JP2021523140A - Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、及び腫瘍関連抗原に結合するタンパク質 - Google Patents

Abstract

ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６、及びＰ−カドヘリンに結合する多重特異性結合タンパク質、ならびにがんの治療に有用な薬学的組成物及び治療法。本発明は、がん細胞上のＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）に結合し、かつナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、これらのタンパク質は、ヒトにおけるＮＫ細胞、ならびに齧歯類及び／またはカニクイザルなどの他の種におけるＮＫ細胞を刺激し得る。
【選択図】図４０Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月７日に出願された米国仮特許出願第６２／６６７，８４４号の利益及びそれに対する優先権を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年４月３０日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＤＦＹ−０５４ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１５２，８３８バイトのサイズである。

本発明は、Ｐ−カドヘリン（ＣＤＨ３）、ＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ１６に結合する多重特異性結合タンパク質に関する。

がんは、この疾患を治療するために文献に報告されている相当な研究努力及び科学的進歩にもかかわらず、深刻な健康問題であり続けている。最も頻繁に診断されるがんのうちのいくつかには、前立腺癌、乳癌、及び肺癌が含まれる。前立腺癌は、男性におけるがんの最も一般的な形態である。乳癌は、依然として女性における死亡の主な原因である。これらのがんの現在の治療選択肢は、全ての患者に有効ではない、及び／またはかなりの有害な副作用を有し得る。既存の治療選択肢を使用して他の種類のがんを治療することも依然として困難である。

がん免疫療法は、特異性が高く、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進し得るため、望ましい。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの融合タンパク質は、腫瘍細胞及びＴ細胞に結合して腫瘍細胞の破壊を促進する、文献に記載されているがん免疫療法である。ある特定の腫瘍関連抗原及びある特定の免疫細胞に結合する抗体が文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１及びＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫系の構成要素であり、循環リンパ球のおよそ１５％を占める。ＮＫ細胞は、実質的に全ての組織に浸潤し、元来、前感作を必要とすることなく腫瘍細胞を有効に殺傷するそれらの能力を特徴とした。活性化されたＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と同様の手段により、すなわち、パーフォリン及びグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒を介して、かつ死受容体経路を介して標的細胞を殺傷する。活性化されたＮＫ細胞は、標的組織への他の白血球の動員を促進するＩＦＮ−γ及びケモカインなどの炎症性サイトカインも分泌する。

ＮＫ細胞は、それらの表面上の様々な活性化受容体及び阻害受容体を介してシグナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇した場合、それらの活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化により阻害される。あるいは、ＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇した場合、それらは、それらの活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）、ＤＮＡＸアクセサリー分子１（ＤＮＡＭ１））により活性化される。ＮＫ細胞は、それらの表面上のＣＤ１６受容体を介していくつかの免疫グロブリンの定常領域によっても活性化される。活性化に対するＮＫ細胞の全体的な感受性は、刺激性及び阻害性シグナルの合計に依存する。

Ｐ−カドヘリン（ＣＤＨ３）は、５つの細胞外カドヘリンリピート、膜貫通領域、及び高度に保存された細胞質尾部から成るカルシウム依存性細胞間接着糖タンパク質である。これは、細胞分化、細胞形状、細胞極性、成長、及び移動に重要な、胚発生及び成体組織構造の維持に関与するいくつかの細胞恒常性プロセスを調節する。Ｐ−カドヘリンは、表皮基底層、乳房、及び前立腺、ならびに中皮、卵巣、子宮頸部、毛包、及び角膜内皮などのいくつかの成体組織に存在し、通常、Ｅ−カドヘリンと共発現される。Ｐ−カドヘリン発現のアップレギュレーションは、食道癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸部癌、頭頸部癌、及び乳癌、ならびに結腸直腸癌、子宮頸部腺癌、黒色腫、ならびに皮膚の基底細胞癌及び扁平上皮癌で報告されている。
本発明は、上記のがんの治療を改善するある特定の利点を提供する。

国際公開第２０１６／１３４３７１号 国際公開第２０１５／０９５４１２号

本発明は、がん細胞上のＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）に結合し、かつナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、これらのタンパク質は、ヒトにおけるＮＫ細胞、ならびに齧歯類及び／またはカニクイザルなどの他の種におけるＮＫ細胞を刺激し得る。本発明の様々な態様及び実施形態が以下にさらに詳細に説明される。

したがって、本発明のある特定の実施形態は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位、Ｐ−カドヘリンに結合する第２の抗原結合部位、抗体断片結晶化可能（Ｆｃ）ドメイン、ＣＤ１６に結合するのに十分なその一部、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位を組み込むタンパク質を提供する。

これらの抗原結合部位は各々、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメイン（例えば、抗体と同様に配置されているか、または一緒に融合してｓｃＦｖを形成する）を組み込み得るか、またはこれらの抗原結合部位のうちの１つ以上が、シングルドメイン抗体、例えば、ラクダ科動物抗体などのＶ_ＨＨ抗体または軟骨魚に見られる抗体等のＶ_ＮＡＲ抗体であり得る。

ある特定の実施形態では、本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合し、かつがん細胞上のＰ−カドヘリンに結合する多重特異性結合タンパク質であって、ＮＫＧ２Ｄ結合部位が、配列番号１、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５、配列番号１５８、配列番号１６２、配列番号１６６、配列番号１７０、配列番号１７４、配列番号１７８、及び配列番号９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む、多重特異性結合タンパク質を提供する。

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、例えば、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有することにより、及び／または配列番号１のＣＤＲ１配列（配列番号１０５または配列番号１４２）、ＣＤＲ２配列（配列番号１０６）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１０７または配列番号１４３）と同一のアミノ酸配列を組み込むことにより、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込み得る。配列番号１に関連する重鎖可変ドメインは、様々な軽鎖可変ドメインと結合して、ＮＫＧ２Ｄ結合部位を形成することができる。例えば、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込む第１の抗原結合部位は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、及び４０に関連する配列のうちのいずれか１つから選択される軽鎖可変ドメインをさらに組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、及び４０から選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを組み込む。

あるいは、ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号４１に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号４２に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号４１のＣＤＲ１配列（配列番号４３または配列番号１４４）、ＣＤＲ２配列（配列番号４４）、及びＣＤＲ３配列（配列番号４５または配列番号１４５）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号４２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号４２のＣＤＲ１配列（配列番号４６）、ＣＤＲ２配列（配列番号４７）、及びＣＤＲ３配列（配列番号４８）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号４９に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号５０に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号４９のＣＤＲ１配列（配列番号５１または配列番号１４６）、ＣＤＲ２配列（配列番号５２）、及びＣＤＲ３配列（配列番号５３または配列番号１４７）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号５０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号５０のＣＤＲ１配列（配列番号５４）、ＣＤＲ２配列（配列番号５５）、及びＣＤＲ３配列（配列番号５６）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

あるいは、第１の抗原結合部位は、例えば、それぞれ、配列番号５７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列及び配列番号５８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有することにより、配列番号５７に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号５８に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。

別の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号５９に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号６０に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号５９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号５９のＣＤＲ１配列（配列番号１０８）、ＣＤＲ２配列（配列番号１０９）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１１０）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号６０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号６０のＣＤＲ１配列（配列番号１１１）、ＣＤＲ２配列（配列番号１１２）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１１３）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、例えば、それぞれ、配列番号１０１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列及び配列番号１０２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有することにより、配列番号１０１に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１０２に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、例えば、それぞれ、配列番号１０３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列及び配列番号１０４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有することにより、配列番号１０３に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１０４に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。

いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号６１に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号６２に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号６１のＣＤＲ１配列（配列番号６３または配列番号１４８）、ＣＤＲ２配列（配列番号６４）、及びＣＤＲ３配列（配列番号６５または配列番号１４９）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号６２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号６２のＣＤＲ１配列（配列番号６６）、ＣＤＲ２配列（配列番号６７）、及びＣＤＲ３配列（配列番号６８）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号６９に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号７０に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号６９のＣＤＲ１配列（配列番号７１または配列番号１５０）、ＣＤＲ２配列（配列番号７２）、及びＣＤＲ３配列（配列番号７３または配列番号１５１）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号７０のＣＤＲ１配列（配列番号７４）、ＣＤＲ２配列（配列番号７５）、及びＣＤＲ３配列（配列番号７６）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号７７に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号７８に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号７７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号７７のＣＤＲ１配列（配列番号７９または配列番号１５２）、ＣＤＲ２配列（配列番号８０）、及びＣＤＲ３配列（配列番号８１または配列番号１５３）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号７８のＣＤＲ１配列（配列番号８２）、ＣＤＲ２配列（配列番号８３）、及びＣＤＲ３配列（配列番号８４）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号８５に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８５のＣＤＲ１配列（配列番号８７または配列番号１５４）、ＣＤＲ２配列（配列番号８８）、及びＣＤＲ３配列（配列番号８９または配列番号１５５）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８６のＣＤＲ１配列（配列番号９０）、ＣＤＲ２配列（配列番号９１）、及びＣＤＲ３配列（配列番号９２）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１５８に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１５８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１５８のＣＤＲ１配列（配列番号８７または配列番号１５９）、ＣＤＲ２配列（配列番号８８）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１６０または配列番号１６１）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８６のＣＤＲ１配列（配列番号９０）、ＣＤＲ２配列（配列番号９１）、及びＣＤＲ３配列（配列番号９２）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１６２に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１６２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１６２のＣＤＲ１配列（配列番号８７または配列番号１６３）、ＣＤＲ２配列（配列番号８８）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１６４または配列番号１６５）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８６のＣＤＲ１配列（配列番号９０）、ＣＤＲ２配列（配列番号９１）、及びＣＤＲ３配列（配列番号９２）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１６６に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１６６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１６６のＣＤＲ１配列（配列番号８７または配列番号１６７）、ＣＤＲ２配列（配列番号８８）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１６８または配列番号１６９）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８６のＣＤＲ１配列（配列番号９０）、ＣＤＲ２配列（配列番号９１）、及びＣＤＲ３配列（配列番号９２）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１７０に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１７０のＣＤＲ１配列（配列番号８７または配列番号１７１）、ＣＤＲ２配列（配列番号８８）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１７２または配列番号１７３）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８６のＣＤＲ１配列（配列番号９０）、ＣＤＲ２配列（配列番号９１）、及びＣＤＲ３配列（配列番号９２）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１７４に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１７４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１７４のＣＤＲ１配列（配列番号８７または配列番号１７５）、ＣＤＲ２配列（配列番号８８）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１７６または配列番号１７７）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８６のＣＤＲ１配列（配列番号９０）、ＣＤＲ２配列（配列番号９１）、及びＣＤＲ３配列（配列番号９２）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１７８に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１７８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１７８のＣＤＲ１配列（配列番号８７または配列番号１７９）、ＣＤＲ２配列（配列番号８８）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１８０または配列番号１８１）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８６のＣＤＲ１配列（配列番号９０）、ＣＤＲ２配列（配列番号９１）、及びＣＤＲ３配列（配列番号９２）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号９３に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号９４に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号９３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号９３のＣＤＲ１配列（配列番号９５または配列番号１５６）、ＣＤＲ２配列（配列番号９６）、及びＣＤＲ３配列（配列番号９７または配列番号１５７）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号９４のＣＤＲ１配列（配列番号９８）、ＣＤＲ２配列（配列番号９９）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１００）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、Ｐ−カドヘリンに結合し得、配列番号１１４に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８に関連する軽鎖可変ドメインを任意に組み込み得る。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１１４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１１４のＣＤＲ１配列（配列番号１１５）、ＣＤＲ２配列（配列番号１１６）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１１７）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１１８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１１８のＣＤＲ１配列（配列番号１１９）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２０）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１２１）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

あるいは、Ｐ−カドヘリンに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１２２に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１２６に関連する軽鎖可変ドメインを任意に組み込み得る。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１２２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１２２のＣＤＲ１配列（配列番号１２３）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２４）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１２５）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１２６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１２６のＣＤＲ１配列（配列番号１２７）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２８）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１２９）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

あるいは、Ｐ−カドヘリンに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１３０に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１３４に関連する軽鎖可変ドメインを任意に組み込み得る。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１３０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１３０のＣＤＲ１配列（配列番号１３１または配列番号１８２）、ＣＤＲ２配列（配列番号１３２または配列番号１８３）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１３３または配列番号１８４）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１３４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１３４のＣＤＲ１配列（配列番号１３５または配列番号１８５）、ＣＤＲ２配列（配列番号１３６または配列番号１８６）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１３７または配列番号１８７）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

あるいは、Ｐ−カドヘリンに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１８８に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１９２に関連する軽鎖可変ドメインを任意に組み込み得る。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１８８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１８８のＣＤＲ１配列（配列番号１８９）、ＣＤＲ２配列（配列番号１９０）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１９１）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１９２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１９２のＣＤＲ１配列（配列番号１９３）、ＣＤＲ２配列（配列番号１９４）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１９５）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

あるいは、Ｐ−カドヘリンに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１９６に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号２００に関連する軽鎖可変ドメインを任意に組み込み得る。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１９６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１９６のＣＤＲ１配列（配列番号１９７）、ＣＤＲ２配列（配列番号１９８）、及びＣＤＲ３配列（配列番号１９９）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２００と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号２００のＣＤＲ１配列（配列番号２０１）、ＣＤＲ２配列（配列番号２０２）、及びＣＤＲ３配列（配列番号２０３）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

あるいは、Ｐ−カドヘリンに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２０４に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号２０８に関連する軽鎖可変ドメインを任意に組み込み得る。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２０４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号２０４のＣＤＲ１配列（配列番号２０５）、ＣＤＲ２配列（配列番号２０６）、及びＣＤＲ３配列（配列番号２０７）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２０８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号２０８のＣＤＲ１配列（配列番号２０９）、ＣＤＲ２配列（配列番号２１０）、及びＣＤＲ３配列（配列番号２１１）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

