JP2020522473A - Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、および腫瘍関連抗原に結合するタンパク質 - Google Patents

Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、および腫瘍関連抗原に結合するタンパク質 Download PDF

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Abstract

ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６およびＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される腫瘍関連抗原に結合する多重特異性結合タンパク質、ならびにがんの処置に有用な医薬組成物および治療方法が記載される。本発明は、ナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびにＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される腫瘍関連抗原に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。かかるタンパク質は２種類以上のＮＫ活性化受容体と会合することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を阻止し得る。ある特定の実施形態では、タンパク質は、ヒトにおいてＮＫ細胞を刺激し得る。一部の実施形態では、タンパク質は、ヒトならびにげっ歯動物およびカニクイザルなどの他の種においてＮＫ細胞を刺激し得る。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年５月２３日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５１０，１７３号、２０１７年７月３１日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５３９，３９６号、２０１７年７月３１日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５３９，４１６号、２０１７年７月３１日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５３９，４１９号、２０１７年８月１６日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５４６，２９２号、２０１７年８月１６日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５４６，２９６号、および２０１７年８月３０日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５５２，１４６号に基づく利益および優先権を主張し、これらのそれぞれの全体の内容は、すべての目的のために本明細書中に参考として援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含み、その全体は、参照により本明細書に組み込まれている。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０１８年５月２１日に作成され、ＤＦＹ−０２２ＷＯ．ｔｘｔという名称であり、２１２ｋｂのサイズである。
発明の分野
本発明は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、およびＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される腫瘍関連抗原に結合する多重特異性結合タンパク質に関する。
背景
がんは、この疾患を処置するための文献に報告されている十分な研究努力および科学進歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。血液および骨髄のがんは、頻繁に診断されるがんの種類である（多発性骨髄腫、白血病、およびリンパ腫が挙げられる）。これらのがんに対する現在の処置選択肢は、すべての患者に効果的というわけではなく、および／または実質的な有害副作用を有する可能性がある。他の種類のがんも、既存の治療選択肢を使用して処置することが依然として困難である。
がん免疫療法は、それらが非常に特異的であり、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進することができるので望ましい。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの融合タンパク質は、腫瘍細胞の破壊を促進するために腫瘍細胞およびＴ細胞に結合する、文献に記載されているがん免疫療法である。ある特定の腫瘍関連抗原およびある特定の免疫細胞に結合する抗体は文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１およびＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫系の構成要素であり、循環リンパ球の約１５％を構成する。ＮＫ細胞は実質的にすべての組織に浸潤し、最初は、事前感作を必要とせずに腫瘍細胞を効果的に殺傷するそれらの能力によって特徴付けられた。活性化されたＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と同様の手段によって、すなわち、パーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞傷害性顆粒を介して、ならびに死受容体経路を介して、標的細胞を殺傷する。活性化されたＮＫ細胞はまた、標的組織への他の白血球の動員を促進するＩＦＮ−γおよびケモカインなどの炎症性サイトカインを分泌する。
ＮＫ細胞は、それらの表面における様々な活性化受容体および阻害受容体を介してシグナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇すると、それらの活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化によって阻害される。あるいはＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇すると、それらは、それらの活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞はまた、それらの表面におけるＣＤ１６受容体を介していくつかの免疫グロブリンの定常領域によって活性化される。活性化に対するＮＫ細胞の全体的な感受性は、刺激シグナルおよび阻害シグナルの合計に依存する。
ＣＤ３７（細胞表面抗原のテトラスパニンスーパーファミリーのメンバー）は、実質的に全ての成熟Ｂリンパ球上で発現されるが、プロＢ細胞または形質細胞上では発現されない。それは、系統特異的Ｂ細胞抗原であり、正常なＴ細胞、胸腺細胞、単球、顆粒球、血小板、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および赤血球上には存在しないかまたは最小限にしか発現されない。さらに、ＣＤ３７は、末梢成熟Ｂ細胞に由来する悪性腫瘍（例えば、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、非ホジキンリンパ腫、および急性骨髄性白血病）上で発現される。
ＣＤ２０は、プロＢ細胞相から成熟相までのＢ細胞分化の間にＢ細胞表面上で発現される活性化グリコシル化リンタンパク質である。それは、Ｂ細胞の発生および形質細胞への分化において役割を果たす。ＣＤ２０はまた、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、およびＢ細胞悪性腫瘍上で見出される。
ＣＤ１９は、Ｂ細胞芽球への発生の間に、最も早期の認識可能なＢ系統細胞からＢリンパ球の表面上に発現される膜貫通糖タンパク質である。それは主に、ＣＤ２１およびＣＤ８１とともに、Ｂ細胞共受容体として作用する。ＣＤ１９は、多くのがん（例えば、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、および急性骨髄性白血病）において発現される。
ＣＤ２２（Ｂ細胞限定リン糖タンパク質（Ｂ−ｃｅｌｌ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ））は、成熟Ｂ細胞の表面上で発現され、より低い程度には、いくらかの未成熟Ｂ細胞上で発現される。それは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達の阻害性受容体として機能する。さらに、ＣＤ２２は、がん細胞（例えば、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍、およびヘアリー細胞白血病）において発現される。
ＣＤ３０は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバー、特に、ＴＮＦＲ８である。ＣＤ３０は、活性化リンパ球およびいくつかの他の正常な細胞上で発現される。そのシグナル伝達は、ＮＦ−κＢ転写因子を活性化し、遺伝子機能の多面発現性調節を生じる。ＣＤ３０は、古典的なホジキンリンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、および胎児性細胞癌の特徴的なマーカーであり、攻撃的なＴ細胞およびＢ細胞新生物のサブセット上で発現される。正常な細胞上でのその限定した発現は、それを、標的化療法の魅力的な候補にする。
ＣＡＭＰＡＴＨ−１（分化抗原群５２（ＣＤ５２）としても公知）は、１２アミノ酸のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーペプチドである。ＣＤ５２は、成熟Ｂリンパ球およびＴリンパ球、単球、ならびに樹状細胞の細胞膜上に発現されるが、これらのリンパ球が由来する幹細胞上では発現されない。さらに、ＣＤ５２は、雄性生殖管内で見出され、成熟精子細胞の表面上に存在する。ＣＤ５２は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫およびＴ細胞性前リンパ球性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫、成熟Ｔ／ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞新生物、ならびに胸腺腫を含むある種のがんに関連する。
ＣＤ１３３は、ヒト造血幹細胞および前駆細胞において主に同定される５回膜貫通糖タンパク質（ｐｅｎｔａｓｐａｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。現在は、この表面受容体の生理学的役割は未知のままである。しかし、ＣＤ１３３は、種々の癌（乳がん、結腸がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、腎臓がん、子宮がんおよび精巣胚細胞がん、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、神経膠腫、膠芽腫ならびに頭頚部の扁平上皮癌が挙げられる）においてがん幹細胞のマーカーとして同定された。ＣＤ１３３は、ｐ８５と相互作用して、がん幹細胞においてＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を活性化し得、この活性化は、その結果として、がん幹細胞を刺激して、腫瘍形成能力を促進させる。
国際公開第２０１６／１３４３７１号 国際公開第２０１５／０９５４１２号
要旨
本発明は、ナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびにＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される腫瘍関連抗原に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。かかるタンパク質は２種類以上のＮＫ活性化受容体と会合することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を阻止し得る。ある特定の実施形態では、タンパク質は、ヒトにおいてＮＫ細胞を刺激し得る。一部の実施形態では、タンパク質は、ヒトならびにげっ歯動物およびカニクイザルなどの他の種においてＮＫ細胞を刺激し得る。本発明の様々な態様および実施形態を以下にさらに詳細に記載する。
したがって、本発明の一態様は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、ＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメイン、その一部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを組み込んだタンパク質を提供する。
抗原結合部位は各々、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメイン（例えば、抗体のように配列されるか、またはｓｃＦｖを形成するために一緒に融合される）を組み込んでいてもよいか、または抗原結合部位の１つもしくは複数は、ラクダ科抗体のようなＶＨＨ抗体もしくは軟骨魚類に見出されるもののようなＶＮＡＲ抗体などの単一ドメイン抗体であってもよい。
一態様では、本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびにＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される腫瘍関連抗原に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号１、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５、および配列番号９３から選択されるアミノ酸と少なくとも９０％同一な重鎖可変ドメインを含む。
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、一部の実施形態では、例えば配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有すること、ならびに／または、配列番号１のＣＤＲ１（配列番号１０５）、ＣＤＲ２（配列番号１０６）、およびＣＤＲ３（配列番号１０７）配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことにより、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込んでいてもよい。配列番号１に関する重鎖可変ドメインは、種々の軽鎖可変ドメインと結びついてＮＫＧ２Ｄ結合部位を形成することができる。例えば、配列番号１に関する重鎖可変ドメインを組み込む第１の抗原結合部位はさらに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および４０に関する配列のうちのいずれか１つから選択される軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一なアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および４０から選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一なアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込む。
代替的に、第１の抗原結合部位は、配列番号４１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号４２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または列番号４１のＣＤＲ１（配列番号４３）、ＣＤＲ２（配列番号４４）、およびＣＤＲ３（配列番号４５）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号４２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号４２のＣＤＲ１（配列番号４６）、ＣＤＲ２（配列番号４７）、およびＣＤＲ３（配列番号４８）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
他の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号４９に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号５０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号４９のＣＤＲ１（配列番号５１）、ＣＤＲ２（配列番号５２）、およびＣＤＲ３（配列番号５３）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号５０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号５０のＣＤＲ１（配列番号５４）、ＣＤＲ２（配列番号５５）、およびＣＤＲ３（配列番号５６）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、第１の抗原結合部位は、例えば、それぞれ、配列番号５７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である、および配列番号５８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有することによって、配列番号５７に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号５８に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。
別の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号５９に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号６０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号５９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号５９のＣＤＲ１（配列番号３２４）、ＣＤＲ２（配列番号３２５）、およびＣＤＲ３（配列番号３２６）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号６０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号６０のＣＤＲ１（配列番号３２７）、ＣＤＲ２（配列番号３２８）、およびＣＤＲ３（配列番号３２９）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、一部の実施形態では、配列番号６１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号６２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号６１のＣＤＲ１（配列番号６３）、ＣＤＲ２（配列番号６４）、およびＣＤＲ３（配列番号６５）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号６２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号６２のＣＤＲ１（配列番号６６）、ＣＤＲ２（配列番号６７）、およびＣＤＲ３（配列番号６８）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号６９に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号７０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号６９のＣＤＲ１（配列番号７１）、ＣＤＲ２（配列番号７２）、およびＣＤＲ３（配列番号７３）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号７０のＣＤＲ１（配列番号７４）、ＣＤＲ２（配列番号７５）、およびＣＤＲ３（配列番号７６）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号７７に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号７８に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号７７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号７７のＣＤＲ１（配列番号７９）、ＣＤＲ２（配列番号８０）、およびＣＤＲ３（配列番号８１）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号７８のＣＤＲ１（配列番号８２）、ＣＤＲ２（配列番号８３）、およびＣＤＲ３（配列番号８４）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号８５に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号８５のＣＤＲ１（配列番号８７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）、およびＣＤＲ３（配列番号８９）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）、およびＣＤＲ３（配列番号９２）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号９３に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号９４に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号９３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号９３のＣＤＲ１（配列番号９５）、ＣＤＲ２（配列番号９６）、およびＣＤＲ３（配列番号９７）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号９４のＣＤＲ１（配列番号９８）、ＣＤＲ２（配列番号９９）、およびＣＤＲ３（配列番号１００）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、例えば、それぞれ、配列番号１０１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である、および配列番号１０２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有することによって、配列番号１０１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１０２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、例えば、それぞれ、配列番号１０３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である、および配列番号１０４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有することによって、配列番号１０３に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１０４に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、ＣＤ３７に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１０９に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１１３に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１０９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１０９のＣＤＲ１（配列番号１１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１１）、およびＣＤＲ３（配列番号１１２）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１１３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１１３のＣＤＲ１（配列番号１１４）、ＣＤＲ２（配列番号１１５）、およびＣＤＲ３（配列番号１１６）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
ＣＤ３７に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号１１７に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１２１に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１１７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１１７のＣＤＲ１（配列番号１１８）、ＣＤＲ２（配列番号１１９）、およびＣＤＲ３（配列番号１２０）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１２１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１２１のＣＤＲ１（配列番号１２２）、ＣＤＲ２（配列番号１２３）、およびＣＤＲ３（配列番号１２４）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
