CN114072416A - 使用正痘病毒主要组织相容性复合物（mhc）i类样蛋白（omcp）和肿瘤特异性结合伴侣的双特异性融合蛋白 - Google Patents

Abstract

提供了用于活化NK细胞和治疗肿瘤的治疗性多肽、其组合物及其使用方法。该治疗性多肽可包括用于结合NKG2D的第一结构域和用于结合肿瘤靶标的第二结构域。

Description

使用正痘病毒主要组织相容性复合物(MHC)I类样蛋白(OMCP) 和肿瘤特异性结合伴侣的双特异性融合蛋白

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年2月18日提交的申请号为62/807,190的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，其通过引用全部内容并入本文。创建于2020年2月17日的所述ASCII副本被命名为P23518WO00_SL.txt，其大小为94,136字节。

援引并入

WO2016/100375和WO2017/136818通过引用整体并入本文。此外，本文中引用的所有出版物均通过引用全部内容并入本文。

背景技术

双特异性淋巴细胞接合剂通过同时接合细胞毒性淋巴细胞和肿瘤细胞来起作用。这会产生一个人工免疫突触并提高免疫参与和癌细胞破坏的效率。这些双特异性蛋白中的配体来源于以形成连续治疗性蛋白的方式一起表达的工程化靶向抗体。这些治疗性蛋白在癌症治疗中可能是有效的。

目前开发中的双特异性疗法通过CD3参与发挥作用，CD3是T细胞受体复合物的一部分。CD3在细胞毒性CD8⁺T细胞和辅助CD4⁺T细胞上表达。广泛的CD3参与可能会导致远离肿瘤部位的非特异性T细胞活化，从而导致毒性，包括“细胞因子风暴”。最近，一些团体开始通过NKp46或CD16受体靶向NK细胞。

然而，NKG2D表达是独一无二的，因为它在人CD8⁺T细胞和NK细胞上组成型表达。因此，NKG2D靶向将使先天性和适应性细胞毒性淋巴细胞(CD8⁺T细胞和NK细胞)能够参与，从而产生更强大的抗肿瘤活性。

发明内容

本公开涉及一类新型双特异性(或多特异性)治疗性蛋白，其一侧通过NKG2D受体的配体而另一侧通过针对肿瘤特异性靶标的结合伴侣来靶向NK和CD8⁺T细胞。NKG2D受体可以通过任何特异性配体结合，例如单克隆或多克隆抗体、正痘病毒主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility complex，MHC)I类样蛋白(Orthopoxvirus MajorHistocompatibility complex class I-like protein，OMCP)配体或天然NKG2D配体。肿瘤靶标可以选自在癌细胞中特异性表达或与正常组织相比在癌细胞中表达增加的任何细胞表面靶标。

在一些实施方式中，提供一种多肽，该多肽包括第一结构域和第二结构域，其中第一结构域包含与SEQ ID NO:1、2或3具有至少80％同源性的第一氨基酸序列并且能够以约0.01nM至约1000nM的结合亲和力与人NKG2D结合，其中第二结构域包含能够与肿瘤细胞上的肽结合的第二氨基酸序列，其中该肽对肿瘤细胞具有特异性或在肿瘤细胞上相比于与该肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

在一些实施方式中，本公开的多肽可包括第一结构域和第二结构域，其中第一结构域包含与SEQ ID NO:1的第48位至第67位和第110位至第147位氨基酸具有至少80％同源性的第一氨基酸序列，其中第二结构域可包括能够与肿瘤细胞上的肽结合的第二氨基酸序列，其中该肽对肿瘤细胞具有特异性或在肿瘤细胞上相比于与该肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

在一些实施方式中，本公开的多肽可包括第一结构域和第二结构域，其中第一结构域包含与SEQ ID NO:2的第49位至第68位和第111位至第148位氨基酸具有至少80％同源性的第一氨基酸序列，其中第二结构域可包括能够与肿瘤细胞上的肽结合的第二氨基酸序列，其中该肽对肿瘤细胞具有特异性或在肿瘤细胞上相比于与该肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

在一些实施方式中，本公开的多肽可包括第一结构域和第二结构域，其中第一结构域包含与SEQ ID NO:3的第48位至第66位和第111位至第148位氨基酸具有至少80％同源性的第一氨基酸序列，其中第二结构域可包括能够与肿瘤细胞上的肽结合的第二氨基酸序列，其中该肽对肿瘤细胞具有特异性或在肿瘤细胞上相比于与该肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

在一些实施方式中，提供了包含本公开的多肽的药物组合物。

在一些实施方式中，提供了一种通过向患者施用包含本公开的多肽的本公开的药物组合物来治疗患者的肿瘤的方法。

附图说明

图1示出了本公开的示例性双特异性多肽，其包括与抗肿瘤靶标连接的OMCP(圆圈)，该抗肿瘤靶标具体是包括针对肿瘤靶标的可变重链和可变轻链的单链可变片段(scFv)；

图2A示出了本公开的示例性三特异性多肽，其包括连接到抗体Fc结构域的、可以与第一肿瘤靶标和第二肿瘤靶标结合的两个单链可变片段(scFv)α-肿瘤靶标1和α-肿瘤靶标2，该抗体Fc结构域还与两个可结合NKG2D的单链可变片段(α-NKG2D)相连；

图2B示出了本公开的示例性三特异性多肽，其包括连接到抗体Fc结构域的、可以与第一肿瘤靶标和第二肿瘤靶标结合的两个单链可变片段(scFv)α-肿瘤靶标1和α-肿瘤靶标2，该抗体Fc结构域还与两个NKG2D配体(“OMCP”)相连；

图2C示出了本公开的示例性三特异性多肽，其包括连接到抗体Fc结构域的、可以与第一肿瘤靶标和第二肿瘤靶标结合的两个单链可变片段(scFv)α-肿瘤靶标1和α-肿瘤靶标2，该抗体Fc结构域还与六个NKG2D配体(“OMCP”)相连；

图3A示出了本公开的示例性四特异性多肽，其包括连接到抗体Fc结构域的、可以与第一肿瘤靶标和第二肿瘤靶标结合的两个单链可变片段(scFv)α-肿瘤靶标1和α-肿瘤靶标2，该抗体Fc结构域还与NKG2D配体(“OMCP”)和可结合CD3e的单链可变片段(“α-CD3e T细胞靶标”)相连；

图3B示出了本公开的示例性四特异性多肽，其包括连接到抗体Fc结构域的、可以与第一肿瘤靶标和第二肿瘤靶标结合的两个单链可变片段(scFv)α-肿瘤靶标1和α-肿瘤靶标2，该抗体Fc结构域也与NKG2D配体(“OMCP”)和可结合FCGH1的单链可变片段(“α-FCGH1NK细胞靶标”)相连；

图4A示出了本公开的示例性双特异性多肽，该双特异性多肽除了针对肿瘤靶标的scFV(α-肿瘤靶标)和NKG2D配体(“OMCP”)之外，还具有细胞因子(38A42K IL2)，其中NKG2D配体和细胞因子之间存在一个接头(左结构)或两个接头(其中一个在细胞因子和scFv之间，一个在细胞因子和NKG2D配体之间)(右结构)；

图4B示出了本公开的示例性多肽，其包括两个连接至抗体Fc结构域的scFv：α-肿瘤靶标1和α-肿瘤靶标2，该抗体Fc结构域还与NKG2D配体(“OMCP”)和细胞因子(38A42KIL2)相连；

图5A示出了本公开的示例性双特异性scFv；

图5B示出了本公开的示例性双特异性scFv；

图5C示出了本公开的示例性双特异性scFv；

图5D示出了本公开的示例性双特异性scFv；

图5E示出了图5A至图5D的示例性双特异性scFv的线性示意图；

图6A示出了本公开的示例性的包括Fc部分的三特异性scFv；

图6B示出了本公开的示例性的包括Fc部分的三特异性scFv；

图6C示出了本公开的示例性的包括Fc部分的三特异性scFv；

图6D示出了本公开的示例性的包括Fc部分的三特异性scFv；

图7A示出了E0与NKG2D结合的等离子体共振测量；

图7B示出了E1与NKG2D结合的等离子体共振测量；

图7C示出了E2与NKG2D结合的等离子体共振测量；

图7D示出了E3与NKG2D结合的等离子体共振测量；

图8A示出了E0与EGFR-Fc结合的等离子体共振测量；

图8B示出了E1与EGFR-Fc结合的等离子体共振测量；

图8C示出了E2与EGFR-Fc结合的等离子体共振测量；

图8D示出了E3与EGFR-Fc结合的等离子体共振测量；

图9示出了实施例2中每次处理的细胞活力随本公开的双特异性多肽的浓度的变化；

图10示出了实施例2中用1×10^-8M双特异性多肽进行每次处理的细胞活力；

图11示出了实施例2中用1×10^-9M双特异性多肽进行每次处理的细胞活力；

图12示出了实施例2的1nM组中阴性对照(没有添加构建体)和处理组的细胞图像；

图13示出了实施例2中用1×10^-10M双特异性多肽进行每次处理的细胞活力；

图14示出了在实施例3中用1×10^-8M双特异性多肽处理的死细胞％；

图15示出了在实施例3中用1×10^-10M双特异性多肽处理的死细胞％；

图16示出了在实施例3中用1×10^-12M双特异性多肽处理的死细胞％；

图17示出了在实施例4中在NK细胞存在下用100pM双特异性多肽处理的死细胞％。对照是带有或不带有NK细胞的肿瘤细胞；

图18示出了在实施例4中在T细胞存在下用100pM双特异性多肽处理的死细胞％。对照是带有或不带有CD8⁺T细胞的肿瘤细胞；

图19A示出了在仅存在PBMC或存在PBMC和肿瘤细胞的情况下，具有或不具有多肽E0、E1、E2和E3以及在不同浓度的E0、E1、E2和E3下的细胞因子产生(IFN-γ)；

图19B示出了在仅存在PBMC或存在PBMC和肿瘤细胞的情况下，具有或不具有多肽E0、E1、E2和E3以及在不同浓度的E0、E1、E2和E3下的细胞因子产生(TNF-α)；

图19C示出了在仅具有PBMC或具有PBMC和肿瘤细胞的情况下，具有或不具有多肽E0、E1、E2和E3以及在不同浓度的E0、E1、E2和E3下的细胞因子产生(IL-6)；

图19D示出了在仅具有PBMC或具有PBMC和肿瘤细胞的情况下，具有或不具有多肽E0、E1、E2和E3以及在不同浓度的E0、E1、E2和E3下的细胞因子产生(IL-17a)。

具体实施方式

本公开提供了一种治疗性融合肽，在一个实施方式中，该治疗性融合肽包含NKG2D配体，该NKG2D配体与肿瘤靶向肽(例如抗肿瘤抗体)在中间具有或不具有连接接头的情况下融合。NKG2D配体可以选自全长OMCP、截短的OMCP、抗NKG2D抗体或如本文更详细公开的MHC I类相关糖蛋白。肿瘤靶向肽是抗体的全长或可变区结构域，该抗体针对具有肿瘤特异性突变或在肿瘤细胞表面比正常组织表达更高的任何蛋白质。在另一个实施方式中，肿瘤靶向蛋白是针对靶标蛋白的天然存在的配体的一种形式。在使用针对靶标的天然配体的实施方式中，可以使配体突变以增加或降低配体对靶标蛋白的亲和力。肿瘤选择性靶标的非限制性实例是ERBB2、CD19、EPCAM、MS4A1、FOLH1、CEACAM5、IL3RA、PMEL、CLEC12A、KDR、EGFR、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、二唾液酸神经节苷脂GD2、CD20、CD123、BCMA、CD38、B7H3/CD276、GPA33、SSTR2、GPC3和CDH3。

应当理解，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”在本文中可以互换使用，是指具有多个序列的单个肽，每个序列产生特定的功能(例如，NKG2D受体配体或肿瘤特异性靶标的结合伴侣)或者可以指结合或以其他方式复合在一起的一种或多种肽(例如异二聚体，其中NKG2D受体配体和肿瘤特异性靶标的结合伴侣位于复合在一起的不同的肽上，例如，其中NKG2D受体配体与第一Fc部分连接以及肿瘤特异性靶标的结合伴侣与第二Fc部分连接，其中第一Fc部分和第二Fc部分复合在一起形成Fc抗体结构域)。

除非内容另有明确规定，否则如本文中所使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代对象。

除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，否则在权利要求和本公开中使用的术语“或”用于表示“和/或”。

当与数值一起使用时，术语“约”的使用旨在包括+/-10％。例如但不限于，如果氨基酸的数量被确定为约200个，这将包括180个至220个(正负10％)。

术语“对象”或“患者”是指待治疗的哺乳动物对象，优选人患者。在一些情况下，发现本发明的方法可用于实验动物、兽医应用和疾病动物模型的开发，包括但不限于包括小鼠、大鼠和仓鼠在内的啮齿动物、以及灵长类动物。

