JP7239911B2 - 腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびnk細胞を含む治療剤、ならびに腫瘍および/またはがんの治療のための薬物のためのその使用 - Google Patents
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Description
1)腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、腫瘍および/またはがん患者に投与する工程であって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる工程と、
2)腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の18~72時間後に、NK細胞を、腫瘍および/またはがん患者に投与する工程と
を含む方法をさらに提供する。
1)本開示による腫瘍溶解性ウイルスを、腫瘍および/またはがん患者に投与する工程であって、腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる工程と、
2)腫瘍溶解性ウイルスの投与の18~72時間後(たとえば、20~70時間後、22~48時間後、24~48時間後、30~48時間後など)に、本開示によるNK細胞を、腫瘍および/またはがん患者に投与する工程と
を含む方法を提供する。
(b)第2の薬学的に許容される担体中にNK細胞を含む第2の医薬組成物と
を含む治療剤であって、
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる治療剤。
1)腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、腫瘍および/またはがん患者に投与する工程であって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる工程と、
2)腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の18~72時間後に、NK細胞を、腫瘍および/またはがん患者に投与する工程と
を含む方法。
A549(ヒト非小細胞肺がん細胞)、HepG2(ヒト肝細胞癌細胞)、HT29(ヒト結腸がん細胞)、HCT116(ヒト結腸直腸がん細胞)、FaDu(ヒト頭頸部がん細胞)、SK-HEP-1(ヒト肝細胞癌細胞)、PANC-1(ヒト膵臓がん細胞)などは、China National Infrastructure of Cell Line Resourceから入手した。細胞を、通常の環境において培養した:DMEM+10% FBS、DMEM:F12(1:1)+10% FBS、マッコイ5A+10% FBS、またはMEM+10% FBS。DMEM:F12(1:1)は、Hycloneから購入し、一方で、DMEM、マッコイ5A、およびMEMは、GIBCOから購入した。ウシ胎児血清(FBS)は、GIBCO Incから購入した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)およびその培養系は、両方とも、ALLCELLS LLC,Germanyから購入した。
実験において使用したNK細胞の供給源は、次の通りである:
1)群Aのそれぞれの例において使用したNK細胞は、Hangzhou Ding Yun Biotech Co.,Ltdから購入した、サンプル番号0215111703のヒトNK細胞であった。
腫瘍溶解性アデノウイルスH101は、Shanghai Sunway Biotech Co.,Ltdから入手した。
24ウェルの細胞培養プレート(1ウェル当たり500μl、Corning Inc.)を、群A~Jのそれぞれの例において使用した(実験例C11およびC12を除く)。12ウェルの細胞培養プレート(1ウェル当たり1ml、Corning Inc.)を、実験例C11およびC12のそれぞれにおいて使用した。
実験例A1:A549細胞に対するNK細胞の用量応答実験
A549細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で48時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比(すなわち、E:T、細胞数の比)で添加した:NK:A549=それぞれ20:1、10:1、5:1、2.5:1、および1.25:1。それぞれのE:T比での殺滅プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、それぞれ、24時間および48時間行った。その後に、トリパンブルー染色法を、生存A549細胞の計数に使用し、NK細胞によるA549細胞の殺滅率を、NK細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。用量応答曲線のX軸は、E:T比を表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す。殺滅時間(すなわち、NK細胞を腫瘍細胞培養物に導入した時間から、殺滅が検出された時間までの期間)が48時間であった実験の結果を、図1に示すが、これは、E:T比が5:1のときに、約14%の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するNK細胞の用量レベルとして採用した。殺滅作用は、殺滅時間が24時間であった場合には、殺滅時間が48時間であった場合のものと比較して、より弱かった。したがって、NK細胞の好適な殺滅時間の長さは、約48時間であった。
A549細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清DMEMで置きかえ、H101を、それぞれ、340、170、85、42.5、および21.25のMOIで添加した。H101を添加した時点を、0時間とした(以下同様)。感染プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、6時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、PBSで洗浄した。次いで、新しいDMEM+10% FBSを添加し、細胞を、さらに72時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存A549細胞の計数に使用し、H101によるA549細胞の殺滅率を、H101を添加しなかった対照群に対して計算した。図2は、用量応答曲線(X軸は、MOIを表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)を示すが、これは、A549細胞に対するH101の用量レベルが約85のMOIであるときに、約37%の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するH101の用量レベルとして採用した。
好適な感染作用を達成するために、H101によるA549細胞の様々な長さの感染時間について試験した。A549細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清DMEMまたはDMEM+10% FBSのいずれかで置きかえ、H101を添加した(MOI=85)。無血清DMEM環境の細胞については、感染プロセスを、それぞれ、2または6時間継続させた。DMEM+10% FBS環境の細胞については、感染プロセスを、24時間継続させた。すべての感染プロセスは、37℃で5% CO2において行った。ウイルスを洗い流した後、新しいDMEM+10% FBSを添加し、細胞を、37℃で5% CO2において、それぞれ、24時間、48時間、または72時間インキュベートした。その後に、生存A549細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数し、A549細胞の阻害率を比較した。
上述の実験例から、A549に対する殺滅に好適なH101の用量レベルは、約85のMOIであり、H101によるA549細胞の感染に好適な時間の長さは、約6時間であり、H101の細胞内複製に好適な時間の長さは、約24時間であり、A549細胞に対する殺滅に好適なNK細胞の用量レベルは、約5:1のE:T比(すなわち、NK:A549)であり、NK細胞による殺滅に好適な時間の長さは、約48時間であったと結論付けることができる。
A549細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、H101(MOI=85)およびNK細胞(E:T比(NK:A549)=5:1)を、同時に添加した。細胞を、さらに72時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存A549細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもNK細胞もA549細胞に添加していないブランク対照群、H101をその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないH101群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、H101を添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
A549細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:A549)=5:1)。細胞を、37℃で5% CO2において、24時間インキュベートした。次いで、H101(MOI=85)を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存A549細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもNK細胞もA549細胞に添加していないブランク対照群、H101をその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないH101群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、H101を添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
