BRPI0708687A2 - domìnios de kunitz quiméricos e seu uso - Google Patents

Abstract

DOMìNIOS DE KUNITZ QUIMéRICOS E SEU USO. A presente invenção refere-se a quimeras de domínio 1 de inibidor de fator de tecido humano com domínios de Kunitz naturais e não naturais, e sua preparação e aplicação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DOMÍNIOSDE KUNITZ QUIMÉRICOS E SEU USO".

A presente invenção se refere a quimeras de domínio 1 de inibi-dor de fator de tecido humano, com domínios de Kunitz naturais e não natu-rais, e a sua preparação e a uso.

Domínios de Kunitz são polipeptídeos, que inibem um grandenúmero de proteases de serina de potência variável. Eles compreendem trêspontes de dissulfeto, que estabilizam a proteína e determinam sua estruturatridimensional. A interação com a respectiva protease de serina ocorre, prin-cipalmente, via um laço que é de cerca de 9 aminoácidos de comprimento eque está na região N-terminal do domínio de Kunitz. Esse laço se liga aocentro catalítico da protease e, portanto, previne a clivagem dos substratosde protease apropriados (Laskowski and Kato [1980]; Bode and Huber[1992]).

Aprotinina (BPTI; figura 1; Seq N° 6) é considerada como o pro-tótipo de domínios de Kunitz (Fritz e Wunderer [1983]). Ela é uma proteínabásica com um comprimento de 58 aminoácidos, que pode ser isolada a par-tir de vários órgãos bovinos (entre outros, pâncreas, pulmão, fígado e cora-ção). Aprotinina é estabilizada por três pontes de dissulfeto (Cys 5 - Cys 55;Cys 14 - Cys 38; Cys 30 - Cys 51) e é, entre outros, um potente inibidor detripsina, plasmina e calicreína de plasma.

Tem sido possível mostrar, por análise estrutural por raios X, docomplexo entre aprotinina e tripsina bovina, que a região de contato de apro-tinina com o centro catalítico da protease é formado essencialmente por umlaço consistindo nos aminoácidos 11 a 19 (vide Bode e Huber [1922] e asreferências listadas aqui). O aminoácido Lys 15 é de importância central pa-ra o efeito inibidor de aprotinina e está em contato particularmente próximoao resíduo de serina cataliticamente ativo da protease. Portanto, refere-seao aminoácido Lys 15, por definição, como resíduo P1 (Schechter e Berger[1967]. Os resíduos P2, P3, etc., estão localizados N-terminalmente a partirde Lys-15, enquanto que se refere aos aminoácidos localizados C-terminalmente a partir de Lys-15 como P1\ P2\ etc. Uma vez que Lys-15está localizada diretamente C-terminalmente próximo ao segundo resíduo decisteína de aprotinina, refere-se ao aminoácido correspondente nessa posi-ção em outros domínios de Kunitz, igualmente, como o resíduo P1. Mostrou-se mais cedo que o efeito inibidor de aprotinina pode ser modificado por mu-dança dirigida de aminoácidos na região a partir do resíduo 11 até o resíduo19 (Otlewski et al. [2001], Apeler et al. [2004], Krowarsch et al. [2005]). Osaminoácidos 36 - 39 são adicionalmente importantes para a atividade de a-protinina (Fritz e Wunder [1983], Krowarsch et al. [2005]).

Aprotinina é agora principalmente empregada sob o nome co-mercial Trasylol em cirurgia cardíaca, uma vez que estudos clínicos demons-traram que o tratamento com aprotinina reduz, de maneira significativa, anecessidade de transfusão em tais operações e conduz a uma redução dehemorragias secundárias (Royston [1992]). Seu efeito clínico é atribuído àinibição da coagulação intrínseca de sangue (ativação por contato), à inibi-ção de fibrinólise e à redução de formação de trombina (Blauhut et al. [1991],Dietrich et al. [1995]). Portanto, a inibição tanto de plasmina quanto de cali-creína de plasma é importante para o efeito hemostático de aprotinina.