本公开的治疗性融合肽可用作治疗恶性肿瘤和癌症的治疗剂。本公开的实施方式中待治疗的癌症的非限制性实例包括：实体瘤，例如乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胃癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤和肺癌；其还包括血液学癌症，例如，B细胞淋巴瘤、弥漫性大细胞B细胞淋巴瘤、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病和滤泡性淋巴瘤。在本公开的任何实施方式中，肿瘤细胞可以选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、肺癌细胞、淋巴瘤细胞、白血病细胞、结肠癌细胞、肾细胞癌、胰腺癌细胞和肝细胞癌细胞。

双特异性融合蛋白

在一些实施方式中，本公开的多肽可以包括第一结构域和第二结构域，其中第一结构域可以包括能够与人NKG2D结合的第一氨基酸序列，其中第二结构域可以包括能够与肿瘤细胞上的肽结合的第二氨基酸序列，其中该肽对肿瘤细胞具有特异性或在肿瘤细胞上相比于与该肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。例如但不限于，能够与人NKG2D结合的第一氨基酸序列可以是人NKG2D配体或是可以与人NKG2D结合的抗体。再例如但不限于，NKG2D配体可以是可以与人NKG2D结合的OMCP或其变体或衍生物。在一些实施方式中，人NKG2D配体可以约0.01nM至约1000nM的结合亲和力与人NKG2D结合。

在一些实施方式中，本公开的多肽可以包括第一结构域和第二结构域，其中第一结构域可以包括与SEQ ID NO:1-3具有至少80％同源性的第一氨基酸序列并且能够以约0.01nM至约1000nM的结合亲和力与人NKG2D结合，其中第二结构域可以包括能够与肿瘤细胞上的肽结合的第二氨基酸序列，其中该肽对肿瘤细胞具有特异性或在肿瘤细胞上相比于与该肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

例如但不限于，如图1所示，本公开的双特异性多肽可包括OMCP(一种NKG2D配体)和衍生自针对肿瘤细胞上的肽的抗体的抗肿瘤单链可变片段(scFv)。

在一些实施方式中，本公开的多肽可以包括第一结构域和第二结构域，其中第一结构域包含与SEQ ID NO:1的第48位至第67位和第110位至第147位氨基酸具有至少80％同源性的第一氨基酸序列，其中第二结构域可包括能够与肿瘤细胞上的肽结合的第二氨基酸序列，其中该肽对肿瘤细胞具有特异性或在肿瘤细胞上相比于与该肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

在一些实施方式中，本公开的多肽可以包括第一结构域和第二结构域，其中第一结构域包含与SEQ ID NO:2的第49位至第68位和第111位至第148位氨基酸具有至少80％同源性的第一氨基酸序列，其中第二结构域可包括能够与肿瘤细胞上的肽结合的第二氨基酸序列，其中该肽对肿瘤细胞具有特异性或在肿瘤细胞上相比于与该肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

在一些实施方式中，本公开的多肽可以包括第一结构域和第二结构域，其中第一结构域包含与SEQ ID NO:3的第48位至第66位和第111位至第148位氨基酸具有至少80％同源性的第一氨基酸序列，其中第二结构域可包括能够与肿瘤细胞上的肽结合的第二氨基酸序列，其中该肽对肿瘤细胞具有特异性或在肿瘤细胞上相比于与该肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

NKG2D配体

与NKG2D结合的配体共享MHC I类相关α1α2超结构域，该超结构域构成了与NKG2D相互作用的共同位点。与NKG2D结合的配体的非限制性实例包括：MHC I类相关糖蛋白，例如MIC家族蛋白(即MICA、MICB)；UL16结合家族蛋白(即ULBP1、ULBP2、ULPB3、ULBP4、ULBP5、ULBP6)；视黄酸早期诱导基因1(Rae1)样蛋白(即Rae1α、Rae1β、Rae1γ、Rae1δ、Rae1ε)；H60蛋白家族成员(即H60a、H60b、H60c)；h-HLA-A；以及小鼠中的Mult1和正痘病毒主要组织相容性复合物I类样蛋白(OMCP)。

在一些实施方式中，NKG2D配体可以是MHC I类相关糖蛋白。在一些实施方式中，NKG2D配体可选自由以下组成的组：MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、Rae1α、Rae1β、Rae1γ、Rae1δ、Rae1ε、H60a、H60b、H60c、h-HLA A、Mult1和OMCP。在一些实施方式中，NKG2D配体可以是UL16结合家族蛋白或MIC家族蛋白。在一些实施方式中，NKG2D配体可选自由以下组成的组：ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6。在一些实施方式中，NKG2D配体可以是ULBP3。在一些实施方式中，多肽的第一结构域包括为OMCP或其变体的NKG2D配体。

OMCP的变体可以是截短的或突变的OMCP，该截短的或突变的OMCP具有与全长OMCP大致相同的结合亲和力。在一个实施方式中，OMCP的变体可以是截短的或突变的OMCP，该截短的或突变的OMCP具有相对于全长OMCP的结合亲和力略低的结合亲和力。在另一个实施方式中，OMCP的变体可以是截短的或突变的OMCP，该截短的或突变的OMCP具有相对于全长OMCP的结合亲和力更高的结合亲和力。

确定配体与靶蛋白的结合亲和力的方法在本领域中是已知的并且如上所述。例如，如下文的实施例所述，结合亲和力可以通过测量表面等离子体共振来确定。OMCP以约0.1nM至约5nM的结合亲和力与NKG2D特异性结合。例如，OMCP以约0.2nM的结合亲和力与人NKG2D特异性结合，以约3nM的结合亲和力与小鼠NKG2D结合。

在优选的实施方式中，NKG2D配体是OMCP或其变体，该OMCP或其变体以约1000nM至约0.01nM的结合亲和力与人NKG2D结合。在某些实施方式中，OMCP或其变体以约100nM至约0.01nM、约10nM至约0.01nM或约1nM至约0.01nM的结合亲和力与人NKG2D结合。在其他实施方式中，OMCP或其变体以约1000nM至约1nM、或约1000nM至约10nM、或约1000nM至约100nM的结合亲和力与人NKG2D结合。在其他实施方式中，OMCP或其变体以约100nM至约1nM或约100nM至10nM的结合亲和力与人NKG2D结合。例如，OMCP或其变体可以约1000nM、约500nM、约100nM、约50nM、约10nM、约9nM、约8nM、约7nM、约6nM、约5nM、约4nM、约3nM、约2nM、约1nM、约0.9nM、约0.8nM、约0.7nM、约0.6nM、约0.5nM、约0.4nM、约0.3nM，约0.2nM或约0.1nM的结合亲和力与人NKG2D结合。再例如但不限于，OMCP或其变体可以约1000nM至约0.1nM、约100nM至约0.1nM、约10nM至约0.1nM或约1nM至约0.1nM的结合亲和力与人NKG2D结合。应当理解，关于结合亲和力的前述公开可适用于本公开的多肽的第一氨基酸序列和本公开的多肽的任何其他NKG2D结合结构域，例如，例如但不限于，与SEQ ID NO:1-3的区域具有同源性的第一氨基酸序列。

全长OMCP氨基酸序列的序列信息可以使用例如GenBank登录号4FFE_Z、4FFE_Y或4FFE_X找到。技术人员会理解，OMCP的同源物可以在其他物种或病毒中找到。例如，参见Lefkowitz et al,Nucleic Acids Res 2005；33:D311-316，其全部内容通过引用全部内容并入本文，其描述了牛痘和猴痘病毒株之间的十八种OMCP变体。在一个实施方式中，OMCP来自正痘病毒。在一个具体实施方式中，OMCP来自牛痘病毒或猴痘病毒。在另一个具体的实施方式中，OMCP来自牛痘病毒的Brighton Red毒株。可以通过本领域已知的方法在其他物种中找到同源物。例如，序列相似性可以通过常规算法来确定，常规算法通常允许引入少量空位以实现最佳匹配。特别地，使用Karlin和Altschul的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268,1993)来确定两个多肽或两个核酸序列的“同一性百分比”。Altschul et al.(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)的BLASTN和BLASTX程序中并入了这种算法。可以用BLASTN程序来执行BLAST核酸检索，以得到与本发明的核酸分子同源的核酸序列。同样，可以用BLASTX程序来执行BLAST蛋白质检索，以得到与本发明的多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul et al.(Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)所述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各自程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默认参数。更多详细信息请访问www.ncbi.nlm.nih.gov。通常，同源物将具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％的同源性。在本公开的任何前述实施方式中，序列可以与OMCP(例如SEQ ID NO:1-3中任一个序列的OMCP)具有至少80、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性。通常，来自猴痘和牛痘的已知菌株的OMCP均在约97％的同源性内。

技术人员会理解，OMCP的结构同源物可以在其他物种或病毒中发现。结构同源物可以是结构相关的但序列是远端同源物(distal homolog)的蛋白质。例如，OMCP与内源性NKG2D配体的序列同一性较低，但发现OMCP会基于结构同源性与NKG2D结合。可以通过本领域已知的方法在其他物种中找到结构同源物。例如，蛋白质结构预测可以通过各种数据库确定，例如Phyre和Phyre2。此类数据库生成可用于确定结构同源物的可靠的蛋白质模型。Phyre2中的主要结果表提供了置信估计％、图像和指向三维预测模型的链接、以及取决于检测模板的来源而来自蛋白质结构分类(Structural Classification of Proteins，SCOP)数据库或蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB)的信息。对于每个匹配，链接使用户能详细查看用户序列与已知三维结构序列之间的比对。更多详细信息请参阅www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/。通常，结构同源物与OMCP的置信度将至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58或59％。在一个实施方式中，结构同源物与OMCP的置信度将至少为60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％或69％。在另一个实施方式中，结构同源物与OMCP的置信度将至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％。在另一个实施方式中，结构同源物与OMCP的置信度将至少为80％、81％、82％、83％、64％、85％、86％、87％、88％或89％。在另一个实施方式中，结构同源物与OMCP的置信度将至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可以使用PDB ID：4PDC找到OMCP-人NKG2D的结构信息。应当理解，此类结构同源物可以是本公开的多肽的第一氨基酸序列和本公开的多肽的任何其他NKG2D结合结构域。

在前述实施方式的任一个中，第一氨基酸序列可以是OMCP的序列，例如SEQ IDNO:1

(HKLAFNFNLEINGSDTHSTVDVYLDDSQIITFDGKDIRPTIPFMIGDEIFLPFYKNVFSEFFS LFRRVPTSTPYEDLTYFYECDYTDNKSTFDQFYLYNGEEYTVKTQEATNKNMWLTTSEFRLKKWFDGEDCIMHLRSLVRKMEDSKRNTG)、SEQ ID NO:2(GHKLAFNFNLEINGSDTHSTVDVYLDDSQIITFDGKDIRPTIPFMIGDEIFLPFYKNVFSEFF SLFRRVPTSTPYEDLTYFYECDYTDNKSTFDQFYLYNGEEYTVKTQEATNKNMWLTTSEFR LKKWFDGEDCIMHLRSLVRKMEDSKR)以及SEQ ID NO:3(HKLVHYFNLKINGSDITNTADILLDNYPIMTFDGKDIYPSIAFMVGNKLFLDLYKNIFVEFF RLFRVSVSSQYEELEYYYSCDYTNNRPTIKQHYFYNGEEYTEIDRSKKATNKNSWLITSGFR LQKWFDSEDCIIYLRSLVRRMEDSNK)中列出的序列。在某些方面，第一氨基酸序列是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的OMCP序列。例如，OMCP可以与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的同一性。

在任何前述实施方式中，第一氨基酸序列可以是包括OMCP的α-螺旋结构域的序列或与其具有至少80％同源性的序列。因此，在某些方面，第一氨基酸序列可以与SEQ ID NO:1的第48位至第67位和第110位至第147位氨基酸、SEQ ID NO:2的第49位至第68位和第111位至第148位氨基酸或SEQ ID NO:3的第48位至第66位和第111位至第148位氨基酸具有至少80％的同源性。例如，第一氨基酸序列可以与SEQ ID NO:1的第48位至第67位和第110位至第147位氨基酸、SEQ ID NO:2的第49位至第68位和第111位至第148位氨基酸或SEQ IDNO:3的第48位至第66位和第111位至第148位氨基酸具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的同一性。