HUVEC細胞(ヒト臍帯静脈内皮細胞)を、30%のコンフルエンシーで、ゼラチンを有する培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、適切な完全培地(HUVEC細胞および完全培地は、ALLCELLS LLCから購入した品目番号H-003である)中で24時間培養した。次いで、培地を、新しい完全培地で置きかえ、H101(MOI=85)を添加し、感染プロセスを、6時間継続させた。次いで、培地を、新しい完全培地で置きかえ、細胞を、37℃で5% CO2において、24時間インキュベートした。その後に、培地を、新しい完全培地で置きかえ、次いで、NK細胞を添加し(E:T比(NK:HUVEC)=5:1)、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存HUVEC細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもNK細胞もHUVEC細胞に添加していないブランク対照群、H101をその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないH101群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、H101を添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
A549細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。第1の群において、培地を、無血清DMEMで置きかえ、次いで、H101(MOI=85)を添加し、感染プロセスを、6時間継続させた。培地を、次いで、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、細胞を、24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、様々な用量レベル(E:T=1:1、5:1、10:1、15:1、または20:1)のNK細胞を、それぞれ添加し、培養物を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存A549細胞の計数に使用した。第2の群において、培地を新しいDMEM+10% FBSで置きかえた後、H101(MOI=85)およびNK細胞を、それぞれE:T=1:1、5:1、10:1、15:1、または20:1のNK細胞の用量レベルで、同時に添加し、細胞を、さらに72時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存A549細胞の計数に使用した。第3の群において、培地を新しいDMEM+10% FBSで置きかえた後、様々な用量レベル(E:T=1:1、5:1、10:1、15:1、または20:1)のNK細胞を、それぞれ、最初に添加し、培養物を、24時間インキュベートした。次いで、同じ用量レベル(MOI=85)のH101を、培地を置きかえることなく添加し、培養物を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存A549細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもNK細胞もA549細胞に添加していないブランク対照群も、存在した。対照群には、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
実験例B1:HepG2細胞に対するNK細胞の用量応答実験
HepG2細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で48時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比(すなわち、E:T、細胞数の比)で添加した:NK:HepG2=それぞれ20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、3:1、および1:1。それぞれのE:T比での殺滅プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、48時間継続させた。その後に、トリパンブルー染色法を、生存HepG2細胞の計数に使用し、NK細胞によるHepG2細胞の殺滅率を、NK細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。図9は、用量応答曲線(X軸は、E:T比を表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)を示すが、これは、E:T比が3:1であるときに、約18%の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するNK細胞の用量レベルとして採用した。
HepG2細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清DMEMで置きかえ、H101を、それぞれ、136、68、34、17、8.5、4.25、および1.7のMOIで添加した。感染プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、6時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、PBSで洗浄した。次いで、新しいDMEM+10% FBSを添加し、細胞を、さらに72時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存HepG2細胞の計数に使用し、H101によるHepG2細胞の殺滅率を、H101を添加しなかった対照群に対して計算した。図10は、用量応答曲線(X軸は、MOIを表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)を示すが、これは、HepG2細胞に対するH101の用量レベルが約13.6のMOIであるときに、約27%の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するH101の用量レベルとして採用した。
上述の実験例から、HepG2細胞に対する殺滅に好適なH101の用量レベルは、約13.6のMOIであり、HepG2細胞に対する殺滅に好適なNK細胞の用量レベルは、約3:1のE:T比(すなわち、NK:HepG2)であったと結論付けることができる。
HepG2細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清DMEMで置きかえ、H101を添加した(MOI=13.6)。6時間感染させた後、培地を、DMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:HepG2)=3:1)。細胞を、さらに96時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存HepG2細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもNK細胞もHepG2細胞に添加していないブランク対照群、H101をその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないH101群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、H101を添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
HepG2細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:HepG2)=3:1)。細胞を、37℃で5% CO2において、48時間インキュベートした。次いで、H101(MOI=13.6)を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存HepG2細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもNK細胞もHepG2細胞に添加していないブランク対照群、H101をその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないH101群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、H101を添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
HepG2細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。第1の群において、培地を、無血清DMEMで置きかえ、次いで、H101(MOI=13.6)を添加し、感染プロセスを、6時間継続させた。培地を、次いで、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、細胞を、48時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、様々な用量レベル(E:T=1:1、2:1、3:1、4:1、または5:1)のNK細胞を、それぞれ添加し、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存HepG2細胞の計数に使用した。第2の群において、培地を、無血清DMEMで置きかえ、H101(MOI=13.6)を添加し、感染プロセスを、6時間継続させた。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、様々な用量レベル(E:T=1:1、2:1、3:1、4:1、または5:1)のNK細胞を、それぞれ添加した。細胞を、さらに96時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存HepG2細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。第3の群において、培地を新しいDMEM+10% FBSで置きかえた後、様々な用量レベル(E:T=1:1、2:1、3:1、4:1、または5:1)のNK細胞を、それぞれ添加し、細胞を、48時間インキュベートした。次いで、同じ用量のH101(MOI=13.6)を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存HepG2細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもNK細胞もHepG2細胞に添加していないブランク対照群も、存在した。対照群には、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
