WO2019062233A1

WO2019062233A1 - 包含分离的重组溶瘤痘病毒和nk细胞的治疗剂及应用、药盒、治疗肿瘤和/或癌症的方法

Info

Publication number: WO2019062233A1
Application number: PCT/CN2018/093401
Authority: WO
Inventors: 傅瑾; 赵荣华; 张蓉; 王婷婷; 陈霖; 胡放
Original assignee: 杭州康万达医药科技有限公司
Priority date: 2017-09-26
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2019-04-04
Also published as: CN111315873A; EP3690034A1; US20200289591A1; EP3690034A4; WO2019062234A1; JP7248325B2; CN109554353A; JP2023071953A; CN111315873B; JP2020536533A; CN109554353B

Abstract

包含分离的重组溶瘤痘病毒和NK细胞的治疗剂、药盒，治疗肿瘤和/或癌症的方法。所述治疗剂包含(a)第一药物组合物，其包含重组溶瘤痘病毒；和(b)第二药物组合物，其包含NK细胞；所述重组溶瘤痘病毒是TK基因和VGF基因功能缺陷型的，并且该重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源IL-21基因，并且该IL-21基因能够在肿瘤细胞中表达。所述重组溶瘤痘病毒能够使溶瘤病毒的溶瘤杀伤作用和IL-21的抗肿瘤免疫刺激作用产生协同效果。所述重组溶瘤痘病毒与NK细胞联用可产生进一步加强的协同杀伤肿瘤的作用。

Description

包含分离的重组溶瘤痘病毒和NK细胞的治疗剂及应用、药盒、治疗肿瘤和/或癌症的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及包含分离的重组溶瘤痘病毒和NK细胞的治疗剂及应用、药盒、治疗肿瘤和/或癌症的方法。

背景技术

溶瘤病毒是一种能够在肿瘤细胞中选择性复制并杀伤肿瘤细胞，但不伤害正常细胞的一类病毒。病毒在受感染的肿瘤细胞内进行复制后，释放出新的病毒颗粒，进而感染其周围的肿瘤细胞，进一步起了溶瘤作用，除了这一直接的溶瘤作用外，溶瘤病毒还可有效刺激机体产生针对病毒自身及针对被感染肿瘤细胞的免疫应答。由此可见，溶瘤病毒的抗肿瘤作用是通过选择性杀伤肿瘤细胞和诱导机体产生系统性抗肿瘤免疫反应的双重作用来实现的。

早在19世纪末人们就发现多种病毒可缓解肿瘤发展的进程，提示了病毒在肿瘤治疗领域的潜力。随着基因技术的发展，可通过改变病毒基因组结构使其可选择性地在肿瘤细胞内进行复制，提升其溶瘤靶向性。近十年来，研究者们以基因重组、基因转入、基因敲除等技术开始对腺病毒、疱疹病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒等病毒进行了基因改构，为此开发出一系列的溶瘤病毒产品。迄今为止大约有20多个产品进入临床研究的不同阶段。其中，2005年中国CFDA批准了上海三维生物技术有限公司的基因改构溶瘤腺病毒H101上市，用于治疗头颈部肿瘤，这是世界范围内首个上市的溶瘤病毒药物。10年之后的2015年，第二个溶瘤病毒药物，即Amgen公司的基因改构溶瘤单纯疱疹病毒T-Vec才被美国FDA以及欧盟EMA批准上市，用于治疗晚期恶性黑素瘤。目前尚未有基因改构的溶瘤痘病毒作为药物上市。

目前在肿瘤和/或癌症的溶瘤病毒免疫治疗中，仍然需要开发出效果更好的药物。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了包含分离的重组溶瘤痘病毒和NK细胞的治疗剂及应用、药盒、治疗肿瘤和/或癌症的方法。

具体而言，本发明提供了：

(1)一种治疗剂，包含：

(a)第一药物组合物，其中该第一药物组合物包含位于第一可药用载体中的重组溶瘤痘病毒；和

(b)第二药物组合物，其中该第二药物组合物包含位于第二可药用载体中的NK细胞；

其中所述重组溶瘤痘病毒是TK基因和VGF基因功能缺陷型的，并且该重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源IL-21基因，并且该IL-21基因能够在肿瘤细胞中表达。

(2)根据(1)所述的治疗剂，其中所述TK基因通过插入外源核苷酸序列而使该TK基因功能缺陷。

(3)根据(1)所述的治疗剂，其中所述外源IL-21基因插入在所述TK基因中，从而使该TK基因功能缺陷。

(4)根据(1)所述的治疗剂，其中所述VGF基因通过基因敲除或插入外源核苷酸序列而使该VGF基因功能缺陷。

(5)根据(1)所述的治疗剂，其中所述重组溶瘤痘病毒是惠氏株或WR株。

(6)根据(1)所述的治疗剂，其中所述重组溶瘤痘病毒的基因组中还整合有外源筛选基因，所述外源筛选基因包括gpt基因和/或LacZ基因，但不包括荧光蛋白基因。

(7)根据(1)或(5)所述的治疗剂，其中所述外源IL-21基因来自于小鼠或人。

(8)根据(1)所述的治疗剂，其中所述第一药物组合物的活性成分为所述重组溶瘤痘病毒，并且所述第二药物组合物的活性成分为所述NK细胞。

(9)根据(1)所述的治疗剂，其中所述第一药物组合物和所述第二药物组合物各自独立地存在于所述治疗剂中而互不混合。

(10)根据(1)所述的治疗剂，其中所述第一药物组合物包含1×10 ⁵-5×10 ⁹pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒，并且所述第二药物组合物包含1×10 ⁷-1×10 ¹⁰个细胞/天剂量的所述NK细胞。

(11)根据(1)所述的治疗剂，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。

(12)根据(1)所述的治疗剂，其中所述重组溶瘤痘病毒配制成通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞配制成通过静脉给药。

(13)根据(1)所述的治疗剂，其中所述治疗剂由所述第一药物组合物和所述第二药物组合物组成。

(14)根据(1)-(13)中任一项所述的治疗剂在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。

(15)根据(14)所述的应用，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌。

(16)一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括：装有重组溶瘤痘病毒的第一容器和装有NK细胞的第二容器，其中所述第一容器和所述第二容器是独立的；以及载明给药时机和给药方式的说明书；其中所述重组溶瘤痘病毒是TK基因和VGF基因功能缺陷型的，并且该重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源IL-21基因，并且该IL-21基因能够在肿瘤细胞中表达。

(17)根据(16)所述的药盒，其中所述第一独立容器包含1×10 ⁵至5×10 ⁹pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒，并且所述第二独立容器包含1×10 ⁷至1×10 ¹⁰个细胞/天剂量的所述NK细胞。

(18)根据(16)所述的药盒，其中所述TK基因通过插入外源核苷酸序列而使该TK基因功能缺陷。

(19)根据(16)所述的药盒，其中所述外源IL-21基因插入在所述TK基因中，从而使该TK基因功能缺陷。

(20)根据(16)所述的药盒，其中所述VGF基因通过基因敲除或插入外源核苷酸序列而使该VGF基因功能缺陷。

(21)根据(16)所述的药盒，其中所述重组溶瘤痘病毒是惠氏株或WR株。

(22)根据(16)所述的药盒，其中所述重组溶瘤痘病毒的基因组中还整合有外源筛选基因，所述外源筛选基因包括gpt基因和/或LacZ基因，但不包括荧光蛋白基因。

(23)根据(16)或(21)所述的药盒，其中所述外源IL-21基因来自于小鼠或人。

(24)根据(16)所述的药盒，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。

(25)根据(16)所述的药盒，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌。

(26)根据(16)所述的药盒，其中所述重组溶瘤痘病毒配制成通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞配制成通过静脉给药。

(27)一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括以下依次进行的步骤：

1)对肿瘤和/或癌症患者施用重组溶瘤痘病毒；

2)在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用NK细胞；

(28)根据(27)所述的方法，其中所述TK基因通过插入外源核苷酸序列而使该TK基因功能缺陷。

(29)根据(27)所述的方法，其中所述外源IL-21基因插入在所述TK基因中，从而使该TK基因功能缺陷。

(30)根据(27)所述的方法，其中所述VGF基因通过基因敲除或插入外源核苷酸序列而使该VGF基因功能缺陷。

(31)根据(27)所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒是惠氏株或WR株。

(32)根据(27)所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒的基因组中还整合有外源筛选基因，所述外源筛选基因包括gpt基因和/或La _cZ基因，但不包括荧光蛋白基因。

(33)根据(27)或(31)所述的方法，其中所述外源IL-21基因来自于小鼠或人。

(34)根据(27)所述的方法，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。

(35)根据(27)所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌。

(36)根据(27)所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为为1×10 ⁵-5×10 ⁹pfu/天，每天1次，连续施用1-6天；并且所述NK细胞的施用剂量为1×10 ⁷至1×10 ¹⁰个细胞/天剂量，每天1次，连续施用1-6天。

(37)根据(27)所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为为1×10 ⁵-5×10 ⁹pfu/天，每2天1次，连续施用2-6天。

(38)根据(27)所述的方法，其中所述NK细胞的施用剂量为1×10 ⁷至1×10 ¹⁰个细胞/天剂量，每2天1次，连续施用2-6天。

(39)根据(27)所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞通过静脉给药。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

本发明首次提出使溶瘤痘病毒的TK基因和VGF基因的功能缺陷，同时使其携带免疫调控因子IL-21的基因，从而使所得的重组溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制，并且表达免疫调控因子IL-21。基于该构思而提供的溶瘤痘病毒、药物组合物和方法能够充分发挥溶瘤病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞、以及进一步引起随后的机体免疫反应的作用，同时还能够充分发挥外源IL-21的抗肿瘤免疫作用。本发明发现在溶瘤痘病毒中整合IL-21基因，能够使溶瘤病毒的溶瘤杀伤作用和IL-21的抗肿瘤免疫刺激作用产生协同效果。

此外，使痘病毒的TK和VGF双基因功能缺陷有效增强了其肿瘤靶向性，从而提高了安全性。

此外，由于本发明的重组溶瘤痘病毒在肿瘤细胞中选择性复制的同时表达外源IL-21，能够协同刺激机体的抗肿瘤免疫反应，进而使得本发明的重组溶瘤痘病毒能够与NK细胞得以联用。基于该构思而提供的药物组合物和方法能够充分发挥本发明的重组溶瘤痘病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞、以及进一步引起随后的机体免疫反应的作用，同时还能够充分发挥NK细胞杀伤肿瘤细胞的功能，并且巧妙地利用了本发明的重组溶瘤痘病毒选择性地在肿瘤细胞中复制的特点，使得含有本发明的重组溶瘤痘病毒的肿瘤细胞成为了NK细胞的特异性靶标，而表达的外源IL-21也能提升NK细胞的杀伤力从而进一步增强了NK细胞的肿瘤杀伤作用。这样最终产生进一步加强的协同杀伤肿瘤的作用。

进一步地，本发明通过研究，使得本发明的重组溶瘤痘病毒和NK细胞各自的施用剂量、施用顺序和施用间隔能够使两者的联合施用达到最大效率的协同作用，同时避免了两者之间的相互制约，从而达到有效地治疗肿瘤和/或癌症的效果。

定义

在本发明中，词语“肿瘤”、“癌症”、“肿瘤细胞”、“癌细胞”涵盖本领域通常认为的含义。

本文所用的词语“溶瘤病毒”是指能够选择性地在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞的病毒。

本文所用的词语“治疗有效量”是指功能药剂或药物组合物能够表现出可检测的治疗效果或抑制效果的量，或者起到抗肿瘤效果的量。所述效果可以通过本领域任何已知的检验方法检测。

本文所用的词语“给药”或“施用”是指向受试者提供化合物、复合物或组合物(包括病毒和细胞)。

本文所用的词语“患者”是指人或非人类生物。因此，本文所述的方法和组合物适用于人类疾病和兽类疾病。在一些实施方案中，患者患有肿瘤。在一些例子中，患者同时患有一种或多种类型的癌症。

本文所用的词语“协同效果”是指两种或多种药剂共同起到的效果，该效果大于其中各药剂的单独效果的总和。

本文所用的术语“pfu”或“蚀斑形成单位”(plague forming unit)是指：产生一个蚀斑的病毒量称为一个蚀斑形成单位(pfu)。

本文所用的术语“MOI”或“感染复数”(Multiplicity of infection)也即，病毒与细胞个数比，是指用以起始病毒感染的每个细胞感染病毒颗粒的粒数。MOI＝pfu/细胞，即细胞个数×MOI＝总PFU。

