CN114028453B - 广谱抗病毒药物、及其药物组合物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了广谱抗病毒药物，其为汉防己甲素或其药学上可接受的盐。本发明还公开了广谱抗病毒药物组合物。本发明还公开了所述的广谱抗病毒药物在制备防治病毒感染性疾病药物或科学研究中的应用。本发明从动物、细胞水平证明汉防己甲素具有抑制多种病毒扩增的功能，并且可以有效的激活I型干扰素的表达。本发明是对广谱抗病毒药物的补充。本发明的创新之处即是发现了一个可以高效激活宿主I型IFN及干扰素诱导基因(ISG)的中药单体化合物。本发明为病毒感染性疾病的预防和治疗提供了一个有效的潜在广谱抗病毒药物。

Description

广谱抗病毒药物、及其药物组合物和应用

技术领域

本发明涉及广谱抗病毒药物技术领域，涉及广谱抗病毒药物、及其药物组合物和应用。

背景技术

病毒感染性疾病具有高传播力和致病性强的特点，是人类健康的巨大威胁。特异性疫苗和抗病毒药物是抵抗病毒感染最有效的工具。但由于自然界中病毒种类繁多，许多病毒具有高的突变能力，因此，大大增加了特异性疫苗和抗病毒药物的研发周期与研发成本。广谱的抗病毒药物可以作用于多种病毒或同一种病毒的多种基因型，相较于特异性抗病毒药物具有更广的适用范围(病毒感染性疾病适应症)。发现新的广谱抗病毒药物具有重大的科学意义和应用前景。

目前开发广谱抗病毒药物可分为：1.靶向病毒本身干预病毒感染活力；2.靶向病毒复制所必需的宿主因子来调节宿主细胞防御系统抗病毒。以“三药三方”为代表的有效方药在新冠肺炎防控，特别是在预防轻症向重症转化过程中表现出显著的疗效，凸显了中医药防治病毒感染性疾病的独特优势。因此，利用现代科学研究方法和技术从中医药宝藏文库中挖掘新的广谱抗病毒药物具有切实的可行性。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供广谱抗病毒药物。

本发明另有一个目的是提供广谱抗病毒药物组合物。

本发明再有一个目的是提供广谱抗病毒药物在制备防治病毒感染性疾病药物或科学研究中的应用。

为此，本发明提供的技术方案为：

广谱抗病毒药物，其为粉防己。

优选的是，所述的广谱抗病毒药物，其为汉防己甲素或其药学上可接受的盐。

广谱抗病毒药物组合物，其包含所述的药物和其在药学上可接受的载体或稀释剂。

优选的是，所述的广谱抗病毒药物组合物，其包含汉防己甲素和氯喹。

优选的是，所述的广谱抗病毒药物组合物，其包含汉防己甲素和奥司他韦。

所述的广谱抗病毒药物在制备防治病毒感染性疾病药物或科学研究中的应用。

优选的是，所述的应用中，所述科学研究包括依赖I型干扰素的抗病毒相关通路的研究。

优选的是，所述的应用中，所述病毒包括水疱性口炎病毒、甲型流感病毒、脑心肌炎病毒和I型单纯疱疹病毒。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明从动物、细胞水平证明汉防己甲素具有抑制多种病毒扩增的功能，并且可以有效的激活I型干扰素的表达。

本发明是对广谱抗病毒药物的补充。相较于已有广谱抗病毒药物，汉防己甲素通过提高宿主基于I型干扰素通路的抗病毒免疫应答水平来增强宿主抗病毒感染能力，发挥预防和治疗病毒感染疾病的功能。目前，基于增强宿主I型干扰素通路的广谱抗病毒药物并不多见。该发明的创新之处是发现了一个可以高效激活宿主I型干扰素及其下游干扰素诱导基因(ISG)表达的中药单体化合物。因此，本发明为多种病毒感染性疾病的预防和治疗提供了一种潜在的广谱抗病毒药物。

