JP2022520978A - オルソポックスウイルス主要組織適合性複合体（ｍｈｃ）クラスｉ様タンパク質（ｏｍｃｐ）と腫瘍特異的結合パートナーを用いた二重特異性融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

ＮＫ細胞を活性化し、腫瘍を治療するための治療用ポリペプチド、その組成物およびそれらの使用方法が提供される。治療用ポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄと結合するための第１のドメインおよび腫瘍標的と結合するための第２のドメインを含み得る。

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１９年２月１８日出願の米国仮出願６２／８０７，１９０に優先権を主張しており、その全体は本明細書に参照により援用される。

（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出された配列リストを含み、本明細書にはその全体が参照により援用されている。２０２０年２月１７日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ２３５１８ＷＯ００＿ＳＬ．ｔｘｔと名づけられており、サイズは９４，１３６バイトである。

（参照による援用）
ＷＯ２０１６／１００３７５およびＷＯ２０１７／１３６８１８は、その全体が本明細書に参照により援用されている。さらに、ここに引用されたすべての出版物は、その全体が本明細書に参照により援用されている。

(背景技術)
二重特異性リンパ球誘導（ｅｎｇａｇｅｒ）は、細胞傷害性リンパ球と腫瘍細胞を同時に関与させること(engaging)によって働く。これにより人工的な免疫シナプスが形成され、がん細胞の免疫関与(immune engagement)と破壊の効率が高まる。これらの二重特異性タンパク質中のリガンドは、継続的な治療タンパク質を形成するような方法で一緒に発現される改変された標的化抗体に由来する。これらの治療タンパク質は、がん治療において効果的であり得る。

開発における最新の二重特異性治療薬は、Ｔ細胞受容体複合体の一部であるＣＤ３の関与を介して機能する。ＣＤ３は細胞毒性ＣＤ８⁺Ｔ細胞、ヘルパーＣＤ４⁺Ｔ細胞に発現している。広範なＣＤ３関与により、腫瘍部位から離れたところで非特異的Ｔ細胞が活性化され、「サイトカインストーム」などの毒性が生じる可能性がある。近年、いくつかのグループは、ＮＫｐ４６またはＣＤ１６受容体を介してＮＫ細胞を標的とすることを始めた。

しかし、ＮＫＧ２Ｄ発現はヒトＣＤ８⁺Ｔ細胞やＮＫ細胞に恒常的に発現しているため、独特である。したがって、ＮＫＧ２Ｄ標的化は、自然免疫および適応性細胞傷害性リンパ球（ＣＤ８⁺Ｔ細胞およびＮＫ細胞）の両方の関与を可能にし、より強固な抗腫瘍活性をもたらすであろう。

本発明は、一方では、ＮＫＧ２Ｄレセプターへのリガンドを介して、他方では腫瘍特異的標的に向けられた結合パートナーを介して、ＮＫおよびＣＤ８⁺Ｔ細胞の両方を標的とする、新しいクラスの二重特異性（または多重特異性）治療タンパク質に関する。ＮＫＧ２Ｄ受容体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、オルソポックスウイルス主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ様タンパク質（ＯＭＣＰ）リガンド、またはネイティブのＮＫＧ２Ｄリガンドなどのいずれかの特異的リガンドを介して結合することができる。腫瘍標的は、がん細胞において特異的に発現されるか、または正常組織と比較してがん細胞において発現が増加したいずれかの細胞表面標的から選択することができる。

いくつかの実施形態において、第１のドメインおよび第２のドメインを含むポリペプチドであって、第１のドメインが配列番号１、２または３に対する少なくとも８０％相同の第１のアミノ酸配列を含み、約０．０１ｎＭから約１０００ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合することが可能であり、第２のドメインが腫瘍細胞上のペプチドに結合することが可能な第２のアミノ酸配列を含み、ここで、ペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである、ポリペプチドが提供される。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含み得、ここで、第１のドメインは、配列番号１のアミノ酸位置４８～６７および１１０～１４７と少なくとも８０％の相同性の第１のアミノ酸配列を含み、ここで、第２のドメインは腫瘍細胞上のペプチドに結合し得る第２のアミノ酸配列を含み得、ペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含み得、ここで、第１のドメインは、配列番号２のアミノ酸位置４９～６８および１１１～１４８と少なくとも８０％の相同性の第１のアミノ酸配列を含み、ここで、第２のドメインは腫瘍細胞上のペプチドに結合し得る第２のアミノ酸配列を含み得、ペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含み得、ここで、第１のドメインは、配列番号３のアミノ酸位置４８～６６および１１１～１４８と少なくとも８０％の相同性の第１のアミノ酸配列を含み、ここで、第２のドメインは腫瘍細胞上のペプチドに結合し得る第２のアミノ酸配列を含み得、ペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。

いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドを含む本開示の医薬組成物を患者に投与することによって、患者の腫瘍を治療するための方法が提供される。

図１は、抗-抗腫瘍標的に連結されたＯＭＣＰ（円）、具体的には腫瘍標的に向けられた可変重鎖および可変軽鎖を含む単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を含む本開示の例示的二重特異性ポリペプチドを示す。

図２Ａは、２つの単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、第１の腫瘍標的および第２の腫瘍標的に結合することができるα－腫瘍標的１およびα－腫瘍標的２を含み、かつＮＫＧ２Ｄ（α－ＮＫＧ２Ｄ）に結合することができる２つの単鎖可変領域断片にも連結されている抗体Ｆｃドメインに連結された、本開示の例示的な三重特異性ポリペプチドを示す。

図２Ｂは、２つの単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、第１の腫瘍標的および第２の腫瘍標的に結合することができるα－腫瘍標的１およびα－腫瘍標的２を含み、かつ２つのＮＫＧ２Ｄリガンド（「ＯＭＣＰ」）にも結合されている抗体Ｆｃドメインに結合された、本開示の例示的な三重特異性ポリペプチドを示す。

図２Ｃは、２つの単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、第１の腫瘍標的および第２の腫瘍標的に結合することができるα－腫瘍標的１およびα－腫瘍標的２を含み、かつ６つのＮＫＧ２Ｄリガンド（「ＯＭＣＰ」）にも連結されている抗体Ｆｃドメインに連結された、本開示の例示的な三重特異性ポリペプチドを示す。

図３Ａは、２つの単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、第１の腫瘍標的および第２の腫瘍標的に結合することができるα－腫瘍標的１およびα－腫瘍標的２を含み、かつＮＫＧ２Ｄリガンド（「ＯＭＣＰ」）にも連結されている抗体ＦｃドメインおよびＣＤ３ｅ（「α－ＣＤ３ｅ Ｔ細胞標的」）に結合できる単鎖可変領域断片に連結されている、本開示の例示的な四重特異性ポリペプチドを示す。

図３Ｂは、２つの単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、第１の腫瘍標的および第２の腫瘍標的に結合し得るα－腫瘍標的１およびα－腫瘍標的２を含み、かつＮＫＧ２Ｄリガンド（「ＯＭＣＰ」）にも連結されている抗体ＦｃドメインおよびＦＣＧＨ１（「α－ＦＣＧＨ１ ＮＫ細胞標的」）に結合し得る単鎖可変領域断片に連結されている、本開示の例示的な四重特異性ポリペプチドを示す。

図４Ａは、腫瘍標的（α－腫瘍標的）およびＮＫＧ２Ｄリガンド（「ＯＭＣＰ」）に向けられたｓｃＦＶに加えて、ＮＫＧ２Ｄリガンドとサイトカインとの間に（１つの）リンカー（左側構造）が存在するか、またはサイトカインとｓｃＦｖとの間に１つ、およびサイトカインとＮＫＧ２Ｄリガンドとの間に１つ（右側構造）の２つのリンカーの存在するか、のいずれかである、サイトカイン（３８Ａ ４２Ｋ ＩＬ２）を有する本開示の例示的な二重特異性ポリペプチドを示す。

図４Ｂは、ＮＫＧ２Ｄリガンド（「ＯＭＣＰ」）およびサイトカイン（３８Ａ ４２Ｋ ＩＬ２）にさらに連結された抗体Ｆｃドメインに連結された、２つのｓｃＦｖ’ｓ、α－腫瘍標的１およびα－腫瘍標的２を含む、本発明の開示の例示的ポリペプチドを示す。

図５Ａは、本開示の例示的な二重特異性ｓｃＦｖを示す。

図５Ｂは、本開示の例示的な二重特異性ｓｃＦｖを示す。

図５Ｃは、本開示の例示的な二重特異性ｓｃＦｖを示す。

図５Ｄは、本開示の例示的な二重特異性ｓｃＦｖを示す。

図５Ｅは、図５Ａ－５Ｄの例示的な二重特異性ｓｃＦｖの線形概略を示す。

図６Ａは、Ｆｃ部分を含む本開示の例示的な三重特異性ｓｃＦｖを示す。

図６Ｂは、Ｆｃ部分を含む本開示の例示的な三重特異性ｓｃＦｖを示す。

図６Ｃは、Ｆｃ部分を含む本開示の例示的な三重特異性ｓｃＦｖを示す。

図６Ｄは、Ｆｃ部分を含む本開示の例示的な三重特異性ｓｃＦｖを示す。

図７Ａは、ＮＫＧ２ＤへのＥ０結合についてのプラズモン共鳴測定を示す。

図７Ｂは、ＮＫＧ２ＤへのＥ１結合についてのプラズモン共鳴測定を示す。

図７Ｃは、ＮＫＧ２ＤへのＥ２結合についてのプラズモン共鳴測定を示す。

図７Ｄは、ＮＫＧ２ＤへのＥ３結合についてのプラズモン共鳴測定を示す。

図８Ａは、ＥＧＦＲ－ＦｃへのＥ０結合についてのプラズモン共鳴測定を示す。

図８Ｂは、ＥＧＦＲ－ＦｃへのＥ１結合についてのプラズモン共鳴測定を示す。

図８Ｃは、ＥＧＦＲ－ＦｃへのＥ２結合についてのプラズモン共鳴測定を示す。

図８Ｄは、ＥＧＦＲ－ＦｃへのＥ３結合についてのプラズモン共鳴測定を示す。

図９は、実施例２における本発明の開示の二重特異性ポリペプチドの濃度の関数としての各処置に対する細胞生存率を示す。

図１０は、実施例２における二重特異性ポリペプチドの１ｘ１０^-8Ｍでの各処置に対する細胞生存率を示す。

図１１は、実施例２における二重特異性ポリペプチドの１ｘ１０^-9Ｍでの各処置に対する細胞生存率を示す。

図１２は、実施例２についての陰性対照（構築物無添加）および１ｎＭ群の処置群の細胞の画像を示す。

図１３は、実施例２における二重特異性ポリペプチド１ｘ１０^-10Ｍでの各処置に対する細胞生存率を示す。

図１４は、実施例３の二重特異性ポリペプチド１ｘ１０^-8Ｍで処置された死細胞％を示す。

図１５は、実施例３の二重特異性ポリペプチド１ｘ１０^-10Ｍで処置された死細胞％を示す。

図１６は、実施例３の二重特異性ポリペプチド１ｘ１０^-12Ｍで処置された死細胞％を示す。

図１７は、実施例４においてＮＫ細胞の存在下で１００ｐＭで二重特異性ポリペプチドで処置された死細胞％を示す。対照はＮＫ細胞を伴うかまたは伴わない腫瘍細胞である。

図１８は、実施例４においてＴ細胞の存在下で１００ｐＭで二重特異性ポリペプチドで処置された死細胞％を示す。対照はＣＤ８⁺Ｔ細胞を伴うかまたは伴わない腫瘍細胞である。

図１９Ａは、ＰＢＭＣのみを有するか、またはＰＢＭＣと腫瘍細胞を有する様々な濃度のＥ０、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３における、ポリペプチドＥ０、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３を伴うかまたは伴わないサイトカイン産生（ＩＦＮ－γ）を示す。

図１９Ｂは、ＰＢＭＣのみを有するか、またはＰＢＭＣと腫瘍細胞を有する様々な濃度のＥ０、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３における、ポリペプチドＥ０、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３を伴うかまたは伴わないサイトカイン産生（ＴＮＦ－α）を示す。

図１９Ｃは、ＰＢＭＣのみを有するか、またはＰＢＭＣと腫瘍細胞を有する様々な濃度のＥ０、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３における、ポリペプチドＥ０、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３を伴うかまたは伴わないサイトカイン産生（ＩＬ－６）を示す。

図１９Ｄは、ＰＢＭＣのみを有するか、またはＰＢＭＣと腫瘍細胞を有する様々な濃度のＥ０、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３における、ポリペプチドＥ０、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３を伴うかまたは伴わないサイトカイン産生（ＩＬ－１７ａ）を示す。

本開示は、１つの実施形態において、中央に連結リンカーを有するかまたは有さない、抗腫瘍抗体などの腫瘍標的ペプチドに融合されたＮＫＧ２Ｄリガンドを含む治療的融合ペプチドを提供する。ＮＫＧ２Ｄリガンドは、本明細書により詳細に開示されるように、完全長ＯＭＣＰ、切断型ＯＭＣＰ、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、またはＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質のいずれかから選択することができる。腫瘍標的ペプチドは、腫瘍－特異的変異を有する、または正常組織よりも腫瘍細胞の表面でより高度に発現される任意のタンパク質を標的とする抗体の完全長または可変領域ドメインのいずれかである。別の実施形態では、腫瘍標的タンパク質は、標的タンパク質に対する天然に存在するリガンドの形態である。標的に対する天然リガンドを用いる実施形態では、リガンドを変異させて、標的タンパク質に対するリガンドの親和性を増加または減少させてもよい。腫瘍選択的標的の非限定的な例は、ＥＲBB２、ＣＤ１９、ＥＰＣＡＭ、ＭＳ４Ａ１、ＦＯＬＨ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＩＬ３ＲＡ、ＰＭＥＬ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＫＤＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質７２）ジシアロガングリオシドＧＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、Ｂ７Ｈ３／ＣＤ２７６、ＧＰＡ３３、ＳＳＴＲ２、ＧＰＣ３、およびＣＤＨ３である。

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」は、本明細書中で互換的に使用して、それぞれが特異的機能を生じさせる複数の配列を有する単一のペプチドを指すか（例えば、ＮＫＧ２Ｄ受容体リガンドまたは腫瘍特異的標的の結合パートナー）、または一緒に結合または複合した１つ以上のペプチドを指すことができるかもしれない（例えば、ＮＫＧ２Ｄ受容体リガンドおよび腫瘍特異的標的の結合パートナーが一緒に複合する別々のペプチド上にあるヘテロダイマーのように、例えば、ＮＫＧ２Ｄ受容体リガンドが第１のＦｃ部分に連結され、腫瘍特異的標的の結合パートナーが第２のＦｃ部分に連結され、第１および第２のＦｃ部分が複合してＦｃ抗体ドメインを形成する）ことが理解されるべきである。

本明細書中で使用される場合、単数形は、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他の点を明確に指示しない限り、複数の参照を含む。

「または」という用語の請求項における使用および本開示は、代替案のみを指すために明示的に示されている場合、または代替案が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するために使用される。

「約」という用語は、数値で用いる場合、＋／－１０％を含むことを意図している。例として、限定ではないが、多数のアミノ酸が約２００と同定される場合、これは１８０～２２０（プラスまたはマイナス１０％）を含むであろう。

