/5/6，MICA/MICB)的检测，与不加H101的对照组对比统计H101感染HT29细胞后细胞表面NKG2D相关配体变化情况。使用的抗体分别为：抗人ULBP-1PE(R&D公司，货号FAB1380P)、抗人ULBP-4/RAET1E APC(R&D公司，货号FAB6285A)、抗人ULBP-2/5/6APC(R&D公司，货号FAB1298A)、抗人MICA/MICB FITC(Miltenyi公司、货号130-106-100)。分别用50μl的1％FBS+PBS重悬HT29细胞沉淀，各样品分别加入相应抗体1～2μl混匀，4℃孵育30分钟后，用1％FBS+PBS洗涤一遍，再用300μl 1％FBS+PBS重悬HT29细胞沉淀，混匀后上流式仪进行检测。
由图28所示(其中X轴为不同NKG2D配体检测组别，Y轴为相应的细胞数量百分比数值)，H101感染HT29细胞并培养至24小时后，ULBP-1和ULBP-4无明显变化，但ULBP-2/5/6和MICA/MICB的表达显著性升高。
试验例C12：H101感染HT29细胞后细胞表面NKG2D配体检测
与上述试验例C11实验方法类似，只是试验例C12中H101感染HT29细胞并感染至48小时后进行检测，而不是感染至24小时，由图29所示(其中X轴为不同NKG2D配体检测组别，Y轴为相应的细胞数量百分比数值)，H101感染HT29细胞48h后，ULBP-1和ULBP-2/5/6无明显变化，但ULBP-4和MICA/MICB的表达显著性升高。
由上述结果可知，1)H101感染HT29细胞后细胞表面NKG2D某些配体显著性升高；2)HT29细胞表面NKG2D配体的升高促进NK细胞对HT29细胞的识别和杀伤；3)H101和NK的联合治疗方案以先施用溶瘤病毒后施用NK效果最佳。
D：溶瘤痘病毒和NK细胞联用对A549细胞的杀伤作用研究
试验例D1：NK对A549细胞杀伤剂量试验
取A549细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM:F12(1:1)+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育48小时后，换新鲜DMEM:F12(1:1)+10％FBS，加入NK细胞，效靶比(E:T，细胞个数比)分别为NK:A549＝40:1、30:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1。各效靶比的杀伤时间为48小时，在37℃、5％CO2下进行。此后对存活的A549细胞进行台盼蓝染色计数，与不加NK细胞的对照组对比统计NK对A549的杀伤率。杀伤剂量曲线X轴为效靶比，Y轴为抑制率的百分比数值。杀伤时间为48小时的结果如图30所示，效靶比为5:1，抑制率为24％左右，剂量合适，取该剂量为后续联合杀伤实验中NK的使用剂量。
试验例D2：ddvv-RFP对A549细胞杀伤剂量测试
取A549细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM:F12(1:1)+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时后，换新鲜无血清DMEM:F12(1:1)，加入ddvv-RFP(以加入ddvv-RFP的时间点为0小时，下同)，剂量分别为MOI＝0.135、0.027、0.0135、0.0054、0.0027、0.00135、0.00054。感染时间为6小时，在37℃、5％CO2下进行，然后弃去培养基，用PBS清洗后换入DMEM:F12(1:1)+10％FBS继续培养至72小时。此后对存活的A549细胞进行台盼蓝染色计数，与不加ddvv-RFP的对照组对比统计ddvv-RFP对A549的杀伤率。图31示出杀伤剂量曲线，其中X轴为MOI，Y轴为抑制率的百分比数值，当MOI＝0.0027时，抑制率为32％左右，取该剂量为后续联合杀伤实验中ddvv-RFP的使用剂量。
实施例D3：ddvv-RFP/NK联合杀伤实验
由上述试验例确定，ddvv-RFP对A549细胞的杀伤剂量适宜为约MOI＝0.0027；NK细胞对A549细胞的杀伤剂量适宜为效靶比NK:A549为约5:1。
取A549细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM:F12(1:1)+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在DMEM:F12(1:1)的无血清环境下加入MOI＝0.0027的ddvv-RFP，感染6小时，在DMEM:F12(1:1)+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下培养至48小时。随后(未换液)加入NK细胞(效靶比NK:A549＝5:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活A549细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组A549细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图32所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用ddvv-RFP和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对A549杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约83％。而本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约49％，单用NK细胞的抑制率为约28％。
对比例D4：同时联合给药
取A549细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM:F12(1:1)+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在DMEM:F12(1:1)无血清环境下加入ddvv-RFP(MOI＝0.0027)，感染6小时，换新鲜DMEM:F12(1:1)+10％FBS后，加入NK细胞(效靶比NK:A549＝5:1)，继续孵育至96小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活A549细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组A549细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图33所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约49％，单用NK细胞的抑制率为约33％，与单独施用一种药的抑制率相比，NK与ddvv-RFP同时施用的抑制率提高，抑制率约为80％，但是没有显示出显著的协同效果。