あるいは、Ｐ−カドヘリンに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２１２に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号２１６に関連する軽鎖可変ドメインを任意に組み込み得る。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２１２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号２１２のＣＤＲ１配列（配列番号２１３）、ＣＤＲ２配列（配列番号２１４）、及びＣＤＲ３配列（配列番号２１５）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２１６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号２１６のＣＤＲ１配列（配列番号２１７）、ＣＤＲ２配列（配列番号２１８）、及びＣＤＲ３配列（配列番号２１９）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

あるいは、Ｐ−カドヘリンに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２２０に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号２２４に関連する軽鎖可変ドメインを任意に組み込み得る。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２２０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号２２０のＣＤＲ１配列（配列番号２２１）、ＣＤＲ２配列（配列番号２２２）、及びＣＤＲ３配列（配列番号２２３）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２２４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号２２４のＣＤＲ１配列（配列番号２２５）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２０）、及びＣＤＲ３配列（配列番号２２６）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

あるいは、Ｐ−カドヘリンに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２２７に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号２２９に関連する軽鎖可変ドメインを任意に組み込み得る。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２２７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号２２７のＣＤＲ１配列（配列番号２２１）、ＣＤＲ２配列（配列番号２２２）、及びＣＤＲ３配列（配列番号２２８）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２２９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号２２９のＣＤＲ１配列（配列番号２２５）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２０）、及びＣＤＲ３配列（配列番号２２６）と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。

ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、Ｐ−カドヘリンに結合し得、それぞれ、配列番号１１４及び１１８、１２２及び１２６、１３０及び１３４、１８８及び１９２、１９６及び２００、２０４及び２０８、２１２及び２１６、２２０及び２２４、及び２２７及び２２９から選択される重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む。

いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部位は、第１の抗原結合部位に存在する軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込む。

いくつかの実施形態では、本タンパク質は、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの一部を組み込み、抗体Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン及びＣＨ２ドメイン、及び／またはヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸配列２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、本タンパク質は、がんに関連する任意の抗原を含む、腫瘍関連抗原に結合する第４の抗原結合部位をさらに組み込む。第４の抗原結合部位は、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＣＤ２０、ＣＤ３３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、デルタ様標準Ｎｏｔｃｈリガンド３（ＤＬＬ３）、ガングリオシドＧＤ２（ＧＤ２）、ＣＤ１２３、アノクタミン−１（Ａｎｏ１）、メソテリン、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質２（ＴＲＯＰ２）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、クローディン−１８．２、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、糖タンパク質非転移性黒色腫タンパク質Ｂ（ＧＰＮＭＢ）、葉酸受容体−アルファ（ＦＲ−アルファ）、妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）、ＣＤ３７、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、Ｂ７ホモログ６（Ｂ７Ｈ６）、Ｃ−ケモカイン受容体４型（ＣＣＲ４）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体２（ＲＯＲ２）、ＣＤ１３３、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１）、インスリン様成長因子１−受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）／ＥＲＢＢ３、ヒト上皮成長因子受容体４（ＨＥＲ４）／ＥＲＢＢ４、ムチン１（ＭＵＣ１）、チロシンタンパク質キナーゼＭＥＴ（ｃＭＥＴ）、シグナル伝達リンパ球性活性化分子Ｆ７（ＳＬＡＭＦ７）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体２（ＴＲＡＩＬＲ２）、黒色腫関連抗原３（ＭＡＧＥ−Ａ３）、Ｂリンパ球抗原Ｂ７．１（Ｂ７．１）、Ｂリンパ球抗原Ｂ７．２（Ｂ７４．２）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、またはがん細胞上で発現されるＣＤ２５抗原に結合し得る。

本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれか１つを含む製剤、それらのタンパク質を発現する１つ以上の核酸を含む細胞、及びそれらのタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法も提供される。
本発明の別の態様は、患者におけるがんを治療する方法を提供する。この方法は、それを必要とする患者に、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質の治療有効量を投与することを含む。Ｐ−カドヘリン標的多重特異性結合タンパク質を使用して治療されるがんには、例えば、食道癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮頸部腺癌、黒色腫、ならびに皮膚の基底細胞癌及び扁平上皮癌が含まれる。

ヘテロ二量体多重特異性結合タンパク質を表す。各アームは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたはＰ−カドヘリンへの結合ドメインのいずれかを表し得る。多重特異性結合タンパク質は、ＣＤ１６に結合するＦｃドメインまたはその一部をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及びＰ−カドヘリン結合ドメインは、共通の軽鎖を共有し得る。 ヘテロ二量体多重特異性結合タンパク質を表す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたはＰ−カドヘリン結合ドメインのいずれかがｓｃＦｖ形式をとり得る（右アーム）。 ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒト組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。 ＥＬＩＳＡアッセイにおけるカニクイザル組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。 ＥＬＩＳＡアッセイにおけるマウス組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。 平均蛍光強度（ＭＦＩ）のバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）としてフローサイトメトリーにより測定された、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合を示す棒グラフである。 平均蛍光強度（ＭＦＩ）のバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）としてフローサイトメトリーにより測定された、マウスＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合を示す棒グラフである。 ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドＵＬＢＰ−６との競合結合アッセイにおける組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。 ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドＭＩＣＡとの競合結合アッセイにおける組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。 ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドＲａｅ−１デルタとの競合結合アッセイにおける組換えマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。 フローサイトメトリーにより測定され、かつＴＮＦ−α陽性細胞のパーセンテージとして定量化された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現する細胞の活性化を示す棒グラフである。 フローサイトメトリーにより測定され、かつＴＮＦ−α陽性細胞のパーセンテージとして定量化された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現する細胞の活性化を示す棒グラフである。 フローサイトメトリーにより測定され、かつＩＦＮγ^＋／ＣＤ１０７ａ^＋細胞のパーセンテージとして定量化された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。 フローサイトメトリーにより測定され、かつＩＦＮγ^＋／ＣＤ１０７ａ^＋細胞のパーセンテージとして定量化された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。 フローサイトメトリーにより測定され、かつＩＦＮγ^＋／ＣＤ１０７ａ^＋細胞のパーセンテージとして定量化された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。 フローサイトメトリーにより測定され、かつＩＦＮγ^＋／ＣＤ１０７ａ^＋細胞のパーセンテージとして定量化された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。 Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）細胞傷害性キットアッセイを使用して測定された、ＴＨＰ−１腫瘍細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の細胞傷害性効果を示す棒グラフである。 示差走査蛍光定量法により測定されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の融解温度を示す棒グラフである。 フローサイトメトリーにより測定され、かつＮＫ活性化マーカーに対する陽性細胞のパーセンテージとして定量化された、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄ結合によるＮＫ細胞の相乗的活性化を示す棒グラフである。Ａは、プレート結合抗ＣＤ１６モノクローナル抗体のみ、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のみ、または抗ＣＤ１６抗体と抗ＮＫＧ２Ｄ抗体との組み合わせでの処理の４時間後のＣＤ１０７ａ^＋細胞のパーセンテージを示す。Ｂは、プレート結合抗ＣＤ１６モノクローナル抗体のみ、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のみ、または抗ＣＤ１６抗体と抗ＮＫＧ２Ｄ抗体との組み合わせでの処理の４時間後のＩＦＮγ^＋細胞のパーセンテージを示す。Ｃは、プレート結合抗ＣＤ１６モノクローナル抗体のみ、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のみ、または抗ＣＤ１６抗体と抗ＮＫＧ２Ｄ抗体との組み合わせでの処理の４時間後のＣＤ１０７ａ^＋／ＩＦＮγ^＋細胞のパーセンテージを示す。グラフは、平均（ｎ＝２）±標準偏差を示す。データは、５体の異なる健常ドナーを使用した５つの独立した実験を代表するものである。 トリオマブ形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 ＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 直交Ｆａｂ界面（直交Ｆａｂ）形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 二機能性（２−ｉｎ−１）Ｉｇ形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 静電ステアリング（ＥＳ）形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 制御されたＦａｂ−アーム交換（ｃＦＡＥ）形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ボディ形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 ＬｕＺ−Ｙ形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙ形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 κλ−Ｂｏｄｙ形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。Ａは、κλ−Ｂｏｄｙのある形態の例示の図であり、Ｂは、別のκλ−Ｂｏｄｙの例示の図である。 ワンアーム一本鎖（ＯＡｓｃ）−Ｆａｂ形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 ＤｕｅｔＭａｂ形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 Ｆｉｔ−Ｉｇ形態の多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 Ｐ−カドヘリン発現ヒト非小細胞肺癌細胞（Ｈ１９７５、Ａ）に対する、抗Ｐ−カドヘリンモノクローナル抗体（Ｄ１５３ｗｔ ｍＡｂ）及び抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）の結合親和性を示す線グラフである。 ヒト結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６、Ｂ）に対する、抗Ｐ−カドヘリンモノクローナル抗体（Ｄ１５３ｗｔ ｍＡｂ）及び抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）の結合親和性を示す線グラフである。 ヒト舌扁平上皮癌細胞（ＣＡＬ２７、Ｃ）に対する、抗Ｐ−カドヘリンモノクローナル抗体（Ｄ１５３ｗｔ ｍＡｂ）及び抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）の結合親和性を示す線グラフである。 Ｐ−カドヘリン発現ヒト非小細胞肺癌細胞（Ｈ１９７５、Ａ）に対する、抗Ｐ−カドヘリンモノクローナル抗体（ＴＳＰ７ｗｔ ｍＡｂ）及び抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質（ＴＳＰ７ ＤＢ）の結合親和性を示す線グラフである。 ヒト結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６、Ｂ）に対する、抗Ｐ−カドヘリンモノクローナル抗体（ＴＳＰ７ｗｔ ｍＡｂ）及び抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質（ＴＳＰ７ ＤＢ）の結合親和性を示す線グラフである。 ヒト舌扁平上皮癌細胞（ＣＡＬ２７、Ｃ）に対する、抗Ｐ−カドヘリンモノクローナル抗体（ＴＳＰ７ｗｔ ｍＡｂ）及び抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質（ＴＳＰ７ ＤＢ）の結合親和性を示す線グラフである。 ヒトがん細胞に対する抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質で刺激されたＫＨＹＧ１−ＣＤ１６ＶヒトＮＫ細胞の細胞傷害性活性を示す線グラフである。Ｈ１９７５がん細胞に対するＫＨＹＧ１−ＣＤ１６Ｖ媒介細胞傷害性のＤ１５３ ＤＢ多重特異性結合タンパク質刺激を示す線グラフである。 ヒトがん細胞に対する抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質で刺激されたＫＨＹＧ１−ＣＤ１６ＶヒトＮＫ細胞の細胞傷害性活性を示す線グラフである。Ｈ１９７５がん細胞に対するＫＨＹＧ１−ＣＤ１６Ｖ媒介細胞傷害性のＴＳＰ７ ＤＢ多重特異性結合タンパク質刺激を示す線グラフである。 ヒトがん細胞に対する抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質で刺激されたＫＨＹＧ１−ＣＤ１６ＶヒトＮＫ細胞の細胞傷害性活性を示す線グラフである。ＣＡＬ２７がん細胞に対するＫＨＹＧ１−ＣＤ１６Ｖ媒介細胞傷害性のＤ１５３ ＤＢ多重特異性結合タンパク質刺激を示す線グラフである。 ヒトがん細胞に対する抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質で刺激されたＫＨＹＧ１−ＣＤ１６ＶヒトＮＫ細胞の細胞傷害性活性を示す線グラフである。ＣＡＬ２７がん細胞に対するＫＨＹＧ１−ＣＤ１６Ｖ媒介細胞傷害性のＴＳＰ７ ＤＢ多重特異性結合タンパク質刺激を示す線グラフである。 ３体の別個のドナー（ドナー４７８９７、５９１６５、及び４８８９２、それぞれ、Ａ、Ｂ、及びＣ）から単離され、かつ多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）またはモノクローナル抗体（Ｄ１５３ ｍＡｂ）で刺激された初代ヒトＮＫ細胞のＰ−カドヘリン発現Ｈ１９７５がん細胞に対する細胞傷害性活性を示す線グラフである。 ３体の別個のドナー（ドナー４７８９７、５９１６５、及び４８８９２、それぞれ、Ａ、Ｂ、及びＣ）から単離され、かつ多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）またはモノクローナル抗体（Ｄ１５３ ｍＡｂ）で刺激された初代ヒトＮＫ細胞のＰ−カドヘリン発現Ｈ１９７５がん細胞に対する細胞傷害性活性を示す線グラフである。 ３体の別個のドナー（ドナー４７８９７、５９１６５、及び４８８９２、それぞれ、Ａ、Ｂ、及びＣ）から単離され、かつ多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）またはモノクローナル抗体（Ｄ１５３ ｍＡｂ）で刺激された初代ヒトＮＫ細胞のＰ−カドヘリン発現Ｈ１９７５がん細胞に対する細胞傷害性活性を示す線グラフである。 ２体の別個のドナー（ドナー４７８９７及び４５０５４、それぞれ、Ａ及びＢ）から単離され、かつ多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）またはモノクローナル抗体（Ｄ１５３ ｍＡｂ）で刺激された初代ヒトＮＫ細胞のＰ−カドヘリン発現ＤＵ１４５細胞に対する細胞傷害性活性を示す線グラフである。 ２体の別個のドナー（ドナー４７８９７及び４５０５４、それぞれ、Ａ及びＢ）から単離され、かつ多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）またはモノクローナル抗体（Ｄ１５３ ｍＡｂ）で刺激された初代ヒトＮＫ細胞のＰ−カドヘリン発現Ｈ１６５０がん細胞に対する細胞傷害性活性を示す線グラフである。 ２体の別個のドナー（ドナー５９１６５及び４７８９７、それぞれ、Ａ及びＢ）から単離され、かつ多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）またはモノクローナル抗体（Ｄ１５３ ｍＡｂ）で刺激された初代ヒトＮＫ細胞のＰ−カドヘリン発現ＣＡＬ２７がん細胞（Ａ）及びＨＣＣ１９５４がん細胞（Ｂ）に対する細胞傷害性活性を示す線グラフである。 多重特異性結合タンパク質（ＴＳＰ７ ＤＢ）またはモノクローナル抗体（ＴＳＰ７ ｍＡｂ）で刺激されたドナーから単離された初代ヒトＮＫ細胞のＰ−カドヘリン発現Ｈ１９７５がん細胞（Ａ）に対する細胞傷害性活性を示す線グラフである。 多重特異性結合タンパク質（ＴＳＰ７ ＤＢ）またはモノクローナル抗体（ＴＳＰ７ ｍＡｂ）で刺激されたドナーから単離された初代ヒトＮＫ細胞のＰ−カドヘリン発現Ｈ１６５０がん細胞（Ｂ）に対する細胞傷害性活性を示す線グラフである。 多重特異性結合タンパク質（ＴＳＰ７ ＤＢ）またはモノクローナル抗体（ＴＳＰ７ ｍＡｂ）で刺激されたドナーから単離された初代ヒトＮＫ細胞のＰ−カドヘリン発現ＨＣＣ１９５４がん細胞（Ｃ）に対する細胞傷害性活性を示す線グラフである。