本发明是对汉防己甲素临床应用的拓展。

定义

为了便于理解本发明，本发明涉及的术语和短语的含义定义如下：

生物制药：生物药物是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、器官、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。生物制药原料以天然的生物材料为主，包括微生物、人体、动物、植物、海洋生物等。

药理学：药理学是研究药物与机体间相互作用规律及其药物作用机制的一门科学，主要包括药效动力学和药代动力学两个方面。前者是阐明药物对机体的作用和作用原理,后者阐明药物在体内吸收、分布、生物转化和排泄等过程,及药物效应和血药浓度随时间消长的规律。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明其中一个实施例中Tet在细胞水平抑制VSV-GFP病毒复制的流式细胞术检测的统计示意图；a.A549细胞中加入VSV-GFP病毒，4℃吸附2h后加入不同浓度(5、10μmol/L)的汉防己甲素，共孵育12h，流式结果示意图，c为a图的柱状统计图；b.A549细胞中加入VSV-GFP病毒，4℃吸附2h后加入不同浓度(5、10μmol/L)的汉防己甲素，共孵育24h，流式结果示意图，d为b图的柱状统计图。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值±标准误表示，***p＜0.001表示差异极显著。

图2为本发明其中一个实例中Tet在细胞水平抑制多种病毒，包括VSV病毒、EMCV病毒、H1N1病毒和HSV-1病毒的qPCR结果示意图；不同病毒(VSV、EMCV、H1N1、HSV1)与汉防己甲素(1.25、2.5、5、10μmol/L)共孵育A549细胞，病毒感染一定时间后，收取细胞提取RNA进行qPCR检测各种病毒复制情况。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值±标准误表示，***，p＜0.001。

图3为本发明其中一个实例中Tet抑制VSV病毒感染引起的细胞死亡的PI/Hoechest染色结果示意图；A549细胞中同时加入VSV病毒和不同浓度(5、10μmol/L)的汉防己甲素，共孵育24h后，固定细胞并进行PI和hoechst33342染色，荧光显微镜结果示意图。实验随机选取7个视野，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值±标准误表示，***，p＜0.001。

图4为本发明其中一个实例中Tet在细胞水平激活Ⅰ型干扰素信号通路的qPCR结果示意图；a.汉防己甲素孵育A549细胞(肺癌上皮细胞)12h或24h后，qPCR检测IFNB1、IFIT1、IFIT2、IFI44基因表达情况；b.汉防己甲素孵育MEF细胞(鼠胚胎成纤维细胞)3h或6h，qPCR检测IFNB1、IFIT1、IFIT2、IFI44基因表达情况；c.汉防己甲素孵育BMDM细胞(鼠骨髓来源的单核细胞分化的巨噬细胞)4h或8h，qPCR检测IFNB1、IFIT1、IFIT2、IFI44基因表达情况；d.汉防己甲素孵育MEF细胞12h或24h，收集上清，ELISA检测IFNβ分泌情况。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值±标准误表示，***，p＜0.001。

图5为本发明其中一个实例中Tet在动物水平激活Ⅰ型干扰素信号通路的qPCR结果示意图；a.取6-8周C57BL/6J小鼠，用不同浓度的汉防己甲素注射液(30、60mg/kg)对小鼠进行腹腔注射，连续注射两天后取材，qPCR法检测肺组织中IFNB1、IFIT1、IFIT2、IFI44基因变化情况；b.取6-8周C57/BL6小鼠，用汉防己甲素注射液(60mg/kg)对小鼠进行腹腔注射，不同时间(24h、48h)点取材，qPCR法检测肝、肺、脾组织中IFNB1、IFIT1、IFIT2、IFI44基因变化情况；c.取6-8周C57/BL6小鼠，用汉防己甲素注射液(60mg/kg)对小鼠进行腹腔注射，不同时间(24h、48h)点取材，将组织匀浆，4℃，6000rpm离心10min后取上清，ELISA检测上清中IFNβ分泌情况。各组n＝5，结果采用平均值±标准误表示，***，p＜0.001。