由上述结果可知，1)ddvv-RFP和NK细胞联合施用的治疗效果比单独施用ddvv-RFP或NK细胞的效果好；2)ddvv-RFP和NK细胞联合给药的时间点不同会对治疗效果带来显著差异，当ddvv-RFP和NK细胞基本同时给药时，联合治疗的效果并没有起到协同效果，而当先施用ddvv-RFP，而后再施用NK细胞时，治疗显示出显著的协同效果。
对比例D5：联合给药顺序对比
取A549细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM:F12(1:1)+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，随后(未换液)加入NK细胞(效靶比NK:A549＝5:1)，在37℃、5％CO2下孵育48小时。之后未换液而加入MOI＝0.0027的ddvv-RFP，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活A549细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组A549细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图34所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，先施用NK细胞再施用ddvv-RFP的反向联合给药的抑制率约为80％，单用ddvv-RFP的抑制率为约33％，单用NK细胞的抑制率为约48％，反向联合给药的杀伤效果并没有出现协同效果。
E：溶瘤痘病毒和NK细胞联用对HepG2细胞的杀伤作用研究
试验例E1：ddvv-RFP对HepG2细胞杀伤剂量测试
取HepG2细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时后，换新鲜无血清DMEM，加入ddvv-RFP，剂量分别为MOI＝0.27、0.135、0.054、0.027、0.0135、0.0027。感染时间为6小时，在37℃、5％CO2下进行，然后弃去培养基，用PBS清洗后换入DMEM+10％FBS继续培养至72小时。此后对存活的HepG2细胞进行台盼蓝染色计数，与不加ddvv-RFP的对照组对比统计ddvv-RFP对HepG2的杀伤率。图35示出杀伤剂量曲线，X轴为MOI，Y轴为抑制率的百分比数值，ddvv-RFP对HepG2细胞的杀伤剂量为约MOI＝0.027时，抑制率为42％左右；而ddvv-RFP对HepG2细胞的杀伤剂量为约MOI＝0.0135时，抑制率为19％左右。在后续联合杀伤实验中，当ddvv-RFP与NK细胞的施用间隔为24小时时，ddvv-RFP的使用剂量取MOI＝0.027，剂量合适；当ddvv-RFP与NK细胞的施用间隔为48小时时，ddvv-RFP的使用剂量取MOI＝0.0135，剂量合适。
实施例E2：ddvv-RFP/NK联合杀伤实验
由上述试验例确定，ddvv-RFP对HepG2细胞的杀伤剂量适宜为约MOI＝0.027；NK细胞对HepG2细胞的杀伤剂量适宜为效靶比NK:HepG2为约3:1。
取HepG2细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在DMEM的无血清环境下加入MOI＝0.027的ddvv-RFP，感染6小时，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下培养至24小时。随后(未换液)加入NK细胞(效靶比NK:HepG2＝3:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HepG2细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HepG2细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图36所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用ddvv-RFP和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对HepG2杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约85％。而本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约51％，单用NK细胞的抑制率为约23％。
实施例E3：ddvv-RFP/NK联合杀伤实验
与上述实施例E2实验方法类似，只是实验例E3加入ddvv-RFP为MOI＝0.0135，并且感染后培养至48小时加NK而不是24小时，如图39所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，最后得到的结果也显示联合使用ddvv-RFP和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对HepG2杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约79％。而本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约53％，单用NK细胞的抑制率为约20％。
对比例E4：同时联合给药
取HepG2细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在DMEM无血清环境下加入ddvv-RFP(MOI＝0.027)，感染6小时，换新鲜DMEM+10％FBS后，加入NK细胞(效靶比NK:HepG2＝3:1)，继续孵育至72小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HepG2细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HepG2细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图37所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约52％，单用NK细胞的抑制率为约36％，与单独施用一种药的抑制率相比，NK与ddvv-RFP同时施用的抑制率提高，抑制率约为80％，但是没有显示出显著的协同效果。