本発明は、がん細胞上のＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）に結合し、かつナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、腫瘍関連抗原に結合する追加の抗原結合部位をさらに含む。

本発明は、がんの治療などの目的のために、かかる多重特異性結合タンパク質を含む薬学的組成物、ならびにかかる多重特異性結合タンパク質及び薬学的組成物を使用する治療法を提供する。本発明の様々な態様をいくつかの区分に分けて以下に記載するが、１つの特定の区分に記載される本発明の態様は、任意の特定の区分に限定されるものではない。

本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語及び語句が以下に定義される。

本明細書で使用される「ａ」及び「ａｎ」という用語は、文脈が不適切でない限り、「１つ以上」を意味し、複数形を含む。

本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部分を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）及び軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐した伸長部は、「超可変領域」と称され、これらは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として既知のより保存された隣接伸長部間に挟まれている。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンにおける超可変領域間及びそれらに隣接して天然に見られるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間で互いに対して配置されて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。ラクダ及び軟骨魚などのある特定の動物では、抗原結合部位は、「シングルドメイン抗体」を提供する単一抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、単一ポリペプチドにおいて重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに連結するためのペプチドリンカーを使用して、インタクト抗体に、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合断片に、またはｓｃＦｖなどの組換えポリペプチドに存在し得る。

本明細書で使用される「腫瘍関連抗原」という用語は、がんに関連するタンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、または脂質を含むが、これらに限定されない任意の抗原を意味する。かかる抗原は、腫瘍関連血管、細胞外マトリックス、間葉間質、または免疫浸潤物などの悪性細胞上でまたは腫瘍微小環境において発現され得る。

本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書に記載の方法及び組成物によって治療される生物を指す。かかる生物には、好ましくは、哺乳動物（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれるが、これらに限定されず、より好ましくは、ヒトが含まれる。

本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１回以上の投与、適用、または投薬量で投与され得、特定の製剤または投与経路に限定されるようには意図されていない。本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、例えば、状態、疾患、障害などを緩和、軽減、調節、改善、もしくは除去する、それらの改善をもたらす、またはその症状を改善する任意の効果を含む。

本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、組成物をインビボまたはエクスビボでの診断的または治療的使用に特に好適なものにする、活性剤と不活性または活性担体との組み合わせを指す。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水エマルションまたは水／油エマルションなど）、及び様々な種類の湿潤剤等の標準の薬学的担体のうちのいずれかを指す。これらの組成物は、安定剤及び防腐剤も含み得る。担体、安定剤、及びアジュバントの例については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９７５）を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象に投与すると、本発明の化合物またはその活性代謝物もしくは残留物を提供することができる、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者に知られているように、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機酸及び塩基に由来し得る。例示の酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の化合物及びそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製において、シュウ酸などの他の酸（それら自体は薬学的に許容されない）が用いられ得る。

例示の塩基には、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、及び式ＮＷ_４ ^＋の化合物（式中、ＷはＣ_１−４アルキルである）などが含まれるが、これらに限定されない。

例示の塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、半硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが含まれるが、これらに限定されない。塩の他の例には、Ｎａ^＋、ＮＨ_４ ^＋、及びＮＷ_４ ^＋（式中、ＷはＣ_１−４アルキル基である）などの好適なカチオンと化合された本発明の化合物のアニオンが含まれる。

治療的使用のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されるものとして企図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸及び塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において使用され得る。

本明細書全体を通して、組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）といわれる場合、またはプロセス及び方法が特定の工程を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）といわれる場合、加えて、列挙された成分から本質的になる、またはそれらからなる本発明の組成物が存在すること、及び列挙された処理工程から本質的になる、またはそれらからなる本発明によるプロセス及び方法が存在することが企図される。

一般事項として、パーセンテージを特定する組成物は、別途特定されない限り、重量による。さらに、変数が定義を伴わない場合、その変数の以前の定義が優先される。

Ｉ．タンパク質
本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合し、かつがん細胞上のＰ−カドヘリンに結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書に記載の薬学的組成物及び治療法に有用である。ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体への多重特異性結合タンパク質の結合により、Ｐ−カドヘリン抗原を発現する腫瘍細胞の破壊に対するナチュラルキラー細胞の活性が増強される。Ｐ−カドヘリン発現細胞への多重特異性結合タンパク質の結合は、がん細胞をナチュラルキラー細胞に近接させ、これにより、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接及び間接的な破壊が促進される。いくつかの例示の多重特異性結合タンパク質のさらなる説明が以下に提供される。

多重特異性結合タンパク質の第１の成分は、ＮＫ細胞、γδＴ細胞、及びＣＤ８^＋αβ Ｔ細胞を含み得るが、これらに限定されない、ＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合する。ＮＫＧ２Ｄ結合時に、多重特異性結合タンパク質は、ＵＬＢＰ６及びＭＩＣＡなどの天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合してＮＫＧ２Ｄ受容体を活性化することを阻止し得る。

ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質の第２の成分は、Ｐ−カドヘリン発現細胞に結合する。Ｐ−カドヘリン発現細胞は、例えば、食道癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮頸部腺癌、黒色腫、ならびに皮膚の基底細胞癌及び扁平上皮細胞癌に見られ得るが、これらに限定されない。

多重特異性結合タンパク質の第３の成分は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞、及び濾胞樹状細胞を含む白血球の表面上のＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する。

本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、様々な形式をとり得る。例えば、ヘテロ二量体多重特異性タンパク質の１つの形式は、第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖、及び第２の免疫グロブリン軽鎖を含む（図１）。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第１の重鎖可変ドメイン、及び任意に第１のＣＨ１重鎖ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の軽鎖可変ドメイン及び第１の軽鎖定常ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と一緒になって、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第２の重鎖可変ドメイン、及び任意に第２のＣＨ１重鎖ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖定常ドメインを含む。ある特定の実施形態では、第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン重鎖と一緒になって、Ｐ−カドヘリンに結合する抗原結合部位を形成する。第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインは一緒に、ＣＤ１６に結合することができる（図１）。いくつかの実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン軽鎖と同一である。

別の例示の形式は、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖、及び免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体多重特異性抗体を含む（図２）。第１の免疫グロブリン重鎖は、対になってＮＫＧ２ＤまたはＰ−カドヘリンに結合する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから成る一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）にリンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して融合した第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第２の重鎖可変ドメイン、及び任意にＣＨ１重鎖ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖と対になり、ＮＫＧ２ＤまたはＰ−カドヘリンに結合する。第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインは一緒に、ＣＤ１６に結合することができる（図２）。

１つ以上の追加の結合モチーフが、任意にリンカー配列を介して、定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合し得る。ある特定の実施形態では、抗原結合部位は、一本鎖またはジスルフィド安定化可変領域（ｓｃＦｖ）であり得るか、または四価もしくは二価分子を形成し得る。

ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＩｇＧ様形状を維持する三官能性二重特異性抗体であるトリオマブ形態（例えば、図２０に表される多重特異性結合タンパク質）である。このキメラ二重特異性抗体は、２つの親抗体に由来する２つの半抗体（各々１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する）から成る。トリオマブ形態は、ラット抗体半分及びマウス抗体半分から成るヘテロ二量体であり得る。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）技術を組み込むＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態（例えば、図２１に表される多重特異性結合タンパク質）である。ＫｉＨ共通ＬＣ形態は、第１の標的に結合するＦａｂ、第２の標的に結合するＦａｂ、及びヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃドメインを含むヘテロ二量体である。これらの２つのＦａｂは各々、重鎖及び軽鎖を含み、各Ｆａｂの重鎖は互いに異なり、各それぞれの重鎖と対をなす軽鎖は、両方のＦａｂに共通である。

ＫｉＨ技術は、ＣＨ３ドメインを操作して各重鎖に「ノブ」または「ホール」のいずれかを作製して、ヘテロ二量体化を促進することを含む。１つのＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）への「ノブ」の導入は、小さい残基の大きい残基での置換（例えば、ＥＵ番号付けにおけるＴ３６６Ｗ_ＣＨ３Ａ）を含む。「ノブ」を収容するために、相補的な「ホール」表面がノブに最も近い隣接残基をより小さい残基で置き換える（例えば、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ_ＣＨ３Ｂ）ことによって他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）に導入される。「ホール」変異は、構造誘導ファージライブラリスクリーニングによって最適化された（Ａｔｗｅｌｌ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．；２７０（１）：２６−３５．）。ＫｉＨ ＦｃバリアントのＸ線結晶構造（Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．；４２６（９）：１９４７−５７．、Ｍｉｍｏｔｏ Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；５８（１）：１３２−８．）は、ＣＨ３ドメイン間のコア界面における立体相補性によって推進される疎水性相互作用によりヘテロ二量体化が熱力学的に好まれる一方で、ノブ−ノブ界面及びホール−ホール界面は、それぞれ、優位な相互作用の立体障害及び立体崩壊のため、ホモ二量体化を好まないことを実証した。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインと、柔軟性な天然に存在するリンカーとを含む四価ＩｇＧ様分子である、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態（例えば、図２２）である。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）形態は、抗原１を標的とするＦａｂ可変ドメインのＮ末端に融合した抗原２を標的とする可変ドメインを含むホモ二量体である。図２２に示される代表的な多重特異性結合タンパク質は、修飾されていないＦｃを含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、直交Ｆａｂ界面（直交Ｆａｂ）形態（例えば、図２３に表される多重特異性結合タンパク質）である。直交Ｆａｂ ＩｇＧアプローチ（Ｌｅｗｉｓ Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；３２（２）：１９１−８．）では、構造に基づく領域設計は、他方のＦａｂに変化を加えることなく、一方のＦａｂのみにＬＣ及びＨＣ_{ＶＨ−ＣＨ１}界面で相補的変異を導入する。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、二機能性Ｉｇ形態（例えば、図２４に表される多重特異性結合タンパク質）である。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂと、Ｆｃドメインとを含むヘテロダイマーである、静電ステアリング（ＥＳ）形態（例えば、図２５に表される多重特異性結合タンパク質）である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃドメインにおける静電的ステアリング変異によって確実にされる。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、制御されたＦａｂ−アーム交換（ｃＦＡＥ）形態（例えば、図２６に表される多重特異性結合タンパク質）である。ｃＦＡＥ形態は、標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂを含む二重特異性ヘテロ二量体であり、ＬＣ−ＨＣ対（半分子）が別の分子由来のＬＣ−ＨＣ対と交換されている。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける変異によって確実にされる。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ボディ形態（例えば、図２７に表される多重特異性結合タンパク質）である。ＳＥＥＤプラットフォームは、天然抗体の治療的用途を拡大するために非対称二重特異性抗体様分子を生成するように設計された。このタンパク質操作プラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメイン内の免疫グロブリンクラスの構造的に関連する配列を交換すること（例えば、ＩｇＡ ＣＨ３ドメイン配列のセグメントとＩｇＧ ＣＨ３ドメイン配列のセグメントを交互に繰り返すこと）に基づく。ＳＥＥＤ設計は、ヘテロ二量体の効率的な生成を可能にする一方で、ＳＥＥＤ ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を好まない。（Ｍｕｄａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．；２４（５）：４４７−５４．）。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＬｕＺ−Ｙ形態（例えば、図２８に表される多重特異性結合タンパク質）である。ＬｕＺ−Ｙ形態は、Ｆｃドメインに融合している、標的１及び標的２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含むヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃドメインのＣ末端に融合したロイシンジッパーモチーフの導入により確実にされる（Ｗｒａｎｉｋ，ＢＪ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２８７：４３３３１−９）。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙ形態（例えば、図２９に表される多重特異性結合タンパク質）である。二重特異性ＣｏｖＸ−Ｂｏｄｙは、各Ｆａｂアームに共有結合したファーマコフォアペプチドヘテロ二量体を有する足場抗体を含み、ペプチドヘテロ二量体の一方の分子が第１の標的に結合し、ペプチドヘテロ二量体の他方の分子が第２の標的に結合し、これらの２つの分子がアゼチジノンリンカーによって連結されている。ファーマコフォアが機能的活性に関与している一方で、抗体足場は長い半減期及びＩｇ様分布を付与する。ファーマコフォアは、化学的に最適化され得るか、または他のファーマコフォアで置き換えられて、最適化されたまたは特有の二重特異性抗体を生成し得る。（Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ Ｖ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＮＡＳ；１０７（５２）；２２６１１−２２６１６．）。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃドメインに融合した２つの異なるＦａｂを含むヘテロ二量体である、γ−Ｂｏｄｙ形態（例えば、図３０に表される多重特異性結合タンパク質）である。標的１に結合する第１のＦａｂはカッパＬＣを含み、標的２に結合する第２のＦａｂはラムダＬＣを含む。図３０Ａは、κλ−Ｂｏｄｙの１つの形態の例示の図であり、図３０Ｂは、別のκλ−Ｂｏｄｙの例示の図である。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ワンアーム一本鎖（ＯＡｓｃ）−Ｆａｂ形態（例えば、図３１に表される多重特異性結合タンパク質）である。Ｆｃドメインに融合している、標的１に結合するＦａｂ及び標的２に結合するｓｃＦａｂを含むＯＡｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃドメインにおける変異によって確実にされる。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＤｕｅｔＭａｂ形態（例えば、図３２に表される多重特異性結合タンパク質）である。ＤｕｅｔＭａｂ形態は、標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃドメインを含むヘテロ二量体である。これらの２つの異なるＦａｂは、正しいＬＣとＨＣとの対合を確実にする異なるＳ−Ｓ架橋を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態（例えば、図３３に表される多重特異性結合タンパク質）である。ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態は、標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃドメインを含むヘテロ二量体である。ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインならびにＶＨドメイン及びＶＬドメインは切り替えられ、例えば、ＣＨ１はＶＬとインラインで融合している一方で、ＣＬはＶＨとインラインで融合している。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｉｔ−Ｉｇ形態（例えば、図３４に表される多重特異性結合タンパク質）である。Ｆｉｔ−Ｉｇ形態は、標的１に結合するＦａｂのＨＣのＮ末端に融合した標的２に結合するＦａｂを含むホモ二量体である。図３４の代表的な多重特異性結合タンパク質は、修飾されていないＦｃドメインを含む。