実験例C1:HT29細胞に対するNK細胞の用量応答実験
HT29細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で48時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比(すなわち、E:T、細胞数の比)で添加した:NK:HT29=それぞれ40:1、20:1、10:1、5:1、および1:1。それぞれのE:T比での殺滅プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、48時間継続させた。その後に、トリパンブルー染色法を、生存HT29細胞の計数に使用し、NK細胞によるHT29細胞の殺滅率を、NK細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。図16は、用量応答曲線(X軸は、E:T比を表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)を示すが、これは、E:T比が3:1であるときに、約17%の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するNK細胞の用量レベルとして採用した。
HT29細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清DMEMで置きかえ、H101を、それぞれ、136、68、34、17、8.5、および1.7のMOIで添加した。感染プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、6時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、PBSで洗浄した。次いで、新しいDMEM+10% FBSを添加し、細胞を、さらに72時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存HT29細胞の計数に使用し、H101によるHT29細胞の殺滅率を、H101を添加しなかった対照群に対して計算し、比較した。図17は、用量応答曲線(X軸は、MOIを表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)を示すが、これは、MOIが13.6であるときに、約40%の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するH101の用量レベルとして採用した。
上述の実験例から、HT29細胞に対する殺滅に好適なH101の用量レベルは、約13.6のMOIであり、HT29細胞に対する殺滅に好適なNK細胞の用量レベルは、約3:1のE:T比(すなわち、NK:HT29)であったと結論付けることができる。
例C4は、H101の添加による感染の後、細胞を、24時間ではなく48時間インキュベートした後に、NK細胞を添加したことを除き、上述の例C3と類似であった。図23に示されるように(X軸は、様々な群を表し、Y軸は、対応する阻害率の百分率値を表す)、最終的な結果はまた、H101およびNK細胞の組合せ適用(腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、NK細胞を後から投与する)は、HT29細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約76%であったことを示した。しかしながら、この実験において、H101の単独適用の阻害率は、約54%であり、NK細胞の単独適用の阻害率は、約14%であった。
HT29細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清DMEMで置きかえ、H101を添加した(MOI=13.6)。6時間感染させた後、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:HT29)=3:1)。細胞を、さらに72時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存HT29細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもNK細胞もHT29細胞に添加していないブランク対照群、H101をその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないH101群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、H101を添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
比較例C6は、H101およびNKを添加した後、細胞を、72時間ではなく96時間インキュベートしたことを除き、上述の比較例C5と類似であった。図24に示されるように(X軸は、様々な群を表し、Y軸は、対応する阻害率の百分率値を表す)、H101の単独適用の阻害率は、約46%であり、NK細胞の単独適用の阻害率は、約23%であった。これらの単独適用と比較して、NK細胞およびH101の組合せ使用の阻害率は、約66%であったため増加していたが、しかしながら、図23と比較して有意な相乗作用は示されなかった(図25に示される比較を参照されたく、ここで、X軸は、様々な群を表し、Y軸は、対応する阻害率の百分率値を表す)。
HT29細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:HT29)=3:1)。細胞を、37℃で5% CO2において、24時間インキュベートした。次いで、H101(MOI=13.6)を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存HT29細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもNK細胞もHT29細胞に添加していないブランク対照群、H101をその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないH101群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、H101を添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
比較例C8は、NKを添加した後、細胞を、24時間ではなく48時間インキュベートした後に、H101を添加したことを除き、上述の比較例C7と類似であった。図26に示されるように(X軸は、様々な群を表し、Y軸は、対応する阻害率の百分率値を表す)、順序逆転様式での組合せ適用(NK細胞を最初に投与し、H101を後から投与する)の阻害率は、約38%であり、H101の単独適用の阻害率は、約8%であり、NK細胞の単独適用の阻害率は、約37%であった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
HT29細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。第1の群において、培地を、無血清DMEMで置きかえ、次いで、H101(MOI=13.6)を添加し、感染プロセスを、6時間継続させた。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえた。細胞を、24時間インキュベートした後、様々な用量レベル(E:T=1:1、2:1、3:1、4:1、または5:1)のNK細胞を、それぞれ添加し、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存HT29細胞の計数に使用した。第2の群において、培地を、無血清DMEMで置きかえ、H101(MOI=13.6)を添加した。6時間感染させた後、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、様々な用量レベル(E:T=1:1、2:1、3:1、4:1、または5:1)のNK細胞を、それぞれ添加した。細胞を、さらに72時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存HT29細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。第3の群において、培地を新しいDMEM+10% FBSで置きかえた後、様々な用量レベル(E:T=1:1、2:1、3:1、4:1、または5:1)のNK細胞を、それぞれ、最初に添加し、細胞を、24時間インキュベートした。次いで、同じ用量のH101(MOI=13.6)を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存HT29細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもNK細胞もHT29細胞に添加していないブランク対照群も、存在した。対照群には、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