对比例E5：同时联合给药
与上述对比例E4实验方法类似，只是对比例E5加入ddvv-RFP为MOI＝0.0135，且ddvv-RFP和NK共培养至96小时而不是72小时，如图40所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约50％，单用NK细胞的抑制率为约49％，与单独施用一种药的抑制率相比，NK与ddvv-RFP同时施用的抑制率提高，抑制率约为84％，但是没有显示出显著的协同效果。
由上述结果可知，1)ddvv-RFP和NK细胞联合施用的治疗效果比单独施用ddvv-RFP或NK细胞的效果好；2)ddvv-RFP和NK细胞联合给药的时间点不同会对治疗效果带来显著差异，当ddvv-RFP和NK细胞基本同时给药时，联合治疗的效果并没有起到协同效果，而当先施用ddvv-RFP，约24小时-48小时后再施用NK细胞时，治疗显示出显著的协同效果。
对比例E6：联合给药顺序对比
取HepG2细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在新鲜DMEM+10％FBS培养环境中加入NK细胞(效靶比NK:HepG2＝3:1)，在37℃、5％CO2下孵育24小时。之后未换液而加入MOI＝0.027的ddvv-RFP，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HepG2细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HepG2细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图38所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，先施用NK细胞再施用ddvv-RFP的反向联合给药的抑制率约为55％，单用ddvv-RFP的抑制率为约28％，单用NK细胞的抑制率为约35％，反向联合给药的杀伤效果并没有出现协同效果。
对比例E7：联合给药顺序对比
与上述对比例E6实验方法类似，只是对比例E7加入NK后培养至48小时加ddvv-RFP(MOI＝0.0135)而不是24小时，如图41所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中先施用NK细胞再施用ddvv-RFP的反向联合给药的抑制率约为56％，单用ddvv-RFP的抑制率为约25％，单用NK细胞的抑制率为约41％，反向联合给药的杀伤效果并没有出现协同效果。
F：溶瘤痘病毒和NK细胞联用对HT29细胞的杀伤作用研究
试验例F1：ddvv-RFP对HT29细胞杀伤剂量测试
取HT29细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时后，换新鲜无血清DMEM，加入ddvv-RFP，剂量分别为MOI＝2、1、0.5、0.25、0.1、0.05。感染时间为6小时，在37℃、5％CO2下进行，然后弃去培养基，用PBS清洗后换入DMEM+10％FBS继续培养至72小时。此后对存活的HT29细胞进行台盼蓝染色计数，与不加ddvv-RFP的对照组对比统计ddvv-RFP对HT29的杀伤率。图42示出杀伤剂量曲线，其中X轴为MOI，Y轴为抑制率的百分比数值，ddvv-RFP对HT29细胞的杀伤剂量为约MOI＝0.2时，抑制率为49％左右。在后续联合杀伤实验中ddvv-RFP的使用剂量取MOI＝0.2。
实施例F2：ddvv-RFP/NK联合杀伤实验
由上述试验例确定，ddvv-RFP对HT29细胞的杀伤剂量适宜为约MOI＝0.2；NK细胞对HT29细胞的杀伤剂量适宜为效靶比NK:HT29为约3:1。
取HT29细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在DMEM的无血清环境下加入MOI＝0.2的ddvv-RFP，感染6小时，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下培养至24小时。之后换新鲜DMEM+10％FBS，加入NK细胞(效靶比NK:HT29＝3:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HT29细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HT29细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图43所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用ddvv-RFP和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对HT29杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约70％。而本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约38％，单用NK细胞的抑制率为约23％。
实施例F3：ddvv-RFP/NK联合杀伤实验
与上述实施例F2实验方法类似，只是实施例F3加入ddvv-RFP并感染后培养至48小时加NK而不是24小时，如图46所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，最后得到的结果也显示联合使用ddvv-RFP和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对HT29杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约78％。而本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约59％，单用NK细胞的抑制率为约12％。
对比例F4：同时联合给药
取HT29细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在DMEM无血清环境下加入ddvv-RFP(MOI＝0.2)，感染6小时，换新鲜DMEM+10％FBS后，加入NK细胞(效靶比NK:HT29＝3:1)，继续孵育至72小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HT29细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HT29细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图44所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约38％，单用NK细胞的抑制率为约30％，与单独施用一种药的抑制率相比，NK与ddvv-RFP同时施用的抑制率提高，抑制率约为61％，但是没有显示出显著的协同效果。