表１は、組み合わせてＮＫＧ２Ｄに結合し得る重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列記する。別途指示されない限り、表１に提供されるＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔに基づいて決定されている。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに対するそれらの結合親和性が異なり得るが、それにもかかわらず、それらは全てヒトＮＫＧ２Ｄ及びＮＫ細胞を活性化する。

あるいは、配列番号１０１によって表される重鎖可変ドメインは、ＵＳ９，２７３，１３６に例証されるように、配列番号１０２によって表される軽鎖可変ドメインと対合されて、ＮＫＧ２Ｄに結合し得る抗原結合部位を形成し得る。
配列番号１０１
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＧＬＧＤＧＴＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号１０２
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮＷＹＱＱＬＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＤＤＬＬＰＳＧＶＳＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＦＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ

あるいは、配列番号１０３によって表される重鎖可変ドメインは、ＵＳ７，８７９，９８５に例証されるように、配列番号１０４によって表される軽鎖可変ドメインと対合されて、ＮＫＧ２Ｄに結合し得る抗原結合部位を形成し得る。
配列番号１０３
ＱＶＨＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＤＤＳＩＳＳＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＳＹＳＧＳＡＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＮＷＤＤＡＦＮＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号１０４
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ

一態様では、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびに抗原Ｐ−カドヘリン（ＣＤＨ３）に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。表２は、組み合わせてＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）に結合し得る重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのいくつかの例示の配列を列記する。以下の表２に列記され、かつ対応する特許及び刊行物に記載されている重鎖及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列のＣＤＲ配列は、参照により本明細書に組み込まれる。別途指示されない限り、表２に提供されるＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔに基づいて決定されている。

あるいは、Ｐ−カドヘリンに結合することができる新規の抗原結合部位は、配列番号１３８（ＣＤＨ３アイソフォーム１前駆体）、配列番号１３９（ＣＤＨ３アイソフォーム２前駆体）、または配列番号１４０（ＣＤＨ３アイソフォーム３前駆体）によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定され得る。
配列番号１３８
ＭＧＬＰＲＧＰＬＡＳＬＬＬＬＱＶＣＷＬＱＣＡＡＳＥＰＣＲＡＶＦＲＥＡＥＶＴＬＥＡＧＧＡＥＱＥＰＧＱＡＬＧＫＶＦＭＧＣＰＧＱＥＰＡＬＦＳＴＤＮＤＤＦＴＶＲＮＧＥＴＶＱＥＲＲＳＬＫＥＲＮＰＬＫＩＦＰＳＫＲＩＬＲＲＨＫＲＤＷＶＶＡＰＩＳＶＰＥＮＧＫＧＰＦＰＱＲＬＮＱＬＫＳＮＫＤＲＤＴＫＩＦＹＳＩＴＧＰＧＡＤＳＰＰＥＧＶＦＡＶＥＫＥＴＧＷＬＬＬＮＫＰＬＤＲＥＥＩＡＫＹＥＬＦＧＨＡＶＳＥＮＧＡＳＶＥＤＰＭＮＩＳＩＩＶＴＤＱＮＤＨＫＰＫＦＴＱＤＴＦＲＧＳＶＬＥＧＶＬＰＧＴＳＶＭＱＶＴＡＴＤＥＤＤＡＩＹＴＹＮＧＶＶＡＹＳＩＨＳＱＥＰＫＤＰＨＤＬＭＦＴＩＨＲＳＴＧＴＩＳＶＩＳＳＧＬＤＲＥＫＶＰＥＹＴＬＴＩＱＡＴＤＭＤＧＤＧＳＴＴＴＡＶＡＶＶＥＩＬＤＡＮＤＮＡＰＭＦＤＰＱＫＹＥＡＨＶＰＥＮＡＶＧＨＥＶＱＲＬＴＶＴＤＬＤＡＰＮＳＰＡＷＲＡＴＹＬＩＭＧＧＤＤＧＤＨＦＴＩＴＴＨＰＥＳＮＱＧＩＬＴＴＲＫＧＬＤＦＥＡＫＮＱＨＴＬＹＶＥＶＴＮＥＡＰＦＶＬＫＬＰＴＳＴＡＴＩＶＶＨＶＥＤＶＮＥＡＰＶＦＶＰＰＳＫＶＶＥＶＱＥＧＩＰＴＧＥＰＶＣＶＹＴＡＥＤＰＤＫＥＮＱＫＩＳＹＲＩＬＲＤＰＡＧＷＬＡＭＤＰＤＳＧＱＶＴＡＶＧＴＬＤＲＥＤＥＱＦＶＲＮＮＩＹＥＶＭＶＬＡＭＤＮＧＳＰＰＴＴＧＴＧＴＬＬＬＴＬＩＤＶＮＤＨＧＰＶＰＥＰＲＱＩＴＩＣＮＱＳＰＶＲＱＶＬＮＩＴＤＫＤＬＳＰＨＴＳＰＦＱＡＱＬＴＤＤＳＤＩＹＷＴＡＥＶＮＥＥＧＤＴＶＶＬＳＬＫＫＦＬＫＱＤＴＹＤＶＨＬＳＬＳＤＨＧＮＫＥＱＬＴＶＩＲＡＴＶＣＤＣＨＧＨＶＥＴＣＰＧＰＷＫＧＧＦＩＬＰＶＬＧＡＶＬＡＬＬＦＬＬＬＶＬＬＬＬＶＲＫＫＲＫＩＫＥＰＬＬＬＰＥＤＤＴＲＤＮＶＦＹＹＧＥＥＧＧＧＥＥＤＱＤＹＤＩＴＱＬＨＲＧＬＥＡＲＰＥＶＶＬＲＮＤＶＡＰＴＩＩＰＴＰＭＹＲＰＲＰＡＮＰＤＥＩＧＮＦＩＩＥＮＬＫＡＡＮＴＤＰＴＡＰＰＹＤＴＬＬＶＦＤＹＥＧＳＧＳＤＡＡＳＬＳＳＬＴＳＳＡＳＤＱＤＱＤＹＤＹＬＮＥＷＧＳＲＦＫＫＬＡＤＭＹＧＧＧＥＤＤ
配列番号１３９
ＭＧＬＰＲＧＰＬＡＳＬＬＬＬＱＶＣＷＬＱＣＡＡＳＥＰＣＲＡＶＦＲＥＡＥＶＴＬＥＡＧＧＡＥＱＥＰＧＱＡＬＧＫＶＦＭＧＣＰＧＱＥＰＡＬＦＳＴＤＮＤＤＦＴＶＲＮＧＥＴＶＱＥＲＲＳＬＫＥＲＮＰＬＫＩＦＰＳＫＲＩＬＲＲＨＫＲＤＷＶＶＡＰＩＳＶＰＥＮＧＫＧＰＦＰＱＲＬＮＱＬＫＳＮＫＤＲＤＴＫＩＦＹＳＩＴＧＰＧＡＤＳＰＰＥＧＶＦＡＶＥＫＥＴＧＷＬＬＬＮＫＰＬＤＲＥＥＩＡＫＹＥＬＦＧＨＡＶＳＥＮＧＡＳＶＥＤＰＭＮＩＳＩＩＶＴＤＱＮＤＨＫＰＫＦＴＱＤＴＦＲＧＳＶＬＥＧＶＬＰＧＴＳＶＭＱＶＴＡＴＤＥＤＤＡＩＹＴＹＮＧＶＶＡＹＳＩＨＳＱＥＰＫＤＰＨＤＬＭＦＴＩＨＲＳＴＧＴＩＳＶＩＳＳＧＬＤＲＥＫＶＰＥＹＴＬＴＩＱＡＴＤＭＤＧＤＧＳＴＴＴＡＶＡＶＶＥＩＬＤＡＮＤＮＡＰＭＦＤＰＱＫＹＥＡＨＶＰＥＮＡＶＧＨＥＶＱＲＬＴＶＴＤＬＤＡＰＮＳＰＡＷＲＡＴＹＬＩＭＧＧＤＤＧＤＨＦＴＩＴＴＨＰＥＳＮＱＧＩＬＴＴＲＫＧＬＤＦＥＡＫＮＱＨＴＬＹＶＥＶＴＮＥＡＰＦＶＬＫＬＰＴＳＴＡＴＩＶＶＨＶＥＤＶＮＥＡＰＶＦＶＰＰＳＫＶＶＥＶＱＥＧＩＰＴＧＥＰＶＣＶＹＴＡＥＤＰＤＫＥＮＱＫＩＳＹＲＩＬＲＤＰＡＧＷＬＡＭＤＰＤＳＧＱＶＴＡＶＧＴＬＤＲＥＤＥＱＦＶＲＮＮＩＹＥＶＭＶＬＡＭＤＮＧＳＰＰＴＴＧＴＧＴＬＬＬＴＬＩＤＶＮＤＨＧＰＶＰＥＰＲＱＩＴＩＣＮＱＳＰＶＲＱＶＬＮＩＴＤＫＤＬＳＰＨＴＳＰＦＱＡＱＬＴＤＤＳＤＩＹＷＴＡＥＶＮＥＥＧＤＴＶＶＬＳＬＫＫＦＬＫＱＤＴＹＤＶＨＬＳＬＳＤＨＧＮＫＥＱＬＴＶＩＲＡＴＶＣＤＣＨＧＨＶＥＴＣＰＧＰＷＫＧＧＦＩＬＰＶＬＧＡＶＬＡＬＬＦＬＬＬＶＬＬＬＬＶＲＫＫＲＫＩＫＥＰＬＬＬＰＥＤＤＴＲＤＮＶＦＹＹＧＥＥＧＧＧＥＥＤＱＤＹＤＩＴＱＬＨＲＧＬＥＡＲＰＥＶＶＬＲＮＤＶＡＰＴＩＩＰＴＰＭＹＲＰＲＰＡＮＰＤＥＩＧＮＦＩＩＥＧＲＧＥＲＧＳＱＲＧＮＧＧＬＱＬＡＲＧＲＴＲＲＳ
配列番号１４０
ＭＧＣＰＧＱＥＰＡＬＦＳＴＤＮＤＤＦＴＶＲＮＧＥＴＶＱＥＲＲＳＬＫＥＲＮＰＬＫＩＦＰＳＫＲＩＬＲＲＨＫＲＤＷＶＶＡＰＩＳＶＰＥＮＧＫＧＰＦＰＱＲＬＮＱＬＫＳＮＫＤＲＤＴＫＩＦＹＳＩＴＧＰＧＡＤＳＰＰＥＧＶＦＡＶＥＫＥＴＧＷＬＬＬＮＫＰＬＤＲＥＥＩＡＫＹＥＬＦＧＨＡＶＳＥＮＧＡＳＶＥＤＰＭＮＩＳＩＩＶＴＤＱＮＤＨＫＰＫＦＴＱＤＴＦＲＧＳＶＬＥＧＶＬＰＧＴＳＶＭＱＶＴＡＴＤＥＤＤＡＩＹＴＹＮＧＶＶＡＹＳＩＨＳＱＥＰＫＤＰＨＤＬＭＦＴＩＨＲＳＴＧＴＩＳＶＩＳＳＧＬＤＲＥＫＶＰＥＹＴＬＴＩＱＡＴＤＭＤＧＤＧＳＴＴＴＡＶＡＶＶＥＩＬＤＡＮＤＮＡＰＭＦＤＰＱＫＹＥＡＨＶＰＥＮＡＶＧＨＥＶＱＲＬＴＶＴＤＬＤＡＰＮＳＰＡＷＲＡＴＹＬＩＭＧＧＤＤＧＤＨＦＴＩＴＴＨＰＥＳＮＱＧＩＬＴＴＲＫＧＬＤＦＥＡＫＮＱＨＴＬＹＶＥＶＴＮＥＡＰＦＶＬＫＬＰＴＳＴＡＴＩＶＶＨＶＥＤＶＮＥＡＰＶＦＶＰＰＳＫＶＶＥＶＱＥＧＩＰＴＧＥＰＶＣＶＹＴＡＥＤＰＤＫＥＮＱＫＩＳＹＲＩＬＲＤＰＡＧＷＬＡＭＤＰＤＳＧＱＶＴＡＶＧＴＬＤＲＥＤＥＱＦＶＲＮＮＩＹＥＶＭＶＬＡＭＤＮＧＳＰＰＴＴＧＴＧＴＬＬＬＴＬＩＤＶＮＤＨＧＰＶＰＥＰＲＱＩＴＩＣＮＱＳＰＶＲＱＶＬＮＩＴＤＫＤＬＳＰＨＴＳＰＦＱＡＱＬＴＤＤＳＤＩＹＷＴＡＥＶＮＥＥＧＤＴＶＶＬＳＬＫＫＦＬＫＱＤＴＹＤＶＨＬＳＬＳＤＨＧＮＫＥＱＬＴＶＩＲＡＴＶＣＤＣＨＧＨＶＥＴＣＰＧＰＷＫＧＧＦＩＬＰＶＬＧＡＶＬＡＬＬＦＬＬＬＶＬＬＬＬＶＲＫＫＲＫＩＫＥＰＬＬＬＰＥＤＤＴＲＤＮＶＦＹＹＧＥＥＧＧＧＥＥＤＱＤＹＤＩＴＱＬＨＲＧＬＥＡＲＰＥＶＶＬＲＮＤＶＡＰＴＩＩＰＴＰＭＹＲＰＲＰＡＮＰＤＥＩＧＮＦＩＩＥＮＬＫＡＡＮＴＤＰＴＡＰＰＹＤＴＬＬＶＦＤＹＥＧＳＧＳＤＡＡＳＬＳＳＬＴＳＳＡＳＤＱＤＱＤＹＤＹＬＮＥＷＧＳＲＦＫＫＬＡＤＭＹＧＧＧＥＤＤ