附图说明

图1示出在本发明一个实施方案中所构建的用于在痘病毒VSC20(即图中所示“Dvv-VSC20/VGF-”)的TK基因中插入IL-21基因的重组质粒的图谱，以及重组机制的示意图，通过所示重组机制得到本发明的一个实施方案的重组双基因缺陷痘病毒(重组DDvv)。

图2示出获得本发明的重组溶瘤痘病毒的一个实施方案的流程图。

图3示出本发明实施例1中所构建的质粒的图谱。

图4示出分别用PCR和ELISA法鉴定P0代重组病毒DDvv-IL21的结果；其中A为用PCR法检测P0代病毒DDvv-mIL21，B为用 PCR法检测P0代病毒DDvv-hIL21，图中泳道M：D000marker，泳道1：阴性对照(即，PCR反应液)，泳道2：VSC20，泳道3：CV1细胞，泳道4：P0代病毒；C为用ELISA鉴定P0代病毒培养上清中IL21的表达水平。图4C中横坐标为组别，纵坐标为IL21浓度(pg/mL)，横坐标中所示“NC”是指CV1细胞，“质粒”是指pCB-mIL21。

图5示出空斑筛选后重组病毒的鉴定结果；其中A和B分别为用PCR法鉴定溶瘤痘病毒DDvv-mIL21、DDvv-hIL21，图中泳道M：D000marker，泳道1：阴性对照(即，PCR反应液)，泳道2：P0代病毒，泳道3：DDvv-mIL21(图5A)或DDvv-hIL21(图5B)；C和D分别为用PCR法进行TK区鉴定，图中泳道M：D000marker，泳道1：阴性对照(即，PCR反应液)，泳道2：VSC20，泳道3：P0代病毒，泳道4：DDvv-mIL21(图5C)或DDvv-hIL21(图5D)；E和G分别为用Western Blot使用抗IL-21抗体检测溶瘤痘病毒DDvv-mIL21和DDvv-hIL21内IL21蛋白的表达，其中所示“NC”是指CV1细胞；F和H分别为用ELISA试剂盒检测溶瘤痘病毒DDvv-mIL21和DDvv-hIL21感染细胞后的培养液及细胞裂解液内IL21的含量。

图6示出携带鼠IL-21片段的重组痘病毒DDvv-mIL21对5种鼠源癌细胞的杀伤效果，其中A为B16细胞实验结果，B为4T1细胞实验结果，C为LLC细胞实验结果，D为GL261细胞实验结果，E为CT26细胞实验结果。图6A-E横坐标为时间(小时)，纵坐标为细胞杀伤率(％)。

图7示出携带鼠IL-21片段的重组痘病毒DDvv-mIL21对5种鼠源癌细胞的杀伤效果曲线(A-E)和IC ₅₀值(F)，其中A为B16细胞实验结果，B为CT26细胞实验结果，C为4T1细胞实验结果，D为LLC细胞实验结果，E为GL261细胞实验结果。图7A-E横坐标为MOI的log值，纵坐标为细胞杀伤率(％)。图7F横坐标为细胞组别，纵坐标为IC ₅₀值(MOI)。

图8示出携带人IL-21片段的重组痘病毒DDvv-hIL21对4种人源癌细胞的杀伤效果，其中A为A549细胞实验结果，B为Hela细胞实验结果，C为SKOV3细胞实验结果，D为U251细胞实验结果。图8A-D横坐标为时间(小时)，纵坐标为细胞杀伤率(％)。

图9示出携带人IL-21片段的重组痘病毒DDvv-hIL21对8种人源癌细胞的杀伤效果曲线(A-H)和IC ₅₀值(I)，其中A为A549细胞实验结果，B为HepG2细胞实验结果，C为Hela细胞实验结果，D为HT29细胞实验结果，E为SKOV3细胞实验结果，F为PANC1细胞实验结果，G为SK-HEP-1细胞实验结果，H为FaDu细胞实验结果。图9A-H横坐标为MOI的log值，纵坐标为细胞杀伤率(％)。图9I横坐标为细胞组别，纵坐标为IC ₅₀值(MOI)。

图10示出携带鼠IL-21片段的重组痘病毒DDvv-mIL21对B16荷瘤小鼠的抑瘤作用。图10A表示肿瘤体积随时间变化的曲线，横坐标为给药时间(天)，纵坐标为肿瘤体积(mm ³)。图10B表示T/C随时间变化的曲线，横坐标为给药时间(天)，纵坐标为T/C(％)。图10C表示不同剂量组的肿瘤重量的比较结果，横坐标为组别，纵坐标为肿瘤重量(g)。

图11示出流式分析DDvv-mIL21对B16荷瘤小鼠的免疫作用；A和B分别为脾脏提取PBMC的流式分析检测CD4 ⁺细胞的变化(A)和CD8 ⁺细胞的变化(B)；C和D分别为肿瘤组织提取肿瘤细胞的流式分析检测CD4 ⁺细胞的变化(C)和CD8 ⁺细胞的变化(D)。图11A-D横坐标为给药组别，纵坐标为CD4 ⁺T或CD8 ⁺T细胞的百分比(％)。

图12示出携带鼠IL-21片段的重组痘病毒DDvv-mIL21对LLC荷瘤小鼠的抑制瘤作用。图12A表示肿瘤体积随时间变化的曲线，横坐标为给药时间(天)，纵坐标为肿瘤体积(mm ³)；图12B表示T/C随时间变化的曲线，横坐标为给药时间(天)，纵坐标为T/C(％)。

图13示出携带人IL-21片段的DDvv-hIL21痘病毒和NK细胞联合对人肿瘤细胞SK-HEP-1的杀伤作用。横坐标为组别，纵坐标为相应的抑制率的百分比数值。

图14示出携带鼠IL-21片段的DDvv-mIL21痘病毒对药物诱导免疫低下B16荷瘤小鼠的抑瘤作用。图14A示出处理后肿瘤体积的变化曲线，横坐标为B16肿瘤细胞接种时间(天)，横坐标上的箭头表示给予DDvv-mIL21时间点，纵坐标为肿瘤体积(mm ³)；图14B示出处理后T/C的变化曲线，横坐标为B16肿瘤细胞接种时间(天)，纵坐标为T/C(％)。

图15示出携带鼠IL-21片段的DDvv-mIL21痘病毒与对照痘病毒对药物诱导免疫低下B16荷瘤小鼠的抑瘤作用的比较。图15A示出处理后肿瘤体积的变化曲线，横坐标为给药后时间(天)，纵坐标为肿瘤体积(mm ³)；图15B示出处理后T/C的变化曲线，横坐标为给药后时间(天)，纵坐标为T/C(％)；图15C示出处理后的肿瘤重量，横坐标为组别，纵坐标为肿瘤重量(g)。

图16示出携带鼠IL-21片段的DDvv-mIL21痘病毒与对照痘病毒对药物诱导免疫低下B16荷瘤小鼠的免疫作用的流式分析比较。图16A-C分别示出流式分析检测CD4 ⁺细胞的变化(A)、CD8 ⁺细胞的变化(B)和NK细胞的变化(C)。图16A-C中横坐标为给药组别，纵坐标分别为肿瘤组织内CD4 ⁺T细胞与肿瘤组织内总免疫细胞的数量百分比(％)(A)、CD8 ⁺T细胞与肿瘤组织内总免疫细胞的数量百分比(％)(B)或NK细胞与肿瘤组织内总免疫细胞的数量百分比(％)(C)。

图17示出携带人IL-21片段的DDvv-hIL21痘病毒联合人NK细胞与对照痘病毒联合人NK细胞对HCT116荷瘤的重度免疫缺陷型小鼠的抑瘤作用比较。图17A示出处理后肿瘤体积的变化曲线，横坐标为HCT116肿瘤细胞接种时间(天)，横坐标上的箭头表示给予DDvv-hIL21时间点，纵坐标为肿瘤体积(mm ³)；图17B示出处理后T/C的变化曲线，横坐标为HCT116肿瘤细胞接种时间(天)，纵坐标为T/C(％)。

图18A-D示出携带人IL-21片段的DDvv-hIL21痘病毒联合人NK细胞与对照痘病毒联合人NK细胞对HCT116荷瘤的重度免疫缺陷型小鼠处理后肿瘤组织分析比较(使用定量PCR法)，包括肿瘤组织内痘病毒A46R基因的相对表达水平(A)、IL-21基因的相对表达水平(B)、NK细胞的NKG2D基因的相对表达水平(C)、IFN-γ 基因的相对表达水平(D)。图18A-D横坐标为给药组别，纵坐标分别为肿瘤组织内各靶点基因(肿瘤内痘病毒的A46R基因(A)、肿瘤内IL-21基因(B)、肿瘤内NK细胞的NKG2D基因(C)、肿瘤内IFN-γ基因(D))的表达水平(单位pg)相对于GAPDH基因的表达水平(单位μg)的比值(pg/μg)。

图19示出静脉给予的DDvv-mIL21痘病毒在B16肿瘤小鼠中的分布。横坐标为组织器官类别，纵坐标为各组织器官内痘病毒A46R基因的表达量分别与肾脏器官内痘病毒A46R基因的表达量的比较倍数。

图20示出携带人IL-21片段的DDvv-hIL21痘病毒和人NK细胞联合对人肿瘤细胞HepG2的杀伤作用。横坐标为组别，纵坐标为相应的抑制率的百分比数值。

图21示出携带人IL-21片段的DDVV-hIL21痘病毒联合人NK细胞与对照痘病毒联合人NK细胞对人肿瘤细胞HCT116的杀伤作用比较。图21A示出NK组、DDvv-hIL21组和DDvv-hIL21+NK组的比较；图21B示出各实验组的比较。图21A和B中横坐标为组别，纵坐标为相应的抑制率的百分比数值。

图22示出携带人IL-21片段的DDVV-hIL21痘病毒联合人NK细胞与对照痘病毒联合人NK细胞对人肿瘤细胞FaDu的杀伤作用比较。图22A示出NK组、DDvv-hIL21组和DDvv-hIL21+NK组的比较；图22B示出各实验组的比较。图22A和B中横坐标为组别，纵坐标为相应的抑制率的百分比数值。

各图中，如果显示的话，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001，****表示p＜0.0001(与所示的对照组比较，使用One-way ANOVA统计分析法得到)。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

人体是一个复杂的系统，它是由呼吸、循环、消化等十大系统组成，这些系统协调配合，使人体内各种复杂的生命活动能够正常进行。当肿瘤发生后，机体可通过多种免疫效应机制发挥抗肿瘤作用，机体的抗肿瘤机制包括细胞免疫和体液免疫两个方面。它们联系密切，相互影响，涉及多种免疫效应分子和效应细胞。一般认为，细胞免疫在抗肿瘤过程中起到主导作用，体液免疫在某些情况下起协同作用。本发明提出利用溶瘤痘病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并杀伤肿瘤细胞的特点，同时使其携带免疫调控因子IL-21，从而使重组的溶瘤痘病毒协同发挥选择性溶瘤和增强机体抗肿瘤免疫效应的作用。基于该构思，本发明的发明人通过实验研究和理论摸索，发现同时使溶瘤痘病毒的TK基因和VGF基因的功能缺陷，并在基因组中整合IL-21基因，能够很好地实现上述协同作用。