Aprotinina, como proteína bovina, conduz à formação de anti-corpos em seres humanos. A administração repetida de Trasylol pode con-duzir a severas reações alérgicas (choque anafilático). O risco disso é de2,8%, e, portanto, a possibilidade de aplicações múltiplas de aprotinina égrandemente restrita (Dietrich et al. [2001], Beierlein et al. [2005]). Portanto,existe uma grande demanda médica por ingredientes ativos, que tenham umefeito clínico similar ou melhor do que a aprotinina e que provoquem signifi-cativamente menos de uma reação alérgica.

A ativação da coagulação de sangue pela via extrínseca (porexemplo, em lesões de tecido) é iniciada por liberação de fator de tecido apartir de células endoteliais (Lindahl [1997], Lwaleed e Bass [2005]). Quandoo fator de tecido entra no sangue, ele se liga ao fator Vila. O complexo for-mado por meio disso ativa tanto o fator X (coagulação extrínseca de sangue)quanto o fator IX (coagulação intrínseca de sangue). Sob condições fisiológi-cas, o fator de tecido é inibido pelo inibidor de fator de tecido (TFPI). Inibidorde fator de tecido humano (hTFPI) é uma proteína com um comprimento de276 aminoácidos e uma massa molecular de cerca de 42 KDa. Primeiramen-te, ele inibe o fator Xa e, então, se liga ao complexo de fator Vila/fator detecido. TFPI consiste em três domínios de Kunitz e, no plasma, está princi-palmente ligado a lipoproteínas. Portanto, também se refere a ele como "ini-bidor de coagulação associado à lipoproteína" (LACI). TFPI foi purificadapela primeira vez a partir de sobrenadantes de células HepG2 humanas(Broze et al. [1987]) e um pouco mais tarde a partir de plasma humano (No-votny et al. [1989]). O cDNA de hTFPI foi clonado em 1988 (Wun et al.[1988]). Sprecher et al. descrevem a clonagem e a caracterização de umaisoforma adicional do inibidor de fator de tecido (hTFPI2; Sprecher et al.[1994]).

Foi possível mostrar, por troca dirigida dos aminoácidos na posi-ção P1 dos respectivos domínios de Kunitz de HTFPI, que o domínio 2 deKunitz (D2) é responsável pela inibição de fator Xa, enquanto que os domí-nios 1 (D1) e 2 de Kunitz são necessários para a ligação ao complexo defator Vila/fator de tecido (Girard et al. [1989]). Investigações com domíniosde Kunitz expressos de maneira separada de hTFPI mostraram que o fatorXa pode ser inibido somente por domínio 2 de Kunitz, enquanto que o domí-nio 1 de Kunitz também inibe a plasmina (Petersen et al. [1996]). Markland etal. descrevem a preparação de bibliotecas de proteína por variação de hTF-PI D1 por meio de exibição de fago. Eles foram capazes de modificar, atra-vés de mutações na região dos aminoácidos 10 a 21 e 31 a 39, as proprie-dades de hTFPI D1 de uma maneira tal que os domínios de Kunitz delasresultantes são ou inibidores de plasmina seletivos, altamente potentes(Markland et al. [1996a]) ou inibidores de calicreína de plasma seletivos, al-tamente potentes (Markland et al. [1996b]). Baja et al. discutem o significadodos aminoácidos 8 a 20 e 31 a 39 para a atividade inibidora de hTFPI D1(Bajajetal. [2001]).

Variantes de domínios de Kunitz, que inibem plasmina com ele-vada potência e são descritas, de maneira específica, em US 6.010.880; EP0 737 207; US 6.071.723 e US 6.953.674. US 5.795.865; EP 0 739 355 eUS2004/0038893 descrevem variantes de domínios de Kunitz, que inibemcalicreína de plasma com elevada potência e de maneira específica. US6.783.960 descreve proteínas quiméricas consistindo em vários domínios deKunitz de hTFPM e/ou de hTFPI2. Inibidores de calicreína de plasma do tipoKunitz são descritos em US 5.786.328; US 5.780.265 e EP 0 832 232.

Sumário da Invenção

O objetivo da presente invenção é preparar variantes de domínio1 de inibidor 1 de fator de tecido humano (hTFPI D1) com uma atividade queseja comparável a ou melhor do que aquela de aprotinina, tendo, simultane-amente, imunogenicidade significativamente menor. As propriedades dese-jadas são alcançadas por troca de aminoácidos no centro ativo de hTFPI D1pelos aminoácidos correspondentes a partir do centro ativo de outros domí-nios de Kunitz naturais ou não naturais. As quimeras assim geradas inibemtanto plasmina quanto calicreína de plasma com elevada potência.