用語「対象」または「患者」は、治療される哺乳動物対象を意味し、ヒト患者が好ましい。場合によっては、本発明の方法は、マウス、ラット、およびハムスターを含むげっ歯類、ならびに霊長類を含むが、これらに限定されない疾患のための動物モデルの開発において、実験動物、獣医学適用、および動物モデルの開発において使用を見出す。

本発明の治療用融合ペプチドは、悪性腫瘍およびがんを治療するための治療薬として使用することができる。本開示の実施形態で治療されるがんの非限定的な例としては、乳がん、前立腺がん、黒色腫、卵巣がん、胃がん、神経膠芽腫、神経芽細胞腫および肺がんなどの固形腫瘍が挙げられ；Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞Ｂ細胞リンパ腫、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、および濾胞性リンパ腫などの血液がんも含まれる。開示の任意の実施形態において、腫瘍細胞は、乳がん細胞、前立腺がん細胞、メラノーマ細胞、卵巣がん細胞、胃がん細胞、神経膠芽腫細胞、神経芽腫細胞、肺がん細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、結腸がん細胞、腎細胞がん、膵臓がん細胞、および肝細胞がん細胞からなる群より選択することができる。

二重特異性融合タンパク質
いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含むことができ、ここで、第１のドメインは、ヒトＮＫＧ２Ｄに結合することができる第１のアミノ酸配列を含むことができ、ここで、第２のドメインは腫瘍細胞上のペプチドに結合し得る第２のアミノ酸配列を含み得、ペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである。例として、限定ではないが、ヒトＮＫＧ２Ｄに結合し得る第１のアミノ酸配列は、ヒトＮＫＧ２ＤリガンドまたはヒトＮＫＧ２Ｄに結合し得る抗体であり得る。限定ではないが、さらなる例示によって、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ヒトＮＫＧ２Ｄに結合し得るＯＭＣＰまたはそのバリアントまたは誘導体であり得る。一部の実施形態では、ヒトＮＫＧ２Ｄリガンドは、約０．０１ｎＭ～約１０００ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄと結合することができる。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含むことができ、ここで、第１のドメインは、配列番号１～３のいずれかと少なくとも８０％の相同性を有する第１のアミノ酸配列を含み得、かつ約０．０１ｎＭ～約１０００ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合することができ、第２のドメインは腫瘍細胞上のペプチドに結合し得る第２のアミノ酸配列を含み得、ペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである。

例として、限定ではないが、図１に示すように、本発明の二重特異性ポリペプチドは、ＯＭＣＰ－ＮＫＧ２Ｄリガンド－および腫瘍細胞上のペプチドに対する抗体に由来する抗腫瘍単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を含むことができる。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含み得、ここで、第１のドメインは、配列番号１のアミノ酸位置４８～６７および１１０～１４７と少なくとも８０％の相同性の第１のアミノ酸配列を含み、ここで、第２のドメインは腫瘍細胞上のペプチドに結合し得る第２のアミノ酸配列を含み得、ペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含み得、ここで、第１のドメインは、配列番号２のアミノ酸位置４９～６８および１１１～１４８と少なくとも８０％の相同性の第１のアミノ酸配列を含み、ここで、第２のドメインは腫瘍細胞上のペプチドに結合し得る第２のアミノ酸配列を含み得、ペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含み得、ここで、第１のドメインは、配列番号３のアミノ酸位置４８～６６および１１１～１４８と少なくとも８０％の相同性の第１のアミノ酸配列を含み、ここで、第２のドメインは腫瘍細胞上のペプチドに結合し得る第２のアミノ酸配列を含み得、ペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである。

ＮＫＧ２Ｄ リガンド
ＮＫＧ２Ｄに結合するリガンドは、ＮＫＧ２Ｄとの相互作用の共通部位を構成するＭＨＣクラスＩ関連α１α２スーパードメインを共有する。ＮＫＧ２Ｄに結合するリガンドの非限定的な例としては、ＭＩＣファミリータンパク質（すなわち、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ）、ＵＬ１６結合ファミリータンパク質（すなわち、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＰＢ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６）、レチノイド酸早期誘導遺伝子１（Ｒａｅ１）様タンパク質（Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、Ｒａｅ１ε）、Ｈ６０タンパク質ファミリーのメンバー（すなわち、Ｈ６０ａ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃ）、ｈ－ＨＬＡ－Ａを含むＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質、ならびにマウスのＭｕｌｔ１およびオルソポックスウイルス主要組織適合性複合体クラスＩ様タンパク質（ＯＭＣＰ）を含む。

一部の実施形態では、ＮＫＧ２ＤリガンドはＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質であり得る。実施形態によっては、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、Ｒａｅ１ε、Ｈ６０ａ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃ、ｈ－ＨＬＡ－Ａ、Ｍｕｌｔ１およびＯＭＣＰからなる群からＮＫＧ２Ｄリガンドを選択することができる。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＵＬ１６結合ファミリータンパク質またはＭＩＣファミリータンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６からなる群より選択することができる。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２ＤリガンドはＵＬＢＰ３であり得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの第１のドメインは、ＯＭＣＰであるＮＫＧ２Ｄリガンドまたはそのバリアントを含む。

ＯＭＣＰのバリアントは、完全長ＯＭＣＰのほぼ同じ結合親和性を有する切断型または変異型ＯＭＣＰであり得る。実施形態では、ＯＭＣＰのバリアントは、完全長ＯＭＣＰの結合親和性に対してわずかに低い結合親和性を有する切断型または変異型ＯＭＣＰであり得る。別の実施形態では、ＯＭＣＰのバリアントは、完全長ＯＭＣＰの結合親和性に対してより高い結合親和性を有する切断型または変異型ＯＭＣＰであり得る。

標的タンパク質に対するリガンドの結合親和性を決定する方法は、当該分野で公知であり、上記で記載される。例えば、以下の実施例で述べるように、結合親和性は、表面プラズモン共鳴を測定することによって決定することができる。ＯＭＣＰは約０．１～約５ｎＭの結合親和性でＮＫＧ２Ｄに特異的に結合する。例えば、ＯＭＣＰは約０．２ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄと、約３ｎＭの結合親和性でマウスＮＫＧ２Ｄと特異的に結合する。

好ましい実施形態において、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、約１０００ｎＭ～約０．０１ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合するＯＭＣＰまたはそのバリアントである。特定の実施形態に、ＯＭＣＰまたはそのバリアントは、約１００ｎＭ～約０．０１ｎＭ、約１０ｎＭ～約０．０１ｎＭ、または約１ｎＭ～約０．０１ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合する。他の実施形態では、ＯＭＣＰまたはそのバリアントは、約１０００ｎＭ～約１ｎＭ、または約１０００ｎＭ～約１０ｎＭ、または約１０００ｎＭ～約１００ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合する。さらに他の実施形態では、ＯＭＣＰまたはそのバリアントは、約１００ｎＭ～約１ｎＭ、または約１００ｎＭ～１０ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合する。例えば、ＯＭＣＰまたはそのバリアントは、約１０００ｎＭ、約５００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約９ｎＭ、約８ｎＭ、約７ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約０．９ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．２ｎＭまたは約０．１ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合することができる。さらなる例として、限定ではないが、ＯＭＣＰまたはそのバリアントは、約１０００ｎＭ～約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ～約０．１ｎＭ、約１０ｎＭ～約０．１ｎＭ、または約１ｎＭ～約０．１ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合することができる。結合親和性に関する上述の開示は、本開示のポリペプチドの第１のアミノ酸配列、および本開示のポリペプチドの他のＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン、例えば、限定されるものではない例として、配列番号１～３の領域に相同性を有する第１のアミノ酸配列に適用できると理解すべきである。

完全長ＯＭＣＰアミノ酸配列の配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号４ＦＦＥ＿Ｚ、４ＦＦＥ＿Ｙまたは４ＦＦＥ＿Ｘを用いて見出すことができる。当業者は、ＯＭＣＰのホモログが他の種またはウイルス中に見出され得ることを認識するであろう。例えば、Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００５；３３：Ｄ３１１－３１６を参照のこと。その全体が本明細書に参照により援用されている。この文献は、牛痘ウイルス株とサル痘ウイルス株との間の１８のＯＭＣＰバリアントを記載している。実施形態では、ＯＭＣＰはオルソポックスウイルス由来である。特異的な実施形態では、ＯＭＣＰは牛痘ウイルスまたはサル痘ウイルス由来である。別の特異的実施形態では、ＯＭＣＰは牛痘ウイルスのブライトンレッド系統由来である。ホモログは、当該技術分野で公知の方法により他の種において見出すことができる。例えば、配列の類似性は、通常、最良の適合を達成するために少数のギャップの導入を可能にする従来のアルゴリズムによって決定されることがある。特に、２つのポリペプチドまたは２つの核酸配列の「パーセント同一性」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズムを用いて決定される（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４－２２６８，１９９３）。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０）のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行うことができる。同様に、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のポリペプチドと相同性のあるアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴＸプログラムを用いて行うことができる。比較目的のためのギャップされたアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）に記載されているように、ギャップされたＢＬＡＳＴが利用される。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）を採用する。詳細はｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖをご覧ください。一般に、ホモログは、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、または８９％の相同性を有する。開示の前記実施形態のいずれにおいても、配列は、配列番号１－３のいずれかのもののように、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の相同性であり得る。一般に、サル痘および牛痘の既知株由来のＯＭＣＰは、いずれも約９７％の相同性の範囲内にある。

当業者は、ＯＭＣＰの構造ホモログが他の種またはウイルス中に見出され得ることを認識するであろう。構造ホモログは、構造的には関連しているが、配列が末端ホモログであるタンパク質であってもよい。例えば、ＯＭＣＰは内因性ＮＫＧ２Ｄリガンドの配列同一性が低いが、ＯＭＣＰは構造的相同性に基づいてＮＫＧ２Ｄに結合することが発見された。構造ホモログは、当該技術分野で公知の方法により他の種において見出すことができる。例えば、タンパク質構造予知は、ＰｈｙｒｅおよびＰｈｙｒｅ２のような種々のデータベースによって決定され得る。そのようなデータベースは、構造ホモログを決定するために使用され得る信頼性の高いタンパク質モデルを生成する。Ｐｈｙｒｅ２の主な結果表は、信頼度の推定、画像および３次元予測モデルと、検出されたテンプレートの源に応じてタンパク質データベースの構造分類（ＳＣＯＰ）またはタンパク質データバンク（ＰＤＢ）のいずれかから導かれた情報へのリンクを提供する。一致するごとに、ユーザーの配列と既知の三次元構造を持つ配列との間のアライメントの詳細を示すリンクが表示される。詳細はｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／ｐｈｙｒｅ２／をご覧ください。一般に、構造ホモログは、ＯＭＣＰに対して少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または５９％の信頼度（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ）を有する。実施形態において、構造ホモログは、ＯＭＣＰに対して少なくとも６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、または６９％の信頼度（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ）を有する。別の実施形態では、構造ホモログは、ＯＭＣＰに対して少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、または７９％の信頼度（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ）を有する。さらに別の実施形態では、構造ホモログは、ＯＭＣＰに対して少なくとも８０、８１、８２、８３、６４、８５、８６、８７、８８、または８９％の信頼度（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ）を有する。さらに別の実施形態では、構造ホモログは、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の信頼度をＯＭＣＰで有し得る。ＯＭＣＰ－ヒトＮＫＧ２Ｄの構造情報は、ＰＤＢ ＩＤ：４ＰＤＣを用いて見出すことができる。このような構造ホモログは、本開示のポリペプチドの第１のアミノ酸配列、および本開示のポリペプチドの他の任意のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインであり得ることを理解すべきである。

上述の実施形態のいずれにおいても、第１のアミノ酸配列は、配列番号１、２および３に示す配列のようなＯＭＣＰの配列であり得る。
配列番号１（ＨＫＬＡＦＮＦＮＬＥＩＮＧＳＤＴＨＳＴＶＤＶＹＬＤＤＳＱＩＩＴＦＤＧＫＤＩＲＰＴＩＰＦＭＩＧＤＥＩＦＬＰＦＹＫＮＶＦＳＥＦＦＳＬＦＲＲＶＰＴＳＴＰＹＥＤＬＴＹＦＹＥＣＤＹＴＤＮＫＳＴＦＤＱＦＹＬＹＮＧＥＥＹＴＶＫＴＱＥＡＴＮＫＮＭＷＬＴＴＳＥＦＲＬＫＫＷＦＤＧＥＤＣＩＭＨＬＲＳＬＶＲＫＭＥＤＳＫＲＮＴＧ），
配列番号２（ＧＨＫＬＡＦＮＦＮＬＥＩＮＧＳＤＴＨＳＴＶＤＶＹＬＤＤＳＱＩＩＴＦＤＧＫＤＩＲＰＴＩＰＦＭＩＧＤＥＩＦＬＰＦＹＫＮＶＦＳＥＦＦＳＬＦＲＲＶＰＴＳＴＰＹＥＤＬＴＹＦＹＥＣＤＹＴＤＮＫＳＴＦＤＱＦＹＬＹＮＧＥＥＹＴＶＫＴＱＥＡＴＮＫＮＭＷＬＴＴＳＥＦＲＬＫＫＷＦＤＧＥＤＣＩＭＨＬＲＳＬＶＲＫＭＥＤＳＫＲ），
配列番号３（ＨＫＬＶＨＹＦＮＬＫＩＮＧＳＤＩＴＮＴＡＤＩＬＬＤＮＹＰＩＭＴＦＤＧＫＤＩＹＰＳＩＡＦＭＶＧＮＫＬＦＬＤＬＹＫＮＩＦＶＥＦＦＲＬＦＲＶＳＶＳＳＱＹＥＥＬＥＹＹＹＳＣＤＹＴＮＮＲＰＴＩＫＱＨＹＦＹＮＧＥＥＹＴＥＩＤＲＳＫＫＡＴＮＫＮＳＷＬＩＴＳＧＦＲＬＱＫＷＦＤＳＥＤＣＩＩＹＬＲＳＬＶＲＲＭＥＤＳＮＫ）。
特定の態様において、第１のアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも８０％の同一性を含むＯＭＣＰの配列である。例えば、ＯＭＣＰは、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対して、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性を有し得る。

上述の実施形態のいずれにおいても、第１のアミノ酸配列は、ＯＭＣＰのアルファ－ヘリックスドメインを含む配列、またはそれに対して少なくとも８０％の相同性を有する配列であり得る。従って、特定の態様において、第１のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸位置４８～６７および１１０～１４７、配列番号２のアミノ酸位置４９～６８および１１１～１４８、または配列番号３のアミノ酸位置４８～６６および１１１～１４８に対して少なくとも８０％の相同性を有し得る。例えば、第１のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸位置４８～６７および１１０～１４７、配列番号２のアミノ酸位置４９～６８および１１１～１４８、または配列番号３のアミノ酸位置４８～６６および１１１～１４８に対して、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性を有し得る。