抗NKG2D抗体

“抗NKG2D抗体”是指与NKG2D内的表位特异性结合的抗体(如本文所定义的术语)。术语“抗体”包括“单克隆抗体”。“单克隆抗体”是指衍生自单个拷贝或克隆的抗体，包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆。单克隆抗体可以使用例如本领域熟知的杂交瘤技术以及重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或这些技术与本领域已知的其他技术的组合来产生。术语“抗体”也应理解为是指功能性单克隆抗体或其免疫有效片段；例如其Fab、Fab'或F(ab')2片段。只要蛋白质保留与其预期靶标特异性结合的能力，它就被包含在术语“抗体”内。定义“抗体”还包括例如具有这种特异性的抗体的单链形式，通常称为Fv区。这些scFv由通过接头连接的重链可变区和轻链可变区组成。制备和使用scFv的方法是本领域已知的。此外，定义“抗体”包括单结构域抗体，通常称为sdAb，其是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。sdAb抗体可以来自骆驼科(VHH片段)或软骨鱼类(VNAR片段)。如本文所用，“人源化抗体”是通过改变具有非人互补决定区(Complementarity determining region，CDR)的抗体的序列，部分或全部由衍生自人抗体种系的氨基酸序列序列构成的抗体。最简单的这种改变可以简单地由用人抗体的恒定区代替鼠恒定区组成，从而产生可能具有足够低的免疫原性而可用于药物用途的人/鼠嵌合体。然而，优选地，抗体的可变区甚至CDR也是通过本领域目前众所周知的技术人源化的。可变区的框架区被相应的人框架区取代，使非人CDR基本上完整，或者甚至用源自人基因组的序列替换CDR。CDR也可以随机突变，使得在完全人种系框架区或基本上是人的框架区的背景下维持或增强对NKG2D的结合活性和亲和力。在某些实施方式中，抗NKG2D抗体是Fab、Fab’或F(ab’)2片段。

在任何前述实施方式中，其中第一氨基酸序列是抗NGK2D抗体，该抗体可以是，例如但不限于Kwong,et al,J Mol Biol.2008Dec 31；384(5):1143-56中描述的KYK-1或KYK-2。KYK-1的轻链包含SEQ ID NO:4(QPVLTQPSSVSVAPGETARIPCGGDDIETKSVHWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRPSGIPERFFGSNSGNTATLSISRVEAGDEADYYCQVWDDNNDEWVFGGGTQLTVL)所示的氨基酸序列，KYK-1的重链包含SEQ ID NO:5(EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRFGYYLDYWGQGTLVTVSS)所示的氨基酸序列。KYK-2的轻链包含SEQ ID NO:6(QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL)所示的氨基酸序列，KYK-2的重链包含SEQ ID NO:7(QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS)所示的氨基酸序列。

在另一个特定的实施方式中，抗NKG2D抗体是源自KYK-1的scFv。例如，KYK-1scFv包含SEQ ID NO:8(QPVLTQPSSVSVAPGETARIPCGGDDIETKSVHWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRPSGIPERFFGSNSGNTATLSISRVEAGDEADYYCQVWDDNNDEWVFGGGTQLTVLGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRFGYYLDYWGQGTLVTVSS)所示的氨基酸序列。可选地，KYK-1scFv包含SEQ ID NO:9(EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRFGYYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQPSSVSVAPGETARIPCGGDDIETKSVHWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRPSGIPERFFGSNSGNTATLSISRVEAGDEADYYCQVWDDNNDEWVFGGGTQLTVL)所示的氨基酸序列。

在另一个特定的实施方式中，抗NKG2D抗体是源自KYK-2的scFv。例如，KYK-2scFv包含SEQ ID NO:10(QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS)所示的氨基酸序列。可选地，KYK-2scFv包含SEQID NO:11(QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL)所示的氨基酸序列。

如上所述，各种KYK-1和KYK-2抗体或其scFv可以在不存在或存在本文描述的任何接头的情况下与本文公开的任何细胞因子组合，以提供本发明的组合物或嵌合肽。还应当理解，KYK-1和KYK-2抗体是适用于本发明组合物的抗体的例子，并且本领域技术人员基于本公开将理解其他抗NKG2D抗体也是合适的。

肿瘤靶标

从概念上讲，与大多数正常组织相比，在给定肿瘤的细胞表面上充分过量表达的任何细胞表面蛋白都将提供合适的治疗靶标。目前在临床中使用的此类靶标的非限制性实例概述如下。在另一个例子中，肿瘤靶标可能是突变的，或者是两种天然存在蛋白质之间的融合蛋白，从而产生可以靶向的独特表位。理想情况下，与这些细胞表面靶标的结合不会抑制正常组织的功能。然而，可以理解的是，由肿瘤细胞表达的大多数蛋白质也将在一定程度上在正常组织中表达。

在本公开的任何实施方式中，第二结构域的第二氨基酸序列可以是肿瘤靶标结合伴侣，例如，例如但不限于，能够与肿瘤细胞上的肽(肿瘤靶标)结合的抗体可变区或配体，该肽对肿瘤细胞具有特异性或在肿瘤细胞上相比于与该肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。在某些实施方式中，双特异性或多特异性构建体通过抗体可变区与肿瘤靶标结合。可变抗体可以表达为经典抗体骨架的一部分，或者可以表达为在可变结构域之间具有短接头的线性抗体可变抗体。在另一个实施方式中，构建体通过与靶蛋白结合的天然存在的配体而与肿瘤靶标结合。在一些实施方式中，使天然存在的配体突变以增加或减少对靶向蛋白的结合亲和力。可被本公开的多肽靶向的示例性肿瘤靶标在下表中提供。

在任何前述实施方式中，第二结构域可以是源自抗体的scFv。例如但不限于，第二结构域可以是针对表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)的抗体，例如西妥昔单抗(cetuximab)。在一个实施方式中，西妥昔单抗的可变轻链包含SEQ IDNO:12(DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVA)所示的氨基酸序列，西妥昔单抗的可变重链包含SEQ ID NO:13(QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA)所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的任何实施方式的融合蛋白包含西妥昔单抗scFv，该西妥昔单抗scFv包含SEQ ID NO:14(DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA)所示的氨基酸序列，该氨基酸序列在可变轻链和可变重链之间包括GGGS(SEQ ID NO:37)接头。在某些方面，scFV的可变轻链可以包括与SEQ ID NO:12具有至少约80％同源性的序列。例如，VL可以与SEQ ID NO:12具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的同一性。在某些方面，scFV的可变重链可以包括与SEQ ID NO:13具有至少约80％同源性的序列。例如，VH可以与SEQ ID NO:13具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的同一性。在某些方面，scFV可以包括与SEQ ID NO:14具有至少约80％同源性的序列。例如，scFV可以与SEQ ID NO:14具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的同一性。

因此，在一个实施方式中，本发明的任何相关实施方式的融合蛋白可以包含OMCP和西妥昔单抗scFV。该融合蛋白的一个示例性实施方式包含SEQ ID NO:15(DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSHKLAFNFNLEINGSDTHSTVDVYLDDSQIITFDGKDIRPTIPFMIGDEIFLPFYKNVFSEFFSLFRRVPTSTPYEDLTYFYECDYTDNKSTFDQFYLYNGEEYTVKTQEATNKNMWLTTSEFRLKKWFDGEDCIMHLRSLVRKMEDSKRNTG)所示的氨基酸序列。

三特异性融合蛋白

本公开的治疗性融合肽可包括三特异性治疗剂和四特异性治疗剂。除第一结构域外，三特异性构型还可包括针对两个不同的肿瘤靶标的抗体可变区。已知即使在同一肿瘤内，癌细胞也具有可变的蛋白质表达模式。因此，多种肿瘤靶向配体的并入将增加在每个细胞上表达的给定表面受体的可能性。作为非限制性实例，可以包括针对ERBB2和EGFR的可变区。可以并入特异性地针对肿瘤特异性靶标的任何组合的抗体可变区，该肿瘤特异性靶标包括ERBB2、CD19、EPCAM、MS4A1、FOLH1、CEACAM5、IL3RA、PMEL、CLEC12A、KDR、EGFR、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、CD20、CD123、BCMA、CD38、B7H3/CD276、GPA33、SSTR2、GPC3和CDH3。

三特异性构型还可能包括两个NKG2D结合部分，例如NKG2D配体或αNKG2D抗体可变区。在这样的实施方式中，多个NKG2D受体在蛋白质表面的结合可能有助于NKG2D二聚化和NKG2D途径活化，从而导致细胞毒性NK和CD8⁺T细胞的活化。在另一种构型中，NKG2D的功能活化可以通过插入一个或多个NKG2D配体然后在每个NKG2D配体之间插入短接头序列来优化。在这种构型的一个具体实施方式中，NKG2D配体可以是本文公开的OMCP或其变体。

在前述实施方式的任一个中，本公开的多肽除了所述的第一结构域和第二结构域之外，还可以包括第三结构域。在某些方面，第三结构域包含能够与肿瘤细胞上的肽结合的第三氨基酸序列，其中该肽对肿瘤细胞具有特异性或在肿瘤细胞上相比于与该肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。在某些方面，第三氨基酸序列能够与第二氨基酸序列能够结合的相同肽结合。在某些方面，第三氨基酸序列能够与第二氨基酸序列能够结合的不同肽结合。应当理解，当第三结构域包括能够与肿瘤细胞上的肽结合的第三氨基酸序列时，关于第二结构域的实施方式的前述描述适用于第三结构域。

在某些方面，第三结构域包含能够与人NKG2D结合的第三氨基酸序列。应当理解，当第三结构域包括能够与人NKG2D结合的第三氨基酸序列时，关于第一结构域的实施方式的描述适用于第三结构域。

在某些方面，第三结构域包含Fc抗体结构域。在某些方面，Fc抗体结构域可包含阻止Fc抗体结构域与CD16结合的突变。

在某些方面，第三结构域包含细胞因子。

在某些方面，第三结构域可以是接头。在某些方面，在第三结构域是接头的情况下，接头可以位于第一结构域和第二结构域之间。

示例性的三特异性多肽显示在图2A至图2C中。

四特异性融合蛋白

在另一种构型中，融合蛋白可以合并多种淋巴细胞靶向蛋白以及多种肿瘤靶向蛋白，从而产生四特异性蛋白。在一个例子中，两种淋巴细胞靶向配体都将与NKG2D结合，两种淋巴细胞靶向配体具体地将是OMCP。在另一个例子中，将选择两种不同的淋巴细胞表面受体。这将使淋巴细胞能够参与各种活化状态，或者可能偏好于更倾向于NK细胞活化或CD8⁺T细胞活化的治疗性活化。在一个非限制性实例中，两种淋巴细胞配体可以选自抗NKG2D抗体、OMCP、抗CD3e(偏好于CD8⁺T细胞)或抗FCGR1(偏好于NK细胞)的任意组合。可以并入特异性地针对肿瘤特异性靶标的任何组合的抗体可变区，该肿瘤特异性靶标包括ERBB2、CD19、EPCAM、MS4A1、FOLH1、CEACAM5、IL3RA、PMEL、CLEC12A、KDR、EGFR、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、CD20、CD123、BCMA、CD38、B7H3/CD276、GPA33、SSTR2、GPC3和CDH3。

在任何前述实施方式中，在本公开的多肽包括三个结构域的情况下，多肽可以包括第四结构域，该第四结构域包括第四氨基酸序列。在某些方面，第四结构域能够与肿瘤细胞上的肽结合，其中该肽对肿瘤细胞具有特异性或在肿瘤细胞上相比于与该肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。在某些方面，第四氨基酸序列能够与第二或第三氨基酸序列能够结合的相同肽结合。在某些方面，第四氨基酸序列能够与第二或第三氨基酸序列能够结合的不同肽结合。应当理解，当第四结构域包括能够与肿瘤细胞上的肽结合的第四氨基酸序列时，关于第二结构域的实施方式的前述描述适用于第四结构域。

在某些方面，第四结构域能够与人NKG2D结合。应当理解，当第四结构域包括能够与人NKG2D结合的第三氨基酸序列时，关于第一结构域的实施方式的描述适用于第四结构域。

在某些方面，第四结构域包含Fc抗体结构域。在某些方面，Fc抗体结构域可包含阻止Fc抗体结构域与CD16结合的突变。

在某些方面，第四结构域包含细胞因子。

在某些方面，第四结构域可以是接头。

本公开的示例性四特异性多肽显示在图3A至图3B中。

应当理解，本公开的多肽可以包括多于四个特定结构域，并且除了第一结构域和第二结构域之外，还可以包括本文公开的结构域的组合。

Fc抗体结构域

在本公开的任何实施方式中，多肽可以包括来自抗体的Fc抗体结构域。在一些实施方式中，Fc抗体结构域可包括铰链部分、CH3部分和CH2部分。例如但不限于，Fc抗体结构域可以包括SEQ ID NO:21(EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)的序列，该序列是IgG1 Fc的野生型序列。

在某些方面，Fc抗体结构域还可包括促进异二聚化的结构域。在一些实施方式中，Fc部分可包括允许两条链异二聚化的杵结构域(knob domain)和臼结构域(hole domain)。例如但不限于，Fc抗体结构域可以包括杵结构域和臼结构域，例如，SEQ ID NO:22(EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)的杵结构域以及SEQ ID NO:23(EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)的臼结构域。再例如但不限于，杵结构域可以包括SEQID NO:24(EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)的序列，臼结构域可以包括SEQ ID NO:25(EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTWPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)的序列。再例如但不限于，杵结构域可以包括SEQ ID NO:26(EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)的序列，臼结构域可以包括SEQ ID NO:27(EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSFLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)的序列，这提供了用于产生异二聚体的噬菌体展示杵臼(knob-in-hole)系统。