ＣＤ３７に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号１２５に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１２９に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１２５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１２５のＣＤＲ１（配列番号１２６）、ＣＤＲ２（配列番号１２７）、およびＣＤＲ３（配列番号１２８）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１２９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１２９のＣＤＲ１（配列番号１３０）、ＣＤＲ２（配列番号１３１）、およびＣＤＲ３（配列番号１３２）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、ＣＤ２０に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１３４に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１３８に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１３４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１３４のＣＤＲ１（配列番号１３５）、ＣＤＲ２（配列番号１３６）、およびＣＤＲ３（配列番号１３７）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１３８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１３８のＣＤＲ１（配列番号１３９）、ＣＤＲ２（配列番号１４０）、およびＣＤＲ３（配列番号１４１）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ２０に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号１４２に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１４６に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１４２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１４２のＣＤＲ１（配列番号１４３）、ＣＤＲ２（配列番号１４４）、およびＣＤＲ３（配列番号１４５）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１４６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１４６のＣＤＲ１（配列番号１４７）、ＣＤＲ２（配列番号１４８）、およびＣＤＲ３（配列番号１４９）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
ＣＤ２０に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号１５０に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１５４に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１５０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１５０のＣＤＲ１（配列番号１５１）、ＣＤＲ２（配列番号１５２）、およびＣＤＲ３（配列番号１５３）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１５４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１５４のＣＤＲ１（配列番号１５５）、ＣＤＲ２（配列番号１５６）、およびＣＤＲ３（配列番号１５７）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ２０に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号１５８に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１６２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１５８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１５８のＣＤＲ１（配列番号１５９）、ＣＤＲ２（配列番号１６０）、およびＣＤＲ３（配列番号１６１）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１６３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１６２のＣＤＲ１（配列番号１６３）、ＣＤＲ２（配列番号１６４）、およびＣＤＲ３（配列番号１６５）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ２０に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号１６６に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１７０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１６６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１６６のＣＤＲ１（配列番号１６７）、ＣＤＲ２（配列番号１６８）、およびＣＤＲ３（配列番号１６９）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１７０のＣＤＲ１（配列番号１７１）、ＣＤＲ２（配列番号１７２）、およびＣＤＲ３（配列番号１７３）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号１７５に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１７９に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１７５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１７５のＣＤＲ１（配列番号１７６）、ＣＤＲ２（配列番号１７７）、およびＣＤＲ３（配列番号１７８）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１７９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１７９のＣＤＲ１（配列番号１８０）、ＣＤＲ２（配列番号１８１）、およびＣＤＲ３（配列番号１８２）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号１８３に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１８７に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１８３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１８３のＣＤＲ１（配列番号１８４）、ＣＤＲ２（配列番号１８５）、およびＣＤＲ３（配列番号１８６）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１８７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１８７のＣＤＲ１（配列番号１８８）、ＣＤＲ２（配列番号１８９）、およびＣＤＲ３（配列番号１９０）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号１９１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１９５に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１９１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１９１のＣＤＲ１（配列番号１９２）、ＣＤＲ２（配列番号１９３）、およびＣＤＲ３（配列番号１９４）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１９５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１９５のＣＤＲ１（配列番号１９６）、ＣＤＲ２（配列番号１９７）、およびＣＤＲ３（配列番号１９８）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号１９９に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２０３に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１９９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１９９のＣＤＲ１（配列番号２００）、ＣＤＲ２（配列番号２０１）、およびＣＤＲ３（配列番号２０２）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２０３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２０３のＣＤＲ１（配列番号２０４）、ＣＤＲ２（配列番号２０５）、およびＣＤＲ３（配列番号２０６）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号２０８に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２１２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２０８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２０８のＣＤＲ１（配列番号２０９）、ＣＤＲ２（配列番号２１０）、およびＣＤＲ３（配列番号２１１）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２１２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２１２のＣＤＲ１（配列番号２１３）、ＣＤＲ２（配列番号２１４）、およびＣＤＲ３（配列番号２１５）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号２１６に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２２０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２１６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２１６のＣＤＲ１（配列番号２１７）、ＣＤＲ２（配列番号２１８）、およびＣＤＲ３（配列番号２１９）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２２０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２２０のＣＤＲ１（配列番号２２１）、ＣＤＲ２（配列番号２２２）、およびＣＤＲ３（配列番号２２３）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。代替的に、ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号２２４に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２２８に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２２４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２２４のＣＤＲ１（配列番号２２５）、ＣＤＲ２（配列番号２２６）、およびＣＤＲ３（配列番号２２７）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２２８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２２８のＣＤＲ１（配列番号２２９）、ＣＤＲ２（配列番号２３０）、およびＣＤＲ３（配列番号２３１）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ３０に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号２３３に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２３７に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２３３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２３３のＣＤＲ１（配列番号２３４）、ＣＤＲ２（配列番号２３５）、およびＣＤＲ３（配列番号２３６）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２３７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２３７のＣＤＲ１（配列番号２３８）、ＣＤＲ２（配列番号２３９）、およびＣＤＲ３（配列番号２４０）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ３０に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号２４１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２４５に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２４１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２４１のＣＤＲ１（配列番号２４２）、ＣＤＲ２（配列番号２４３）、およびＣＤＲ３（配列番号２４４）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２４５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２４５のＣＤＲ１（配列番号２４６）、ＣＤＲ２（配列番号２４７）、およびＣＤＲ３（配列番号２４８）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ３０に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号２４９に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２５３に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２４９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２４９のＣＤＲ１（配列番号２５０）、ＣＤＲ２（配列番号２５１）、およびＣＤＲ３（配列番号２５２）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２５３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２５３のＣＤＲ１（配列番号２５４）、ＣＤＲ２（配列番号２５５）、およびＣＤＲ３（配列番号２５６）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ３０に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号２５７に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２６１に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２５７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２５７のＣＤＲ１（配列番号２５８）、ＣＤＲ２（配列番号２５９）、およびＣＤＲ３（配列番号２６０）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２６１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２６１のＣＤＲ１（配列番号２６２）、ＣＤＲ２（配列番号２６３）、およびＣＤＲ３（配列番号２６４）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ３０に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号２６５に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２６９に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２６５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２６５のＣＤＲ１（配列番号２６６）、ＣＤＲ２（配列番号２６７）、およびＣＤＲ３（配列番号２６８）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２６９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２６９のＣＤＲ１（配列番号２７０）、ＣＤＲ２（配列番号２７１）、およびＣＤＲ３（配列番号２７２）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、ＣＤ５２に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号２７４に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２７８に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２７４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２７４のＣＤＲ１（配列番号２７５）、ＣＤＲ２（配列番号２７６）、およびＣＤＲ３（配列番号２７８）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２７８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２７８のＣＤＲ１（配列番号２７９）、ＣＤＲ２（配列番号２８０）、およびＣＤＲ３（配列番号２８１）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ５２に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号２８２に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２８６に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２８２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２８２のＣＤＲ１（配列番号２８３）、ＣＤＲ２（配列番号２８４）、およびＣＤＲ３（配列番号２８５）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２８６のＣＤＲ１（配列番号２８７）、ＣＤＲ２（配列番号２８８）、およびＣＤＲ３（配列番号２８９）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、ＣＤ１３３に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号２９１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２９５に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２９１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２９１のＣＤＲ１（配列番号２９２）、ＣＤＲ２（配列番号２９３）、およびＣＤＲ３（配列番号２９４）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２９５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２９５のＣＤＲ１（配列番号２９６）、ＣＤＲ２（配列番号２９７）、およびＣＤＲ３（配列番号２９８）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ１３３に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号２９９に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号３０３に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２９９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２９９のＣＤＲ１（配列番号３００）、ＣＤＲ２（配列番号３０１）、およびＣＤＲ３（配列番号３０２）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号３０３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号３０３のＣＤＲ１（配列番号３０４）、ＣＤＲ２（配列番号３０５）、およびＣＤＲ３（配列番号３０６）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ１３３に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号３０７に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号３１１に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３０７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号３０７のＣＤＲ１（配列番号３０８）、ＣＤＲ２（配列番号３０９）、およびＣＤＲ３（配列番号３１０）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号３１１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号３１１のＣＤＲ１（配列番号３１２）、ＣＤＲ２（配列番号３１３）、およびＣＤＲ３（配列番号３１４）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、ＣＤ１３３に結合する第２の抗原結合部位は、必要に応じて、配列番号３１５に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号３１９に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３１５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号３１５のＣＤＲ１（配列番号３１６）、ＣＤＲ２（配列番号３１７）、およびＣＤＲ３（配列番号３１８）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号３１９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号３１９のＣＤＲ１（配列番号３２０）、ＣＤＲ２（配列番号３２１）、およびＣＤＲ３（配列番号３２２）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、第１の抗原結合部位に存在する軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。
一部の実施形態では、本タンパク質は、ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメインの一部分を組み込んでおり、ここで抗体Ｆｃドメインは、ヒンジおよびＣＨ２ドメイン、および／またはヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸配列２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれか１つを含有する製剤、このタンパク質を発現する１つまたは複数の核酸を含有する細胞、およびこのタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法も提供される。