图6为本发明其中一个实例中Tet增强polyI:C诱导的I型干扰素信号通路激活的qPCR结果示意图；A549细胞中，Poly(I:C)转染5h后加入不同浓度的汉防己甲素，孵育12h后，qPCR法检测细胞中IFNB1、IFIT1、IFIT2、IFI44和OAS1基因变化情况。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值±标准误表示，***，p＜0.001。

图7为本发明其中一个实例中Tet在动物水平有效抑制VSV病毒感染、减轻VSV病毒感染诱发炎症的结果示意图；取6-8周C57BL/6J小鼠，实验组给予腹腔注射60mg/kg汉防己甲素注射液，对照组注射等量生理盐水。24h后腹腔注射VSV病毒(2×10⁷PFU/g)，病毒感染48h后脱臼处死小鼠，取材。a.腹腔注射生理盐水组与汉防己甲素组，VSV病毒感染后眼眶示意图；b.腹腔注射生理盐水组、汉防己甲素组，肝、肺、脾中VSV病毒载量；c.腹腔注射生理盐水组与汉防己甲素组，肺部切片HE染色图。各组n＝5，结果采用平均值±标准误表示，***，p＜0.001。

图8为本发明其中一个实例中Tet在动物水平有效抑制SARS-Cov-2病毒感染结果示意图；取6-8周人源化hACE2的C57BL/6J小鼠，实验组给予腹腔注射60mg/kg汉防己甲素注射液，对照组注射等量生理盐水。预给药1天后，SARS-CoV-2B.1.617.2(印度株)经鼻滴入式感染，剂量为1x10⁵PFU/g。a.SARS-CoV-2病毒感染期间小鼠体重变化；b.qPCR检测病毒感染1天后小鼠气管内病毒载量；c.qPCR检测病毒感染1天后小鼠肺组织病毒载量；d.qPCR检测病毒感染5天后小鼠肺组织病毒载量。

图9为本发明其中一个实例中Tet增强已知抗病毒药物的抗病毒功能结果示意图；a.A549细胞中加入VSV-GFP病毒，4℃吸附2h后加入不同浓度(10-4、10-3、10-2、10-1、10⁰、10¹μmol/L)的氯喹或不同浓度氯喹与汉防己甲素(10μmol/L)的混合物，共孵育12h，流式细胞术检测GFP阳性细胞比率变化，抑制率为感染细胞相对于DMSO处理细胞(空白对照细胞)的标准化百分比。b.A549细胞中加入H1N1病毒，同时加入不同浓度(10^-4、10^-3、10^-2、10^-1、10⁰μmol/L)的磷酸奥司他韦或不同浓度磷酸奥司他韦与汉防己甲素(10μmol/L)的混合物，共孵育12h，收取细胞提取RNA进行qPCR检测病毒复制情况，抑制率为感染细胞相对于DMSO处理细胞(空白对照细胞)的标准化百分比。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值±标准误表示。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

粉防己(Stephania tetrandra S.Moore)是传统中药材,其根部入药可利水消肿,祛风止痛,用于水肿脚气、小便不利、风湿痹痛、湿疹疮毒、高血压症等。汉防己甲素(Tetrandrine，Tet)，别名粉防己碱、汉防己碱，是一种白色固体的化学品。化学名称(S,S)-(+)-粉防已碱，分子式为C₃₈H₄₂N₂O₆，分子量为622.75000，熔点217～218℃，几乎不溶于水、石油醚，溶于乙醚等，是从粉防己中提取得到的一种双苄基异喹啉类生物碱，具有多种药理作用。在临床上常用于治疗关节炎、矽肺、高血压、肿瘤、预防和治疗肝纤维化、保护肝细胞等。近年来研究发现，汉防己甲素的药理作用非常广泛，在抗炎、治疗白血病、逆转多重耐药性、诱导细胞凋亡等方面都表现出了良好的生理活性。目前市场上有汉防己甲素片和注射液两种药物形式，适应症为用于风湿痛、关节痛、神经痛。与小剂量放射合并用于肺癌；亦用于单纯硅肺I、II、III期及各期煤硅肺。