痘病毒(Vaccinia virus，VV)是迄今发现最大、最复杂的病毒之一，它是预防天花的疫苗病毒。该病毒的特殊生物属性使其在肿瘤免疫治疗/基因治疗领域获得越来越大的关注：(1)安全性：痘病毒是在细胞胞浆内复制的DNA病毒，不会整合进宿主细胞基因组，减少由于外源基因诱发的变异(参见文献：“Hruby，D.E.Vaccinia Virus Vectors：New Strategies for Producing Recombinant Vaccines.Clin.Microbiol.Rev.3，153-170(1990).”)；(2)表达效率高：痘病毒可培养到很高滴度(＞10 ⁹pfu/ml)，通常感染1-3小时，可使90％以上的受感染细胞表达目的基因产物(参见文献：“Pfleiderer，M.，Falkner，F.G.&Dorner，F.A novel vaccinia virus expression system allowing construction of recombinants without the need for selection markers，plasmids and bacterial hosts.J.Gen.Virol.76，2957-2962(1995).”)；(3)感染的细胞范围广：几乎可感染所有类型的哺乳动物细胞，包括分裂和非分裂细胞(参见文献：“Hruby，D.E.Vaccinia Virus Vectors：New Strategies for Producing Recombinant Vaccines.Clin.Microbiol.Rev.3，153-170(1990).”)；(4) 基因组容量大：至少可插入25kb的外源基因而不影响其遗传稳定性(参见文献：“Hruby，D.E.Vaccinia Virus Vectors：New Strategies for Producing Recombinant Vaccines.Clin.Microbiol.Rev.3，153-170(1990).”)；(5)稳定性：对温度不敏感，成药性好，方便使用和运输(参见文献：“Hruby，D.E.Vaccinia Virus Vectors：New Strategies for Producing Recombinant Vaccines.Clin.Microbiol.Rev.3，153-170(1990).”)；(6)表达产物具有天然结构：它表达的产物可具有正确的糖基化和翻译后加工，接近天然构型(参见文献：“Hruby，D.E.Vaccinia Virus Vectors：New Strategies for Producing Recombinant Vaccines.Clin.Microbiol.Rev.3，153-170(1990).”)，这对于病毒携带免疫调控基因用以激发机体免疫反应是至关重要的。

痘病毒的胸苷激酶(thymidine kinase(TK))基因是痘病毒复制过程需依赖的基因之一。如果痘病毒缺失了TK基因，则需通过宿主细胞提供TK蛋白补给，而TK蛋白在正常细胞周期中只能短暂表达，但在大多数肿瘤细胞中TK蛋白呈持续性高表达。因此利用TK蛋白在肿瘤组织的表达特性使得TK缺失痘病毒的复制局限在肿瘤组织内，而不在正常细胞内复制，从而提高了肿瘤靶向性。自从1982年开始使用痘病毒基因改造体系以来，TK基因区一直是被用于外源基因的插入区(参见文献：“Byrd，C.&Hruby，D.Construction of Recombinant Vaccinia Virus.in Vaccinia Virus and Poxvirology：Methods and Protocols 269，31-40(2004).”)。

其次，痘病毒在细胞内的复制和在细胞间的播散与宿主细胞表皮生长因子受体(EGFR)信号通路的活化密切相关。痘病毒感染细胞后分泌病毒生长因子(virus growth factor(VGF))，其与已感染的或邻近的未感染细胞表面的EGFR结合并激活EGFR/Ras信号通路，为痘病毒的复制及感染邻近细胞提供有利的环境。因此VGF缺失的痘病毒在正常细胞内无法启动EGFR/Ras通道，使其感染正常细胞受限。而肿瘤细胞中EGFR信号通路处于活化状态，故缺失VGF基因的痘病毒在肿瘤细胞内的复制、感染不受影响，亦即相对提高了对肿瘤作用的特异性(参见文献：“Autio，K.et al.Safety and biodistribution of a double-deleted oncolytic vaccinia virus encoding CD40 ligand in laboratory Beagles.Mol.Ther.-Oncolytics1，1-8(2014).”)。

IL-21(即白细胞介素-21(interleukin-21))是一种多向性I型细胞因子，主要由T细胞产生，调节先天免疫和获得性免疫应答，在抗肿瘤免疫反应中发挥了重要作用。已有文献报道IL-21对各类免疫细胞及信号转导的作用(参见文献：“Leonard，W.J.&Wan，C.IL-21 Signaling in Immunity.F1000Research 5，1-10(2016).”)，各类免疫细胞主要包括：1)CD4 ⁺T细胞：促进增殖、产生细胞因子；T _fh细胞：促进分化、提高发育中心功能；T _h17细胞：促进分化、增殖；Treg细胞：抑制其产生与存活；2)NKT细胞：增殖、增强细胞毒性；3)CD8 ⁺T细胞：提升细胞毒性、增殖和/或存活、抗肿瘤作用；4)NK细胞：促进细胞成熟、增殖、提高细胞毒性作用、增强抗肿瘤活性；5)DC细胞：抑制抗原递呈功能、诱导凋亡；6)巨噬细胞：提升吞噬作用；7)B细胞：促进增殖和/或凋亡、促进浆细胞分化和免疫球蛋白的生成；8)另外IL-21可激活多种与肿瘤相关信号通道，包括JAK/STAT、MARK/PI3K等信号通道，调控肿瘤的发展过程。在肿瘤免疫治疗中，激活NK细胞和CD8 ⁺T细胞的细胞毒性是关键，许多研究已充分表明IL-21在这一程序中起着重要作用。IL-21促进NK细胞成熟使其产生IFN-γ和穿孔素，诱发NK细胞介导的抗肿瘤细胞毒性作用靶向于肿瘤细胞表面的NKG2D配体，通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)提升NK细胞的杀伤力(参见文献：“Spolski，R.&Leonard，W.J.Interleukin-21：a double-edged sword with therapeutic potential.Nat.Rev.Drug Discov.13，379-395(2014).”)。其次，IL-21通过诱导CD8 ⁺T细胞的增殖、诱导记忆T细胞的生成、促进IFNγ/颗粒酶的分泌等，以增强CD8 ⁺T细胞对肿瘤的杀伤和有利于对复发肿瘤细胞产生记忆性免疫应答。重要的是不同于IL-2，IL-21不会诱导Treg细胞的扩增，也进一步增强了CD8 ⁺T细胞的免疫功能应答(参见文献：“Spolski，R.&Leonard，W.J.Interleukin-21：a double-edged sword with therapeutic potential.Nat.Rev.Drug Discov.13，379-395(2014).”)。基于IL-21对免疫细胞的多样化作用，体现了IL-21可在肿瘤微环境内 “重新活化”多种效应细胞，已有多个临床研究使用IL-21单独或与其它药物联合用于肿瘤治疗。

因此，本发明提供了一种分离的重组溶瘤痘病毒，其中该重组溶瘤痘病毒是TK基因和VGF基因功能缺陷型的，并且该重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源IL-21基因，并且该IL-21基因能够在肿瘤细胞中表达。

本发明在提及溶瘤病毒的基因时所使用的术语“功能缺陷”是指该溶瘤病毒无法发挥该基因应有的功能，即功能丧失，该目的可通过(例如)在基因中插入外源片段或敲除该基因而实现。

因此，可以在所述TK基因中插入外源核苷酸序列，从而使其功能缺陷。也可以在所述VGF基因中插入外源核苷酸序列，从而使其功能缺陷，但优选将所述VGF基因敲除。

优选地，将外源IL-21基因插入到TK基因中，这样能够使该TK基因发生功能缺陷，并且在感染肿瘤细胞之后能够表达IL-21基因。

在本发明中，可使用的痘病毒包括惠氏株或WR株，WR株的一个例子为VSC20。

在一个优选的实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒是对VSC20痘病毒进行基因改造而得到的。VSC20痘病毒是VGF基因缺失的痘病毒，其中在C11R位点插入LacZ基因，制备方法可参见科技文献：“McCart，JA，et al.Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.Cancer Res(2001)61：8751-8757.”。所述基因改造包括将外源IL-21基因插入该VSC20痘病毒的TK基因中，从而使该TK基因功能缺陷。具体地，用于在痘病毒VSC20的TK基因中插入IL-21基因的质粒的图谱，以及通过重组机制实现插入的示意图如图1所示。

所述重组溶瘤痘病毒的基因组中还可以整合有外源筛选基因，所述外源筛选基因包括gpt(鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)基因和/或LacZ基因，但不包括荧光蛋白基因，以避免荧光蛋白的表达在患者体内带来的安全隐患。

所述重组溶瘤痘病毒的基因组中也可以不整合有外源筛选基因。

在一些实施方案中，本发明通过分别使用痘病毒早/晚启动子p7.5控制gpt基因，以及人工合成痘病毒早启动子pSEL控制外源IL-21基因，使用体外细胞内重组技术将gpt和IL-21基因插入到痘病毒VSC20株的TK基因区中，以此构建溶瘤病毒，两个启动子以背靠背的方式分别启动各自调控基因的表达。

本发明进一步发现，仅将外源IL-21基因插入TK基因中，从而使其发生功能缺陷，并且使该溶瘤痘病毒的VGF基因的功能缺陷，即可发挥溶瘤病毒选择性地在肿瘤细胞中复制、杀死肿瘤细胞、引起随后的机体免疫反应的作用，并且溶瘤痘病毒携带的外源IL-21基因可直接诱发抗肿瘤免疫作用。

优选地，所述外源IL-21基因来自于小鼠或人。

本发明的重组溶瘤痘病毒可通过生物工程领域的相关已知方法获得，一个具体实施方案的流程如图2所示。

本发明考虑了溶瘤痘病毒和IL-21各自的特点，巧妙地使其整合在一起而联合发挥作用，其中溶瘤痘病毒在溶瘤的同时，通过其在肿瘤细胞内复制的功能可放大IL-21在肿瘤细胞内表达，随后外泌到细胞外，以此进一步诱发机体的肿瘤免疫作用，两者联合作用具有更好的治疗效果。

基于本发明开发的重组溶瘤痘病毒，本发明还提供了一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据本发明所述的重组溶瘤痘病毒，及可药用辅料。

优选地，所述药物组合物包含治疗有效量的所述重组溶瘤痘病毒。在某些实施方案中，所述药物组合物的活性成分包括1×10 ⁵至5×10 ⁹pfu/天剂量的根据本发明所述的重组溶瘤痘病毒(例如，1×10 ⁵至3×10 ⁹pfu/天剂量的根据本发明所述的重组溶瘤痘病毒、1×10 ⁵至1×10 ⁸pfu/天剂量的根据本发明所述的重组溶瘤痘病毒等)。

所述重组溶瘤痘病毒可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。

本发明的药物组合物还可以包含本领域已知的其它活性成分，例如白细胞介素-2(IL-2)、IL-15、IL-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，其施用剂量和施用方式可以按照各自常规的方式进行。如果包含其它活性成分，那么所述重组溶瘤痘病毒应独立地存在于所述药物组合物中而不与其它活性成分相互混合。例如，将重组溶瘤痘病毒独立地装在独立容器中。

本领域的技术人员可以理解，本发明的药物组合物还可包含合适的可药用的辅料。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含一种或多种可药用载体。可以通过本领域已知的方法制备药物制剂。例如，可以将化合物等活性成分与常见的赋形剂、稀释剂(例如磷酸盐缓冲液或生理盐水)、组织培养基、和载体(例如自体血浆或人血清白蛋白)进行配制，并作为悬浮剂施用。其它的载体可以包括脂质体、胶团、纳米胶囊、聚合纳米颗粒、固体脂颗粒(例如参见文献“E.Koren and V.Torchilin，Life，63：586-595，2011”)。本发明的药物组合物的具体配制方法可参见科学文献和专利文献中的描述，例如参见最新版雷明登氏药物科学，Maack出版公司，Easton PA(″Remington′s″)。

本发明另一方面还提供了一种用于制备本发明所述的重组溶瘤痘病毒的载体。

所述载体可通过重组机制使痘病毒内的TK基因和VGF基因发生功能缺陷。例如，在一个具体实施方案中，如图1所示，重组载体包含TK同源片段TK-L、TK-R、及启动IL-21基因和外源筛选基因gpt的表达框。当痘病毒为WR株时，TK基因的序列为NCBI(即，美国国立生物技术信息中心，网址：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank中编号为NC_006998的痘病毒基因中第80724-81257bp所示的序列，则TK-L的序列可为例如第80724-80961bp所示序列片段，TK-R的序列可为例如第81033-81257bp所示序列片段。该载体可通过细胞内重组机制使IL-21基因表达框和gpt基因表达框插入到痘病毒的TK基因区中(从而使(例如)GenBank中编号为NC_006998的痘病毒基因中第80962-81032bp所示的序列片段缺失)，从而使重组痘病毒丧失TK基因功能。本发明另一方面还提供了一种含有本发明所述的载体的宿主细胞。

本发明另一方面还提供了本发明所述的重组溶瘤痘病毒在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。

所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌等。

本发明另一方面还提供了一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括对肿瘤和/或癌症患者施用根据本发明所述的重组溶瘤痘病毒。