本発明の別の態様は、患者のがんを処置する方法を提供する。本方法は、それを必要とする患者に、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を治療有効量で投与することを含む。ＣＤ３７を標的とする多重特異性結合タンパク質を使用して処置するがんとして、ＣＤ３７を発現する任意のがん、例えば、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、非ホジキンリンパ腫、および急性骨髄性白血病が挙げられる。ＣＤ２０を標的とする多重特異性結合タンパク質を使用して処置するがんとして、ＣＤ２０を発現する任意のがん、例えば、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、およびＢ細胞悪性腫瘍が挙げられる。ＣＤ１９を標的とする多重特異性結合タンパク質を使用して処置するがんとして、ＣＤ１９を発現する任意のがん、例えば、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍、多発性骨髄腫、および急性骨髄性白血病が挙げられる。ＣＤ２２を標的とする多重特異性結合タンパク質を使用して処置するがんとして、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍、およびヘアリー細胞白血病を発現する任意のがんが挙げられる。ＣＤ３０を標的とする多重特異性結合タンパク質を使用して処置するがんとして、ＣＤ３０を発現する任意のがん、例えば、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および胎児性細胞癌が挙げられる。ＣＤ５２を標的とする多重特異性結合タンパク質を使用して処置するがんとして、ＣＤ５２を発現する任意のがん、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫およびＴ細胞性前リンパ球性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫、成熟Ｔ／ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞新生物、ならびに胸腺腫が挙げられる。ＣＤ１３３を標的とする多重特異性結合タンパク質を使用して処置するがんとして、ＣＤ１３３を発現する任意のがん、例えば、乳がん、結腸がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、腎臓がん、子宮がん、精巣胚細胞がん、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、神経膠腫、膠芽腫、および頭頚部の扁平上皮癌が挙げられる。
図１は、ヘテロ二量体の多重特異性抗体の図である。各アームは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたはＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２またはＣＤ１３３の結合ドメインのいずれかを表し得る。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび抗原結合ドメインは、共通の軽鎖をもつ場合がある。
図２は、ヘテロ二量体の多重特異性抗体の図である。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたはＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される抗原への結合ドメインのいずれかは、ｓｃＦｖフォーマット（右アーム）をとることができる。
図３は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒト組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。
図４は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるカニクイザル組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。
図５は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるマウス組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。
図６は、フローサイトメトリーによる、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合を示す棒グラフであり、バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍率（ＦＯＢ）を示している。
図７は、フローサイトメトリーによる、マウスＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合を示す棒グラフであり、バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍率（ＦＯＢ）を示している。
図８は、天然リガンドＵＬＢＰ−６と競合することによる、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。
図９は、天然リガンドＭＩＣＡと競合することによる、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。
図１０は、天然リガンドＲａｅ−１デルタと競合することによる、組換えマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。
図１１は、ヒトＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ−α陽性細胞のパーセンテージを定量することにより、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフである。
図１２は、マウスＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ−α陽性細胞のパーセンテージを定量することにより、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフである。
図１３は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
図１４は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
図１５は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
図１６は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
図１７は、腫瘍細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の細胞傷害作用を示す棒グラフである。
図１８は、示差走査型蛍光定量法によって測定された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の融解温度を示す棒グラフである。
図１９Ａ〜１９Ｃは、ＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄ結合を使用したＮＫ細胞の相乗的活性化の棒グラフである。図１９ＡはＣＤ１０７ａのレベルを示し、図１９ＢはＩＦＮγのレベルを示し、図１９ＣはＣＤ１０７ａおよびＩＦＮγのレベルを示す。グラフは平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。データは、５名の異なる健康なドナーを使用した、５つの独立した実験を代表するものである。
図２０は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体であるＴｒｉｏｍａｂ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。このキメラは、２つの親抗体に由来する２つの半抗体からなり、各半抗体が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する。Ｔｒｉｏｍａｂ形態は、ラット抗体の１／２およびマウス抗体の１／２を含有するヘテロ二量体構築物であり得る。
図２１は、ノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ：ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）技術を用いるＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＫｉＨは、標的１および２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。ＫｉＨフォーマットにおけるＴｒｉＮＫＥＴは、２つの異なる重鎖と、両方の重鎖と対合する共通の軽鎖とを含有する、標的１および標的２に結合する２つのＦａｂを有するヘテロ二量体構築物であり得る。
図２２は、自然起源の可動性リンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）とは、抗原２を標的とする可変ドメインが、抗原１を標的とするＦａｂの可変ドメインのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である。構築物は通常のＦｃを含有する。
図２３は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つのＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である、直交性Ｆａｂ界面（オルト−Ｆａｂ）形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＬＣ−ＨＣの対合は、直交界面によって確実になっている。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける突然変異によって確実になっている。
図２４は、２ｉｎ１ ＩｇフォーマットにおけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。
図２５は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける静電的ステアリング突然変異によって確実になっている。
図２６は、Ｆａｂアーム交換形態におけるＴｒｉＮＫＥＴ、すなわち、重鎖および結合した軽鎖（半分子）を別の分子の重−軽鎖対とスワップすることによりＦａｂアームを交換した結果、二重特異性抗体となった抗体の図である。Ｆａｂアーム交換形態（ｃＦａｅ）は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。
図２７は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である、ＳＥＥＤ Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。
図２８は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーを使用する、ＬｕＺ−Ｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＬｕＺ−Ｙ形態は、Ｆｃに融合した標的１および２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含有するヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃのＣ末端に融合したロイシンジッパーモチーフによって確実になっている。
図２９は、Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。
図３０Ａおよび３０Ｂは、ヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、κλ−Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。抗原１を標的とするＦａｂ１はカッパＬＣを含有し、一方、抗原２を標的とする第２のＦａｂはラムダＬＣを含有する。図３０Ａは、κλ−Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり、図３０Ｂは、別のκλ−Ｂｏｄｙの例示的な図である。
図３１は、Ｆｃに融合した、標的１に結合するＦａｂと、標的２に結合するｓｃＦａｂとを含む、Ｏａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体構築物である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける突然変異によって確実になっている。
図３２は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂである。Ｆａｂ １および２は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）の正確な対合を確実にする特異な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）Ｓ−Ｓ架橋を含有する。
図３３は、ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合した標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂである。ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインと、ＶｈドメインおよびＶＬドメインとが切り換わっており、例えば、ＣＨ１は、ＶＬとインラインで融合しており、一方、ＣＬは、ＶＨとインラインで融合している。
図３４は、抗原２に結合するＦａｂが、抗原１に結合するＦａｂのＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ−Ｉｇである。この構築物は、野生型Ｆｃを含有する。
図３５は、ＥＬ４細胞上で発現されるＮＫＧ２ＤへのＣＤ２０標的化ＴｒｉＮＫＥＴの結合を示すヒストグラムである。染色されていないＥＬ４細胞は、蛍光シグナルの陰性対照として使用した。染色されていない：黒塗り； Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０：実線； ＣＤ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０：破線。
図３６は、Ｒａｊｉヒトリンパ腫細胞上で発現されるＣＤ２０へのＣＤ２０標的化ＴｒｉＮＫＥＴの結合を示すヒストグラムである。染色されていない細胞は、蛍光シグナルの陰性対照として使用した。染色されていない：黒塗り； Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０：実線； ＣＤ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０：破線。
図３７は、ヒトＮＫ細胞が、これらをＣＤ２０＋ Ｒａｊｉ Ｂ細胞リンパ腫細胞と共培養した場合に、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されたことを示す（ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γ二重陽性細胞の増加によって示される）棒グラフである。
図３８は、ＣＤ２０発現Ｒａｊｉ Ｂ細胞リンパ腫細胞に向けたヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介性細胞傷害性活性を示す線グラフである。
図３９は、ＴｒｉＮＫＥＴが、親の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体よりもＣＤ２０発現Ｒａｊｉ Ｂ細胞リンパ腫細胞に対して高いＮＫ細胞の細胞傷害性を媒介したことを示す線グラフである。
詳細な説明
本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびにＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される腫瘍関連抗原に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質はさらに、腫瘍関連抗原に結合するさらなる抗原結合部位を含む。本発明は、かかる多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに、がんの処置などの目的のためのかかる多重特異性タンパク質および医薬組成物を使用する治療方法も提供する。本発明の様々な態様を複数のセクションに分けて以下に記述する。しかしながら、１つの特定のセクションに記載される本発明の態様は、いずれかの特定のセクションに限定されるものではない。
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および句を以下に定義する。
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、「１つまたは複数」を意味し、文脈が不適切でない限り、複数を含む。
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部分を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知である、より保存された隣接するストレッチの間に介在している「超可変領域」と称される。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンにおける超可変領域の間におよびそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するように三次元空間において互いに対して配置される。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。ラクダおよび軟骨魚類などのある特定の動物において、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」を提供する単一抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、インタクトな抗体中、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合断片中、またはｓｃＦｖなどの組換えポリペプチド中に存在し、ペプチドリンカーを使用して単一ポリペプチドにおいて重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに連結することができる。
本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」という用語は、がんに関連するタンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含むがこれらに限定されない、任意の抗原を意味する。このような抗原は、悪性細胞において、または腫瘍関連血管、細胞外マトリックス、間葉系間質、もしくは免疫浸潤物におけるような腫瘍微小環境中で発現され得る。
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載の方法および組成物によって処置される生物を指す。かかる生物には、好ましくは、限定されないが、哺乳動物（例えば、ネズミ、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれ、より好ましくはヒトが含まれる。
本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬量で投与されてもよく、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図しない。本明細書中で使用される場合、「処置する」という用語は、何らかの効果、例えば、状態、疾患、障害などの好転をもたらす、減少、低減、モジュレート、改善もしくは除去、またはそれらの症状の改善を含む。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、組成物を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断的使用または治療的使用に特に適切にする、活性剤と、不活性または活性な担体との組合せを指す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水または水／油エマルションなど）、および種々の種類の湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかを指す。組成物はまた、安定剤および保存剤を含んでもよい。担体、安定剤およびアジュバントの例に関しては、例えば、Ｍａｒｔｉｎ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ［１９７５年］を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象に投与すると、本発明の化合物またはその活性代謝産物もしくは残留物を提供することができる、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者に公知であるように、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基から誘導され得る。例示的な酸には、限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが含まれる。シュウ酸などの他の酸は、それら自体では薬学的に許容されないが、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製に利用され得る。
例示的な塩基には、限定されないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニアおよび式ＮＷ４ ＋（式中、ＷはＣ１〜４アルキルである）の化合物などが含まれる。
例示的な塩には、限定されないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが含まれる。塩の他の例には、Ｎａ＋、ＮＨ４ ＋およびＮＷ４ ＋（式中、ＷはＣ１〜４アルキル基である）などの適切なカチオンと配合された本発明の化合物のアニオンが含まれる。
治療的使用のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されると意図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において使用することができる。
組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されているか、またはプロセスおよび方法が特定のステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている説明全体にわたって、さらに、列挙された成分から本質的になる、またはそれからなる本発明の組成物が存在すること、ならびに列挙されたプロセスステップから本質的になる、またはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが意図される。
一般的事項として、パーセンテージを特定する組成物は、特に明記しない限り、重量による。さらに、変数が定義を伴わない場合、変数の以前の定義が優先する。
Ｉ．タンパク質
本発明は、ナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、およびＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される腫瘍関連抗原に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書に記載の医薬組成物および治療方法において有用である。ナチュラルキラー細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に多重特異性結合タンパク質が結合すると、ＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２またはＣＤ１３３抗原を発現する腫瘍細胞の破壊を目的としたナチュラルキラー細胞の活性が増強される。ＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２またはＣＤ１３３発現細胞に多重特異性結合タンパク質が結合すると、がん細胞がナチュラルキラー細胞に近接するため、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的および間接的な破壊が容易になる。一部の例示的な多重特異性結合タンパク質のさらなる記載を以下に提供する。
多重特異性結合タンパク質の第１の構成要素は、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８＋αβＴ細胞を含み得るがこれらに限定されない、ＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合する。多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合すると、ＵＬＢＰ６およびＭＩＣＡなどの天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合することおよびＮＫＧ２Ｄ受容体を活性化することを阻止し得る。