Ｆｃドメイン内では、ＣＤ１６結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用は、主に、ＣＨ２ドメイン内のアミノ酸残基Ａｓｐ２６５〜Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７〜Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７〜Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９、及び炭水化物残基Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに焦点を合わせられている（例えば、Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ；４０６（６７９３）：２６７−２７３．を参照のこと）。既知のドメインに基づいて、変異は、ファージディスプレイライブラリまたは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリなどを使用することによって、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強または低減するように選択され得るか、または相互作用の既知の三次元構造に基づいて設計され得る。

ヘテロ二量体抗体重鎖のアセンブリは、同じ細胞で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることによって達成され得、これは、ヘテロ二量体のアセンブリのみならず、各抗体重鎖のホモ二量体のアセンブリももたらし得る。ヘテロ二量体の優先的アセンブリの促進は、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０、ＵＳ１４／８３０３３６に示されるように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメインに異なる変異を組み込むことによって達成され得る。例えば、変異は、ヒトＩｇＧ１に基づいて、かつ第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド内にアミノ酸置換の別個の対を組み込む（これらの２つの鎖が互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にする）ことによって、ＣＨ３ドメインに加えられ得る。以下に例証されるアミノ酸置換の位置はすべて、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って番号付けされている。

１つのシナリオでは、第１のポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）から選択されるより大きいアミノ酸で置き換え、第２のポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、元のアミノ酸（複数可）を、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）から選択されるより小さいアミノ酸（複数可）で置き換え、これにより、より大きいアミノ酸置換（突起）がより小さいアミノ酸置換（空洞）の表面にフィットするようになる。例えば、一方のポリペプチドがＴ３６６Ｗ置換を組み込み得、他方のポリペプチドが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込み得る。

本発明の抗体重鎖可変ドメインは、任意に、ＣＨ１ドメインの有無にかかわらず、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域などの抗体定常領域と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列に結合され得る。いくつかの実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域などのヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。いくつかの他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマなどの別の哺乳動物由来の抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及び／またはＫ４３９において、ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して１つ以上の変異が定常領域に組み込まれ得る。例示的な置換には、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅが含まれ得る。

ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込まれ得る変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、及び／またはＶ１７３にあり得る。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込まれ得る変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、及び／またはＴ１６４にあり得る。

あるいは、アミノ酸置換は、以下の表３に示される組の置換から選択され得る。

あるいは、アミノ酸置換は、以下の表４に示される組の置換から選択され得る。

あるいは、アミノ酸置換は、以下の表５に示される組の置換から選択され得る。

あるいは、各ポリペプチド鎖における少なくとも１つのアミノ酸置換は、表６から選択され得る。

あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、以下の表７における組の置換から選択され得、ここで、第１ポリペプチドの列に示される位置（複数可）は、任意の既知の負に荷電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドの列に示される位置（複数可）は、任意の既知の正に荷電したアミノ酸によって置き換えられる。

あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、以下の表８における組の置換から選択され得、ここで、第１ポリペプチドの列に示される位置（複数可）は、任意の既知の負に荷電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドの列に示される位置（複数可）は、任意の既知の正に荷電したアミノ酸によって置き換えられる。

あるいは、アミノ酸置換は、以下の表９に示される組から選択され得る。

あるいは、または加えて、ヘテロ多量体タンパク質の構造的安定性は、第１のポリペプチド鎖または第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃを導入し、反対側のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入して、２つのポリペプチドの界面内に人工ジスルフィド架橋を形成することによって増加し得る。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６位でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８、及びＹ４０７からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８、及びＹ４０７からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖の配列は、Ｔ３６６位でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００、及びＹ４０７からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００、及びＹ４０７からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０、及びＫ４０９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９、及びＦ４０５からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９、及びＦ４０５からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７、及びＫ４０９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、及びＫ４３９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７、及びＤ３９９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７、及びＤ３９９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖の配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、及びＫ４３９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６、及びＤ３９９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２、及びＫ４０９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２、及びＫ４０９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６、及びＤ３９９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換がＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

上述の多重特異性結合タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列は、第１の発現ベクターにクローニングされ得、第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列は、第２の発現ベクターにクローニングされ得、免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列は、第３の発現ベクターにクローニングされ得、第１の発現ベクター、第２の発現ベクター、及び第３の発現ベクターは、宿主細胞に一緒に安定的にトランスフェクトされて、多量体タンパク質を産生し得る。

多重特異性タンパク質の最も高い収率を達成するために、第１の発現ベクター、第２の発現ベクター、及び第３の発現ベクターの異なる比率が探索されて、宿主細胞へのトランスフェクションのための最適な比率を決定することができる。トランスフェクション後、単一クローンが、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、顕微鏡法、またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当該技術分野で既知の方法を使用して、細胞バンク生成のために単離され得る。

クローンは、バイオリアクタースケールアップに好適な条件下で培養され、多重特異性タンパク質の発現を維持し得る。多重特異性タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、均質化、凍結融解、親和性精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、及び混合モードクロマトグラフィーを含む当該技術分野で既知の方法を使用して単離及び精製され得る。

ＩＩ．多重特異性タンパク質の特徴
本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位、ＣＤ１６結合部位、及びＰ−カドヘリン結合部位を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＮＫ細胞などのＮＫＧ２Ｄ及び／またはＣＤ１６を発現する細胞と、Ｐ−カドヘリンを発現する腫瘍細胞とに同時に結合する。ＮＫ細胞への多重特異性タンパク質の結合は、がん細胞の破壊に向けてＮＫ細胞の活性を増強することができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、同じＰ−カドヘリン結合部位を有する対応するモノクローナル抗体と同様の親和性でＰ−カドヘリンに結合する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、同じＰ−カドヘリン結合部位を有する対応するモノクローナル抗体よりも、Ｐ−カドヘリンを発現する腫瘍細胞の殺傷に効果的である。

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位及びＰ−カドヘリン結合部位を含む本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、Ｐ−カドヘリンを発現する腫瘍細胞と共培養されると、初代ヒトＮＫ細胞を活性化する。ＮＫ細胞活性化は、ＣＤ１０７ａ発現、脱顆粒、及びＩＦＮ−γサイトカイン産生の増加を特徴とする。さらに、同じＰ−カドヘリン結合部位を有する対応するモノクローナル抗体と比較して、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、Ｐ−カドヘリンを発現する細胞の存在下でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示し得る。

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及びＰ−カドヘリン結合部位を含む本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、Ｐ−カドヘリンを発現する腫瘍細胞の存在下で静止しているＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞の活性化を増強する。

ある特定の実施形態では、同じＰ−カドヘリン結合部位を有する対応するモノクローナル抗体と比較して、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、Ｐ−カドヘリンの中程度または低い発現を有する腫瘍細胞に対してより高い細胞傷害性活性を有し得る。

ＩＩＩ．治療的用途
本発明は、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質及び／または本明細書に記載の薬学的組成物を使用してがんを治療するための方法を提供する。これらの方法を使用して、Ｐ−カドヘリンを発現する様々ながんを治療することができる。治療される例示のがんは、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、子宮内膜癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、頭頸部癌、卵巣癌、食道癌、腎癌、肝臓癌、精巣癌、口腔癌、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、黒色腫、皮膚の基底細胞癌及び扁平上皮癌、神経膠腫、ユーイング肉腫、カポシ肉腫、及び中皮腫であり得る。

いくつかの他の実施形態では、治療される例示のがんは、末端性黒子性黒色腫、光線性角化症、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺癌、腺様嚢胞癌、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管癌、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管肉腫、肛門直腸癌、星状細胞腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌（例えば、皮膚）、Ｂ細胞リンパ腫、胆道癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、気管支癌、気管支腺癌、バーキット白血病、カルチノイド、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫／癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血、慢性好中球性白血病、明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、結合組織癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、嚢胞腺腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜癌／過形成、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞癌、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、上衣癌、上皮細胞癌、食道癌、ユーイング肉腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、眼及び眼窩癌、女性生殖器癌、限局性結節性過形成、濾胞性リンパ腫、胆嚢癌、胃前庭部癌、胃癌、胃底部癌、ガストリノーマ、膠芽細胞腫、神経膠腫、グルカゴノーマ、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、血液腫瘍、肝細胞腺腫、肝腺腫症、肝細胞癌、肝胆道癌、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内新形成、上皮内扁平上皮新形成、肝内胆管癌、浸潤性扁平上皮癌、空腸癌、関節癌、カポジ肉腫、腎臓癌、大細胞癌、大腸癌、平滑筋肉腫、悪性黒子型黒色腫、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、男性生殖器癌、悪性黒色腫、悪性中皮腫腫瘍、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、髄芽腫、髄様上皮腫、黒色腫、髄膜癌、中皮癌、中皮腫、転移性癌、口腔癌（ｍｏｕｔｈ ｃａｎｃｅｒ）、粘液性類表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、骨髄異形成新生物、骨髄増殖性新生物、鼻道癌、神経系癌、神経芽細胞腫、神経上皮腺癌、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、結節性黒色腫、非上皮性皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠細胞癌、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｎｃｅｒ）、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭状漿液性腺癌、耳下腺癌、骨盤癌、陰茎癌、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、偽肉腫、肺芽腫、直腸癌、腎臓癌、腎細胞癌、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、小リンパ球性リンパ腫、平滑筋癌、軟部組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎癌、脾性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、扁平上皮癌（例えば、皮膚）、横紋筋癌、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、亜中皮癌、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫、睾丸癌、甲状腺癌、舌癌、未分化癌、尿管癌、尿道癌、膀胱癌、子宮癌、子宮体癌、ブドウ膜黒色腫、膣癌、疣状癌、ＶＩＰ産生腫瘍、外陰癌、高分化癌、またはウィルムス腫瘍であり得る。

ＩＶ．併用療法
本発明の別の態様は、併用療法を提供する。本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、がんを治療するための追加の治療薬と組み合わせて使用され得る。

がんの治療における併用療法の一環として使用され得る例示の治療薬には、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、チマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イフォスファミド、プレドニムスチン、ピシバニル、レバミソール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、フォルメスタン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−２アルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、コロニー刺激因子−１、コロニー刺激因子−２、デニロイキン・ディフティトックス、インターロイキン−２、黄体形成ホルモン放出因子、及び同族受容体への異なる結合及び増加または減少した血清半減期を呈し得る前述の薬剤の変形が含まれる。

がんの治療における併用療法の一環として使用され得る追加のクラスの薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。例示の免疫チェックポイント阻害剤には、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７−Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７−Ｈ４、及び（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１つ以上を阻害する薬剤が含まれる。ＣＴＬＡ４阻害剤であるイピリムマブは、黒色腫の治療薬として米国食品医薬品局によって承認されている。

がんの治療における併用療法の一環として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェックポイント標的（例えば、ハーセプチン）を標的とするモノクローナル抗体薬剤及び非細胞傷害性剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。

抗がん剤のさらに他のカテゴリーには、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトンチロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫ及びｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤＋２−クロロ−デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１及びＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、及びＷＥＥ１阻害剤、（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、またはＩＣＯＳアゴニスト、及び（ｉｉｉ）ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦから選択されるサイトカインから選択される阻害剤が含まれる。