例C10は、実験群(腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、NK細胞を後から投与する)では、H101を添加した後に、細胞を、24時間ではなく48時間インキュベートした後、NK細胞を添加し、組合せ同時投与群では、H101およびNKを同時に添加した後に、細胞を、72時間ではなく96時間インキュベートし、順序逆転様式での組合せ投与群では、NKを添加した後、細胞を、24時間ではなく48時間インキュベートした後に、H101を添加したことを除き、上述の例C9と類似であった。図27に示されるように(X軸は、E:T比を表し、Y軸は、対応する阻害率の百分率値を表す)、組合せ適用において、NK細胞の用量レベルと、その殺滅作用との間には正相関があり、H101およびNK細胞の用量レベルを、それぞれ変更しなかった場合には、H101を最初に投与し、NK細胞を後から投与した組合せの殺滅作用は、H101およびNK細胞を同時に投与した組合せの殺滅作用またはNK細胞を最初に投与し、H101を後から投与した組合せの殺滅作用よりも有意に高かった。
HT29細胞を、50%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、H101(MOI=17)を、培地を置きかえることなく添加した。感染プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、24時間継続させた。この実験には、ウイルスをHT29細胞に添加していないブランク対照群も、存在した。細胞を、トリプシン処理によって収集し、PBSで1回洗浄し、次いで、HT29細胞上のNKG2D関連リガンド(ULBP-1、ULBP-4、ULBP-2/5/6、およびMICA/MICB)を、検出した。H101に感染したHT29細胞の表面上のNKG2D関連リガンドの変化を、H101を添加していない対照群に対して計算した。以下の抗体を使用した:抗ヒトULBP-1 PE(R&D、品目番号FAB1380P)、抗ヒトULBP-4/RAET1E APC(R&D、品目番号FAB6285A)、抗ヒトULBP-2/5/6 APC(R&D、品目番号FAB1298A)、および抗ヒトMICA/MICB FITC(Miltenyi、品目番号130-106-100)。結果として得られたHT29細胞ペレットを、それぞれ、50μlの1% FBS+PBS中に再懸濁させた。対応する抗体(1~2μl)を、それぞれのサンプルに添加し、均一に混合した。4℃で30分間インキュベートした後、結果として得られたサンプルを、1% FBS+PBSで1回洗浄した。結果として得られたHT29細胞ペレットを、300μlの1% FBS+PBS中に再懸濁させ、均一に混合し、次いで、フローサイトメーターによって検出した。
実験例C12は、検出を、H101によるHT29細胞の感染を24時間ではなく48時間継続させた後に行ったことを除き、上述の実験例C11と類似であった。図29に示されるように(X軸は、様々なNKG2Dリガンド検出群を表し、Y軸は、対応する細胞数の百分率値を表す)、HT29細胞をH101に48時間感染させた後、ULBP-1およびULBP-2/5/6には有意な変化はなかったが、ULBP-4およびMICA/MICBの発現は、有意に増加した。
実験例D1:A549細胞に対するNK細胞の用量応答実験
A549細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM:F12(1:1)+10% FBS中で48時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいDMEM:F12(1:1)+10% FBSで置きかえ、NK細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比(すなわち、E:T、細胞数の比)で添加した:NK:A549=それぞれ40:1、30:1、20:1、15:1、10:1、5:1、および1:1。それぞれのE:T比での殺滅プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、48時間継続させた。その後に、トリパンブルー染色法を、生存A549細胞の計数に使用し、NK細胞によるA549細胞の殺滅率を、NK細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。用量応答曲線のX軸は、E:T比を表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す。殺滅時間が48時間であった実験の結果を、図30に示すが、これは、E:T比が5:1のときに、約24%の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するNK細胞の用量レベルとして採用した。
A549細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM:F12(1:1)+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清DMEM:F12(1:1)で置きかえ、ddvv-RFPを、それぞれ、0.135、0.027、0.0135、0.0054、0.0027、0.00135、および0.00054のMOIで添加した。ddvv-RFPを添加した時点を、0時間とした(以下同様)。感染プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、6時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、PBSで洗浄した。次いで、新しいDMEM:F12(1:1)+10% FBSを添加し、細胞を、さらに72時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存A549細胞の計数に使用し、ddvv-RFPによるA549細胞の殺滅率を、ddvv-RFPを添加しなかった対照群に対して計算した。図31は、用量応答曲線(X軸は、MOIを表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)を示すが、これは、MOIが0.0027であるときに、約32%の阻害率を呈する。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するddvv-RFPの用量レベルとして採用した。
上述の実験例から、A549細胞に対する殺滅に好適なddvv-RFPの用量レベルは、約0.0027のMOIであり、A549細胞に対する殺滅に好適なNK細胞の用量レベルは、約5:1のE:T比(すなわち、NK:A549)であったと結論付けることができる。
A549細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM:F12(1:1)+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清DMEM:F12(1:1)で置きかえ、ddvv-RFPを添加した(MOI=0.0027)。6時間感染させた後、培地を、新しいDMEM:F12(1:1)+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:A549)=5:1)。細胞を、さらに96時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存A549細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもNK細胞もA549細胞に添加していないブランク対照群、ddvv-RFPをその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないddvv-RFP群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、ddvv-RFPを添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
A549細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM:F12(1:1)+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、NK細胞を、培地を置きかえることなく添加し(E:T比(NK:A549=5:1)、細胞を、37℃で5% CO2において、48時間インキュベートした。次いで、ddvv-RFP(MOI=0.0027)を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存A549細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもNK細胞もA549細胞に添加していないブランク対照群、ddvv-RFPをその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないddvv-RFP群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、ddvv-RFPを添加していないNK群も、存在した。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
実験例E1:HepG2細胞に対するddvv-RFPの用量応答実験
HepG2細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清DMEMで置きかえ、ddvv-RFPを、それぞれ、MOI=0.27、0.135、0.054、0.027、0.0135、および0.0027のMOIで添加した。感染プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、6時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、PBSで洗浄した。次いで、新しいDMEM+10% FBSを添加し、細胞を、さらに72時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存HepG2細胞の計数に使用し、ddvv-RFPによるHepG2の殺滅率を、ddvv-RFPを添加しなかった対照群に対して計算した。図35は、用量応答曲線(X軸は、MOIを表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)を示すが、これは、HepG2細胞に対するddvv-RFPの用量レベルが約0.027のMOIであるときに、約42%の阻害率を呈し、用量レベルが約0.0135のMOIであるときに、約19%の阻害率を呈する。後続の組合せ殺滅実験において、ddvv-RFPおよびNK細胞の投与間の間隔が24時間であった場合には、使用するddvv-RFPの用量レベルとして、MOI=0.027を採用することが好適であったが、一方で、その間隔が48時間であった場合には、使用するddvv-RFPの用量レベルとして、MOI=0.0135を採用することが好適であった。
