ES2931223T3 - Anticuerpo de un solo dominio para CTLA4 y proteína procedente del mismo - Google Patents

Anticuerpo de un solo dominio para CTLA4 y proteína procedente del mismo Download PDF

Info

Publication number
ES2931223T3
ES2931223T3 ES17798775T ES17798775T ES2931223T3 ES 2931223 T3 ES2931223 T3 ES 2931223T3 ES 17798775 T ES17798775 T ES 17798775T ES 17798775 T ES17798775 T ES 17798775T ES 2931223 T3 ES2931223 T3 ES 2931223T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
ctla4
antibody
binding protein
seq
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17798775T
Other languages
English (en)
Inventor
Ting Xu
Xiaoxiao Wang
Jie Li
Haiyan Wu
Li Gao
Qian Chu
Yu Bai
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Alphamab Co Ltd
Original Assignee
Suzhou Alphamab Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Alphamab Co Ltd filed Critical Suzhou Alphamab Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2931223T3 publication Critical patent/ES2931223T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

Se proporciona un anticuerpo para CTLA-4. El anticuerpo es un anticuerpo de dominio único de cadena pesada única (VHH) capaz de unirse específicamente a CTLA-4. También se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo CTLA-4 y un uso del anticuerpo para preparar fármacos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo de un solo dominio para CTLA4 y proteína procedente del mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere al campo de la biología médica y divulga un anticuerpo de un solo dominio y proteínas procedentes del mismo contra CTLA4. En particular, la presente invención divulga una proteína de unión a CTLA4 y el uso de la misma, en especial, el uso para tratar y/o prevenir enfermedades relacionadas con el CTLA4, tales como un tumor.
Antecedentes
Los animales de Camelidae, como los camellos o las alpacas, son capaces de producir un anticuerpo de cadena pesada que de forma natural carece de la cadena ligera. La molécula del anticuerpo de cadena pesada contiene sólo una región variable de cadena pesada (VHH) y dos regiones CH2 y CH3 habituales, pero tiene la función completa de unión a antígeno y no es tan fácil de agregar como los fragmentos de anticuerpos monocatenarios (scFv) genomanipulados. Y lo que es más importante, el dominio VHH expresado de manera recombinante tiene una estabilidad estructural y una actividad de unión a antígeno comparables a las del anticuerpo de cadena pesada original, y es la unidad más pequeña conocida actualmente que puede unirse al antígeno diana, llamado nanocuerpo o anticuerpo de cadena pesada de un solo dominio. Debido a sus propiedades estructurales especiales, el anticuerpo de cadena pesada de un solo dominio tiene las ventajas de los anticuerpos tradicionales y de los fármacos de moléculas pequeñas, y supera las deficiencias del anticuerpo tradicional, tales como el largo ciclo de desarrollo, la baja estabilidad y las duras condiciones de almacenamiento, lo que representa la dirección del desarrollo de una nueva generación de terapias con anticuerpos.
Los antígenos asociados a tumores expresados por las células tumorales son la base para producir una respuesta inmunitaria eficaz. Sin embargo, cuando los antígenos se unen a las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, del inglés major histocompatibility complex) en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC, del inglés antigen-presenting cells) y se presentan, se necesitan señales coestimuladoras para promover la activación de los linfocito T efectores. Los estudios han demostrado que muchos tumores pueden escapar del propio sistema inmunitario del paciente, en parte debido a la falta de señales coestimuladoras para activar completamente los linfocitos T y muy probablemente debido a la inmunosupresión inducida por los linfocitos T reguladores (Treg). La unión de CD80 o CD86 en las células presentadoras de antígenos a CD28 en los linfocitos T es una señal coestimuladora clave. El antígeno 4 asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA4) humano es un regulador negativo de la expresión de linfocitos T y tiene una mayor afinidad por CD80 y CD86. Bloquea la señal coestimuladora de CD28 y, al mismo tiempo, activa la ruta reguladora negativa de los linfocitos T. El efecto inmunosupresor de CTLA4 desempeña un papel importante en la limitación de la respuesta autoinmunitaria. Sin embargo, en la respuesta inmunitaria al tumor, el mecanismo de inhibición mediado por CTLA4 suele ser una de las razones por las que las células tumorales pueden escapar del sistema inmunitario. Por lo tanto, las respuestas antitumorales mediadas por linfocitos T pueden potenciarse mediante el bloqueo de la interacción de CTLA4 con CD80 o CD86.
Todavía hay una necesidad en la materia de anticuerpos anti-CTLA4, en especial, de un anticuerpo de cadena pesada de un solo dominio contra CTLA4, que pueda unirse a CTLA4 con elevada afinidad y bloquear la unión de CTLA4 a CD80.
El documento WO01/14424 divulga el anticuerpo contra CTLA4 10D1/ipilimumab. El documento WO01/14424 no divulga que el anticuerpo de la presente invención tenga una arquitectura proteica diferente y CDR diferentes que den lugar a propiedades mejoradas en comparación con el ipilimumab.
Breve descripción de la invención
Los presentes inventores han obtenido un anticuerpo de cadena pesada de un solo dominio (VHH) anti-CTLA4 con elevada especificidad, elevada afinidad y elevada estabilidad mediante el cribado con tecnología de presentación en fagos.
En un primer aspecto, la invención proporciona una proteína de unión a CTLA4 que comprende un dominio variable único de inmunoglobulina que se une de manera específica a CTLA4, comprendiendo dicho dominio variable único de inmunoglobulina la CDR1 expuesta en el SEQ ID n O: 25, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 26 y la CDR3 expuesta en el SEQ ID NO: 27.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de unión a CTLA4, y a un vector de expresión y a una célula hospedadora que contienen dicha molécula de ácido nucleico.
La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión a CTLA4 de la invención.
La presente invención se refiere además a un método para producir la proteína de unión a CTLA4 de la invención.
La presente invención se refiere además a la proteína de unión a CTLA4 y a la composición farmacéutica de la invención, para su uso en un método de prevención y/o tratamiento de enfermedades relacionadas con CTLA4.
Descripción de los dibujos
En la figura 1 se muestran las curvas de unión de los anticuerpos de cadena pesada de un solo dominio contra CTLA4 a la proteína del antígeno CTLA4-Fc.
En la figura 2 se muestran las curvas de bloqueo de los anticuerpos de cadena pesada de un solo dominio contra CTLA4 frente a la interacción CD80/CTLA4.
En la figura 3 se muestran las curvas de bloqueo de las proteínas de fusión de Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 frente a la interacción CD80/c TlA4.
En la figura 4 se muestra la alineación de secuencias de cinco variantes humanizadas (A) del anticuerpo n.° C27 y cuatro variantes humanizadas (B) del anticuerpo n.° C1.
En la figura 5 se muestran las curvas de unión de las proteínas de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 a CTLA4 (mediante ELISA).
En la figura 6 se muestran las curvas de unión de las proteínas de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 a CTLA4 (mediante ELISA).
En la figura 7 se muestran las curvas de bloqueo de las proteínas de fusión de Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 frente a la interacción CD80/CTLA4 (mediante ELISA competitivo).
En la figura 8 se muestran las curvas de unión de las proteínas de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 a CTLA4 (mediante ELISA competitivo).
En la figura 9 se muestra la capacidad de bloqueo de las proteínas de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 bivalentes o tetravalentes frente a la interacción CD80/CTLA4 (mediante un experimento de neutralización celular).
Figura 10. La especificidad de unión de las proteínas de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 a la proteína CTLA4 detectada mediante citometría de flujo.
En la figura 11 se muestra la unión de las proteínas de fusión Fc-anticuerpos de un solo dominio contra CTLA4 tetravalentes a la proteína CTLA4 de mono detectada mediante citometría de flujo.
En la figura 12 se muestra la activación de las PBMC por proteínas de fusión Fc-anticuerpos de un solo dominio contra CTLA4.
En la figura 13 se muestra la comparación de la activación de las PBMC mediante proteínas de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 bivalentes y tetravalentes.
En la figura 14 se muestra la activación de los linfocitos T CD4+ mediante las proteínas de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4.
En la figura 15 se muestra el efecto de inhibición in vivo de las proteínas de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 frente al tumor MC38 en ratones humanizados con CTLA4.
En la figura 16 se muestran las curvas de cambio de la concentración en plasma de las proteínas de fusión Fcanticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 bivalentes y tetravalentes en ratas a lo largo del tiempo.
En la figura 17 se muestran los parámetros farmacocinéticos de las proteínas de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 en ratas. En la figura 18 se muestra la estabilidad térmica de las proteínas de fusión Fcanticuerpo de un solo dominio contra CTLA4.
Descripción detallada
La divulgación técnica que se expone más adelante puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas. Los elementos de la divulgación que no están dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo, es decir, para situar la invención real reivindicada en un contexto técnico más amplio.
Definiciones
Salvo que se indique o defina de otro modo, todos los términos utilizados tienen su significado habitual en la materia, que resultarán evidentes para el experto. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales típicos, tales como Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2.a Ed.), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, Nueva York, (1990), y Roitt et al., "Immunology" (2.a Ed.), Gower Medical Publishing, Londres, Nueva York (1989), así como a los antecedentes generales citados en el presente documento. Además, a menos que se indique de otro modo, todos los métodos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen de manera específica en detalle se pueden realizar y se han realizado de manera conocida per se, como será evidente para el experto. Por ejemplo, se hace referencia de nuevo a los manuales típicos, a los antecedentes generales mencionados antes y a las referencias adicionales citadas en ellos.
A menos que se indique de otro modo, los términos intercambiables "anticuerpo" e "inmunoglobulina", ya sea que se utilicen en el presente documento para referirse a un anticuerpo de cadena pesada o a un anticuerpo habitual de 4 cadenas, se utilizan como términos generales para incluir tanto al anticuerpo de tamaño completo, las cadenas individuales del mismo, como a todas las partes, dominios o fragmentos del mismo (que incluyen, pero sin limitación, los dominios o fragmentos de unión a antígenos, tales como los dominios VHH o los dominios VH/VL, respectivamente). Además, el término "secuencia" como se utiliza en el presente documento (por ejemplo, en términos como "secuencia de inmunoglobulina", "secuencia de anticuerpos", "secuencia de un solo dominio variable", "secuencia VHH" o "secuencia proteica"), debe entenderse en general que incluye tanto la secuencia de aminoácidos pertinente como las secuencias de ácidos nucleicos o las secuencias de nucleótidos que codifican la misma, a menos que el contexto requiera una interpretación más limitada.
El término "dominio" (de un polipéptido o proteína), como se utiliza en el presente documento, se refiere a una estructura proteica plegada que tiene la capacidad de conservar su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. En general, los dominios son responsables de las propiedades funcionales individuales de las proteínas y, en muchos casos, pueden añadirse, eliminarse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de la función del resto de la proteína y/o del dominio.
La expresión "dominio de inmunoglobulina", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una región globular de una cadena de anticuerpo (tal como, por ejemplo, una cadena de un anticuerpo típico de 4 cadenas o de un anticuerpo de cadena pesada) o a un polipéptido que consiste esencialmente en dicha región globular. Los dominios de inmunoglobulina se caracterizan por conservar el pliegue de inmunoglobulina característico de las moléculas de anticuerpos, que consiste en un sándwich de 2 capas de unas 7 cadenas p antiparalelas dispuestas en dos hojas p, opcionalmente estabilizadas por un enlace disulfuro conservado.
La expresión "dominio variable de inmunoglobulina", como se utiliza en el presente documento, significa un dominio de inmunoglobulina que consiste esencialmente en cuatro "regiones marco" que se denominan en la materia y en lo sucesivo en el presente documento "región marco 1" o "FR1"; "región marco 2" o "FR2"; "región marco 3" o "FR3"; y "región marco 4" o "FR4", respectivamente; cuyas regiones marco están interrumpidas por tres "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR", que se denominan en la materia y en lo sucesivo en el presente documento "región determinante de la complementariedad" o "CDR1"; "región determinante de la complementariedad 2" o "CDR2"; y "región determinante de la complementariedad 3" o "CDR3", respectivamente. Por lo tanto, la estructura general o la secuencia de un dominio variable de inmunoglobulina puede indicarse como sigue: FR1 - CDR1 - FR2 -CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. El dominio o dominios variables de la inmunoglobulina confieren la especificidad a un anticuerpo para el antígeno al llevar el sitio de unión al mismo.
La expresión "dominio variable único de inmunoglobulina", como se utiliza en el presente documento, significa un dominio variable de inmunoglobulina que es capaz de unirse de manera específica a un epítopo del antígeno sin emparejarse con un dominio variable de inmunoglobulina adicional. Un ejemplo de dominios variables únicos de inmunoglobulina en el sentido de la presente divulgación es el "anticuerpo de dominio", tal como los dominios variables únicos de inmunoglobulina VH y VL (dominios VH y dominios VL). Otro ejemplo de dominios variables únicos de inmunoglobulina es el "dominio VHH" (o simplemente "VHH") de los camélidos, como se define en lo sucesivo en el presente documento.
Los "dominios VHH", también conocidos como anticuerpos de cadena pesada de un solo dominio, VHH, dominios VhH, fragmentos de anticuerpos VHH y anticuerpos VHH, son el dominio variable de inmunoglobulina de unión a antígeno de los "anticuerpos de cadena pesada" (es decir, "anticuerpos desprovistos de cadenas ligeras") (Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Songa E. B., Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993)). La expresión "dominio VHH" se ha utilizado para distinguir estos dominios variables de los dominios variables de cadena pesada que están presentes en los anticuerpos típicos de 4 cadenas (que se denominan en el presente documento "dominios VH") y de los dominios variables de cadena ligera que están presentes en los anticuerpos típicos de 4 cadenas (que se denominan en el presente documento "dominios VL"). Los dominios VHH se pueden unir de manera específica a un epítopo sin un dominio de unión a antígeno adicional (a diferencia de los dominios VH o VL en un anticuerpo típico de 4 cadenas), en cuyo caso un dominio VL junto con un dominio VH reconocen al epítopo). Los dominios VHH son unidades de reconocimiento de antígenos pequeñas, consistentes y eficaces formadas por un dominio único de inmunoglobulina.
En el contexto de la presente divulgación, los términos anticuerpo de cadena pesada de un solo dominio, dominio VHH, VHH, dominio VhH, fragmentos de anticuerpo VHH, anticuerpo VHH, así como "Nanobody®" y "dominio de Nanobody®" ("Nanobody" es una marca comercial de la empresa Ablynx N.V.; Ghent; Bélgica) se utilizan indistintamente.
Los restos de aminoácidos de los dominios VHH de los camélidos están numerados de acuerdo con la numeración general de los dominios VH dada por Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publicación n.°91), como se muestra, por ejemplo, en la figura 2 de Riechmann y Muyldermans, J. Immunol. Methods 231,25-38 (1999). De acuerdo con esta numeración,
- la FR1 comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 1 a 30,
- la CDR1 comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 31 a 35,
- la FR2 comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 36 a 49,
- la CDR2 comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 50 a 65,
- la FR3 comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 66 a 94,
- la CDR3 comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 95 a 102 y
- la FR4 comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 103 a 113.
Sin embargo, cabe señalar que, como es bien sabido en la materia para los dominios VH y para los dominios VHH, el número total de restos de aminoácidos en cada una de las CDR puede variar y puede no corresponder al número total de restos de aminoácidos indicado por la numeración de Kabat (es decir, una o más posiciones de acuerdo con la numeración de Kabat pueden no estar ocupadas en la secuencia real, o la secuencia real puede contener más restos de aminoácidos que el número permitido por la numeración de Kabat). Esto significa que, en general, la numeración de acuerdo con Kabat puede corresponder o no a la numeración real de los restos de aminoácidos en la secuencia real.
En la materia se conocen métodos alternativos para numerar los restos de aminoácidos de los dominios VH, cuyos métodos también se pueden aplicar de forma análoga a los dominios VHH. Sin embargo, en la presente descripción, reivindicaciones y figuras, se seguirá la numeración de acuerdo con Kabat y aplicada a los dominios VHH como se ha descrito anteriormente, a menos que se indique de otra manera.