在一些实施方式中，Fc抗体结构域还可包括用于SEED异二聚化的结构域。例如但不限于，Fc抗体结构域可以包括优先形成异二聚体的具有SEQ ID NO:28(EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPKDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTTTFAVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKTISLSPGK)的序列的结构域和具有SEQ ID NO:29(EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPPSEELALNELVTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWAPVLDSDGSFFLYSILRVAAEDWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDRSPGK)的序列的结构域。

通过优先形成异二聚体，本公开的具有Fc抗体结构域的多肽可以具有两个不同的结合部分，一个连接到Fc抗体结构域的各部分。例如，如图6A至图6D所示，本公开的示例性多肽可以包括与Fc抗体结构域组合的两个特异性结合部分，在图6A至图6D的情况下，该Fc抗体结构域包括SEED异二聚化设计。

在一些实施方式中，Fc抗体还可包括阻止Fc部分与CD16结合的一个或多个突变。图6A至图6B进一步举例说明了包括效应子功能沉默突变的这种设计。例如但不限于，效应子沉默突变包括相对于天然人IgG1的L234A、L235P、P329G及其组合。在SEQ ID NO:21中，这些突变将发生在SEQ ID NO:21的第19、20和114位(L19、L20和P114)。因此，在相应位置存在的范围里，效应子功能沉默突变可以在本公开的多肽的Fc抗体结构域中的相应位置处。

在一些实施方式中，Fc抗体结构域还可包括能够纯化构建体的一个或多个突变。例如但不限于，这种突变可包括相对于天然人IgG1的T307P、L309Q、Q311R及其组合。在SEQID NO:21中，这些突变将发生在SEQ ID NO:21的第19、20和114位(T92、L94和Q96)。

在一些实施方式中，本公开的多肽可包括单体Fc抗体结构域。单体Fc结构域可用于增加本公开的多肽的半衰期。例如但不限于，单体Fc结构域可以包括SEQ ID NO:30(EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTSPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)的序列，该序列是具有L351S、T366R、L368H和P396K(分别对应于SEQ ID NO:30中的第136、151、153和181位)突变的单体Fc结构域。

应当理解，本公开的多肽中的Fc抗体结构域可因Fc抗体结构域的突变、添加、缺失和其他修饰而与前述示例性实施方式不同。例如但不限于，Fc抗体域可包括与SEQ ID NO:21-30中的任一个序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。

接头

应当理解，本公开的多肽可以包括如本文公开的以及多肽的结构域之间的接头。在一些实施方式中，接头可以包括(GGGGS)_n，其中n是至少为1的整数。例如但不限于，n可以是1、2、3、4、5或更大。接头是本领域技术人员熟知的并且可以使用的任何合适的接头。

细胞因子

“细胞因子”是一种在细胞信号传导中很重要的小蛋白质(约5kDa至20kDa)。细胞因子由细胞释放并影响其他细胞和/或释放细胞因子的细胞的行为。细胞因子的非限制性实例包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子、单核因子和集落刺激因子。细胞因子可由大范围的细胞产生，包括但不限于免疫细胞(例如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞和单核细胞)、内皮细胞、成纤维细胞和基质细胞。细胞因子可以由超过一种类型的细胞产生。细胞因子通过受体发挥作用，并且在免疫系统中尤其重要，调节体液免疫应答与基于细胞的免疫应答之间的平衡，并调节细胞群的成熟、生长和反应性。细胞因子在宿主对感染的反应、免疫反应、炎症、创伤、败血症、癌症和生殖中很重要。本发明的细胞因子可以是天然存在的细胞因子或可以是天然存在的细胞因子的突变形式。如本文所用，“天然存在的”，也可称为野生型，其包括等位基因变异。天然存在的细胞因子的突变形式或“突变体”是指对天然存在的序列进行的特定突变，以改变细胞因子的功能、活性和/或特异性。在一个实施方式中，突变可以增强细胞因子的功能、活性和/或特异性。在另一个实施方式中，突变可以降低细胞因子的功能、活性和/或特异性。突变可以包括细胞因子的一个或多个氨基酸残基的缺失或添加。

细胞因子可以基于结构进行分类。例如，细胞因子可分为四类：四-α-螺旋束家族、IL1家族、IL17家族和半胱氨酸杵细胞因子。四-α-螺旋束家族的成员具有带有四束α螺旋的三维结构。该家族进一步分为三个亚家族：IL2亚家族、干扰素(IFN)亚家族和IL10亚家族。IL2亚家族是最大的，包括若干种非免疫细胞因子，包括但不限于促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)和促血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)。

在前述实施方式的任一个中，细胞因子可以是来自四-α-螺旋束家族或其突变体的细胞因子。本领域技术人员能够确定四-α-螺旋束家族内的细胞因子。

在上述任何实施方式中，细胞因子可以是IL2亚家族细胞因子或其突变体。IL2亚家族成员的非限制性实例包括IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21。在一个具体实施方式中，细胞因子是IL2或其突变体。在任何前述实施方式中，细胞因子可以是IL15或其突变体。可以使用例如GenBank登录号CAG46777.1、AAI00962.1或AAI00963.1找到全长人IL15氨基酸序列的序列信息。可以使用例如GenBank登录号CR542007.1、KJ891469.1、NM_172175.2、NM_000585.4或CR541980.1找到全长人IL15 mRNA序列的序列信息。技术人员将理解，IL15可以在多种物种中发现，并且鉴定IL15的类似物或同源物的方法是本领域已知的，如下所详述的。

在任何前述实施方式中，细胞因子可以是IL1家族细胞因子或其突变体。IL1家族是一组11种细胞因子，其在调节免疫反应和炎症反应中起着核心作用。通常，IL1细胞因子家族是调节和启动炎症反应的促炎细胞因子。IL1家族细胞因子的非限制性实例包括IL1α、IL1β、IL1Ra、IL18、IL-36Ra、IL36α、IL37、IL36β、IL36γ、IL38和IL33。IL1家族成员具有相似的基因结构。本领域技术人员将能够确定IL1家族内的细胞因子。

在任何前述实施方式中，细胞因子可以是IL18或其突变体。可以使用例如GenBank登录号CAG46771.1找到全长人IL18氨基酸序列的序列信息。可以使用例如GenBank登录号KR710147.1、CR542001.1、CR541973.1或KJ897054.1找到全长人IL18 mRNA序列的序列信息。本领域技术人员将理解，IL18可以在多种物种中发现并且鉴定IL18的类似物或同源物的方法是本领域已知的。

在上述任何实施方式中，细胞因子可以是干扰素亚家族细胞因子或其突变体。干扰素因其通过保护细胞免受病毒感染而“干扰”病毒复制的能力而得名。干扰素还具有其他功能：它们活化免疫细胞，例如自然杀伤细胞和巨噬细胞；它们通过增加主要组织相容性复合物(MHC)抗原的表达来上调抗原呈递，从而增强宿主防御。根据它们发出信号的受体类型，人干扰素主要被分为三类：I型IFN、II型IFN和III型IFN。I型IFN与称为IFN-α/β受体(IFNAR)的特定细胞表面受体复合物结合，IFN-α/β受体由IFNAR1链和IFNAR2链组成。人中存在的I型干扰素的非限制性实例是IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω。因此，在某些实施方式中，组合物的细胞因子是1型IFN细胞因子或其突变体，包括但不限于IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω的野生型和突变体形式。II型IFN与由IFNGR1链和IFNGR2链组成的IFNGR结合。人中存在的II型干扰素的非限制性实例是IFN-γ。因此，在某些实施方式中，组合物的细胞因子是II型IFN细胞因子或其突变体，包括但不限于IFN-γ的野生型和突变体形式。III型IFN通过由IL10R2(也称为CRF2-4)和IFNLR1(也称为CRF2-12)组成的受体复合物发出信号。III型干扰素的非限制性实例包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3(也分别称为IL29、IL28A和IL28B)。因此，在某些实施方式中，组合物的细胞因子是III型IFN细胞因子或其突变体，包括但不限于IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3的野生型和突变体形式。

在任何前述实施方式中，细胞因子可以是肿瘤坏死因子超家族(Tumor necrosisfactor superfamily，TNSF)的成员，或其突变体。TNSF成员是主要由免疫细胞表达的促炎细胞因子，其诱导炎症状态并刺激免疫细胞功能。至少存在18种TNSF同源物，包括但不限于TNF(TNFα)、CD40L(TNFSF5)、CD70(TNFSF7)、EDA、FASLG(TNFSF6)、LTA(TNFSF1)、LTB(TNFSF3)、TNFSF4(OX40L)、TNFSF8(CD153)、TNFSF9(4-1BBL)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(RANKL)、TNFSF12(TWEAK)、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18。因此，在某些实施方式中，组合物的细胞因子是肿瘤坏死因子超家族的成员或其突变体，包括但不限于TNF(TNFα)、CD40L(TNFSF5)、CD70(TNFSF7)、EDA、FASLG(TNFSF6)、LTA(TNFSF1)、LTB(TNFSF3)、TNFSF4(OX40L)、TNFSF8(CD153)、TNFSF9(4-1BBL)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(RANKL)、TNFSF12(TWEAK)、TNFSF13、TNFSF1SF3B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18。

在另一种构型中，可以将免疫调节细胞因子并入融合蛋白设计中。例如，可以将细胞因子并入淋巴细胞特异性配体和肿瘤靶向抗体之间的接头内。在另一个例子中，细胞因子可以从包含Fc重链的融合蛋白的一条链中并入。在一个非限制性示例中，活性分子可以选自IL1、IL2、IL7、IL12、IL15、IL18、IL21、TNFα、IFNα、IFNλ的天然存在形式或突变形式。

包括细胞因子的本公开的示例性多肽显示在图4A至图4B中。

PEG化和糖基化

在其中NKG2D配体是OMCP或其变体的某些实施方式中，可以修饰OMCP或其变体以改善系统半衰期并降低给药频率。在其中多肽包括OMCP或其变体的任何前述实施方式中，可以将N-聚糖添加至OMCP或其变体。虽然生物学功能通常由蛋白质成分决定，但碳水化合物可以在分子稳定性、溶解性、体内活性、血清半衰期和免疫原性方面发挥作用。特别是碳水化合物的唾液酸成分，可以延长蛋白质治疗剂的血清半衰期。因此，可以将新型N连接糖基化共有序列引入肽骨架中的所需位置以产生含唾液酸的碳水化合物增加的蛋白质，从而由于更长的血清半衰期而增加体内活性。在另一个实施方式中，可以将PEG添加到OMCP或其变体中。将PEG与蛋白质缀合的方法是本领域标准的。例如，参见Kolate et al,Journal ofControlled Release 2014；192(28):67-81，其通过引用全部内容在此并入。在任何前述实施方式中，本公开的多肽可以包括含有PEG和/或一种或多种N聚糖的OMCP或其变体。在任何前述实施方式中，PEG选自由PEG-10K、PEG-20K和PEG-40K组成的组。

去免疫

更进一步地，可以修饰本公开的融合蛋白以去除T细胞表位。T细胞表位可在向对象施用组合物后刺激免疫原性反应。通过它们向T细胞呈递，它们激活了抗药抗体的发展过程。T细胞表位的临床前筛选可以在计算机(silico)中进行，然后进行体外和体内验证。诸如EpiMatrix的T细胞表位定位工具可以高度准确地预测免疫反应。有意去除T细胞表位可能会降低免疫原性。

药物组合物

本公开还提供药物组合物。该药物组合物可以包含本文所述的治疗性融合蛋白中的一种作为活性成分以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

药学上可接受的赋形剂可以是稀释剂、粘合剂、填充剂、缓冲剂、pH调节剂、崩解剂、分散剂、防腐剂、润滑剂、掩味剂、调味剂或着色剂。可以根据药物科学的已知原理来选择用于形成药物组合物的赋形剂的量和类型。

在一个实施方式中，赋形剂可以是稀释剂。稀释剂可以是可压缩的(即，可塑性变形的)或磨碎的。合适的可压缩的稀释剂的非限制性实例包括微晶纤维素(Microcrystalline cellulose，MCC)、纤维素衍生物、纤维素粉末、纤维素酯(即乙酸酯和丁酸酯混合的酯)、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、玉米淀粉、磷酸化玉米淀粉、预胶化玉米淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、淀粉-乳糖、淀粉-碳酸钙、羟基乙酸淀粉钠、葡萄糖、果糖、乳糖、乳糖一水合物、蔗糖、木糖、乳糖醇、甘露醇、麦芽糖醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖糊精和海藻糖。合适的磨碎的稀释剂的非限制性实例包括磷酸氢钙(无水或二水合物)、磷酸三钙、碳酸钙和碳酸镁。

在另一个实施方式中，赋形剂可以是粘合剂。合适的粘合剂包括但不限于淀粉、预胶化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯恶唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖类、低聚糖、多肽、寡肽及其组合。

在另一个实施方式中，赋形剂可以是填充剂。合适的填充剂包括但不限于碳水化合物、无机化合物和聚乙烯吡咯烷酮。作为非限制性实例，填充剂可以是二元和三元硫酸钙、淀粉、碳酸钙、碳酸镁、微晶纤维素、二碱式磷酸钙、碳酸镁、氧化镁、硅酸钙、滑石、改性淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇。