上述の実験例から、HepG2細胞に対する殺滅に好適なddvv-RFPの用量レベルは、約0.027のMOIであり、HepG2細胞に対する殺滅に好適なNK細胞の用量レベルは、約3:1のE:T比(すなわち、NK:HepG2)であったと結論付けることができる。
例E3は、ddvv-RFPをMOI=0.0135の用量レベルで添加し、感染した細胞を、24時間ではなく48時間インキュベートした後に、NK細胞を添加したことを除き、上述の例E2と類似であった。図39に示されるように(X軸は、様々な群を表し、Y軸は、対応する阻害率の百分率値を表す)、最終的な結果はまた、ddvv-RFPおよびNK細胞の組合せ適用(腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、NK細胞を後から投与する)は、HepG2細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約79%であったことを示した。しかしながら、この実験において、ddvv-RFPの単独適用の阻害率は、約53%であり、NK細胞の単独適用の阻害率は、約20%であった。
HepG2細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清DMEMで置きかえ、ddvv-RFPを添加した(MOI=0.027)。6時間感染させた後、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:HepG2)=3:1)。細胞を、さらに72時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存HepG2細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもNK細胞もHepG2細胞に添加していないブランク対照群、ddvv-RFPをその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないddvv-RFP群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、ddvv-RFPを添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
比較例E5は、ddvv-RFPをMOI=0.0135の用量レベルで添加し、細胞を、ddvv-RFPとNK細胞の両方とともに72時間ではなく96時間インキュベートしたことを除き、上述の比較例E4と類似であった。図40に示されるように(X軸は、様々な群を表し、Y軸は、対応する阻害率の百分率値を表す)、ddvv-RFPの単独適用の阻害率は、約50%であり、NK細胞の単独適用の阻害率は、約49%であった。これらの単独適用と比較して、NK細胞およびddvv-RFPの組合せ使用の阻害率は、約84%であったため増加していたが、しかしながら、有意な相乗作用は示されなかった。
HepG2細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:HepG2)=3:1)。細胞を、37℃で5% CO2において、24時間インキュベートした。次いで、ddvv-RFP(MOI=0.0027)を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存HepG2細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもNK細胞もHepG2細胞に添加していないブランク対照群、ddvv-RFPをその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないddvv-RFP群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、ddvv-RFPを添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
比較例E7は、NKを添加した後、細胞を、24時間ではなく48時間インキュベートした後に、ddvv-RFPを添加したこと(MOI=0.0135)を除き、上述の比較例E6と類似であった。図41に示されるように(X軸は、様々な群を表し、Y軸は、対応する阻害率の百分率値を表す)、順序逆転様式での組合せ適用(NK細胞を最初に投与し、ddvv-RFPを後から投与する)の阻害率は、約56%であり、ddvv-RFPの単独適用の阻害率は、約25%であり、NK細胞の単独適用の阻害率は、約41%であった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
実験例F1:HT29に対するddvv-RFPの用量応答実験
HT29細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清DMEMで置きかえ、ddvv-RFPを、それぞれ、MOI=2、1、0.5、0.25、0.1、および0.05のMOIで添加した。感染プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、6時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、PBSで洗浄した。次いで、新しいDMEM+10% FBSを添加し、細胞を、さらに72時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存HT29細胞の計数に使用し、ddvv-RFPによるHT29細胞の殺滅率を、ddvv-RFPを添加しなかった対照群に対して計算した。図42は、用量応答曲線(X軸は、MOIを表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)を示すが、これは、HT29細胞に対するddvv-RFPの用量レベルが約0.2のMOIであるときに、約49%の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量MOI=0.2を、組合せ殺滅実験において使用するddvv-RFPの用量レベルとして採用した。
上述の実験例から、HT29細胞に対する殺滅に好適なddvv-RFPの用量レベルは、約0.2のMOIであり、HT29細胞に対する殺滅に好適なNK細胞の用量レベルは、約3:1のE:T比(すなわち、NK:HT29)であったと結論付けることができる。
例F3は、ddvv-RFPの添加による感染の後、細胞を、24時間ではなく48時間インキュベートした後に、NK細胞を添加したことを除き、上述の例F2と類似であった。図46に示されるように(X軸は、様々な群を表し、Y軸は、対応する阻害率の百分率値を表す)、最終的な結果はまた、ddvv-RFPおよびNK細胞の組合せ適用(腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、NK細胞を後から投与する)は、HT29細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約78%であったことを示した。しかしながら、この実験において、ddvv-RFPの単独適用の阻害率は、約59%であり、NK細胞の単独適用の阻害率は、約12%であった。
HT29細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清DMEMで置きかえ、ddvv-RFPを添加した(MOI=0.2)。6時間感染させた後、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:HT29)=3:1)。細胞を、さらに72時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存HT29細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもNK細胞もHT29細胞に添加していないブランク対照群、ddvv-RFPをその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないddvv-RFP群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、ddvv-RFPを添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
比較例F5は、ddvv-RFPおよびNKを添加した後、細胞を、72時間ではなく96時間インキュベートしたことを除き、上述の比較例F4と類似であった。図47に示されるように(X軸は、様々な群を表し、Y軸は、対応する阻害率の百分率値を表す)、ddvv-RFPの単独適用の阻害率は、約64%であり、NK細胞の単独適用の阻害率は、約19%であった。これらの単独適用と比較して、NK細胞およびddvv-RFPの組合せ使用の阻害率は、約77%であったため増加していたが、しかしながら、有意な相乗作用は示されなかった。