El número total de restos de aminoácidos en un dominio VHH suele estar en el intervalo de 110 a 120, a menudo entre 112 y 115. No obstante, cabe señalar que las secuencias más pequeñas y más grandes también pueden ser adecuadas para los fines descritos en el presente documento.
Otras características estructurales y propiedades funcionales de los dominios VHH y de los polipéptidos que los contienen pueden resumirse como sigue:
Los dominios VHH (que han sido "diseñados" por la naturaleza para unirse de manera funcional a un antígeno sin la presencia de un dominio variable de cadena ligera y sin ninguna interacción con él) pueden funcionar como una unidad estructural, dominio o polipéptido único, relativamente pequeño y funcional de unión a antígeno. Esto distingue los dominios VHH de los dominios VH y VL de los anticuerpos típicos de 4 cadenas, que por sí mismos no suelen ser adecuados para su aplicación práctica como proteínas únicas de unión a antígenos o dominios variables únicos de inmunoglobulina, pero deben combinarse de una forma u otra para proporcionar una unidad funcional de unión a antígeno (como en, por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos habituales, tales como los fragmentos Fab; en scFvs, que consisten en un dominio VH unido covalentemente a un dominio VL).
Debido a estas propiedades únicas, el uso de los dominios VHH, solos o como parte de un polipéptido más grande - ofrece una serie de ventajas significativas sobre el uso de los dominios VH y VL habituales, los scFvs o los fragmentos de anticuerpos habituales (tales como los fragmentos Fab o F(ab')2 ):
- sólo se necesita un único dominio para unirse a un antígeno con elevada afinidad y con elevada selectividad, para que no haya necesidad de tener dos dominios separados presentes, ni para asegurar que estos dos dominios estén presentes en la conformación y configuración espacial correcta (es decir, mediante el uso de enlazadores especialmente diseñados, como en el caso de los scFv);
- los dominios VHH se pueden expresar a partir de un único gen y no necesitan ningún plegamiento o modificación postraduccional;
- los dominios VHH pueden ser fácilmente genomanipulados en formatos multivalentes y multiespecíficos (formateados);
- los dominios VHH son altamente solubles y no tienen tendencia a agregarse;
- los dominios VHH son muy estables al calor, pH, proteasas y otros agentes o condiciones desnaturalizantes y, por lo tanto, pueden prepararse, almacenarse o transportarse sin utilizar equipos de refrigeración, lo que supone un ahorro de costes, tiempo y medio ambiente;
- los dominios VHH son fáciles y relativamente baratos de preparar, incluso a la escala necesaria para la producción; - los dominios VHH son relativamente pequeños (aproximadamente 15 kDa o 10 veces más pequeños que una IgG típica) en comparación con los anticuerpos típicos de 4 cadenas y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y, por lo tanto, muestran una elevada penetración en los tejidos y se pueden administrar en dosis más elevadas que dichos anticuerpos típicos de 4 cadenas y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos; - los dominios VHH pueden mostrar las llamadas propiedades de unión a cavidades (en especial debido a su bucle CDR3 extendido, en comparación con los dominios VH típicos) y, por tanto, también pueden acceder a dianas y epítopos no accesibles para los anticuerpos típicos de 4 cadenas y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
Ya se han descrito métodos para obtener dominios VHH que se unen a un antígeno o epítopo específico, por ejemplo, en los documentos WO2006/040153 y WO2006/122786; R. van der Linden et al., Journal of Immunological Methods, 240 (2000) 185-195; Li et al., J Biol Chem., 287 (2012) 13713-13721; Deffar et al., African Journal of Biotechnology Vol. 8 (12), págs. 2645-2652, 17 de junio de 2009 y el documento WO94/04678.
Los dominios VHH procedentes de camélidos se pueden "humanizar" mediante la sustitución de uno o más restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la secuencia VHH original por uno o más de los restos de aminoácidos que se encuentran en la posición o posiciones correspondientes en un dominio VH de un anticuerpo típico de 4 cadenas de un ser humano (también denominado "optimización de la secuencia" y además de la humanización, la optimización de la secuencia también abarca otras modificaciones de la secuencia mediante una o más mutaciones para proporcionar características de VHH mejoradas, tales como la eliminación de posibles sitios de modificación posterior a la traducción). Un dominio VHH humanizado puede contener una o más secuencias de la región marco totalmente humanas y, en un ejemplo específico, puede contener la secuencia de la región marco humana IGHV3.
Como se utiliza en el presente documento, los "anticuerpos de dominio" se refieren en especial a los dominios VH o VL de los anticuerpos de 4 cadenas de mamíferos no camélidos, en particular, de seres humanos. Para unir un epítopo como un dominio único de unión a antígeno, es decir, sin estar emparejado con un dominio VL o VH, respectivamente, se necesita una selección específica para dichas propiedades de unión a antígeno, por ejemplo, mediante el uso de bibliotecas de secuencias de dominios VH o VL humanos.
Los anticuerpos de dominio tienen, como los VHH, un peso molecular de aproximadamente 13 a aproximadamente 16 kDa y, si proceden de secuencias totalmente humanas, no necesitan humanización para, por ejemplo, su uso terapéutico en seres humanos. Como en el caso de los dominios VHH, también se expresan bien en los sistemas de expresión procarióticos, lo que proporciona una importante reducción del coste total de fabricación.
Los "anticuerpos de dominio" se han descrito, por ejemplo, en Ward, E. S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341:544-546(1989); Holt, L. J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11):484-490 (2003).
Además, también estará claro para el experto que es posible "injertar" una o más de las CDR mencionadas anteriormente en otros "andamios", que incluyen, pero sin limitación, andamios humanos o andamios sin inmunoglobulina. Los andamios y las técnicas adecuadas para dicho injerto de CDR son conocidos en la materia.
Como se utiliza en el presente documento, el término "epítopo" se refiere a cualquier determinante antigénico en un antígeno al que se une el parátopo de un anticuerpo. Los determinantes antigénicos suelen contener agrupaciones superficiales de moléculas químicamente activas, tales como cadenas laterales de aminoácidos o glucídicas y suelen tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Por ejemplo, un epítopo normalmente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos consecutivos o no en una conformación espacial única, que puede ser "lineal" o "conformacional". Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). En un epítopo lineal, todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula que interactúa (tal como un anticuerpo) se producen linealmente a lo largo de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción se producen a través de restos de aminoácidos en la proteína que están separados entre sí.
Los epítopos de un determinado antígeno se pueden identificar mediante una serie de técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.
66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse mediante, por ejemplo, la síntesis al mismo tiempo de un gran número de péptidos en soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos aún están unidos a los soportes. Dichas técnicas se conocen en la materia y se describen en, por ejemplo, la patenten de EE. UU. n.° 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol.
23:709-715. De forma similar, los epítopos conformacionales se pueden identificar mediante la determinación de la conformación espacial de los aminoácidos tal como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, citado anteriormente.
Los anticuerpos se pueden cribar para la unión competitiva a un mismo epítopo mediante técnicas habituales conocidas en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos que compiten o compiten de forma cruzada por la unión al antígeno se pueden obtener mediante ensayos de competencia o de competencia cruzada. Un proceso de alto rendimiento para la obtención de anticuerpos que se unen a un mismo epítopo basado en su competencia cruzada se describe en la publicación de patente internacional n.°WO 03/48731. De manera correspondiente, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos que compiten con las moléculas de anticuerpos de la divulgación para unirse al mismo epítopo en CTLA4 se pueden obtener mediante técnicas habituales conocidas en la materia.
En general, el término "especificidad" se refiere al número de tipos diferentes de antígenos o epítopos a los que se puede unir una determinada molécula de unión a antígeno o proteína de unión a antígeno (tal como un dominio variable único de inmunoglobulina de la divulgación). La especificidad de una proteína de unión a antígeno se puede determinar en función de su afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión a antígeno (KD), es una medida de la fuerza de unión entre un epítopo y un sitio de unión a antígeno en la proteína de unión a antígeno: cuanto menor sea el valor de la KD, mayor será la fuerza de unión entre un epítopo y la proteína de unión a antígeno (de manera alternativa, la afinidad también se puede expresar como la constante de afinidad (KA), que es 1/KD). Como será evidente para el experto, la afinidad se puede determinar de una manera conocida per se, dependiendo del antígeno específico de interés. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre una proteína de unión a antígeno (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, un dominio variable único de inmunoglobulina o un polipéptido que lo contenga) y el antígeno pertinente. La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un epítopo y su sitio de unión a antígeno en la proteína de unión a antígeno como con el número de sitios de unión pertinentes presentes en la proteína de unión a antígeno.
A menos que se indique de otro modo, la expresión "proteína de unión a CTLA4" se refiere a cualquier proteína que se pueda unir de manera específica a CTLA4. La proteína de unión a CTLA4 puede abarcar los anticuerpos o inmunoconjugados contra CTLA4 definidos en el presente documento. La expresión "proteína de unión a CTLA4" abarca los anticuerpos de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF) o las moléculas con CDR.
La molécula de unión a CTLA4 de la divulgación puede contener al menos un dominio variable único de inmunoglobulina de unión a CTLA4, tal como VHH. En algunos ejemplos, la molécula de unión a CTLA4 de la divulgación puede contener dos, tres, cuatro o más dominios variables únicos de inmunoglobulina de unión a CTLA4, tales como VHH. La proteína de unión a CTLA4 de la divulgación puede comprender, además de los dominios variables únicos de inmunoglobulina de unión a CTLA4, enlazadores y/o fracciones con funciones efectoras, por ejemplo, fracciones que prolongan la semivida, como dominios variables únicos de inmunoglobulina que se unen a la albúmina, y/o un socio de fusión como la seroalbúmina y/o un polímero unido como PEG y/o una región Fc. En algunos ejemplos, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación también abarca un anticuerpo biespecífico, que contiene dominios variables únicos de inmunoglobulina que se unen a diferentes antígenos.
Normalmente, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación se unirá al antígeno (es decir, a CTLA4) con una constante de disociación (KD) de preferentemente 10-7 a 10-10 moles/litro (M), más preferentemente de 10-8 a 10-10 moles/litro, aún más preferentemente de 10-9 a 10-10 moles/litro o menos (medido en un Biacore o en un KinExA o en un ensayo Fortibio), y/o con una constante de asociación (KA) de al menos 107 M-1, preferentemente al menos 108 M-1, más preferentemente al menos 109 M-1, más preferentemente al menos 1010 M-1. Cualquier valor de la KD superior a 10-4M se considera, en general, como indicación de unión no específica. La unión específica de una proteína de unión a antígeno a un antígeno o epítopo se puede determinar de cualquier manera adecuada conocida per se, que incluye, por ejemplo, los ensayos descritos en el presente documento, el análisis de Scatchard y/o los ensayos de unión competitiva, tal como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos de competencia en sándwich.
Los restos de aminoácidos se indicarán de acuerdo con el código habitual de tres letras o de una letra, como se conoce generalmente y se ha acordado en la materia. Cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos, la expresión "diferencia de aminoácidos" se refiere a las inserciones, eliminaciones o sustituciones del número indicado de restos de aminoácidos en una posición de la secuencia de referencia, en comparación con una segunda secuencia. En caso de sustitución(es), dicha(s) sustitución(es) será(n) preferentemente una(s) sustitución(es) conservadora(s) de aminoácidos, lo que significa que un resto de aminoácido se sustituye por otro resto de aminoácido de estructura química similar y que tiene poca o ninguna influencia en la función, actividad u otras propiedades biológicas del polipéptido. Dichas sustituciones conservadoras de aminoácidos son conocidas en la materia, en donde las sustituciones conservadoras de aminoácidos son preferentemente sustituciones en las que un aminoácido dentro de los siguientes grupos (i) a (v) se sustituye por otro resto de aminoácido del mismo grupo: (i) restos pequeños alifáticos, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; (ii) restos polares cargados negativamente y sus amidas (sin carga): Asp, Asn, Glu y Gin; (iii) restos polares cargados positivamente: His, Arg y Lys; (iv) restos grandes, alifáticos y no polares: Met, Leu, He, Val y Cys; y (v) restos aromáticos: Phe, Tyr y Trp. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras particularmente preferidas son las siguientes: Ala por Gly o por Ser; Arg por Lys; Asn por Gln o por His; Asp por Glu; Cys por Ser; Gln por Asn; Glu por Asp; Gly por Ala o por Pro; His por Asn o por Gln; Ile por Leu o por Val; Leu por Ile o por Val; Lys por Arg, por Gln o por Glu; Met por Leu, por Tyr o por Ile; Phe por Met, por Leu o por Tyr; Ser por Thr; Thr por Ser; Trp por Tyr; Tyr por Trp o por Phe; Val por Ile o por Leu.
La "identidad de secuencia" entre dos secuencias polipeptídicas indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias. La "similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones de aminoácidos conservadoras. Los métodos para evaluar el nivel de identidad de secuencia entre secuencias de aminoácidos o de nucleótidos son conocidos en la materia. Por ejemplo, para determinar la identidad de las secuencias de aminoácidos se suelen utilizar programas de análisis de secuencias. Por ejemplo, la identidad se puede determinar mediante el uso del programa BLAST en la base de datos del NCBI. Para determinar la identidad de la secuencia, véase, por ejemplo, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987 y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991.
Se considera que una molécula polipeptídica o de ácido nucleico está "esencialmente aislada", por ejemplo, cuando se compara con su fuente biológica natural y/o el medio de reacción o de cultivo del que se ha obtenido, cuando se ha separado de al menos otro componente con el que suele estar asociado en dicha fuente o medio, tal como otra proteína/polipéptido, otro ácido nucleico, otro componente biológico o macromolécula o al menos un contaminante, impureza o componente menor. En particular, una molécula polipeptídica o de ácido nucleico se considera "esencialmente aislada" cuando se ha purificado al menos 2 veces, en particular, al menos 10 veces, más en particular al menos 100 veces, y hasta 1000 veces o más. Una molécula polipeptídica o de ácido nucleico que está "en forma esencialmente aislada" es de manera preferente esencialmente homogénea, según se determina mediante una técnica adecuada, tal como una técnica cromatográfica adecuada, tal como la electroforesis en gel de poliacrilamida.
Un anticuerpo anti-CTLA4 "madurado por afinidad", en particular un VHH o un anticuerpo de dominio, tiene una o más alteraciones en una o más CDR que dan como resultado una afinidad mejorada para CTLA4, en comparación con la respectiva molécula de unión a CTLA4 original. Las moléculas de unión a CTLA4 maduradas por afinidad de la divulgación pueden prepararse mediante métodos conocidos en la materia, por ejemplo, como se describe en Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783 o Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813.; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; y Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226(3): 889896; K. S. Johnson y R. E. Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996.
Como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un mamífero, especialmente a un primate, en particular, a un ser humano.
Proteína de unión a CTLA4 de la invención
En un primer aspecto, la invención proporciona una proteína de unión a CTLA4 como se define en las reivindicaciones, que comprende al menos un dominio variable único de inmunoglobulina que puede unirse de manera específica a CTLA4. Puede comprender un dominio variable único de inmunoglobulina que se une de manera específica a CTLA4, o puede comprender dos, tres, cuatro o más dominios variables únicos de inmunoglobulina que se unen de manera específica a CTLA4. En algunos ejemplos, dicha proteína de unión a CTLA4 comprende dos o más dominios variables únicos de inmunoglobulina idénticos que se unen de manera específica a CTLA4. En otros ejemplos, dicha proteína de unión a CTLA4 comprende dos o más dominios variables únicos de inmunoglobulina diferentes que se unen de manera específica a CTLA4. En algunos ejemplos, dichos dos o más dominios variables únicos de inmunoglobulina que se unen de manera específica a CTLA4 están directamente unidos entre sí. En algunos ejemplos, dichos dos o más dominios variables únicos de inmunoglobulina que se unen de manera específica a CTLA4 están unidos entre sí mediante un enlazador. Dicho enlazador puede ser una secuencia de aminoácidos no funcional con una longitud de 1 a 20 o más aminoácidos y sin estructura secundaria o superior. Por ejemplo, dicho enlazador es un enlazador flexible tal como GGGGS, GS, GAP, (GGGGS) x 3 y similares.