在又一个实施方式中，赋形剂可以是缓冲剂。合适的缓冲剂的代表性实例包括但不限于磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、tris缓冲液和盐缓冲盐水(例如，Tris缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)。

在各种实施方式中，赋形剂可以是pH调节剂。作为非限制性实例，pH调节剂可以是碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠、柠檬酸或磷酸。

在进一步的实施方式中，赋形剂可以是崩解剂。崩解剂可以是非泡腾的或泡腾的。非泡腾的崩解剂的合适实例包括但不限于：淀粉，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化和改性淀粉；甜味剂；粘土，如膨润土；微晶纤维素；藻酸盐；羟基乙酸淀粉钠；树胶，如琼脂、瓜尔豆、刺槐角豆胶、梧桐树胶、果胶和黄蓍胶。合适的泡腾的崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。

在又一个实施方式中，赋形剂可以是分散剂或分散增强剂。合适的分散剂可包括但不限于淀粉、藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔豆胶、高岭土、膨润土、纯木纤维素、羟基乙酸淀粉钠、异晶硅酸盐和微晶纤维素。

在另一个替代实施方式中，赋形剂可以是防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例包括：抗氧化剂，例如BHA、BHT、维生素A、维生素C、维生素E或棕榈酸视黄酯、柠檬酸、柠檬酸钠；螯合剂，例如EDTA或EGTA；和抗菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇或苯酚。

在另一个实施方式中，赋形剂可以是润滑剂。合适的润滑剂的非限制性实例包括矿物质，例如滑石或二氧化硅；和脂肪，例如植物硬脂、硬脂酸镁或硬脂酸。

组合物中赋形剂或赋形剂组合的重量分数可以为组合物的总重量的约99％或更少、约97％或更少、约95％或更少、约90％或更少、约85％或更少、约80％或更少、约75％或更少、约70％或更少、约65％或更少、约60％或更少、约55％或更少、约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约2％、或约1％或更少。

可以将该组合物配制成各种剂型并通过多种不同的将递送治疗有效量的活性成分的方式施用。此类组合物可以按需要以含有常规无毒药学上可接受的载体、佐剂和溶媒的剂量单位制剂来口服、肠胃外或局部施用。局部施用还可以涉及使用透皮施用，例如透皮贴剂或离子电渗疗法装置。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内或胸骨内注射或输注技术。例如Gennaro,A.R.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.,Easton,Pa.(18th ed,1995)和Liberman,H.A.and Lachman,L.,Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker Inc.,New York,N.Y.(1980)中讨论了药物的配制。

用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、囊片、丸剂、粉剂、球剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性成分通常与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合，其实例在上文详述。口服制剂也可以以含水悬浮液、酏剂或糖浆剂施用。对于这些，活性成分可以与各种甜味剂或调味剂、着色剂以及，如果需要的话，乳化剂和/或悬浮剂，以及稀释剂(例如水、乙醇、甘油及其组合)组合。

对于肠胃外施用(包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内和腹膜内)，制剂可以是水溶液或油基溶液。水溶液可以包含：无菌稀释剂，例如水、盐水溶液、药学上可接受的多元醇(例如甘油、丙二醇)或其他合成溶剂；抗菌剂和/或抗真菌剂，例如苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、硫柳汞等；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和/或张力调节剂，如氯化钠、右旋糖或多元醇(如甘露醇或山梨糖醇)。水溶液的pH可以用酸(例如盐酸)或碱(例如氢氧化钠)来调节。油基溶液或悬浮液还可以包含芝麻油、花生油、橄榄油或矿物油。

在某些实施方式中，包含本公开的治疗性融合肽的组合物可以包封在合适的媒介中以帮助将化合物递送至靶细胞、增加组合物的稳定性或使组合物的潜在毒性最小化。本领域技术人员将理解，多种媒介适用于递送本发明的组合物。合适的结构化流体递送系统的非限制性实例可以包括纳米颗粒、脂质体、微乳液、胶束、树枝状聚合物和其他含磷脂的系统。将组合物并入递送媒介的方法是本领域已知的。

在一个替代实施方式中，可以使用脂质体递送媒介。取决于实施方式，考虑到脂质体的结构和化学特性，脂质体适合于递送肽。一般来说，脂质体是带有磷脂双层膜的球形囊泡。脂质体的脂质双层可以与其他双层(例如细胞膜)融合，从而将脂质体的内容物递送至细胞。以这种方式，本发明的化合物可以通过包封在与靶细胞膜融合的脂质体中而选择性地递送至细胞。

脂质体可以由具有不同烃链长度的多种不同类型的磷脂组成。磷脂通常包含通过磷酸甘油与多种极性基团之一连接的两种脂肪酸。合适的磷脂包括磷脂酸(Phosphatidicacid，PA)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol，PG)、二磷脂酰甘油(Diphosphatidylglycerol，DPG)、磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)和磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)。包含磷脂的脂肪酸链的长度可以为约6个至约26个碳原子，并且脂质链可以是饱和的或不饱和的。合适的脂肪酸链包括(括号中为通用名称)正十二烷酸酯(月桂酸酯)、正十四烷酸酯(肉豆蔻酸酯)、正十六烷酸酯(棕榈酸酯)、正十八酸酯(硬脂酸酯)、正二十烷酸酯(花生酸酯)、正二十二烷酸酯(山嵛酸酯)、正二十四烷酸酯(木蜡酸酯)、顺-9-棕榈油酸酯(棕榈油酸)、顺-9-十八碳酯(油酸酯)、顺,顺-9,12-十八碳二烯酸酯(亚油酸酯)、全顺-9,12,15-十八碳三烯酸酯(亚麻酸酯)和全顺5,8,11,14-二十碳四烯酸(花生四烯酸)。磷脂的两条脂肪酸链可以相同或不同。可接受的磷脂包括二油酰PS、二油酰PC、二硬脂酰PS、二硬脂酰PC、二肉豆蔻酰PS、二肉豆蔻酰PC、二棕榈酰PG、硬脂酰PS、油酰PS、棕榈酰PS、亚麻酰PS等。

磷脂可以来自任何天然来源，并因此可以包括磷脂的混合物。例如，蛋黄中富含PC、PG和PE，大豆中含有PC、PE、PI和PA，以及动物脑或脊髓中富含PS。磷脂也可以来自合成来源。可以使用具有不同比例的单个磷脂的磷脂混合物。不同磷脂的混合物可以产生具有有利活性或活性特性稳定性的脂质体组合物。上述磷脂可以与阳离子脂质以最佳比例混合，该阳离子脂质例如N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵、1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳菁高氯酸酯、3,3'-二庚基氧化碳菁碘化物、1,1'-双十二烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳菁高氯酸酯(1,1’-dedodecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchloarate)、1,1'-二油烯基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳菁甲磺酸酯、N-4-(二亚油酸氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓碘化物(N-4-(delinoleylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide)或1,1,-二亚油酸-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳菁高氯酸酯。

脂质体可以任选地包含鞘脂，其中鞘氨醇是甘油和磷酸甘油酯或胆固醇的一种脂肪酸中的一种的结构对应物，是动物细胞膜的主要成分。脂质体可以任选地包含聚乙二醇化脂质，聚乙二醇化脂质是共价连接至聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)聚合物的脂质。PEG的大小范围可以从约500道尔顿至约10000道尔顿。

脂质体还可以包含合适的溶剂。溶剂可以是有机溶剂或无机溶剂。合适的溶剂包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、甲基吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、乙腈、醇类、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或其组合。

携带本公开内容的治疗性融合肽的脂质体可以通过制备用于药物递送的脂质体的任何已知方法来制备，例如在美国专利第4,241,046、4,394,448、4,529,561、4,755,388、4,828,837、4,925,661、4,954,345、4,957,735、5,043,164、5,064,655、5,077,211和5,264,618号中详细描述的，其内容通过引用整体并入本文。例如，脂质体可以通过对水溶液中的脂质进行超声处理、溶剂注射、脂质水合、反向蒸发或通过反复冷冻和解冻的冷冻干燥来制备。在一个优选的实施方式中，脂质体通过超声处理形成。脂质体可以是多层的，其像洋葱一样有很多层，但也可以是单层的。脂质体可大可小。持续的高剪切超声往往会形成更小的单层脂质体。

对于普通技术人员显而易见的是，控制脂质体形成的所有参数都可以变化。这些参数包括但不限于温度、pH、甲硫氨酸化合物的浓度、脂质的浓度和组成、多价阳离子的浓度、混合速率、溶剂的存在和浓度。

在另一个实施方式中，治疗性融合肽可以作为微乳液递送至细胞。微乳液通常是透明的、热力学稳定的溶液，该溶液包含水溶液、表面活性剂和“油”。在这种情况下，“油”是超临界流体相。表面活性剂位于油水界面。多种表面活性剂中的任一种适用于微乳液制剂，包括本文所述的那些或本领域已知的那些。适用于本发明的水性微区通常具有约5nm至约100nm的特征结构尺寸。这种大小的聚集体是可见光的不良散射体，因此，这些溶液在光学上是透明的。本领域技术人员将理解，微乳液可以具有并且将具有多种不同的微观结构，包括球形、棒形或盘形聚集体。在一个实施方式中，该结构可以是胶束，胶束是最简单的微乳液结构，通常是球形或圆柱形物体。胶束就像水中的油滴，反胶束就像油中的水滴。在一个替代实施方式中，微乳液结构是薄层。它包括通过表面活性剂层隔开的连续的水层和油层。微乳液的“油”最佳地包含磷脂。上述针对脂质体详述的任何磷脂都适用于涉及微乳液的实施方式。可以通过本领域公知的任何方法将本发明的组合物包封在微乳液中。

在又一个实施方式中，治疗性融合肽可以树枝状大分子或树枝状聚合物的形式递送。一般来说，树枝状聚合物是一个分支的树状分子，其中每个分支都是在一定长度后分成两个新的分支(分子)的相互连接的分子链。这种分支一直持续到分支(分子)变得如此密集以至于树冠(canopy)形成一个球体。通常，树枝状聚合物的性质由其表面的官能团决定。例如，亲水端基(如羧基基团)通常会形成水溶性树枝状聚合物。或者，可将磷脂并入树枝状聚合物的表面以促进穿过皮肤吸收。针对用于脂质体实施方式详述的任何磷脂都适用于树枝状聚合物实施方式。可以使用本领域公知的任何方法来制备树枝状聚合物并将本发明的组合物包封在其中。例如，树枝状聚合物可以通过迭代的一系列反应步骤产生，其中每个额外的迭代导致更高阶的树枝状聚合物。因此，它们具有规则的、高度分支的尺寸和形状几乎一致的3D结构。此外，树枝状聚合物的最终大小通常由合成过程中使用的迭代步骤数来控制。多种树枝状聚合物尺寸适用于本发明。通常，树枝状聚合物的大小范围可以从约1nm至约100nm。

施用

在某些方面，可以将本公开的治疗有效量的治疗性融合肽施用至对象。使用标准有效的技术进行施用，包括外周施用(即不施用至中枢神经系统)或局部施用至中枢神经系统。外周施用包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肺部、透皮、肌肉内、鼻内、口腔、舌下或栓剂施用。包括直接进入中枢神经系统(Central nervous system，CNS)的局部施用包括但不限于通过腰椎、心室内的或器官实质内的导管或使用手术植入的控释制剂。Pherasis可用于递送本公开的治疗性融合肽。在某些实施方式中，本公开的治疗性融合肽可通过输注(连续或推注)施用。

用于有效施用的药物组合物被有意设计为适合于所选择的施用方式，并且适当地使用药学上可接受的赋形剂，例如相容的分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。最新版的“雷明顿药物科学，马克出版有限公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，第16版(Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton Pa.,16Ed)”ISBN:0-912734-04-3(其通过引用全部内容并入本文)提供了从业者通常已知的配制技术概要。

通过静脉内或腹膜内或皮下注射的有效外周全身递送是对活体患者施用的优选方法。用于这种注射的合适的溶媒是简单的。然而，此外，还可以借助鼻用气化喷雾剂或栓剂通过粘膜进行施用。用于这种施用方式的合适制剂是众所周知的并且通常包括促进跨膜转移的表面活性剂。这种表面活性剂通常来源于类固醇或阳离子脂质，如N-[1-(2,3-二油酰基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)或诸如胆固醇半琥珀酸酯、磷脂酰甘油等的各种化合物。

对于治疗应用，将本公开的治疗有效量的治疗性融合肽施用至对象。“治疗有效量”是足以产生可测量反应(例如，肿瘤消退)的治疗性组合物的量。本发明的治疗性组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便施用有效实现特定对象的所需治疗反应的一定量的活性化合物。选择的剂量水平将取决于多种因素，包括治疗性组合物的活性、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、肿瘤大小和寿命、感染以及被治疗对象的身体状况和既往病史。在一些实施方式中，施用最小剂量，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下逐步加大剂量。治疗有效剂量的确定和调整，以及评估何时和如何进行这种调整，是医学领域普通技术人员已知的。