本発明のタンパク質は、原発病変の外科的除去を補助するものとしても使用され得る。

多重特異性結合タンパク質及び追加の治療薬の量、ならびに相対的な投与タイミングは、所望の併用療法効果を達成するために選択され得る。例えば、併用療法の投与を必要とする患者に併用療法を投与する場合、併用における治療薬、またはそれらの治療薬を含む薬学的組成物（複数可）は、例えば、順次に、同時発生的に、一緒に、同時になどの任意の順序で投与され得る。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、追加の治療薬（複数可）がその予防的または治療的効果を発揮している間に投与され得、またはその逆も同様であり得る。

Ｖ．薬学的組成物
本開示は、本明細書に記載のタンパク質の治療有効量を含む薬学的組成物も特色とする。本組成物は、様々な薬物送達系での使用のために製剤化され得る。１つ以上の生理学的に許容される賦形剤または担体も適切な製剤化のために本組成物に含まれ得る。本開示における使用に好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８５）に記載されている。薬物送達のための方法の簡潔な総説については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ Ｔ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ；２４９（４９７６）：１５２７−１５３３を参照されたい。

本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、またはシリンジに収容され得る。ある特定の実施形態では、バッグは、管及び／または針を含むチャネルに接続され得る。ある特定の実施形態では、製剤は、凍結乾燥製剤または液体製剤であり得る。ある特定の実施形態では、製剤は、冷凍乾燥（凍結乾燥）され、約１２〜６０個のバイアル内に収容され得る。ある特定の実施形態では、製剤は、冷凍乾燥され得、４５ｍｇの冷凍乾燥製剤が１つのバイアル内に収容され得る。ある特定の実施形態では、約４０ｍｇ〜約１００ｍｇの冷凍乾燥製剤が１つのバイアル内に収容され得る。ある特定の実施形態では、静脈内薬物製剤中のタンパク質の治療用量を得るために、１２、２７、または４５個のバイアルからの冷凍乾燥製剤が組み合わせられる。ある特定の実施形態では、製剤は、液体製剤であり、約２５０ｍｇ／バイアル〜約１０００ｍｇ／バイアルとして保管され得る。ある特定の実施形態では、製剤は、液体製剤であり、約６００ｍｇ／バイアルとして保管され得る。ある特定の実施形態では、製剤は、液体製剤であり、約２５０ｍｇ／バイアルとして保管され得る。

本開示は、緩衝溶液中に多重特異性タンパク質の治療有効量を含む液体水性薬学的製剤で存在し得る。

本明細書に開示される組成物は、従来の滅菌技法によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。結果として生じた水溶液は、そのまま使用するために包装され得るか、または凍結乾燥され得、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わせられる。調製物のｐＨは、典型的には、３〜１１、より好ましくは５〜９または６〜８、最も好ましくは７〜７．５などの７〜８である。結果として生じた固体形態の組成物は、各々前述の薬剤（複数可）の固定量を収容する複数の単回用量単位に包装され得る。固体形態の組成物は、自在量用の容器に包装される場合もある。

ある特定の実施形態では、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水、及び水酸化ナトリウムと組み合わせて、本開示の多重特異性タンパク質を含む、保管期間が延長された製剤を提供する。

ある特定の実施形態では、ｐＨ緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含む水性製剤が調製される。本発明の緩衝液は、約４〜約８、例えば、約４．５〜約６．０、または約４．８〜約５．５の範囲のｐＨを有し得るか、または約５．０〜約５．２のｐＨを有し得る。上記のｐＨに対して中間の範囲も本開示の一部であるよう意図されている。例えば、上記の値のうちのいずれかの組み合わせを上限値及び／または下限値として使用する値の範囲が含まれるよう意図されている。ｐＨをこの範囲内で制御する緩衝液の例には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、及び他の有機酸緩衝液が含まれる。

ある特定の実施形態では、製剤は、約４〜約８の範囲のｐＨを維持するためにクエン酸塩及びリン酸塩を含有する緩衝系を含む。ある特定の実施形態では、ｐＨ範囲は、約４．５〜約６．０、または約４．８〜約５．５、または約５．０〜約５．２のｐＨ範囲であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、及び／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。ある特定の実施形態では、緩衝系は、約１．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約０．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約１．５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍＬ）、約０．９ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６ｍｇ／ｍＬ）、及び約６．２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍＬ）を含む。ある特定の実施形態では、緩衝系は、１〜１．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸、０．２５〜０．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、１．２５〜１．７５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物、０．７〜１．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物、及び６．０〜６．４ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムを含む。ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは、水酸化ナトリウムで調整される。

等張化剤として作用し、かつ抗体を安定化させ得るポリオールも本明細書に記載の製剤に含まれ得る。ポリオールは、製剤の所望の等張性に応じて変化し得る量で製剤に添加される。ある特定の実施形態では、水性製剤は、等張性であり得る。添加されるポリオールの量は、ポリオールの分子量に応じて変化する場合もある。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、より少ない量の単糖（例えば、マンニトール）が添加され得る。ある特定の実施形態では、等張化剤として製剤中で使用され得るポリオールは、マンニトールである。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約５〜約２０ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約７．５〜１５ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１０〜１４ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１２ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、ポリオールソルビトールが製剤に含まれ得る。

洗剤または界面活性剤も本発明の製剤に添加され得る。例示の洗剤には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）等の非イオン性洗剤が含まれる。添加される洗剤の量は、それが製剤化された抗体の凝集を減少させる及び／または製剤中の微粒子の形成を最小限に抑える及び／または吸着を減少させるような量である。ある特定の実施形態では、製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含み得る。ある特定の実施形態では、製剤は、洗剤であるポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ ８０を含み得る。Ｔｗｅｅｎ ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを説明するために使用される用語である（例えば、Ｆｉｅｄｌｅｒ Ｈ．Ｐ．，Ｌｅｘｉｋｏｎ ｄｅｒ Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ ｆｕｒ Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，Ｋｏｓｍｅｔｉｋ ｕｎｄ ａｎｄｒｅｎｚｅｎｄｅ Ｇｅｂｉｅｔｅ，４^ｔｈ Ｅｄ．，Ｅｄｉｔｉｏ Ｃａｎｔｏｒ，Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９９６）を参照のこと）。ある特定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬまたは約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含み得る。ある特定の実施形態では、約０．１％ポリソルベート８０が製剤に添加され得る。

ある特定の実施形態では、本開示の多量特異性タンパク質産物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉鎖され、かつアルミニウム圧着シール閉鎖材で密封されたＵＳＰ／Ｐｈ ＥｕｒのいずれかのＩ型５０Ｒバイアル中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。栓は、ＵＳＰ及びＰｈ Ｅｕｒに準拠したエラストマーで作製され得る。ある特定の実施形態では、バイアルは、６０ｍＬの抽出可能な体積を可能にするために、６１．２ｍＬの多重特異性タンパク質産物溶液で充填され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、０．９％生理食塩水溶液で希釈され得る。

ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、安定化レベルで糖と組み合わせて１０ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液として調製され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、水性担体中で調製され得る。ある特定の実施形態では、安定剤は、静脈内投与に望ましくないまたは好適ではない粘度をもたらし得る量を超えない量で添加され得る。ある特定の実施形態では、糖は、二糖、例えば、スクロースであり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、緩衝剤、界面活性剤、及び防腐剤のうちの１つ以上も含み得る。

ある特定の実施形態では、液体製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸及び／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は、塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、塩基は、水酸化ナトリウムであり得る。

凝集に加えて、脱アミド化は、発酵、収集／細胞浄化、精製、薬物物質／薬物製品保管、及び試料分析中に生じ得るペプチド及びタンパク質の一般的な産物変化である。生理学的条件下では、脱アミド化は、タンパク質のアスパラギン残基からのアンモニア（ＮＨ_３）の欠失であり、その結果、質量が１７ダルトン減少し、スクシンイミド中間体が形成される。その後のスクシンイミドの加水分解により、質量が１８ダルトン増加し、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸が形成される。脱アミド化の速度に影響を及ぼすパラメータには、ｐＨ、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所ポリペプチド立体配座、及び三次構造が含まれる。ペプチド鎖内のＡｓｎに隣接するアミノ酸残基も脱アミド化速度に影響を及ぼし得、例えば、Ａｓｎ残基に続くＧｌｙ残基及びＳｅｒ残基は、脱アミド化に対する感受性を高める。

ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミノ化を防止するためのｐＨ及び湿度条件下で保存され得る。

本明細書における目的とする水性担体は、薬学的に許容され（すなわち、ヒトへの投与に安全及び非毒性である）、かつ液体製剤の調製に有用なものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液、またはデキストロース溶液が含まれる。

細菌作用を減少させるために、防腐剤が本明細書の製剤に任意に添加され得る。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。

静脈内（ＩＶ）製剤は、特定の場合、例えば、患者が移植後に病院で全ての薬物をＩＶ経路で受けている場合に好ましい投与経路であり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈される。ある特定の実施形態では、注射用に希釈された薬物製品は、等張性であり、静脈内注入による投与に好適である。

ある特定の実施形態では、塩または緩衝液成分は、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭの量で添加され得る。塩及び／または緩衝液は、薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを有する様々な既知の酸（無機及び有機）に由来する。ある特定の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシン酸、炭酸、クエン酸緩衝液であり得、この場合、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。

細菌作用を減少させるために、防腐剤が本明細書の製剤に任意に添加され得る。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（すなわち、複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。

本明細書における目的とする水性担体は、薬学的に許容され（すなわち、ヒトへの投与に安全及び非毒性である）、かつ液体製剤の調製に有用なものである。例示的な担体には、ＳＷＦＩ、ＢＷＦＩ、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液、またはデキストロース溶液が含まれる。

本開示は、タンパク質及び凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む凍結乾燥製剤中に存在し得る。凍結乾燥保護剤は、糖、例えば、二糖であり得る。ある特定の実施形態では、凍結乾燥保護剤は、スクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥製剤は、緩衝剤、界面活性剤、増量剤、及び／または防腐剤のうちの１つ以上も含み得る。

凍結乾燥薬物製品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なくとも１：２のタンパク質のスクロースまたはマルトースに対する重量比であり得る。ある特定の実施形態では、タンパク質のスクロースまたはマルトースに対する重量比は、１：２〜１：５であり得る。

ある特定の実施形態では、凍結乾燥前の凍結乾燥製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸及び／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は、塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される塩基は、水酸化ナトリウムであり得る。

凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含む溶液のｐＨは、６〜８に調整され得る。ある特定の実施形態では、凍結乾燥薬物製品のｐＨ範囲は、７〜８であり得る。

ある特定の実施形態では、塩または緩衝液成分は、１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加され得る。塩及び／または緩衝液は、薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを有する様々な既知の酸（無機及び有機）に由来する。ある特定の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシン酸、炭酸、クエン酸緩衝液であり得、この場合、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。

ある特定の実施形態では、「増量剤」が凍結乾燥製剤に添加され得る。「増量剤」とは、凍結乾燥混合物に質量を加え、かつ凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開放細孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール、及びソルビトールが含まれる。本発明の凍結乾燥製剤は、かかる増量剤を含み得る。

細菌作用を減少させるために、防腐剤が本明細書の凍結乾燥製剤に任意に添加され得る。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（すなわち、複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。

ある特定の実施形態では、凍結乾燥薬物製品は、水性担体で再構成され得る。本明細書における目的とする水性担体は、凍結乾燥後に薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与に安全及び非毒性である）、かつ再構成された液体製剤の調製に有用なものである。例示的な希釈剤には、ＳＷＦＩ、ＢＷＦＩ、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液、またはデキストロース溶液が含まれる。

ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥薬物製品は、ＳＷＦＩ（ＵＳＰ）または注射用０．９％塩化ナトリウム（ＵＳＰ）のいずれかで再構成される。再構成中に、凍結乾燥粉末が溶液中に溶解する。

ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質製品は、ＳＷＦＩ中で約４．５ｍＬに構成され、０．９％生理食塩水（塩化ナトリウム溶液）で希釈される。

本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性を与えることなく、特定の患者、組成物、及び投与様式に所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変更され得る。

具体的な用量は、患者毎に均一の用量、例えば、５０〜５０００ｍｇのタンパク質であり得る。あるいは、患者の用量は、患者のおよその体重または表面積に対して調整され得る。適切な投薬量を決定する際の他の要因には、治療または予防される疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別、及び医学的状態が含まれ得る。治療に適切な投薬量を決定するのに必要な計算のさらなる微調整は、特に本明細書に開示される投薬量情報及びアッセイに照らして、当業者によって慣習的になされ得る。投薬量は、適切な用量応答データと併せて使用される投薬量を決定するための既知のアッセイの使用によっても決定され得る。個々の患者の投薬量は、疾患の進行を監視しながら調整され得る。有効濃度に到達するか、またはそれを維持するように投薬量が調整される必要があるかを確認するために、患者における標的可能な構築物または複合体の血中濃度が測定され得る。薬理ゲノミクスを使用して、どの標的可能な構築物及び／または複合体、ならびにそれらの投薬量が、所与の個体に有効である可能性が最も高いかを決定することができる（例えば、Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ；３０８：４３−５３，２００１、Ｓｔｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ３０８：３３−４１を参照のこと）。

概して、体重に基づく投薬量は、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、または約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。

用量は、１日回以上、週回以上、月回以上、もしくは年１回以上、またはさらに２〜２０年に１回与えられ得る。当業者であれば、体液または組織中の標的可能な構築物または複合体の測定された滞留時間及び濃度に基づいて、投薬の繰り返し速度を容易に推定することができる。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内投与、カテーテルを介した灌流による投与、または直接病巣内注射による投与であり得る。これは、１日１回以上、週１回以上、月１回以上、及び年１回以上投与され得る。