Descrição Detalhada da Invenção

Domínios de Kunitz, no contexto desta invenção, são homólogosde aprotinina tendo 55 a 62 aminoácidos, que compreendem seis resíduosde cisteína e três pontes de dissulfeto. Os aminoácidos são, conforme mos-trado na Tabela 1, numerados de acordo com os 58 aminoácidos de aproti-nina. Portanto, Cys 1 é aminoácido 5, Cys 6 é aminoácido 55. Na Tabela 1,"x" significa qualquer aminoácido e "X" significa um dos aminoácidos, emcada caso especificados em detalhes. Pontes de dissulfeto são formados,em cada caso, entre as posições Cys 5 - Cys 55; Cys 14 - Cys 38 e Cys 30 -Cys 51.

Inibidores de Kunitz, até agora, foram encontrados, entre outros,em vários vertebrados (por exemplo, seres humanos, gado) e em algunsinvertebrados (caracóis, anêmonas do mar) (Laskowski and Kato [1980] ereferências citadas aqui). Neste pedido, refere-se a tais domínios de Kunitzde ocorrência natural como "domínios de Kunitz naturais". Exemplos de do-mínios de Kunitz naturais são, entre outros, aprotinina, domínio 1 de bicuni-na de placenta humana, domínio 2 de bicunina de placenta humana, o do-mínio de Kunitz do precursor de proteína beta A4 amilóide humano e o do-mínio de Kunitz do precursor de epina humano. As seqüências de algunsdomínios de Kunitz naturais são detalhados na Tabela 2.

É possível, por meio de métodos de engenharia genética, prepa-rar variantes recombinantes de domínios de Kunitz, que diferem de domíniosKunitz naturais em um ou mais aminoácidos. Neste pedido, refere-se a taisdomínios de Kunitz resultando de troca de aminoácidos como "domínios deKunitz não naturais". Vários domínios de Kunitz não naturais foram descritosna literatura (Dennis et al. [1995], Markland et al. [1996a], Markland et al.[1996b], Apeler et al. [2004], EP 0307592). As seqüências de alguns domí-nios de Kunitz não naturais são mostradas na Tabela 3.

O objetivo desta invenção é preparar um domínio de Kunitz, quetenha um efeito clínico que seja comparável a ou melhor do que aquela deaprotinina, mas, que provoque significativamente menos de uma reação a-lérgica em seres humanos do que a aprotinina. hTFPI D1 é um domínio deKunitz humano tendo a seqüência

MHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFMFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD (Seq No. 2).

Devido a origem humana, nenhuma reação alérgica comparávelàquela de aprotinina deve ser esperada quando da aplicação de hTFPI D1em seres humanos.

Aprotinina é um potente inibidor de plasmina e calicreína deplasma (Tabela 4), cujo efeito clínico é atribuído à coagulação intrínseca desangue (ativação por contato), à inibição de fibrinólise e à redução de forma-ção de trombina (Blauhut et al. [1991], Dietrich et al. [1995]). Em contraste aisso, hTFPI D1 é um inibidor consideravelmente mais fraco de plasmina e,além disso, não mostra qualquer efeito inibidor sobre calicreína de plasma(Tabela 4). O objetivo desta invenção é, portanto, preparar variantes dehTFPI D1 com potencial imunogênico mínimo e que, adicionalmente, inibatanto plasmina quanto calicreína de plasma com elevada potência. Variantespreferidas de acordo com a invenção inibem plasmina com uma CI5o de <100 nM, mas, melhor, com uma Cl50 de < 10 nM. Calicreína de plasma é ini-bida por variantes preferidas de acordo com a invenção, com uma Cl50 < 100nM, mas, melhor, com uma CI5o de < 10 nM.Variantes de acordo com a invenção de hTFPI D1 são produzi-das por formação de quimeras entre hTFPI D1 e outros domínios de Kunitznaturais e não naturais. A formação das quimeras ocorre por troca de um oumais aminoácidos no centro ativo de hTFPI D1 por aminoácidos correspon-dentes a partir do centro ativo de outros domínios de Kunitz naturais e nãonaturais. O centro ativo inclui os aminoácidos 10 a 21 e 31 a 39 do domíniode Kunitz correspondente. De maneira surpreendente, constatou-se que va-riantes de hTFPI D1, produzidas por meio disso, exibem propriedades quesejam comparáveis não somente àquelas de aprotinina, mas, em alguns ca-sos, são distintamente melhores. Portanto, por exemplo, constatou-se quevariantes de TFPI de acordo com a invenção têm um efeito inibidor substan-cialmente mais forte sobre calicreína de plasma do que aprotinina (Tabela4). Em adição, constatou-se que variantes de TFPI de acordo com a inven-ção têm um efeito anticoagulante similar ou distintamente aperfeiçoadocomparado com aprotinina (figura 3, figura 8). A fibrinólise, em plasma hu-mano, foi inibida por variantes de TFPI de acordo com a invenção com umapotência comparável àquela de aprotinina (figura 2, figura 7).