在本发明的一个优选实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，每天1次，连续施用1-6天(包括连续施用1天、2天、3天、4天、5天或6天)。所述治疗有效量优选为1×10 ⁵至5×10 ⁹pfu/天剂量(例如，1×10 ⁵至3×10 ⁹pfu/天剂量、1×10 ⁵至1×10 ⁸pfu/天剂量等)。

如果需要，还可以将本发明的重组溶瘤痘病毒与其它药物联合使用，例如白细胞介素-2(IL-2)、IL-15、IL-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，其施用剂量和施用方式可以按照各自常规的方式进行。

可以根据实际情况和需要对患者进行一次或多次本发明的治疗肿瘤和/或癌症的方法。

本发明还提供了一种治疗剂，包含：

(a)第一药物组合物，其中该第一药物组合物包含位于第一可药用载体中的本发明所述的重组溶瘤痘病毒；和

(b)第二药物组合物，其中该第二药物组合物包含位于第二可药用载体中的NK细胞。

在一些实施方案中，所述第一可药用载体和第二可药用载体是相同的。在另一些实施方案中，所述第一可药用载体和第二可药用载体是不同的。

在一些情况下，所述治疗剂也可以理解为药物的组合。

所有溶瘤病毒杀伤肿瘤细胞的机制都大体相似。在不同实施方案中，通过瘤内注射或静脉给药的方式，溶瘤病毒与肿瘤细胞接触，感染进入肿瘤细胞内。由于溶瘤病毒的特性是，其主要在肿瘤细胞内复制增殖，而在正常细胞内低复制或不复制，因此被感染的肿瘤细胞中会出现大量的溶瘤病毒，造成肿瘤细胞的溶解和死亡。肿瘤细胞的溶解会释放出大量的肿瘤抗原和增殖的溶瘤病毒，抗原会进一步激活体内的免疫系统，刺激体内的NK细胞和T细胞继续攻击尚未死亡的肿瘤细胞，同时新的溶瘤病毒会继续感染尚未被感染的肿瘤细胞。

NK细胞是广谱型杀伤肿瘤细胞的免疫细胞，NK细胞可以辨别肿瘤细胞与正常细胞的区别。NK通过与肿瘤细胞接触，识别确认其为非正常细胞，然后通过受体识别、抗体靶向识别(ADCC)、颗粒酶分泌、穿孔素分泌和分泌干扰素间接杀伤等多种协同手段，达到杀死肿瘤细胞的效果。体外实验显示，一个健康的NK细胞在生命期内可以连续杀死27个肿瘤细胞。

NK细胞还具有抗病毒的功能。当正常细胞感染了病毒后，随着病毒的大量复制，细胞体现出衰老病变，体现在细胞膜上的蛋白簇的组成发生变化，在这个过程中，NK细胞就可以敏锐而高效地识别被感染的细胞，通过类似于杀伤肿瘤细胞的上述手段，杀死被感染的细胞，从而达到抑制病毒复制增殖的目的。随后在抗原刺激和干扰素等因子的作用下，其它免疫细胞会持续作用，抵抗病毒。

本发明考虑了溶瘤病毒和NK细胞各自的特点，巧妙地将其联用，在联用时，NK细胞的抗病毒机制对于被溶瘤病毒感染的肿瘤细胞同样适用，并且与其抗肿瘤机制互补。此外，联用还使得含有溶瘤病毒的肿瘤细胞成为了NK细胞的特异性靶标，从而增强了NK细胞的肿瘤杀伤作用。溶瘤病毒选择性地在癌细胞内增殖，在胞内起作用杀伤癌细胞，同时能够导致癌细胞膜上的蛋白受体簇发生变化，增强NK细胞对癌细胞的识别，NK细胞在癌细胞外攻击，两者联合起来协同杀伤癌细胞，具有更好的治疗效果。进一步地，本发明所述的重组溶瘤痘病毒还同时表达外源IL-21，而表达的外源IL-21能够提升NK细胞的杀伤力从而进一步增强NK细胞的杀伤作用，使得本发明所述的重组溶瘤痘病毒与NK细胞的联用能够对肿瘤的杀伤效果产生令人惊奇的效果。

优选的是，所述第一药物组合物的活性成分为本发明所述的重组溶瘤痘病毒，并且所述第二药物组合物的活性成分为所述NK细胞。

优选地，所述第一药物组合物和所述第二药物组合物各自独立地存在于所述治疗剂中而互不混合。

在本发明中，所述NK细胞可以选自自体NK细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。NK细胞的大规模体外扩增培养技术是已知的，并且已经基本成熟(参见(例如)以下科技文献：“Somanchi SS，Lee DA.Ex Vivo Expansion of Human NK Cells Using K562 Engineered to Express Membrane Bound IL21.Methods Mol Biol.2016；1441：175-93.”或“Phan MT，Lee SH，Kim SK，Cho D.Expansion of NK Cells Using Genetically Engineered K562 Feeder Cells.Methods Mol Biol.2016；1441：167-74.”)。临床数据证实自体NK细胞、半相合异体NK细胞(属于异体NK细胞)、以及脐血制备NK细胞回输人体后均无毒副作用，无长期依赖性，安全有效。

可用于治疗的NK细胞的纯度范围可以是：自体NK细胞的纯度可为大于等于85％，异体NK细胞的纯度可为大于等于90％；其中的杂质细胞可为NK-T和/或γδT细胞。优选地，NK细胞活性(存活率)大于等于90％，NK细胞杀伤力活性大于等于80％。

在本发明的所述联用治疗方案中，本发明进一步探索优化了溶瘤病毒和NK细胞各自的施用剂量，这是至关重要的。优选地，所述第一药物组合物包含1×10 ⁵-5×10 ⁹pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒(例如，1×10 ⁵-3×10 ⁹pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒、1×10 ⁵-1×10 ⁸pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒等)，并且所述第二药物组合物包含1×10 ⁷-1×10 ¹⁰个细胞/天剂量的所述NK细胞(优选地，所述第二药物组合物包含1×10 ⁸至5×10 ⁹个细胞/天剂量的所述NK细胞；还优选地，所述第二药物组合物包含1×10 ⁹至4×10 ⁹个细胞/天剂量的所述NK细胞；更优选地，所述第二药物组合物包含1×10 ⁹至3×10 ⁹个细胞/天剂量的所述NK细胞)。优选的是，该治疗剂的活性成分由1×10 ⁵至5×10 ⁹pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒(例如，1×10 ⁵至3×10 ⁹pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒、1×10 ⁵至1×10 ⁸pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒等)和1×10 ⁷至1×10 ¹⁰个细胞/天剂量的所述NK细胞(例如，1×10 ⁸至5×10 ⁹个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×10 ⁹至4×10 ⁹个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×10 ⁹至3×10 ⁹个细胞/天剂量的所述NK细胞等)组成。

NK细胞可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如可通过静脉给药。

本领域的技术人员可以理解，本发明的治疗剂还可包含合适的可药用的辅料。

本发明的治疗剂还可以包含本领域已知的其它活性成分，例如白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等。

在一些实施方案中，本发明的治疗剂包含一种或多种可药用载体。可以通过本领域已知的方法制备药物制剂。例如，可以将化合物等活性成分与常见的赋形剂、稀释剂(例如磷酸盐缓冲液或生理盐水)、组织培养基、和载体(例如自体血浆或人血清白蛋白)进行配制，并作为悬浮剂施用。其它的载体可以包括脂质体、胶团、纳米胶囊、聚合纳米颗粒、固体脂颗粒(例如参见文献“E.Koren and V.Torchilin，Life，63：586-595，2011”)。本发明的治疗剂的具体配制方法可参见科学文献和专利文献中的描述，例如参见最新版雷明登氏药物科学， Maack出版公司，Easton PA(″Remington′s″)。

本发明的治疗剂可以治疗多种肿瘤和/或癌症，包括但不限于：肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌等。

本发明的治疗剂的施用方法为，对肿瘤和/或癌症患者首先施用所述重组溶瘤痘病毒，然后，在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18-72小时(例如，第20-70小时、第22-48小时、第24-48小时、第30-48小时等)，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述NK细胞。“在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18-72小时(例如，第20-70小时、第22-48小时、第24-48小时、第30-48小时等)，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述NK细胞”是指首次NK细胞的施用与首次重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)，或首次NK细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)。优选地，首次NK细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)。还优选地，首次NK细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为24-48小时。

在本发明的一个优选实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，每天1次，连续施用1-6天；并且所述NK细胞的施用剂量为1×10 ⁷至1×10 ¹⁰个细胞/天剂量(例如，1×10 ⁸至5×10 ⁹个细胞/天剂量、1×10 ⁹至4×10 ⁹个细胞/天剂量、1×10 ⁹至3×10 ⁹个细胞/天剂量)，每天1次，连续施用1-6天。在本发明的另一个优选实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，每2天1次，连续施用2-6天；并且所述NK细胞的施用剂量为1×10 ⁷至1×10 ¹⁰个细胞/天剂量(例如，1×10 ⁸至5×10 ⁹个细胞/天剂量、1×10 ⁹至4×10 ⁹个细胞/天剂量、1×10 ⁹至3×10 ⁹个细胞/天剂量)，每2天1次，连续施用2-6天。无论本发明采用上述何种实施方案或其它实施方案，只要满足在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用NK细胞的条件即可。其中所述重组溶瘤痘病毒的施用和NK细胞的施用可以是间隔给药方式(例如，第1天施用所述重组溶瘤痘病毒，第2天施用NK细胞，第3天施用所述重组溶瘤痘病毒，第4天施用NK细胞…以此类推)；或依次给药方式(例如，第1天施用所述重组溶瘤痘病毒，第2天依次施用所述重组溶瘤痘病毒和NK细胞，第3天依次施用所述重组溶瘤痘病毒和NK细胞，第4天依次施用所述重组溶瘤痘病毒和NK细胞…以此类推)；或其它给药方式(例如首先施用所述重组溶瘤痘病毒，每天1次，连续施用1-6天，之后间隔18-72小时再施用NK细胞，每天1次，连续施用1-6天)。优选的是，首先施用所述重组溶瘤痘病毒，在所述重组溶瘤痘病毒全部施用之后间隔18-72小时再施用NK细胞。在本发明的一个优选实施方案中，对肿瘤和/或癌症患者首先施用所述重组溶瘤痘病毒，所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，施用1次；并且在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述NK细胞，所述NK细胞的施用剂量为1×10 ⁷至1×10 ¹⁰个细胞/天剂量(例如，1×10 ⁸至5×10 ⁹个细胞/天剂量、1×10 ⁹至4×10 ⁹个细胞/天剂量、1×10 ⁹至3×10 ⁹个细胞/天剂量)，施用1次。所述重组溶瘤痘病毒的治疗有效量优选为1×10 ⁵至5×10 ⁹pfu/天剂量(例如，1×10 ⁵至3×10 ⁹pfu/天剂量、1×10 ⁵至1×10 ⁸pfu/天剂量等)。

本发明还提供了本发明所述的治疗剂在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。

本发明另一方面还提供了一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括装有本发明所述重组溶瘤痘病毒的第一容器和装有本发明所述NK细胞的第二容器，其中所述第一容器和所述第二容器是独立的；以及载明给药时机和给药方式的说明书。优选的是，该药盒由分别独立地装有本发明所述的重组溶瘤痘病毒和本发明所述的NK细胞的独立容器组成，以及载明给药时机和给药方式的说明书。

优选地，装有本发明所述重组溶瘤痘病毒的第一容器包含治疗有效量的所述重组溶瘤痘病毒，并且装有NK细胞的第二容器包含足够提供1×10 ⁷-1×10 ¹⁰个细胞/天剂量的所述NK细胞(例如，1×10 ⁸至5×10 ⁹个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×10 ⁹至4×10 ⁹个细胞/天剂量的所述NK细胞、1×10 ⁹至3×10 ⁹个细胞/天剂量的所述NK细胞等)。所述重组溶瘤痘病毒的治疗有效量优选为1×10 ⁵至5×10 ⁹pfu/天剂量(例如，1×10 ⁵至3×10 ⁹pfu/天剂量、1×10 ⁵至1×10 ⁸pfu/天剂量等)。

优选地，所述装有所述重组溶瘤痘病毒的第一容器包含1×10 ⁵-1×10 ⁸pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒，并且所述装有NK细胞的第二容器包含1×10 ⁹至3×10 ⁹个细胞/天剂量的所述NK细胞。