根据有效治疗症状或疾病的需要，给药频率可以是每天一次、两次、三次或更多次或者每周或每月一次、两次、三次或更多次。在某些实施方式中，给药频率可以是每天一次、两次或三次。例如，可以每24小时、每12小时或每8小时给药一剂。在一个具体实施方式中，给药频率可以是每天两次。

在任何前述实施方式中，可以以每患者体重约0.1μg/Kg至约50μg/Kg本公开的多肽的剂量施用该药物组合物。作为进一步的例子，但不限于，可以以每患者体重约0.1μg/Kg至约50μg/Kg、约0.1μg/Kg至约25μg/Kg、约0.1μg/Kg至约10μg/Kg、约1μg/Kg至约50μg/Kg、约1μg/Kg至约25μg/Kg、约1μg/Kg至约10μg/Kg、约10μg/Kg至约50μg/Kg、约25μg/Kg至约μg/Kg、约0.1μg/Kg、约0.5μg/Kg、约1μg/Kg、约5μg/Kg、约10μg/Kg、约15μg/Kg、约20μg/Kg、约25μg/Kg、约30μg/Kg、约35μg/Kg、约40μg/Kg、约45μg/Kg或约50μg/Kg本公开的多肽的剂量施用该药物组合物。

治疗持续时间的范围可以从一次性施用单一剂量至终生的治疗过程。治疗持续时间可以根据并且将根据对象和要治疗的癌症而变化。例如，治疗持续时间可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。或者，治疗持续时间可以是1周、2周、3周、4周、5周或6周。或者，治疗持续时间可以是1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月。在又一个实施方式中，治疗持续时间可以是1年、2年、3年、4年、5年或大于5年。还预期施用可以在一段时间是频繁的，然后施用可以在一段时间是间歇的。例如，治疗持续时间可以是5天，然后9天不治疗，然后治疗5天。

与疾病本身相关的治疗施用时间和治疗持续时间将取决于病例周围的情况。治疗可以立即开始，例如在诊断时开始，或者治疗可以在手术后开始。治疗可以在医院或诊所本地开始，也可以在出院后或在门诊就诊后开始。

实施例

在以下实施例中，名称E0、E1、E2和E3是指下表中的构建体，这些构建体还在图5A至图5E中示意性地描绘并且具有如下公开的序列。这些构建体是使用本领域公知的标准方法在计算机上设计的。在DNA合成之前对最终序列进行密码子优化，然后在CHO细胞中表达，并通过镍层析和pH为7的PBS缓冲液交换从培养基中纯化。

实施例1-抗EGFR双特异性融合蛋白的结合亲和力

设计了四种具有不同免疫靶向部分的构建体：(E0)OMCP，一种病毒NKG2D配体；(E1)抗NKG2D抗体KYK1的单链可变片段(scFv)；(E2)抗NKG2D抗体KYK2的scFv；或作为阳性对照的(E3)抗CD3抗体OKT3的scFv。每个免疫靶向结构域通过甘氨酸-丝氨酸接头连接到抗EGFR抗体西妥昔单抗的scFv。之所以选择西妥昔单抗进行这些概念验证研究，是因为它是专利保护到期的，并且已在一系列肿瘤模型中建立了双特异性治疗功能。

图5A至图5D描绘了设计和测试的scFv构建体。具体地，图5A描绘了包含SEQ IDNO:16

(DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHHHH)所示的氨基酸序列的双特异性融合蛋白。图5A中的融合蛋白包含通过包含氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO:37)的接头而与CD3 scFv偶联的针对EGFR的抗体的scFv(西妥昔单抗-SEQ ID NO:14)，其中CD3 scFv包含氨基酸序列SEQ ID NO:17(DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK)，并且在c末端包括组氨酸标签(HHHHHHHH(SEQ ID NO:38))。

具体地，图5B描绘了包含SEQ ID NO:18(DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSHKLAFNFNLEINGSDTHSTVDVYLDDSQIITFDGKDIRPTIPFMIGDEIFLPFYKNVFSEFFSLFRRVPTSTPYEDLTYFYECDYTDNKSTFDQFYLYNGEEYTVKTQEATNKNMWLTTSEFRLKKWFDGEDCIMHLRSLVRKMEDSKRNTGHHHHHHHH)所示的氨基酸序列的双特异性融合蛋白。图5B的融合蛋白包含通过包含三个重复的氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO:37)的接头而与OMCP(SEQ ID NO:1)偶联的针对EGFR的抗体的scFv(西妥昔单抗-SEQ ID NO:14)，并且在c末端包括组氨酸标签(HHHHHHHH(SEQ IDNO:38))。

具体地，图5C描绘了包含SEQ ID NO:19(DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVLHHHHHHHH)所示的氨基酸序列的双特异性融合蛋白。图5C的融合蛋白包含通过氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO:37)的接头而与KYK-2(SEQ ID NO:11)偶联的针对EGFR的抗体的scFv(西妥昔单抗-SEQ ID NO:14)，并且在c末端包括组氨酸标签(HHHHHHHH(SEQ ID NO:38))。

具体地，图5D描绘了包含SEQ ID NO:20(DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRFGYYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQPSSVSVAPGETARIPCGGDDIETKSVHWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRPSGIPERFFGSNSGNTATLSISRVEAGDEADYYCQVWDDNNDEWVFGGGTQLTVLHHHHHHHH)所示的氨基酸序列的双特异性融合蛋白。图5D的融合蛋白包含通过氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO:37)的接头而与KYK-1(SEQ ID NO:9)偶联的针对EGFR的抗体的scFv(西妥昔单抗-SEQ ID NO:14)，并且在c末端包括组氨酸标签(HHHHHHHH(SEQ ID NO:38))。

为了确认所有双特异性抗体与其靶受体相互作用，使用表面等离子体共振测量它们的相互作用。ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad)用于确定蛋白质:蛋白质相互作用的动力学。所有实验均以100μl/min的流速、在25℃下并且在含有1X PBS、pH7.4、0.005％Tween 20的运行缓冲液中进行。GLC芯片用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化，用于蛋白质的胺偶联。在一个芯片上偶联了约1000RU的人NKG2D。将约500RU的每种双特异性抗体与第二个芯片偶联。然后使用乙醇胺淬灭未反应的酯。

在300nM至0.38nM的范围内确定双特异性抗体与人NKG2D结合。用10mM HCl脉冲再生人NKG2D结合。在9nM至0.1nM的范围内确定EGF-FcR与双特异性抗体的结合。使用ProteOn分析软件分析以下数据：使用1:1的朗格缪尔(langmuir)结合模型进行拟合的双特异性抗体:NKG2D曲线，以及使用二价结合模型进行拟合的EGFR-Fc:双特异性抗体曲线。

E0、E1、E2和E3的NKG2D结合的所得等离子体共振测量结果分别显示在图7A至图7D中，而E0、E1、E2和E3的EGFR-Fc结合的所得等离子体共振测量结果分别显示在图8A至图8D中。处理后的数据点以灰色显示，而拟合模型在图7A至图7D和图8A至图8D中以黑色显示。

如图7A至图7D所示，具有NKG2D靶向结构域(E0、E1和E2)的所有双特异性融合蛋白均以高亲和力结合NKG2D。正如预期的那样，E3没有与NKG2D结合，因为OKT3 scFv对CD3具有特异性。E0与NKG2D结合的K_D为0.17nM，类似于OMCP对NKG2D的亲和力(0.2nM)(Lazear etal.,Crystal Structure of the Cowpox Virus-Encoded NKG2D Ligand OMCP,J.Virol87(2):840-850(2013))。E2以35.7nM的K_D与NKG2D结合，类似于KYK1抗体对NKG2D的亲和力(27nM)(Kwong,Generation,affinity maturation,and characterization of ahumananti-human NKG2D monoclonal antibody with dual antagonistic and agonisticactivity,J.Mol.Bio.384(5):1143-1156(2008))。E1以比之前报道的更高的亲和力(KD：0.39nM对比5.8nM)结合。没有检测到质量传递或其他混杂变量。虽然亲和力比报道的要高，但E1的较高亲和力并不限制其在这些实验中的使用。

如图8A至图8D所示，所有含有EGFR靶向结构域的双特异性融合蛋白都以高亲和力结合EGFR-Fc。

所有双特异性抗体都含有来自西妥昔单抗的相同的对EGFR具有特异性的肿瘤靶向scFv。所有双特异性抗体都与EGFR-Fc结合。E1和E2以0.33nM和0.38nM的KD结合，这与公布的西妥昔单抗的亲和力(0.4nM)非常一致。E0和E3以比预期更高的表观亲和力与EGFR-Fc结合，尽管两个传感图都显示了质量传递的证据，这限制了对这些测量亲和力的置信度。在没有质量传递限制的情况下，E0和E3的亲和力预计与西妥昔单抗、E1和E2相似。无论如何，在所有情况下，双特异性抗体都显示出与其预期受体的高亲和力结合。因此验证了双特异性抗体具有预期受体靶向性。

实施例2-抗EGFR双特异性融合蛋白的体外细胞毒性

在有限稀释的测试剂或阴性对照的存在下，将来自非吸烟者供体的人PBMC(AllCells，冷冻小瓶)与MDA-MB-231乳腺癌细胞以10:1的比例在96孔板中铺板。测定培养基是含有50μM的β-巯基乙醇和5％热灭活FBS的RPMI培养基。使MDA-MB-231细胞在标准培养基(高糖DMEM，10％热灭活FBS)中生长至70％至80％融合，然后再开始测定，并使用Accutase收集以保存表面蛋白表达。使细胞孵育48小时，然后成像。去除所有培养基并用200μL PBS洗涤孔3次以去除免疫细胞，然后用100μL PBS和100μL CellTiterGlo2.0(Promega)在黑暗中振摇10分钟，并根据制造商的说明测量荧光素酶产量，荧光素酶产量与活细胞数量直接相关。与测试剂阴性对照比较，报告所有计算。

图9示出了每次处理的细胞活力随浓度的变化。

图10、图11和图13分别示出了每组的1×10^-8M、1×10^-9M和1×10^-10M处理的细胞活力。

图12示出了阴性对照(没有添加构建体)和接受1nM双特异性融合蛋白的处理组的细胞图像。

如图9至图11和图13所示，E0(OMCP-EGFR)和E3(OKT3-EGFR)在PBMC存在下均显著降低了细胞活力，表明了OMCP在诱导细胞毒性方面的效率与抗CD3相似或略高。有趣的是，抗NKG2D抗体KYK1和KYK2在PBMC存在下不会显著影响细胞活力。

如图12所示，阴性对照示出了覆盖有PBMC细胞的MDA-MB-231细胞的广泛生长。抗NKG2D双特异性物(KYK1-EGFRscFv(E1)和KYK2-EGFRscFv(E2))似乎几乎没有影响，但OMCP-EGFR scFv(E0)(也与NKG2D结合)导致MDA-MB-231细胞的显著清除和免疫细胞活化簇的产生。抗CD3双特异性物(OKT3-EGFR scFv(E3))也导致MDA-MB-231细胞的清除，但免疫活化簇的存在减少。

正如预期的那样，含有抗CD3的构建体OKT3-EGFR诱导的MDA-MB-231细胞死亡与构建体浓度呈负相关。然而，注意到NKG2D结合构建体之间存在差异。包含KYK1和KYK2抗NKG2D抗体的构建体没有诱导显著的细胞死亡，而OMCP-EGFR构建体诱导的细胞死亡相较于对照OKT3-EGFR构建体相似或略好。孔的可视化显示在OMCP-EGFR孔中显著的免疫细胞簇形成，表明了细胞活化，而在KYK1-EGFR或KYK2-EGFR孔中则没有，这支持了细胞活力测定结果。这些数据表明，尽管与相同的NKG2D受体结合，但OMCP-EGFR独特地增强了PBMC靶细胞死亡。

实施例3-抗EGFR双特异性融合蛋白的体外细胞毒性

在有限稀释的测试剂(E0、E1、E2和E3)或阴性对照的存在下，将新鲜的人非吸烟者PBMC与A549肺癌细胞以5:1的比例在96孔板中铺板。用Cell trace violet(CTV)染料(ThermoFischer)标记靶细胞，然后与PBMC孵育过夜，随后对细胞活力进行流式细胞术分析。测试剂是双特异性蛋白E0、E1、E2和E3，它们具有抗EGFR scFv(源自Cituximab)和免疫特异性结构域，通过ser-gly接头连接至OMCP(E0)、KYK1抗NKG2D scFv(E1)、KYK2抗NKG2DscFv(E2)或OKT3抗CD3 scFv(E3)，如上所述。

图14至图16分别示出了在1×10^-8M、1×10^-9M和1×10^-10M浓度的测试剂下得到的细胞杀伤数据。

如图14至图16所示，OMCP(与NKG2D结合)和OKT3(与CD3结合)双特异性测试剂(分别为E0和E3)在低至1pM(10^-12M)的浓度下可测量地增加了A549细胞死亡。然而，抗NKG2D结合构建体(KYK1-EGFR(E1)和KYK2-EGFR(E2))不会单独对PBMC细胞产生可测量的效果。