多重特異性結合タンパク質の第２成分は、ＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２またはＣＤ１３３に結合する。ＣＤ３７発現細胞は、例えば、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、非ホジキンリンパ腫、および急性骨髄性白血病において見出され得る。ＣＤ２０発現細胞は、例えば、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、およびＢ細胞悪性腫瘍において見出され得る。ＣＤ１９発現細胞は、例えば、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍、多発性骨髄腫、および急性骨髄性白血病において見出され得る。ＣＤ２２発現細胞は、例えば、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍、およびヘアリー細胞白血病において見出され得る。ＣＤ３０発現細胞は、例えば、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および胎児性細胞癌において見出され得る。ＣＤ５２発現細胞は、例えば、これらに限定されないが、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫およびＴ細胞性前リンパ球性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫、成熟Ｔ／ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞新生物、ならびに胸腺腫において見出され得る。ＣＤ１３３発現細胞は、例えば、これらに限定されないが、乳がん、結腸がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、腎臓がん、子宮がん、精巣胚細胞がん、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、神経膠腫、膠芽腫、および頭頚部の扁平上皮癌において見出され得る。
多重特異性結合タンパク質の第３の構成要素は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞、および濾胞性樹状細胞を含む白血球の表面にあるＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する。
本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、様々なフォーマットをとることができる。例えば、１つのフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖、および第２の免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体の多重特異性抗体（図１）である。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインと、第１の重鎖可変ドメインと、必要に応じて第１のＣＨ１重鎖ドメインとを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の軽鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖定常ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と一緒に、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインと、第２の重鎖可変ドメインと、必要に応じて第２のＣＨ１重鎖ドメインとを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の軽鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン重鎖と一緒に、ＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２またはＣＤ１３３に結合する抗原結合部位を形成する。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒にＣＤ１６に結合することができる（図１）。一部の実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン軽鎖と同一である。
別の例示的フォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体の多重特異性抗体（図２）に関する。第１の免疫グロブリン重鎖は、対合し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、またはＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される抗原に結合する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して融合している、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインと、第２の重鎖可変ドメインと、必要に応じてＣＨ１重鎖ドメインとを含む。この免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖と対合し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、またはＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される腫瘍関連抗原に結合する。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒にＣＤ１６に結合することができる（図２）。
１つまたは複数のさらなる結合モチーフが、必要に応じてリンカー配列を介して、定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合され得る。ある特定の実施形態では、抗原結合部位は、一本鎖もしくはジスルフィド安定化可変領域（ｓｃＦｖ）であり得るか、または四価もしくは三価の分子を形成し得る。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体である、Ｔｒｉｏｍａｂ形態である。このキメラは、２つの親抗体に由来する２つの半抗体からなり、各半抗体が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ）技術を用いるＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態である。ＫＩＨは、ヘテロ二量体化を促進するために、ＣＨ３ドメインを工学操作して各重鎖に「ノブ」または「ホール」のいずれかを作出することを伴う。「ノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）」Ｆｃ技術の背後にある概念は、小さな残基を嵩高の残基で置換することにより、１つのＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）に「ノブ」（例えば、ＥＵ付番でＴ３６６ＷＣＨ３Ａ）を導入することであった。この「ノブ」に適応するように、他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）において、ノブに最も近い隣接残基をより小さな残基に置き換えること（例えば、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７ＶＣＨ３Ｂ）により、相補的な「ホール」表面が作出された。「ホール」突然変異は、構造情報に基づくファージライブラリスクリーニング（Ａｔｗｅｌｌ Ｓ、Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ、Ｗｅｌｌｓ ＪＡ、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．、Ｓｔａｂｌｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｏｆ ａ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９７年）２７０巻（１号）：２６〜３５頁）によって最適化された。ＫｉＨ Ｆｃ変異体のＸ線結晶構造（Ｅｌｌｉｏｔｔ ＪＭ、Ｕｌｔｓｃｈ Ｍ、Ｌｅｅ Ｊ、Ｔｏｎｇ Ｒ、Ｔａｋｅｄａ Ｋ、Ｓｐｉｅｓｓ Ｃら、Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ＣＨ２−ＣＨ３ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１４年）４２６巻（９号）：１９４７〜５７頁、Ｍｉｍｏｔｏ Ｆ、Ｋａｄｏｎｏ Ｓ、Ｋａｔａｄａ Ｈ、Ｉｇａｗａ Ｔ、Ｋａｍｉｋａｗａ Ｔ、Ｈａｔｔｏｒｉ Ｋ． Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ＦｃγＲｓ． Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１４年）５８巻（１号）：１３２〜８頁）は、ＣＨ３ドメイン間のコア界面では、立体的相補性によって推進される疎水性相互作用がヘテロ二量体化に熱力学的に有利に働くが、ノブ−ノブおよびホール−ホールの界面は、それぞれ立体障害および好ましい相互作用の妨害が原因でホモ二量体化に有利に働かないことを示した。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、自然起源の可動性リンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態におけるものである。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、直交性Ｆａｂ界面（オルト−Ｆａｂ）形態におけるものである。オルト−Ｆａｂ ＩｇＧアプローチ（Ｌｅｗｉｓ ＳＭ、Ｗｕ Ｘ、Ｐｕｓｔｉｌｎｉｋ Ａ、Ｓｅｒｅｎｏ Ａ、Ｈｕａｎｇ Ｆ、Ｒｉｃｋ ＨＬら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｆａｂ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４年）３２巻（２号）：１９１〜８頁）では、構造に基づく領域デザインにより、一方のＦａｂにおけるＬＣおよびＨＣＶＨ−ＣＨ１の界面にのみ相補的突然変異が導入され、他方のＦａｂが変化することはない。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２ｉｎ１ Ｉｇフォーマットにおけるものである。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態におけるものである。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける静電的ステアリング突然変異によって確実になっている。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、κλ−Ｂｏｄｙ形態におけるものである。抗原１を標的とするＦａｂ１はカッパＬＣを含有し、一方、抗原２を標的とする第２のＦａｂはラムダＬＣを含有する。図３０Ａは、κλ−Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり、図３０Ｂは、別のκλ−Ｂｏｄｙの例示的な図である。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆａｂアーム交換形態（重鎖および結合した軽鎖（半分子）を別の分子の重鎖−軽鎖対とスワップすることによりＦａｂアームを交換した結果、二重特異性抗体となった抗体）である。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＳＥＥＤ Ｂｏｄｙ形態におけるものである。ＳＥＥＤ（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ）プラットフォームは、天然抗体の治療用途を広げる可能性がある非対称かつ二重特異性抗体様の分子を生成するためにデザインされた。このタンパク質工学操作プラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメインにおける免疫グロブリンの構造的に関連した配列の交換に基づく。ＳＥＥＤデザインは、ＡＧおよびＧＡ ＳＥＥＤ ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避しつつ、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効果的な生成を可能にする（Ｍｕｄａ Ｍ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ．（２０１１年、２４巻（５号）：４４７〜５４頁））。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーを使用する、ＬｕＺ−Ｙ形態におけるものである（Ｗｒａｎｉｋ， ＢＪ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（２０１２年）、２８７巻：４３３３１〜９頁）。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙ形態におけるものである。二重特異性ＣｏｖＸ−Ｂｏｄｙでは、分枝状のアゼチジノンリンカーを使用して２つの異なるペプチドをひとつに結合させ、温和な条件下にてスキャフォールド抗体に部位特異的様式で融合させる。機能的活性に関与するのはファルマコフォアだが、抗体スキャフォールドは長い半減期およびＩｇ様の分布をもたらす。最適化された、または独特の二重特異性抗体を生成するために、ファルマコフォアは化学的に最適化するか、または他のファルマコフォアに置き換えることができる（Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ ＶＲら、ＰＮＡＳ（２０１０年）、１０７巻（５２号）；２２６１１〜２２６１６頁）。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合した、標的１に結合するＦａｂと、標的２に結合するｓｃＦａｂとを含む、Ｏａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体形態におけるものである。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける突然変異によって確実になっている。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂ形態におけるものである。Ｆａｂ１および２は、ＬＣおよびＨＣの正確な対合を確実にする特異なＳ−Ｓ架橋を含有する。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合した、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態におけるものである。ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインと、ＶＨドメインおよびＶＬドメインとが切り換わっており、例えば、ＣＨ１は、ＶＬとインラインで融合しており、ＣＬは、ＶＨとインラインで融合している。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原２に結合するＦａｂが、抗原１に結合するＦａｂのＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ−Ｉｇ形態におけるものである。この構築物は、野生型Ｆｃを含有する。
表１は、組み合わせてＮＫＧ２Ｄと結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を記載している。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに対するそれらの結合親和性において変動し得、にも拘わらず、それらは全て、ヒトＮＫＧ２ＤおよびＮＫ細胞を活性化する。
代替的に、ＵＳ９，２７３，１３６において説明されているように、配列番号１０１によって表される重鎖可変ドメインを、配列番号１０２によって表される軽鎖可変ドメインと対合させて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成してもよい。
代替的に、ＵＳ７，８７９，９８５において説明されているように、配列番号１０３によって表される重鎖可変ドメインを、配列番号１０４によって表される軽鎖可変ドメインと対合させて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成してもよい。
一態様では、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに抗原ＣＤ３７に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。表２は、組み合わせて、ＣＤ３７に結合し得る重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのいくつかの例示的配列を列記する。
代替的に、ＣＤ３７に結合することができる新規の抗原結合部位は、配列番号１３３によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定することができる。
一態様では、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに抗原ＣＤ２０に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。表３は、組み合わせて、ＣＤ２０に結合し得る重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのいくつかの例示的ペプチド配列を列記する。
代替的に、ＣＤ２０に結合することができる新規の抗原結合部位は、配列番号１７４によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定することができる。
一態様では、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに抗原ＣＤ１９に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。表４は、組み合わせて、ＣＤ１９に結合し得る重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのいくつかの例示的ペプチド配列を列記する。
代替的に、ＣＤ１９に結合することができる新規の抗原結合部位は、配列番号２０７によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定することができる。
一態様では、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに抗原ＣＤ２２に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。表５は、組み合わせて、ＣＤ２２に結合し得る重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのいくつかの例示的ペプチド配列を列記する。
ＣＤ２２に結合する抗原結合部位は、配列番号２３２によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定することができる。
一態様では、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに抗原ＣＤ３０に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。表６は、組み合わせて、ＣＤ３０に結合し得る重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのいくつかの例示的ペプチド配列を列記する。
代替的に、ＣＤ３０に結合することができる新規の抗原結合部位は、配列番号２７３によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定することができる。
一態様では、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに抗原ＣＤ５２に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。表７は、組み合わせて、ＣＤ５２に結合し得る重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのいくつかの例示的ペプチド配列を列記する。
代替的に、ＣＤ５２に結合することができる新規の抗原結合部位は、配列番号２９０によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定することができる。
一態様では、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに抗原ＣＤ１３３に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。表８は、組み合わせて、ＣＤ１３３に結合し得る重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのいくつかの例示的ペプチド配列を列記する。
代替的に、ＣＤ１３３に結合することができる新規の抗原結合部位は、配列番号３２３によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定することができる。
Ｆｃドメイン内で、ＣＤ１６結合はヒンジ領域およびＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内で、ＣＤ１６との相互作用は主に、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５〜Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７〜Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７〜Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９、およびＣＨ２ドメインにおける炭水化物残基Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに焦点が当てられている（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４０６巻（６７９３号）：２６７〜２７３頁を参照されたい）。既知のドメインに基づいて、突然変異は、ファージディスプレイライブラリもしくは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリを使用することなどによって、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強もしくは低減させるように選択され得るか、または相互作用の既知の三次元構造に基づいてデザインされ得る。
ヘテロ二量体抗体重鎖の構築は、同じ細胞内で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることによって達成することができ、これにより、各抗体重鎖のホモ二量体の構築およびヘテロ二量体の構築をもたらすことができる。ヘテロ二量体の選択的構築の促進は、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０および、ＵＳ１４／８３０３３６に示されているように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン内に異なる突然変異を組み込むことによって達成することができる。例えば、突然変異は、ヒトＩｇＧ１に基づき、これらの２つの鎖が互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にする第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド内にアミノ酸置換の異なる対を組み込んでいるＣＨ３ドメイン内で作製され得る。以下に例示したアミノ酸置換の位置は、Ｋａｂａｔにおけるように、すべてＥＵインデックスに従って番号付けしている。
１つの状況では、第１のポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）から選択される、より大きなアミノ酸で置換し、第２のポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、より大きなアミノ酸置換（突出）が、より小さなアミノ酸置換（空洞）の表面に適合するように、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）から選択される、より小さなアミノ酸で置換する。例えば、一方のポリペプチドはＴ３６６Ｗ置換を組み込むことができ、他方のポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込むことができる。