在本发明中，所述NK细胞可以选自自体NK细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。

所述重组溶瘤痘病毒可采用其各自的本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。

本发明另一方面还提供了一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括以下依次进行的步骤：

1)对肿瘤和/或癌症患者施用根据本发明所述的重组溶瘤痘病毒；

2)在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18-72小时(例如，第20-70小时、第22-48小时、第24-48小时、第30-48小时等)，对所述肿瘤和/或癌症患者施用本发明所述的NK细胞。

“在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18-72小时(例如，第20-70小时、第22-48小时、第24-48小时、第30-48小时等)，对所述肿瘤和/或癌症患者施用本发明所述的NK细胞”是指首次NK细胞的施用与首次重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)，或首次NK细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)。优选地，首次NK细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)。还优选地，首次NK细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为24-48小时。

溶瘤病毒能够在肿瘤或癌症细胞中选择性复制，经过一定时间达到峰值。本发明的发明人发现，在经过一段时间的复制之后，肿瘤细胞里的溶瘤病毒会促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。因此，本发明提出的重组溶瘤痘病毒和NK细胞的施用顺序和间隔实现了两者作用峰值的双峰重叠。

本发明进一步探索优化了所述重组溶瘤痘病毒和NK细胞各自的施用剂量，其与上述施用顺序和施用间隔的配合是至关重要的，其决定了所述重组溶瘤痘病毒的抗肿瘤疗效、NK细胞的抗肿瘤疗效、以及两者对肿瘤细胞的最佳协同杀伤。

在本发明的一个优选实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，每天1次，连续施用1-6天；并且所述NK细胞的施用剂量为1×10 ⁷至1×10 ¹⁰个细胞/天剂量(例如，1×10 ⁸至5×10 ⁹个细胞/天剂量、1×10 ⁹至4×10 ⁹个细胞/天剂量、1×10 ⁹至3×10 ⁹个细胞/天剂量)，每天1次，连续施用1-6天。在本发明的另一个优选实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，每2天1次，连续施用2-6天；并且所述NK细胞的施用剂量为1×10 ⁷至1×10 ¹⁰个细胞/天剂量(例如，1×10 ⁸至5×10 ⁹个细胞/天剂量、1×10 ⁹至4×10 ⁹个细胞/天剂量、1×10 ⁹至3×10 ⁹个细胞/天剂量)，每2天1次，连续施用2-6天。无论本发明采用上述何种实施方案或其它实施方案，只要满足在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用NK细胞的条件即可。其中重组溶瘤痘病毒的施用和NK细胞的施用可以是间隔给药方式(例如，第1天施用重组溶瘤痘病毒，第2天施用NK细胞，第3天施用重组溶瘤痘病毒，第4天施用NK细胞…以此类推)；或依次给药方式(例如，第1天施用重组溶瘤痘病毒，第2天依次施用重组溶瘤痘病毒和NK细胞，第3天依次施用重组溶瘤痘病毒和NK细胞，第4天依次施用重组溶瘤痘病毒和NK细胞…以此类推)；或其它给药方式(例如首先施用重组溶瘤痘病毒，每天1次，连续施用1-6天，之后间隔18-72小时再施用NK细胞，每天1次，连续施用1-6天)。优选的是，首先施用重组溶瘤痘病毒，在重组溶瘤痘病毒全部施用之后间隔18-72小时再施用NK细胞。在本发明的一个优选实施方案中，对肿瘤和/或癌症患者首先施用所述重组溶瘤痘病毒，所述溶瘤病毒的施用剂量为治疗有效量，施用1次；并且在施用所述溶瘤病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述NK细胞，所述NK细胞的施用剂量为1×10 ⁷至1×10 ¹⁰个细胞/天剂量(例如，1×10 ⁸至5×10 ⁹个细胞/天剂量、1×10 ⁹至4×10 ⁹个细胞/天剂量、1×10 ⁹至3×10 ⁹个细胞/天剂量)，施用1次。所述重组溶瘤痘病毒的治疗有效量优选为1×10 ⁵至5×10 ⁹pfu/天剂量(例如，1×10 ⁵至3×10 ⁹pfu/天剂量、1×10 ⁵至1×10 ⁸pfu/天剂量等)。

所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌等。

以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。

例子

以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用生物工程领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。

以下除非特别说明，否则各试剂的百分浓度(％)均指该试剂的体积百分浓度(％(v/v))。

以下例子中所用的材料如下：

1.CV1细胞和Hu-143B细胞来源于武汉大学中国典型培养物保藏中心。

2.肿瘤细胞

除FaDu人头颈癌细胞来源于杭州市第一人民医院，其余各肿瘤细胞来源于中国典型培养物保藏中心和ATCC。细胞培养为正常培养环境McCoy′s 5A+10％FBS和MEM+10％FBS。McCoy′s 5A和MEM购自GIBCO公司。胎牛血清FBS购自SIGMA公司。

3.NK细胞

实验中采用的NK细胞来源如下：

各例子中采用杭州康万达医药科技有限公司培养冻存的人NK细胞。该人NK细胞的制备方法如下：采用本领域常规的方法，用采血针穿刺肘部静脉，取健康人的外周静脉血，提取全免疫细胞PBMC。采用经辐照后的K562滋养细胞(购自杭州鼎云生物技术有限公司)，以自体血浆培养法扩增NK细胞，最终NK细胞纯度达到90％，NK细胞存活活性达到90％，NK细胞体外杀伤率达到85％。

4.对照病毒

作为对照病毒的溶瘤痘病毒DDVV-RFP是已知的，属于溶瘤痘病毒WR株(可参见(例如)科技文献：“X Song，et al.T-cell Engager-armed Oncolytic Vaccinia Virus Significantly Enhances Antitumor TherapyMolecular Therapy.(2014)；221，102-111”)，该病毒的TK基因和VGF基因均为功能缺陷型，且携带有外源红色荧光蛋白(RFP)基因。由于RFP基因仅起到筛选/报告作用，因此溶瘤痘病毒DDVV-RFP的抗肿瘤功能基本等同TK基因和VGF基因功能缺陷型的溶瘤痘病毒。溶瘤痘病毒DDvv-RFP也可采用本领域常规技术对VSC20痘病毒进行基因改造而得到。VSC20痘病毒是VGF基因缺失的痘病毒，制备方法可参见科技文献：“McCart，JA，et al.Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.Cancer Res(2001)61：8751-8757.”。所述基因改造包括使用人工合成痘病毒早/晚期启动子pSEL调控外源DsRed基因(即RFP基因)，使用体外细胞内重组技术将DsRed基因插入到痘病毒VSC20株的TK基因区中，从而构建得到溶瘤痘病毒DDVV-RFP。其生产和纯化可按照下文所述制备例2进行。

5.C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。重度免疫缺陷型NCG小鼠得自浙江省动物中心。

6.培养板

6孔细胞培养板(每孔培养体积2ml)、24孔细胞培养板(每孔培养体积500μl)、96孔细胞培养板(每孔培养体积200μl)均得自：Corning(康宁)公司。

7.gpt筛选药物配制方法：使用0.1M NaOH分别配制10mg/ml霉酚酸(400×)、10mg/ml 40×黄嘌呤(40×)、10mg/ml次黄嘌呤(670×)，避光-20℃储存；使用时配制1×工作液：在10ml DMEM内加入25μl霉酚酸+250μl黄嘌呤+15μl次黄嘌呤。

8.PBS配方：8mM Na ₂HPO ₄、136mM NaCl、2mM KH ₂PO ₄、2.6mM KCl，pH7.2-7.4。

9.STE缓冲液配方：10mM Tris-Cl、0.1M NaCl、1mM EDTA，pH8.0。

10.以下例子中所用的细胞计数方法如下：

MTT法：每孔细胞中加入10μl MTT溶液(5mg/ml)，在37℃培养箱培养4～6小时，吸弃培养液，每孔加入150μl DMSO，置摇床上低速震荡10分钟，使结晶物充分溶解，使用酶标仪检测其在490nm处的吸光值(OD ₄₉₀)。抑制率计算公式：细胞增殖抑制百分率(IR％)＝1-(OD ₄₉₀供试品-OD ₄₉₀空白)/(OD ₄₉₀阴性对照-OD ₄₉₀空白)×100％。

台盼蓝染色法计数：将细胞用PBS洗后，用胰蛋白酶消化，细胞悬浮在PBS中，加入终浓度为0.04％(w/v)的台盼蓝染液，显微镜下计数，死细胞会染成蓝色，活细胞为透明无色。取活细胞数为最终数据。

以下例子中所用的缩写说明如下：

FBS：胎牛血清

PSG：青霉素-链霉素-谷氨酰胺

PBMC：外周血单个核细胞

RFP：红色荧光蛋白

TIL：肿瘤浸润淋巴细胞

DMSO：二甲亚砜

制备例1：DDvv-IL21溶瘤痘病毒的构建

以下过程可参见图2。

(1)质粒构建

构建两株溶瘤痘病毒使其分别携带人IL-21、鼠IL-21基因，分别标注为DDvv-hIL21、DDvv-mIL21。

1)根据NCBI基因库序列NM_001291041和NM_021803，用基因合成方法合成鼠IL21DNA片段(mIL-21)和人IL21DNA片段(hIL-21)共2条，具体而言：

mIL-21包含正常序列的鼠源IL21片段(即Genbank编号NM_001291041的核苷酸序列中72-560bp的片段)，其序列(SEQ ID NO.1)如下所示：

AGATCTATGGAGAGGACCCTTGTCTGTCTGGTAGTCATCTTCTTGGGGACAGTGGCCCATAAATCAAGCCCCCAAGGGCCAGATCGCCTCCTGATTAGACTTCGTCACCTTATTGACATTGTTGAACAGCTGAAAATCTATGAAAATGACTTGGATCCTGAACTTCTATCAGCTCCACAAGATGTAAAGGGGCACTGTGAGCATGCAGCTTTTGCCTGTTTTCAGAAGGCCAAACTCAAGCCATCAAACCCTGGAAACAATAAGACATTCATCATTGACCTCGTGGCCCAGCTCAGGAGGAGGCTGCCTGCCAGGAGGGGAGGAAAGAAACAGAAGCACATAGCTAAATGCCCTTCCTGTGATTCGTATGAGAAAAGGACACCCAAAGAATTCCTAGAAAGACTAAAATGGCTCCTTCAAAAGGTATGCACCTTAAATGCATTTCTTTCACTTCCATGTTGTGTCCGGGTACCTCCTGTGCCCAGTGACTCATAG

其中 AGATCT为BglII识别序列；

为SpeI识别序列；以及

hIL-21包含正常序列的人源IL21片段(即Genbank编号为NM_021803的核苷酸序列中47-535bp的片段)，其序列(SEQ ID NO.2)如下所示：

AGATCTATGAGATCCAGTCCTGGCAACATGGAGAGGATTGTCATCTGTCTGATGGTCATCTTCTTGGGGACACTGGTCCACAAATCAAGCTCCCAAGGTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTAT AGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTGCCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCCTGA

其中 AGATCT为BglII识别序列；

为SpeI识别序列。

使用BglII内切酶与SpeI内切酶进行剪切，把IL21基因插入pCB质粒(来源可参见文献“房有容等，Zeocin和GFP双筛选标记重组痘苗病毒载体的构建.《国际流行病学传染病学杂志》，2012.39(3)：148-152.”)内，使用大肠杆菌DH5α转化提取质粒pCB-mIL21、pCB-hIL21(图3)。

2)T7通用引物测序检测质粒pCB-mIL21、pCB-hIL21，序列正确。

3)使用TIANprep Rapid Mini Plasmid试剂盒(TIANGEN，DP105-03)进行中等量质粒DNA提取。

(2)重组溶瘤痘病毒的包装及鉴定

1)选取生长状态良好的CV1细胞铺于6孔板中，约4×10 ⁵个细胞/孔，使得次日细胞密度达到80％-90％。

2)弃掉6孔板中的培养基，两个孔分别加入1ml无血清无抗生素的DMEM培养基，其中分别含有9×10 ³pfu的Dvv-VSC20病毒(病毒来源可参见文献“McCart，JA，et al.Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.Cancer Res(2001)61：8751-8757.”)使其浓度为0.03pfu/细胞，十字混匀，37℃培养2小时，期间每20分钟混匀一次，同时设置一个不加病毒液的对照孔。