抗ＮＫＧ２Ｄ抗体
「抗ＮＫＧ２Ｄ抗体」とは、ＮＫＧ２Ｄ内のエピトープに特異的に結合する抗体（本明細書中でいう）を意味する。「抗体」という用語は、「モノクローナル抗体」を包含する。「モノクローナル抗体」とは、例えば、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一コピーまたはクローンに由来する抗体を意味する。モノクローナル抗体は、当該技術において周知の、例えばハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、またはその技術および容易に知られる他の技術の組合せを用いて産生することができる。「抗体」という用語は、機能性なモノクローナル抗体、またはその免疫学的に有効断片を意味することも理解されるべきである。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２断片など。タンパク質が意図した標的に結合する能力を特異的に保持する限り、「抗体」という用語に含まれる。また、定義「抗体」の中には、例えば、この特異性を有する抗体の単鎖形態、一般にＦｖ領域、と称される。これらのｓｃＦｖは、リンカーによって連結された重鎖および軽鎖可変領域から構成される。ｓｃＦｖの作製および使用方法は、当該技術分野において公知である。さらに、定義「抗体」の中に含まれるのは、単一ドメイン抗体であり、一般に、単一モノマー可変抗体ドメインからなる抗体断片であるｓｄＡｂと称される。ｓｄＡｂ抗体は、ラクダ科動物（ＶＨＨ断片）または軟骨魚類（ＶＮＡＲ断片）から誘導され得る。本明細書において使用される「ヒト化抗体」は、非ヒト相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を有する抗体の配列を変更することによって、ヒト抗体生殖系列に由来するアミノ酸配列の一部または全部から構成される抗体である。最も単純なこのような改変は、単にヒト抗体の定常領域をマウス定常領域のために置換することから成り、従って、医薬用途に受容可能なほど十分に低い免疫原性を有する可能性のあるヒト／マウスキメラを生じることができる。しかしながら、好ましくは、抗体およびＣＤＲの可変領域もまた、現在当該技術分野でよく知られている技術によってヒト化される。可変領域のフレームワーク領域は、対応するヒトフレームワーク領域によって置換され、非ヒトＣＤＲは実質的にインタクトなままであるか、またはＣＤＲをヒトゲノムに由来する配列で置き換えることさえできる。ＣＤＲはまた、実質的にヒトである完全ヒト生殖細胞系フレームワーク領域またはフレームワーク領域との関連において、ＮＫＧ２Ｄに対する結合活性および親和性が維持または増強されるように、ランダムに変異されてもよい。特定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２断片である。

第１のアミノ酸配列が抗ＮＧＫ２Ｄ抗体である上記実施形態のいずれにおいても、抗体は、Ｋｗｏｎｇら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８ Ｄｅｃ ３１；３８４（５）：１１４３－５６に記載されているように、例として、ＫＹＫ－１またはＫＹＫ－２を挙げることができるが、限定するものではない。ＫＹＫ－１の軽鎖は、配列番号４に示すアミノ酸配列
（ＱＰＶＬＴＱＰＳＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＰＣＧＧＤＤＩＥＴＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＤＤＤＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＦＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＳＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＤＮＮＤＥＷＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＬ）を含み、
ＫＹＫ－１の重鎖は配列番号５に示すアミノ酸配列（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＦＧＹＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）を含む。
ＫＹＫ－２の軽鎖は、配列番号６に示すアミノ酸配列
（ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮＷＹＱＱＬＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＤＤＬＬＰＳＧＶＳＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＦＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ）を含み、
ＫＹＫ－２の重鎖は配列番号７に示すアミノ酸配列
（ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＧＬＧＤＧＴＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）を含む。

別の特定の実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＫＹＫ－１に由来するｓｃＦｖである。例えば、ＫＹＫ－１ ｓｃＦｖは、配列番号８に示すアミノ酸配列
（ＱＰＶＬＴＱＰＳＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＰＣＧＧＤＤＩＥＴＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＤＤＤＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＦＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＳＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＤＮＮＤＥＷＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＦＧＹＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）を含む。
あるいは、ＫＹＫ－１ ｓｃＦｖは配列番号９に示すアミノ酸配列
（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＦＧＹＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＰＶＬＴＱＰＳＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＰＣＧＧＤＤＩＥＴＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＤＤＤＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＦＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＳＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＤＮＮＤＥＷＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＬ）を含む。

別の特定の実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＫＹＫ－２に由来するｓｃＦｖである。例えば、ＫＹＫ－２ ｓｃＦｖは、配列番号１０に示すアミノ酸配列
（ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮＷＹＱＱＬＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＤＤＬＬＰＳＧＶＳＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＦＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＧＬＧＤＧＴＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）を含む。
または、ＫＹＫ－２ ｓｃＦｖは、配列番号１１に示すアミノ酸配列
（ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＧＬＧＤＧＴＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮＷＹＱＱＬＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＤＤＬＬＰＳＧＶＳＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＦＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ）を含む。

上述のように、本発明の組成物またはキメラペプチドを提供するために、種々のＫＹＫ－１およびＫＹＫ－２抗体またはそのｓｃＦｖを、本明細書に記載されるリンカーのいずれかの非存在下または存在下で、本明細書に開示されるサイトカインのいずれかと組み合わせてもよい。また、ＫＹＫ－１およびＫＹＫ－２抗体は、本組成物中での使用に適した抗体の例であり、当業者の１つであり、この開示に基づいて、他の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体も同様に適しているであろうことを理解すべきである。

腫瘍標的
概念では、所定の腫瘍において細胞表面で十分に過剰発現される任意の細胞表面タンパク質対正常組織は、適当な治療標的を提供するであろう。臨床で現在使用されているこのような標的の非限定的な例を以下に概説する。別の実施形態では、腫瘍標的は、突然変異されていてもよいし、または２つの天然に存在するタンパク質間の融合タンパク質であってもよく、標的とすることができる独特のエピトープを作り出すことができる。理想的には、これらの細胞表面標的の結合は正常組織の機能を阻害しないであろう。しかし、腫瘍細胞によって発現される大部分のタンパク質は、正常組織においてもある程度発現されるであろうことは認識できる。

本開示のいずれの実施形態においても、第２のドメインの第２のアミノ酸配列は、例えば、限定ではないが、腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞上で過剰発現される腫瘍細胞上のペプチド（腫瘍標的）に結合することができる抗体可変領域、または、リガンドのような腫瘍な標的結合パートナーであり得る。特定の実施形態に、二重特異性または多重特異性構築物は、抗体可変領域を介して腫瘍標的に結合する。可変抗体は、古典的な抗体骨格の一部として発現され得るか、または可変ドメイン間の短いリンカーを有する線状抗体可変抗体として発現され得る。別の実施形態では、構築物は、標的タンパク質への天然に存在するリガンドを介して腫瘍標的に結合する。いくつかの実施形態では、天然に存在するリガンドを変異させて、標的タンパク質に対する結合親和性を増加または減少させる。本発明のポリペプチドによってターゲティングされ得る例示的な腫瘍標的は、下表に提供される。

上述の実施形態のいずれにおいても、第２のドメインは、抗体に由来するｓｃＦｖであり得る。例として、第２のドメインは、セツキシマブのような上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する抗体であり得るが、限定されるものではない。１つの実施形態において、セツキシマブの可変軽鎖は、配列番号１２に示すアミノ酸配列
（ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡ）
を含み、
およびセツキシマブの可変重鎖は配列番号１３に示すアミノ酸配列
（ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ）を含む。
１つの実施形態において、本発明の任意の実施形態の融合タンパク質は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列
（ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ）
を含むセツキシマブｓｃＦｖを含む。
これには可変軽鎖及び重鎖の間のＧＧＧＳ（配列番号３７）リンカーが含まれる。特定の態様において、ｓｃＦＶの可変軽鎖は、配列番号１２と少なくとも約８０％の相同性を有する配列を含むことができる。例えば、ＶＬは、配列番号１２と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性を有し得る。特定の態様において、ｓｃＦｖの可変重鎖は、配列番号１３に対して少なくとも約８０％の相同性を有する配列を含むことができる。例えば、ＶＨは、配列番号１３と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性を有し得る。特定の態様において、ｓｃＦＶは、配列番号１４と少なくとも約８０％の相同性を有する配列を含むことができる。例えば、ｓｃＦｖは、配列番号１４と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性を有し得る。

したがって、１つの実施形態において、本発明の関連実施形態のいずれかの融合タンパク質は、ＯＭＣＰおよびセツキシマブｓｃＦＶを含み得る。この融合タンパク質の例示的な１つの実施形態は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列
（ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＫＬＡＦＮＦＮＬＥＩＮＧＳＤＴＨＳＴＶＤＶＹＬＤＤＳＱＩＩＴＦＤＧＫＤＩＲＰＴＩＰＦＭＩＧＤＥＩＦＬＰＦＹＫＮＶＦＳＥＦＦＳＬＦＲＲＶＰＴＳＴＰＹＥＤＬＴＹＦＹＥＣＤＹＴＤＮＫＳＴＦＤＱＦＹＬＹＮＧＥＥＹＴＶＫＴＱＥＡＴＮＫＮＭＷＬＴＴＳＥＦＲＬＫＫＷＦＤＧＥＤＣＩＭＨＬＲＳＬＶＲＫＭＥＤＳＫＲＮＴＧ）を含む。

三重特異性融合タンパク質
本発明の治療的融合ペプチドは、三重および四重特異性治療薬を含むことができる。三重特異性構成は、第１のドメインに加えて、２つの別々の腫瘍標的に対する抗体可変領域を含み得る。がん細胞は、同じ腫瘍内でも様々なタンパク質発現様式を示すことが知られている。したがって、多数の腫瘍を標的としたリガンドを組み込むことで、あらゆる細胞上にある表面受容体が発現する可能性を高めることになる。非限定的な例として、ＥＲＢＢ２およびＥＧＦＲの両方に対する可変領域を含めることができる。ＥＲＢＢ２、ＣＤ１９、ＥＰＣＡＭ、ＭＳ４Ａ１、ＦＯＬＨ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＩＬ３ＲＡ、ＰＭＥＬ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＫＤＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖蛋白７２）、ＣＤ２０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、Ｂ７Ｈ３／ＣＤ２７６、ＧＰＡ３３、ＳＳＴＲ２、ＧＰＣ３、およびＣＤＨ３を含む任意の組合せの腫瘍特異的標的に対して特異的な抗体可変領域を組み込むことができた。

三重特異性構成はまた、２つのＮＫＧ２Ｄ結合部分、例えばＮＫＧ２ＤリガンドまたはαＮＫＧ２Ｄ抗体可変領域を含み得る。このような実施形態では、タンパク質の表層における複数ＮＫＧ２Ｄ受容体の結合がＮＫＧ２Ｄの二量体化およびＮＫＧ２Ｄ経路の活性化に寄与し、その結果、細胞毒性ＮＫおよびＣＤ８⁺Ｔ細胞が活性化される可能性がある。別の構成では、ＮＫＧ２Ｄの機能性活性化は、各々のＮＫＧ２Ｄリガンド間の短いリンカー配列を伴う１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの連続的な挿入を介して最適化することができた。この構成の具体実施形態において、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、本明細書に開示されるように、ＯＭＣＰまたはそのバリアントであり得る。

上述の実施形態のいずれにおいても、本開示のポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインに加えて、第３のドメインをさらに含むことができる。特定の態様において、第３のドメインは、腫瘍細胞上のペプチドに結合することができる第３のアミノ酸配列を含み、ここで、ペプチドは、腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである。ある種の態様では、第３のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列が結合可能であるのと同じペプチドに結合することが可能である。特定の態様において、第３のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列が結合可能なものとは別のペプチドに結合することが可能である。第２のドメインに関する実施形態の前述の説明は、腫瘍細胞上のペプチドに結合可能な第３のアミノ酸配列を含む場合、第３のドメインに適用されることを理解すべきである。

特定の態様において、第３のドメインは、ヒトＮＫＧ２Ｄに結合することができる第３のアミノ酸配列を含む。第１のドメインに関する実施形態の説明は、ヒトＮＫＧ２Ｄに結合可能な第３のアミノ酸配列を含む場合には、第３のドメインに当てはまることを理解すべきである。

特定の態様において、第３のドメインは、Ｆｃ抗体ドメインを含む。特定の態様において、Ｆｃ抗体ドメインは、Ｆｃ抗体ドメインがＣＤ１６に結合するのを妨げる変異を含むことができる。

特定の態様において、第３のドメインはサイトカインを含む。

特定の態様において、第３のドメインはリンカーとなりうる。第３のドメインがリンカーである特定の態様では、リンカーは第１のドメインと第２のドメインとの間に配置することができる。

例示的な三重特異性ポリペプチドを図２Ａ－２Ｃに示す。

四重特異性融合タンパク質
別の構成では、融合タンパク質は、複数リンパ球ターゲティングタンパク質ならびにタンパク質をターゲティングする複数腫瘍を組み込むことができ、四重特異性タンパク質を作り出す。１つの例では、両方のリンパ球ターゲティングリガンドがＮＫＧ２Ｄと結合し、特異的にＯＭＣＰであろう。別の例では、２つの別々のリンパ球表面レセプターが選択されるであろう。これは、様々な活性化状態におけるリンパ球の関与を可能にするか、または、治療活性化をＮＫ細胞活性化またはＣＤ８⁺Ｔ細胞活性化のいずれかにより大きく偏らせるかもしれない。非限定的な例では、２つのリンパ球リガンドは、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＯＭＣＰ、抗ＣＤ３ｅ（ＣＤ８⁺Ｔ細胞に偏る）、または抗ＦＣＧＲ１（ＮＫ細胞に偏る）のいずれかの組合せから選択することができる。ＥＲＢＢ２、ＣＤ１９、ＥＰＣＡＭ、ＭＳ４Ａ１、ＦＯＬＨ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＩＬ３ＲＡ、ＰＭＥＬ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＫＤＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖蛋白７２）、ＣＤ２０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、Ｂ７Ｈ３／ＣＤ２７６、ＧＰＡ３３、ＳＳＴＲ２、ＧＰＣ３、およびＣＤＨ３を含む任意の組合せの腫瘍特異的標的に対して特異的な抗体可変領域を組み込むことができた。

上述の実施形態のいずれにおいても、本発明のポリペプチドは３つのドメインを含み、ポリペプチドは第４のアミノ酸配列を含む第４のドメインを含むことができる。特定の態様において、第４のアミノ酸配列が腫瘍細胞上のペプチドに結合することが可能であり、ここで、ペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである。特定の態様において、第４のアミノ酸配列は、第２または第３のアミノ酸配列が結合可能であるのと同じペプチドに結合することが可能である。特定の態様において、第４のアミノ酸配列は、第２および第３のアミノ酸配列が結合可能なものとは異なったペプチドに結合することが可能である。第２のドメインに関する実施形態の前述の説明は、腫瘍細胞上のペプチドに結合可能な第４のアミノ酸配列を含む場合、第４のドメインに適用されることを理解すべきである。

特定の態様において、４番目のアミノ酸配列はヒトＮＫＧ２Ｄに結合可能である。第１のドメインに関する実施形態の説明は、ヒトＮＫＧ２Ｄに結合可能な第３のアミノ酸配列を含む場合、第４のドメインに適用されることを理解すべきである。

特定の態様において、第４のドメインはＦｃ抗体ドメインを含む。特定の態様において、Ｆｃ抗体ドメインは、Ｆｃ抗体ドメインがＣＤ１６に結合するのを妨げる変異を含むことができる。

特定の態様において、第４のドメインはサイトカインを含む。

特定の態様において、第４のドメインはリンカーとなりうる。

本開示の例示的な四重特異性ポリペプチドは、図３Ａ－３Ｂに示されている。

本発明のポリペプチドは、４つ以上の特異的ドメインを含み得、第１のドメインおよび第２のドメインに加えてここに開示されたドメインの組合せを含むことができることを理解すべきである。