本発明の抗体重鎖可変ドメインは、必要に応じて、ＣＨ１ドメインを有するまたは有さないヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域などの、抗体定常領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と連結され得る。一部の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域などの、ヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。一部の他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマなどの別の哺乳動物由来の抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。１つまたは複数の突然変異が、ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１および／またはＫ４３９において定常領域に組み込まれ得る。例示的な置換には、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅが含まれる。
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込まれ得る突然変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、および／またはＶ１７３であり得る。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込まれ得る突然変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、および／またはＴ１６４であり得る。
代替的に、アミノ酸置換は以下の表９にされる置換のセットから選択され得る。
代替的に、アミノ酸置換は以下の表１０に示される置換のセットから選択され得る。
代替的に、アミノ酸置換は以下の表１１に示される置換のセットから選択され得る。
代替的に、各ポリペプチド鎖における少なくとも１つのアミノ酸置換は表１２から選択され得る。
代替的に、以下の表１３における置換のセットから少なくとも１つのアミノ酸置換を選択してもよく、ここで「第１のポリペプチド」欄に示される位置は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、「第２のポリペプチド」欄に示される位置は、任意の公知の正に帯電したアミノ酸に置き換えられる。
代替的に、以下の表１４におけるセットから少なくとも１つのアミノ酸置換を選択してもよく、ここで「第１のポリペプチド」欄に示される位置は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、「第２のポリペプチド」欄に示される位置は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられる。
代替的に、アミノ酸置換は、以下の表１５に示されるセットから選択してもよい。
代替的にまたは付加的に、ヘテロ多量体タンパク質の構造安定性は、第１または第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃを導入し、反対のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入することによって増加させることができ、これにより、２つのポリペプチドの界面内で人工ジスルフィド架橋が形成する。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６位においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６位においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、およびＴ４１１からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、およびＴ４１１からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０、およびＫ４０９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７およびＫ４０９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｏ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｏ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
上記の多重特異性タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列を第１の発現ベクターにクローニングすることができ、第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列を第２の発現ベクターにクローニングすることができ、免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列を第３の発現ベクターにクローニングすることができ、第１、第２および第３の発現ベクターを一緒に宿主細胞に安定にトランスフェクトして多量体タンパク質を産生することができる。
多重特異性タンパク質の最も高い収率を達成するために、第１、第２および第３の発現ベクターの異なる比率を調べて宿主細胞へのトランスフェクションのための最適比率を決定することができる。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法、またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当技術分野において公知の方法を使用して、細胞バンク生成のために単一クローンを単離することができる。
クローンは、バイオリアクタスケールアップに適した条件下で培養することができ、多重特異性タンパク質の発現を維持することができる。多重特異性タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、均質化、凍結融解、親和性精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、およびミックスモードクロマトグラフィーを含む、当技術分野において公知の方法を使用して単離され、精製され得る。
ＩＩ．多重特異性タンパク質の特徴
本明細書で記載される多重特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位、ＣＤ１６結合部位、およびＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される腫瘍関連抗原の結合部位を含む。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＣＤ１６を発現する細胞（例えば、ＮＫ細胞）、ならびに上記の抗原のうちのいずれか１つを同時に発現する腫瘍細胞に結合する。ＮＫ細胞への多重特異性タンパク質の結合は、がん細胞の破壊に向けたＮＫ細胞の活性を増強し得る。
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される腫瘍関連抗原に、同じそれぞれの抗原結合部位を有するモノクローナル抗体の親和性に類似の親和性で結合する。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、その抗原（複数可）を発現する腫瘍細胞の殺滅において、対応するそれぞれのモノクローナル抗体より有効である。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位およびＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される腫瘍関連抗原の結合部位を含む本明細書で記載される多重特異性タンパク質は、それぞれＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３を発現する細胞と共培養すると、初代ヒトＮＫ細胞を活性化する。ＮＫ細胞活性化は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮγサイトカイン産生の増加によって示される。さらに、対応するそれぞれのモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、抗原ＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２またはＣＤ１３３を発現する細胞の存在下において、ヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示し得る。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位およびＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３から選択される腫瘍関連抗原の結合部位を含む本明細書で記載される多重特異性タンパク質は、ＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３を発現する細胞と共培養して、ヒト休止およびＩＬ−２活性化ＮＫ細胞の活性を増強する。
ある特定の実施形態では、ＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２またはＣＤ１３３に結合する対応するモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、中程度レベルおよび低レベルのＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２およびＣＤ１３３を発現する腫瘍細胞を標的とするにあたって利点を提供する。
ＩＩＩ．治療用途
本発明は、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質および／または本明細書に記載の医薬組成物を使用してがんを処置するための方法を提供するその方法は、ＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２またはＣＤ１３３を発現する種々のがんを処置するために使用され得る。ＣＤ３７を標的とする多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんは、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、非ホジキンリンパ腫、または急性骨髄性白血病であり得る。ＣＤ２０を標的とする多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんは、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、またはＢ細胞悪性腫瘍であり得る。ＣＤ１９を標的とする多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんは、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍、多発性骨髄腫、または急性骨髄性白血病であり得る。ＣＤ２２を標的とする多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんは、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍、またはヘアリー細胞白血病であり得る。ＣＤ３０を標的とする多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんは、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、または胎児性細胞癌であり得る。ＣＤ５２を標的とする多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫およびＴ細胞性前リンパ球性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫、成熟Ｔ／ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞新生物、または胸腺腫であり得る。ＣＤ１３３を標的とする多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんは、乳がん、結腸がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、腎臓がん、子宮がん、精巣胚細胞がん、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、神経膠腫、膠芽腫、または頭頚部の扁平上皮癌であり得る。
一部の他の実施形態では、処置されるがんとしては、脳がん、直腸がん、および子宮がんが挙げられる。さらに他の実施形態では、がんは、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭がん、耳下腺がん、胆道がん、甲状腺がん、末端黒子型黒色腫、日光角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌（ａｄｅｎｏｉｄ ｃｙｃｓｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管がん、肛門がん、肛門直腸がん、星細胞系腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆管がん、骨がん、骨髄がん、気管支がん、気管支腺癌、カルチノイド、胆管細胞癌、軟骨肉腫（ｃｈｏｎｄｏｓａｒｃｏｍａ）、脈絡叢乳頭腫／細胞腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織がん、嚢胞腺腫、消化器系がん、十二指腸がん、内分泌系がん、卵黄嚢腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞がん、上衣がん、上皮細胞がん、ユーイング肉腫、眼および眼窩のがん、女性性器がん、限局性結節性過形成、胆嚢がん、胃噴門がん、胃底部がん、ガストリン産生腫瘍、神経膠芽腫、グルカゴン産生腫瘍、心臓がん、血管芽腫（ｈｅｍａｎｇｉｂｌａｓｔｏｍａ）、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道がん、肝細胞癌、ホジキン病、回腸がん、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮間扁平細胞新生物（ｉｎｔｅｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、肝内胆管がん、浸潤性扁平上皮癌、空腸がん、関節がん、カポジ肉腫、骨盤がん、大細胞癌、大腸がん、平滑筋肉腫、悪性黒子由来黒色腫、リンパ腫、男性生殖器がん、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄上皮腫、髄膜がん、中皮がん、転移性癌、口がん、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉がん、鼻腔がん、神経系がん、神経上皮腺癌結節性黒色腫、非上皮性皮膚がん、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠細胞がん、口腔がん、骨肉腫、漿液性乳頭腺がん、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、直腸がん、腎細胞癌、呼吸器系がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性細胞腫、副鼻腔がん、皮膚がん、小細胞癌、小腸がん、平滑筋がん、軟部組織がん、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎がん、扁平上皮癌、横紋筋がん、中皮下がん、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌がん、未分化癌、尿管がん、尿道がん、膀胱がん、泌尿器系がん、子宮頸部がん、子宮体がん、ぶどう膜黒色腫、膣がん、疣状癌、ＶＩＰ産生腫瘍、外陰部がん、高分化癌、またはウィルムス腫瘍である。
ある特定の他の実施形態では、処置するがんは、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫である。ある特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、または原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫などのＢ細胞リンパ腫である。ある特定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、または末梢Ｔ細胞リンパ腫などのＴ細胞リンパ腫である。
ＩＶ．併用療法
本発明の別の態様は併用療法を提供する。本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、がんを処置するためにさらなる治療剤と組み合わせて使用され得る。
がんを処置する際の併用療法の一部として使用され得る例示的な治療剤には、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、チマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミゾール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−２アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、コロニー刺激因子−１、コロニー刺激因子−２、デニロイキンディフティトックス、インターロイキン−２、黄体形成ホルモン放出因子、ならびにその同種受容体に対して特異な結合、および増加したまたは減少した血清半減期を示し得る上述の薬剤の変形型が含まれる。
がんを処置する際の併用療法の一部として使用され得る薬剤のさらなるクラスは免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７−Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７−Ｈ４、および（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１つまたは複数を阻害する薬剤が含まれる。ＣＴＬＡ４阻害剤であるイピリムマブは、黒色腫を処置するために米国食品医薬品局によって承認されている。
がんを処置する際に併用療法の一部として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェックポイント標的を標的とするモノクローナル抗体薬剤（例えば、ハーセプチン）および非細胞傷害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。
抗がん剤のさらに他のカテゴリーには、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫおよびｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤＋２−クロロ−デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１およびＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ−ＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ならびにＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、またはＩＣＯＳのアゴニスト；ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦから選択されるサイトカインが含まれる。
本発明のタンパク質はまた、原発病巣の外科的除去の補助として使用され得る。
多重特異性結合タンパク質およびさらなる治療剤の量ならびに投与の相対的タイミングは、所望の併用療法効果を達成するために選択され得る。例えば、このような投与を必要とする患者に併用療法を投与する場合、組み合わせる治療剤、または治療剤を含む１つもしくは複数の医薬組成物は、例えば、連続的に、併せて、一緒に、同時になどの任意の順序で投与され得る。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、さらなる治療剤がその予防効果または治療効果を発揮する時間の間投与されてもよく、またはその逆であってもよい。
Ｖ．医薬組成物
本開示はまた、治療有効量の本明細書に記載のタンパク質を含有する医薬組成物を特徴とする。組成物は、種々の薬物送達系で使用されるように製剤化することができる。適切な製剤を作るために、１種または複数の生理学的に許容される賦形剤または担体を組成物に含めることもできる。本開示で使用される好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．、第１７版、１９８５年に見出される。薬物送達のための方法に関する簡潔な概説については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：１５２７〜１５３３頁、１９９０年）を参照されたい。
本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、または注射器に含有されてもよい。ある特定の実施形態では、バッグはチューブおよび／または針を含むチャネルに接続されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は凍結乾燥製剤または液体製剤であってもよい。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライ（凍結乾燥）されてもよく、約１２〜６０個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライされてもよく、４５ｍｇのフリーズドライされた製剤が１個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、約４０ｍｇ〜約１００ｍｇのフリーズドライされた製剤が１個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、１２、２７、または４５個のバイアルからのフリーズドライされた製剤は、静脈内薬物製剤中に治療用量のタンパク質を得るために組み合わされてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約２５０ｍｇ／バイアル〜約１０００ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約６００ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約２５０ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。
タンパク質は、製剤を形成する緩衝溶液中に治療有効量のタンパク質を含む液体水性医薬製剤中に存在することができる。
これらの組成物は従来の滅菌技術によって滅菌されてもよく、または濾過滅菌されてもよい。得られた水溶液はそのままで使用するためにパッケージ化されてもよく、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的に、３から１１の間、より好ましくは５から９の間または６から８の間、最も好ましくは７から８の間、例えば７〜７．５である。得られた固形の組成物は複数の単回用量単位でパッケージ化されてもよく、各々は一定量の上述の１つまたは複数の薬剤を含有する。固形の組成物はまた、柔軟な量のための容器にパッケージ化されてもよい。
ある特定の実施形態では、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水、および酸化ナトリウムと組み合わせて本開示のタンパク質を含む、延長された貯蔵寿命を有する製剤を提供する。
ある特定の実施形態では、ｐＨ緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含む水性製剤が調製される。本発明の緩衝液は、約４〜約８、例えば、約４．５〜約６．０、もしくは約４．８〜約５．５の範囲のｐＨを有してもよく、または約５．０〜約５．２のｐＨを有してもよい。上記に列挙したｐＨの中間の範囲も、本開示の一部であることが意図される。例えば、上限および／または下限として上記に列挙した値のいずれかの組合せを使用する値の範囲が含まれることが意図される。ｐＨをこの範囲内に制御する緩衝液の例には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸緩衝液が含まれる。
ある特定の実施形態では、製剤は、ｐＨを約４〜約８の範囲に維持するためにクエン酸塩およびリン酸塩を含有する緩衝系を含む。ある特定の実施形態では、ｐＨの範囲は、約４．５〜約６．０、または約ｐＨ４．８〜約５．５、または約５．０〜約５．２のｐＨ範囲であってもよい。ある特定の実施形態では、緩衝系には、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、および／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物が含まれる。ある特定の実施形態では、緩衝系は、約１．３ｍｇ／ｍｌのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍｌ）、約０．３ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍｌ）、約１．５ｍｇ／ｍｌのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍｌ）、約０．９ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６）、および約６．２ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍｌ）を含む。ある特定の実施形態では、緩衝系は、１〜１．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸、０．２５〜０．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム、１．２５〜１．７５ｍｇ／ｍｌのリン酸二ナトリウム二水和物、０．７〜１．１ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素ナトリウム二水和物、および６．０〜６．４ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムを含む。ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは水酸化ナトリウムを用いて調整される。