O efeito hemostático de variantes de TFPI de acordo com a in-venção foi testado em vários modelos animais. Em um modelo de sangra-mento em rato, variantes de TFPI de acordo com a invenção mostraram umefeito comparável àqueles de aprotinina (figura 4, figura 9). O tempo de san-gramento mesentérica em rato foi reduzido por aprotinina e variantes de TF-PI de acordo com a invenção com potência comparável (figura 11, figura 12),O efeito antitrombótico de variantes de TFPI de acordo com ainvenção foi investigado em um modelo de desvio arteriovenoso em rato.Nesse caso, variantes de TFPI de acordo com a invenção mostraram umefeito antitrombótico comparável àquele de aprotinina (figura 10).

Possíveis efeitos indesejados de variantes de TFPI de acordocom a invenção sobre o sistema cárdio-vascular foram examinados em ratosanestesiados. Variantes de TFPI de acordo com a invenção não mostraramqualquer efeito sobre a pressão do sangue e ECG, quando de administraçãointravenosa de uma dose de até 50 mg/Kg (Tabela 8).Trauma, reperfusão e circulação extracorpórea são causas deprocessos inflamatórios complexos, com ativação de sistemas em cascatahumoral e celular. Isso conduz à ativação de, entre outros, leucócitos e pla-quetas, o que causa os efeitos colaterais clinicamente observáveis, tais co-mo formação de edema e lesão a órgãos (Hess PJ Jr. [2005]). Vários estu-dos mostram possíveis efeitos de aprotinina sobre o estado inflamatório depacientes com "bypass" (Asimakopoulos G. et al. [2000]). A possível influên-cia de variantes de TFPI de acordo com a invenção sobre processos infla-matórios foi testada em vários sistemas de teste celulares. Portanto, varian-tes de TFPI de acordo com a invenção inibiram a quimiotaxia induzida porIL-8 e por C5a de neutrófilos com uma potência que é comparável a ou ligei-ramente melhor do que aquela de aprotinina (figura 13, Tabela 6). O aumen-to de permeabilidade induzido por CAP-37 foi igualmente inibido por varian-tes de TFPI de acordo com a invenção com uma potência comparável a ouligeiramente melhor do que aquela de aprotinina (figura 14, Tabela 7).

Variantes de acordo com a invenção de hTFPI D1 têm a fórmulageral

MhsfcafkaXjOXI1GPCX15X16Xj7X18X19X20X2iX^RD

OU

EAMHsFcAFKAx10XnGpcx15X15X17X18X1^20X21X22FNlFTRQCEEnyGGCEGNQNRFEsLEECKJCMCTRD.

Nisto, "X" é um aminoácido de um domínio de Kunitz de acordocom a numeração mostrada na Tabela 1. Esse aminoácido pode ser deriva-do ou a partir de hTFPI D1 ou a partir de outros domínios de Kunitz naturaisou não naturais detalhados nas Tabelas 2 e 3. Variantes de acordo com ainvenção são produzidos por troca de pelo menos um aminoácido de hTFPID1 por outro aminoácido do domínio de Kunitz natural ou não natural corres-pondente. Aminoácido a partir de domínios de Kunitz naturais e não naturais,que, de preferência, podem ser trocados pelos aminoácido correspondentesa partir de hTFPI D1 estão resumidos, por meio de exemplo, na Tabela 5.