En algunos ejemplos, dicho al menos un dominio variable único de inmunoglobulina comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas de:
(1) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 1, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 2 y la CDR3 expuesta en el SEQ ID NO: 3 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° 116);
(2) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 4, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 5 y la CDR3 expuesta en el SEQ ID NO: 6 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° 119);
(3) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 7, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 8 y la CDR3 expuesta en el SEQ ID NO: 9 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° 128);
(4) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 10, la c Dr 2 expuesta en el SEQ ID NO: 11 y la CDR3 expuesta en el s Eq ID NO: 12 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° 138);
(5) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 13, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 14 y la CDR3 expuesta en el s Eq ID NO: 15 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° 145);
(6) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 16, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 17 y la CDR3 expuesta en el s Eq ID NO: 18 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° 155);
(7) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 19, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 20 y la CDR3 expuesta en el s Eq ID NO: 21 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° 165);
(8) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 22, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 23 y la CDR3 expuesta en el s Eq ID NO: 24 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° 188);
(9) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 25, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 26 y la CDR3 expuesta en el s Eq ID NO: 27 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° C1);
(10) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 28, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 29 y la CDR3 expuesta en el Se Q ID NO: 30 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° C2);
(11) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 31, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 32 y la CDR3 expuesta en el Se Q ID NO: 33 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° C16);
(12) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 34, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 35 y la CDR3 expuesta en el Se Q ID NO: 36 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° C22);
(13) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 37, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 38 y la CDR3 expuesta en el Se Q ID NO: 39 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° C27);
(14) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 40, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 41 y la CDR3 expuesta en el Se Q ID NO: 42 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° C29);
(15) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 43, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 44 y la CDR3 expuesta en el SEQ ID NO: 45 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° C38);
(16) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 46, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 47 y la CDR3 expuesta en el Se Q ID NO: 48 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° J5);
(17) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 49, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 50 y la CDR3 expuesta en el Se Q ID NO: 51 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° J17);
(18) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 52, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 53 y la CDR3 expuesta en el Se Q ID NO: 54 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° J29);
(19) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 55, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 56 y la CDR3 expuesta en el SEQ ID NO: 57 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° J35);
(20) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 58, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 59 y la CDR3 expuesta en el Se Q ID NO: 60 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° J37);
(21) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 61, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 62 y la CDR3 expuesta en el Se Q ID NO: 63 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° J38);
(22) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 64, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 65 y la CDR3 expuesta en el Se Q ID NO: 66 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° J39);
(23) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 67, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 68 y la CDR3 expuesta en el Se Q ID NO: 69 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° J42);
(24) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 70, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 71 y la CDR3 expuesta en el Se Q ID NO: 72 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° J69); y
(25) la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 73, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 74 y la CDR3 expuesta en el Se Q ID NO: 75 (correspondientes a las CDR del anticuerpo n.° J78).
En algunos ejemplos, dicho al menos un dominio variable único de inmunoglobulina de la proteína de unión a CTLA4 de la invención es un VHH. En algunos ejemplos específicos, dicho VHH comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de los SEQ ID NO: 76 a 100. En algunos otros ejemplos, dicho VHH es un VHH humanizado. Dicho VHH humanizado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, preferentemente al menos un 90 %, más preferentemente al menos un 95 %, aún más preferentemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de los SEQ ID NO: 76 a 100. Como alternativa, la secuencia de aminoácidos de dicho VHH contiene una o más sustituciones de aminoácidos, preferentemente sustituciones de aminoácidos conservadoras, en comparación con una cualquiera de los SEQ ID NO: 76 a 100. Por ejemplo, dicho VHH contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En algunos ejemplos específicos, dicho VHH humanizado comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de los SEQ ID NO: 101 a 109.
En algunos ejemplos, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación se obtiene mediante maduración por afinidad. La proteína de unión a CTLA4 obtenida mediante maduración por afinidad puede tener una o más alteraciones en una o más CDR, dando como resultado dichas alteraciones un aumento de la afinidad por CTLA4 en comparación con la proteína de unión a CTLA4 original.
En algunos ejemplos, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación, además del al menos un dominio variable único de la inmunoglobulina que se puede unir de manera específica a CTLA4, comprende además una región Fc de inmunoglobulina. La inclusión de una región Fc de inmunoglobulina en la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación permite que la proteína de unión forme dímeros y también permite la extensión de la semivida in vivo de dicha proteína de unión. La región Fc que se puede utilizar en la divulgación puede proceder de inmunoglobulinas de diferentes subtipos, tales como IgG (por ejemplo, los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM. La región Fc de inmunoglobulina incluye, en general, una región bisagra o una porción de la región bisagra, la región CH2 y la región CH3 de la región constante de la inmunoglobulina.
En algunos ejemplos, se pueden introducir mutaciones en la secuencia Fc de tipo silvestre para alterar las actividades de interés mediadas por Fc. Dichas mutaciones incluyen, pero sin limitación, a) mutaciones que alteran la actividad de CDC mediada por Fc; b) mutaciones que alteran la actividad de ADCC mediada por Fc; o c) mutaciones que alteran la semivida in vivo mediada por el FcRn. Dichas mutaciones se describen en Leonard G. Presta, Current Opinion in Immunology 2008, 20:460-470; Esohe E. Idusogie et al., J Immunol 2000, 164: 4178-4184; RAPHAEL A. CLYNES et al., Nature Medicine, 2000, volumen 6, número 4: 443-446; Paul R. Hinton et al., J Immunol, 2006, 176:346-356. Por ejemplo, la actividad de ADCC o CDC mediada por Fc se puede aumentar o eliminar, o la afinidad de FcRn se puede aumentar o atenuar mediante la mutación de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos en la región CH2. Además, la estabilidad de la proteína se puede aumentar mediante la mutación de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de la región bisagra.
En algunos ejemplos, pueden introducirse mutaciones en la secuencia de Fc de tal manera que el Fc mutado tiende a formar homodímeros o heterodímeros con mayor facilidad. Por ejemplo, Ridgway, Presta et al. 1996 y Carter 2001 mencionaron el uso del modelo de botón-ojal de la interacción espacial de los grupos de cadenas laterales de aminoácidos en la interfaz de contacto de Fc para permitir que diferentes mutantes de Fc formen heterodímeros con mayor facilidad; además, el documento CN 102558355A o el documento CN 103388013A divulgan que diferentes mutantes de Fc forman heterodímeros con mayor facilidad (CN 102558355A) o que Fc con las mismas mutaciones forman homodímeros con mayor facilidad (CN 103388013A), mediante el cambio de las cargas de los aminoácidos en la interfaz de contacto de Fc que a su vez cambia la interacción iónica en la interfaz de contacto de Fc.
Preferentemente, dicha región Fc de inmunoglobulina es una región Fc de inmunoglobulina humana, más preferentemente una región Fc de IgG1 humana. En algunos ejemplos específicos, la secuencia de aminoácidos de la región Fc de inmunoglobulina se expone en el SEQ ID NO: 132. En algunos ejemplos, la EPKSC aminoterminal en el SEQ ID NO: 132 se puede eliminar o mutar a EPKSS o MDPKSS.
En algunos ejemplos, en la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación, el dominio variable único de inmunoglobulina capaz de unirse de manera específica a CTLA4 está unido a la región Fc de inmunoglobulina mediante un enlazador. Dicho enlazador puede ser una secuencia de aminoácidos no funcional de 1 a 20 o más aminoácidos de longitud, sin estructura secundaria o superior. Por ejemplo, el enlazador es una unión flexible tal como GGGGS, GS, GAP y similares.
En algunos ejemplos, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación comprende un dominio variable único de inmunoglobulina que se une de manera específica a CTLA4, que se une directamente, o mediante un enlazador, a una región Fc de inmunoglobulina, permitiendo dicha región Fc de inmunoglobulina que dicha proteína de unión a CTLA4 forme una molécula dimérica que comprende dos dominios de unión a CTLA4. Dicha proteína de unión a CTLA4 también se denomina proteína de unión a CTLA4 bivalente. En algunos ejemplos, el dímero es un homodímero.
En algunos ejemplos, una proteína de unión a CTLA4 de la divulgación comprende dos dominios variables únicos de inmunoglobulina que se unen de manera específica a CTLA4 y una región Fc de inmunoglobulina, que se unen directamente o a través de un enlazador, permitiendo dicha región Fc de inmunoglobulina que la proteína de unión a CTLA4 forme una molécula dimérica que comprende cuatro dominios de unión a CTLA4. Dicha proteína de unión a CTLA4 también se denomina proteína de unión a CTLA4 tetravalente. En algunos ejemplos, el dímero es un homodímero.
En algunos ejemplos preferidos, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación que comprende una región Fc de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de los SEQ ID NO: 114 a 128.
En otro aspecto, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación también abarca una molécula de anticuerpo anti-CTLA4 que se une al mismo epítopo que un VHH que consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de los SEQ ID NO: 76 a 100.
La proteína de unión a CTLA4 de la divulgación tiene al menos una de las siguientes características:
(a) se une a CTLA4 humano con una KD inferior a 1 * 10-7 M;
(b) bloquea la interacción de CTLA4 con CD80 y/o CD86;
(c) aumenta la activación de las PBMC y/o de los linfocitos T;
(d) inhibe del crecimiento tumoral.
La proteína de unión a CTLA4 de la divulgación puede unirse a CTLA4 con una KD inferior a 1 *10 -7M, preferentemente inferior a 1 * 10-8 M, más preferentemente inferior a 1 * 10-9 M, más preferentemente inferior a 1 * 10­ 10 M.
En algunos ejemplos, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación puede unirse de manera específica a CTLA4 humano y bloquear la interacción de CTLA4 con CD80, y/o la interacción de CTLA4 con CD80 y/o CD86.
La proteína de unión a CTLA4 de la divulgación puede inhibir el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente un 10 %, preferentemente, al menos aproximadamente un 20 %, más preferentemente, al menos aproximadamente un 30 %, más preferentemente, al menos aproximadamente un 40 %, más preferentemente, al menos aproximadamente un 50 %, más preferentemente, al menos aproximadamente un 60 %, más preferentemente, al menos aproximadamente un 70 % e incluso, más preferentemente, al menos aproximadamente un 80 %.
Además, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación es resistente al tratamiento térmico. Por ejemplo, no se observa ninguna agregación o degradación significativa tras el tratamiento a 40 °C durante un máximo de 30 días.
Por último, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación muestra una mejor tolerancia en macacos. Por ejemplo, hasta 30 mg/kg de la dosis administrada, no se observan reacciones adversas relacionadas con el medicamento.
Ácido nucleico, vector y célula hospedadora
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica las proteínas de unión a CTLA4 de la divulgación. El ácido nucleico de la divulgación puede ser ARN, ADN o ADNc. De acuerdo con un ejemplo de la divulgación, el ácido nucleico de la divulgación está en forma esencialmente aislada.
El ácido nucleico de la divulgación también puede estar en forma de, puede estar presente en y/o puede ser parte de un vector, tal como, por ejemplo, un plásmido, cósmido o YAC. El vector puede ser especialmente un vector de expresión, es decir, un vector que puede proporcionar la expresión de la proteína de unión a CTLA4 in vitro y/o in vivo (es decir, en una célula hospedadora, organismo hospedador y/o sistema de expresión adecuados). En general, dicho vector de expresión comprende al menos un ácido nucleico de la divulgación que está unido de manera operativa a uno o más elementos reguladores adecuados, tales como promotores, potenciadores, terminadores y similares. Dichos elementos y su selección con vistas a la expresión de una secuencia específica en un hospedador específico son de conocimiento común del experto. Ejemplos específicos de elementos reguladores y otros elementos útiles o necesarios para expresar la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación incluyen tales como promotores, potenciadores, terminadores, factores de integración, marcadores de selección, secuencias líder, genes indicadores y similares.
Los ácidos nucleicos de la divulgación pueden prepararse u obtenerse de una manera conocida per se (por ejemplo, mediante la síntesis automatizada de ADN y/o la tecnología de ADN recombinante), basándose en la información de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de la divulgación dada en el presente documento, y/o pueden aislarse de una fuente natural adecuada.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a células hospedadoras de recombinación que expresan o son capaces de expresar una o más proteínas de unión a CTLA4 de la divulgación; y/o que contienen un ácido nucleico de la divulgación. De acuerdo con un ejemplo particularmente preferido, dichas células hospedadoras son células bacterianas; otras células útiles son las de levadura, fúngicas o de mamíferos.
Las células bacterianas adecuadas incluyen células de cepas bacterianas gramnegativas como las cepas de Escherichia coli, Proteus y Pseudomonas, y cepas bacterianas grampositivas como las cepas de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus y Lactococcus. Las células fúngicas adecuadas incluyen células de especies de Trichoderma, Neurospora y Aspergillus.
Las células fúngicas adecuadas incluyen células de especies de Trichoderma, Neurospora y Aspergillus. Las células de levadura adecuadas incluyen células de especies de Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por ejemplo, Schizosaccharomyces pombe), Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris y Pichia methanolica) y Hansenula.
Las células de mamífero adecuadas incluyen, por ejemplo, células HEK293, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS y similares.
Sin embargo, también se pueden utilizar células de anfibios, células de insecto, células vegetales y cualquier otra célula utilizada en la materia para la expresión de proteínas heterólogas.
La divulgación proporciona además métodos de fabricación de una proteína de unión a CTLA4 de la divulgación, comprendiendo dichos métodos las etapas de:
- cultivar las células hospedadoras de la divulgación en condiciones que permitan la expresión de la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación; y
- recuperar la proteína de unión a CTLA4 expresada mediante las células hospedadoras del cultivo; y
- opcionalmente, purificar y/o modificar aún más la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación.
Las proteínas de unión a CTLA4 de la divulgación pueden producirse en una célula como se ha expuesto anteriormente, ya sea de forma intracelular (por ejemplo, en el citosol, en el periplasma o en cuerpos de inclusión) y después aislarse de las células hospedadoras y, opcionalmente, purificarse más; o pueden producirse de forma extracelular (por ejemplo, en el medio en el que se cultivan las células hospedadoras) y después aislarse del medio de cultivo y, opcionalmente, purificarse más.
Se conocen en la materia métodos y reactivos utilizados para la producción recombinante de polipéptidos, tales como vectores de expresión específicos adecuados, métodos de transformación o transfección, marcadores de selección, métodos de inducción de la expresión de proteínas, condiciones de cultivo y similares. De forma similar, las técnicas de aislamiento y purificación de proteínas útiles en un método de fabricación de una proteína de unión a CTLA4 de la divulgación son bien conocidas por el experto.
Sin embargo, las proteínas de unión a CTLA4 de la divulgación también se pueden obtener mediante otros métodos de producción de proteínas conocidos en la materia, tales como, síntesis química, que incluye la síntesis en fase sólida o en fase líquida.
Composiciones farmacéuticas
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene una proteína de unión a CTLA4 de la presente divulgación o una combinación de la misma, formulada junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden incluir una o una combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) proteínas de unión a CTLA4 de la divulgación. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la divulgación puede comprender una combinación de moléculas de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos del antígeno diana.
Las composiciones farmacéuticas de la divulgación también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una proteína de unión a CTLA4 de la presente divulgación combinada con al menos otro agente antitumoral. Por ejemplo, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación puede administrarse en combinación con anticuerpos dirigidos a otros antígenos específicos del tumor. Dichos anticuerpos dirigidos a otros antígenos específicos del tumor incluyen, pero sin limitación, el anticuerpo anti-EGFR, el anticuerpo antivariante de EGFR, el anticuerpo anti-VEGFa, el anticuerpo anti-HER2 o el anticuerpo anti-CMET. Preferentemente, dichos anticuerpos son monoclonales. La proteína de unión a CTLA4 de la presente divulgación también se puede utilizar en combinación con otros medios de inmunoterapia tumoral o fármacos de molécula pequeña dirigidos a los tumores. Los otros medios de inmunoterapia tumoral incluyen, pero sin limitación, anticuerpos terapéuticos contra moléculas inmunomoduladoras de tumores tales como OX40, PDL1/PD1, CD137, etc., o medios de tratamiento con CAR-T y similares.