HT29細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:HT29)=3:1)。細胞を、37℃で5% CO2において、24時間インキュベートした。次いで、ddvv-RFP(MOI=0.2)を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存HT29細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもNK細胞もHT29細胞に添加していないブランク対照群、ddvv-RFPをその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないddvv-RFP群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、ddvv-RFPを添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
比較例F7は、NKを添加した後、細胞を、24時間ではなく48時間インキュベートした後に、ddvv-RFPを添加したことを除き、上述の比較例F6と類似であった。図48に示されるように(X軸は、様々な群を表し、Y軸は、対応する阻害率の百分率値を表す)、順序逆転様式での組合せ適用(NK細胞を最初に投与し、ddvv-RFPを後から投与する)の阻害率は、約34%であり、ddvv-RFPの単独適用の阻害率は、約21%であり、NK細胞の単独適用の阻害率は、約22%であった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
実験例G1:HCT116細胞に対するNK細胞の用量応答実験
HCT116細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、マッコイ5A+10% FBS中で48時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいマッコイ5A+10% FBSで置きかえ、NK細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比(すなわち、E:T、細胞数の比)で添加した:NK:HCT116=それぞれ40:1、20:1、10:1、および5:1。それぞれのE:T比での殺滅プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、48時間継続させた。その後に、トリパンブルー染色法を、生存HCT116細胞の計数に使用し、NK細胞によるHCT116細胞の殺滅率を、NK細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。用量応答曲線を、図49に示すが(X軸は、E:T比を表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)、これは、E:T比が10:1であるときに、約13%の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するNK細胞の用量レベルとして採用した。
HCT116細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、マッコイ5A+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清マッコイ5Aで置きかえ、ddvv-RFPを、それぞれ、MOI=8、4、2、1、0.5、0.25、および0.125のMOIで添加した。感染プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、6時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、PBSで洗浄した。次いで、マッコイ5A+10% FBSを添加し、細胞を、さらに72時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存HCT116細胞の計数に使用し、ddvv-RFPによるHCT116細胞の殺滅率を、ddvv-RFPを添加しなかった対照群に対して計算した。図50は、用量応答曲線(X軸は、MOIを表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)を示すが、これは、HCT116細胞に対するddvv-RFPの用量レベルが約0.7のMOIであるときに、約22%の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するddvv-RFPの用量レベルとして採用した。
上述の実験例から、HCT116細胞に対する殺滅に好適なddvv-RFPの用量レベルは、約0.7のMOIであり、HCT116細胞に対する殺滅に好適なNK細胞の用量レベルは、約10:1のE:T比(すなわち、NK:HCT116)であったと結論付けることができる。
HCT116細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、マッコイ5A+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清マッコイ5Aで置きかえ、ddvv-RFPを添加した(MOI=0.7)。6時間感染させた後、培地を、新しいマッコイ5A+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:HCT116)=10:1)。細胞を、さらに72時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存HCT116細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもNK細胞もHCT116細胞に添加していないブランク対照群、ddvv-RFPをその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないddvv-RFP群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、ddvv-RFPを添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
HCT116細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、マッコイ5A+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、NK細胞を、培地を置きかえることなく添加し(E:T比(NK:HCT116)=10:1)、細胞を、37℃で5% CO2において、24時間インキュベートした。次いで、ddvv-RFP(MOI=0.7)を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存HCT116細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもNK細胞もHCT116細胞に添加していないブランク対照群、ddvv-RFPをその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないddvv-RFP群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、ddvv-RFPを添加していないNK群も、存在した。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
実験例H1:FaDu細胞に対するNK細胞の用量応答実験
FaDu細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、MEM+10% FBS中で48時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比(すなわち、E:T、細胞数の比)で添加した:NK:FaDu=それぞれ40:1、30:1、20:1、15:1、10:1、および5:1。それぞれのE:T比での殺滅プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、48時間継続させた。その後に、トリパンブルー染色法を、生存FaDu細胞の計数に使用し、NK細胞によるFaDu細胞の殺滅率を、NK細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。用量応答曲線を、図54に示すが(X軸は、E:T比を表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)、これは、E:T比が10:1であるときに、約27%の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するNK細胞の用量レベルとして採用した。
FaDu細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、MEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清MEMで置きかえ、ddvv-RFPを、それぞれ、MOI=2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、および0.03125のMOIで添加した。感染プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、6時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、PBSで洗浄した。次いで、MEM+10% FBSを添加し、細胞を、さらに72時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存FaDu細胞の計数に使用し、ddvv-RFPによるFaDuの殺滅率を、ddvv-RFPを添加しなかった対照群に対して計算した。図55は、用量応答曲線(X軸は、MOIを表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)を示すが、これは、FaDu細胞に対するddvv-RFPの用量レベルが約0.2のMOIであるときに、約32%の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するddvv-RFPの用量レベルとして採用した。
上述の実験例から、FaDu細胞に対する殺滅に好適なddvv-RFPの用量レベルは、約0.2のMOIであり、FaDu細胞に対する殺滅に好適なNK細胞の用量レベルは、約10:1のE:T比(すなわち、NK:FaDu)であったと結論付けることができる。