上記の記述は、本発明の複数の態様及び実施形態を説明している。本特許出願は、これらの態様及び実施形態の全ての組み合わせ及び順列を具体的に企図する。

ここで概して記載されている本発明は、本発明のある特定の態様及び実施形態を例証する目的のみのために含まれており、本発明を限定するようには意図されていない以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。

実施例１−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄに結合する
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは精製された組換えＮＫＧ２Ｄに結合する
ヒト、マウス、またはカニクイザルＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインの核酸配列を、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインをコードする核酸配列と融合させ、発現させる哺乳類細胞に導入した。精製後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させた。ウェルをウシ血清アルブミンでブロックして非特異的結合をブロックした後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを滴定し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質を事前に吸着させたウェルに添加した。一次抗体の結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされ、かつヒトカッパ軽鎖を特異的に認識してＦｃ交差反応性を回避する二次抗体を使用して検出した。ワサビペルオキシダーゼの基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェルに添加して結合シグナルを可視化し、その吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローン、アイソタイプ対照、または陽性対照（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン、または抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６及びＣＸ−５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む）を各ウェルに添加した。

アイソタイプ対照が組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への最小限の結合を示した一方で、陽性対照は、組換え抗原に最も強く結合した。全てのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、クローンによって親和性が異なるが、ヒト、マウス、及びカニクイザル組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質にわたって結合することを実証した。概して、各抗ＮＫＧ２Ｄクローンは、ヒト（図３）及びカニクイザル（図４）組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに同様の親和性で結合したが、マウス（図５）組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃにはより低い親和性で結合した。

ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株を、ヒトまたはマウスＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインキメラ抗原受容体を発現するように操作した。ＥＬ４細胞上に発現した細胞外ＮＫＧ２Ｄを染色するために、ＮＫＧ２Ｄ結合クローン、アイソタイプ対照、または陽性対照を１００ｎＭの濃度で使用した。抗体結合を、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、バックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を、親ＥＬ４細胞と比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して計算した。

ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ヒト及びマウスＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に結合した全てのクローンによって産生された。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン、または抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６及びＣＸ−５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む）は、最良のＦＯＢ結合シグナルを提供した。各クローンのＮＫＧ２Ｄ結合親和性は、ヒトＮＫＧ２Ｄ（図６）及びマウスＮＫＧ２Ｄ（図７）を発現する細胞間で同様であった。

実施例２−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を阻害する
ＵＬＢＰ−６との競合
組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、ウェルをウシ血清アルブミンでブロックして非特異的結合を減少させた。飽和濃度のＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンをウェルに添加し、その後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンを添加した。２時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ被覆ウェルに結合したままのＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンを、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされたストレプトアビジン及びＴＭＢ基質によって検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインのＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への特異的結合を、ウェル中のＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への結合が阻害されたＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンの割合から計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む）及び様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＵＬＢＰ−６のＮＫＧ２Ｄへの結合を阻害した一方で、アイソタイプ対照は、ＵＬＢＰ−６との競合をほとんど示さなかった（図８）。

ＵＬＢＰ−６配列は配列番号１４１によって表される。
ＭＡＡＡＡＩＰＡＬＬＬＣＬＰＬＬＦＬＬＦＧＷＳＲＡＲＲＤＤＰＨＳＬＣＹＤＩＴＶＩＰＫＦＲＰＧＰＲＷＣＡＶＱＧＱＶＤＥＫＴＦＬＨＹＤＣＧＮＫＴＶＴＰＶＳＰＬＧＫＫＬＮＶＴＭＡＷＫＡＱＮＰＶＬＲＥＶＶＤＩＬＴＥＱＬＬＤＩＱＬＥＮＹＴＰＫＥＰＬＴＬＱＡＲＭＳＣＥＱＫＡＥＧＨＳＳＧＳＷＱＦＳＩＤＧＱＴＦＬＬＦＤＳＥＫＲＭＷＴＴＶＨＰＧＡＲＫＭＫＥＫＷＥＮＤＫＤＶＡＭＳＦＨＹＩＳＭＧＤＣＩＧＷＬＥＤＦＬＭＧＭＤＳＴＬＥＰＳＡＧＡＰＬＡＭＳＳＧＴＴＱＬＲＡＴＡＴＴＬＩＬＣＣＬＬＩＩＬＰＣＦＩＬＰＧＩ（配列番号１４１）

ＭＩＣＡとの競合
組換えヒトＭＩＣＡ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、ウェルをウシ血清アルブミンでブロックして非特異的結合を減少させた。ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、その後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベート及び洗浄後、ＭＩＣＡ−Ｆｃ被覆ウェルに結合したままのＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインのＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への特異的結合を、ＭＩＣＡ−Ｆｃ被覆ウェルへの結合が阻害されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンの割合から計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む）及び様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＭＩＣＡのＮＫＧ２Ｄへの結合を阻害した一方で、アイソタイプ対照は、ＭＩＣＡとの競合をほとんど示さなかった（図９）。

Ｒａｅ−１デルタとの競合
組換えマウスＲａｅ−１デルタ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をマイクロプレートのウェルに吸着させ、ウェルをウシ血清アルブミンでブロックして非特異的結合を減少させた。マウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、その後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベート及び洗浄後、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃ被覆ウェルに結合したままのＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインのＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への特異的結合を、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃ被覆ウェルへの結合が阻害されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンの割合から計算した。陽性対照（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン、または抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６及びＣＸ−５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む）及び様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンがＲａｅ−１デルタのマウスＮＫＧ２Ｄへの結合を阻害した一方で、アイソタイプ対照抗体は、Ｒａｅ−１デルタとの競合をほとんど示さなかった（図１０）。

実施例３−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンはＮＫＧ２Ｄを活性化する
ヒト及びマウスＮＫＧ２Ｄの核酸配列を、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と融合させて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を得た。その後、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ構築物を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用してレトロウイルスベクターにクローニングし、レトロウイルス産生のためにｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクションした。ＥＬ４細胞を、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを含むウイルスに８μｇ／ｍＬポリブレンと一緒に感染させた。感染の２４時間後、ＥＬ４細胞におけるＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーによって分析し、細胞表面上に高レベルのＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを発現するクローンを選択した。

ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＮＫＧ２Ｄを活性化するかを決定するために、それらをマイクロプレートのウェルに吸着させ、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ ＥＬ４細胞をブレフェルジン−Ａ及びモネンシンの存在下で４時間にわたって抗体断片被覆ウェル上で培養した。ＮＫＧ２Ｄ活性化の指標である細胞内ＴＮＦ−α産生をフローサイトメトリーによってアッセイした。ＴＮＦ−α陽性細胞の割合を陽性対照で処理した細胞に対して正規化した。全てのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ヒトＮＫＧ２Ｄ（図１１）及びマウスＮＫＧ２Ｄ（図１２）の両方を活性化した。

実施例４−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫ細胞を活性化する
初代ヒトＮＫ細胞
密度勾配遠心分離を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血バフィーコートから単離した。ＰＢＭＣからの磁気ビーズを用いたネガティブ選択を使用してＮＫ細胞（ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋）を単離し、単離したＮＫ細胞の純度は、典型的には、９５％超であった。その後、単離したＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含む培地中で２４〜４８時間培養した後、それらを、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａ、及びモネンシンを含む培地中で培養した。培養後、ＣＤ３、ＣＤ５６、及びＩＦＮγに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用してＮＫ細胞をフローサイトメトリーによってアッセイした。ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋細胞におけるＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γ染色を分析して、ＮＫ細胞活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の結合によるより良好なＮＫ細胞活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び陽性対照（例えば、配列番号１０１または配列番号１０３によって表される重鎖可変ドメイン、及び配列番号１０２または配列番号１０４によって表される軽鎖可変ドメイン）は、アイソタイプ対照よりも高い割合のＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ^＋及びＩＦＮγ^＋になることを示した（図１３及び図１４は、各々ＮＫ細胞調製のために異なるドナーのＰＢＭＣを使用した２つの独立した実験からのデータを表す）。

初代マウスＮＫ細胞
脾臓をＣ５７Ｂｌ／６マウスから得て、７０μｍの細胞ストレーナーを通して粉砕して単一細胞懸濁液を得た。細胞をペレット状にし、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ａ１０４９２０１（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ重炭酸カリウム、０．０１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁して赤血球を除去した。残存した細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２と７２時間培養した後、収集し、ＮＫ細胞単離のために調製した。その後、磁気ビーズを用いたネガティブ枯渇技法を使用してＮＫ細胞（ＣＤ３⁻ＮＫ１．１^＋）を脾臓細胞から単離し、典型的には９０％超の純度を有するＮＫ細胞集団を産出した。精製したＮＫ細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ−１５を含む培地中で４８時間培養した後、それらを、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａ、及びモネンシンを含む培地中で培養した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン被覆ウェル中での培養後、ＣＤ３、ＮＫ１．１、及びＩＦＮ−γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用してＮＫ細胞をフローサイトメトリーによってアッセイした。ＣＤ３⁻ＮＫ１．１^＋細胞におけるＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γ染色を分析して、ＮＫ細胞活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の係合によるより良好なＮＫ細胞活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び陽性対照（抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６及びＣＸ−５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から選択される）は、アイソタイプ対照よりも高い割合のＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ^＋及びＩＦＮ−γ^＋になることを示した（図１５及び図１６は、各々ＮＫ細胞調製のために異なるマウスを使用した２つの独立した実験からのデータを表す）。

実施例５−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは標的腫瘍細胞に対する細胞傷害性を増強する
ヒト及びマウスの初代ＮＫ細胞活性化アッセイは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインとのインキュベート後のＮＫ細胞上の細胞傷害性マーカーの増加を実証する。これが腫瘍細胞溶解の増加につながるかに取り組むために、各ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを単一特異性抗体に発展させた細胞ベースのアッセイを利用した。Ｆｃ領域を１つの標的アームとして使用し、Ｆａｂ領域（ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン）を別の標的アームとして機能させて、ＮＫ細胞を活性化した。ヒト起源であり、かつ高レベルのＦｃ受容体を発現するＴＨＰ−１細胞を腫瘍標的として使用し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）細胞傷害性キット（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用した。ＴＨＰ−１細胞をＢＡＴＤＡ試薬で標識し、１０^５細胞／ｍＬで培養培地中に再懸濁した。その後、標識したＴＨＰ−１細胞をＮＫＧ２Ｄ抗体と組み合わせ、マイクロタイタープレートのウェル中でマウスＮＫ細胞を３７℃で３時間単離した。インキュベート後、２０μＬの培養上清を除去し、２００μＬのユーロピウム溶液と混合し、暗所で１５分間振盪しながらインキュベートした。時間分解蛍光モジュール（励起３３７ｎｍ、発光６２０ｎｍ）を備えたＰＨＥＲＡＳｔａｒ（登録商標）プレートリーダーによって蛍光を経時的に測定し、特異的溶解をキットの指示に従って計算した。

ＮＫＧ２Ｄに対する天然リガンドである陽性対照ＵＬＢＰ−６は、マウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解の増加を示した。ＮＫＧ２Ｄ抗体がＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解も増加させた一方で、アイソタイプ対照抗体は、減少した特異的溶解を示した。点線は、抗体を添加していないマウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１細胞の特異的溶解を示す（図１７）。

実施例６−ＮＫＧ２Ｄ抗体は高い熱安定性を有する
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの融解温度を、示差走査蛍光定量法を使用してアッセイした。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの推定された見かけの融解温度は、典型的なＩｇＧ１抗体と比較して高かった（図１８）。

実施例７−ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６の架橋によるヒトＮＫ細胞の相乗的活性化
初代ヒトＮＫ細胞活性化アッセイ
密度勾配遠心分離を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血バフィーコートから単離した。ネガティブ選択磁気ビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ、カタログ番号１７９５５）を使用してＮＫ細胞をＰＢＭＣから精製した。ＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによって決定される、９０％超のＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋であった。その後、細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ、カタログ番号２００−０２）を含む培地中で４８時間増殖させた後、活性化アッセイに使用した。抗体を１００μＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２μｇ／ｍＬ（抗ＣＤ１６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、カタログ番号３０２０１３）及び５μｇ／ｍＬ（抗ＮＫＧ２Ｄ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、カタログ番号ＭＡＢ１３９）の濃度で９６ウェル平底プレート上に４℃で一晩被覆し、その後、ウェルを完全に洗浄して過剰な抗体を除去した。脱顆粒の評価のために、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ２及び１μｇ／ｍＬのＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２８６１９）を補充した培地中に５×１０^５細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、１×１０^５細胞／ウェルを抗体被覆プレートに添加した。タンパク質輸送阻害剤ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、カタログ番号４２０６０１）及びモネンシン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、カタログ番号４２０７０１）を、それぞれ、１：１０００及び１：２７０の最終希釈で添加した。プレーティングした細胞を５％ＣＯ_２中３７℃で４時間インキュベートした。ＩＦＮ−γの細胞内染色について、ＮＫ細胞を抗ＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、カタログ番号３００４５２）及び抗ＣＤ５６ ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、カタログ番号３１８３２８）で標識し、その後、固定及び透過処理し、抗ＩＦＮ−γ ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、カタログ番号５０６５０７）で標識した。ＮＫ細胞を、生存ＣＤ５６^＋ＣＤ３⁻細胞上でゲーティングした後、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γの発現について分析した。