Ｆｃ抗体ドメイン
本発明の実施形態のいずれにおいても、ポリペプチドは、抗体からのＦｃ抗体ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ抗体ドメインは、ヒンジ部分、ＣＨ３部分およびＣＨ２部分を含むことができる。例として、限定ではないが、Ｆｃ抗体ドメインは、配列番号２１の配列
（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）
を含むことができる。
これはＩｇＧ１ Ｆｃの野生型配列である。

特定の態様において、Ｆｃ抗体ドメインは、ヘテロ二量体化を促進するドメインをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、２つの鎖のヘテロ二量体化を可能にするノブドメインとホールドメインを含むことができる。例として、限定ではないが、Ｆｃ抗体ドメインは、配列番号２２のノブドメイン
（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＹＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）
および配列番号２３のホールドメイン
（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＴＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のような、ノブドメインおよびホールドメインを含むことができる。
限定ではないが、さらなる例示によって、ノブドメインは、配列番号２４の配列
（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＹＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）を含み得、
そしてホールドメインは配列番号２５の配列
（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＴＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）を含むことができる。
さらに別の例示であるが、限定ではないが、ノブドメインは、配列番号２６の配列
（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）を含み得、
そしてホールドメインは配列番号２７の配列
（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＦＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）を含むことができる。
これは、ヘテロ二量体を生成するための、ファージディスプレイノブ－イン－ホールシステムを提供する。

いくつかの実施形態において、Ｆｃ抗体ドメインは、SEEDヘテロ二量体化のためのドメインを含むことができる。例として、非限定的に、Ｆｃ抗体ドメインは、配列番号２８の配列
（ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＷＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＡＲＧＦＹＰＫＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＴＩＳＬＳＰＧＫ）を有するドメイン、
および配列番号２９の配列を有するドメイン
（ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＤＲＳＰＧＫ）を含むことができ、これらはヘテロ二量体を選択的に形成する。

ヘテロ二量体を優先的に形成することにより、本発明のＦｃ抗体ドメインを有するポリペプチドは、Ｆｃ抗体ドメインの各々の部分に１つずつ付着した２つの異なった結合部分を有することができる。例えば、図６Ａ－６Ｄに示されるように、本発明の例示的ポリペプチドは、Ｆｃ抗体ドメインと結合した２つの特異的結合部分を含み得、この結合部分は、図６Ａ－６Ｄのケースでは、SEEDヘテロ二量体化設計を含む。

いくつかの実施形態において、Ｆｃ抗体は、Ｆｃ部分のＣＤ１６への結合を妨げる変異または変異をさらに含むことができる。図６Ａ～６Ｂは、エフェクター機能サイレンシング変異を含むこのようなデザインをさらに例示する。例として、制限はないが、エフェクターサイレンシング変異には、ネイティブヒトＩｇＧ１に対するＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｐ、Ｐ３２９Ｇおよびその組合せが含まれる。配列番号２１では、これらの変異は配列番号２１の位置１９、２０および１１４で生じる（Ｌ１９、Ｌ２０およびＰ１１４）と考えられる。したがって、エフェクター機能サイレンシング変異は、対応する位置が存在する範囲で、本発明のポリペプチドのＦｃ抗体ドメイン中の対応する位置にあり得る。

いくつかの実施形態において、Ｆｃ抗体ドメインは、構築物の浄化を可能にする変異または変異をさらに含むことができる。例示として、このような変異は、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｑ、Ｑ３１１ＲおよびネイティブヒトＩｇＧ１と比較した組合せを含むことができるが、これに限定されない。配列番号２１では、これらの変異は配列番号２１の位置１９、２０および１１４に生じる（Ｔ９２、Ｌ９４およびＱ９６）と考えられる。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、単量体Ｆｃ抗体ドメインを含むことができる。単量体Ｆｃドメインを用いて、本発明のポリペプチドの半減期を増大させることができる。例として、単量体Ｆｃドメインは、配列番号３０の配列

を含み得るが、限定されるものではない。
これは、Ｌ３５１Ｓ、Ｔ３６６Ｒ、Ｌ３６８ＨおよびＰ３９６Ｋ変異（配列番号３０でそれぞれ位置１３６、１５１、１５３および１８１に対応）を有する単量体Ｆｃドメインである。

本発明のポリペプチド中のＦｃ抗体ドメインは、Ｆｃ抗体ドメインに対する変異、添加、欠失および他の修飾により、上述の例示的な実施形態から変化し得ることを理解すべきである。例として、限定ではないが、Ｆｃ抗体ドメインは、配列番号２１－３０のいずれかに対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。

リンカー
本発明のポリペプチドは、本明細書に開示されているように、およびポリペプチドのドメイン間のリンカーを含み得ることを理解すべきである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ｎが少なくとも１の整数である（ＧＧＧＧＳ）_nを含むことができる。例として、ｎは、１、２、３、４、５またはそれ以上であり得るが、限定的ではない。リンカーは当業者に周知であり、好適なリンカーを使用することができる。

サイトカイン
「サイトカイン」は小さなタンパク質（約５～２０ｋＤａ）で、シグナル伝達に重要である。サイトカインは細胞から放出され、他の細胞および／またはサイトカインを放出する細胞の挙動に影響を及ぼす。サイトカインの非限定的な例としては、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍ネクローシスファクター、モノカイン、およびコロニー刺激因子が挙げられる。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、肥満細胞および単球、内皮細胞、線維芽細胞および間質細胞などの免疫細胞を含むが、これらに限定されない広範囲の細胞によって産生され得る。サイトカインは複数のタイプの細胞から産生される。サイトカインは受容体を介して作用し、特に免疫系において重要であり、体液性免疫応答と細胞性免疫応答のバランスを調節し、細胞集団の成熟、増殖および応答性を調節する。サイトカインは、感染、免疫応答、炎症、外傷、敗血症、がんおよび生殖に対する宿主応答において重要である。本発明のサイトカインは、天然に存在するサイトカインであってもよく、天然に存在するサイトカインの変異型であってもよい。本明細書中で使用される「天然に存在するは、野生型とも呼ばれ、対立遺伝子の分散を含み、天然に存在するサイトカインの突然変異型または「変異体」は、サイトカインの機能、活性および／または特異性を変化させるために天然に存在する配列になされた特異的変異を意味する。１つの実施形態において、変異は、サイトカインの機能、活性および／または特異性を増強し得る。別の実施形態では、変異は、サイトカインの機能、活性および／または特異性を低下させ得る。変異は、サイトカインの１つ以上のアミノ酸残基の欠失または付加を含み得る。

サイトカインは構造に基づいて分類することができる。例えば、サイトカインは、４－α－ヘリックスバンドルファミリー、ＩＬ１ファミリー、ＩＬ１７ファミリーおよびシステイン－ノットサイトカインの４種類に分類され得る。４αヘリックスバンドルファミリーのメンバーは４本のαヘリックスバンドルをもつ３次元構造をもつ。このファミリーはさらに、ＩＬ２サブファミリー、インターフェロン（ＩＦＮ）サブファミリーおよびＩＬ１０サブファミリーの３つのサブファミリーに分けられる。ＩＬ２サブファミリーは最大であり、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびトロンボポイエチン（ＴＰＯ）を含むが、これらに限定されないいくつかの非免疫学的サイトカインを含む。

前述の実施形態のいずれかにおいて、サイトカインは、4-α-ヘリックスバンドルファミリー内のサイトカインまたはその変異体であり得る。 当業者であれば、4-α-ヘリックスバンドルファミリー内のサイトカインを決定することができるであろう。

上記の実施形態のいずれかにおいて、サイトカインは、ＩＬ２サブファミリーまたはその変異体であり得る。ＩＬ２サブファミリーのメンバーの非限定的な例としては、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５およびＩＬ２１が挙げられる。特異的実施形態において、サイトカインはＩＬ２またはその変異体である。前記実施形態のいずれにおいても、サイトカインはＩＬ１５またはその変異体であり得る。全長ヒトＩＬ１５アミノ酸配列の配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＧ４６７７７．１、ＡＡＩ００９６２．１またはＡＡＩ００９６３．１を用いて見出すことができる。全長ヒトＩＬ１５ ｍＲＮＡ配列の配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＲ５４２００７．１、ＫＪ８９１４６９．１、ＮＭ＿１７２１７５．２、ＮＭ＿０００５８５．４またはＣＲ５４１９８０．１を用いて見出すことができる。当業者は、ＩＬ１５が様々な種において見出され得ること、およびＩＬ１５の類似体またはホモログを同定する方法が、以下に詳しく記載されるように当技術分野において公知であることを認識するであろう。

上述の実施形態のいずれにおいても、サイトカインはＩＬ１ファミリーサイトカインまたはその変異体であり得る。ＩＬ１ファミリーは１１種類のサイトカインの一群であり、免疫反応および炎症反応の調節において中心的な役割を果たしている。一般に、サイトカインのＩＬ１ファミリーは、炎症反応を調節し、開始させる炎症性サイトカインである。ＩＬ１ファミリーサイトカインの非限定的な例としては、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ１Ｒａ、ＩＬ１８、ＩＬ－３６Ｒａ、ＩＬ３６α、ＩＬ３７、ＩＬ３６β、ＩＬ３６γ、ＩＬ３８、およびＩＬ３３が挙げられる。ＩＬ１ファミリーメンバーは類似の遺伝子構造を有する。当業者は、ＩＬ１ファミリー内のサイトカインを決定することができるであろう。

前記実施形態のいずれにおいても、サイトカインはＩＬ１８またはその変異体であり得る。全長ヒトＩＬ１８アミノ酸配列の配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＧ４６７７１．１を用いて見出すことができる。全長ヒトＩＬ１８ ｍＲＮＡ配列の配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＲ７１０１４７．１、ＣＲ５４２００１．１、ＣＲ５４１９７３．１またはＫＪ８９７０５４．１を用いて見出すことができる。当業者は、ＩＬ１８が様々な種において見出され得ること、およびＩＬ１８の類似体またはホモログを同定する方法が当技術分野において公知であることを認識するであろう。

上記の実施形態のいずれにおいても、サイトカインはインターフェロンサブファミリーサイトカインまたはその変異体となりうる。インターフェロンは、細胞をウイルス感染から守ることによってウイルスの複製を「妨げる」能力をもつことから名づけられている。ＩＦＮは他の機能ももっている。すなわち、ナチュラルキラー細胞やマクロファージなどの免疫細胞を活性化する。主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原の発現を増加させることによって、抗原提示をアップレギュレートすることによって、宿主の防御能を高める。ヒトインターフェロンは、シグナルを伝達する受容体の種類に基づいて、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＩ型ＩＦＮ、ＩＩＩ型ＩＦＮの３つの主要なタイプに分類されている。Ｉ型ＩＦＮは、ＩＦＮＡＲ１鎖とＩＦＮＡＲ２鎖からなるＩＦＮ－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）として知られる特異的な細胞表面受容体複合体に結合する。ヒトに存在するＩ型インターフェロンの非限定的な例は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－κおよびＩＦＮ－ωである。したがって、特定の実施形態に、組成物のサイトカインは、野生型および変異体型のＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－κおよびＩＦＮ－ωを含むが、これらに限定されない、１型ＩＦＮサイトカインまたはその変異体である。ＩＩ型ＩＦＮはＩＦＮＧＲ１鎖とＩＦＮＧＲ２鎖からなるＩＦＮＧＲに結合する。ヒトに存在するＩＩ型インターフェロンの非限定的な例はＩＦＮ－γである。したがって、特定の実施形態に、組成物のサイトカインは、ＩＩ型ＩＦＮサイトカインまたはその変異体であり、これらには、野生型および変異体型のＩＦＮ－γが含まれるが、これらに限定されない。ＩＩＩ型ＩＦＮは、ＩＬ１０Ｒ２（ＣＲＦ２－４とも呼ばれる）およびＩＦＮＬＲ１（ＣＲＦ２－１２とも呼ばれる）からなる受容体複合体を介してシグナルを伝達する。ＩＩＩ型インターフェロンの非限定的な例としては、ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２およびＩＦＮ－λ３（それぞれＩＬ２９、ＩＬ２８ＡおよびＩＬ２８Ｂとも呼ばれる）が挙げられる。したがって、特定の実施形態に、組成物のサイトカインは、ＩＩＩ型ＩＦＮサイトカインまたはその変異体であり、これらには、野生型および変異体型のＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２およびＩＦＮ－λ３が含まれるが、これらに限定されない。

上述の実施形態のいずれにおいても、サイトカインは、腫瘍ネクローシスファクタースーパーファミリー（ＴＮＳＦ）、またはその変異体の一員であり得る。ＴＮＳＦメンバーは主に免疫細胞によって発現される炎症誘発性サイトカインであり、炎症状態を誘導し、免疫細胞機能を刺激する。ＴＮＦ（ＴＮＦα）、ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）、ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７）、ＥＤＡ、ＦＡＳＬＧ（ＴＮＦＳＦ６）、ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）、ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢＬ）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８を含むがこれらに限定されない少なくとも１８のＴＮＳＦホモログが存在する。したがって、特定の実施形態において、組成物のサイトカインは、腫瘍壊死因子スーパーファミリーまたはその変異体であり、ＴＮＦ（ＴＮＦα）、ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）、ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７）、ＥＤＡ、ＦＡＳＬＧ（ＴＮＦＳＦ６）、ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）、ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢＬ）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８を含むが、これらに限定されない。

別の構成では、免疫調節性サイトカインを融合タンパク質設計に組み込むことができる。例えば、サイトカインは、リンパ球特異的リガンドと腫瘍標的化抗体との間のリンカー内に取り込むことができる。別の例では、Ｆｃ重鎖を含む融合タンパク質の１つの鎖からサイトカインを取り込ませることができる。非限定的な例では、活性分子は、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮλの天然に存在する型または変異型のいずれかから選択することができる。

サイトカインを含む本開示の例示的ポリペプチドを図４Ａ－４Ｂに示す。

ＰＥＧ化とグリコシル化
ＮＫＧ２ＤリガンドがＯＭＣＰまたはそのバリアントである特定の実施形態では、ＯＭＣＰまたはそのバリアントを改変して、全身半減期を改善し、用量発生頻度を減少させることができる。ポリペプチドがＯＭＣＰまたはそのバリアントを含む上記実施形態のいずれにおいても、Ｎ－グリカンをＯＭＣＰまたはそのバリアントに付加することができる。生物学的機能は、典型的にはタンパク質成分によって決定されるが、炭水化物は、分子安定性、溶解性、ｉｎ ｖｉｖｏ活性、血清半減期、および免疫原性に関与し得る。特に糖質のシアル酸成分は、タンパク質治療薬の血清半減期を延長させることができる。従って、新しいＮ－結合グリコシル化コンセンサス配列をペプチド主鎖中の望ましい位置に導入して、炭水化物を含むシアル酸が増加したタンパク質を生成し、それにより、より長い血清半減期によりｉｎ ｖｉｖｏ活性を増加させることができる。別の実施形態では、ＰＥＧをＯＭＣＰまたはそのバリアントに加えてもよい。ＰＥＧをタンパク質に結合させる方法は、当該技術分野においてスタンダードである。例えば、「Ｋｏｌａｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１４；１９２（２８）：６７－８１」を参照のこと。その全体が本明細書に参照により援用されている。上述の実施形態の本開示のポリペプチドは、ＯＭＣＰ、またはＰＥＧおよび／または１以上のＮ－グリカンを含むそのバリアントを含み得る。上記のいずれかの実施形態において、ＰＥＧは、ＰＥＧ－１０Ｋ、ＰＥＧ－２０ＫおよびＰＥＧ－４０Ｋからなる群より選択される。