对比例F5：同时联合给药
与上述对比例F4实验方法类似，只是对比例F5加入ddvv-RFP和NK并培养至96小时而不是72小时，如图47所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约64％，单用NK细胞的抑制率为约19％，与单独施用一种药的抑制率相比，NK与ddvv-RFP同时施用的抑制率提高，抑制率约为77％，但是没有显示出显著的协同效果。
由上述结果可知，1)ddvv-RFP和NK细胞联合施用的治疗效果比单独施用ddvv-RFP或NK细胞的效果好；2)ddvv-RFP和NK细胞联合给药的时间点不同会对治疗效果带来显著差异，当ddvv-RFP和NK细胞同时给药时，联合治疗的效果并没有起到协同效果，而当先施用ddvv-RFP，约24小时-48小时后再施用NK细胞时，治疗显示出显著的协同效果。
对比例F6：联合给药顺序对比
取HT29细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在新鲜DMEM+10％FBS环境中加入NK细胞(效靶比NK:HT29＝3:1)，在37℃、5％CO2下孵育24小时。之后未换液而加入MOI＝0.2的ddvv-RFP，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HT29细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HT29细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图45所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，先施用NK细胞再施用ddvv-RFP的反向联合给药的抑制率约为43％，单用ddvv-RFP的抑制率为约30％，单用NK细胞的抑制率为约30％，反向联合给药的杀伤效果并没有出现协同效果。
对比例F7：联合给药顺序对比
与上述对比例F6实验方法类似，只是对比例F7加入NK后培养至48小时加ddvv-RFP而不是24小时，如图48所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中先施用NK细胞再施用ddvv-RFP的反向联合给药的抑制率约为34％，单用ddvv-RFP的抑制率为约21％，单用NK细胞的抑制率为约22％，反向联合给药的杀伤效果并没有出现协同效果。
G：溶瘤痘病毒和NK细胞联用对HCT116细胞的杀伤作用研究
试验例G1：NK对HCT116细胞杀伤剂量试验
取HCT116细胞种入培养板，铺满30％，在McCoy's 5A+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育48小时后，换新鲜McCoy's5A+10％FBS，加入NK细胞，效靶比(E:T，细胞个数比)分别为NK:HCT116＝40:1、20:1、10:1、5:1。各效靶比的杀伤时间为48小时，在37℃、5％CO2下进行。此后对存活的HCT116细胞进行台盼蓝染色计数，与不加NK细胞的对照组对比统计NK对HCT116的杀伤率。杀伤剂量曲线如图49所示，其中X轴为效靶比，Y轴为抑制率的百分比数值，效靶比为10:1，抑制率为13％左右，剂量合适，取该剂量为后续联合杀伤实验中NK的使用剂量。
试验例G2：ddvv-RFP对HCT116细胞杀伤剂量测试
取HCT116细胞种入培养板，铺满30％，在McCoy's 5A+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时后，换新鲜无血清McCoy's 5A，加入ddvv-RFP，剂量分别为MOI＝8、4、2、1、0.5、0.25、0.125。感染时间为6小时，在37℃、5％CO2下进行，然后弃去培养基，用PBS清洗后换McCoy's 5A+10％FBS继续培养至72小时。此后对存活的HCT116细胞进行台盼蓝染色计数，与不加ddvv-RFP的对照组对比统计ddvv-RFP对HCT116的杀伤率。图50示出杀伤剂量曲线，其中X轴为MOI，Y轴为抑制率的百分比数值。ddvv-RFP对HCT116细胞的杀伤剂量为约MOI＝0.7时，抑制率为22％左右，剂量合适，取该剂量为后续联合杀伤实验中ddvv-RFP的使用剂量。
实施例G3：ddvv-RFP/NK联合杀伤实验
由上述试验例确定，ddvv-RFP对HCT116细胞的杀伤剂量适宜为约MOI＝0.7；NK细胞对HCT116细胞的杀伤剂量适宜为效靶比NK:HCT116为约10:1。
取HCT116细胞种入培养板，铺满30％，在McCoy's 5A+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在McCoy's 5A的无血清环境下加入MOI＝0.7的ddvv-RFP，感染6小时，在McCoy's 5A+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下培养至24小时。随后未换液而加入NK细胞(效靶比NK:HCT116＝10:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HCT116细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HCT116细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图51所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用ddvv-RFP和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对HCT116杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约71％。而本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约37％，单用NK细胞的抑制率为约25％。
对比例G4：同时联合给药