这里的数据表明OMCP-EGFR双特异性物将对A549细胞的PBMC杀伤增强到相较于抗CD3 OKT3-EGFR对照相似或更大的程度。然而，NKG2D结合KYK1-EGFR和KYK2-EGFR构建体不会诱导显著的细胞杀伤。这些数据与使用替代测定形式进行的MDA-MB-231细胞杀伤分析中所看到的数据一致，表明了该结果并不孤立于单个细胞系或单种测量技术。

实施例4：具有分离的NK和CD8⁺T细胞的抗EGFR双特异性融合蛋白的体外细胞毒性

使用标准磁珠分离试剂盒(Miltenyibiotec公司)将新鲜的人非吸烟者PBMC纯化为NK或CD8⁺T细胞级分。NK或CD8⁺T细胞以一定浓度铺板，旨在重复如上所述的其相对比例为5:1效靶比的大批PBMC测定。因此，构成PBMC的20％的NK细胞以1:1的效靶比孵育，而占PBMC的50％的CD8⁺T细胞以2.5:1的效靶比孵育。用Cell trace violet(CTV)(ThermoFischer)染料标记靶标A549细胞，然后在双特异性抗体存在或不存在的情况下，与NK或CD8⁺T细胞孵育过夜，随后进行细胞活力的流式细胞术分析。

E0、E1、E2和E3以10^-10M(100pM)的浓度进行测试。

图17示出了测试的每个构建体、以及仅A549、以及A549加NK细胞对照的NK细胞杀伤。

图18示出了测试的每个构建体、以及仅A549、以及A549加NK细胞对照的T细胞杀伤。

正如预期的那样，每个NKG2D结合双特异性物(OMCP-EGFR、KYK1-EGFR和KYK2-EGFR)都因为能够与活化受体NKG2D结合而增强了NK细胞的抗肿瘤细胞毒性。正如预期的那样，与T细胞受体CD3结合的OKT3-EGFR构建体对NK细胞功能没有显著影响，但确实增强了T细胞的细胞毒性。

活化受体NKG2D也表达在CD8⁺T细胞(以及其他细胞群，如NKT细胞和γδT细胞)上(Roulet DH,Roles of the NKG2D Immunoreceptor and its Ligands,Nature ReviewImmunology 3:781-790(2003))。这种在多种类型的细胞毒性淋巴细胞上的广泛表达使之成为以在能够杀伤肿瘤的多种细胞类型中间广泛活化细胞毒性为目标的独特配体。有趣的是，使用纯化的CD8⁺T细胞培养物，OMCP-EGFR构建体显著增强了CD8⁺T细胞的细胞毒性，甚至超过了抗CD3 OKT3-EGFR对照的功能性。与单独的CD8⁺T细胞相比，使用KYK1-EGFR(E1)或KYK2-EGFR(E2)双特异性接合剂并没有增强细胞毒性。综上所述，我们可以得出结论，含有OMCP的构建体的功能增强可能是由于：1)OMCP与NKG2D的高亲和力结合；2)加之缺乏受体内化(参见Campbell JA,Zoonotic orthopoviruses encode a high-affinity antagonistof NKG2D,J.Exp.Med.204(6):1311-1317(2007))。然而我们的数据指出：1)由于不仅有T细胞而且有NK细胞的参与，使用抗NK2D靶向允许比CD3靶向更好地杀死靶标；2)与使用已建立的KYK1和KYK2抗体相比，使用OMCP改善了NKG2D双特异性靶向。

实施例5：体外细胞因子释放分析

细胞因子释放综合征的副作用使抗CD3双特异性物的使用变得复杂(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6003181/#)。由于CD3抗体形式的T细胞受体的接合和交联可以全身性地活化所有T细胞(CD4+或CD8⁺)，而不仅仅是在肿瘤部位，因此细胞因子释放综合征或细胞因子风暴导致了意想不到的发病和死亡。从理论上讲，NKG2D的接合应该会导致这种并发症的水平较低，因为NKG2D在T细胞上充当共刺激受体，而不是充当主要刺激活化受体。此外，NKG2D表达在记忆和效应CD8⁺T细胞上最为突出。因此，它的接合应该不会导致对幼稚T细胞和未经抗原刺激的T细胞(https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012635)或CD4⁺T细胞的广泛刺激。与使用二价抗NKG2D抗体相比，使用单体OMCP提供了又一个优势。由于并入我们提出的双特异性构建体中的OMCP是一种单体，所以它不能交联NKG2D。由于这个原因，只有在肿瘤接合时，即一旦两个或更多个肿瘤靶向结构域与肿瘤配体接合并使双特异性物的OMCP部分及其接合的NKG2D受体靠近时，含有OMCP的双特异性物的NKG2D活化才发生。综合考虑这两个因素，应提供基于以下的安全措施：1)对肿瘤无反应性的幼稚T细胞的非特异性和广泛活化缺乏；2)肿瘤床外T细胞活化缺乏；3)在没有基于肿瘤的配体的情况下的NKG2D交联缺乏。

为了评估淋巴细胞活化和细胞因子释放，体外研究了在存在或不存在A549肿瘤靶标的情况下，大量PBMC与具有不同免疫细胞靶向结构域的EGFR靶向双特异性物(OMCP(E0)、KYK1抗NKG2D scFv(E1)、KYK2抗NKG2D scFv(E2)或OKT3抗CD3 scFv(E3))一起孵育所导致的细胞因子的产生。

将500000个新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)(通过Ficoll富集从新鲜血液中分离)在圆底96孔板中在150ul由RPMI、10％FCS和1％青霉素/链球菌抗生素组成的培养基中铺板。对于一些培养物，将100000个A549肺癌细胞添加到PBMC，而其他PBMC培养物没有肿瘤细胞。然后将具有不同免疫细胞靶向结构域的EGFR靶向双特异性体(OMCP(E0)、KYK1抗NKG2D scFv(E1)、KYK2抗NKG2D scFv(E2)或OKT3抗CD3 scFv(E3))添加到培养物(含肿瘤和不含肿瘤)中，使最终浓度为10^-6M或10^-8M。培养24小时后，将平板减速旋转以聚集团粒并收集无细胞培养基。根据制造商方案(ThermoFischer Scientific)，使用Luminex测定法测量多个细胞因子浓度。

图19A至图19D示出了用单独的PMBC或用PBMC和肿瘤细胞针对在不同浓度下的各种构建体测试的细胞因子产生，使用单独的PMBC和PBMC与肿瘤细胞作为对照。

如图19A至图19D所示，在肿瘤细胞存在或不存在的情况下，E3或含有OKT3的构建体导致血清细胞因子释放，支持了细胞毒性淋巴细胞的非特异性全局活化作为细胞因子风暴副作用的原因。另一方面，含有E0或OMCP的构建体仅在与肿瘤一起培养时才会导致血清细胞因子释放。这些数据支持我们的假设，即E0(含有OMCP的双特异性构建体)导致的细胞因子释放和淋巴细胞活化仅发生在肿瘤部位，因此支持我们应该不会获得非特异性活化的观点，并因此可以避免双特异性-细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的主要副作用(***＝p＜.001；**p＜.01)。

实施例6–体外细胞毒性试验

本实施例描述了OMCP肿瘤靶向双特异性疗法的体外测试。具体而言，该实施例将证明与双特异性肿瘤靶标相关的针对人靶细胞系的人细胞毒性免疫细胞反应的改进。

将从供体收集新鲜人淋巴细胞并纯化，并按以下比例以一式三份接种靶细胞：无靶细胞、15.6:1、31.25:1、62.5:1、125:1、250:1、500:1。4小时后，将通过流式细胞术评估活靶细胞与死靶细胞的比率。淋巴细胞和靶细胞将另外与以下浓度的相关蛋白质构建体：10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL或盐水对照一起孵育。除了下表中列出的构建体之外，还将针对所有细胞系测试由OMCP和非靶向抗体(OMCP-NT)构建的融合蛋白。

潜在结果包括，发现新收集的具有肿瘤的人PBMC的细胞毒活性因一种或多种OMCP双特异性构建体的存在而增强。具体而言，我们预期发现淋巴细胞的细胞毒活性与肿瘤细胞表面上抗体靶标的表达成比例地增加。此外，我们预期发现与盐水对照相比，OMCP-NT既不增强也不抑制人淋巴细胞对靶细胞的功能。

使用的双特异性构建体和细胞系如下：

实施例7-用OMCP-抗-PMEL或OMCP-抗-EGFR治疗的小鼠中的黑色素瘤肿瘤的生长和存活

将使用总共30只6至9周龄的C57Bl/6小鼠。小鼠将在侧腹皮下注射B16黑色素瘤，每只小鼠注射1×10⁶个细胞。将在5天后开始治疗，此时肿瘤已生长到足以可见和可测量的程度。获取初始肿瘤大小和小鼠体重，并将小鼠随机分成10只小鼠的组，使组与组之间初始肿瘤大小和小鼠体重相似。治疗组如下：第1组：盐水对照，第2组：OMCP-NT治疗，第3组：OMCP-抗-PMEL治疗，第4组：OMCP-抗-EGFR。所有小鼠将每周治疗2次，持续3周，总共5剂。第1组：小鼠将被腹膜内(intraperitoneally，i.p.)施用200μL盐水用于所有治疗，作为阴性对照。第2组：小鼠将被腹膜内施用200μg OMCP-NT的200μL盐水溶液。第3组：小鼠将被腹膜内施用200μg OMCP-抗-PMEL的200μL盐水溶液。第4组：小鼠将被腹膜内施用200μg OMCP-抗-EGFR的200μL盐水溶液。

在治疗期间每天，将通过卡尺测量法测量所有肿瘤，以及测量小鼠体重。治疗过程完成后，每周测量三次小鼠体重和肿瘤。将在整个研究期间监测小鼠的痛苦迹象或治疗性治疗的其他效果。所有小鼠都将在最大肿瘤直径为20mm的情况下被安乐死，并将肿瘤保留用于后续分析。任何因已知或未知原因过早死亡的小鼠都将进行最终测量并尽快收集组织。

由于gp100(PMEL)和EGFR的高表达水平，这里选择了B16黑色素瘤细胞系。因此，潜在结果可能包括，发现与盐水对照组相比，OMCP-抗-PMEL治疗将显著减弱肿瘤生长并增加存活时间。我们将通过免疫组织化学进一步针对淋巴细胞浸润对剩余肿瘤进行分析。具体来说，我们将评估CD8+Teff细胞和NK细胞的肿瘤内浸润。此外，我们将通过TUNEL测定(Millipore ApopTag过氧化物酶原位细胞凋亡检测试剂盒，目录号S7100)评估细胞凋亡水平。潜在结果包括，发现用PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2进行治疗比盐水对照小鼠或wtIL2治疗的小鼠显著增加了CD8+Teff和NK细胞的肿瘤内浸润。

这些结果表明，与未治疗的小鼠相比，OMCP-抗-PMEL和OMCP-抗-EGFR对具有高靶标表达的肿瘤具有增强的治疗益处。通过使用OMCP将NK和CD8⁺T细胞特异性地接合到肿瘤表面，我们预期发现这些关键细胞群的肿瘤浸润和细胞毒性接合是显著的。

实施例8-双特异性Fc构建体的测试

将根据对scFv构建体(E0、E1、E2和E3)进行的所有前述实施例对以下Fc构建体进行测试。

应当理解，上述描述提供了本发明的实施方式，这些实施方式在不脱离本公开的精神的情况下可以变化和组合。就可以组合所公开的不同方面而言，本文公开了这样的组合。

序列表

<110> 克里尔治疗股份有限公司

<120> 使用正痘病毒主要组织相容性复合物（MHC）I类样蛋白（OMCP）和肿瘤特异性结合伴侣的双特异性融合蛋白

<130> P23518WO00

<140>

<141>

<150> 62/807,190

<151> 2019-02-18

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 152

<212> PRT

<213> Orthopoxvirus sp.

<400> 1

His Lys Leu Ala Phe Asn Phe Asn Leu Glu Ile Asn Gly Ser Asp Thr

1 5 10 15

His Ser Thr Val Asp Val Tyr Leu Asp Asp Ser Gln Ile Ile Thr Phe

20 25 30

Asp Gly Lys Asp Ile Arg Pro Thr Ile Pro Phe Met Ile Gly Asp Glu

35 40 45

Ile Phe Leu Pro Phe Tyr Lys Asn Val Phe Ser Glu Phe Phe Ser Leu

50 55 60

Phe Arg Arg Val Pro Thr Ser Thr Pro Tyr Glu Asp Leu Thr Tyr Phe

65 70 75 80

Tyr Glu Cys Asp Tyr Thr Asp Asn Lys Ser Thr Phe Asp Gln Phe Tyr

85 90 95

Leu Tyr Asn Gly Glu Glu Tyr Thr Val Lys Thr Gln Glu Ala Thr Asn

100 105 110

Lys Asn Met Trp Leu Thr Thr Ser Glu Phe Arg Leu Lys Lys Trp Phe

115 120 125

Asp Gly Glu Asp Cys Ile Met His Leu Arg Ser Leu Val Arg Lys Met

130 135 140

Glu Asp Ser Lys Arg Asn Thr Gly

145 150

<210> 2

<211> 150

<212> PRT

<213> Orthopoxvirus sp.