脱免疫
さらに、開示の融合タンパク質を改変して、Ｔ細胞エピトープを除去してもよい。Ｔ細胞エピトープは、対象への組成物の投与に際して免疫原性を刺激することができる。Ｔ細胞への提示を介して、抗薬物抗体の開発プロセスを活性化する。Ｔ細胞エピトープの前臨床スクリーニングをインシリコで実施し、続いてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ検証を実施してもよい。ＥｐｉＭａｔｒｉｘのようなＴ細胞エピトープマッピングツールは、免疫応答の高度に正確な予測因子となりうる。Ｔ細胞エピトープを意図的に除去すると、免疫原性が低下する可能性がある。

医薬組成物
本開示はまた、医薬組成物を提供する。医薬組成物は、活性成分として本明細書に記載される治療用融合タンパク質物の１つおよび少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含み得る。

薬学的に許容可能な賦形剤は、希釈剤、結合剤、充填剤、緩衝剤、ｐＨ改変剤、崩壊剤、分散剤、保存剤、潤滑剤、味覚マスキング剤、香味剤、または着色剤であってよい。医薬組成物を形成するために利用される賦形剤の量および種類は、薬学の既知の原理に従って選択され得る。

１つの実施形態において、賦形剤は希釈剤であってもよい。希釈剤は圧縮可能（すなわち、可塑的に変形可能）であるか、または研磨性脆性である。適当な圧縮性希釈剤の非限定的な例としては、微結晶セルロース（ＭＣＣ）、セルロース誘導体、セルロース粉末、セルロースエステル（すなわち、酢酸および酪酸混合エステル）、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、トウモロコシデンプン、リン酸塩トウモロコシデンプン、プリゼラチン化トウモロコシデンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、デンプン－ラクトース、デンプン－炭酸カルシウム、デンプン－グリコール酸ナトリウム、グルコース、フルクトース、乳糖、乳糖一水和物、スクロース、キシロース、ラクチトール、マンニトール、マリトール、ソルビトール、キシリトール、マルトデキストリン、およびトレハロースが挙げられる。適当な研磨性脆性希釈剤の非限定的な例としては、二塩基性リン酸カルシウム（無水または二水和物）、三塩基性リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、および炭酸マグネシウムが挙げられる。

別の実施形態では、賦形剤はバインダーであってもよい。好適な結合剤としては、デンプン、プリゼラチン化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ１２～Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施形態では、賦形剤は充填剤であってもよい。適当な充填剤には、炭水化物、無機化合物、およびポリビニルピロリドンが含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例として、充填剤は、硫酸カルシウム、二塩基性および三塩基性の両方、デンプン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、微結晶セルロース、二塩基性リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸カルシウム、タルク、変性デンプン、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールであり得る。

さらに別の実施形態では、賦形剤は緩衝剤であってもよい。好適な緩衝剤の代表的な例としては、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、トリス緩衝剤、および緩衝生理食塩水（例えば、トリス緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）が挙げられるが、これらに限定されない。

様々な実施形態において、賦形剤はｐＨ修飾剤であり得る。非限定的な例として、ｐＨ修飾剤は、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸、またはリン酸であり得る。

さらなる実施形態では、賦形剤は崩壊剤であってもよい。崩壊剤は、非発泡性または発泡性であり得る。非発泡性崩壊剤の好適な例としては、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、プレゼラチン化およびその修飾デンプンなどのデンプン、甘味剤、ベントナイトなどのクレイ、微結晶セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、寒天、グアー、ローカストビーン、カラヤ、ペシチン、およびトラガントなどのガムが挙げられるが、これらに限定されない。適当な発泡性崩壊剤の非限定的な例としては、酒石酸と組合せたクエン酸および重炭酸ナトリウムと組合せた重炭酸ナトリウムが挙げられる。

さらに別の実施形態では、賦形剤は分散剤または分散増強剤であってもよい。適切な分散剤としては、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、ナトリウムデンプングリコレート、イソアモルファスシリケート、および微結晶セルロースが挙げられ得るが、これらに限定されない。

別の代替実施形態では、賦形剤は防腐剤であってもよい。適切な防腐剤の非限定的な例としては、抗酸化剤、例えばＢＨＡ、ＢＨＴ、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、またはレチニルパルミテート、クエン酸、クエン酸ナトリウム；キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ；および抗菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、またはフェノールが挙げられる。

さらなる実施形態において、賦形剤は潤滑剤であり得る。適当な潤滑剤の非限定的な例としては、タルクまたはシリカなどのミネラル；および植物性ステアリン、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸などの脂肪が挙げられる。

組成物中の賦形剤または賦形剤の組合せの重量分率は、組成物の全重量の約９９％以下、約９７％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下、約１％以下であり得る。

組成物は、種々の用量形態に製剤化し、治療有効量の活性成分を送達する多数の種々の手段によって投与することができる。このような組成物は、所望により、通常の非毒性薬学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルを含む用量ユニット製剤中で経口、非経口、または局所的に投与することができる。局所投与は、経皮パッチ又はイオン導入素子のような経皮投与の使用も含みうる。本明細書中で使用される用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、または胸骨内注射、または注入技術を含む。薬物の処方は、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ、Ａ．Ｒ．、レミントンの薬学、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１８ｔｈ ｅｄ、１９９５）、およびＬｉｂｅｒｍａｎ、Ｈ．Ａ．およびＬａｃｈｍａｎ、Ｌ．、Ｅｄｓ．、薬学用量フォーム、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．（１９８０）で議論される。

経口投与用の固体用量形態は、カプセル、錠剤、カプレット、ピル、パウダー、ペレット、および顆粒を含む。このような固体用量形態では、活性成分は、通常、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせられ、その実例は上記に詳述される。経口製剤は、水性懸濁液、エリキシル剤、またはシロップ剤として投与することもできる。これらのために、活性成分は、様々な甘味剤または香味剤、着色剤、および、もしそうであれば、乳化剤および／または懸濁剤、ならびに水、エタノール、グリセリン、およびそれらの組合せなどの希釈剤と組み合わせてもよい。

非経口投与（皮下、皮内、静脈内、筋肉内、および腹腔内を含む）の場合、製剤は水性または油性の溶液でよい。水溶液は、水、塩水などの滅菌ポリオール希釈剤、グリセロール、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；ベンジルアルコール、メチルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、チメロサールなどの抗菌剤および／または抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート化剤；酢酸、クエン酸塩、またはリン酸などの緩衝剤；および／または塩化ナトリウム、デキストロース、またはマンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコールなどの調和剤を含んでもよい。水溶液のｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウム等の酸又は塩基で調整することができる。油ベースの溶液または懸濁液はさらにゴマ、ピーナッツ、オリーブ油、または鉱油を含み得る。

特定の実施形態に、本開示の治療用融合ペプチドを含む組成物は、標的細胞への化合物の送達を助けるか、組成物の安定性を増加させるか、または組成物の潜在的毒性を最小限にするかのいずれかのために、好適なビヒクルにカプセル化することができる。当業者によって理解されるように、本発明の組成物を送達するためには、様々なビヒクルが適している。適切な構造化流体送達システムの非限定的な例としては、ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルション、ミセル、デンドリマーおよび他のリン脂質含有システムが挙げられる。送達ビヒクルに配合物を組み込む方法は、当技術分野で公知である。

一つの代替実施形態では、リポソーム送達ビヒクルを利用することができる。リポソームは、実施形態に応じて、その構造的および化学的性質を考慮すると、ペプチドの送達に適している。一般的に言えば、リポソームはリン脂質二重層膜をもつ球形の小胞である。リポソームの脂質二重層は、他の二重層（例えば、細胞膜）と融合して、リポソームの含有量を細胞に運ぶことができる。このようにして、本発明の化合物は、標的細胞の膜と融合するリポソーム中に封入することによって、細胞に選択的に送達され得る。

リポソームは、種々の炭化水素鎖長を有する種々の異なる種類のリン脂質から構成され得る。リン脂質は一般に、グリセロールリン酸を介して様々な極性基の１つに結合した２つの脂肪酸からなる。適切なリン脂質には、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ジホスファチジルグリセロール（ＤＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）などがある。リン脂質を含む脂肪酸鎖は、約６～約２６炭素原子の長さの範囲であり得、脂質鎖は、飽和または不飽和であり得る。適当な脂肪酸鎖には、ｎ－ドデカン酸（ラウリン酸）、ｎ－トレトラデカン酸（ミリスチン酸）、ｎ－ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ｎ－オクタデカン酸（ステアリン酸）、ｎ－エイコサン酸（アラキド酸）、ｎ－ドコサン酸（ベヘン酸）、ｎ－テトラコサン酸（リグノセリン酸）、ｃｉｓ－９－ヘキサデセン酸（パルミトレイン酸）、ｃｉｓ－９－オクタデカン酸（オレイン酸）、ｃｉｓ, ｃｉｓ－９，１２－オクタデカンジエン酸（リノール酸）、すべてのｃｉｓ－９，１２，１５－オクタデカトリエン酸（リノレン酸）、およびすべてｃｉｓ－５，８，１１，１４－エイコサテトラエン酸（アラキドン酸が含まれる（括弧内は一般名）。リン脂質の２つの脂肪酸鎖は同一の場合もあれば、異なる場合もある。許容可能なリン脂質には、ジオレオイルＰＳ、ジオレオイルＰＣ、ジステアロイルＰＳ、ジステアロイルＰＣ、ジステアロイルＰＣ、ジミリストイルＰＳ、ジミリストイルＰＣ、ジパルミトイルＰＧ、ステアロイルＰＳ、オレオイルＰＳ、パルミトイル、リノレニルＰＳなどがある。

リン脂質は、任意の天然源から得られ、それ自体、リン脂質の混合物を含み得る。例えば、卵黄にはＰＣ、ＰＧ、ＰＥが多く、大豆にはＰＣ、ＰＥ、ＰＩ、ＰＡが含まれ、動物の脳または脊髄にはＰＳが豊富である。リン脂質は合成源に由来することもある。個々のリン脂質の比率が異なるリン脂質の混合物を用いることができる。種々のリン脂質の混合物は、有利な活性または活性特性の安定性を有するリポソーム組成物をもたらす可能性がある。上記のリン脂質は、Ｎ－（１－（２，３－ジオレリオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド、 １，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドカルボシアニンペルクロアレート、３，３’－デヘプチルオキサカルボシアニンヨージド、１，１’－デドデシル－３，３，３’，３’テトラメチルインドカルボシアニンペルクロアレート、１，１’－ジオレイル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドカルボシアニンメタンスルホネート、Ｎ－４－（デリノレイルアミノスチリル）－Ｎ－メチルピリジニウムヨージド、または１，１，－ジリノレイル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドカルボシアニンパークロアレートなどカチオン性脂質と最適な比率で混合され得る。

リポソームは、任意にスフィンゴ脂質を含み得るが、このスフィンゴ脂質は、スピンゴシンがグリセロールの構造的対応物であり、ホスホグリセリド、または動物細胞膜の主要成分であるコレステロールの１つの脂肪酸の１つである。リポソームは、任意に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のポリマーに共有結合した脂質であるペグ化脂質を含有してもよい。ＰＥＧのサイズは、約５００～約１０，０００ダルトンの範囲であり得る。

リポソームはさらに適切な溶媒を含み得る。溶媒は有機溶媒または無機溶媒でよい。適切な溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルピロリドン、Ｎ－メチルピロリドン、アセトロニトリル、アルコール、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の治療用融合ペプチドを担持するリポソームは、例えば、米国特許番号４２４１０４６，４３９４４４８，４５２９５６１，４７５５３８８，４８２８８３７，４９２５６６１，４９５４３４５，４９５７７３５，５０４３１６４，５０６４６５５，５０７７２１１及び５２６４６１８（これらの開示はその全体が本明細書に参照により援用されている）に詳述されているような、薬物送達のためのリポソームを調製する任意の公知の方法によって調製することができる。例えば、リポソームは、水溶液中で脂質を超音波処理すること、溶媒注入、脂質水和、逆蒸発、または凍結融解を繰り返すことによる凍結乾燥によって調製することができる。好ましい実施形態では、リポソームは超音波処理によって形成される。リポソームは多層性で、タマネギのような層をもつか、単層性である。リポソームは大きくても小さくてもよい。高剪断超音波処理を続けると、より小さな単層リプソームが形成される傾向がある。

通常の技能の１つに明らかなように、リポソーム形成を支配するパラメータの全ては、変化し得る。これらのパラメータは、温度、ｐＨ、メチオニン化合物の濃度、脂質の濃度および組成、多価カチオンの濃度、混合速度、溶媒の存在および濃度を含むが、これらに限定されない。

別の実施形態では、治療用融合ペプチドをマイクロエマルションとして細胞に送達することができる。マイクロエマルションは、一般に、水溶液、界面活性剤、および「油」を含む透明な熱力学的に安定な溶液であり、「油」は、この場合、超臨界流体相である。界面活性剤は油－水界面にある。様々な界面活性剤のいずれも、本明細書に記載されているものを含む、または他の方法で当該技術分野で知られているマイクロエマルション製剤に使用するのに適している。本発明で使用するのに適した水溶液マイクロドメインは、一般的に、約５ｎｍ～約１００ｎｍの特徴的な構造寸法を有するであろう。この大きさの凝集体は可視光の散乱体に乏しく、したがってこれらの溶液は光学的に明確である。当業者によって理解されるように、マイクロエマルションは、球形、棒状、または円板状の凝集体を含む多数の異なった顕微鏡的構造を有し得る。１つの実施形態では、構造はミセルであってもよく、ミセルは一般に球形または円筒形の物体である最も単純なマイクロエマルション構造である。ミセルは水中の油滴のようなもので、逆ミセルは油中の水滴のようなものである。別の実施形態では、マイクロエマルション構造は層板である。これは界面活性剤の層によって隔てられた水と油の連続した層から成る。マイクロエマルションの「油」は、リン脂質を最適に含む。リポソームについて上述したリン脂質のいずれも、マイクロエマルションに向けられた実施形態に適している。本発明の組成物は、当技術分野で一般的に公知の任意の方法によってマイクロエマルション中にカプセル化され得る。

さらに別の実施形態では、治療的融合ペプチドは、樹状高分子、またはデンドリマーで送達され得る。一般的にデンドリマーは枝分かれした樹木のような分子で、それぞれの枝分かれは分子の連鎖で、一定の長さを経て２つの新しい枝（分子）に分かれる。この分岐は、枝（分子）が非常に密に詰まって樹冠が眼球を形成するまで続く。一般に、デンドリマーの性質はその表面の機能性基によって決まる。例えば、カルボキシル基のような親水性末端基は、典型的には水溶性デンドリマーをつくるであろう。あるいは、リン脂質は、皮膚を介した吸収を促進するためにデンドリマーの表面に組み込まれ得る。リポソーム実施形態に使用するために詳述されるリン脂質のいずれも、デンドリマー実施形態における使用に適している。一般に当該技術分野で公知の任意の方法を利用してデンドリマーを作り、本発明の組成物をその中に封入することができる。たとえば、デンドリマーは反応工程の反復配列によってつくられることがある。この反復配列のたびにさらに高次のデンドリマーが生じる。その結果、規則的で高度に分岐した３Ｄ構造をもち、ほぼ均一なサイズや形状をもつ。さらに、デンドリマーの最終的な大きさは、典型的には、合成中に使用される反復工程の回数によって制御される。様々なデンドリマーサイズが、本発明での使用に適している。一般に、デンドリマーのサイズは、約１ｎｍ～約１００ｎｍの範囲であり得る。