La composición farmacéutica de la presente divulgación también se puede utilizar en combinación con otros medios de tratamiento de tumores, tales como la radioterapia, quimioterapia, cirugía o similares, o se puede utilizar antes o después de la radioterapia, quimioterapia o cirugía.
Como se utiliza en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo o el inmunoconjugado, se puede recubrir con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y de otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
Los compuestos farmacéuticos de la divulgación pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto precursor y que no produce ningún efecto toxicológico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácidos incluyen las procedentes de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos, tales como ácidos alifáticos mono y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición de bases incluyen las procedentes de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.
Una composición farmacéutica de la divulgación también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes hidrosolubles, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes liposolubles, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, a-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes metálicos, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes.
La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse mediante procedimientos de esterilización, véase anteriormente, y mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol de ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede conseguir mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas o dispersiones estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la materia. Excepto en la medida en que cualquier agente o medio habitual sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la divulgación. También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.
Normalmente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una elevada concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por microfiltración. En general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la criodesecación (liofilización) que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir una solución de los mismos previamente esterilizada por filtración.
La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material vehículo para producir una sola forma de dosificación variará dependiendo del sujeto que se va a tratar y del modo particular de administración. La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material vehículo para producir una sola forma de dosificación, en general, será la cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico. En general, del cien por cien, esta cantidad variará de aproximadamente un 0,01 por ciento a aproximadamente un noventa y nueve por ciento de principio activo, preferentemente, de aproximadamente un 0,1 por ciento a aproximadamente un 70 por ciento, más preferentemente de aproximadamente un 1 por ciento a aproximadamente un 30 por ciento de principio activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma farmacéutica unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente individuales adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que han de tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. La memoria descriptiva para las formas farmacéuticas unitarias de la divulgación está dictada por y dependiente directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la materia de la composición de dicho un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Para la administración de la molécula de anticuerpo, la dosis varía de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 20 mg/kg, del peso corporal del sujeto. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal, 10 mg/kg de peso corporal, 20 mg/kg de peso corporal o 30 mg/kg de peso corporal o en el intervalo de 1 a 30 mg/kg. Un régimen de tratamiento ilustrativo implica la administración una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses, o con un intervalo de administración corto al principio (tal como una vez a la semana a una vez cada tres semanas) y después un intervalo ampliado más adelante (tal como una vez al mes a una vez cada tres a 6 meses).
Como alternativa, el anticuerpo se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la mayor semivida, seguidos de los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos no humanos. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un periodo de tiempo prolongado. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, en ocasiones se necesita una dosis relativamente elevada a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o detiene la progresión de la enfermedad y preferentemente, hasta que el paciente muestra una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después de esto, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico.
Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden variar para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración particulares, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de varios factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente divulgación empleadas, o el éster, la sal o la amida del mismo, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se esté empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la condición, el estado de salud general y la anamnesis previa del paciente que se está tratando y factores similares bien conocidos en las materias médicas.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una proteína de unión a CTLA4 de la divulgación da como resultado preferentemente una disminución de la intensidad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia y la duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad o una prevención del deterioro o de la discapacidad debidos a la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores relacionados con CTLA4, una "cantidad terapéuticamente eficaz" inhibe preferentemente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, más preferentemente en al menos aproximadamente un 40 %, incluso más preferentemente en al menos aproximadamente un 60 %, y todavía más preferentemente en al menos aproximadamente un 80 % con respecto a los sujetos no tratados. La capacidad de inhibir el crecimiento del tumor se puede evaluar en un sistema de modelo animal que predice la eficacia en tumores humanos. Como alternativa, se puede evaluar esta propiedad de una composición mediante el examen de la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento tumoral; dicha inhibición se puede determinar in vitro mediante ensayos conocidos por el experto en la materia. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede reducir el tamaño del tumor o mejorar de otro modo los síntomas en un sujeto, por ejemplo, para lograr o prolongar la supervivencia sin progresión de los pacientes con cáncer, prolongar la supervivencia global de los pacientes con cáncer. Un experto en la materia debe ser capaz de determinar estas cantidades en función de factores tales como las dimensiones del sujeto, la intensidad de los síntomas del sujeto y la composición particular o vía de administración seleccionada. Además, un experto en la materia también puede determinar la cantidad eficaz de una proteína de unión a CTLA4 de la divulgación mediante el examen de la capacidad de activar linfocitos T in vitro.
Una composición de la presente divulgación se puede administrar a través de una o más rutas de administración utilizando uno o más de diversos métodos conocidos en la materia. Como apreciará el experto en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para las proteínas de unión a CTLA4 de la divulgación incluyen las vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión "administración parenteral", tal como se usa en el presente documento, significa modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, normalmente, mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal e infusión.
Como alternativa, una proteína de unión a CTLA4 de la divulgación se puede administrar a través de una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.
Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán al compuesto frente a la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la materia. Por ejemplo, en un ejemplo preferido, una composición terapéutica de la divulgación se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos divulgados en las patentes de EE. UU. n.° 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.4l3; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Ejemplos de implantes bien conocidos y módulos útiles en la presente divulgación se incluyen en: la patente de EE. UU. n.° 4.487.603, que divulga una bomba de microinfusión implantable para dispensar un medicamento a una velocidad controlada; la patente de EE. UU. n.° 4.486.194, que divulga un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la patente de EE. UU. n.° 4.447.233, que divulga una bomba de infusión de medicamentos para suministrar un medicamento a una velocidad de infusión precisa; la patente de EE. UU. n.° 4.447.224, que divulga un aparato de infusión implantable de flujo variable para la liberación continua de fármacos; la patente de EE. UU. n.° 4.439.196, que divulga un sistema de liberación osmótica de fármaco que tiene compartimentos multicámara; y la patente de EE. UU n.° 4.475.196, que divulga un sistema de liberación osmótica de fármacos. Muchos otros de estos implantes, sistemas de administración y módulos son conocidos por los expertos en la materia.
En determinados ejemplos, las proteínas de unión a CTLA4 de la divulgación se pueden formular para asegurar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB, del inglés blood-brain barrier) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos de la divulgación crucen la BBB (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, las Patentes de EE. Uu .4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender una o más fracciones que se transportan de manera selectiva al interior de células u órganos específicos, mejorando de este modo la administración dirigida de fármacos (véase, por ejemplo, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol.
29:685). Las fracciones de direccionamiento ilustrativas incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 5.416.016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038): anticuerpos (P. G. Bloeman et al. (1995) FEb S Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother.
39:180); receptor de proteína surfactante A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); pl20 (Schreier et al. (1994) J Biol. Chem. 269:9090): véase también K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; L. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
Prevención y tratamiento de enfermedades
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona el uso de la proteína de unión a CTLA4, el ácido nucleico, la célula hospedadora y la composición farmacéutica de la divulgación para prevenir y/o tratar enfermedades relacionadas con CTLA4, así como los métodos correspondientes. Las enfermedades relacionadas con CTLA4 que se pueden prevenir y/o tratar con la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación se describen en detalle como sigue.
Cáncer
El bloqueo de CTLA4 mediante la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación puede mejorar la respuesta inmunitaria a las células cancerosas en el paciente. Una proteína de unión a CTLA4 de la divulgación puede utilizarse sola para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. O como se describe a continuación, una proteína de unión a CTLA4 de la divulgación puede utilizarse junto con otras terapias antitumorales, por ejemplo, junto con otros agentes inmunogénicos, tratamientos del cáncer habituales u otras moléculas de anticuerpo.
Por consiguiente, en un ejemplo, la divulgación proporciona un método para prevenir y/o tratar un cáncer en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación para inhibir el crecimiento de las células tumorales en el sujeto.
Los cánceres preferidos que pueden prevenirse y/o tratarse utilizando la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación incluyen los cánceres que suelen responder a la inmunoterapia. Los ejemplos no limitantes de cánceres preferidos para tratamiento incluyen cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer rectal, melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastásico), cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de hígado, linfoma, neoplasia hemática, cáncer de cabeza y cuello, glioma, cáncer gástrico, cáncer nasofaríngeo, cáncer laríngeo, cáncer de cuello uterino, carcinoma del cuerpo uterino, osteosarcoma. Los ejemplos de otros cánceres que pueden tratarse usando los métodos de la divulgación incluyen cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de la región anal, cáncer de testículo, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemia crónica o aguda, que incluyen leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o del uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de linfocitos T, cánceres inducidos ambientalmente incluyendo aquellos inducidos por amianto y combinaciones de dichos cánceres.
Opcionalmente, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación se puede combinar con un agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células y células transfectadas con genes que codifican citocinas inmunoestimulantes (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Los ejemplos no limitantes de vacunas tumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MARTI y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-CSF.
En los seres humanos, se ha demostrado que algunos tumores son inmunogénicos tales como los melanomas. Se prevé que al elevar el umbral de activación de los linfocitos T mediante el bloqueo de CTLA4 con la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación, es posible activar respuestas tumorales en el hospedador. El bloqueo de CTLA4 (tal como el anticuerpo contra CTLA4, por ejemplo, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación) es probable que sea más eficaz cuando se combina con un protocolo de vacunación. Se han ideado muchas estrategias experimentales para la vacunación contra tumores (véase Rosenberg, S., 2000, "Development of Cancer Vaccines", ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C, 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; véase también Restifo, N. y Sznol, M., "Cancer Vaccines", cap. 61, págs. 3023-3043 en DeVita, V. et al. (eds.), 1997, "Cancer: Principles and Practice of Oncology". Quinta Edición). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna usando células tumorales autólogas o alogénicas. Se ha demostrado que estas vacunas celulares son más eficaces cuando las células tumorales se someten a transducción para expresar GM-CSF. Se ha demostrado que el GM-CSF es un potente activador de la presentación de antígenos para la vacunación de tumores (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 3539­ 43).
El estudio de la expresión génica y los patrones de expresión génica a gran escala en diversos tumores ha conducido a la definición de los denominados antígenos específicos de tumores (Rosenberg, S. A. (1999) Immunity 10: 281-7). En muchos casos, estos antígenos específicos de tumor son antígenos de diferenciación expresados en los tumores y en la célula de la que se originó el tumor, por ejemplo, antígenos de melanocitos gp100, antígenos MAGE y Trp-2. Y lo que es más importante, se puede demostrar que muchos de estos antígenos son las dianas de linfocitos T específicos de tumor encontrados en el hospedador. La proteína de unión a CTLA4 de la divulgación puede utilizarse junto con una colección de proteínas recombinantes y/o péptidos expresados en un tumor para generar una respuesta inmunitaria a estas proteínas. Estas proteínas son normalmente vistas por el sistema inmunitario como antígenos propios y, por lo tanto, son tolerantes a ellos. El antígeno tumoral también puede incluir la proteína telomerasa, que se necesita para la síntesis de telómeros de cromosomas y que se expresa en más de un 85 % de los cánceres humanos y en solo un número limitado de tejidos somáticos (Kim, N. et al. (1994) Science 266: 2011-2013). El antígeno tumoral también puede ser "neoantígeno" expresado en células cancerosas debido a mutaciones somáticas que alteran la secuencia de proteínas o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir, bcr-abl en el cromosoma Filadelfia).
Otras vacunas de tumores pueden incluir las proteínas de virus implicados en cánceres humanos tales como virus del papiloma humano (VPH), virus de la hepatitis (VHB y VHC) y virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi (VHSK). Otra forma de antígeno específico de tumor que puede utilizarse junto con el bloqueo de CTLA4 (tal como el anticuerpo contra CTLA4, por ejemplo, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación) son las proteínas de choque térmico (HSP, del inglés heat shock proteins) purificadas y aisladas del propio tejido tumoral. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales y estas HSP son altamente eficaces en la administración a las células que presentan antígenos para provocar la inmunidad tumoral (Suot, R. y Srivastava, P. (1995) Science 269:1585-1588; Tamura, Y. et al. (1997) Science 278:117-120).
Las células dendríticas (CD) son potentes células presentadoras de antígenos que se pueden utilizar para preparar respuestas específicas a antígenos. Las CD se pueden producir ex vivo y cargarse con diversos antígenos proteicos y peptídicos, así como con extractos de células tumorales (Nestle, F. et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). Las CD también se pueden transducir por medios genéticos para expresar también estos antígenos tumorales. Las CD también se han fusionado directamente a células tumorales con el propósito de inmunización (Kugler, A. et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). Como método de vacunación, la inmunización con CD puede combinarse de manera eficaz con el bloqueo de CTLA4 (tal como el anticuerpo contra CTLA4, por ejemplo, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación) para activar respuestas antitumorales más potentes.
La inmunoterapia con CAR-T (Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy, inmunoterapia con linfocitos T con receptor quimérico para el antígeno) es otra terapia celular para el tratamiento de tumores. Las linfocitos T con receptor quimérico para el antígeno (linfocitos T-CAR) son linfocitos T de un paciente que se han infectado genéticamente con una proteína quimérica de una fracción de unión a antígeno de un anticuerpo contra determinado antígeno tumoral acoplada con la cadena CD3-Z o la porción intracelular de FceRIy para expresar un receptor quimérico para el antígeno (CAR, del inglés chimeric antigen receptor). Además, se puede introducir una secuencia de señalización coestimuladora para aumentar la actividad citotóxica, la proliferación y la supervivencia de los linfocitos T, y la promoción de la liberación de citocinas. Después de la reprogramación, los linfocitos T del paciente expandidos in vitro para producir un gran número de linfocitos T-CAR específicos para el tumor después se transfieren al paciente para tratar el tumor. Los agentes bloqueadores de CTLA4 (tales como los anticuerpos contra CTLA4, por ejemplo, la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación) pueden utilizarse en combinación con la terapia de linfocitos T-CAR para activar una respuesta antitumoral más fuerte.
La proteína de unión a CTLA4 de la divulgación también puede combinarse con tratamientos habituales contra el cáncer. La proteína de unión a CTLA4 de la divulgación puede combinarse de manera eficaz con regímenes quimioterapéuticos. El fundamento científico del uso combinado de la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación y la quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería dar lugar a niveles incrementados de antígeno tumoral en la ruta de presentación del antígeno. Otras terapias combinadas que pueden dar como resultado una sinergia con el bloqueo de CTLA4 a través de la muerte celular son la radiación, cirugía y privación de hormonas. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el hospedador. Los inhibidores de la angiogénesis también pueden combinarse con la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte de células tumorales que pueden alimentar el antígeno tumoral en las rutas de presentación del antígeno hospedador.
La proteína de unión a CTLA4 de la divulgación también se puede utilizar en combinación con anticuerpos contra otros antígenos específicos del tumor. Dichos anticuerpos contra otros antígenos específicos del tumor incluyen, pero sin limitación, el anticuerpo anti-EGFR, el anticuerpo antivariante de EGFR, el anticuerpo anti-VEGFa, el anticuerpo anti-HER2 o el anticuerpo anti-CMET. Preferentemente, dichos anticuerpos son monoclonales.
La proteína de unión a CTLA4 de la divulgación también se pueden utilizar en combinación con anticuerpos biespecíficos que dirigen las células efectoras que expresan receptores Fc a o Fc y a células tumorales (véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.922.845 y 5.837.243). Se pueden usar anticuerpos biespecíficos para dirigir dos antígenos separados. Por ejemplo, se han usado anticuerpos biespecíficos antirreceptor de Fc/antiantígeno tumoral (por ejemplo, Her-2/neu) para dirigir macrófagos a sitios de tumor. Este direccionamiento puede activar de manera más eficaz las respuestas tumorales específicas. El brazo de los linfocitos T de estas respuestas se vería aumentado por el uso del bloqueo de CTLA4. Como alternativa, el antígeno se puede administrar directamente a las CD mediante el uso de anticuerpos biespecíficos que se unen al antígeno tumoral y un marcador de superficie celular específico de células dendríticas.
Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del hospedador por una gran diversidad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden superarse mediante la inactivación de proteínas que se expresan en los tumores y que son inmunosupresoras. Estas incluyen, entre otras, TGF-p (Kehrl, J. et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1o5o), IL-10 (Howard, M. y O'Garra, A. (1992) Immunology Today 13: 198-200) y ligando Fas (Hahne, M. et al. (1996) Science 274: 1363-1365). Los anticuerpos de cada una de estas entidades pueden utilizarse junto con la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación para contrarrestar los efectos del agente inmunosupresor y favorecer las respuestas inmunitarias tumorales por parte del hospedador.
Pueden utilizarse otros anticuerpos para activar la capacidad de respuesta inmunitaria del hospedador junto con anti-CTLA4. Los anticuerpos anti-CD40 son capaces de sustituir de manera eficaz la actividad auxiliar de los linfocitos T (Ridge, J. et al. (1998) Nature 393: 474-478) y se pueden utilizar junto con la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación. Los anticuerpos activadores para moléculas coestimuladoras de linfocitos T tal como OX-40 (Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero, I. et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997) e ICOS (Hutloff, A. et al. (1999) Nature 397: 262-266), así como los anticuerpos que bloquean la actividad de moléculas coestimuladoras negativas tales como CTLA-4 (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 5.811.097) o BTLA (Watanabe, N. et al. (2003) Nat Immunol 4:670-9), B7-h 4 (Sica, G. L. et al. (2003) Immunity 18:849-61) también pueden proporcionar mayores niveles de activación de linfocitos T.
El trasplante de médula ósea se utiliza actualmente para tratar diversos tumores de origen hematopoyético. Mientras que la enfermedad del injerto contra hospedador es una consecuencia de este tratamiento, el beneficio terapéutico puede obtenerse a partir de respuestas del injerto frente al tumor. El bloqueo de CTLA4 se puede usar para aumentar la eficacia de los linfocitos T específicos de tumor injertados del donante. También hay varios protocolos de tratamiento experimental que implican activación ex vivo y expansión de linfocitos T específicos de antígeno y transferencia adoptiva de estas células en receptores para linfocitos T específicos de antígenos contra tumor (Greenberg, R. & Riddell, S. (1999) Science 285: 546-51). Estos métodos también pueden usarse para activar las respuestas de los linfocitos T a agentes infecciosos tales como CMV. Se puede esperar que la activación ex vivo en presencia de la proteína de unión a CTLA4 de la divulgación aumente la frecuencia y la actividad de los linfocitos T transferidos de manera adoptiva.
Enfermedades infecciosas
Otros métodos de la divulgación se utilizan para tratar pacientes que han sido expuestos a toxinas o patógenos particulares. Por consiguiente, otro aspecto de la divulgación proporciona un método para prevenir o tratar una enfermedad infecciosa en un sujeto que comprende administrar al sujeto una proteína de unión a CTLA4 de la divulgación, de manera que el sujeto sea tratado por la enfermedad infecciosa.
Similar a su aplicación a los tumores como se ha analizado anteriormente, el bloqueo de CTLA4 se puede utilizar solo, o como adyuvante, en combinación con vacunas, para estimular la respuesta inmunitaria a patógenos, toxinas y autoantígenos. Los ejemplos de patógenos para los que este enfoque terapéutico puede ser particularmente útil, incluyen patógenos para los que actualmente no existe una vacuna eficaz o patógenos para los cuales las vacunas habituales son menos que completamente eficaces. Estos incluyen, pero sin limitación, HTV, hepatitis (A, B, y C), gripe, herpes, giardia, malaria, leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas Aeruginosa. El bloqueo de CTLA4 es particularmente útil contra infecciones establecidas por agentes tales como el VIH que presentan antígenos alterados durante el curso de las infecciones. Estos nuevos epítopos se reconocen como extraños en el momento de la administración de anti-CTLA4 humano, provocando así una fuerte respuesta de linfocitos T que no se ve atenuada por señales negativas a través de CTLA4.
Algunos ejemplos de virus patógenos que provocan infecciones tratables mediante métodos de la divulgación incluyen el VIH, hepatitis (A, B o C), virus del herpes (p. ej., VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II y CMV, virus de Epstein Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, cornovirus, virus respiratorio sincicial, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus de molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis arboviral.
Algunos ejemplos de bacterias patógenas que provocan infecciones tratables mediante métodos de la divulgación incluyen clamidia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos y conococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, carbunco, peste, leptospirosis y bacterias de la enfermedad de Lyme.
Algunos ejemplos de hongos patógenos que provocan infecciones tratables mediante los métodos de la divulgación incluyen Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Género Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.
Algunos ejemplos de parásitos patógenos que provocan infecciones tratables mediante los métodos de la divulgación incluyen Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambía, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi, Nippostrongylus brasiliensis.
En todos los métodos anteriores, el bloqueo de CTLA4 puede combinarse con otras formas de inmunoterapia tales como tratamiento con citocinas (por ejemplo, interferones, GM-CSF, G-CSF, IL-2) o terapia de anticuerpos biespecíficos, que proporciona una presentación de antígenos tumorales aumentada (véase, por ejemplo, Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123).
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran la invención, pero no debe interpretarse como limitación de su alcance, que se define por las reivindicaciones.
Ejemplo 1: Cribado del anticuerpo de cadena pesada de un solo dominio contra CTLA4
1.1 Construcción de la biblioteca y cribado
La proteína de fusión CTLA4-Fc (SEQ ID NO: 129) para la inmunización se expresó en células HEK293 (pCDNA4, Invitrogen, Cat. V86220) y se purificó mediante cromatografía de afinidad con proteína A. Se eligió un Camelus bactrianus para la inmunización. Después de 4 inmunizaciones, se aislaron linfocitos de 100 ml de sangre periférica de camello y se extrajo el ARN total con el kit de extracción de ARN (QIAGEN). El ARN extraído se transcribió de forma inversa a ADNc con el kit Super-Script III FIRST STRANDSUPERMIX de acuerdo con las instrucciones. Los fragmentos de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de cadena pesada se amplificaron mediante PCR con cebadores internos:
Primera ronda de PCR:
Cebador cadena arriba: GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC (SEQ ID NO: 110);
Cebador cadena abajo: GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC (SEQ ID NO: 111).
Segunda ronda de PCR:
Productos de la PCR de la primera ronda de PCR como molde,
Cebador cadena arriba: GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG (SEQ ID NO: 112);
Cebador cadena abajo: GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT (SEQ ID NO: 113).
Se recuperaron fragmentos de ácido nucleico del anticuerpo de cadena pesada de un solo dominio dianas y se clonaron en el vector de presentación en fagos pCDisplay-3 (Creative Biolabs, Cat: VPT4023) utilizando las endonucleasas PstI y NotI (de NEB). A continuación, los productos se electroporaron en la célula competente TG1 de E. coli, y se construyó y verificó la biblioteca de presentación en fagos para anticuerpos de cadena pesada de un solo dominio contra CTLA4. Mediante la colocación de diluciones en serie, la capacidad de la biblioteca se determinó en aproximadamente 108. Para determinar la relación de inserción de la biblioteca, se seleccionaron al azar 50 clones para la PCR de las colonias. Los resultados revelaron una relación de inserción superior al 99 %.
1.2 Selección de anticuerpos de cadena pesada de un solo dominio contra CTLA4
Las placas multipocillos se recubrieron con la proteína de fusión CTLA4-Fc y la proteína Fc a 5 pg/pocillo, a 4 °C durante una noche. Al día siguiente, tras el bloqueo con leche desnatada al 1 % a temperatura ambiente durante 2 horas, se añadieron 100 pl de fagos (8 * 1011 tfu, de la biblioteca de presentación en fagos para anticuerpos de cadena pesada de un solo dominio de camello construida en 1.1), a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de esto, el fago no unido a Fc se transfirió de nuevo a los pocillos recubiertos con la proteína de fusión CTLA4-Fc mediante un lavado con PBST (0,05 % de Tween 20 en PBS), a temperatura ambiente durante 1 hora. Los fagos que se unen de manera específica a CTLA4 se disociaron con trietilamonio (100 mM) y se utilizaron para infectar TG1 de E. coli en fase logarítmica, lo que produjo fagos que después se purificaron para la siguiente ronda de cribado. El mismo crinado se repitió durante 3 a 4 rondas. De este modo, se enriquecieron los clones positivos, logrando el propósito de seleccionar anticuerpos específicos contra CTLA4 a partir de la biblioteca de anticuerpos mediante la tecnología de presentación en fagos.
1.3 Selección específica de clones positivos individuales mediante inmunoensayo ligado a enzima (ELISA) de fagos
Los fagos positivos a la unión de CTLA4 obtenidos tras 3 rondas de selección se utilizaron para infectar E.coli no tratada y se emplacaron. Se seleccionaron al azar 96 colonias individuales para su cultivo, y se produjeron y purificaron los fagos respectivamente. Las placas se recubrieron con la proteína de fusión CTLA4-Fc a 4 °C durante la noche; se añadieron los fagos de muestra obtenidos (fagos no tratados como control) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió el anticuerpo primario, anticuerpo de ratón antimarcador HA (Beijing Kangwei Shiji Biotech. Ltd ), después de los lavados y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora para la reacción. Se añadió el anticuerpo secundario, anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina de cabra antimurino (Amyject Scientific Ltd.), después de los lavados y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora para la reacción. Se añadió una solución cromógena de fosfatasa alcalina después de los lavados y se leyó el valor de absorción a 405 nm de longitud de onda. Cuando la DO del pocillo de la muestra es 3 veces mayor que la DO del pocillo de control, la muestra se determina como positiva. Las bacterias de los pocillos positivos se transfirieron y cultivaron en medio líquido LB complementado con 100 |jg/ml de ampicilina para la extracción de plásmidos y la posterior secuenciación.
Las secuencias de proteínas de cada clon se analizaron de acuerdo con el programa informático de alineación de secuencias Vector NTI. Los clones con las mismas secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 se consideran el mismo anticuerpo, mientras que los clones con diferentes secuencias de CDR se consideran como un anticuerpo diferente y se excluyeron aquellas secuencias con terminación temprana. Finalmente se obtuvieron un total de 34 anticuerpos diferentes.
Ejemplo 2 Evaluación preliminar de anticuerpos de cadena pesada de un solo dominio contra CTLA4 2.1 Expresión de anticuerpos de cadena pesada de un solo dominio en E.coli y purificación de los mismos
Las secuencias de codificación de los 34 anticuerpos de cadena pesada de un solo dominio obtenidos mediante el análisis de secuenciación se subclonaron en el vector de expresión PET32b (Novagen, número de producto: 69016­ 3) y el plásmido recombinante correcto se transformó en la cepa hospedadora de expresión BL1 (DE3) (Tiangen Biotech, CB105-02) y se emplacó en medio sólido LB con 100 microgramos por mililitro de ampicilina durante la noche a 37 °C. Se inocularon colonias individuales y se cultivaron durante la noche, se transfirieron al día siguiente para su expansión a 37 °C mediante agitación. Cuando el cultivo alcanzó el valor de DO de 0,6 a 1, se añadió IPTG 0,5 mM para la inducción a 28 °C durante la noche con agitación. Al día siguiente, las bacterias se recogieron mediante centrifugación y se lisaron para obtener extractos brutos de anticuerpos. A continuación se utilizó la cromatografía de afinidad con iones de níquel para purificar las proteínas de los anticuerpos, lo que dio lugar a proteínas de anticuerpos con una pureza superior al 90 %.
2.2 Unión específica del anticuerpo candidato de cadena pesada de un solo dominio contra CTLA4 a la proteína CTLA4 humana
Las placas se recubrieron con la proteína de fusión CTLA4-Fc durante una noche a 4 °C y se añadió a cada pocillo lOng del anticuerpo de cadena pesada de un solo dominio obtenido en el ejemplo 2.1 (el control era un anticuerpo de un solo dominio que no se unía a la proteína CTLA4-Fc) y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, el anticuerpo primario antimarcador His (adquirido en Beijing Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd.) se añadió y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, un anticuerpo secundario de cabra antimurino marcado con peroxidasa de caballo (Yiqiao Shenzhou, Cat: SSA007200) se añadió y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió un agente cromógeno y se leyó la absorbencia a 405 nm.
Las placas se recubrieron con proteína Fc durante una noche a 4 °C y se añadieron a cada pocillo 10 ng del anticuerpo de un solo dominio de cadena pesada obtenido en el ejemplo 2.1 (el control fue un anticuerpo de un solo dominio contra otras dianas no relacionadas) y se dejaron reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, un anticuerpo de conejo anti-Fc humano (adquirido en Shanghai Pu Xin Biotechnology Co, Ltd.) se añadió y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, el anticuerpo de cabra anticonejo marcado con peroxidasa de rábano (adquirido en Shanghai Pu Xin Biotechnology Co., Ltd.) y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado, se añadió un agente cromógeno y se leyó la absorbencia a 405 nm.
Se considera que el anticuerpo candidato se une a la proteína CTLA4-Fc cuando la relación del valor de DO para la proteína CTLA4-Fc dividido por el valor de DO para el control no tratado es mayor o igual a 4; y de manera simultánea, el anticuerpo anterior capaz de unirse a la proteína del antígeno CTLA4-Fc, cuando la relación del valor de DO de unión a CTLA4-Fc dividido por el valor de DO de unión a la proteína Fc es >5, se considera que se une de manera específica a la fracción de CTLA4 y no a la fracción Fc.
Los resultados mostraron que de los 34 anticuerpos, 25 (en negrita) podrían unirse de manera específica a CTLA4 sin unirse a Fc. Los resultados se muestran en la siguiente tabla 1:
Tabla 1
Figure imgf000019_0001
continuación
Figure imgf000020_0001
2.3 Examen del efecto del bloqueo del anticuerpo de cadena pesada de un solo dominio contra CTLA4 a la interacción entre CD80 y CTLA4 mediante ELISA competitivo
La proteína CTLA4-Fc y la proteína CD80-Fc (SEQ ID NO: 130) se obtuvieron mediante la expresión en células HEK293 (pCDNA4, Invitrogen, Cat V86220). La proteína CD80-Fc-biotina biotinilada se obtuvo con el kit Thermo Biotinlytion.
Las placas se recubrieron durante la noche a 4 °C con la proteína de fusión CTLA4-Fc a 0,5 pg/pocillo seguido de la adición a cada pocillo de 500 ng del anticuerpo de cadena pesada de un solo dominio que se une de manera específica a CTLA4 confirmado en el ejemplo 2.2 (los controles son anticuerpos de un solo dominio contra otras dianas no relacionadas o simplemente tampón) y 25 ng de CD80-Fc-biotina (no se añadió ningún anticuerpo o proteína al grupo sin tratamiento, sólo se añadió un volumen igual de tampón), y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió SA-HRP (adquirido en Sigma) y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de añadir la solución cromógena, se leyó la absorbencia a una longitud de onda de 405 nm. Cuando el valor de la DO de la muestra en relación con el valor de la DO del control es <0,8, se considera que el anticuerpo posee un efecto de bloqueo.
Como se muestra en la tabla 2, los anticuerpos n.° C1, C16, C27, J37, J42, 128, 145, 155, 165 mostraron un efecto de bloqueo de la interacción CD80/CTLA4.
Tabla 2
Figure imgf000020_0002
continuación
Figure imgf000021_0002
2.4 Unión del anticuerpo de cadena pesada de un solo dominio contra CTLA4 a la proteína CTLA4 de ratón
La proteína CTLA4-Fc de ratón (SEQ ID NO: 131) se obtuvo mediante la expresión en células HEK293 (pCDNA4, Invitrogen, Cat V86220). La proteína mCTLA4-Fc-biotina biotinilada se obtuvo con el kit Thermo Biotinlytion.
Las placas se recubrieron con el anticuerpo de un solo dominio de cadena pesada obtenido en el ejemplo 2.1 (el grupo de control es un anticuerpo de un solo dominio contra otra diana no relacionada), es decir, los cuatro anticuerpos, 145, 155, C1 y C27, con el mejor efecto de bloqueo seleccionados de acuerdo con los resultados del ejemplo 2.3, a 0,5 jg/pocillo durante la noche a 4 °C y se añadieron 100 |jg de proteína de fusión CTLA4-Fc de ratón a cada pocillo y se dejó reaccionar durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Después de esto, se añadió SA-HRP (adquirido en Sigma) y la mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Después del lavado, se añadió un agente cromógeno y se leyó la absorbencia a 405 nm. Los resultados se muestran en la tabla 3.