As seguintes variantes de hTFPI D1 são particularmente preferidas:MHSFCAFKAETGPCRAAHPRWFFhra^RQCEEFIYGGCEGNQNl^ESLEECKKMCTRD (Seq No. 4)

MHSFCAFKAETGPCRAAHPRWWFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD (Seq No. 5).

EAIVlHSFCAFKAETGPCRAAHPRWFFNIFrRQCEEFIYGGCEGNQNRFESIiECKKMCTRD (Seq No.

19)

EAMHSFCAFKAETGPCRAAHPRWWFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD (Seq No.

20).

Os valores de Cl50 de algumas variantes de hTFPI D1 de acordocom a invenção para a inibição de tripsina, plasmina e calicreína de plasmaestão resumidas na Tabela 4.

Outras variantes de acordo com a invenção de hTFPI D1 sãomostradas na figura 1.

Essa invenção também se refere a medicamentos, que compre-endem uma ou mais das variantes de acordo com a invenção de hTFPI D1.

Os novos domínios de Kunitz descritos são adequados para otratamento dos seguintes estados patológicos:

perda de sangue associada com operações com um risco au-mentado de hemorragia; terapia de condições tromboembolíticas (por exem-plo, depois de operações, acidentes), choque, politrauma, sepse, coagula-ção intravascular disseminada (DIC), falência de múltiplos órgãos, anginainstável, infarto do miocárido, acidente vascular cerebral, embolia, trombosede veia profunda, distúrbios inflamatórios (por exemplo, reumatismo, asma),crescimento de tumor invasivo e metástase, terapia de dor e de edema (e-dema cerebral, edema da medula espinhal), prevenção de ativação de he-mostase no tratamento de diálise, tratamento de sintomas de envelhecimen-to da pele (elastose, atrofia, enrugamento, alterações vasculares, alteraçõesde pigmento, queratose actínica, pústulas, cistos), câncer de pele, tratamen-to de sintomas de câncer de pele (queratose actínica, carcinoma de célulasbasais, carcinoma de células escamosas, melanoma maligno), esclerosemúltipla, fibrose, hemorragia cerebral, inflamações do cérebro e de medulaespinhal, infecções do cérebro.

Concretizações Exemplares

Exemplo 1

Clonagem do domínio 1 de inibidor de fator de tecido humano (hTFPI, inibi-dor de via de fator de tecido) e geração de variantes de TFPI

O vetor pYES2 de lançamento de E.coli/S.cerevisiae comercial-mente disponível (Invitrogen) foi modificado (vide Apeler [2005]) e serviucomo material de partida para a construção dos vetores plU10.10W eplU3.12.M de secreção em levedura.

plU10.10.W

Promotor de MFaI - MFa1-Met1-Arg2 ... pré-sequência ... Ala17-Leu18-Ala19|peptidase de sinal

plU3.12.M

Promotor de MFaI - MFa1-Met1-Arg2 ... pré-pró-sequência ... Asp83-Lys84-Arg85|protease de Kexll

O domínio 1 de TFPI humano de ocorrência natural (hTFPI D1,acc. P10646, aminoácido Met49 - Asp107, aqui: Meti - Asp58) foi fundidocomo gene sintético (otimizado para uso de códon de S.cerevisiae) ou a A-Ia19 no vetor plU10.10.W de secreção em levedura (via os sítios de cliva-gem de restrição BsaB! e Xhol) ou a Arg85 no vetor plU3.12.M de secreçãoem levedura (por meio de PCR e os sítios de clivagem de restrição Hindlll eBamHI).

Clonagem de hTFPI D1 em vetor plU10.10.W de secreção em levedura

O gene preparado de maneira sintética para hTFPI D1 (Seq. Ne2) foi subclonado por meio da enzima de restrição BsaBI (5') e Xhol (3') novetor plU10.10.W de secreção em levedura (figura 5) e a seqüência de nu-cleotídeos foi verificada por análise de seqüência de DNA. A preparação devariantes de hTFPI D1 em levedura, por transformação de plU10.10.W con-duz à expressão de variantes de hTFPI D1 tendo a seqüência de aminoáci-dos N-terminal de MHSF.