投与
特定の態様において、本発明の治療的融合ペプチドの治療的有効量を対象に投与することができる。投与は、末梢（すなわち、中枢神経系への投与によってではなく）または中枢神経系への局所を含む標準的な有効な技術を用いて行われる。末梢投与には、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬部、舌下、または坐剤投与が含まれるが、これらに限定されない。中枢神経系（ＣＮＳ）への直接的な投与を含む局所投与は、限定されるものではないが、腰部、脳室内または脳実質内カテーテルを介して、または外科的に埋め込まれた制御放出製剤を用いて行う。フェレーシスは、本開示の治療用融合ペプチドを送達するために使用され得る。特定の実施形態に、本発明の治療的融合ペプチドは、注入（連続または急速静注）を介して投与され得る。

有効な投与のための医薬組成物は、選択された投与様式に適切であるように意図的に設計され、適合性分散剤、緩衝剤、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などの薬学的に許容される賦形剤が適宜使用される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．，１６Ｅｄ ＩＳＢＮ：０－９１２７３４－０４－３、その援用により本明細書に組み込まれている最新版は、実施者に一般的に知られている製剤技術の概要を提供する。

静脈内または腹腔内または皮下注射による有効末梢全身送達は、生きている患者への好ましい投与法である。このような注射に適したビヒクルは簡単である。しかしながら、さらに、投与は、鼻エアロゾルまたは坐剤の手段によって粘膜を介しても効果的であり得る。このような投与様式に適した製剤はよく知られており、典型的には、膜横断移動を容易にする界面活性剤を含む。このような界面活性剤は、しばしばステロイドに由来するか、またはＮ－［１－（２，３－ジオレオイル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）などのカチオン性脂質、またはコレステロールヘミスクシネート、ホスファチジルグリセロールなどの種々の化合物である。

治療用途のために、本発明の治療用融合ペプチドの治療有効量を対象に投与する。「治療上有効量」とは、測定可能な反応（例えば、腫瘍の退縮）を生じさせるのに充分な治療組成物の量である。本発明の治療用組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、特定の対象について所望の治療反応を達成するのに効果的な量の活性化合物を投与するように変化させることができる。選択される用量レベルは、治療組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬物または治療との組合せ、腫瘍の大きさおよび寿命、感染、ならびに治療される対象の身体状態および以前の病歴を含む様々な因子に依存するであろう。実施形態によっては、最小用量を投与し、用量制限毒性がない場合に用量を漸増する。治療上有効な用量の決定および調整、ならびにそのような調整をいつ、どのように行うかの評価は、医学の当業者に知られている。

投与回数は、症状又は疾患を効果的に治療するために必要に応じて、１日１回、２回、３回以上、又は１日１回、週３回以上、又は月１回とすることができる。特定の実施形態に、投与回数は１日１回、２回又は３回とすることができる。例えば、２４時間ごと、１２時間ごと、又は８時間ごとに投与することができる。具体的な実施形態では、投与頻度は１日２回でよい。

前述の実施形態のいずれにおいても、医薬組成物は、患者体重当たり、本開示のポリペプチドを約０．１μｇ／Ｋｇ～約５０μｇ／Ｋｇの間の用量で投与することができる。さらなる例として、非限定的に、医薬組成物は、患者の体重当たり、本開示のポリペプチドを約０．１μｇ／Ｋｇ～約５０μｇ／Ｋｇ、約０．１μｇ／Ｋｇ～約２５μｇ／Ｋｇ、約０．１μｇ／Ｋｇ～約１０μｇ／Ｋｇ、約１μｇ／Ｋｇ～約５０μｇ／Ｋｇ、約１μｇ／Ｋｇ～約２５μｇ／Ｋｇ、約１μｇ／Ｋｇ～約１０μｇ／Ｋｇ、約１０μｇ／Ｋｇ～約５０μｇ／Ｋｇ、約２５μｇ／Ｋｇ～約μｇ／Ｋｇ、約０．１μｇ／Ｋｇ、約０．５μｇ／Ｋｇ、約１μｇ／Ｋｇ、約５μｇ／Ｋｇ、約１０μｇ／Ｋｇ、約１５μｇ／Ｋｇ、約２０μｇ／Ｋｇ、約２５μｇ／Ｋｇ、約３０μｇ／Ｋｇ、約３５μｇ／Ｋｇ、約４０μｇ／Ｋｇ、約４５μｇ／Ｋｇまたは約５０μｇ／Ｋｇの容量で投与することができる。

治療期間は、１回の投与で１回の治療から、生涯にわたる治療コースまでの範囲とすることができる。治療期間は、対象や治療対象となるがんによって異なる。例えば、治療期間は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、または７日間であり得る。または、治療期間は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間または６週間であり得る。あるいは、治療期間は、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、または１２か月であり得る。さらに別の実施形態では、治療期間は１年、２年、３年、４年、５年、または５年を超える場合がある。また、一定期間頻回に投与し、その後、一定期間投与する間隔をあけることができることも考えられる。例えば、治療期間は５日間であり、その後９日間は治療を行わず、その後５日間は治療を行うことができる。

疾患そのものに対する治療の投与時期及び治療期間は、症例を取り巻く状況によって決定される。診断時など、治療を直ちに開始するか、手術後に治療を開始することができる。治療は、病院や診療所そのもので、あるいは退院後や外来で診察を受けた後に開始されることもある。

以下の実施例において、Ｅ０、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３という名称は、図５Ａ－５Ｅにおいても同様に模式的に描かれ、以下に開示されるような配列を有する下表の構築物を参照する。これらの構築物は、当技術分野で周知の標準的アプローチを用いてインシリコで設計した。最終配列は、ＤＮＡ合成前のコドン最適化と、それに続くＣＨＯ細胞での発現、およびｐＨ７でのニッケルクロマトグラフィーとＰＢＳ緩衝液交換による培養培地からの精製であった。

実施例１－抗ＥＧＦＲ二重特異性融合タンパク質の結合親和性

異なる免疫標的化部分を有する４つの構築物を設計した：（Ｅ０）ウイルスＮＫＧ２Ｄリガンド、ＯＭＣＰ、（Ｅ１）抗ＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ１の単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、（Ｅ２）抗ＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ２のｓｃＦｖ、または陽性対照として、（Ｅ３）抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のｓｃＦｖ。それぞれの免疫標的ドメインを、グリシン－セリンリンカーを介して、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブのｓｃＦｖに連結した。セツキシマブは特許切れであり、一連の腫瘍モデルにおいて二重特異的な治療機能性を確立しているため、これらの概念証明研究に選択された。

図５Ａ～５Ｄは、設計され、試験されたｓｃＦｖコンストラクトを示す。具体的には、図５Ａは、配列番号１６に示すアミノ酸配列
（ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＨＨＨＨＨＨＨＨ）を含む二重特異性融合タンパク質を示す。
図５Ａの融合タンパク質は、ｃ末端にＧＧＧＧＳ（配列番号３７）を含みヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨＨＨ （配列番号３８））を含むリンカーを介して、ＣＤ３ ｓｃＦｖと結合したＥＧＦＲに対する抗体（セツキシマブ－配列番号１４）のｓｃＦｖを含み、ＣＤ３ ｓｃＦｖが配列番号１７のアミノ酸配列
（ＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ）を含む。

図５Ｂは、配列番号１８に示すアミノ酸配列
（ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＫＬＡＦＮＦＮＬＥＩＮＧＳＤＴＨＳＴＶＤＶＹＬＤＤＳＱＩＩＴＦＤＧＫＤＩＲＰＴＩＰＦＭＩＧＤＥＩＦＬＰＦＹＫＮＶＦＳＥＦＦＳＬＦＲＲＶＰＴＳＴＰＹＥＤＬＴＹＦＹＥＣＤＹＴＤＮＫＳＴＦＤＱＦＹＬＹＮＧＥＥＹＴＶＫＴＱＥＡＴＮＫＮＭＷＬＴＴＳＥＦＲＬＫＫＷＦＤＧＥＤＣＩＭＨＬＲＳＬＶＲＫＭＥＤＳＫＲＮＴＧＨＨＨＨＨＨＨＨ）を含む二重特異性融合タンパク質を示す。
図５Ｂの融合タンパク質は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３７）の３つの反復を含みｃ末端上のヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号３８））を含むリンカーを介してＯＭＣＰ（配列番号１）と結合した、ＥＧＦＲ（セツキシマブ－配列番号１４）に対する抗体のｓｃＦｖを含む。

図５Ｃは、配列番号１９に示すアミノ酸配列
（ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＧＬＧＤＧＴＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮＷＹＱＱＬＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＤＤＬＬＰＳＧＶＳＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＦＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＨＨＨＨＨＨＨＨ）を含む二重特異性融合タンパク質を示す。
図５Ｃの融合タンパク質は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３７）を含みｃ末端にヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号３８））を含むリンカーを介して、ＫＹＫ－２（配列番号１１）と結合したＥＧＦＲ（セツキシマブ－配列番号１４）に対する抗体のｓｃＦｖを含む。

図５Ｄは、配列番号２０に示すアミノ酸配列
（ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＦＧＹＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＰＶＬＴＱＰＳＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＰＣＧＧＤＤＩＥＴＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＤＤＤＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＦＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＳＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＤＮＮＤＥＷＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＬＨＨＨＨＨＨＨＨ）を含む二重特異性融合タンパク質を示す。
図５Ｄの融合タンパク質は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３７）を含みｃ末端にヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号３８））を含むリンカーを介して、ＫＹＫ－１（配列番号９）と結合した、ＥＧＦＲ（セツキシマブ－配列番号１４）に対する抗体のｓｃＦｖを含む。

すべての二重特異性抗体が標的受容体と相互作用することを確認するために、それらの相互作用を表面プラズモン共鳴を用いて測定した。ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、タンパク質：タンパク質相互作用の動態を調べた。すべての実験は流速１００μｌ／分、２５℃、ｐＨ７．４、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０の１ＸＰＢＳを含むランニング緩衝液中で行った。タンパク質のアミンカップリングのためにＧＬＣチップを１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化した。１つのチップ上で、ヒトＮＫＧ２Ｄの約１０００ＲＵを結合した。～５００ＲＵの各二重特異性抗体を第２のチップに結合した。次にエタノールアミンを用いて未反応のエステルを反応停止した。

ヒトＮＫＧ２Ｄに対する二重特異的結合性を３００～０．３８ｎＭで測定した。ヒトＮＫＧ２Ｄ結合を１０ｍＭ ＨＣｌのパルスで再生した。二重特異性抗体へのＥＧＦ－ＦｃＲ結合を９－０．１ｎＭの範囲にわたって測定した。１：１ラングミュアー結合モデルを用いて適合させた二重特異性抗体：ＮＫＧ２Ｄ曲線と、二価結合モデルを用いて適合させたＥＧＦＲ－Ｆｃ：二重特異性抗体曲線を用いて、ＰｒｏｔｅＯｎ分析ソフトを用いてデータを解析した。

得られたＮＫＧ２Ｄ結合のためのプラズモン共鳴測定は、それぞれＥ０、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３について図７Ａ－７Ｄに示され、一方、ＥＧＦＲ－Ｆｃ結合について得られたプラスモン耐性測定は、それぞれＥ０、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３について図８Ａ－８Ｄに示される。処置されたデータポイントは灰色で示され、適合されたモデルは図７Ａ～７Ｄ及び図８Ａ～８Ｄにおいてブラックで示される。

図７Ａ～７Ｄに示すように、ＮＫＧ２Ｄ標的ドメイン（Ｅ０、Ｅ１およびＥ２）を有する全ての二重特異性融合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに高親和性で結合した。予想通り、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖはＣＤ３に特異的であるため、Ｅ３はＮＫＧ２Ｄに結合しなかった。Ｅ０は、ＮＫＧ２Ｄに対するＯＭＣＰの親和性（０．２ｎＭ）と同様に、Ｋ_Dが０．１７ｎＭのＮＫＧ２Ｄに結合した(Lazear et al., Crystal Structure of the Cowpox Virus-Encoded NKG2D Ligand OMCP, J. Virol 87(2):840-850 (2013)）。Ｅ２は、Ｋ_D ３５．７ｎＭでＮＫＧ２Ｄに結合し、ＮＫＧ２Ｄ（２７ｎＭ）に対するＫＹＫ１抗体の親和性と同様であった (Kwong, Generation, affinity maturation, and characterization of a human anti-human NKG2D monoclonal antibody with dual antagonistic and agonistic activity, J. Mol. Bio. 384(5):1143-1156 (2008)。Ｅ１は以前の報告より高い親和性で結合した（ＫＤ ０．３９ｎＭ 対５．８）。物質輸送や他の交絡変数は検出されなかった。親和性は報告されているよりも高いが、Ｅ１の親和性が高いからといって、これらの実験での使用は制限されない。

図８Ａ～８Ｄに示すように、ＥＧＦＲターゲティングドメインを含む全ての二重特異性融合タンパク質は、ＥＧＦＲ－Ｆｃに高親和性で結合した。

すべての二重特異性抗体は、EGFRに特異的なセツキシマブと同一の腫瘍標的ｓｃＦｖをもっている。すべての二重特異性抗体はＥＧＦＲ－Ｆｃに結合した。Ｅ１およびＥ２は、ＫＤ０．３３および０．３８ｎＭで結合し、セツキシマブ（０．４ｎＭ）の公表されている親和性とほぼ一致する。Ｅ０とＥ３はＥＧＦＲ－Ｆｃと結合し、見かけ上の親和性が高くなると予想されたが、どちらのセンソグラムも物質輸送の証拠を示しており、これらの測定された親和性の信頼性には限界がある。物質輸送に制限がない場合、Ｅ０とＥ３の親和性はセツキシマブ、Ｅ１、Ｅ２と同様であると予想されるだろう。いずれにせよ、すべての場合において、二重特異性抗体は、それらの意図されたレセプターに対して高親和性の結合を示す。したがって、二重特異性抗体が意図した受容体ターゲティングを有することを確認する。

実施例２－抗ＥＧＦＲ二重特異性融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
非喫煙者ドナー由来のヒトＰＢＭＣ（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、凍結バイアル）を、被験薬または陰性対照の限界希釈液の存在下で、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞と共に１０：１の比率で９６ウェルプレートに平板培養した。アッセイ培地は、５０μＭのβ－メルカプトエタノールおよび５％の加熱不活性ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地であった。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、アッセイ開始前に７０～８０％コンフルエントまで標準培地（高グルコースＤＭＥＭ、１０％加熱不活性ＦＢＳ）で増殖させ、表層タンパク質発現を保存するためにＡｃｃｕｔａｓｅを用いて採取した。細胞を４８時間インキュベートした後、画像化した。すべての培地を除去し、ウェルを２００μＬのＰＢＳで３Ｘ洗浄して、１０分間暗所で振盪しながら１００μＬのＰＢＳおよび１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ）とインキュベートする前に免疫細胞を除去し、製造業者の指示に従って測定したルシフェラーゼ産生量を測定した。これは生存細胞数と直接相関する。すべての計算は、試験剤陰性対照と比較して報告される。