受容体組み合わせの相対的効力を調査するために、ＮＫＧ２ＤまたはＣＤ１６の架橋及びプレート結合刺激による両受容体の共架橋を行った。

図１９に示されるように、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ及び細胞内ＩＦＮ−γの発現を、抗ＣＤ１６、抗ＮＫＧ２Ｄ、またはそれらの両方のモノクローナル抗体の組み合わせで４時間プレート結合刺激した後に分析した。ＣＤ１６とＮＫＧ２Ｄとの組み合わせ刺激により、（点線によって表される）ＣＤ１６のみまたはＮＫＧ２Ｄのみの個々の刺激の相加的効果を超える割合のＣＤ１０７ａ^＋細胞（図１９Ａ）及びＩＦＮγ^＋細胞（図１９Ｂ）がもたらされた。同様に、ＣＤ１６とＮＫＧ２Ｄとの組み合わせ刺激により、各受容体のみの個々の相加的効果と比較してより高い割合のＣＤ１０７ａ^＋ＩＦＮγ^＋二重陽性細胞がもたらされた（図１９Ｃ）。棒グラフは、平均（ｎ＝２）±標準偏差を示し、５体の異なる健常ドナーを使用した５つの独立した実験を代表するものである。

実施例８−Ｐ−カドヘリン（ＣＤＨ３）を発現する細胞に結合する多重特異性結合タンパク質及びモノクローナル抗体の評価
ヒトＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）発現がん細胞株であるＨＣＴ１１６、Ｈ１９７５、及びＣＡＬ２７を使用して、配列番号１９６と同一の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号２００と同一の軽鎖可変ドメイン配列を含むＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）結合部位を有する多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）、または配列番号１８８と同一の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号１９２と同一の軽鎖可変ドメイン配列を含むＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）結合部位を有する多重特異性結合タンパク質（ＴＳＰ７ ＤＢ）の腫瘍抗原結合を評価した。同じＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）結合部位を有する多重特異性結合タンパク質または対応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を希釈し、細胞とインキュベートした。結合を、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、結合をヒト組換えＩｇＧ１染色対照に対して正規化した平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表し、バックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）値を得た。

図３５Ａ〜Ｃに示されるように、配列番号１９６と同一の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号２００と同一の軽鎖可変ドメイン配列を含む抗Ｐ−カドヘリンｍＡｂ（Ｄ１５３ｗｔ ｍＡｂ）、及び同じＰ−カドヘリン結合Ｆａｂを有する抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）は、Ｐ−カドヘリン発現ヒト非小細胞肺癌細胞（Ｈ１９７５、図３５Ａ）、ヒト結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６、図３５Ｂ）、及びヒト舌扁平上皮癌細胞（ＣＡＬ２７、図３５Ｃ）に同様の用量応答で結合する。全体的な結合シグナルは、対応するｍＡｂと比較して、多重特異性結合タンパク質が高かった。

同様に、図３６Ａ〜Ｃに示されるように、配列番号１８８と同一の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号１９２と同一の軽鎖可変ドメイン配列を含む抗Ｐ−カドヘリンｍＡｂ（ＴＳＰ７ｗｔ ｍＡｂ）、及び同じＰ−カドヘリン結合Ｆａｂを有する抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質（ＴＳＰ７ ＤＢ）は、Ｐ−カドヘリン発現Ｈ１９７５細胞（図３６Ａ）、ＨＣＴ１１６細胞（図３６Ｂ）、及びＣＡＬ２７細胞（図３６Ｃ）に同様の用量応答で結合する。

実施例９−多重特異性結合タンパク質によるＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）^＋標的細胞の増強されたＮＫ細胞媒介溶解
ＫＨＹＧ１−ＣＤ１６Ｖ細胞を、ＣＤ１６の高親和性Ｖ１５８対立遺伝子をＫＨＹＧ１細胞で異所的に発現させることによって産生した。細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリンストレプトマイシン、５０μＭ β−メルカプトエタノール、及び１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ２を補充したＲＰＭＩ１６５０培地中で維持した。細胞を、ＩＬ２を含まない培地中で一晩インキュベートした後、細胞傷害性アッセイに使用した。

密度勾配遠心分離を使用してＰＢＭＣをヒト末梢血バフィーコートから単離した。単離したＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞の単離のために調製した。磁気ビーズを用いたネガティブ選択を使用してＮＫ細胞を単離した。ＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによって決定される、９０％超のＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋であった。単離したＮＫ細胞を、サイトカインを含まない培地中で一晩インキュベートした後、細胞傷害性アッセイに使用した。

ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ：
Ｐ−カドヘリン発現ヒトがん細胞株を培養物から収集した。細胞をＰＢＳで洗浄し、１０^６細胞／ｍＬで成長培地中に再懸濁して、製造業者の指示に従ってＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、カタログ番号ＡＤ０１１６）で標識した。標識後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、５×１０^４細胞／ｍＬで培養培地中に再懸濁し、１００μＬのＢＡＴＤＡ標識細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。指定したウェルを標的細胞からの自然放出のために保存し、全ての他のウェルを１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの添加によって標的細胞の最大溶解のために調製した。

希釈したＰ−カドヘリンｍＡｂまたは抗Ｐ−カドヘリンデュオボディ（ｄｕｏｂｏｄｙ）多重特異性結合タンパク質５０μＬを指定したウェルに添加した。ＫＨＹＧ１−ＣＤ１６Ｖまたは精製した初代ＮＫ細胞を培養物から収集し、洗浄し、１×１０^５〜２．０×１０^６細胞／ｍＬの濃度で培養培地中に再懸濁した。ＫＨＹＧ１−ＣＤ１６Ｖまたは初代ＮＫ細胞懸濁液５０μＬを９６ウェルプレートの指定したウェルに添加して合計２００μＬの培養体積にし、１０：１のエフェクターの標的細胞に対する比率を達成した。プレートを５％ＣＯ_２、３７℃で２〜４時間インキュベートした後、アッセイを開発した。

共培養後、細胞を２００×Ｇで５分間の遠心分離によってペレット状にした。２０μＬの培養上清を清潔なマイクロプレートに移し、２００μＬの室温のユーロピウム溶液を各ウェルに添加した。マイクロプレートを光から保護し、プレート振盪機上で、２５０ｒｐｍで１５分間インキュベートした。マイクロプレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘ機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で読み取った。特異的溶解％を以下のように計算した。
特異的溶解％＝［（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）］×１００％

図３７に示されるように、抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質は、ヒトがん細胞に対するＫＨＹＧ１−ＣＤ１６Ｖ媒介細胞傷害性を刺激した。図３７Ａは、配列番号１９６と同一の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号２００と同一の軽鎖可変ドメイン配列を含むＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）結合部位を有する多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）がＨ１９７５がん細胞に対するＫＨＹＧ１−ＣＤ１６Ｖ媒介細胞傷害性を刺激したことを示す。同様に、図３７Ｂは、配列番号１８８と同一の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号１９２と同一の軽鎖可変ドメイン配列を含むＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）結合部位を有する多重特異性結合タンパク質（ＴＳＰ７ ＤＢ）がＨ１９７５がん細胞に対するＫＨＹＧ１−ＣＤ１６Ｖ媒介細胞傷害性を刺激したことを示す。図３７Ｃは、配列番号１９６と同一の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号２００と同一の軽鎖可変ドメイン配列を含むＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）結合部位を有する多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）がＣＡＬ２７がん細胞に対するＫＨＹＧ１−ＣＤ１６Ｖ媒介細胞傷害性を刺激したことを示す。同様に、図３７Ｄは、配列番号１８８と同一の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号１９２と同一の軽鎖可変ドメイン配列を含むＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）結合部位を有する多重特異性結合タンパク質（ＴＳＰ７ ＤＢ）がＣＡＬ２７がん細胞に対するＫＨＹＧ１−ＣＤ１６Ｖ媒介細胞傷害性を刺激したことを示す。

抗Ｐ−カドヘリンデュオボディ多重特異性結合タンパク質が標的細胞溶解を刺激した一方で、同じＰ−カドヘリン結合部位を有する対応するｍＡｂはいずれの細胞傷害性活性も呈しなかった（図３７Ａ〜Ｄ）。

図３８、３９、４０、及び４１に示されるように、配列番号１９６と同一の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号２００と同一の軽鎖可変ドメイン配列を含むＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）結合部位を有する多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）は、Ｐ−カドヘリン発現ヒトがん細胞に対する細胞傷害性を刺激した。図３８は、抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）が、Ｐ−カドヘリン発現Ｈ１９７５ヒトがん細胞に対する、ドナー４７８９７（図３８Ａ）、ドナー５９１６５（図３８Ｂ）、及びドナー４８８９２（図３８Ｃ）から単離された初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性活性を刺激したことを示す。同様に、図３９は、抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）が、Ｐ−カドヘリン発現ＤＵ１４５ヒトがん細胞に対する、ドナー４７８９７（図３９Ａ）及びドナー４５０５４（図３９Ｂ）から単離された初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性活性を刺激したことを示す。図４０は、抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）が、Ｐ−カドヘリン発現Ｈ１６５０ヒトがん細胞に対する、ドナー４７８９７（図４０Ａ）及びドナー４５０５４（図４０Ｂ）から単離された初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性活性も刺激したことを示す。図４１は、抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質（Ｄ１５３ ＤＢ）が、それぞれ、Ｐ−カドヘリン発現ＣＡＬ２７ヒトがん細胞及びＨＣＣ１９５４ヒトがん細胞に対する、ドナー５９１６５（図４１Ａ）及びドナー４７８９７（図４１Ｂ）から単離された初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性活性も刺激したことを示す。

同様に、図４２Ａ〜Ｃに示されるように、配列番号１８８と同一の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号１９２と同一の軽鎖可変ドメイン配列を含むＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）結合部位を有する多重特異性結合タンパク質（ＴＳＰ７ ＤＢ）は、Ｐ−カドヘリン発現Ｈ１９７５（図４２Ａ）、Ｈ１６５０（図４２Ｂ）、及びＨＣＣ１９５４（図４２Ｃ）ヒトがん細胞に対するドナー精製初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性活性を刺激した。

両方の抗Ｐ−カドヘリン多重特異性結合タンパク質が、同じＰ−カドヘリン結合部位を有する対応するｍＡｂよりも効果的に標的がん細胞の溶解を刺激した。

参照による組み込み
本明細書で参照される特許文献及び科学論文の各々の全開示は、全ての目的のために参照により組み込まれる。

等価物
本発明は、その趣旨または本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するのではなく、全ての点で例証であるとみなされるべきである。それ故に、本発明の範囲は、前述の記述ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価性の意味及び範囲内に入る全ての変更がそこに包含されるよう意図されている。

Claims (44)

1. （ａ） ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
   （ｂ） Ｐ−カドヘリンに結合する第２の抗原結合部位と、
   （ｃ） ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と、を含む、タンパク質。
2. 前記第１の抗原結合部位が、ヒト、非ヒト霊長類、及び齧歯類におけるＮＫＧ２Ｄに結合する、請求項１に記載のタンパク質。
3. 前記第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項１または２に記載のタンパク質。
4. 前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、請求項３に記載のタンパク質。
5. 前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項３または４に記載のタンパク質。
6. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、請求項５に記載のタンパク質。
7. 前記第１の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、請求項５または６に記載のタンパク質。
8. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号１、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５、配列番号１５８、配列番号１６２、配列番号１６６、配列番号１７０、配列番号１７４、配列番号１７８、及び配列番号９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
9. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号４１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号４２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
10. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号４９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号５０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
11. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号５７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号５８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
12. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号５９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号６０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
13. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号６１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号６２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
14. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号６９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号７０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
15. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号７７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号７８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
16. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号８５、配列番号１５８、配列番号１６２、配列番号１６６、配列番号１７０、配列番号１７４、または配列番号１７８と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン、及び配列番号８６と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
17. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号９３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号９４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
18. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号１０１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
19. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号１０３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
20. 前記第１の抗原結合部位が、シングルドメイン抗体である、請求項１または２に記載のタンパク質。
21. 前記シングルドメイン抗体が、Ｖ_ＨＨ断片またはＶ_ＮＡＲ断片である、請求項２０に記載のタンパク質。
22. 前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜２または２０〜２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
23. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、請求項２２に記載のタンパク質。
24. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１１４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１１８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
25. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１２２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１２６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
26. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１３０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１３４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
27. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１８８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１９２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
28. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１９６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２００と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
29. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２０４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２０８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
30. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２１２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２１６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
31. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２２０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２２４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
32. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２２７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２２９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
33. 前記第２の抗原結合部位が、それぞれ、配列番号１１４及び１１８、１２２及び１２６、１３０及び１３４、１８８及び１９２、１９６及び２００、２０４及び２０８、２１２及び２１６、２２０及び２２４、及び２２７及び２２９からなる群から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
34. 前記第２の抗原結合部位が、シングルドメイン抗体である、請求項１〜４または８〜２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
35. 前記第２の抗原結合部位が、Ｖ_ＨＨ断片またはＶ_ＮＡＲ断片である、請求項３４に記載のタンパク質。
36. 前記タンパク質が、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの一部を含み、前記抗体Ｆｃドメインが、ヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインを含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のタンパク質。
37. 前記抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインを含む、請求項３６に記載のタンパク質。
38. 前記抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３６または３７に記載のタンパク質。
39. 前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、Ｋ４３９からなる群から選択される１つ以上の位置が異なる、請求項３８に記載のタンパク質。
40. 請求項１〜３９のいずれか１項に記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、製剤。
41. 請求項１〜３９のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む、細胞。
42. 腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を請求項１〜３９のいずれか１項に記載のタンパク質の有効量に曝露することを含む、前記方法。
43. がんを治療する方法であって、患者に、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項４０に記載の製剤の有効量を投与することを含む、前記方法。
44. 前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＰ−カドヘリンに結合し、治療される前記がんが、食道癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮頸部腺癌、黒色腫、ならびに皮膚の基底細胞癌及び扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。

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