取HCT116细胞种入培养板，铺满30％，在McCoy's 5A+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在McCoy's 5A无血清环境下加入ddvv-RFP(MOI＝0.7)，感染6小时，换新鲜McCoy's 5A+10％FBS后，加入NK细胞(效靶比NK:HCT116＝10:1)，继续孵育至72小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HCT116细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HCT116细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图52所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约37％，单用NK细胞的抑制率为约41％，与单独施用一种药的抑制率相比，NK与ddvv-RFP同时施用的抑制率提高，抑制率约为78％，但是没有显示出显著的协同效果。
由上述结果可知，1)ddvv-RFP和NK细胞联合施用的治疗效果比单独施用ddvv-RFP或NK细胞的效果好；2)ddvv-RFP和NK细胞联合给药的时间点不同会对治疗效果带来显著差异，当ddvv-RFP和NK细胞基本同时给药时，联合治疗的效果并没有起到协同效果，而当先施用ddvv-RFP，而后再施用NK细胞时，治疗显示出显著的协同效果。
对比例G5：联合给药顺序对比
取HCT116细胞种入培养板，铺满30％，在McCoy's 5A+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，未换液而加入NK细胞(效靶比NK:HCT116＝10:1)，在37℃、5％CO2下孵育24小时。之后未换液而加入MOI＝0.7的ddvv-RFP，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HCT116细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组HCT116细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图53所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，先施用NK细胞再施用ddvv-RFP的反向联合给药的抑制率约为58％，单用ddvv-RFP的抑制率为约21％，单用NK细胞的抑制率为约41％，反向联合给药的杀伤效果并没有出现协同效果。
H：溶瘤痘病毒和NK细胞联用对FaDu细胞的杀伤作用研究
试验例H1：NK对FaDu细胞杀伤剂量试验
取FaDu细胞种入培养板，铺满30％，在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育48小时后，换新鲜MEM+10％FBS，加入NK细胞，效靶比(E:T，细胞个数比)分别为NK:FaDu＝40:1、30:1、20:1、15:1、10:1、5:1。各效靶比的杀伤时间为48小时，在37℃、5％CO2下进行。此后对存活的FaDu细胞进行台盼蓝染色计数，与不加NK细胞的对照组对比统计NK对FaDu的杀伤率。杀伤剂量曲线如图54所示，其中X轴为效靶比，Y轴为抑制率的百分比数值，效靶比为10:1时，抑制率为27％左右，剂量合适，取该剂量为后续联合杀伤实验中NK的使用剂量。
试验例H2：ddvv-RFP对FaDu细胞杀伤剂量测试
取FaDu细胞种入培养板，铺满30％，在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时后，换新鲜无血清MEM，加入ddvv-RFP，剂量分别为MOI＝2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125。感染时间为6小时，在37℃、5％CO2下进行，然后弃去培养基，用PBS清洗后换MEM+10％FBS继续培养至72小时。此后对存活的FaDu细胞进行台盼蓝染色计数，与不加ddvv-RFP的对照组对比统计ddvv-RFP对FaDu的杀伤率。图55示出杀伤剂量曲线，其中X轴为MOI，Y轴为抑制率的百分比数值，ddvv-RFP对FaDu细胞的杀伤剂量为约MOI＝0.2时，抑制率为32％左右，剂量合适，取该剂量为后续联合杀伤实验中ddvv-RFP的使用剂量。
实施例H3：ddvv-RFP/NK联合杀伤实验
由上述试验例确定，ddvv-RFP对FaDu细胞的杀伤剂量适宜为约MOI＝0.2；NK细胞对FaDu细胞的杀伤剂量适宜为效靶比NK:FaDu为约10:1。
取FaDu细胞种入培养板，铺满30％，在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在MEM的无血清环境下加入MOI＝0.2的ddvv-RFP，感染6小时，在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下培养至24小时。随后未换液而加入NK细胞(效靶比NK:FaDu＝10:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活FaDu细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组FaDu细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图56所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用ddvv-RFP和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对FaDu杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约82％。而本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约38％，单用NK细胞的抑制率为约26％。
对比例H4：同时联合给药
取FaDu细胞种入培养板，铺满30％，在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在MEM无血清环境下加入ddvv-RFP(MOI＝0.2)，感染6小时，换新鲜MEM+10％FBS后，加入NK细胞(效靶比NK:FaDu＝10:1)，继续孵育至72小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活FaDu细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组FaDu细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图57所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约38％，单用NK细胞的抑制率为约41％，与单独施用一种药的抑制率相比，NK与ddvv-RFP同时施用的抑制率提高，抑制率约为72％，但是没有显示出显著的协同效果。