Tabla 3
Figure imgf000021_0001
Se puede observar que el anticuerpo de un solo dominio de cadena pesada contra CTLA4 humano de la presente divulgación no se une a la proteína CTLA4-Fc de ratón.
2.5 Curvas de unión de los anticuerpos de cadena pesada de un solo dominio contra CTLA4 a la proteína del antígeno CTLA4-Fc
Las placas se recubrieron con el anticuerpo de cadena pesada de un solo dominio contra CTLA4 obtenido a 0,5 jg/pocillo durante toda la noche a 4 °C seguido de la adición de una serie de diluciones en gradiente de la proteína de fusión CTLA4-Fc y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG-Fc humana marcado con peroxidasa de rábano picante (lakepharma) y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió una solución cromógena de peroxidasa de rábano picante y se leyó la absorbencia a una longitud de onda de 405 nm. Se utilizó SotfMax Pro v5.4 para el procesamiento de los datos y el análisis de mapeo para obtener la curva de unión del anticuerpo a CTLA4 y el valor CE50 (para el anticuerpo n.° 14, aproximadamente 50 ng/ml; para el anticuerpo n.° 155, aproximadamente 13 ng/ml; para el anticuerpo n.°C1, aproximadamente 123 ng/ml; para el anticuerpo n.° C27, aproximadamente 93 ng/ml) mediante un ajuste de cuatro parámetros. Los resultados de 145 y 155 se muestran en la figura 1A, los resultados de C1 y C27 se muestran en la figura 1B.
2.6 Curvas de bloqueo de los anticuerpos de cadena pesada de un solo dominio contra CTLA4 sobre la interacción entre CD80 y CTLA4
Las placas se recubrieron con 0,5 jg/pocillo de proteína de fusión CTLA4-Fc durante la noche a 4 °C seguido de la adición de 100 pl de una serie de dilución en gradiente (que contenía 250 ng/ml de CD80-Fc-biotina) de 100 j l de anticuerpo de un solo dominio bloqueador de CTLA4 obtenido en el ejemplo 2.1 por pocillo, y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió SA-HRP (adquirido en Sigma) y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de añadir la solución cromógena, se leyó la absorbencia a una longitud de onda de 405 nm.
Se utilizó SotfMax Pro v5.4 para el procesamiento de los datos y el análisis gráfico para obtener la curva de bloqueo y el valor CI50 de los anticuerpos n.° C1, C27, 145, 155 a CD80/CTLA4 a través de un ajuste de cuatro parámetros (CI50 para el anticuerpo n.° C1 es 852 ng/ml, para el anticuerpo n.° C27 es de aproximadamente 731 ng/ml, para el anticuerpo n.° 145 es de aproximadamente 1,947 pg/ml, para el anticuerpo n.°155 es de aproximadamente 4,690 pg/ml). Los resultados de 145 y 155 se muestran en la figura 2A, los resultados de C1 y C27 se muestran en la figura 2B.
2.7 Preparación de la proteína de fusión Fc del anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4
La secuencia de aminoácidos de la región IgGl-Fc humana (SEQ ID NO: 132) se obtuvo a partir de la secuencia de aminoácidos de la región constante de la inmunoglobulina gamma 1 (IgGl) humana de la base de datos de proteínas Uniprot (P01857). El fragmento de ácido nucleico que codifica la IgG1-Fc humana se obtuvo a partir de ARN total de PBMC humano mediante PCR de transcripción inversa y el fragmento de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión del anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 obtenido en el ejemplo anterior y Fc se obtuvo mediante PCR de superposición, después se subclonó en el vector pCDNA4 (Invitrogen, Cat V86220).
El plásmido de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio recombinante se transfectó en células HEK293 para la expresión del anticuerpo. Los plásmidos de expresión recombinantes se diluyeron en el medio Freestyle 293 y se añadieron a la solución de PEI (polietilenimina) para su transformación. Cada mezcla de plásmido/PEI se añadió a la suspensión de células HEK293 y se incubó a 37 °C y CO2 al 10 % a 90 rpm. Al mismo tiempo, se añadieron 50 pg/l de IGF-1. Cuatro horas después se complementó con medio EX293, glutamina 2 mM e IGF-1 50 pg/l, y se cultivó a 135 rpm. Después de 24 horas, se añadió VPA 3,8 mM. Después de cultivar durante 5 a 6 días, el sobrenadante de la expresión transitoria se recogió y se purificó mediante cromatografía de afinidad con proteína A para obtener la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4.
Las secuencias de las proteínas de fusión Fc de los anticuerpos n.° C1, C27, 145, 155 se muestran en los SEQ ID NO: 114 a 117, respectivamente.
2.8 Curvas de bloqueo de las proteínas de fusión Fc-anticuerpo de cadena pesada contra CTLA4 sobre la interacción de CD80 y CTLA4
Las placas se recubrieron con la proteína de fusión CTLA4-Fc 0,5 pg/pocillos durante la noche a 4 °C seguido de la adición de 100 pl de una serie de dilución en gradiente (que contenía 250 ng/ml de CD80-Fc-biotina) del anticuerpo de un solo dominio bloqueador de CTLA4 obtenido en el ejemplo 2.7 por pocillo, y se dejó reaccionar durante 1,5 hora a temperatura ambiente. Se añadió SA-HRP (adquirido en Sigma) y se dejó reaccionar durante 1,5 hora a temperatura ambiente. Después de añadir la solución cromógena, se leyó la absorbencia a una longitud de onda de 405 nm.
Se utilizó SotfMax Pro v5.4 para el procesamiento de los datos y el análisis gráfico para obtener la curva de bloqueo y el valor CI50 de los anticuerpos n.° 145, 155 contra CD80/CTLA4 mediante el ajuste de cuatro parámetros (la CI50 para el anticuerpo n.° 145 es de aproximadamente 339 ng/ml, para el anticuerpo n.° 155 es de aproximadamente 261 ng/ml). Los resultados se muestran en la figura 3.
Ejemplo 3 Humanización de anticuerpos de un solo dominio contra CTLA4
La humanización se realiza mediante el método de humanización de aminoácidos de la superficie de la proteína (rechapado) y el método de injerto de marco universal para la humanización de VHH (injerto de CDR a un marco universal).
Las etapas de la humanización son las siguientes: El modelado homólogo de los anticuerpos n.° C27 y C1 se realizó con el programa informático de modelado Modeller9. La secuencia homóloga de referencia es el anticuerpo cAb-Lys3 (código PDB: 1xFP) y la accesibilidad relativa al disolvente de los aminoácidos se calcula de acuerdo con la estructura tridimensional de la proteína. Si uno de los aminoácidos de los anticuerpos n.° C27 y C1 se expone a un disolvente, se sustituyó por el aminoácido en la misma posición de la secuencia del anticuerpo humano de referencia DP-47, hasta que se hayan completado todas las sustituciones.
El anticuerpo n.° C27 se humanizó y se obtuvieron cinco variantes humanizadas del anticuerpo n.° C27; el anticuerpo n.° C1 se humanizó y se obtuvieron cuatro variantes humanizadas del anticuerpo n.° C1. La tabla 4 enumera el número de identificación de secuencia de estas variantes humanizadas, así como los cambios de aminoácidos en las mismas, con números de restos de aminoácidos siguiendo la numeración de Kabat. En la figura 4a se muestra la alineación de las secuencias humanizadas C27 y en la figura 4b se muestra la alineación de las secuencias humanizadas C1.
Figure imgf000023_0001
Ejemplo 4 Preparación de la proteína del anticuerpo bloqueador de CTLA4 utilizando células de mamífero
4.1 Preparación de la proteína de fusión Fc del anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4
La secuencia de aminoácidos de la región IgGl-Fc humana (SEQ ID NO: 132) se obtuvo a partir de la secuencia de aminoácidos de la región constante de la inmunoglobulina gamma1 humana (IgG1) de la base de datos de proteínas Uniprot (P01857). El fragmento de ácido nucleico que codifica la IgG1-Fc humana se obtuvo a partir de ARN total de PBMc humano mediante PCR de transcripción inversa y el fragmento de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión del anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 obtenido en el ejemplo anterior y Fc se obtuvo mediante PCR de superposición, después se subclonó en el vector pCDNA4 (Invitrogen, Cat V86220).
El plásmido de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio recombinante se transfectó en células HEK293 para la expresión del anticuerpo. Los plásmidos de expresión recombinantes se diluyeron en el medio Freestyle 293 y se añadieron a la solución de PEI (polietilenimina) para su transformación. Cada mezcla de plásmido/PEI se añadió a la suspensión de células HEK293 y se incubó a 37 °C y CO2 al 10 % a 90 rpm. Al mismo tiempo, se añadieron 50 pg/l de IGF-1. Cuatro horas después se complementó con medio EX293, glutamina 2 mM e IGF-1 50 pg/l, y se cultivó a 135 rpm. Después de 24 horas, se añadió VPA 3,8 mM. Después de cultivar durante 5 a 6 días, el sobrenadante de la expresión transitoria se recogió y se purificó mediante cromatografía de afinidad con proteína A para obtener la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4.
Las secuencias de las proteínas de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 obtenidas se muestran en los SEQ ID NO: 114 a 126, respectivamente, en donde los SEQ ID NO: 118 a 126 son proteínas de fusión Fc de anticuerpos de un solo dominio contra CTLA4 humanizados. Estas proteínas de fusión comprenden un dominio de unión a CTLA4 y forman homodímeros, cada uno de los cuales comprende dos dominios de unión a CTLA4, por lo que estas proteínas de fusión también se denominan proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 bivalente.
4.2 Preparación de anticuerpos contra CTLA4 a partir de BMS
El gen del anticuerpo anti-CTLA4 ipilimumab a partir de BMS, Inc. se clonó mediante el método del anticuerpo 10D1 en el documento US20020086041 y se clonó en el vector pCDNA4.
El plásmido recombinante se transfectó transitoriamente en células HEK293 mediante el mismo método que en el ejemplo 4.1 y el anticuerpo anti-CTLA4 resultante de BMS se renombró como 10D1.
4.3 Comparación de la expresión de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 y los anticuerpos contra CTLA4 conocidos
Utilizando el mismo sistema de expresión y las mismas condiciones de transfección transitoria, el nivel de expresión de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 de la presente divulgación era superior a 400 mg/l, mientras que el nivel de expresión del anticuerpo 10D1 era de aproximadamente 150 mg/l. Este resultado indica que la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 de la presente divulgación tiene una estructura más estable y puede dar lugar a un mayor nivel de expresión que los anticuerpos contra CTLA4 conocidos.
4.4 Preparación de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente
Se obtuvo un fragmento de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de dos anticuerpos de un solo dominio contra CTLA4 en tándem y una región Fc mediante PCR superpuesta, y después se subclonó en el vector pCDNA4 (Invitrogen, Cat V86220). El plásmido recombinante construido se utilizó para transfectar células HEK293 para la expresión transitoria mediante el mismo método descrito en 4.1. Se obtuvo una proteína de fusión de dos anticuerpos de un solo dominio contra CTLA4 en tándem y un Fc, que podría formar una molécula dimérica con cuatro dominios de unión a CTLA4, también llamada proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente. El nivel medio de expresión transitoria de las proteínas de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalentes es de unos 400 mg/l, comparable al de las proteínas de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 bivalentes.
Ejemplo 5 Caracterización de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4
5.1 Capacidad de unión de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 a CTLA4 (mediante ELISA)
Las placas se recubrieron con 0,5 pg/pocillo de la proteína de fusión Fc de un solo dominio contra CTLA4 obtenida por el ejemplo 2.7 y 4.1 o de la proteína 10D1 obtenida por el ejemplo 4.2 durante la noche a 4 °C seguido de la adición de una serie de dilución en gradiente de CTLA4-Fc-biotina, y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió SA-HRP (adquirido en Sigma) y se dejó reaccionar durante 1,5 hora a temperatura ambiente.
Después de añadir la solución cromógena, se leyó la absorbencia a una longitud de onda de 405 nm.
Se utilizó SotfMax Pro v5.4 para el procesamiento de los datos y el análisis gráfico. Mediante un ajuste de cuatro parámetros, se obtuvieron la curva de unión y el valor CE50 del anticuerpo contra CTLA4 (el valor CE50 de todos los anticuerpos de prueba es de aproximadamente 60 a 70 ng/ml) para reflejar la afinidad a CTLA4.
Los resultados se muestran en la figura 5, donde la coordenada longitudinal es la DO405 y la ordenada horizontal es la concentración de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 (o proteína 10D1) (en ng/ml); cuatro formas diferentes humanizadas de la proteína de fusión Fc del anticuerpo n.° C27 se marcaron como: huC27v1-LdFc (SEQ ID NO: 118), huC27v2-LdFc (SEQ ID NO: 119), huC27v3-LdFc (SEQ ID NO: 120) y huC27v4-LdFc (SEQ ID NO: 121). Las cuatro proteínas tienen una afinidad por CTLA4 comparable, y comparable a C27-LdFc no humanizado y al conocido anticuerpo contra CTLA4 10D1 de BMS.
5.2 Capacidad de unión de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 a CTLA4 (mediante ELISA)
Las placas se recubrieron con 0,5 pg/pocillo de la proteína de fusión Fc de un solo dominio contra CTLA4 obtenida por el ejemplo 2.7 y 4.1 durante la noche a 4 °C, seguido de la adición de una serie de dilución en gradiente de CTLA4-Fc-biotina, y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió SA-HRP (adquirido en Sigma) y se dejó reaccionar durante 1,5 hora a temperatura ambiente. Después de añadir la solución cromógena, se leyó la absorbencia a una longitud de onda de 405 nm.
Se utilizó SotfMax Pro v5.4 para el procesamiento de los datos y el análisis gráfico. Mediante un ajuste de cuatro parámetros, se obtuvieron la curva de unión y el valor CE50 del anticuerpo contra CTLA4 (el valor CE50 de todos los anticuerpos de prueba es de aproximadamente 25 a 35 ng/ml) para reflejar la afinidad a CTLA4.
Los resultados se muestran en la figura 6, donde la coordenada longitudinal es la DO405 y la ordenada horizontal es la concentración de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 (en ng/ml); el triángulo representa la forma humanizada de la proteína de fusión Fc del anticuerpo n.° C27, huC27v3-LdFc (SEQ ID NO: 120), el cuadrado representa la forma humanizada de la proteína de fusión Fc del anticuerpo n.° C1, huC1v4-Ld-Fc (SEQ ID NO: 126) y el círculo representa la proteína de fusión Fc del anticuerpo n.° C1, C1-ld-Fc. La C1-ld-Fc tiene una coloración mucho más elevada que los otros dos debido al largo tiempo de reacción y, por lo tanto, muestra una mejor CE50. Sin embargo, en realidad no hay diferencia en la afinidad de las tres proteínas por CTLA4.
5.2 Efecto de bloqueo de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 a la interacción CTLA4-CD80 (mediante ELISA competitivo)
Las placas se recubrieron con 0,5 pg/pocillo de la proteína de fusión CTLA4-Fc durante la noche a 4 °C seguido de la adición de 100 pl de una serie de dilución en gradiente (que contenía 250 ng/ml de CD80-Fc-biotina) de la proteína de fusión Fc de un solo dominio contra CTLA4 obtenida en el ejemplo 4.1 o la proteína 10D1 obtenida en el ejemplo 4.2 por pocillo, y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió SA-HRP (adquirido en Sigma) y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de añadir la solución cromógena, se leyó la absorbencia a una longitud de onda de 405 nm.