汉防己甲素的药理功效除上述诸多方面外，是否具有广谱抗病毒的作用？深入阐明汉防己甲素的抗病毒作用及其广谱性是拓展汉防己甲素药用价值的重点，亦是研发广谱抗病毒药物的难点。

本发明提供广谱抗病毒药物，其为粉防己。

在上述方案中，作为优选，所述的广谱抗病毒药物为汉防己甲素或其药学上可接受的盐。汉防己甲素是从粉防己中提取得到的一种双苄基异喹啉类生物碱。

本发明还提供了广谱抗病毒药物组合物，其包含所述的药物和其在药学上可接受的载体或稀释剂。

在上述方案中，作为优选，该广谱抗病毒药物组合物包含汉防己甲素和氯喹。

在上述方案中，作为优选，该广谱抗病毒药物组合物包含汉防己甲素和奥司他韦。

所述的广谱抗病毒药物在制备防治病毒感染性疾病药物或科学研究中的应用。

在上述方案中，作为优选，所述科学研究包括依赖I型干扰素的抗病毒相关通路的研究。

在上述方案中，作为优选，所述病毒包括水疱性口炎病毒、甲型流感病毒、脑心肌炎病毒和I型单纯疱疹病毒。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：实施例1

Tet在细胞水平抑制VSV病毒复制

将带有GFP标签的水疱性口炎病毒VSV病毒(MOI＝0.1)加入培养于24孔板的肺癌人类肺泡基底上皮细胞A549细胞中，4℃吸附2h，弃含有病毒的培养基并用PBS洗两遍后加入含有不同浓度(5、10μmol/L)的汉防己甲素培养基，每孔500μL，一起孵育12h或24h，收集细胞进行流式细胞术检测含有GFP阳性细胞的百分率。

如图1结果显示，汉防己甲素处理A549细胞，可剂量依赖性(5、10μmol/L)降低GFP阳性细胞百分率，柱形图分别统计了两个时间点GFP阳性细胞的百分比,***P<0.001(差异极显著)。GFP阳性比例越高，表明VSV病毒复制越强，加入汉防己甲素后，阳性率下降，证明Tet可抑制VSV病毒复制。

实施例2

Tet在细胞水平抑制多种病毒复制

为了探究Tet抗病毒的广谱性，发明人使用多种RNA病毒VSV病毒(水疱性口炎病毒)、EMCV(脑心肌炎病毒)、H1N1(甲型流感病毒)和DNA病毒HSV-1(I型单纯疱疹病毒)感染A549细胞，检测Tet对病毒复制的影响。具体如下：A549细胞中同时加入VSV病毒(MOI＝0.01)和不同浓度(1.25、2.5、5、10μmol/L)的汉防己甲素，共孵育12h后，qPCR检测细胞中VSV病毒载量变化。A549细胞中同时加入EMCV病毒(MOI＝3)和不同浓度(同上)的汉防己甲素，共孵育8h后，qPCR检测细胞中EMCV病毒载量变化。A549细胞中同时加入H1N1病毒(PR8)(MOI＝0.0)和不同浓度(同上)的汉防己甲素，共孵育8h后，qPCR检测细胞中H1N1病毒载量变化。A549细胞中同时加入HSV1病毒(MOI＝1)和不同浓度(同上)的汉防己甲素，共孵育24h后，qPCR检细胞中HSV1病毒载量变化。