3)配制质粒/Lipo2000(

2000转染试剂，Life Technologies，11668-019)混合液：溶液A-吸取5μg的质粒加入到300μl的Opti-MEM I(Gibco，1802679)中混匀，室温孵育5分钟；溶液B-吸取12μl的Lipo2000，加入至300μl的Opti-MEM I中混匀，室温孵育5分钟；将配置好的溶液A及溶液B混合，温和混匀，室温孵育15分钟，得到质粒/Lipo2000混合液。向感染病毒的其中一个孔加入300μl质粒/Lipo2000混合液，另设置一个只转染质粒的对照孔，37℃培养4小时，每孔补加2ml含10％FBS+1％PSG的DMEM培养基。

4)24小时后，弃旧的培养基，换含5％FBS+1％PSG的DMEM培养基，继续培养约48小时，显微镜下观察见细胞完全病变后，收集上清及细胞，反复冻融3次，释放病毒。

5)取出200μl的病毒液，使用TIANamp Virus DNA/RNA试剂盒(TIANGEN，DP315)抽提病毒基因组，用于PCR法检测外源插入的IL-21基因是否整合到骨架病毒内；同时取50μl的病毒液离心取上清用于ELISA检测(Mouse IL-21DuoSet ELISA，R&D，DY594-05；Human IL-21 Uncoated ELISA，Invitrogen，88-8218)，进一步确定重组痘病毒是否表达IL-21蛋白，剩余病毒液保存于-80℃，标示为P0。PCR鉴定所用引物序列如表1，PCR检测获得阳性病毒的鉴定条带大小如表2所示。

表1.PCR引物序列

表2.PCR结果条带大小

引物对	鉴定的病毒	条带大小(bp)
P1/P2	VSC20	622
P15/P11	DDvv-mIL21	1893
P15/zP1	DDvv-hIL21	1792

PCR结果显示，IL-21基因序列整合到病毒TK区，即病毒重组成功(图4A-B)；ELISA结果显示含有IL21的重组病毒上清(图中示为“DDvv-mIL-21”)中有IL-21蛋白的表达，其余细胞(图中示为“NC”)、转染质粒(pCB-mIL21)及VSC20对照未见IL-21的表达(图4C)。

(3)重组溶瘤痘病毒的筛选

1)使用60mm培养皿培养CV1细胞，达到80％满时加入1ml病毒稀释液，含150μl P0代病毒，感染2小时后，加3ml含1×gpt筛选药物进行筛选，观察细胞病变，收集病毒标注P1病毒。使用病毒基因组抽提试剂盒抽提病毒基因进行PCR验证。

2)重复2次步骤1)获得P3病毒，使用PCR法进行验证。

3)采用10cm培养皿培养CV1细胞待其密度达到80％，弃培养基，加入3ml梯度稀释的P3病毒感染2小时，去除培养液，加入8ml含有0.8×gpt筛选药物的1％(w/v)琼脂糖凝胶(V _{5％的琼脂糖凝胶}∶V _1×gpt工作 _液＝1∶4)，37℃培养48小时，挑取单个空斑至300μl的无菌PBS中，反复冻融三次释放病毒，每个空斑分别取150μl的病毒液在24孔板中采用CV1细胞进行小扩，约48小时待病毒完全病变后，收集病毒，吸取200μl病毒液抽提基因组，使用PCR法验证，其余病毒液标记为P4，保存于-80℃。

4)重复2-3次步骤3)，PCR法确认重组病毒中不含骨架病毒VSC20，同时使用ELISA和Western-blot方法(一抗：兔抗鼠IL21，PEpro Tech.INC.，#500-P278；兔抗IL21抗体，abcam，ab5978；二抗：Goat anti-Rb，Abcam，ab97051)确认IL21蛋白的表达。

结果显示：从上述4)步骤获得的病毒经PCR法鉴定显示P1/P2的PCR结果无条带，表明重组病毒为携带外源目的基因IL-21的纯种病毒，不含其骨架背景病毒VSC20(图5A-D)。Western blot结果同样显示DDvv-IL21病毒可有效表达IL-21蛋白，且大小正确(图5E、G)。ELISA结果显示重组病毒DDvv-IL21在细胞培养上清及细胞裂解(图中示为“细胞”)中均可检测到IL-21蛋白，也进一步体现了IL-21蛋白为外泌型蛋白的特性(图5F、H)。

制备例2：溶瘤痘病毒的生产和纯化

(1)生产和纯化

1)分别对DDvv-mIL21的P5-1样本和DDvv-hIL21的P4-3样本进行大量扩增，使用50个150mm培养皿，当Hu-143B细胞长至80％左右时，每个培养皿加50μL小扩后的病毒约2×10 ⁴PFU感染细胞，37℃、5％CO ₂培养。约2～3天后，显微镜下观察细胞变圆呈串珠状，部分细胞脱离培养皿，使用细胞刮刀收集培养液/细胞，保存于-80℃冰箱。

2)使用液氮、高压灭菌水将所收集的病毒液反复冻融三次，2000rpm离心3分钟，收集上清。

3)将收集的上清在12,000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀物用5mL PBS悬浮，12,000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀物用4mL 30％(w/v)蔗糖重悬。

4)蔗糖梯度的制备：在超速离心管中从下至上依次加入60％(w/v)、50％(w/v)、40％(w/v)的蔗糖溶液各2mL，最上层加30％(w/v)蔗糖重悬的病毒液4mL。

5)铺好蔗糖梯度后，39,000g超速离心20分钟后，肉眼可看到病毒呈乳白色条带，分布在50％(w/v)蔗糖层，使用1mL剪平/大口的枪头吸取病毒条带，置于新的离心管中(记录吸取病毒条带的体积为V1)。

6)使用2倍V1体积的STE缓冲液清洗病毒去除残余的蔗糖，离心35,000×g、1小时，弃上清，保留沉淀。

7)用V1体积的STE重悬沉淀，离心35,000×g，30分钟，保留沉淀，重复此操作2次，随后用PBS洗3次。

8)最后用预冷的PBS重悬沉淀，混匀后分装在无菌的EP管中，储存于-80℃，预留1管放置4℃进行病毒滴度检测。

(2)病毒滴度检测

1)使用2个6-well培养皿，每孔接种约4×10 ⁵HuTK-143B细胞，在37℃、5％CO ₂培养箱过夜，使其次日细胞量接近80％-90％。

2)将待测病毒液200μl用无血清DMEM 1800μl作10倍梯度稀释，使其稀释度在10 ^-4-10 ^-8范围。

3)吸去6孔板内细胞培养液，加入0.5ml稀释的病毒液，标注各孔稀释度，同时设立两个空白对照孔，置37℃感染2小时，期间每20分钟摇动6孔板一次，以保证孔内均匀湿润和避免局部干燥。

4)每孔加2ml含5％FBS的DMEM，37℃培养48小时。

5)吸去培养液，每孔加0.5ml含0.1％结晶紫染色液，室温染色10分钟，吸去染色液，PBS清洗3次，倒扣自然风干，拍照。

6)计数各孔内的病毒噬斑数，病毒滴度＝平均病毒噬斑数/(病毒稀释度×加入的病毒体积)。

举例：假如在10 ^-5稀释度孔内有30个病毒噬斑，病毒滴度为30/(10 ^-5×0.5)＝6×10 ⁶pfu/ml。

放大/纯化后各个批号的DDvv-mIL21病毒和DDvv-hIL21病毒的滴度在2×10 ⁸～4×10 ⁸PFU/ml。

实施例1：携带鼠IL-21片段的DDvv-mIL21痘病毒对不同鼠肿瘤细胞的杀伤作用

在96孔板铺鼠肿瘤细胞，包括B16细胞(小鼠黑色素瘤细胞)、 GL261细胞(小鼠脑胶质瘤细胞)、LLC细胞(小鼠Lewis肺癌细胞)、CT-26细胞(小鼠结肠癌细胞)、4T-1细胞(小鼠乳腺癌细胞)，每孔5000个细胞，培养过夜使其贴壁后使用1MOI的通过上述方法制备的DDvv-mIL21病毒感染细胞，分别于24小时、48小时和60小时后(针对LLC细胞、GL261细胞的试验)，或者24小时、48小时和72小时后(针对B16细胞、CT-26细胞、4T-1细胞的试验)，使用MTT法检测肿瘤细胞凋亡情况(n＝3，2-3次重复实验)。本试验的对照组为：阴性对照组(无病毒感染)、重组鼠源IL-21蛋白(rmIL-21，购自R&D Systems)及阳性对照组(1μtM紫杉醇(Paclitaxel)，购自北京双鹭药业)，每个处理组及对照组均设置3个复孔，细胞杀伤率为实验组与阴性对照组百分比值。结果显示DDvv-mIL21病毒对各肿瘤细胞在60小时或72小时后均达到超过60％的杀伤率，其中，DDvv-mIL21病毒对CT-26和4T1细胞在感染24小时后就达到70％的杀伤率(参见图6)。

实施例2：携带鼠IL-21片段的DDvv-mIL21痘病毒对不同鼠肿瘤细胞杀伤的IC ₅₀

B16细胞、CT26细胞、4T1细胞、LLC细胞、GL261细胞铺于96孔板，每孔5000个细胞，使用0.002MOI、0.02MOI、0.2MOI、1MOI、2MOI的通过上述方法制备的DDvv-mIL21病毒感染细胞72小时后使用MTT试剂检测细胞杀伤，并计算DDvv-mIL21重组痘病毒对不同肿瘤细胞杀伤的半数致死量(IC ₅₀值)(n＝3，1次实验)。结果显示，重组痘病毒对B16细胞、CT26细胞、4T1细胞、LLC细胞、GL261细胞杀伤的IC ₅₀分别为0.232MOI、0.216MOI、0.07MOI、0.304MOI、0.227MOI(参见图7)。由此可见，本发明的重组痘病毒DDvv-mIL21对不同肿瘤细胞的IC ₅₀值均较低(小于或约等于0.3MOI)，具有较好的成药前景。

实施例3：携带人IL-21片段的DDvv-hIL21痘病毒对不同人肿瘤细胞的杀伤作用

A549(人非小细胞肺癌细胞)、SKOV3(人卵巢腺癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、U251(人神经胶质细胞瘤细胞)铺于96孔板，每孔5000个细胞，培养过夜使其贴壁后使用1MOI的通过上述方法制备的DDvv-hIL21病毒感染细胞，分别于24小时、48小时和72小时后，使用MTT法检测肿瘤细胞凋亡情况(n＝3，3次重复实验)。本试验的对照组为：阴性对照组(无病毒感染)、重组人源IL-21蛋白(rhIL-21，购自R&D Systems)及阳性对照组(1μtM紫杉醇)，每个处理组及对照组均设置3个复孔，细胞杀伤率为实验组与阴性对照组百分比值。结果显示重组病毒对Hela、A549、SKVO3、U251细胞杀伤作用呈时间依赖性，随时间而加强(参见图8)。此外，结果还显示DDvv-hIL21病毒对各肿瘤细胞在48小时后均达到超过60％的杀伤率，在72小时后均达到超过70％的杀伤率。

实施例4：携带人IL-21片段的DDvv-hIL21痘病毒对不同人肿瘤细胞杀伤的IC ₅₀

A549、HepG2(人肝癌细胞)、Hela、HT29(人结直肠癌细胞)、SKOV3(人卵巢腺癌细胞)、PANC1(人胰腺癌细胞)、SKHEP-1(人肝癌细胞)、FaDu(人咽鳞癌细胞)铺于96孔板，每孔5000个细胞，以3倍稀释MOI梯度的通过上述方法制备的DDvv-hIL21病毒感染细胞，使DDvv-hIL21病毒的MOI浓度分别为：0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10，感染48小时后使用MTT试剂检测细胞杀伤，并计算病毒对不同肿瘤细胞杀伤的IC ₅₀值(n＝3，1次实验)，本研究每个处理组及对照组均设置3个复孔。结果显示，重组痘病毒对各株肿瘤细胞杀伤的IC ₅₀在0.05-0.4MOI之间，均较低(参见图9)。由此可见，本发明的重组痘病毒DDvv-hIL21具有较好的成药前景。