<400> 2

Gly His Lys Leu Ala Phe Asn Phe Asn Leu Glu Ile Asn Gly Ser Asp

1 5 10 15

Thr His Ser Thr Val Asp Val Tyr Leu Asp Asp Ser Gln Ile Ile Thr

20 25 30

Phe Asp Gly Lys Asp Ile Arg Pro Thr Ile Pro Phe Met Ile Gly Asp

35 40 45

Glu Ile Phe Leu Pro Phe Tyr Lys Asn Val Phe Ser Glu Phe Phe Ser

50 55 60

Leu Phe Arg Arg Val Pro Thr Ser Thr Pro Tyr Glu Asp Leu Thr Tyr

65 70 75 80

Phe Tyr Glu Cys Asp Tyr Thr Asp Asn Lys Ser Thr Phe Asp Gln Phe

85 90 95

Tyr Leu Tyr Asn Gly Glu Glu Tyr Thr Val Lys Thr Gln Glu Ala Thr

100 105 110

Asn Lys Asn Met Trp Leu Thr Thr Ser Glu Phe Arg Leu Lys Lys Trp

115 120 125

Phe Asp Gly Glu Asp Cys Ile Met His Leu Arg Ser Leu Val Arg Lys

130 135 140

Met Glu Asp Ser Lys Arg

145 150

<210> 3

<211> 150

<212> PRT

<213> Orthopoxvirus sp.

<400> 3

His Lys Leu Val His Tyr Phe Asn Leu Lys Ile Asn Gly Ser Asp Ile

1 5 10 15

Thr Asn Thr Ala Asp Ile Leu Leu Asp Asn Tyr Pro Ile Met Thr Phe

20 25 30

Asp Gly Lys Asp Ile Tyr Pro Ser Ile Ala Phe Met Val Gly Asn Lys

35 40 45

Leu Phe Leu Asp Leu Tyr Lys Asn Ile Phe Val Glu Phe Phe Arg Leu

50 55 60

Phe Arg Val Ser Val Ser Ser Gln Tyr Glu Glu Leu Glu Tyr Tyr Tyr

65 70 75 80

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<213> Artificial Sequence

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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic

8xHis tag

<400> 38

His His His His His His His His

1 5

Claims (69)

1.一种多肽，所述多肽包含第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域包含与SEQID NO:1、2或3具有至少80％同源性的第一氨基酸序列并且能够以约0.01nM至约1000nM的结合亲和力与人NKG2D结合，以及其中所述第二结构域包含能够与肿瘤细胞上的肽结合的第二氨基酸序列，其中，所述肽对所述肿瘤细胞具有特异性或在所述肿瘤细胞上相比于与所述肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

2.根据权利要求1所述的多肽，还包含第三结构域，其中所述第三结构域是抗体Fc结构域。

3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述抗体Fc结构域包含阻止与CD16结合的突变。

4.根据权利要求1所述的多肽，其中所述第二结构域是衍生自抗体的单链可变片段。

5.根据权利要求1所述的多肽，还包含第三结构域，其中所述第三结构域是接头并且位于所述第一结构域和所述第二结构域之间。

6.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽不包含抗体Fc结构域。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述肽选自由以下组成的组：ERBB2、CD19、EPCAM、MS4A1、FOLH1、CEACAM5、PMEL、CLEC12A、KDR、EGFR、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、二唾液酸神经节苷脂GD2、CD20、CD123、CD33、BCMA、CD38、B7H3/CD276、GPA33、SSTR2、GPC3和CDH30。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述肽是EGFR。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:14。

10.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2或3至少90％同源。

11.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列选自由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组。

12.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述肿瘤细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、肺癌细胞、淋巴瘤细胞、白血病细胞、结肠癌细胞、肾细胞癌、胰腺癌细胞和肝细胞癌细胞。

13.一种多肽，所述多肽包含第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域包含与SEQ ID NO:1的第48位至第67位和第110位至第147位氨基酸具有至少80％同源性的第一氨基酸序列，以及其中所述第二结构域具有能够与肿瘤细胞上的肽结合的第二氨基酸序列，其中，所述肽对所述肿瘤细胞具有特异性或在所述肿瘤细胞上相比于与所述肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

14.根据权利要求13所述的多肽，还包含第三结构域，其中所述第三结构域是抗体Fc结构域。

15.根据权利要求14所述的多肽，其中所述抗体Fc结构域包含阻止与CD16结合的突变。

16.根据权利要求13所述的多肽，其中所述第二结构域是衍生自抗体的单链可变片段。

17.根据权利要求13所述的多肽，还包含第三结构域，其中所述第三结构域是接头并且位于所述第一结构域和所述第二结构域之间。

18.根据权利要求13所述的多肽，其中所述多肽不包含抗体Fc结构域。

19.根据权利要求13至18中任一项所述的多肽，其中所述肽选自由以下组成的组：ERBB2、CD19、EPCAM、MS4A1、FOLH1、CEACAM5、PMEL、CLEC12A、KDR、EGFR、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、二唾液酸神经节苷脂GD2、CD20、CD123、CD33、BCMA、CD38、B7H3/CD276、GPA33、SSTR2、GPC3和CDH30。

20.根据权利要求13至18中任一项所述的多肽，其中所述肽是EGFR。

21.根据权利要求13至18中任一项所述的多肽，其中所述第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:14。

22.根据权利要求13至18中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列与SEQ IDNO:1的第48位至第67位和第110位至第147位氨基酸至少90％同源。

23.根据权利要求13至18中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列与SEQ IDNO:1的第48位至第67位和第110位至第147位氨基酸至少95％同源。

24.根据权利要求13至18中任一项所述的多肽，其中所述肿瘤细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、肺癌细胞、淋巴瘤细胞、白血病细胞、结肠癌细胞、肾细胞癌、胰腺癌细胞和肝细胞癌细胞。

25.一种多肽，所述多肽包含第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域包含与SEQ ID NO:2的第49位至第68位和第111位至第148位氨基酸具有至少80％同源性的第一氨基酸序列，以及其中所述第二结构域具有能够与肿瘤细胞上的肽结合的第二氨基酸序列，其中，所述肽对所述肿瘤细胞具有特异性或在所述肿瘤细胞上相比于与所述肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

26.根据权利要求25所述的多肽，还包含第三结构域，其中所述第三结构域是抗体Fc结构域。

27.根据权利要求26所述的多肽，其中所述抗体Fc结构域包含阻止与CD16结合的突变。

28.根据权利要求25所述的多肽，其中所述第二结构域是衍生自抗体的单链可变片段。

29.根据权利要求25所述的多肽，还包含第三结构域，其中所述第三结构域是接头并且位于所述第一结构域和所述第二结构域之间。

30.根据权利要求25所述的多肽，其中所述多肽不包含抗体Fc结构域。

31.根据权利要求25至30中任一项所述的多肽，其中所述肽选自由以下组成的组：ERBB2、CD19、EPCAM、MS4A1、FOLH1、CEACAM5、PMEL、CLEC12A、KDR、EGFR、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、二唾液酸神经节苷脂GD2、CD20、CD123、CD33、BCMA、CD38、B7H3/CD276、GPA33、SSTR2、GPC3和CDH30。

32.根据权利要求25至30中任一项所述的多肽，其中所述肽是EGFR。

33.根据权利要求25至30中任一项所述的多肽，其中所述第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:14。

34.根据权利要求25至30中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列与SEQ IDNO:2的第49位至第68位和第111位至第148位氨基酸至少90％同源。

35.根据权利要求25至30中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列与SEQ IDNO:2的第49位至第68位和第111位至第148位氨基酸至少95％同源。

36.根据权利要求25至30中任一项所述的多肽，其中所述肿瘤细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、肺癌细胞、淋巴瘤细胞、白血病细胞、结肠癌细胞、肾细胞癌、胰腺癌细胞和肝细胞癌细胞。

37.一种多肽，所述多肽包含第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域包含与SEQ ID NO:3的第48位至第66位和第111位至第148位氨基酸具有至少80％同源性的第一氨基酸序列，以及其中所述第二结构域具有能够与肿瘤细胞上的肽结合的第二氨基酸序列，其中，所述肽对所述肿瘤细胞具有特异性或在所述肿瘤细胞上相比于与所述肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

38.根据权利要求37所述的多肽，还包含第三结构域，其中所述第三结构域是抗体Fc结构域。

39.根据权利要求38所述的多肽，其中所述抗体Fc结构域包含阻止与CD16结合的突变。

40.根据权利要求37所述的多肽，其中所述第二结构域是衍生自抗体的单链可变片段。

41.根据权利要求37所述的多肽，还包含第三结构域，其中所述第三结构域是接头并且位于所述第一结构域和所述第二结构域之间。

42.根据权利要求37所述的多肽，其中所述多肽不包含抗体Fc结构域。

43.根据权利要求37至42中任一项所述的多肽，其中所述肽选自由以下组成的组：ERBB2、CD19、EPCAM、MS4A1、FOLH1、CEACAM5、PMEL、CLEC12A、KDR、EGFR、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、二唾液酸神经节苷脂GD2、CD20、CD123、CD33、BCMA、CD38、B7H3/CD276、GPA33、SSTR2、GPC3和CDH30。

44.根据权利要求37至42中任一项所述的多肽，其中所述肽是EGFR。

45.根据权利要求37至42中任一项所述的多肽，其中所述第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:14。

46.根据权利要求37至42中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列与SEQ IDNO:3的第48位至第66位和第111位至第148位氨基酸至少90％同源。

47.根据权利要求37至42中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列与SEQ IDNO:3的第48位至第66位和第111位至第148位氨基酸至少95％同源。

48.根据权利要求37至42中任一项所述的多肽，其中所述肿瘤细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、肺癌细胞、淋巴瘤细胞、白血病细胞、结肠癌细胞、肾细胞癌、胰腺癌细胞和肝细胞癌细胞。

49.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列是聚乙二醇化的。

50.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列进一步包含PEG-10K、PEG-20K或PEG-40K。

51.根据权利要求13至18中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列是聚乙二醇化的。

52.根据权利要求13至18中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列进一步包含PEG-10K、PEG-20K或PEG-40K。

53.根据权利要求25至30中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列是聚乙二醇化的。

54.根据权利要求25至30中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列进一步包含PEG-10K、PEG-20K或PEG-40K。

55.根据权利要求37至42中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列是聚乙二醇化的。

56.根据权利要求37至42中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列进一步包含PEG-10K、PEG-20K或PEG-40K。

57.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，还包含具有能够与所述肿瘤细胞上的第二肽结合的第三氨基酸序列的第三结构域，其中，所述第二肽对所述肿瘤细胞具有特异性或在所述肿瘤细胞上相比于与所述肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

58.根据权利要求13至18中任一项所述的多肽，还包含具有能够与所述肿瘤细胞上的第二肽结合的第三氨基酸序列的第三结构域，其中，所述第二肽对所述肿瘤细胞具有特异性或在所述肿瘤细胞上相比于与所述肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

59.根据权利要求25至30中任一项所述的多肽，还包含具有能够与所述肿瘤细胞上的第二肽结合的第三氨基酸序列的第三结构域，其中，所述第二肽对所述肿瘤细胞具有特异性或在所述肿瘤细胞上相比于与所述肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

60.根据权利要求37至42中任一项所述的多肽，还包含具有能够与所述肿瘤细胞上的第二肽结合的第三氨基酸序列的第三结构域，其中，所述第二肽对所述肿瘤细胞具有特异性或在所述肿瘤细胞上相比于与所述肿瘤细胞具有相同组织来源的非肿瘤细胞过量表达。

61.一种药物组合物，包含权利要求1至60中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体。

62.一种用于治疗对象的肿瘤的方法，包括向对象施用治疗有效量的权利要求61所述的药物组合物。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述药物组合物包含每患者体重约0.1μg/Kg至约50μg/Kg的所述多肽。

64.根据权利要求13至18中任一项所述的多肽，其中所述第一结构域包含SEQ ID NO:1。

65.根据权利要求25至30中任一项所述的多肽，其中所述第一结构域包含SEQ ID NO:2。

66.根据权利要求37至42中任一项所述的多肽，其中所述第一结构域包含SEQ ID NO:3。

67.根据权利要求13至18中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列能够以约0.01nM至约1000nM的结合亲和力与人NKG2D结合。

68.根据权利要求25至30中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列能够以约0.01nM至约1000nM的结合亲和力与人NKG2D结合。

69.根据权利要求37至42中任一项所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列能够以约0.01nM至约1000nM的结合亲和力与人NKG2D结合。

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