トニシファイヤー（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）として作用し、抗体を安定化させることができるポリオールも、製剤に含めることができる。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変化し得る量で製剤に添加される。ある特定の実施形態では、水性製剤は等張性であってもよい。添加されるポリオールの量も、ポリオールの分子量に関して変化し得る。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、少量の単糖（例えば、マンニトール）が添加されてもよい。ある特定の実施形態では、等張化剤として製剤に使用され得るポリオールはマンニトールである。ある特定の実施形態では、マンニトール濃度は約５〜約２０ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約７．５〜１５ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１０〜１４ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１２ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、ポリオールソルビトールを製剤に含めることができる。
洗剤または界面活性剤もまた、製剤に添加してもよい。例示的な洗剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロクサマー（例えば、ポロクサマー１８８）などの非イオン性洗剤が挙げられる。添加される洗剤の量は、製剤化された抗体の凝集を低減させ、かつ／または製剤中の微粒子の形成を最低限に抑え、かつ／または吸着を低減させるようなものである。ある特定の実施形態では、製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含み得る。ある特定の実施形態では、製剤は、洗剤のポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ ８０を含有し得る。Ｔｗｅｅｎ ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを表すために使用される用語である（Ｆｉｅｄｌｅｒ、Ｌｅｘｉｋｏｎ ｄｅｒ Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ、Ｅｄｉｔｉｏ Ｃａｎｔｏｒ Ｖｅｒｌａｇ Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ、第４版、１９９６年を参照されたい）。ある特定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの間のポリソルベート８０、または約０．５ｍｇ／ｍＬから約５ｍｇ／ｍＬの間を含有し得る。ある特定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０が製剤に添加され得る。
実施形態では、本開示のタンパク質産物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉じ、アルミニウムクリンプシールクロージャで密封した、ＵＳＰ／Ｐｈ ＥｕｒいずれかのタイプＩ ５０Ｒバイアルにおいて、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され得る。栓は、ＵＳＰおよびＰｈ Ｅｕｒに準拠したエラストマーで作られていてもよい。ある特定の実施形態では、６０ｍＬの採取容量を可能にするために、バイアルに６１．２ｍＬのタンパク質産物溶液が充填され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、０．９％の生理食塩水で希釈され得る。
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、安定化レベルで糖と組み合わせた１０ｍｇ／ｍＬ濃度溶液として調製され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は水性担体中で調製され得る。ある特定の実施形態では、安定剤は、静脈内投与に望ましくないまたは不適切な粘度をもたらし得る量以下の量で添加され得る。ある特定の実施形態では、糖は、二糖、例えば、スクロースであり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、および保存剤のうちの１つまたは複数を含み得る。
ある特定の実施形態では、液体製剤のｐＨは薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムであり得る。
凝集に加えて、脱アミドは、発酵、採取／細胞清澄化、精製、薬物物質／薬物製品貯蔵の間および試料分析の間に発生し得るペプチドおよびタンパク質の一般的な産物のバリアントである。脱アミドは、加水分解を受け得るスクシンイミド中間体を形成するタンパク質からのＮＨ３の喪失である。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質量減少をもたらす。その後の加水分解は、１８ダルトンの質量増加をもたらす。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下での不安定性に起因して困難である。したがって、脱アミドは、典型的に１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミドは、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸のいずれかを生じる。脱アミドの速度に影響を及ぼすパラメータには、ｐＨ、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所ポリペプチド立体配座および三次構造が含まれる。ペプチド鎖におけるＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド化速度に影響を及ぼす。タンパク質配列におけるＡｓｎに続くＧｌｙおよびＳｅｒは、脱アミドに対してより高い感受性を生じる。
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミノを阻止するためのｐＨおよび湿度の条件下で保存され得る。
本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。
保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減させるために本明細書における製剤に添加することができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にすることができる。
静脈内（ＩＶ）製剤は、患者が、移植後に入院しており、ＩＶ経路を介してすべての薬物を受けている場合などの特定の場合に好ましい投与経路であり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％の塩化ナトリウム溶液により希釈される。ある特定の実施形態では、注射のための希釈された薬物製品は等張であり、静脈内注入による投与に適している。
ある特定の実施形態では、塩または緩衝成分は１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加することができる。塩および／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いて種々の公知の酸（無機および有機）から誘導される。ある特定の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシネート、炭酸、クエン酸緩衝液であってもよく、これらの場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。
保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減させるために本明細書における製剤に添加することができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にすることができる。
本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。
本開示のタンパク質は、タンパク質およびリオプロテクタントを含む凍結乾燥製剤として存在することもできる。リオプロテクタントは糖、例えば二糖であり得る。ある特定の実施形態では、リオプロテクタント（ｌｙｃｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）は、スクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥製剤は、緩衝剤、界面活性剤、増量剤、および／または保存剤のうちの１つまたは複数を含んでもよい。
凍結乾燥された薬物製品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なくとも１：２のタンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比であり得る。ある特定の実施形態では、タンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比は１：２〜１：５であり得る。
ある特定の実施形態では、凍結乾燥前の製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される塩基は水酸化ナトリウムであり得る。
凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは６から８の間に調整され得る。ある特定の実施形態では、凍結乾燥した薬物製品についてのｐＨ範囲は７〜８であり得る。
ある特定の実施形態では、塩または緩衝成分は１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加することができる。塩および／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いて種々の公知の酸（無機および有機）から誘導される。ある特定の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシネート、炭酸、クエン酸緩衝液であってもよく、これらの場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。
ある特定の実施形態では、「増量剤」を添加することができる。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を付加し、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開放気孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトールが含まれる。本発明の凍結乾燥製剤はこのような増量剤を含有し得る。
保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減させるために本明細書における製剤に添加することができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にすることができる。
ある特定の実施形態では、凍結乾燥薬物製品は水性担体で構成され得る。本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、凍結乾燥後、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な希釈剤には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥薬物製品は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または０．９％の塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰのいずれかで再構成される。再構成の間、凍結乾燥粉末は溶液に溶解する。
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質製品は、約４．５ｍＬの注射用水に構成され、０．９％の生理食塩水溶液（塩化ナトリウム溶液）により希釈される。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性を生じず、特定の患者、組成物、および投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るように変化し得る。
特定の用量は、各患者に対して均一な用量、例えば、５０〜５０００ｍｇのタンパク質であってもよい。代替的に、患者の用量は、患者のおおよその体重または表面積に合わせられ得る。適切な投薬量を決定する際の他の要因には、処置または予防される疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別および医学的状態が含まれ得る。処置のための適切な投薬量を決定するために必要な計算のさらなる改良は、特に、本明細書に開示される投薬量情報およびアッセイを考慮して当業者によって慣用的になされる。投薬量はまた、適切な用量応答データと併せて使用される投薬量を決定するための公知のアッセイの使用によって決定することができる。個々の患者の投薬量は、疾患の進行がモニターされるにつれて調節されてもよい。患者における標的化可能な構築物または複合物の血中レベルは、有効濃度に達するか、または有効濃度を維持するように投薬量が調節される必要があるかどうかを調べるために測定され得る。どの標的化可能な構築物および／または複合物、ならびにそれらの投薬量が、所与の個体に対して効果的である可能性が高いかを決定するために薬理ゲノム学が使用され得る（Ｓｃｈｍｉｔｚら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３０８巻：４３〜５３頁、２００１年；Ｓｔｅｉｍｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３０８巻：３３〜４１頁、２００１年）。
一般に、体重に基づく投薬量は、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
用量は、１日に１回もしくは複数回、１週間に１回もしくは複数回、１ヶ月に１回もしくは複数回または１年に１回もしくは複数回、またはさらに２〜２０年に１回与えられ得る。当業者は、体液または組織中の標的化可能な構築物または複合体の測定された滞留時間および濃度に基づいて投薬のための反復率を容易に推定することができる。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内であってもよく、カテーテルを介する潅流によってでもよく、または直接的な病巣内注射によってでもよい。これは、１日に１回または複数回、１週間に１回または複数回、１ヶ月に１回または複数回、および１年に１回または複数回、投与され得る。
上記の説明は本発明の複数の態様および実施形態を記載している。本出願は特に、態様および実施形態のすべての組合せおよび置換を意図する。
ここで概して記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、これらの実施例は本発明のある特定の態様および実施形態の例示の目的のためにのみ含まれ、本発明を限定することを意図していない。
（実施例１）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄに結合する
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは精製した組換えＮＫＧ２Ｄに結合する
ヒト、マウスまたはカニクイザルＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインの核酸配列を、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインをコードする核酸配列と融合させ、発現させる哺乳動物細胞に導入した。精製後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させた。非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミンでウェルを阻止した後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを滴定し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質を予め吸着させたウェルに添加した。一次抗体結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートし、Ｆｃ交差反応を回避するためにヒトカッパ軽鎖を特異的に認識する二次抗体を使用して検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼに対する基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェルに添加して結合シグナルを可視化し、その吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローン、アイソタイプ対照または陽性対照（配列番号１０１〜１０４、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５から選択した重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）を各ウェルに添加した。
アイソタイプ対照は組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対してわずかな結合を示したが、陽性対照が組換え抗原に対して最も強く結合した。クローン毎に親和性は異なったが、すべてのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒト、マウス、およびカニクイザルの組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質のすべてで結合を示した。概して、各抗ＮＫＧ２Ｄクローンは、ヒト（図３）およびカニクイザル（図４）の組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに同様の親和性で結合したが、マウス（図５）の組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対する親和性は比較的低かった。
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株を、ヒトまたはマウスのＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインキメラ抗原受容体を発現するように工学操作した。ＮＫＧ２Ｄ結合クローン、アイソタイプ対照または陽性対照を１００ｎＭ濃度にて使用して、ＥＬ４細胞において発現した細胞外ＮＫＧ２Ｄを染色した。フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して抗体結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、親ＥＬ４細胞と比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用してバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を計算した。
すべてのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒトおよびマウスのＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に結合した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５から選択される重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）が最も良好なＦＯＢ結合シグナルをもたらした。各クローンのＮＫＧ２Ｄ結合親和性は、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（図６）とマウスＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（図７）との間で同様であった。
（実施例２）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄへの天然リガンドの結合を阻止する
ＵＬＢＰ−６との競合
組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウシ血清アルブミンでウェルを阻止した。飽和濃度のＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンを添加した。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンを、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびＴＭＢ基質とコンジュゲートしたストレプトアビジンによって検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、ウェル中のＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への結合を阻止されたＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）および種々のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２ＤへのＵＬＢＰ−６結合を阻止したが、アイソタイプ対照はＵＬＢＰ−６との競合をほとんど示さなかった（図８）。
ＵＬＢＰ−６配列は、配列番号１０８により表される。
ＭＩＣＡとの競合
組換えヒトＭＩＣＡ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウシ血清アルブミンでウェルを阻止した。ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーションおよび洗浄後、ＭＩＣＡ−Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、ＭＩＣＡ−Ｆｃでコーティングされたウェルへの結合を阻止されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）および種々のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２ＤへのＭＩＣＡ結合を阻止したが、アイソタイプ対照はＭＩＣＡとの競合をほとんど示さなかった（図９）。
Ｒａｅ−１デルタとの競合
組換えマウスＲａｅ−１デルタ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した）をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウェルをウシ血清アルブミンで阻止した。マウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーションおよび洗浄後、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃでコーティングされたウェルへの結合を阻止されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５から選択される重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）および種々のＮＫＧ２Ｄ−結合ドメインクローンはマウスＮＫＧ２ＤへのＲａｅ−１デルタ結合を阻止したが、アイソタイプ対照抗体はＲａｅ−１デルタとの競合をほとんど示さなかった（図１０）。
（実施例３）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンはＮＫＧ２Ｄを活性化させる
ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に、ヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄの核酸配列を融合させて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を得た。次に、ギブソンアセンブリを使用してＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ構築物をレトロウイルスベクターにクローニングし、レトロウイルス産生のためにｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。８μｇ／ｍＬのポリブレンと共にＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを含有するウイルスにＥＬ４細胞を感染させた。感染の２４時間後、ＥＬ４細胞中のＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーによって分析し、細胞表面で高レベルのＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを発現するクローンを選択した。