实施例5：携带鼠IL-21片段的DDvv-mIL21痘病毒对B16肿瘤小鼠的抑瘤作用

构建免疫健全荷瘤小鼠：使用对数生长期B16细胞，每只小鼠给予20万个细胞接种于C57BL/6小鼠(北京维通力华实验动物中心) 后腿背部皮下，观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积在100-200mm ³左右开始给药，以瘤内给药方式分别给予100μl PBS内包含5×10 ⁶pfu(低剂量(low dose))、1×10 ⁷pfu(高剂量(high dose))的通过上述方法制备的DDvv-mIL21及PBS，每组3只小鼠，每3天测定1次瘤体大小及体重。结果显示重组病毒DDvv-mIL21能够有效的抑制肿瘤的生长，并且呈剂量依赖性(图10A)。截至给药后第9天，各给药组T/C(抑瘤有效率，即给药组肿瘤大小与对照组肿瘤大小的百分比率，该值＜40％时表示药物有效)都小于40％(图10B)。第12天处死小鼠，取出肿瘤检测瘤重，也显示出相似的结果(图10C)。

实施例6：携带鼠IL-21片段的DDvv-mIL21痘病毒对B16肿瘤小鼠的抗肿瘤免疫激活作用

使用对数生长期B16细胞，每只小鼠给予20万个细胞接种于C57/B16小鼠后腿背部皮下，观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积在100-200mm ³左右开始给药，以瘤内给药方式分别给予100μl PBS内包含5×10 ⁶pfu(低剂量(low dose))、1×10 ⁷pfu(高剂量(high dose))的通过上述方法制备的DDvv-mIL21及PBS，每组3只小鼠，2周后处死小鼠收取脾脏、肿瘤组织，提取脾脏PBMC和肿瘤组织内肿瘤细胞，采用流式细胞术检测CD8 ⁺T细胞(CD3 ⁺CD8 ⁺)(抗体：抗鼠CD3、抗鼠CD8a，eBioscience)和CD4 ⁺T细胞(CD3 ⁺CD4 ⁺)(抗体：抗鼠CD4，eBioscience)。结果显示给重组病毒DDvv-mIL21的小鼠脾脏PBMC内的CD8 ⁺T细胞和CD4 ⁺T细胞比例相对于PBS组有显著增加(图11A-B)；同时肿瘤组织内免疫细胞侵润分析发现给予DDvv-mIL2高剂量组的CD8 ⁺T细胞和CD4 ⁺T细胞(TIL)比例相对于PBS组增加(图11C-D)。

实施例7：携带鼠IL-21片段的DDvv-mIL21痘病毒对LLC肿瘤小鼠的抑瘤作用

使用对数生长期LLC细胞，每只小鼠给予100万个细胞接种于C57BL/6小鼠后腿背部皮下，观察肿瘤生长情况，当肿瘤体积在 100-200mm ³左右开始给药，以瘤内给药方式分别给予100μl PBS内包含1×10 ⁶pfu(低剂量(low dose))、1×10 ⁷pfu(高剂量(high dose))的通过上述方法制备的DDvv-mIL21和100μtlPBS作为对照组，每组5只小鼠，每3天测定1次瘤体大小及体重。结果显示重组病毒DDvv-mIL21能够有效地抑制LLC肿瘤的生长，并且呈剂量依赖性(图12A)，给药后第9天，高剂量给药组T/C小于40％(图12B)。

实施例8：携带人IL-21片段的DDvv-hIL21痘病毒和NK细胞联合对人肿瘤细胞SK-HEP-1的杀伤作用

取SK-HEP-1细胞种入24孔培养板，铺满30％，在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO ₂下孵育24小时，在DMEM无血清环境下加入MOI＝0.15的通过上述方法制备的DDvv-hIL21病毒，感染6小时，换液为MEM+10％FBS，在37℃、5％CO ₂下培养24小时。之后换新鲜MEM+10％FBS，加入NK细胞(效靶比NK∶SK-HEP-1＝5∶1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活SK-HEP-1细胞进行台盼蓝染色计数，该实验组为DDvv-hIL21+NK组。实验中另外保留一组SK-HEP-1细胞，不加病毒，不加NK，作为空白(Blank)组；一组在相应时间点加DDvv-hIL21病毒，但不加NK，作为DDvv-hIL21病毒组；一组在相应时间点加NK，但不加DDvv-hIL21病毒，作为NK组；一组在相应时间点加NK，并同时加入终浓度为50ng/ml的人IL21重组蛋白，但不加DDvv-hIL21病毒，作为NK+IL21组；一组不加病毒，不加NK，但在相应的时间加入终浓度为50ng/ml的人IL21重组蛋白作为空白+IL21组。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。

结果如图13所示(其中横坐标为不同组别，纵坐标为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用DDvv-hIL21病毒和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对SK-HEP-1杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约87％。而本实验中单用DDvv-hIL21病毒的抑制率为约47％，单用NK细胞的抑制率为约11％，NK+IL21组的抑制率为约22％，空白+IL21组的抑制率为约1％。而空白组抑制率约为0(未示出在图13中)。

结果显示联合使用DDvv-hIL21病毒和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对SK-HEP-1细胞杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约87％。

实施例9：携带鼠IL-21片段的DDvv-mIL21痘病毒对药物诱导免疫低下B16荷瘤小鼠的抑瘤作用

构建药物诱导免疫低下荷瘤小鼠：使用对数生长期B16细胞，每只小鼠使用20万个细胞接种于C57BL/6小鼠后腿背部皮下，观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积在80-150mm ³左右开始每天腹腔注射30mg/kg环孢素直到实验结束，第二天(即接种后第10天)以瘤内给药方式分别给予100μl PBS内包含1×10 ⁵pfu(低剂量(low dose))、1×10 ⁶pfu(中剂量(middle dose))、1×10 ⁷pfu(高剂量(high dose))的通过上述方法制备的DDvv-mIL21及100μl PBS，每组5只小鼠，每3天测定1次瘤体大小及体重。结果显示重组病毒DDvv-mIL21能够有效的抑制肿瘤的生长，并且呈剂量依耐性(图14A)。截至给药后第9天(即接种后第19天)，中、高剂量组T/C(有效抑瘤率，即给药组肿瘤大小与对照组肿瘤大小的百分比，该值低于40％时表示药物有效)都小于40％(图14B)。

实施例10：携带鼠IL-21片段的DDvv-mIL21痘病毒与对照痘病毒对药物诱导免疫低下B16荷瘤小鼠的抑瘤作用的比较

使用对数生长期B16细胞，每只小鼠使用20万个细胞接种于C57BL/6小鼠后腿背部皮下，观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积在80-150mm ³左右开始每天腹腔注射30mg/kg环孢素直到实验结束，第二天以瘤内给药方式分别给予100μl PBS内包含1×10 ⁶pfu的通过上述方法制备的DDvv-mIL21、1×10 ⁶pfu的DDvv-RFP和100μl PBS，每组3只小鼠，每3天测定1次瘤体大小及体重。结果显示与DDvv-RFP相比，DDvv-mIL21可有效抑制肿瘤的生长(图15A)，给药后第6天开始，DDvv-mIL21组T/C都小于40％(图15B)。实验结束后处死小鼠收取肿瘤组织称重，DDvv-mIL21组肿瘤重量明显降低(图15C)。同时采用流式细胞仪检测肿瘤组织内TIL的含量(包括CD8 ⁺T细胞(CD3 ⁺CD8 ⁺)(抗体：抗鼠CD3、抗鼠CD8a，eBioscience)和CD4 ⁺T细胞(CD3 ⁺CD4 ⁺)(抗体：抗鼠CD3、抗鼠CD4，eBioscience))及NK细胞(CD3 ^-NK1.1 ⁺)(抗体：抗鼠NK1.1，eBioscience)的含量，结果显示给予DDvv-RFP和DDvv-mIL21可明显提高肿瘤组织内TIL含量，与DDvv-RFP组比较，DDvv-mIL21组可见肿瘤TIL内CD4 ⁺T细胞显著增高(图16A-C)。

实施例11：携带人IL-21的DDvv-hIL21痘病毒联合人NK细胞与对照痘病毒联合人NK细胞对HCT116荷瘤的重度免疫缺陷型小鼠的抑瘤作用比较

使用重度免疫缺陷型NCG小鼠(得自浙江省动物中心)，在小鼠后腿背部皮下接种500万个HCT116细胞，观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积在80-150mm ³左右开始(约接种后第7天)以瘤内给药方式分别给予100μl PBS内包含5×10 ⁶pfu的DDvv-hIL21病毒、5×10 ⁶pfu的对照痘病毒DDvv-RFP和PBS，每组5只小鼠。次日开始尾静脉给予5×10 ⁷NK细胞/天，连续给予3天，停止3天，以此为一个周期，共给予3个周期的NK细胞。在开始给予病毒起每2-5天测定1次瘤体大小及体重。结果显示溶瘤痘病毒DDvv-RFP和DDvv-hIL21都能够有效的抑制肿瘤的生长，DDvv-hIL21呈现出比DDvv-RFP更好的抑瘤作用(图17A)，给药后第12天开始，DDvv-RFP和DDvv-hIL21组T/C都小于40％(图17B)。实验结束后处死小鼠收取肿瘤组织，采用定量PCR法检测肿瘤组织内痘病毒A46R基因的表达水平(目标基因的引物序列为：5’-CAGGGAAACGGATGTATA-3’(SEQ ID NO.8)和5’-TGTGTTACAGAATCATATAAGG-3’(SEQ ID NO.9))、IL-21基因表达水平(目标基因的引物序列为：5’-CCAACTAAAGTCAGCAAATACAGG-3’(SEQ ID NO.10)和5’-CTTTCTAGGAATTCTTTGGGTGG-3’(SEQ ID NO.11))、NK 细胞NKG2D基因的表达水平(目标基因的引物序列为：5’-GGCTTTTATCCACAAGAATCAAGATC-3’(SEQ ID NO.12)和5’-GTGCACGTCTACCGCAGAGA-3’(SEQ ID NO.13))、IFN-γ基因表达水平(目标基因的引物序列为：5’-AGTGTGGAGACCATCAAGGAAG-3’(SEQ ID NO.14)和5’-GTATTGCTTTGCGTTGGACAT-3’(SEQ ID NO.15))，以看家基因(House Keeping Gene)GAPDH为内参(目标基因的引物序列为：5’-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’(SEQ ID NO.16)和5’-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3’(SEQ ID NO.17))，靶点基因的表达量为pg/μg GAPDH。结果显示DDvv-hIL21溶瘤病毒在肿瘤内的复制与对照痘病毒DDvv-RFP无显著区别(图18A)，同时IL21的表达进一步验证了，DDvv-hIL21溶瘤病毒在肿瘤组织中的存在(图18B)。与给予DDvv-RFP病毒的对照组比较，发现给予DDvv-hIL21溶瘤病毒组的肿瘤内NK含量明显增高(图18C)，同时伴有免疫因子INF-γ的表达增高(图18D)。

实施例12：静脉给予的DDvv-mIL21痘病毒在B16肿瘤小鼠中的分布

使用对数生长期B16细胞，每只小鼠使用20万个细胞接种于C57/B16雌小鼠后腿背部皮下，观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积在100-200mm ³左右开始给药，以静脉给药方式给予100μl PBS内包含5×10 ⁹pfu的通过上述方法制备的DDvv-mIL21溶瘤病毒，共4只小鼠，1周后处死小鼠收取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、脑、卵巢、肿瘤组织，使用PCR法检测痘病毒在各脏器的分布，具体而言将各组织器官内痘病毒A46R基因的表达量分别与肾脏器官内痘病毒A46R基因的表达量进行比较(目标基因的引物序列为：5’-CAGGGAAACGGATGTATA-3’(SEQ ID NO.8)和5’-TGTGTTACAGAATCATATAAGG-3’(SEQ ID NO.9))，结果显示给予的DDvv-mIL21溶瘤病毒主要分布在肿瘤组织内，其中有一只小鼠的卵巢组织也可检测到病毒，其他脏器都未检测到DDvv-mIL21 溶瘤病毒(图19)。