如图2结果发现，对照组中多种病毒扩增明显，而加入汉防己甲素的实验组以剂量依赖的方式显著抑制多种病毒基因表达，10μmol/L时抑制最为显著。病毒感染宿主后会释放病毒基因组，而后利用宿主细胞资源进行转录和翻译。病毒基因表达强弱可反映病毒在宿主扩增情况，汉防己甲素处理细胞后，病毒基因表达受抑制，说明Tet可有效抵抗上述多种病毒感染，具有广谱抗病毒功能。

实施例3

Tet抑制由病毒感染引起的细胞死亡

将不同浓度(5、10μmol/L)的汉防己甲素加入培养于24孔板的A549细胞中孵育2h后加入野生型VSV病毒(MOI＝0.1)感染细胞，24h后固定细胞并进行PI(检测细胞死亡)和hoechst33342(核染料)染色，荧光显微镜下观察细胞死亡情况。

如图3结果发现，VSV病毒感染可引起大量细胞死亡，而加入Tet后，细胞死亡比例降低且呈现剂量依赖性关系。此结果表明汉防己甲素可抑制VSV病毒感染引起的细胞死亡。

实施例4

汉防己甲素在细胞水平激活I型干扰素通路

I型干扰素通路的激活在抗病毒免疫应答中具有重要作用，为了探究Tet对I型干扰素通路是否有调控作用，用10μmol/L的Tet孵育A549细胞、小鼠原代胚胎成纤维细胞MEF和小鼠骨髓来源的巨噬细胞BMDM，不同时间点收集细胞，提取RNA后进行qPCR检测IFNB1和干扰素诱导基因(IFIT1/IFIT2/IFI44)的表达情况。Tet孵育MEF细胞12h和24h后收集细胞培养上清，ELISA检测IFNβ分泌情况。

如图4a-c中qPCR结果显示，单独加Tet孵育三种细胞均显著诱导IFNB1表达，与此同时，干扰素诱导基因(IFIT1/IFIT2/IFI44)也上调表达。图4d中ELISA结果显示，Tet孵育后MEF细胞IFNβ分泌增多。这些结果表明，汉防己甲素可有效激活I型干扰素通路，诱导抗病毒免疫相关基因表达。

实施例5

汉防己甲素体内激活I型干扰素通路

6-8周C57BL/6J小鼠腹腔注射不同浓度的汉防己甲素注射液(30mg/kg、60mg/kg)或生理盐水(对照组)，2天后脱颈椎处死小鼠，取肺组织提取RNA，qPCR检测肺组织中IFNB1及干扰素诱导基因(IFIT1/IFIT2/IFI44)表达情况。此外，将60mg/kg的汉防己甲素腹腔注射C57BL/6J小鼠，分别在药物处理24h和48h脱颈椎处死小鼠并取多种组织器官，包括肝、肺和脾，将组织在预冷的PBS中进行匀浆，4℃，6000rpm离心10min，取上清做ELISA检测组织中IFNβ分泌情况。

如图5结果表明，Tet处理小鼠后可剂量依赖性(图5a)和时间梯度依赖性(图5b)显著上调组织中IFNB1、IFIT1、IFIT2和IFI44的表达。此外，图5c的ELISA结果显示，Tet处理小鼠后，肝、肺和脾组织中IFNβ分泌显著增加。以上结果表明，Tet在动物体内可以显著激活I型干扰素通路及干扰素诱导基因的表达。

实施例6

Tet增强polyI:C诱导的I型干扰素的激活

用1μg/ml的polyI:C刺激A549细胞，5h后换液同时加入不同浓度Tet(5、10μmol/L)继续孵育A549细胞，12h后收细胞提取RNA进行qPCR检测IFNB1和干扰素诱导基因(IFIT1/IFIT2/IFI44/OAS1)表达情况。

如图6结果显示，polyI:C有效激活I型干扰素通路，而Tet可剂量依赖性增强polyI:C诱导的IFNB1及干扰素诱导基因的表达。polyI:C为dsRNA结构，是病毒核酸类似物，可激活抗病毒相关通路。此结果说明Tet可剂量依赖性的增强I型干扰素通路的激活和干扰素诱导基因的表达。