Se utilizó SotfMax Pro v5.4 para el procesamiento de los datos y el análisis gráfico. Mediante un ajuste de cuatro parámetros, se obtuvieron la curva de bloqueo y el valor CI50 del anticuerpo contra CTLA4-CD80. Los resultados se muestran en la figura 7A y en la figura 7B. Se puede observar que los dos anticuerpos de un solo dominio diferentes n.° C27 y C1, ya sean humanizados o de secuencia original, tienen una capacidad comparable para bloquear la interacción CTLA4-CD80 y son superiores al anticuerpo ya comercializado de BMS (marcado como 10D1).
5.3 Capacidad de unión de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente a CTLA4 (mediante ELISA)
Las placas se recubrieron con 0,5 pg/pocillo de la proteína de fusión Fc de un solo dominio contra CTLA4 obtenida en el ejemplo 4.1 y la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente obtenida en el ejemplo 4.4 durante la noche a 4 °C seguido de la adición de una serie de dilución en gradiente de CTLA4-Fc-biotina, y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió SA-HRP (adquirido en Sigma) y se dejó reaccionar durante 1,5 hora a temperatura ambiente. Después de añadir la solución cromógena, se leyó la absorbencia a una longitud de onda de 405 nm.
Se utilizó SotfMax Pro v5.4 para el procesamiento de los datos y el análisis gráfico. Mediante un ajuste de cuatro parámetros, se obtuvieron la curva de unión y el valor CE50 del anticuerpo contra CTLA4 (el valor CE50 de todos los anticuerpos de prueba es de aproximadamente 25 a 35 ng/ml) para reflejar la afinidad a CTLA4.
Los resultados se muestran en la figura 8, donde la coordenada longitudinal es la DO405 y la ordenada horizontal es la concentración de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 (en ng/ml); triángulo representa la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente, huC1v4-tet-Fc(SEQ ID NO: 128); el cuadrado representa la forma humanizada de la proteína de fusión Fc del anticuerpo n.° C1, huC1v4-Fc; el círculo representa la proteína de fusión Fc del anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 n.°C1, C1-ld-Fc. La CE50 de las tres proteínas es ligeramente diferente, pero teniendo en cuenta que el peso molecular de la proteína tetravalente es aproximadamente 5/4 del de la molécula divalente, no hay diferencia en la afinidad de las tres proteínas por CTLA4 cuando se convierte a una concentración molar.
5.4 Identificación y comparación de la capacidad de unión de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 bivalente y tetravalente a CTLA4 (método de SPR)
La cinética de unión de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 obtenida en los ejemplos anteriores al CTLA4 humano recombinante se midió mediante el método de resonancia de plasmón superficial (SRP, del inglés surface plasmon resonance) con un instrumento BIAcore X100. El anticuerpo recombinante de camello anti-Fc humano se acopló a un chip biosensor CM5 para obtener aproximadamente 1000 unidades de respuesta (UR). Para las mediciones de cinética, los anticuerpos se diluyeron (1,37 a 1000 nM) con HBS-EP tampón 1* (GE, n.° de cat. BR-1006-69) hasta una concentración fija y se inyectaron durante 120 s a 25 °C para asegurar la obtención de un valor de respuesta superior a 100 UR, y se siguió con una dilución en serie de tres veces para la proteína de fusión de CTLA4 y Fc de ratón y se inyectó durante 120 s a 25 °C con un tiempo de disociación de 30 min, se regeneró con 10 mM de Glicina-HCl (pH 2,0) durante 120 s. Las tasas de unión (kon) y las tasas de disociación (koff) se calcularon utilizando un modelo de unión simple de Languir (Programa informático BlAcore Evaluation versión 3.2). La constante de disociación en equilibrio (kD) se calcula como la relación de koff/kon.
Las afinidades de unión medidas de los anticuerpos anti-CTLA4 se muestran en la tabla 5. Los resultados muestran que la afinidad de la molécula tetravalente es ligeramente inferior a la de la molécula divalente, posiblemente debido a un determinado impedimento estérico.
Tabla 5
Figure imgf000026_0001
5.4 Capacidad de bloqueo de la proteína de fusión Fc de un solo dominio contra CTLA4 bivalente y tetravalente en la interacción CTLA4/CD80 (mediante un experimento de neutralización celular)
Se inoculó una placa de 96 pocillos con 1,5 * 105 linfocitos T Jurkat (del Banco de Células de Shanghai de la Academia China de Ciencias), complementada con anti-CD3 humano (50 ng/ml) e incubada a 37 °C durante 15 min, después se añadieron una dilución en gradiente de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 bivalente o tetravalente (se añadieron de 30 ng/ml a 0,94 ng/ml y 100 ng/ml de proteína de fusión CTLA4-Fc a la dilución) y células Raji de igual densidad (del Banco de Células de Shanghai de la Academia China de Ciencias). Después de 24 horas de cultivo, se recogió el sobrenadante para detectar la expresión de IL-2. Los datos se procesaron con Soft Max para calcular el efecto de la inhibición de la IL-2 por la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 bivalente o tetravalente mediante la neutralización de la proteína de fusión CTLA4-Fc. Los efectos se compararon utilizando la CE50.
Los resultados se muestran en la figura 9. Las proteínas de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 bivalentes y tetravalentes (representadas por el cuadrado y el triángulo, respectivamente) fueron equivalentes en la inhibición de CTLA4-CD80, y fueron superiores al anticuerpo contra CTLA4 ya comercializado de BMS (marcado como 10D1, indicado por un círculo).
5.5 Especificidad de unión de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 para la proteína CTLA4
Las células humanas HEK293 expresan transitoriamente las proteínas CTLA4, CD28, PD1 humanas en las membranas mediante la transfección transitoria de un plásmido que transporta los genes de la proteína humana de la familia B7 de longitud completa (pCDNA4, Invitrogen, Cat V86220). El plásmido también permite fusionar el extremo C de la proteína diana con la proteína EGFP para poder examinar el nivel de proteína de la familia B7 expresada en la membrana mediante la intensidad de fluorescencia verde. Las estirpes celulares construidas y transfectadas transitoriamente incluyen 293-CTLA4-EGFP, 293-PD1-EGFP, 293-CD28-EGFP.
Las células construidas se resuspendieron en tampón PBS-BSA al 0,5 % y se añadió el anticuerpo huC1v4-tet-Fc. Al mismo tiempo, se estableció un control negativo de 2 |jg de un anticuerpo de un solo dominio contra otra diana no relacionada y se incubó en hielo durante 20 minutos. Después del lavado, se añadió el anticuerpo secundario anti-hIg-PE de eBioscience, en hielo durante 20 minutos. Después del lavado, las células se resuspendieron en 500 j l de tampón PBS-BSA al 0,5 % y se detectaron mediante citometría de flujo.
Los resultados se muestran en la figura 10. La fila superior muestra el grupo de control, la fila inferior muestra los grupos de muestra. Está claro que huC1v4-tet-Fc se une de manera específica a la proteína CTLA4 humana únicamente, no a otras proteínas de la familia B7.
5.6 Unión de la proteína de fusión Fc de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente a la proteína CTLA4 de mono
La proteína CTLA4-Fc de mono se compró a Yiqiao Shenzhou. La proteína biotinilada huC1v4-tet-Fc-biotina se obtuvo utilizando el kit Thermo Biotinlytion con la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente obtenida en el ejemplo 4.4.
Las placas se recubrieron con la proteína CTLA4-Fc de mono o con la proteína CTLA4-Fc humana, 0,5 pg/pocillo, durante la noche a 4 °C, seguido de la adición de series de dilución en gradiente de la huC1 v4-tet-Fc-biotina, y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se añadió SA-HRP (adquirido en Sigma) y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 1,5 horas. A continuación, se añadió un agente cromógeno y se leyó la absorbencia a 405 nm.
Se utilizó SotfMax Pro v5.4 para el procesamiento de los datos y el análisis gráfico. Mediante un ajuste de cuatro parámetros, se obtuvieron la curva de bloqueo y el valor CE50 del anticuerpo contra CTLA4 de mono o CTLA4 humano.
Los resultados se muestran en la figura 11, donde la coordenada longitudinal es DO405 y la abscisa es la concentración de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente (en ng/ml); el triángulo representa la unión con CTLA4 de mono, el cuadrado y el círculo representan la unión con CTLA4 humano. Se puede observar que la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente puede unirse de manera eficaz a la proteína CTLA4 del mono.
5.7 Activación de PBMC mediante la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4
Se aislaron células mononucleares de la sangre periférica (PBMC, del inglés Peripheral blood mononuclear cells) de la sangre periférica de donantes sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando una solución de aislamiento para linfocitos humanos (Tianjin Hao Yang).
Las placas se recubrieron con 0,3 pg/pocillo de anticuerpo anti-CD3 durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se añadieron 1 * 105 PBMC a cada pocillo, al mismo tiempo, se añadieron 10 pg/ml de proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 huC1v4-Fc, huC27-Fc o el anticuerpo CTLA4 de BMS (denominado 10D1) a cada pocillo respectivamente. Después de cultivar durante 5 días, se tomó el sobrenadante y se detectó el nivel de IFN-y en el sobrenadante mediante el kit ELISA de IFN-y (eBioscience).
Los resultados se muestran en la figura 12. Se observa que a la concentración de 10 pg/ml, la proteína de fusión Fcanticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 combinada con el anticuerpo anti-CD3 puede potenciar la secreción de Y-interferón por parte de las células PBMC, es decir, la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 aumenta la activación de las células PBMC. Por otra parte, tanto huC1v4-Ld-Fc como huC27v3-Ld-Fc mostraron una mejor actividad que el anticuerpo anti-CTLA4 de b Ms .
5.8 Activación de PBMC mediante la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 bivalente y tetravalente
Se aislaron células mononucleares de la sangre periférica (PBMC, del inglés Peripheral blood mononuclear cells) de la sangre periférica de donantes sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando una solución de aislamiento para linfocitos humanos (Tianjin Hao Yang).
Las placas se recubrieron con 0,3 pg/pocillo de anticuerpo anti-CD3 durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se añadieron 1 * 105 PBMC en cada pocillo, al mismo tiempo, se añadieron a cada pocillo 0,03 pg/ml de proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 bivalente o tetravalente huC1v4-LD-Fc (marcada como Ld en la figura), huC1v4-tet-Fc (marcada como tet en la figura) o el anticuerpo contra CTLA4 de BMS (denominado 10D1) respectivamente. Después de cultivar durante 5 días, se tomó el sobrenadante y se detectó el nivel de IFN-y en el sobrenadante mediante el kit ELISA de IFN-y (eBioscience).
Los resultados se muestran en la figura 13. Se puede observar que a la concentración de dosis baja de 0,03 pg/ml, la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 (tanto bivalente como tetravalente) combinada con el anticuerpo anti-CD3 puede potenciar la secreción de Y-interferón por parte de las células PBMC, es decir, la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 bivalente o tetravalente mejora significativamente la activación de las células PBMC a la concentración de dosis baja de 0,03 pg/ml. Por otra parte, la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente huC1v4-tet-Fc mostró una actividad mejor que el anticuerpo anti-CTLA4 de BMS.
5.9 Activación de linfocitos T CD4+ mediante la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 en la reacción linfoide mixta de células dendríticas y linfocitos T
Se aislaron células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) a partir de glóbulos blancos de sangre periférica de donantes sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando una solución de aislamiento para linfocitos humanos (Tianjin Hao Yang). A continuación, se incubaron con medio RPMI 1640 sin suero durante 1 a 2 horas para eliminar las células no adherentes y se cultivaron las células en RPMI que contenía FBS al 10 %, GM-CSF 10 ng/ml e IL-4 20 ng/ml. Después de cultivar durante 5 a 6 días, se añadieron 10 ng/ml de TNF-a y se incubaron durante 24 horas para obtener células dendríticas maduras.
Las células dendríticas obtenidas por este método se resuspendieron en medio completo RPMI, 2 * 105/ml. A continuación, se añadieron 50 pl por pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo en U (Costar: 3799) y se cultivó en una incubadora.
Los linfocitos T CD4+ se aislaron de las PBMC de otro donante utilizando un kit de aislamiento con perlas magnéticas (Miltenyi Biotec: 130-096-533) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se mezclaron 1 * 104 células dendríticas y 1 * 105 linfocitos T CD4+ obtenidos por los métodos anteriores, se resuspendieron en medio completo RPMI y se añadieron a una placa de cultivo de 96 pocillos, y se añadieron 50 pl de la mezcla celular a cada pocillo. Se añadieron 100 pl por pocillo de huC1v4-Ld-Fc diluido en medio completo RPMl hasta una concentración final de anticuerpos de 0,1 pg/ml o 0,01 pg/ml. Los sobrenadantes se recogieron de 5 a 7 días después del cultivo y se detectó el nivel de IFN-y en el sobrenadante mediante un kit ELISA de IFN-y (eBioscience).
Los resultados se muestran en la figura 14. Se observa que la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 puede potenciar la secreción de IFN-y de los linfocitos T CD4+ en la reacción linfocitaria mixta. Es decir, la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio bloqueador de CTLA4 aumenta la activación de los linfocitos T. Por otra parte, esta actividad biológica fue dependiente de la concentración y se observó una activación significativa de los linfocitos T a una concentración de dosis baja (0,01 pg/ml).
5.10 Efecto antitumoral de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente en ratones humanizados
Los ratones humanizados con CTLA4 (es decir, ratones que expresan la proteína CTLA4 humana) se inocularon con 5 * 105 células tumorales MC38.
Los días 7, 10, 13 y 16 después de la inoculación, se administraron por vía intraperitoneal 100 pg de la muestra de ensayo o la misma cantidad de inmunoglobulina humana (como grupo de control). El tamaño de los tumores se midió cada dos días desde el día 5 después de la inoculación hasta el día 20. Las muestras examinadas incluían la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente (Tet en la figura) y el anticuerpo monoclonal contra CTLA4, ipilimumab, que se comercializó por BMS.
A partir de los resultados mostrados en la figura siguiente, el efecto antitumoral de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente en ratones humanizados con CTLA4 fue comparable al del ipilimumab de BMS a una dosis de aproximadamente 5 mg/kg.
Ejemplo 6: Farmacocinética de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 en ratas La proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 se administró por vía intravenosa (i.v.) a ratas SD, la muestra de sangre se recogió en diferentes momentos y se utilizó el ensayo Elisa para determinar la concentración de la sustancia de ensayo en el plasma de las ratas tras la administración de la sustancia de ensayo. Se calcularon los parámetros farmacocinéticos.
Selección de animales: Se seleccionaron ratas SD de 6 a 8 semanas de edad y de 200 a 300 g de peso. Se les asignó aleatoriamente a dos grupos, 8 ratas en cada grupo, la mitad hembras y la mitad machos.
Administración: Administración única intravenosa (i.v.) a una dosis de 10 mg/kg.
Extracción de sangre: Antes de la administración, inmediatamente después de la administración y en varios momentos después de la administración, se recogieron aproximadamente 0,5 ml de sangre cada vez de la vena yugular de cada rata. La sangre recogida se centrifugó rápidamente para separar el suero que se almacenó a -80 °C hasta su análisis. Detección de la concentración de fármacos en sangre: El contenido de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 en el suero se detectó mediante ELISA de sándwich. La placa se recubrió con la proteína CTLA4 humana recombinante para capturar los anticuerpos específicos de CTLA4, y la región Fc se detectó con un anticuerpo de cabra anti-IgG humana (específico de Fc)-HRP (Sigma) para asegurar la detección de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 inalterada.
Procesamiento de datos: los parámetros farmacocinéticos en cuestión se calcularon mediante la curva de concentración del fármaco en sangre frente al tiempo, incluyendo el ABC (0-t), ABC(0.-), Cmáx., Tmáx., T1/2 , Vss, MRT, etc.
En la figura 16 se muestran las curvas de concentración de fármaco en sangre frente al tiempo de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 bivalente y tetravalente en ratas (a es el anticuerpo huC1v4-Ld-Fc bivalente y b es el anticuerpo huC1v4-tet-Fc tetravalente). Los parámetros farmacocinéticos se muestran en la figura 17. Los resultados mostraron que tanto la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 bivalente como tetravalente tenía una semivida in vivo más larga en ratas (más de 5 días), lo que indica una buena estabilidad in vivo. Al mismo tiempo, en el caso de mantener la mayor concentración en sangre, el anticuerpo tetravalente tenía una semivida in vivo que se duplica (más de 11 días). Se concluye así que el mantenimiento de la concentración en sangre eficaz del anticuerpo tetravalente in vivo es más largo y se espera que la administración clínica pueda tener un intervalo más largo.