实施例13：携带人IL-21的DDvv-hIL21痘病毒和NK细胞联合对人肿瘤细胞HepG2的杀伤作用

取HepG2细胞种入24孔培养板，铺满30％，在DMEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO ₂下孵育24小时，在DMEM无血清环境下加入MOI＝0.027的通过上述方法制备的DDvv-hIL21病毒，感染6小时，之后换液为DMEM+10％FBS，在37℃、5％CO ₂下继续孵育18小时。之后换新鲜DMEM+10％FBS，加入NK细胞(效靶比NK∶HepG2＝3∶1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HepG2细胞进行台盼蓝染色计数，该实验组为DDvv-hIL21+NK组。实验中另外保留一组HepG2细胞，不加病毒，不加NK，作为空白(Blank，简称BK)组；一组在相应时间点加DDvv-hIL21病毒，但不加NK，作为DDvv-hIL21病毒组；一组在相应时间点加NK，但不加DDvv-hIL21病毒，作为NK组；一组在相应时间点加NK，并同时加入终浓度为50ng/ml的人IL21重组蛋白，但不加DDvv-hIL21病毒，作为NK+IL21组；一组不加病毒，不加NK，但在与上述NK加入时间点相应的时间加入终浓度为50ng/ml的人IL21重组蛋白作为空白+IL21组；对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。

结果如图20所示(其中横坐标为不同组别，纵坐标为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用DDvv-hIL21病毒和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对HepG2杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约71％。而本实验中单用DDvv-hIL21病毒的抑制率为约34％，单用NK细胞的抑制率为约14％，二者的叠加值在图中用虚线示出。此外，NK+IL21组的抑制率为约25％，空白+IL21组的抑制率为约2％。而空白组抑制率约为0(未示出在图20中)。

结果显示联合使用DDvv-hIL21病毒和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对HepG2细胞杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约71％。

实施例14：携带人IL-21片段的DDVV-hIL21痘病毒联合人NK细胞与对照痘病毒联合人NK细胞对人肿瘤细胞HCT116的杀伤作用比较

由试验确定，DDVV-RFP对HCT116细胞的杀伤剂量适宜为约MOI＝0.7；NK细胞对HCT116细胞的杀伤剂量适宜为效靶比NK∶HCT116为约5∶1。

取HCT116细胞种入24孔培养板，铺满30％，在McCoy′s 5A+10％FBS环境中，在37℃、5％CO ₂下孵育24小时，在McCoy′s 5A的无血清环境下加入MOI＝0.7的通过上述方法制备的DDVV-hIL21或DDVV-RFP，感染6小时，之后在McCoy′s 5A+10％FBS环境中，在37℃、5％CO ₂下继续孵育18小时。随后(未换液)加入NK细胞(效靶比NK∶HCT116＝5∶1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活HCT116细胞进行台盼蓝染色计数。该实验组分别为DDVV-RFP+NK组和DDVV-hIL21+NK组。实验中保留一组HCT116细胞，不加病毒，不加NK，作为空白组；一组不加病毒，不加NK，但在与上述NK加入时间点相应的时间加入终浓度为50ng/ml的人IL21重组蛋白作为空白+IL21组。一组在相应时间点只加DDVV-RFP，但不加NK，作为DDVV-RFP组；一组在相应时间点只加DDVV-hIL21，但不加NK，作为DDVV-hIL21组；一组在相应时间点加NK，但不加病毒，作为NK组；一组在相应时间点加NK，并同时加入终浓度为50ng/ml的人IL21重组蛋白，但不加病毒作为NK+IL21组。一组在相应时间点分别加DDVV-RFP、NK，并在加NK的同时加入终浓度为50ng/ml的人IL21重组蛋白，作为DDVV-RFP+NK+IL21组；对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。

如图21A所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用DDvv-hIL21病毒和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对HCT116细胞的杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约86％。而本实验中单用DDvv-hIL21病毒的抑制率为约43％，单用NK细胞的抑制率为约10％，二者的叠加值在图中用虚线示出。而空白组抑制率约为0(未示出在图21A或B中)。

此外，如图21B所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用DDVV-hIL21与NK细胞对HCT116细胞的杀伤效果(抑制率为约86％)显著高于同样剂量的DDVV-RFP和NK细胞联用的杀伤效果(抑制率为约67％)，也显著高于同样剂量的DDVV-RFP和NK细胞以及人IL21重组蛋白联用的杀伤效果(抑制率为约64％)。而单用DDVV-RFP的抑制率为约37％，空白+IL21组的抑制率为未测出，NK+IL21组的抑制率为约12％，其它组数据同上。

上述结果表明由于DDVV-hIL21在HCT116细胞中选择性复制从而杀伤HCT116细胞的同时表达外源IL-21，而表达的外源IL-21能够提升NK细胞的杀伤力从而进一步增强了NK细胞的HCT116细胞杀伤作用，使得DDVV-hIL21与NK细胞的联用对HCT116细胞的杀伤效果产生了令人惊奇的效果。

实施例15：携带人IL-21片段的DDVV-hIL21痘病毒联合人NK细胞与对照痘病毒联合人NK细胞对人肿瘤细胞FaDu的杀伤作用比较

取FaDu细胞种入24孔培养板，铺满30％，在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO ₂下孵育24小时，在MEM的无血清环境下加入MOI＝0.2的通过上述方法制备的DDVV-hIL21或DDVV-RFP，感染6小时，之后在MEM+10％FBS环境中，在37℃、5％CO ₂下继续孵育18小时。随后(未换液)加入NK细胞(效靶比NK∶FaDu＝5∶1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活FaDu细胞进行台盼蓝染色计数。该实验组分别为DDVV-RFP+NK组和DDVV-hIL21+NK组。实验中保留一组FaDu细胞，不加病毒，不加NK，作为空白组；一组不加病毒，不加NK，但在与上述NK加入时间点相应的时间加入终浓度为50ng/ml的人IL21重组蛋白作为空白+IL21组。一组在相应时间点只加DDVV-RFP，但不加NK，作为 DDVV-RFP组；一组在相应时间点只加DDVV-hIL21，但不加NK，作为DDVV-hIL21组；一组在相应时间点加NK，但不加病毒，作为NK组；一组在相应时间点加NK，并同时加入终浓度为50ng/ml的人IL21重组蛋白，但不加病毒，作为NK+IL21组；一组在相应时间点加DDVV-RFP，加NK的同时加入终浓度为50ng/ml的人IL21重组蛋白，作为DDVV-RFP+NK+IL21组；对照组均在相应时间做相应换液操作。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。

如图22A所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用DDvv-hIL21病毒和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对FaDu细胞的杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约73％。而本实验中单用DDvv-hIL21病毒的抑制率为约37％，单用NK细胞的抑制率为约13％，二者的叠加值在图中用虚线示出。而空白组抑制率约为0(未示出在图22A或B中)。

此外，如图22B所示(其中X轴为不同组别，Y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用DDVV-hIL21与NK细胞对FaDu细胞的杀伤效果(抑制率为约73％)显著高于同样剂量的DDVV-RFP和NK细胞联用的杀伤效果(抑制率为约66％)，也显著高于同样剂量的DDVV-RFP和NK细胞以及人IL21重组蛋白联用的杀伤效果(抑制率为约65％)。而单用DDVV-RFP的抑制率为约39％，空白+IL21组的抑制率为未测出，NK+IL21组的抑制率为约14％，其它组数据同上。

上述结果表明由于DDVV-hIL21在FaDu细胞中选择性复制从而杀伤FaDu细胞的同时表达外源IL-21，而表达的外源IL-21能够提升NK细胞的杀伤力从而进一步增强了NK细胞的FaDu细胞杀伤作用，使得DDVV-hIL21与NK细胞的联用对FaDu细胞的杀伤效果产生了令人惊奇的效果。

Claims

一种治疗剂，包含：

(a)第一药物组合物，其中该第一药物组合物包含位于第一可药用载体中的重组溶瘤痘病毒；和

(b)第二药物组合物，其中该第二药物组合物包含位于第二可药用载体中的NK细胞；

其中所述重组溶瘤痘病毒是TK基因和VGF基因功能缺陷型的，并且该重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源IL-21基因，并且该IL-21基因能够在肿瘤细胞中表达。
根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述TK基因通过插入外源核苷酸序列而使该TK基因功能缺陷。
根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述外源IL-21基因插入在所述TK基因中，从而使该TK基因功能缺陷。
根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述VGF基因通过基因敲除或插入外源核苷酸序列而使该VGF基因功能缺陷。
根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述重组溶瘤痘病毒是惠氏株或WR株。
根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述重组溶瘤痘病毒的基因组中还整合有外源筛选基因，所述外源筛选基因包括gpt基因和/或LacZ基因，但不包括荧光蛋白基因。
根据权利要求1或5所述的治疗剂，其中所述外源IL-21基因来自于小鼠或人。
根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述第一药物组合物的活性成分为所述重组溶瘤痘病毒，并且所述第二药物组合物的活性成分为所述NK细胞。
根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述第一药物组合物和所述第二药物组合物各自独立地存在于所述治疗剂中而互不混合。
根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述第一药物组合物包含1×10 ⁵-5×10 ⁹pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒，并且所述第二药物组合物包含1×10 ⁷-1×10 ¹⁰个细胞/天剂量的所述NK细胞。
根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述重组溶瘤痘病毒配制成通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞配制成通过静脉给药。
根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述治疗剂由所述第一药物组合物和所述第二药物组合物组成。
根据权利要求1-13中任一项所述的治疗剂在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。
根据权利要求14所述的应用，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌。
一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括：装有重组溶瘤痘病毒的第一容器和装有NK细胞的第二容器，其中所述第一容器和所述第二容器是独立的；以及载明给药时机和给药方式的说明书；其中所述重组溶瘤痘病毒是TK基因和VGF基因功能缺陷型的，并且该重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源IL-21基因，并且该IL-21基因能够在肿瘤细胞中表达。
根据权利要求16所述的药盒，其中所述第一独立容器包含1×10 ⁵至5×10 ⁹pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒，并且所述第二独立容器包含1×10 ⁷至1×10 ¹⁰个细胞/天剂量的所述NK细胞。
根据权利要求16所述的药盒，其中所述TK基因通过插入外源核苷酸序列而使该TK基因功能缺陷。
根据权利要求16所述的药盒，其中所述外源IL-21基因插入在所述TK基因中，从而使该TK基因功能缺陷。
根据权利要求16所述的药盒，其中所述VGF基因通过基因敲除或插入外源核苷酸序列而使该VGF基因功能缺陷。
根据权利要求16所述的药盒，其中所述重组溶瘤痘病毒是惠氏株或WR株。
根据权利要求16所述的药盒，其中所述重组溶瘤痘病毒的基因组中还整合有外源筛选基因，所述外源筛选基因包括gpt基因和/或LacZ基因，但不包括荧光蛋白基因。
根据权利要求16或21所述的药盒，其中所述外源IL-21基因来自于小鼠或人。
根据权利要求16所述的药盒，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
根据权利要求16所述的药盒，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌。
根据权利要求16所述的药盒，其中所述重组溶瘤痘病毒配制成通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞配制成通过静脉给药。
一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括以下依次进行的步骤：

1)对肿瘤和/或癌症患者施用重组溶瘤痘病毒；

2)在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用NK细胞；

其中所述重组溶瘤痘病毒是TK基因和VGF基因功能缺陷型的，并且该重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源IL-21基因，并且该IL-21基因能够在肿瘤细胞中表达。
根据权利要求27所述的方法，其中所述TK基因通过插入外源核苷酸序列而使该TK基因功能缺陷。
根据权利要求27所述的方法，其中所述外源IL-21基因插入在所述TK基因中，从而使该TK基因功能缺陷。
根据权利要求27所述的方法，其中所述VGF基因通过基因敲除或插入外源核苷酸序列而使该VGF基因功能缺陷。
根据权利要求27所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒是惠氏株或WR株。
根据权利要求27所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒的基因组中还整合有外源筛选基因，所述外源筛选基因包括gpt基因和/或LacZ基因，但不包括荧光蛋白基因。
根据权利要求27或31所述的方法，其中所述外源IL-21基因来自于小鼠或人。
根据权利要求27所述的方法，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。
根据权利要求27所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌。
根据权利要求27所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为为1×10 ⁵-5×10 ⁹pfu/天，每天1次，连续施用1-6天；并且所述NK细胞的施用剂量为1×10 ⁷至1×10 ¹⁰个细胞/天剂量，每天1次，连续施用1-6天。
根据权利要求27所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为为1×10 ⁵-5×10 ⁹pfu/天，每2天1次，连续施用2-6天。
根据权利要求27所述的方法，其中所述NK细胞的施用剂量为1×10 ⁷至1×10 ¹⁰个细胞/天剂量，每2天1次，连续施用2-6天。
根据权利要求27所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞通过静脉给药。