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＮＫＧ２Ｄを活性化させるかどうかを判定するために、それらをマイクロプレートのウェルに吸着させ、抗体断片でコーティングされたウェルにおいてＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ ＥＬ４細胞をブレフェルジン−Ａおよびモネンシンの存在下で４時間にわたって培養した。ＮＫＧ２Ｄ活性化の指標である細胞内ＴＮＦ−α産生をフローサイトメトリーによってアッセイした。陽性対照で処置した細胞に対してＴＮＦ−α陽性細胞のパーセンテージを正規化した。すべてのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがヒトＮＫＧ２Ｄ（図１１）およびマウスＮＫＧ２Ｄ（図１２）の両方を活性化させた。
（実施例４）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫ細胞を活性化させる
初代ヒトＮＫ細胞
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血軟膜から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を単離した。単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には＞９５％であった。次に、単離されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地中で２４〜４８時間にわたって培養した後、それらを、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａ、およびモネンシンを含有する培地中で培養した。培養後、ＣＤ３、ＣＤ５６、およびＩＦＮ−γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞におけるＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γの染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の会合による、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび陽性対照（例えば、配列番号１０１または配列番号１０３によって表される重鎖可変ドメイン、および配列番号１０２または配列番号１０４によって表される軽鎖可変ドメイン）は、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージのＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ＋およびＩＦＮ−γ＋になることを示した（図１３および図１４は、ＮＫ細胞の調製のために異なるドナーのＰＢＭＣをそれぞれ使用した、２つの独立した実験のデータを表す）。
初代マウスＮＫ細胞
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから脾臓を得、７０μｍのセルストレイナーを通して押しつぶして、単一細胞懸濁液を得た。細胞をペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した、＃Ａ１０４９２０１；１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ炭酸水素カリウム、０．０１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁して赤血球を除去した。残りの細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２と共に７２時間にわたって培養し、その後採取し、ＮＫ細胞単離の準備をした。次に、磁気ビーズを用いたネガティブディプリーション技術を使用し、典型的には＞９０％の純度で脾臓細胞からＮＫ細胞（ＣＤ３−ＮＫ１．１＋）を単離した。精製されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ−１５を含有する培地中で４８時間にわたって培養した後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａ、およびモネンシンを含有する培地中で培養した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインでコーティングされたウェルにおいて培養した後、ＣＤ３、ＮＫ１．１、およびＩＦＮ−γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３−ＮＫ１．１＋細胞におけるＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γの染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の会合による、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび陽性対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５から選択される）は、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージのＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ＋およびＩＦＮ−γ＋になることを示した（図１５および図１６は、ＮＫ細胞の調製のために異なるマウスをそれぞれ使用した、２つの独立した実験のデータを表す）。
（実施例５）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは標的腫瘍細胞の細胞傷害性を可能にする
ヒトおよびマウス初代ＮＫ細胞活性化アッセイは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインとのインキュベーション後、ＮＫ細胞にある増加した細胞傷害性マーカーを示す。これが腫瘍細胞溶解の増加につながるかどうかに対処するために、各ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが単一特異的抗体になる細胞ベースのアッセイを利用した。Ｆｃ領域を１つの標的化アームとして使用し、一方、Ｆａｂ領域（ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン）はＮＫ細胞を活性化するための別の標的化アームとして作用した。ヒト起源であり、高レベルのＦｃ受容体を発現するＴＨＰ−１細胞を腫瘍標的として使用し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性キットを使用した。ＴＨＰ−１細胞をＢＡＴＤＡ試薬で標識化し、１０５／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。次に、標識化したＴＨＰ−１細胞をＮＫＧ２Ｄ抗体と合わせ、マイクロタイタープレートのウェル中で３７℃にて３時間、マウスＮＫ細胞を単離した。インキュベーション後、２０μｌの培養上清を取り出し、２００μｌのユーロピウム溶液と混合し、暗所で１５分間振盪しながらインキュベートした。時間分解蛍光モジュール（励起３３７ｎｍ、発光６２０ｎｍ）を備えたＰｈｅｒａＳｔａｒプレートリーダーによって蛍光を経時的に測定し、キットの説明書に従って特異的溶解率を計算した。
ＮＫＧ２Ｄに対する天然リガンドである陽性対照のＵＬＢＰ−６は、マウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解率の増加を示した。ＮＫＧ２Ｄ抗体も、ＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解率を増加させたが、アイソタイプ対照抗体は特異的溶解率の低減を示した。点線は、抗体を添加していないマウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１細胞の特異的溶解率を示す（図１７）。 （実施例６）
ＮＫＧ２Ｄ抗体は高い熱安定性を示す
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの融解温度を、示差走査型蛍光定量法を使用してアッセイした。外挿した見かけの融解温度は典型的なＩｇＧ１抗体と比較して高い（図１８）。
（実施例７）
ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６の架橋によるヒトＮＫ細胞の相乗的活性化
初代ヒトＮＫ細胞活性化アッセイ
密度勾配遠心分離を使用し、末梢ヒト血液軟膜から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ネガティブ磁気ビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＃１７９５５）を使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞を精製した。ＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによって決定して＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。次に、細胞を、活性化アッセイに使用する前に１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００−０２）を含有する培地中で４８時間増殖させた。抗体を、１００μｌの滅菌ＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌ（抗ＣＤ１６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３０２０１３）および５μｇ／ｍＬ（抗ＮＫＧ２Ｄ、Ｒ＆Ｄ ＃ＭＡＢ１３９）の濃度にて４℃で一晩、９６ウェル平底プレート上にコーティングし、続いてウェルを十分に洗浄して過剰の抗体を除去した。脱顆粒の評価のために、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２（ｈＩＬ２）および１μｇ／ｍＬのＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３２８６１９）を補充した培養培地に５×１０５個の細胞／ｍＬにて再懸濁した。次に、１×１０５個の細胞／ウェルを、抗体でコーティングされたプレート上に添加した。タンパク質輸送阻害剤であるブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４２０６０１）およびモネンシン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４２０７０１）を、それぞれ１：１０００および１：２７０の最終希釈にて添加した。播いた細胞を、３７℃にて４時間にわたって５％ＣＯ２においてインキュベートした。ＩＦＮ−γの細胞内染色のために、ＮＫ細胞を、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３００４５２）および抗ＣＤ５６ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３１８３２８）で標識化し、続いて固定し、透過処理し、抗ＩＦＮ−γ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃５０６５０７）で標識化した。ＮＫ細胞を、生ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞においてゲーティングした後、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γの発現について分析した。
受容体の組合せの相対的効力を調査するため、プレート結合刺激により、ＮＫＧ２ＤまたはＣＤ１６の架橋および両受容体の共架橋を行った。図１９（図１９Ａ〜１９Ｃ）に示したように、ＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄの組み合わせた刺激は、ＣＤ１０７ａ（脱顆粒）レベル（図１９Ａ）および／またはＩＦＮ−γ産生レベル（図１９Ｂ）の大きな上昇をもたらした。点線は、各受容体の個々の刺激の相加効果を表す。
抗ＣＤ１６、抗ＮＫＧ２Ｄまたは両方のモノクローナル抗体の組合せを用いた４時間のプレート結合刺激の後、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａレベルおよび細胞内ＩＦＮ−γ産生を分析した。グラフは平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。図１９ＡはＣＤ１０７ａのレベルを示し、図１９ＢはＩＦＮγのレベルを示し、図１９ＣはＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γ産生のレベルを示す。図１９Ａ〜１９Ｃに示したデータは、５名の異なる健康なドナーを使用した、５つの独立した実験を代表するものである。
実施例８−細胞で発現されるヒトＮＫＧ２ＤへのＴｒｉＮＫＥＴ結合の評価
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株を、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現するように工学操作した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン、腫瘍関連抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ２０結合ドメイン）および図１に示されるとおりのＣＤ１６に結合するＦｃドメインを各々含む三重特異的結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）を、ＥＬ４細胞上で発現される細胞外ＮＫＧ２Ｄに対するそれらの親和性について試験した。ＴｒｉＮＫＥＴを、２０μｇ／ｍＬに希釈し、次いで、段階希釈した。ＮＫＧ２ＤへのＴｒｉＮＫＥＴの結合を、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ヒストグラムをプロットした。試験したＴｒｉＮＫＥＴとしては、ＣＤ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０（クローンＡＤＩ−２８２２６に由来するＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよびリツキシマブに由来するＣＤ２０結合ドメイン）、およびＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０（クローンＡＤＩ−２９４０４に由来するＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよびリツキシマブに由来するＣＤ２０結合ドメイン）が挙げられる。ＣＤ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０の結合プロファイル（破線）、およびＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０の結合プロファイル（実線）は、染色されていないサンプルと一緒に、図３５に示される。その結果は、クローンＡＤＩ−２８２２６およびＡＤＩ−２９４０４による異なるレベルのＮＫＧ２Ｄへの結合を示す。
実施例９−細胞で発現されるヒトがん抗原へのＴｒｉＮＫＥＴ結合の評価
ＣＤ２０を発現するＲａｊｉヒトリンパ腫細胞を使用して、腫瘍関連抗原ＣＤ２０へのＴｒｉＮＫＥＴの結合をアッセイした。ＴｒｉＮＫＥＴをその細胞とともにインキュベートし、その結合を、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ヒストグラムをプロットした。図３６に示されるように、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０およびＣＤ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０は、ＣＤ２０に等しく十分に結合する。
実施例１０−ＴｒｉＮＫＥＴはＮＫ細胞を活性化する。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィコートから単離した。ＮＫ細胞（ＣＤ３− ＣＤ５６＋）を、ＰＢＭＣから磁性ビーズでの陰性選択を使用して単離し、その単離したＮＫ細胞の純度は、代表的には＞９０％であった。単離されたＮＫ細胞を、活性化に関して１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２を含む培地中で培養したか、またはサイトカインなしで一晩休止させた。ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を、活性化後の２４〜４８時間以内に使用した。休止ＮＫ細胞は常に、精製後に同日に使用した。
腫瘍抗原を発現するヒトがん細胞を採取し、培養培地中２×１０６／ｍＬで再懸濁した。腫瘍抗原を標的化する、モノクローナル抗体または腫瘍抗原を標的化するＴｒｉＮＫＥＴを、培養培地で希釈した。休止および／または活性化ＮＫ細胞を採取し、洗浄し、培養培地中２×１０６／ｍＬで再懸濁した。次いで、がん細胞をモノクローナル抗体／ＴｒｉＮＫＥＴと混合し、ＩＬ−２の存在下でＮＫ細胞を活性化した。ブレフェルジンＡおよびモネンシンも、その混合培養物に添加し、細胞内サイトカイン染色のため細胞からのタンパク質輸送を遮断した。フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａを、その混合培養物に添加し、その培養物を、ＣＤ３、ＣＤ５６およびＩＦＮ−γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用して、ＦＡＣＳ分析のためにサンプルを調製する前に、４時間にわたってインキュベートした。ＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γ染色をＣＤ３− ＣＤ５６＋ 細胞において分析して、ＮＫ細胞活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の会合による、より良好なＮＫ細胞活性化を示す。
初代ヒトＮＫ細胞とＣＤ２０陽性ヒトがん細胞とを共培養したところ、初代ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介性活性化を生じた（図３７）。ＴｒｉＮＫＥＴ標的化ＣＤ２０（例えば、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０およびＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０）は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮ−γサイトカイン産生の増加によって示されるように、ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞と共培養したヒトＮＫ細胞の活性化を媒介した（図３７）。モノクローナル抗体リツキシマブと比較して、両方のＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０およびＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０）は、ヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示した。
実施例１１−ＴｒｉＮＫＥＴは、がん細胞に向けたヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を増強する
ヒトＮＫ細胞がＴｒｉＮＫＥＴの存在下でがん細胞を溶解する能力を試験するために、ヒトＣＤ１６ａ−１５８ｖを発現するように形質導入したヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１細胞を、エフェクター細胞として使用した。全ての細胞傷害性アッセイを、以下のとおりに調製した：目的の標的を発現するヒトがん細胞株（例えば、ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞）を培養物から採取し、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＤ０１１６）で標識するために１０６／ｍＬにおいて成長培地中で再懸濁した。標的細胞の標識を、製造業者の指示に倣った。標識後に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、培養培地中で０．５〜１．０×１０５／ｍＬで再懸濁した。バックグラウンドウェルを調製するために、その標識した細胞のアリコートをとっておき、その細胞を培地からスピンアウトした。その培地１００μｌを、三連でウェルへと注意深く添加して、ペレット化した細胞が乱れるのを回避した。ＢＡＴＤＡ標識細胞１００μｌを、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ウェルを、標的細胞からの自発的放出のために保全し、ウェルを、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの添加による標的細胞の最大溶解のために調製した。目的の腫瘍標的に対するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを、培養培地で希釈し、その希釈したモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴ５０μｌを、各ウェルに添加した。ＫＨＹＧ−１−ＣＤ１６−１５８Ｖ細胞を洗浄し、所望のエフェクター細胞 対 標的細胞比に応じて、培養培地中に１０５〜２．０×１０６／ｍＬで再懸濁した。ＮＫ細胞５０μｌを、そのプレートの各ウェルに添加して、合計２００μｌ培養容積にした。そのプレートを、そのアッセイを展開する前に、３７℃において５％ ＣＯ２と２〜３時間にわたってインキュベートした。
２〜３時間の培養後に、そのプレートをインキュベーターから取り出し、細胞を、２００ｇで５分間遠心分離することによってペレット化した。その培養上清２０μｌを、製造業者から提供されたきれいなマイクロプレートへと移し、室温のユーロピウム溶液２００μｌを、各ウェルに添加した。そのプレートを遮光し、プレート振盪機上で２５０ｒｐｍにおいて１５分間インキュベートした。プレートを、Ｖｉｃｔｏｒ ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘ機器のいずれかを使用して読み取った。％ 特異的溶解を、以下のように計算した： ％ 特異的溶解＝（（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出））×１００％。
ＣＤ２０標的化ＴｒｉＮＫＥＴは、ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ Ｂ細胞リンパ腫細胞に向けたヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を媒介する。図３９に示されるように、両方のＴｒｉＮＫＥＴ（Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０およびＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０）は、そのがん細胞に向けた休止ヒトＫＨＹＧ−１−ＣＤ１６ａ−１５８Ｖエフェクター細胞の細胞傷害性活性を用量応答性様式で増強できた。ＫＨＹＧ−１−ＣＤ１６ａ−１５８Ｖ細胞は、ＴｒｉＮＫＥＴの添加なしでＲａｊｉ細胞に対して活性が弱かった。点線は、ＴｒｉＮＫＥＴの添加なしでＲａｊｉ標的細胞の特異的溶解を示す。
Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０（これは、ＣＤ２０発現がん細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を媒介する）を、親のモノクローナル抗体リツキシマブと比較した。Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０または抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブを、ＫＨＹＧ−１−ＣＤ１６ａ−１５８Ｖ細胞（ヒトＣＤ１６ａ−１５８Ｖを発現するように形質導入したＫＨＹＧ−１細胞）およびＲａｊｉ細胞と混合し、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を、上記のように測定した。図３９は、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０が、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体と比較して、Ｒａｊｉ細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性の効力および最大殺滅を増強したことを示す。点線は、ＴｒｉＮＫＥＴまたは抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の添加なしで、ＫＨＹＧ−１−ＣＤ１６ａ−１５８Ｖ細胞によるＲａｊｉ標的細胞の特異的溶解を示す。