Ejemplo 7: Evaluación de la capacidad como fármaco de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA47.1 Propiedades fisicoquímicas de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4
La proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente purificada por afinidad y expresada por células 293HEK humanas se obtuvo mediante el método descrito en el ejemplo 4.4. A continuación, se evaluó su capacidad como fármaco mediante un análisis preliminar de las propiedades físicas y químicas a través de SE-HPLC, CE en condiciones reductoras, CE, WCX y DSC en condiciones no reductoras. Los valores específicos se recogen en la siguiente tabla. A partir de estos datos, se puede determinar de manera preliminar que la proteína de fusión Fcanticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente tiene buenas propiedades físicas y químicas y es adecuada para su producción a escala industrial.
Tabla 6
Figure imgf000029_0001
7.2 Prueba de destrucción térmica de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4
La proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 se concentró mediante UF/DF y se intercambió en tampón PBS para preparar una solución de 20 mg/ml y se realizó la prueba de destrucción térmica con aceleración a 40 °C durante 30 días. Se comprobó la pureza de las muestras los días 0, 10, 20 y 30 mediante SE-HPLC y la tendencia de cambio se muestra en la siguiente figura. Se puede observar que a 40 °C, sin optimizar la preparación, aunque la pureza del pico principal disminuyó ligeramente, no se observa ninguna tendencia evidente de agregación o degradación. Al mismo tiempo, considerando su mayor valor de Tm, se puede determinar que la proteína tiene una buena estabilidad térmica.
Ejemplo 8: Evaluación de la toxicidad preliminar de la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4
Cuatro macacos se dividieron al azar en dos grupos, dos en cada grupo, la mitad hembras y la mitad machos, como los grupos de dosis bajas y altas respectivamente (7,5 y 30 mg/kg, respectivamente). Se administró la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tetravalente una vez a través de un bolo en la vena de la extremidad posterior. Antes de la administración (D-1), y D15 y D29 después de la administración, se detectaron los índices de peso corporal, el recuento de células sanguíneas, la función de coagulación de la sangre, la bioquímica sanguínea y la inmunogenicidad.
Durante la prueba, cuatro animales no mostraron muerte o muerte inminente. En cuanto a los macacos que recibieron una dosis única de 7,5 a 30 mpk, se observaron aumentos significativos de los índices hematológicos de linfa, Eo, Baso y Mono. La observación clínica, el peso, la función de coagulación, y los indicadores bioquímicos sanguíneos de otros grupos de animales no mostraron cambios con significado toxicológico.
Por lo tanto, una única inyección intravenosa a macacos a 7,5 y 30 mpk no mostró una toxicidad significativa, con NOAEL superior o igual a 30 mg/kg. El NOAEL no clínico indicado para ipilimumab de BMS es de aproximadamente 10 mg/kg. Se puede determinar que la proteína de fusión Fc-anticuerpo de un solo dominio contra CTLA4 tiene menos efectos secundarios tóxicos que el ipilimumab.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de unión a CTLA4, que puede unirse de manera específica a CTLA4 y comprende al menos un dominio variable único de inmunoglobulina, que comprende la CDR1 expuesta en el SEQ ID NO: 25, la CDR2 expuesta en el SEQ ID NO: 26 y la CDR3 expuesta en el SEQ ID NO: 27;
preferentemente en donde
dicho dominio variable único de inmunoglobulina es un VHH, más preferentemente un VHH humanizado.
2. La proteína de unión a CTLA4 de la reivindicación 1, en donde dicho VHH comprende
a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84;
b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, preferentemente al menos un 90 %, más preferentemente al menos un 95 %, aún más preferentemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 84; o
c) una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de los SEQ ID NO: 106 a 109.
3. La proteína de unión a CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende dos de dichos dominios variables únicos de inmunoglobulina.
4. La proteína de unión a CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además
a) una región Fc de inmunoglobulina;
b) una región Fc de inmunoglobulina humana, preferentemente una región Fc de IgG1 humana; o
c) una región Fc de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 132.
5. La proteína de unión a CTLA4 de la reivindicación 4, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de los SEQ ID NO: 114, 123 a 126 y 128.
6. La proteína de unión a CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene al menos una de las siguientes características:
(a) se une a CTLA4 humano con una KD inferior a 1 * 10-7M, preferentemente inferior a 1 * 10-8 M, más preferentemente inferior a 1 * 10-9 M, más preferentemente inferior a 1 * 10-10 M;
(b) bloquea la interacción de CTLA4 con CD80 y/o CD86;
(c) aumenta la activación de las PBMC y/o de los linfocitos T;
(d) inhibe del crecimiento tumoral.
7. Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de unión a CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un vector de expresión, que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7 unida operativamente a un elemento de regulación de la expresión.
9. Una célula recombinante, que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7 o es transformada con el vector de expresión de la reivindicación 8 y es capaz de expresar dicha proteína de unión a CTLA4.
10. Un método para producir la proteína de unión a CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende:
a) cultivar la célula recombinante de la reivindicación 9 en condiciones que permitan la expresión de la proteína de unión a CTLA4;
b) recuperar la proteína de unión a CTLA4 expresada por la célula hospedadora del cultivo de la etapa a); y c) opcionalmente, purificar y/o modificar además la proteína de unión a CTLA4 obtenida en la etapa b).
11. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión a CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. La proteína de unión a CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para su uso en un método de prevención y/o tratamiento del cáncer en un sujeto, comprendiendo dicho método
a) administrar al sujeto una cantidad eficaz de la proteína de unión a CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la composición farmacéutica de la reivindicación 11,
b) opcionalmente administrar a dicho sujeto un medio terapéutico antitumoral adicional, preferentemente quimioterapia, radioterapia, terapia de anticuerpos dirigidos al antígeno específico del tumor, otra inmunoterapia tumoral o fármacos de molécula pequeña dirigidos a tumores, más preferentemente una terapia de anticuerpos utilizando el anticuerpo anti-EGFR, el anticuerpo antivariante de EGFR, el anticuerpo anti-VEGFa, el anticuerpo anti-HER2 o el anticuerpo anti-CMET o combinaciones de los mismos,
preferentemente, dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer rectal, melanoma, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de hígado, linfoma, neoplasia hemática, cáncer de cabeza y cuello, glioma, cáncer gástrico, cáncer nasofaríngeo, cáncer laríngeo, cáncer de cuello uterino, carcinoma del cuerpo uterino, osteosarcoma.
13. La proteína de unión a CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para su uso en un método de prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de la proteína de unión a CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de la composición farmacéutica de la reivindicación 11, preferentemente dicha enfermedad infecciosa está provocada por un patógeno seleccionado del grupo que consiste en VIH, virus de la hepatitis, virus de la gripe, virus del herpes, giardia, plasmodium, leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
ES17798775T 2016-05-19 2017-05-19 Anticuerpo de un solo dominio para CTLA4 y proteína procedente del mismo Active ES2931223T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610332590.7A CN107400166A (zh) 2016-05-19 2016-05-19 针对ctla4的单域抗体及其衍生蛋白
PCT/CN2017/085038 WO2017198212A1 (zh) 2016-05-19 2017-05-19 针对ctla4的单域抗体及其衍生蛋白

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2931223T3 true ES2931223T3 (es) 2022-12-27

Family

ID=60325740

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17798775T Active ES2931223T3 (es) 2016-05-19 2017-05-19 Anticuerpo de un solo dominio para CTLA4 y proteína procedente del mismo

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11091549B2 (es)
EP (1) EP3459597B1 (es)
JP (2) JP2019522489A (es)
CN (2) CN107400166A (es)
DK (1) DK3459597T3 (es)
ES (1) ES2931223T3 (es)
FI (1) FI3459597T3 (es)
WO (1) WO2017198212A1 (es)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA53355A (fr) 2015-05-29 2022-03-16 Agenus Inc Anticorps anti-ctla-4 et leurs procédés d'utilisation
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
WO2018106862A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Agenus Inc. Anti-ctla-4 antibodies and methods of use thereof
SG11202005692WA (en) * 2017-12-20 2020-07-29 Harbour Biomed Shanghai Co Ltd Antibodies binding ctla-4 and uses thereof
CN111527109A (zh) * 2017-12-26 2020-08-11 南京金斯瑞生物科技有限公司 以抗体Fc区为骨架的融合蛋白二聚体及其应用
CN109970860A (zh) * 2017-12-27 2019-07-05 信达生物制药(苏州)有限公司 三链抗体、其制备方法及其用途
CA3082280A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against tigit
WO2019137541A1 (en) 2018-01-15 2019-07-18 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against pd-1
CN112218892B (zh) * 2018-03-19 2023-04-25 上海药明生物技术有限公司 新型抗ctla-4抗体多肽
US11661452B2 (en) 2018-03-20 2023-05-30 WuXi Biologics Ireland Limited Anti-lag-3 antibody polypeptide
CN111886254B (zh) * 2018-03-30 2023-12-08 南京传奇生物科技有限公司 针对lag-3的单结构域抗体及其用途
CN110343181B (zh) * 2018-04-08 2022-04-08 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对凝血因子ix(fix)的单域抗体
CN110407942B (zh) * 2018-04-27 2022-02-22 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对kn044的单域抗体
WO2019233413A1 (en) * 2018-06-05 2019-12-12 Jiangsu Alphamab Biopharmaceuticals Co., Ltd. Dimer and use thereof
EP3823653A4 (en) * 2018-07-20 2022-05-18 The Trustees of Columbia University in the City of New York PROGRAMMABLE BACTERIA FOR THE TREATMENT OF CANCER
JP2022539260A (ja) * 2019-07-04 2022-09-07 江蘇康寧杰瑞生物制薬有限公司 腫瘍を治療するための物質および方法
CN110669139A (zh) * 2019-09-18 2020-01-10 沣潮医药科技（上海）有限公司 二聚体免疫粘附素、药物组合物和用途
CN114269781A (zh) * 2019-12-04 2022-04-01 江苏康宁杰瑞生物制药有限公司 双特异性融合蛋白与抗Her2抗体的组合用于肿瘤治疗
CN114746448A (zh) * 2019-12-04 2022-07-12 江苏康宁杰瑞生物制药有限公司 用于肿瘤治疗的双特异性融合蛋白
CN110885375B (zh) * 2019-12-20 2021-07-02 南京融捷康生物科技有限公司 特异性针对mmp-9蛋白锌离子结合结构域的单域抗体及产品与应用
WO2021213435A1 (zh) * 2020-04-22 2021-10-28 迈威(上海)生物科技股份有限公司 一种靶向人程序性死亡配体1(pd-l1)的单可变域抗体及其衍生物
KR20230061390A (ko) 2020-08-05 2023-05-08 신테카인, 인크. Il27 수용체 결합과 관련된 조성물 및 방법
JP2023537005A (ja) * 2020-08-05 2023-08-30 シンセカイン インコーポレイテッド Ｉｌ１０受容体結合性分子および使用方法
CN112500487B (zh) * 2020-12-11 2022-09-13 华道(上海)生物医药有限公司 一种抗cd123单克隆抗体及其应用
CN115873114A (zh) * 2021-09-29 2023-03-31 浙江纳米抗体技术中心有限公司 Ctla-4结合分子及其应用
CN113754770B (zh) * 2021-10-21 2023-11-03 江苏诺迈博生物医药科技有限公司 一种特异性结合人ctla4的抗体及包含其的药物和试剂盒
CN114702575B (zh) * 2022-01-24 2023-05-23 广东医科大学 抗SARS-CoV-2 S蛋白的纳米抗体、重组纳米抗体、重组载体、重组菌及应用
CN114560942B (zh) * 2022-01-24 2023-05-19 宁夏医科大学 一种抗ctla-4的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌及其应用
CN115925942A (zh) * 2022-06-08 2023-04-07 北京科诺信诚科技有限公司 靶向人lilrb4的纳米抗体及其应用
WO2023240287A1 (en) * 2022-06-10 2023-12-14 Bioentre Llc Combinations of ctla4 binding proteins and methods of treating cancer
WO2024020486A2 (en) * 2022-07-20 2024-01-25 Fuse Biotherapeutics Inc. Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ror1)-specific vhh antibodies and multispecific antibodies thereof as immune cell engagers
WO2024088424A1 (zh) * 2022-10-28 2024-05-02 嘉和生物药业有限公司 新型抗ctla4抗体
CN116082509A (zh) * 2023-02-24 2023-05-09 广州杰博生物科技有限公司 一种单域抗体及其制备方法和应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1792991A1 (en) * 1999-08-24 2007-06-06 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
EP1904530A2 (en) * 2005-07-07 2008-04-02 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Anti-ctla-4 antibody and cpg-motif-containing synthetic oligodeoxynucleotide combination therapy for cancer treatment
CN101074264B (zh) * 2006-05-17 2011-08-17 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种重组抗ctla4单克隆抗体及其制备方法和用途
US8907065B2 (en) * 2006-12-15 2014-12-09 Ablynx N.V. Polypeptides that modulate the interaction between cells of the immune system
EP2315778A2 (en) * 2008-07-18 2011-05-04 Domantis Limited Compositions monovalent for cd28 binding and methods of use
US8119129B2 (en) * 2008-08-01 2012-02-21 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-CTLA4 antibody with dasatinib for the treatment of proliferative diseases
CN107936121B (zh) 2011-05-16 2022-01-14 埃泰美德(香港)有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
CN103833851B (zh) 2014-03-14 2016-04-13 东南大学 针对于载脂蛋白a1的单域抗体及其应用
AU2015261536B2 (en) * 2014-05-16 2020-05-07 Ablynx Nv Improved immunoglobulin variable domains
CN105296433B (zh) 2014-08-01 2018-02-09 中山康方生物医药有限公司 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
CN106188297B (zh) 2015-07-20 2019-09-27 广西医科大学 抗CTLA-4的纳米抗体Nb91及其制备方法与应用
CN106046165B (zh) 2015-07-20 2019-05-21 广西医科大学 抗CTLA-4的纳米抗体Nb30及其制备方法与应用
CN106220732B (zh) 2015-07-20 2019-05-21 广西医科大学 抗CTLA-4的纳米抗体Nb16及其制备方法与应用
CN106046164B (zh) 2015-07-20 2019-10-25 广西医科大学 抗CTLA-4的纳米抗体Nb36及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP7256348B2 (ja) 2023-04-12
US20220177588A1 (en) 2022-06-09
EP3459597B1 (en) 2022-08-31
EP3459597A4 (en) 2020-04-15
DK3459597T3 (da) 2022-11-28
WO2017198212A1 (zh) 2017-11-23
US11091549B2 (en) 2021-08-17
FI3459597T3 (fi) 2022-12-15
US20190315864A1 (en) 2019-10-17
CN109195665A (zh) 2019-01-11
JP2021184736A (ja) 2021-12-09
EP3459597A1 (en) 2019-03-27
CN109195665B (zh) 2022-09-09
US11912768B2 (en) 2024-02-27
JP2019522489A (ja) 2019-08-15
CN107400166A (zh) 2017-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2931223T3 (es) Anticuerpo de un solo dominio para CTLA4 y proteína procedente del mismo
AU2016302951B2 (en) Single domain antibody for programmed death-ligand (PD-L1) and derived protein thereof
AU2018226298B2 (en) Anti-LAG-3 antibodies and uses thereof
JP2018531039A6 (ja) プログラム死リガンド（ｐｄｌ１）に対する単一ドメイン抗体およびその誘導体タンパク質
JP2023126951A (ja) Ｃｄ１３７に結合するシングルドメイン抗体
CN108348601A (zh) 与lag3结合的抗体治疗剂
WO2018133873A1 (zh) Pd-l1结合多肽或化合物
CN109929037B (zh) 针对程序性死亡配体的结合物及其应用
EP3348571B1 (en) Single domain antibody for programmed death-ligand (pd-l1) and derived protein thereof