図９は、濃度の関数としての各処置に対する細胞生存率を示す。

図１０、１１および１３は、それぞれの群に対する１ｘ１０^-8Ｍ、１ｘ１０^-9Ｍおよび１ｘ１０^-10Ｍ処置の細胞生存率を示している。

図１２は、二重特異性融合タンパク質１ｎＭを投与した陰性対照（構造物を添加しない）および投与群の細胞の画像を示す。

図９－１１および１３によって実証されるように、Ｅ０（ＯＭＣＰ－ＥＧＦＲ）およびＥ３（ＯＫＴ３－ＥＧＦＲ）の両方は、ＰＢＭＣの存在下で細胞生存率を顕著に低下させ、このことは、ＯＭＣＰが細胞傷害性を誘導する際に抗ＣＤ３と同様にまたはわずかに効率的であることを示唆する。興味深いことに、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ１とＫＹＫ２は、ＰＢＭＣの存在下で細胞生存率に有意な影響を与えない。

図１２によって示されるように、陰性対照は、ＰＢＭＣ細胞が重層したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の広い増殖を示す。抗ＮＫＧ２Ｄ二重特異性（ＫＹＫ１－ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ（Ｅ１）およびＫＹＫ２－ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ（Ｅ２））はほとんど影響しないと思われるが、ＯＭＣＰ－ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ（Ｅ０）（ＮＫＧ２Ｄとも結合する）はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の劇的な除去および免疫細胞活性化クラスターの生成をもたらす。抗ＣＤ３二重特異性（ＯＫＴ３－ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ（Ｅ３））もＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のクリアランスをもたらしたが、免疫活性化クラスターの存在は低下した。

予想通り、構築物ＯＫＴ３－ＥＧＦＲを含む抗ＣＤ３含有構築物はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞死を誘導し、構築物濃度と逆相関した。しかし、ＮＫＧ２Ｄ結合構築物の間には格差が認められた。構築物を含むＫＹＫ１およびＫＹＫ２抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、有意な細胞死を誘導しなかったが、ＯＭＣＰ－ＥＧＦＲ構築物は、制御ＯＫＴ３－ＥＧＦＲ構築物と同様にまたはわずかに良好な細胞死を誘導した。ウェルの可視化は、細胞活性化を示す有意な免疫細胞クラスター形成を、ＯＭＣＰ－ＥＧＦＲウェルにおいて示したが、ＫＹＫ１－ＥＧＦＲまたはＫＹＫ２－ＥＧＦＲウェルにおいては示さず、細胞生存率アッセイの結果を支持した。これらのデータは、ＯＭＣＰ‐ＥＧＦＲが同じＮＫＧ２Ｄ受容体に結合するにもかかわらず、ＰＢＭＣ標的細胞死を独自に増強することを示唆する。

実施例３－抗ＥＧＦＲ二重特異性融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
新鮮なヒト非喫煙者ＰＢＭＣを、被験物質（Ｅ０、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３）または陰性対照の限界希釈液の存在下で、Ａ５４９肺がん細胞と５：１の比率で９６ウェルプレートに平板培養した。標的細胞をＰＢＭＣと一晩インキュベートする前に細胞微量バイオレット（ＣＴＶ）色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）で標識し、続いて細胞生存率についてフローサイトメトリー解析を行った。試験薬剤は二重特異性タンパク質Ｅ０、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３で、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ（Ｃｉｔｕｘｉｍａｂ由来）および免疫特異的ドメインを用い、上記のようにＯＭＣＰ （Ｅ０）、ＫＹＫ１抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖ（Ｅ１）、ＫＹＫ２抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖ（Ｅ２）、またはＯＫＴ３抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｅ３）に血清－ｇｌｙリンカーで結合した。

図１４－１６は、１ｘ１０^-8Ｍ、１ｘ１０^-10Ｍ、および１ｘ１０^-12Ｍでの細胞殺傷データを示している。

図１４－１６によって実証されるように、ＯＭＣＰ（ＮＫＧ２Ｄと結合する）およびＯＫＴ３（それぞれＣＤ３と結合する）二重特異性試験剤（Ｅ０およびＥ３）はいずれも、１ｐＭ（１０ｅ－１２Ｍ）程度の低濃度でＡ５４９細胞死を測定可能な程度に増大させる。しかし、抗ＮＫＧ２Ｄ結合構築物（ＫＹＫ１－ＥＧＦＲ（Ｅ１）およびＫＹＫ２－ＥＧＦＲ（Ｅ２））は、ＰＢＭＣ細胞単独を上回る測定可能な効果を生じない。

本明細書のデータは、ＯＭＣＰ－ＥＧＦＲ二重特異性がＡ５４９細胞のＰＢＭＣ殺傷を抗ＣＤ３ ＯＫＴ３－ＥＧＦＲ対照と同程度またはそれ以上に増強することを示唆する。しかし、ＮＫＧ２Ｄ結合ＫＹＫ１－ＥＧＦＲおよびＫＹＫ２－ＥＧＦＲ構築物は、有意な細胞殺傷を誘導しない。これらのデータは、別の試験フォーマットを用いたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞殺傷試験で認められたデータと一致しており、結果が単一の細胞株または測定技術に単離されないことを示唆している。

実施例４：単離したＮＫおよびＣＤ８⁺Ｔ細胞と抗ＥＧＦＲ二重特異性融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
標準的な磁気ビーズ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ社）を用いて、新鮮なヒト非喫煙者ＰＢＭＣをＮＫまたはＣＤ８＋Ｔ細胞分画のいずれかに精製した。ＮＫまたはＣＤ８＋Ｔ細胞を、上記のバルクＰＢＭＣアッセイの５：１のエフェクター：標的比のそれらの相対的割合を複製するように設計された濃度で平板培養した。従って、ＰＢＭＣＳの２０％を構成するＮＫ細胞を１：１のエフェクター：ターゲット比でインキュベートし、一方、ＰＢＭＣの５０％であるＣＤ８＋Ｔ細胞を２．５：１のエフェクター：ターゲット比でインキュベートした。標的Ａ５４９細胞を、二重特異性抗体の存在下または非存在下で、ＮＫまたはＣＤ８＋Ｔ細胞と一晩インキュベートする前に、細胞微量バイオレット（ＣＴＶ）（サーモフィッシャー）色素で標識し、続いて、細胞生存率についてフローサイトメトリー解析した。

１０^-10Ｍ（１００ｐＭ）の濃度でＥ０、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３を試験した。

図１７は、試験した各構築物について、ならびにＡ５４９のみおよびＡ５４９＋ＮＫ細胞対照についてのＮＫ細胞殺傷を示す。

図１８は、試験した各構築物ついて、ならびにＡ５４９のみおよびＡ５４９＋ＮＫ細胞対照についてのＴ細胞殺傷を示す。

予想通り、それぞれのＮＫＧ２Ｄ結合二重特異性（ＯＭＣＰ－ＥＧＦＲ、ＫＹＫ１－ＥＧＦＲ、およびＫＹＫ２－ＥＧＦＲ）は、活性化受容体ＮＫＧ２Ｄを利用（engage）できることから、ＮＫ細胞の抗腫瘍細胞傷害性を増強した。予想通り、Ｔ細胞レセプターＣＤ３と結合するＯＫＴ３－ＥＧＦＲコンストラクトは、ＮＫ細胞の機能には有意な影響を及ぼさないが、Ｔ細胞の細胞傷害性を増強する。

また、活性化レセプターＮＫＧ２Ｄは、ＣＤ８＋Ｔ細胞（並びにＮＫＴ細胞及びガンマデルタＴ細胞のような他の細胞集団）上に発現される（(Roulet DH, Roles of the NKG2D Immunoreceptor and its Ligands, Nature Review Immunology 3:781-790 (2003)）。多種類の細胞傷害性リンパ球に関するこの広範なベースの発現は、腫瘍殺傷能を有する多種類の細胞型にわたる細胞傷害性の広範な活性化を標的とする独特のリガンドとなる。興味深いことに、精製ＣＤ８⁺Ｔ細胞培養を用いて、ＯＭＣＰ－ＥＧＦＲ構築物はＣＤ８⁺Ｔ細胞の細胞傷害性を有意に増強し、抗ＣＤ３ ＯＫＴ３－ＥＧＦＲ制御の機能性を上回った。ＫＹＫ１‐ＥＧＦＲ（Ｅ１）またはＫＹＫ２‐ＥＧＦＲ（Ｅ２）二重特異性誘導（ｅｎｇａｇｅｒ）の使用は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞単独よりも細胞傷害性を増強しなかった。まとめると、ＯＭＣＰ含有構築物の機能増強は、１）ＯＭＣＰのＮＫＧ２Ｄへの高い親和性結合、２）受容体の内在化の欠如との組合せ（Campbell JA, Zoonotic orthopoviruses encode a high-affinity antagonist of NKG2D, J. Exp. Med. 204(6):1311-1317 (2007)を参照）、のためであると結論できる。しかし、著者らのデータは、１）抗ＮＫ２Ｄターゲティングの使用は、Ｔ細胞だけでなくＮＫ細胞の関与によるＣＤ３ターゲティングよりも標的の殺傷を改善することを可能にする；２）ＯＭＣＰの使用は、確立されたＫＹＫ１およびＫＹＫ２抗体の使用よりもＮＫＧ２Ｄ二重特異性ターゲティングを改善する、と指摘している。

実施例５：ｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカイン放出分析
抗ＣＤ３二重特異性の使用は、サイトカイン放出症候群（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ６００３１８１／＃））の副作用により複雑化している。ＣＤ３抗体の形でのＴ細胞レセプターの結合と架橋は、腫瘍、サイトカイン放出症候群、またはサイトカインストームの部位だけでなく、全身的にすべてのＴ細胞（ＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺）を活性化することができるため、予期せぬ罹病率および死亡率がもたらされている。理論的には、ＮＫＧ２ＤはＴ細胞上の一次刺激活性化受容体ではなく、共刺激受容体として作用するため、ＮＫＧ２Ｄの関与はこのような合併症のレベルを低下させるはずである。さらに、ＮＫＧ２Ｄ発現はメモリーおよびエフェクターＣＤ８⁺Ｔ細胞上で最も顕著である。したがって、その関与によってナイーブＴ細胞や抗原未経験Ｔ細胞（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１２６３５）やＣＤ４⁺Ｔ細胞が広く活性化されることはないはずである。単量体ＯＭＣＰの使用は、二価抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の使用よりも１つの利点を提供する。提案した二重特異性構築物に取り込まれたＯＭＣＰは単量体であるため、ＮＫＧ２Ｄを架橋できない。このため、ＯＭＣＰ含有二重特異性によるＮＫＧ２Ｄ活性化は、腫瘍結合時にのみ起こる。すなわち、２つ以上の腫瘍標的ドメインが腫瘍リガンドを誘導し、二重特異性のＯＭＣＰ部分とそれらに関与したＮＫＧ２Ｄ受容体を近接させる。これらの両因子を総合すると、１）腫瘍反応性ではないナイーブＴ細胞の非特異的かつ広範な活性化の欠如、２）腫瘍床外でのＴ細胞活性化の欠如、３）腫瘍に基づくリガンドが存在しない場合のＮＫＧ２Ｄ架橋の欠如、のため、安全対策が提供されるはずである。

ＥＧＦＲ標的二重特異性と様々な免疫細胞標的ドメイン：ＯＭＣＰ（Ｅ０）、ＫＹＫ１抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖ（Ｅ１）、ＫＹＫ２抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖ（Ｅ２）、またはＯＫＴ３抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｅ３）とインキュベートしたバルクＰＢＭＣによるリンパ球活性化およびサイトカイン放出サイトカイン産生を評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡ５４９腫瘍標的の存在下または非存在下で検討した。

５００，０００新鮮分離末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｆｉｃｏｌｌ増菌により新鮮血から分離）を、ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳおよび１％ｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐ抗生物質からなる培地１５０ｕｌ中の丸底９６ウェルプレートに平板培養した。いくつかの培養については、１００，０００のＡ５４９肺がん細胞をＰＢＭＣに加え、一方他のＰＢＭＣ培養は腫瘍細胞なしで放置した。次に、異なる免疫細胞標的ドメインを有するＥＧＦＲ標的二重特異性：ＯＭＣＰ（Ｅ０）、ＫＹＫ１抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖ（Ｅ１）、ＫＹＫ２抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖ（Ｅ２）、またはＯＫＴ３抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｅ３）を、１０^-6Ｍまたは１０^-8Ｍのいずれかの最終濃度で培養物（腫瘍含有および非含有）に添加した。培養２４時間後、プレートを遠心分離してペレットを濃縮し、無細胞培地を採取した。マルチプレックスサイトカイン濃度は、製造業者のプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に従い、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを用いて測定した。

図１９Ａ－１９Ｄは、ＰＭＢＣ単独またはＰＢＭＣおよび腫瘍細胞と共に種々の濃度で試験した種々の構築物についてのサイトカイン産生を示し、ＰＭＢＣ単独および腫瘍細胞を対照として用いる。

図１９Ａ－１９Ｄによって実証されるように、Ｅ３またはＯＫＴ３を含む構築物は、サイトカインストームの副作用の原因であるとして、細胞傷害性リンパ球の非特異的全体的活性化を支持する腫瘍細胞の存在下または非存在下において、血清サイトカイン放出をもたらす。一方、Ｅ０あるいはＯＭＣＰを含むコンストラクトは、腫瘍で培養した場合にのみ血清中サイトカイン放出をもたらす。このようなデータは、Ｅ０（二重特異性構築物を含むＯＭＣＰ）によるサイトカイン放出とリンパ球活性化が腫瘍の部位でのみ起こるという著者らの仮説を支持し、したがって、非特異的活性化を得ないという概念を支持し、したがって二重特異性‐サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの主な副作用を回避できる（＊＊＊＝ｐ＜．００１；＊＊ｐ＜．０１）。

実施例６－インビトロ細胞傷害性アッセイ
この実施例では、ＯＭＣＰ－腫瘍標的二重特異性治療のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験について述べる。具体的には、この実施例は、二重特異性腫瘍標的に関連するヒト標的細胞株に対する改良されたヒト細胞毒性免疫細胞反応を実証するであろう。

新鮮なヒトリンパ球をドナーから採取し、精製し、以下の比率で標的細胞とともに３回播種する：標的細胞なし、１５．６：１、３１．２５：１、６２．５：１、１２５：１、２５０：１、５００：１。４時間後、フローサイトメトリーを介して、生物標的細胞対死標的細胞比を評価する。リンパ球および標的細胞を、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、または生理食塩水対照のいずれかの濃度で、関連するタンパク質構成体と追加インキュベートする。下表に概略を示した構築物に加えて、ＯＭＣＰから構築された融合タンパク質と非標的化抗体（ＯＭＣＰ－ＮＴ）を全ての細胞株に対して試験する。

潜在的な結果には、新鮮に採取されたヒトＰＢＭＣの腫瘍による細胞毒性活性が、１つ以上のＯＭＣＰ－二重特異性構築物の存在によって増強されるという知見が含まれる。具体的には、リンパ球細胞傷害性活性が、腫瘍細胞表面上の抗体標的の発現に比例して増加することを見出すことが期待される。さらに、著者らは、ＯＭＣＰ－ＮＴが、生理食塩水対照と比較して、標的細胞に対するヒトリンパ球の機能性を増強も阻害もしないことを見出していると期待している。