FaDu細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、MEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清MEMで置きかえ、ddvv-RFPを添加した(MOI=0.2)。6時間感染させた後、培地を、新しいMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:FaDu)=10:1)。細胞を、さらに72時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存FaDu細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもNK細胞もFaDu細胞に添加していないブランク対照群、ddvv-RFPをその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないddvv-RFP群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、ddvv-RFPを添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
FaDu細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、MEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、NK細胞を、培地を置きかえることなく添加し(E:T比(NK:FaDu=10:1)、細胞を、37℃で5% CO2において、24時間インキュベートした。次いで、ddvv-RFP(MOI=0.2)を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存FaDu細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもNK細胞もFaDu細胞に添加していないブランク対照群、ddvv-RFPをその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないddvv-RFP群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、ddvv-RFPを添加していないNK群も、存在した。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
実験例I1:SK-HEP-1細胞に対するNK細胞の用量応答実験
SK-HEP-1細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、MEM+10% FBS中で48時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比(すなわち、E:T、細胞数の比)で添加した:NK:SK-HEP-1=それぞれ40:1、30:1、20:1、10:1、および5:1。それぞれのE:T比での殺滅プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、48時間継続させた。その後に、トリパンブルー染色法を、生存SK-HEP-1細胞の計数に使用し、NK細胞によるSK-HEP-1細胞の殺滅率を、NK細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。図59は、用量応答曲線(X軸は、E:T比を表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)を示すが、これは、E:T比が5:1であるときに、約17%の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するNK細胞の用量レベルとして採用した。
SK-HEP-1細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、MEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清MEMで置きかえ、ddvv-RFPを、それぞれ、MOI=1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03、および0.015のMOIで添加した。感染プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、6時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、PBSで洗浄した。次いで、MEM+10% FBSを添加し、細胞を、さらに72時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存SK-HEP-1細胞の計数に使用し、ddvv-RFPによるSK-HEP-1の殺滅率を、ddvv-RFPを添加しなかった対照群に対して計算した。図60は、用量応答曲線(X軸は、MOIを表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)を示すが、これは、SK-HEP-1細胞に対するddvv-RFPの用量レベルが約0.15のMOIであるときに、約40%の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するddvv-RFPの用量レベルとして採用した。
上述の実験例から、SK-HEP-1細胞に対する殺滅に好適なddvv-RFPの用量レベルは、約0.15のMOIであり、SK-HEP-1細胞に対する殺滅に好適なNK細胞の用量レベルは、約5:1のE:T比(すなわち、NK:SK-HEP-1)であったと結論付けることができる。
SK-HEP-1細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、MEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清MEMで置きかえ、ddvv-RFPを添加した(MOI=0.15)。6時間感染させた後、培地を、新しいMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:SK-HEP-1)=5:1)。細胞を、さらに72時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存SK-HEP-1細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもNK細胞もSK-HEP-1細胞に添加していないブランク対照群、ddvv-RFPをその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないddvv-RFP群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、ddvv-RFPを添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
SK-HEP-1細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、MEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:SK-HEP-1)=5:1)。細胞を、37℃で5% CO2において、24時間インキュベートした。次いで、ddvv-RFP(MOI=0.15)を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存SK-HEP-1細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもNK細胞もSK-HEP-1細胞に添加していないブランク対照群、ddvv-RFPをその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないddvv-RFP群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、ddvv-RFPを添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
実験例J1:PANC-1細胞に対するNK細胞の用量応答実験
PANC-1細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で48時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比(すなわち、E:T、細胞数の比)で添加した:NK:PANC-1=それぞれ40:1、20:1、15:1、10:1、および5:1。それぞれのE:T比での殺滅プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、48時間継続させた。その後に、トリパンブルー染色法を、生存PANC-1細胞の計数に使用し、NK細胞によるPANC-1細胞の殺滅率を、NK細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。図64は、用量応答曲線(X軸は、E:T比を表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)を示すが、これは、E:T比が3:1であるときに、約10%の阻害率を呈する。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するNK細胞の用量レベルとして採用した。