参照による組み込み
本明細書で参照される特許文献および科学論文の各々の開示全体は、すべての目的のために参照により組み込まれる。
等価物
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱せずに他の特定の形態で実現されてもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書で記載している本発明を限定するのではなく、すべての点で例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に入るすべての変更はその中に包含されることが意図される。

Claims (66)

  1. （ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
    （ｂ）ＣＤ３７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２またはＣＤ１３３に結合する第２の抗原結合部位と、
    （ｃ）ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
    を含むタンパク質。
  2. 前記第１の抗原結合部位が、ヒトのＮＫＧ２Ｄに結合する、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 前記第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項１または２に記載のタンパク質。
  4. 前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、請求項３に記載のタンパク質。
  5. 前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項３または４に記載のタンパク質。
  6. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、請求項５に記載のタンパク質。
  7. 前記第１の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、請求項５または６に記載のタンパク質。
  8. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号１、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５および配列番号９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  9. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号４１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号４２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質。
  10. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号４９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号５０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質。
  11. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号５７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号５８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質。
  12. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号５９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号６０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質。
  13. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号６１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号６２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質。
  14. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号６９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号７０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質。
  15. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号７７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号７８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質。
  16. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号８５と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号８６と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質。
  17. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号９３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号９４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質。
  18. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号１０１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号１０２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質。
  19. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号１０３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号１０４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質。
  20. 前記第１の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、請求項１または２に記載のタンパク質。
  21. 前記単一ドメイン抗体が、ＶＨＨ断片またはＶＮＡＲ断片である、請求項２０に記載のタンパク質。
  22. 前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項１、２、または２０から２１のいずれか一項に記載のタンパク質。
  23. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、請求項２２に記載のタンパク質。
  24. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ３７に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号１０９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１１３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  25. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ３７に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号１１７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１２１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  26. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ３７に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号１２５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１２９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  27. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ２０に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号１３４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１３８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  28. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ２０に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号１４２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１４６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  29. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ２０に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号１５０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１５４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  30. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ２０に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号１５８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１６２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  31. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ２０に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１７０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  32. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ１９に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号１７５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１７９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  33. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ１９に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号１８３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１８７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  34. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ１９に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号１９１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１９５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  35. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ１９に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号１９９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２０３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  36. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ２２に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号２０８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２１２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  37. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ２２に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号２１６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２２０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  38. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ２２に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号２２４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２２８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  39. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ３０に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号２３３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２３７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  40. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ３０に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号２４１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２４５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  41. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ３０に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号２４９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２５３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  42. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ３０に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号２５７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２６１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  43. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ３０に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号２６５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２６９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  44. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ５２に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号２７４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２７８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  45. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ５２に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号２８２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  46. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ１３３に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号２９１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２９５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  47. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ１３３に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号２９９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号３０３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  48. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ１３３に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号３０７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号３１１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  49. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ１３３に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号３１５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号３１９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  50. 前記第２の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、請求項１から４または８から２１のいずれか一項に記載のタンパク質。
  51. 前記第２の抗原結合部位が、ＶＨＨ断片またはＶＮＡＲ断片である、請求項５０に記載のタンパク質。
  52. 前記タンパク質が、ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメインの一部分を含み、前記抗体Ｆｃドメインが、ヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  53. 前記抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、請求項５２に記載のタンパク質。
  54. 前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５２または５３に記載のタンパク質。
  55. 前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、Ｋ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる、請求項５４に記載のタンパク質。
  56. 先行する請求項のいずれか一項に記載のタンパク質および薬学的に許容される担体を含む製剤。
  57. 請求項１から５５のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する１つまたは複数の核酸を含む細胞。
  58. 有効量の、請求項１〜５５のいずれか１項に記載のタンパク質に、腫瘍細胞およびナチュラルキラー細胞を曝露する工程を包含する、腫瘍細胞死を増強する方法。
  59. 有効量の、請求項１〜５５のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５６に記載の製剤を、患者に投与することを包含する、がんを処置する方法。
  60. 前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ３７に結合し、処置される前記がんは、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、非ホジキンリンパ腫、および急性骨髄性白血病からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ２０に結合し、処置される前記がんは、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、およびＢ細胞悪性腫瘍からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ１９に結合し、処置される前記がんは、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍、多発性骨髄腫、および急性骨髄性白血病からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
  63. 前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ２２に結合し、処置される前記がんは、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍、およびヘアリー細胞白血病からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
  64. 前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ３０に結合し、処置される前記がんは、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および胎児性細胞癌からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
  65. 前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ５２に結合し、処置される前記がんは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫およびＴ細胞性前リンパ球性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫、成熟Ｔ／ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞新生物、ならびに胸腺腫からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
  66. 前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ１３３に結合し、処置される前記がんは、乳がん、結腸がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、腎臓がん、子宮がん、精巣胚細胞がん、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、神経膠腫、膠芽腫、および頭頚部の扁平上皮癌からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
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