由上述结果可知，1)ddvv-RFP和NK细胞联合施用的治疗效果比单独施用ddvv-RFP或NK细胞的效果好；2)ddvv-RFP和NK细胞联合给药的时间点不同会对治疗效果带来显著差异，当ddvv-RFP和NK细胞基本同时给药时，联合治疗的效果并没有起到协同效果，而当先施用ddvv-RFP，而后再施用NK细胞时，治疗显示出显著的协同效果。
对比例H5：联合给药顺序对比
取FaDu细胞种入培养板，铺满30％，在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，未换液而加入NK细胞(效靶比NK:FaDu＝10:1)，在37℃、5％CO2下孵育24小时。之后未换液而加入MOI＝0.2的ddvv-RFP，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活FaDu细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组FaDu细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图58所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，先施用NK细胞再施用ddvv-RFP的反向联合给药的抑制率约为64％，单用ddvv-RFP的抑制率为约22％，单用NK细胞的抑制率为约41％，反向联合给药的杀伤效果并没有出现显著的协同效果(P>0.8)。
I：溶瘤痘病毒和NK细胞联用对SK-HEP-1细胞的杀伤作用研究
试验例I1：NK对SK-HEP-1细胞杀伤剂量试验
取SK-HEP-1细胞种入培养板，铺满30％，在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育48小时后，换新鲜MEM+10％FBS，加入NK细胞，效靶比(E:T，细胞个数比)分别为NK:SK-HEP-1＝40:1、30:1、20:1、10:1、5:1。各效靶比的杀伤时间为48小时，在37℃、5％CO2下进行。此后对存活的SK-HEP-1细胞进行台盼蓝染色计数，与不加NK细胞的对照组对比统计NK对SK-HEP-1的杀伤率。图59示出杀伤剂量曲线，其中X轴为效靶比，Y轴为抑制率的百分比数值，当效靶比为5:1时，抑制率为17％左右，剂量合适，取该剂量为后续联合杀伤实验中NK的使用剂量。
试验例I2：ddvv-RFP对SK-HEP-1细胞杀伤剂量测试
取SK-HEP-1细胞种入培养板，铺满30％，在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时后，换新鲜无血清MEM，加入ddvv-RFP，剂量分别为MOI＝1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03、0.015。感染时间为6小时，在37℃、5％CO2下进行，然后弃去培养基，用PBS清洗后换MEM+10％FBS继续培养至72小时。此后对存活的SK-HEP-1细胞进行台盼蓝染色计数，与不加ddvv-RFP的对照组对比统计ddvv-RFP对SK-HEP-1的杀伤率。图60示出杀伤剂量曲线，其中X轴为MOI，Y轴为抑制率的百分比数值。ddvv-RFP对SK-HEP-1细胞的杀伤剂量为约MOI＝0.15时，抑制率为40％左右，剂量合适，取该剂量为后续联合杀伤实验中ddvv-RFP的使用剂量。
实施例I3：ddvv-RFP/NK联合杀伤实验
由上述试验例确定，ddvv-RFP对SK-HEP-1细胞的杀伤剂量适宜为约MOI＝0.15；NK细胞对SK-HEP-1细胞的杀伤剂量适宜为效靶比NK:SK-HEP-1为约5:1。
取SK-HEP-1细胞种入培养板，铺满30％，在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在MEM的无血清环境下加入MOI＝0.15的ddvv-RFP，感染6小时，在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下培养至24小时。之后换新鲜MEM+10％FBS，加入NK细胞(效靶比NK:SK-HEP-1＝5:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活SK-HEP-1细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组SK-HEP-1细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图61所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用ddvv-RFP和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对SK-HEP-1杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约72％。而本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约51％，单用NK细胞的抑制率为约13％。
对比例I4：同时联合给药
取SK-HEP-1细胞种入培养板，铺满30％，在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在MEM无血清环境下加入ddvv-RFP(MOI＝0.15)，感染6小时，换新鲜MEM+10％FBS后，加入NK细胞(效靶比NK:SK-HEP-1＝5:1)，继续孵育至72小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活SK-HEP-1细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组SK-HEP-1细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图62所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约51％，单用NK细胞的抑制率为约17％，与单独施用一种药的抑制率相比，NK与ddvv-RFP同时施用的抑制率提高，抑制率约为60％，但是没有显示出显著的协同效果。