PANC-1細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清DMEMで置きかえ、ddvv-RFPを、それぞれ、MOI=0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03、および0.015のMOIで添加した。感染プロセスは、細胞を37℃で5% CO2においてインキュベートした状態で、6時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、PBSで洗浄した。次いで、DMEM+10% FBSを添加し、細胞を、さらに72時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存PANC-1細胞の計数に使用し、ddvv-RFPによるPANC-1の殺滅率を、ddvv-RFPを添加しなかった対照群に対して計算した。図65は、用量応答曲線(X軸は、MOIを表し、Y軸は、阻害率(IR)の百分率値を表す)を示すが、これは、MOIが0.1であるときに、約58%の阻害率を呈する。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するddvv-RFPの用量レベルとして採用した。
上述の実験例から、PANC-1細胞に対する殺滅に好適なddvv-RFPの用量レベルは、約0.1のMOIであり、PANC-1細胞に対する殺滅に好適なNK細胞の用量レベルは、約3:1のE:T比(すなわち、NK:PANC-1)であったと結論付けることができる。
PANC-1細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清DMEMで置きかえ、ddvv-RFPを添加した(MOI=0.1)。6時間感染させた後、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:PANC-1)=3:1)。細胞を、さらに96時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存PANC-1細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもNK細胞もPANC-1細胞に添加していないブランク対照群、ddvv-RFPをその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないddvv-RFP群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、ddvv-RFPを添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
PANC-1細胞を、30%のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、37℃で5% CO2において、DMEM+10% FBS中で24時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいDMEM+10% FBSで置きかえ、NK細胞を添加した(E:T比(NK:PANC-1)=3:1)。細胞を、37℃で5% CO2において、48時間インキュベートした。次いで、ddvv-RFP(MOI=0.1)を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに48時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存PANC-1細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもNK細胞もPANC-1細胞に添加していないブランク対照群、ddvv-RFPをその対応する時点で添加したが、NK細胞を添加していないddvv-RFP群、およびNK細胞をその対応する時点で添加したが、ddvv-RFPを添加していないNK群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、3回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
Claims (24)
- (a)第1の薬学的に許容される担体中に腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む第1の医薬組成物と、
(b)第2の薬学的に許容される担体中にNK細胞を含む第2の医薬組成物と
を含む治療剤であって、
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができ、
前記NK細胞が改変されておらず、
前記第1の医薬組成物の投与の18~72時間後に前記第2の医薬組成物を投与する、
腫瘍および/またはがんの治療のための治療剤。 - 前記腫瘍および/またはがんが、肺がん、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病を含む、請求項1に記載の治療剤。
- 前記第1の医薬組成物の活性成分が、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであり、かつ、前記第2の医薬組成物の活性成分が、前記NK細胞である、請求項1に記載の治療剤。
- 前記第1の医薬組成物が、治療有効用量の前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み、前記第2の医薬組成物が、1×107~1×1010細胞/日の範囲の用量の前記NK細胞を含む、請求項1に記載の治療剤。
- 前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される、請求項1に記載の治療剤。
- 前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、TK遺伝子および/またはVGF遺伝子が機能的に欠損している、請求項1に記載の治療剤。
- 前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、Pexa-vac、JX-963、JX-929、VSC20、GL-ONC1、および/またはTG6002から選択される、請求項1に記載の治療剤。
- 前記NK細胞が、自家NK細胞および同種NK細胞から選択される、請求項1に記載の治療剤。
- 前記NK細胞が、インビトロで増殖させた自家NK細胞またはインビトロで増殖させた同種NK細胞である、請求項8に記載の治療剤。
- 前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内注入を介して投与されるかまたは静脈内投与されるように製剤化され、かつ、前記NK細胞が、静脈内投与されるように製剤化される、請求項1に記載の治療剤。
- 前記第1の医薬組成物の活性成分が、1×105~5×109pfu/日の範囲の用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み、かつ、前記第2の医薬組成物の活性成分が、1×107~1×1010細胞/日の範囲の用量のNK細胞を含む、請求項1に記載の治療剤。
- 前記第1の医薬組成物および前記第2の医薬組成物からなる、請求項1に記載の治療剤。
- 腫瘍および/またはがんの治療のための薬物の調製のための請求項1~12の何れか1項に記載の治療剤の使用であって、
前記治療剤の第1の医薬組成物の投与の18~72時間後に前記治療剤の第2の医薬組成物を投与する、使用。 - 前記腫瘍および/またはがんが、肺がん、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病を含む、請求項13に記載の使用。
- 腫瘍および/またはがんの治療のための相乗作用を有する組合せ薬物のキットであって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む第1の容器と、NK細胞を含む第2の容器と、投与のタイミングおよび経路を示す説明書とを含み、前記第1の容器が、前記第2の容器とは別個であり、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができ、前記NK細胞が改変されておらず、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与のタイミングは、前記NK細胞の投与のタイミングの18~72時間前である、キット。
- 前記第1の容器が、治療有効用量の前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み、前記第2の容器が、1×107~1×1010細胞/日の範囲の用量の前記NK細胞を含む、請求項15に記載のキット。
- 前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される、請求項15に記載のキット。
- 前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、TK遺伝子および/またはVGF遺伝子が機能的に欠損している、請求項15に記載のキット。
- 前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、Pexa-vac、JX-963、JX-929、VSC20、GL-ONC1、および/またはTG6002から選択される、請求項15に記載のキット。
- 前記NK細胞が、自家NK細胞および同種NK細胞から選択される、請求項15に記載のキット。
- 前記NK細胞が、インビトロで増殖させた自家NK細胞またはインビトロで増殖させた同種NK細胞である、請求項20に記載のキット。
- 前記腫瘍および/またはがんが、肺がん、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病を含む、請求項15に記載のキット。
- 前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内注入を介して投与されるかまたは静脈内投与されるように製剤化され、かつ、前記NK細胞が、静脈内投与されるように製剤化される、請求項15に記載のキット。
- 前記第1の容器が、1×105~5×109pfu/日の範囲の用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み、かつ、前記第2の容器が、1×107~1×1010細胞/日の範囲の用量のNK細胞を含む、請求項15に記載のキット。
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