使用する二重特異性構築物および細胞株は、以下のとおりである：

実施例７－ＯＭＣＰ－抗－ＰＭＥＬまたはＯＭＣＰ－抗－ＥＧＦＲで処置されたマウスにおけるメラノーマ腫瘍増殖および生残
６～９週齢のマウス３０匹のＣ５７Ｂｌ／６を用いる。マウスは、１マウス当たり１×１０個の⁶細胞を側腹部の皮下にＢ１６メラノーマを注射されるであろう。治療は５日後、腫瘍が十分に増殖し、目に見えて測定できるようになった時点で開始する。最初の腫瘍の大きさおよびマウス重量を測定し、最初の腫瘍の大きさおよびマウス重量が群間で類似するように、マウスを１０匹のマウスからなる群に無作為に割り付ける。処置群は以下の通りである：第１群－生理食塩水対照、第２群－ＯＭＣＰ－ＮＴ処置、第３群－ＯＭＣＰ－抗ＰＭＥＬ処置、第４群 ＯＭＣＰ－抗－ＥＧＦＲ。すべてのマウスに週２回、３週間投与し、計５回投与する。第１群－マウスには、陰性対照として、すべての処置について２００μＬの生理食塩水を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与する。第２群－マウスにＯＭＣＰ－ＮＴ ２００μｇを２００μＬの生理食塩水に溶解して腹腔内投与する。第３群－マウスにＯＭＣＰ－抗ＰＭＥＬ ２００μＬ生理食塩水を２００μｇ腹腔内投与する。第４群－マウスはＯＭＣＰ－抗ＥＧＦＲ ２００μｇを生理食塩水２００μＬに溶解してｉ．ｐ．（腹腔内）投与する。

全ての腫瘍は、キャリパー測定および治療中に毎日測定されるマウス重量を介して測定される。治療コース終了後、マウス重量および腫瘍は毎週２回測定する。試験期間を通じて、苦痛または治療処置による他の効果の徴候についてマウスをモニタリングする。すべてのマウスを最大腫瘍径２０ｍｍで安楽死させ、腫瘍は後の解析のために残しておく。既知の原因または未知の原因により早期に死亡したマウスはいずれも、最終的な測定を行い、できるだけ早く組織を採取する。

Ｂ１６メラノーマ細胞株は、ｇｐ１００（ＰＭＥＬ）およびＥＧＦＲの高レベルの発現のため、ここで選択した。したがって、潜在的な転帰には、ＯＭＣＰ－抗ＰＭＥＬによる処置が生理食塩水対照群よりも腫瘍増殖を有意に減弱させ、生存期間を延長させるという知見が含まれる可能性がある。さらに、残存腫瘍の免疫組織化学的検索を行い、リンパ球浸潤の有無を解析する。具体的には、ＣＤ８陽性Ｔｅｆｆ細胞とＮＫ細胞の腫瘍内浸潤を評価する。さらに、ＴＵＮＥＬアッセイ（ミリポアアポタッグペルオキシダーゼインサイチュアポトーシス検出キット、カタログ番号Ｓ７１００）を介してアポトーシスレベルを評価する。潜在的な転帰としては、ＰＤＬ１－ｍｕｔＩＬ２およびＰＤＬ２－ｍｕｔＩＬ２による処置が、生理食塩水対照マウスまたはｗｔ ＩＬ２処置マウスのいずれよりもＣＤ８＋Ｔｅｆｆ ＮＫ細胞腫瘍内浸潤を有意に増加させるという知見がある。

これらの結果は、ＯＭＣＰ‐抗ＰＭＥＬおよびＯＭＣＰ‐抗ＥＧＦＲが、未処置マウスと比較して、高標的発現を高い腫瘍に対して増強された治療利益を高いことを示唆するであろう。ＯＭＣＰを用いてＮＫおよびＣＤ８⁺Ｔ細胞の両方を腫瘍表面に特異的に関与させることにより、これらの重要な細胞集団に対する腫瘍の浸潤および細胞毒性関与が有意であることが期待される。

実施例８－二重特異性Ｆｃ構築物の試験
以下のＦｃ構築物は、ｓｃＦｖ構築物（Ｅ０、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３）について実施されるように、上述の全ての例に従って試験される。

上述の説明は、本開示の精神から逸脱することなく、変更及び組み合わせることができる本発明の実施形態を提供するものであることを理解すべきである。開示された様々な態様を組み合わせることができる範囲で、そのような組合せをここに開示する。

Claims (69)

1. 第１のドメインおよび第２のドメインを含むポリペプチドであって、第１のドメインが配列番号１、２または３に対する少なくとも８０％相同の第１のアミノ酸配列を含み、約０．０１ｎＭから約１０００ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合することが可能であり、かつ第２のドメインが腫瘍細胞上のペプチドに結合することが可能な第２のアミノ酸配列を含み、ここで、ペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである、ポリペプチド。
2. 第３のドメインをさらに含み、第３のドメインが抗体Ｆｃドメインである、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 抗体Ｆｃドメインが、ＣＤ１６への結合を妨げる変異を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
4. 第２のドメインが、抗体に由来する単鎖可変領域断片である、請求項１に記載のポリペプチド。
5. 第３のドメインをさらに含み、第３のドメインがリンカーであり、第１および第２のドメインの間に位置する、請求項１に記載のポリペプチド。
6. ポリペプチドが抗体Ｆｃドメインを含まない、請求項１に記載のポリペプチド。
7. ペプチドが、ＥＲＢB２、ＣＤ１９、ＥＰＣＡＭ、ＭＳ４Ａ１、ＦＯＬＨ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＰＭＥＬ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＫＤＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質７２）、ジシアロガングリオシドＧＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、Ｂ７Ｈ３／ＣＤ２７６、ＧＰＡ３３、ＳＳＴＲ２、ＧＰＣ３、およびＣＤＨ３０からなる群より選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
8. ペプチドがＥＧＦＲである、請求項１～６のいずれか一項記載のポリペプチド。
9. 第２のアミノ酸配列が配列番号１４を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
10. 第１のアミノ酸配列が、配列番号１、２、または３と少なくとも９０％相同である、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
11. 第１のアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群より選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
12. 腫瘍細胞が、乳がん細胞、前立腺がん細胞、メラノーマ細胞、卵巣がん細胞、胃がん細胞、神経膠芽腫細胞、神経芽腫細胞、肺がん細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、結腸がん細胞、腎細胞がん、膵臓がん細胞、および肝細胞がん細胞からなる群より選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
13. 第１のドメインおよび第２のドメインを含むポリペプチドであって、第１のドメインが、配列番号１のアミノ酸位置４８～６７および１１０～１４７と少なくとも８０％相同である第１のアミノ酸配列を含み、かつ第２のドメインが、腫瘍細胞上のペプチドに結合することができる第２のアミノ酸配列を有し、前記ペプチドは、腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されているかのいずれかである、ポリペプチド。
14. 第３のドメインをさらに含み、第３のドメインが抗体Ｆｃドメインである、請求項１３に記載のポリペプチド。
15. 抗体Ｆｃドメインが、ＣＤ１６への結合を妨げる変異を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
16. 第２のドメインが、抗体に由来する単鎖可変領域断片である、請求項１３に記載のポリペプチド。
17. 第３のドメインがリンカーであり、第１および第２のドメインの間に位置する、第３のポリペプチドをさらに含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
18. ポリペプチドが抗体Ｆｃドメインを含まない、請求項１３に記載のポリペプチド。
19. ペプチドが、ＥＲＢＢ２、ＣＤ１９、ＥＰＣＡＭ、ＭＳ４Ａ１、ＦＯＬＨ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＰＭＥＬ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＫＤＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質７２）、ジシアロガングリオシドＧＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、Ｂ７Ｈ３／ＣＤ２７６、ＧＰＡ３３、ＳＳＴＲ２、ＧＰＣ３、およびＣＤＨ３０からなる群より選択される、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
20. ペプチドがＥＧＦＲである、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
21. 第２のアミノ酸配列が配列番号１４を含む、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
22. 第１のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸位置４８～６７および１１０～１４７と少なくとも９０％相同である、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
23. 第１のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸位置４８～６７および１１０～１４７と少なくとも９５％相同である、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
24. 腫瘍細胞が、乳がん細胞、前立腺がん細胞、メラノーマ細胞、卵巣がん細胞、胃がん細胞、神経膠芽腫細胞、神経芽腫細胞、肺がん細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、結腸がん細胞、腎細胞がん、膵臓がん細胞、および肝細胞がん細胞からなる群より選択される、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
25. 第１のドメインおよび第２のドメインを含むポリペプチドであって、第１のドメインが、配列番号２のアミノ酸位置４９～６８および１１１～１４８と少なくとも８０％相同である第１のアミノ酸配列を含み、かつ第２のドメインが、腫瘍細胞上のペプチドに結合することができる第２のアミノ酸配列を有し、前記ペプチドは、腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されているかのいずれかである、ポリペプチド。
26. 第３のドメインをさらに含み、第３のドメインが抗体Ｆｃドメインである、請求項２５に記載のポリペプチド。
27. 抗体Ｆｃドメインが、ＣＤ１６への結合を妨げる変異を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
28. 第２のドメインが、抗体に由来する単鎖可変領域断片である、請求項２５に記載のポリペプチド。
29. 第３のドメインをさらに含み、第３のドメインがリンカーであり、第１および第２のドメインの間に位置する、請求項２５に記載のポリペプチド。
30. ポリペプチドが抗体Ｆｃドメインを含まない、請求項２５に記載のポリペプチド。
31. ペプチドが、ＥＲＢＢ２、ＣＤ１９、ＥＰＣＡＭ、ＭＳ４Ａ１、ＦＯＬＨ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＰＭＥＬ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＫＤＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質７２）、ジシアロガングリオシドＧＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、Ｂ７Ｈ３／ＣＤ２７６、ＧＰＡ３３、ＳＳＴＲ２、ＧＰＣ３、およびＣＤＨ３０からなる群より選択される、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
32. ペプチドがＥＧＦＲである、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
33. 第２のアミノ酸配列が配列番号１４を含む、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
34. 第１のアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸位置４９～６８および１１１～１４８と少なくとも９０％相同である、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
35. 第１のアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸位置４９～６８および１１１～１４８と少なくとも９５％相同である、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
36. 腫瘍細胞が、乳がん細胞、前立腺がん細胞、メラノーマ細胞、卵巣がん細胞、胃がん細胞、神経膠芽腫細胞、神経芽腫細胞、肺がん細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、結腸がん細胞、腎細胞がん、膵臓がん細胞、および肝細胞がん細胞からなる群より選択される、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
37. 第１のドメインおよび第２のドメインを含むポリペプチドであって、第１のドメインが、配列番号３のアミノ酸位置４８～６６および１１１～１４８に対する少なくとも８０％の相同である第１の腫瘍細胞を含み、かつ第２のドメインが腫瘍細胞上のペプチドに結合可能な第２のアミノ酸配列を有し、腫瘍細胞に特異的であるか、またはアミノ酸配列と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである、ポリペプチド。
38. 第３のドメインをさらに含み、第３のドメインが抗体Ｆｃドメインである、請求項３７に記載のポリペプチド。
39. 抗体Ｆｃドメインが、ＣＤ１６への結合を妨げる変異を含む、請求項３８に記載のポリペプチド。
40. 第２のドメインが、抗体に由来する単鎖可変領域断片である、請求項３７に記載のポリペプチド。
41. 第３のドメインをさらに含み、第３のドメインがリンカーであり、第１および第２のドメインの間に位置する、請求項３７に記載のポリペプチド。
42. ポリペプチドが抗体Ｆｃドメインを含まない、請求項３７に記載のポリペプチド。
43. ペプチドが、ＥＲＢＢ２、ＣＤ１９、ＥＰＣＡＭ、ＭＳ４Ａ１、ＦＯＬＨ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＰＭＥＬ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＫＤＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質７２）、ジシアロガングリオシドＧＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、Ｂ７Ｈ３／ＣＤ２７６、ＧＰＡ３３、ＳＳＴＲ２、ＧＰＣ３、およびＣＤＨ３０からなる群より選択される、請求項３７～４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
44. ペプチドがＥＧＦＲである、請求項３７～４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
45. 第２のアミノ酸配列が配列番号１４を含む、請求項３７～４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
46. 第１のアミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸位置４８～６６および１１１～１４８と少なくとも９０％相同である、請求項３７～４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
47. 第１のアミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸位置４８～６６および１１１～１４８と少なくとも９５％相同である、請求項３７～４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
48. 腫瘍細胞が、乳がん細胞、前立腺がん細胞、メラノーマ細胞、卵巣がん細胞、胃がん細胞、神経膠芽腫細胞、神経芽腫細胞、肺がん細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、結腸がん細胞、腎細胞がん、膵臓がん細胞、および肝細胞がん細胞からなる群より選択される、請求項３７～４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
49. 第１のアミノ酸配列がペグ化されている、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
50. 第１のアミノ酸配列がさらにＰＥＧ－１０Ｋ、ＰＥＧ－２０ＫまたはＰＥＧ－４０Ｋを含む、請求項１～６のいずれかに記載のポリペプチド。
51. 第１のアミノ酸配列がペグ化されている、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
52. 第１のアミノ酸配列がさらにＰＥＧ－１０Ｋ、ＰＥＧ－２０ＫまたはＰＥＧ－４０Ｋを含む、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
53. 第１のアミノ酸配列がペグ化されている、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
54. 第１のアミノ酸配列がさらにＰＥＧ－１０Ｋ、ＰＥＧ－２０ＫまたはＰＥＧ－４０Ｋを含む、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
55. 第１のアミノ酸配列がペグ化されている、請求項３７～４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
56. 第１のアミノ酸配列がさらにＰＥＧ－１０Ｋ、ＰＥＧ－２０ＫまたはＰＥＧ－４０Ｋを含む、請求項３７～４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
57. 腫瘍細胞上の第２のペプチドに結合することができる第３のアミノ酸配列を有する第３のドメインをさらに含み、ここで第２のペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである、請求項１～６のいずれか一項にポリペプチド。
58. 腫瘍細胞上の第２のペプチドに結合することができる第３のアミノ酸配列を有する第３のドメインをさらに含み、ここで第２のペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
59. 腫瘍細胞上の第２のペプチドに結合することができる第３のアミノ酸配列を有する第３のドメインをさらに含み、ここで第２のペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
60. 腫瘍細胞上の第２のペプチドに結合することができる第３のアミノ酸配列を有する第３のドメインをさらに含み、ここで第２のペプチドは腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と同じ組織起源の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるかのいずれかである、請求項３７～４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
61. 請求項１～６０のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
62. 対象の腫瘍を治療する方法であって、請求項６１に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む方法。
63. 医薬組成物が、患者体重当たり約０．１μｇ／Ｋｇ～約５０μｇ／Ｋｇのポリペプチドを含む、請求項６２に記載の方法。
64. 第１のドメインが配列番号１を含む、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
65. 第１のドメインが配列番号２を含む、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
66. 第１のドメインが配列番号３を含む、請求項３７～４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
67. 第１のアミノ酸配列が、約０．０１ｎＭ～約１０００ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合可能である、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
68. 第１のアミノ酸配列が、約０．０１ｎＭ～約１０００ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合可能である、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
69. 第１のアミノ酸配列が、約０．０１ｎＭ～約１０００ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合可能である、請求項３７～４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

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