实施例7

Tet体内抑制VSV病毒感染

以汉防己甲素注射液(每只小鼠60mg/kg)腹腔注射6-8周C57BL/6J小鼠，对照组注射等量生理盐水，24h后腹腔注射VSV病毒，病毒感染剂量为小鼠2×10⁷PFU/g,每组5只小鼠。病毒感染48h后脱颈椎处死小鼠，取肺、肝、脾等组织，匀浆后TRIZOL法提取RNA，qPCR检测所取组织中病毒载量。此外，对肺组织的病理切片进行观察。

如图7a结果显示，对照组小鼠在VSV病毒感染1天时出现结膜炎症状，而Tet给药组小鼠未出现结膜炎症状。图7b显示，对照组中病毒复制明显，而腹腔注射Tet组病毒核酸减少，说明病毒复制被显著抑制。图7c中苏木精—伊红染色法(HE染色)结果显示，对照组小鼠在病毒感染后肺组织炎性细胞浸润增强，肺组织病理严重，而Tet可有效缓解VSV病毒感染引起的肺部损伤。以上结果表明Tet在体内抑制VSV病毒感染，发挥抗病毒功能。

实施例8

Tet体内抑制SARS-Cov-2病毒感染

构建小鼠感染SARS-CoV-2急性期并发症模型：6-8周人源化hACE2的C57BL/6小鼠(内源性敲除鼠ACE2并敲入人ACE2)，进行分组实验，对照组和模型组各10只。SARS-CoV-2B.1.617.2(印度株)可直接感染hACE2小鼠并在其体内复制。采用感染病毒的剂量为1x10⁵PFU/g，经鼻滴入式感染。感染1-5天，麻醉处死小鼠检测病毒载量。

其中，在药物干预的评价模型中，汉防己甲素注射液(每只小鼠60mg/kg)腹腔注射人源化hACE2的C57BL/6J小鼠进行1次/日给药处理，预给药1天后腹腔注射SARS-CoV-2病毒(记为Day0)。感染1天后每组选取5只脱颈椎处死，qPCR检测气管和肺部病毒载量。病毒感染第5天(记为Day5)，脱颈椎处死全部小鼠，qPCR检测气管和肺部病毒载量。此外，每日定时检测小鼠在病毒感染期间体重变化。

由图8结果显示，给药组小鼠在病毒感染期间体重下降较对照组小鼠体重下降不明显(图8a)。在病毒感染的第1天及第5天，Tet组小鼠气管和肺部病毒载量均低于对照组(图8b-d)。以上结果表明，汉防己甲素具有抗SARS-Cov-2的药效。

实施例9

Tet增强氯喹和奥司他韦的抗病毒功能

氯喹(chloroquine)作为治疗疟疾的首选药物，研究证明其具有广谱抗病毒活性，对流感病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、人类免疫缺陷病毒及新型冠状病毒等有一定的抑制作用。为了探究Tet对氯喹抗病毒功能的影响，用带GFP标签的VSV病毒感染A549细胞后，加入不同浓度的氯喹(10^-4、10^-3、10^-2、10^-1、10⁰、10¹μmol/L)或不同浓度氯喹与Tet(10μmol/L)的混合物，流式细胞术检测GFP阳性细胞比率变化。如图9a结果所示，氯喹在1μmol/L时开始抑制VSV复制扩增，在10μmol/L时较为显著抑制VSV复制扩增；当Tet与氯喹同时给药时，10^-4μmol/L的氯喹即可显著抑制VSV复制扩增。此结果表明Tet可以显著增强氯喹的抗病毒功能。