由上述结果可知，1)ddvv-RFP和NK细胞联合施用的治疗效果比单独施用ddvv-RFP或NK细胞的效果好；2)ddvv-RFP和NK细胞联合给药的时间点不同会对治疗效果带来显著差异，当ddvv-RFP和NK细胞基本同时给药时，联合治疗的效果并没有起到协同效果，而当先施用ddvv-RFP，而后再施用NK细胞时，治疗显示出显著的协同效果。
对比例I5：联合给药顺序对比
取SK-HEP-1细胞种入培养板，铺满30％，在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在新鲜MEM+10％FBS培养基中加入NK细胞(效靶比NK:SK-HEP-1＝5:1)，在37℃、5％CO2下孵育24小时。之后未换液而加入MOI＝0.15的ddvv-RFP，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活SK-HEP-1细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组SK-HEP-1细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图63所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，先施用NK细胞再施用ddvv-RFP的反向联合给药的抑制率约为21％，单用ddvv-RFP的抑制率为约11％，单用NK细胞的抑制率为约17％，反向联合给药的杀伤效果并没有出现协同效果。
J：溶瘤痘病毒和NK细胞联用对PANC-1细胞的杀伤作用研究
试验例J1：NK对PANC-1细胞杀伤剂量试验
取PANC-1细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育48小时后，换新鲜DMEM+10％FBS，加入NK细胞，效靶比(E:T，细胞个数比)分别为NK:PANC-1＝40:1、20:1、15:1、10:1、5:1。各效靶比的杀伤时间为48小时，在37℃、5％CO2下进行。此后对存活的PANC-1细胞进行台盼蓝染色计数，与不加NK细胞的对照组对比统计NK对PANC-1的杀伤率。图64示出杀伤剂量曲线，其中X轴为效靶比，Y轴为抑制率的百分比数值，当效靶比为3:1时，抑制率为10％左右，取该剂量为后续联合杀伤实验中NK的使用剂量。
试验例J2：ddvv-RFP对PANC-1细胞杀伤剂量测试
取PANC-1细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时后，换新鲜无血清DMEM，加入ddvv-RFP，剂量分别为MOI＝0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03、0.015。感染时间为6小时，在37℃、5％CO2下进行，然后弃去培养基，用PBS清洗后换DMEM+10％FBS继续培养至72小时。此后对存活的PANC-1细胞进行台盼蓝染色计数，与不加ddvv-RFP的对照组对比统计ddvv-RFP对PANC-1的杀伤率。图65示出杀伤剂量曲线，其中X轴为MOI，Y轴为抑制率的百分比数值，当MOI＝0.1时，抑制率为58％左右，取该剂量为后续联合杀伤实验中ddvv-RFP的使用剂量。
实施例J3：ddvv-RFP/NK联合杀伤实验
由上述试验例确定，ddvv-RFP对PANC-1细胞的杀伤剂量适宜为约MOI＝0.1；NK细胞对PANC-1细胞的杀伤剂量适宜为效靶比NK:PANC-1为约3:1。
取PANC-1细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在DMEM的无血清环境下加入MOI＝0.1的ddvv-RFP，感染6小时，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下培养至48小时。之后换新鲜DMEM+10％FBS，加入NK细胞(效靶比NK:PANC-1＝3:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活PANC-1细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组PANC-1细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图66所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用ddvv-RFP和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对PANC-1杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约85％。而本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约59％，单用NK细胞的抑制率为约13％。
对比例J4：同时联合给药
取PANC-1细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在DMEM无血清环境下加入ddvv-RFP(MOI＝0.1)，感染6小时，换新鲜DMEM+10％FBS后，加入NK细胞(效靶比NK:PANC-1＝3:1)，继续孵育至96小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活PANC-1细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组PANC-1细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图67所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中单用ddvv-RFP的抑制率为约59％，单用NK细胞的抑制率为约19％，与单独施用一种药的抑制率相比，NK与ddvv-RFP同时施用的抑制率提高，抑制率约为80％，但是没有显示出显著的协同效果(P>0.3)。
由上述结果可知，1)ddvv-RFP和NK细胞联合施用的治疗效果比单独施用ddvv-RFP或NK细胞的效果好；2)ddvv-RFP和NK细胞联合给药的时间点不同会对治疗效果带来显著差异，当ddvv-RFP和NK细胞基本同时给药时，联合治疗的效果并没有起到显著的协同效果，而当先施用ddvv-RFP，而后再施用NK细胞时，治疗显示出显著的协同效果。
对比例J5：联合给药顺序对比
取PANC-1细胞种入培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO2下孵育24小时，在新鲜DMEM+10％FBS环境中加入NK细胞(效靶比NK:PANC-1＝3:1)，在37℃、5％CO2下孵育48小时。之后未换液而加入MOI＝0.1的ddvv-RFP，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活PANC-1细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组PANC-1细胞，不加病毒，不加NK，作为空白对照组；一组在相应时间点加ddvv-RFP，但不加NK，作为ddvv-RFP组；一组在相应时间点加NK，但不加ddvv-RFP，作为NK组。对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图68所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，先施用NK细胞再施用ddvv-RFP的反向联合给药的抑制率约为28％，单用ddvv-RFP的抑制率为约21％，单用NK细胞的抑制率为约19％，反向联合给药的杀伤效果并没有出现协同效果。
Claims (23)
1.一种治疗剂，包含：
(a)第一药物组合物，其中该第一药物组合物包含位于第一可药用载体中的溶瘤痘病毒；和
(b)第二药物组合物，其中该第二药物组合物包含位于第二可药用载体中的NK细胞；
其中所述溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制；
其中所述溶瘤痘病毒不含有能够表达药物活性成分的外源基因；并且
其中所述治疗剂的活性成分由所述溶瘤痘病毒和NK细胞组成。
2.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述第一药物组合物和所述第二药物组合物各自独立地存在于所述治疗剂中而互不混合。
3.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述第一药物组合物包含治疗有效量的所述溶瘤痘病毒，并且所述第二药物组合物包含1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞。
4.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述溶瘤痘病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。
5.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述溶瘤痘病毒是TK基因和/或VGF基因功能缺陷型的。
6.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述溶瘤痘病毒选自：VSC20、和/或GL-ONC1。
7.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞。
8.根据权利要求7所述的治疗剂，其中所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
9.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述溶瘤痘病毒配制成通过瘤内注射给药或静脉给药；并且其中所述NK细胞配制成通过静脉给药。
10.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述第一药物组合物的活性成分包含1×105至5×109pfu/天剂量的所述溶瘤痘病毒，并且其中所述第二药物组合物的活性成分包含1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞。
11.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述治疗剂由所述第一药物组合物和所述第二药物组合物组成。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的治疗剂在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病。
14.一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括：装有溶瘤痘病毒的第一容器和装有NK细胞的第二容器，其中所述第一容器和所述第二容器是独立的；以及载明给药时机和给药方式的说明书；其中所述溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制；其中所述溶瘤痘病毒不含有能够表达药物活性成分的外源基因；并且其中所述联合药物的活性成分由所述溶瘤痘病毒和NK细胞组成。
15.根据权利要求14所述的药盒，其中所述第一容器包含治疗有效量的所述溶瘤痘病毒，并且所述第二容器包含1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞。
16.根据权利要求14所述的药盒，其中所述溶瘤痘病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。
17.根据权利要求14所述的药盒，其中所述溶瘤痘病毒是TK基因和/或VGF基因功能缺陷型的。
18.根据权利要求14所述的药盒，其中所述溶瘤痘病毒选自：VSC20、和/或GL-ONC1。
19.根据权利要求14所述的药盒，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞。
20.根据权利要求19所述的药盒，其中所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
21.根据权利要求14所述的药盒，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病。
22.根据权利要求14所述的药盒，其中所述溶瘤痘病毒配制成通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞配制成通过静脉给药。
23.根据权利要求14所述的药盒，其中所述第一容器包含1×105至5×109pfu/天剂量的所述溶瘤痘病毒，并且所述第二容器包含1×107至1×1010个细胞/天剂量的所述NK细胞。
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