奥司他韦(Oseltamivir)是一种作用于神经氨酸酶的特异性抑制剂，可以显著抑制流感病毒的复制。为了探究Tet对奥司他韦抗流感病毒的影响，用H1N1(PR8)病毒感染A549细胞，同时加入不同浓度的奥司他韦(10^-4、10^-3、10^-2、10^-1、10⁰μmol/L)或不同浓度奥司他韦与Tet(10μmol/L)的混合物，qPCR法检测细胞内H1N1病毒复制情况。如图9b结果所示，奥司他韦在1μmol/L时抑制H1N1病毒复制扩增；当Tet与奥司他韦同时给药时，10^-4μmol/L的奥司他韦即可显著抑制H1N1病毒复制扩增。此结果表明Tet可以显著增强奥司他韦抗流感病毒的功能。

本发明中，发明人分别在细胞和动物水平检测汉防己甲素对病毒复制的抑制作用及对I型干扰素IFNβ及ISGs的诱导功能。

1.细胞水平检测汉防己甲素的抗病毒功能：发明人选用抗病毒免疫应答常用细胞株肺癌人类肺泡基底上皮细胞A549、小鼠原代胚胎成纤维细胞MEF开展药理药效研究。实验用多种病毒包括RNA病毒VSV(水疱性口炎病毒)、H1N1(甲型流感病毒)、EMCV(脑心肌炎病毒)和DNA病毒HSV-1(I型单纯疱疹病毒)感染细胞，汉防己甲素的加入可显著地抑制各种病毒在细胞中的扩增。

2、动物水平检测汉防己甲素的抗病毒功能：小鼠腹腔注射汉防己甲素注射液与VSV病毒，2天后取肺、肝脏、脾脏等，通过qPCR检测多种器官中病毒载量，发明人发现注射汉防己甲素的小鼠体内病毒水平显著低于对照组，且肺部病理减轻，证明汉防己甲素在机体水平可有效抵抗病毒感染。此外，发明人发现汉防己甲素可抑制SARS-Cov-2在小鼠体内的复制扩增。

3、汉防己甲素诱导I型干扰素及干扰素诱导基因(ISGs)表达：细胞和动物水平给药汉防己甲素，qPCR检测IFNβ、IFIT1、IFIT2、IFI44，与对照组相比，仅加药就能显著上调I型干扰素及干扰素诱导基因表达。此外，病毒双链RNA类似物polyI:C刺激细胞后，有效诱导I型干扰素及ISGs的表达，汉防己甲素处理可进一步促进I型干扰素及ISGs表达。

4、汉防己甲素与已知抗病毒药物氯喹和奥司他韦联用，可显著增强两种药物的抗病毒功能。

本发明的研究从动物、细胞水平证明汉防己甲素具有抑制多种病毒扩增的功能，并且可以有效的激活I型干扰素及干扰素诱导基因的表达。I型干扰素在宿主抗病毒免疫应答中具有重要作用，其下游干扰素诱导基因可以在病毒的入侵、病毒核酸的复制、病毒蛋白的翻译和病毒粒子的释放等各个环节抑制病毒复制或调控宿主免疫应答以增强宿主抗病毒能力。

本发明是对广谱抗病毒药物的补充。相较于已有广谱抗病毒药物，汉防己甲素通过提高宿主基于I型干扰素的抗病毒免疫应答水平来增强宿主抵抗力，达到预防和治疗病毒感染性疾病的目的。目前，国内基于增强I型干扰素表达发挥广谱抗病毒功能的药物不多，该发明的创新之处即是发现了一个可以高效激活宿主I型干扰素及干扰素诱导基因(ISGs)表达的中药单体化合物。因此，本发明为病毒感染性疾病的预防和治疗提供了一个潜在的新广谱抗病毒药物。汉防己甲素通过增强宿主基于I型干扰素通路的抗病毒免疫应答发挥广谱抗病毒功能的活性与用途，尚未见公开文献报道。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的广谱抗病毒药物、及其药物组合物和应用的修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (1)

1.汉防己甲素作为唯一活性成分在制备防治甲型流感病毒H1N1感染药物中的应用。

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