Clonagem de hTFPI D1 em vetor plU3.12.M de secreção em levedurahTFPI D1 (Seq. Nq 2) foi subclonado por meio da reação em ca-deia com polimerase (PCR) e iniciadores de PCR apropriados com sítios declivagem de restrição adequados (iniciador de PCR 1/Hindlll, 5' e iniciadorde PCR 2/BamHI, 3') no vetor plU3.12.M de secreção em levedura (figura 6)e a seqüência de nucleotídeos foi verificada por análise de seqüência deDNA.

Os seguintes iniciadores de PCR 1 e 2 foram usados para sub-clonagem de hTFPI D1 no vetor plU3.12.M de secreção em levedura. Se-qüências de reconhecimento para as enzimas de restrição (Hindlll, BamHI)usadas para a subclonagem são sublinhadas.

Hindm

PCRiriciactorde 5'- GGTAAGCTTGGATAAAAGAGAAGCTATGCATTTTTTTTGTGCTTTTAA -3'

BamHl

PCRnciactorde 2: 5'- TAGTGGATCCCGAGCTTGCTTATTAATCTCTAGTACACATT -3'

A preparação de variantes de hTFPI D1 em levedura por trans-formação de plU3.12.M conduz à expressão de variantes de hTFPI D1 tendoa seqüência de aminoácidos N-terminal EAMHSF.Geração de variantes de hTFPI D1Variante 1: TFPI mut1 (Seq. N2 1)

TFPI mut1 tem as seguintes trocas de aminoácidos por compa-ração com hTFPI D1: K15R, I17A, M18H, K19P, F21W

TFPI mut1 foi gerado por meio de PCR e iniciadores de PCRmodificados de maneira apropriada (iniciadores de PCR 3 e 4).Iniciador de PCR 3:

NsiI

5' -CTAJ£CArrCTTTTTGTGCTTTTAAAGCT^CAATATTTTTACAAGACA- 3'

Iniciador de PCR 4:XhoI

5' -TCCCTCGAGTTATTAATCTCTAGTACACAT- 3"

Trocas de nucleotídeos conduzindo a trocas de aminoácidoscorrespondentes são mostradas em negrito com um fundo cinza no iniciadorde PCR 3.

O fragmento de DNA amplificado com iniciadores de PCR 3 e 4foi clonado via os sítios de clivagem de restrição Nsil (5') e Xhol (3') no vetorplU10.10.W de secreção em levedura. Os iniciadores de PCR descritos naseção 2 (iniciador de PCR 1 e iniciador de PCR 2) foram usados para sub-clonagem de TFPI mut1 no vetor PIU3.12.M de secreção em levedura. Asseqüências de nucleotídeos foram verificadas em cada caso por análises deseqüência de DNA.

Variante 2: TFPI mut3 (Seq. N9 4)

TFPI mut3 tem, por comparação com hTFPI D1 e TFPI mut1,trocas de aminoácidos adicionais: D10E, D11T, K15R, I17A, M18H, K19P,F21W (Seq Ne 4)

TFPI mut3 foi gerado por mutagênese in vitro (usando o kit demutagênese sítio-dirigida Quick-change Il XL, a partir de Stratagene), partin-do de TFPI mut1 usando os iniciadores de mutagênese 1 e 2.

A seqüência inicial em TFPI mut1 (seqüência parcial) a ser mu-tada é

-TTTGTGCTTTTAAAGCTGATGATGGTCCATfiTAGAGrTfirTr- 3'CAF K ADDGPCR AA

Iniciadorde mutagênese 1:

5'-lTTGTGCTTITAAAGCrGAA^CTGGTCCATGrAGAGCTGCTC- 3'

O iniciador de mutagênese 1 compreende, ao invés dos tripletesGAT/D10 e GAT/D11, os tripletes modificados GAA e ACT1 e, portanto, con-duz às trocas de aminoácidos D10E and D11T.Iniciador de mutagênese 2:

: (5'-GAGCAGCTCTACATGGACCAcM"rcAGCTTTAAAAGCACAAA- 3') é complementarao iniciador de mutagênese 1.

A mutagênese foi realizada de acordo com as informações dofabricante, e a seqüência de nucleotídeos foi, então, verificada por análisede seqüência de DNA.

Exemplo 2

Transformação de Saccharomyces cerevisiae

Células de levedura, por exemplo, da cepa JC34.4D (MATa, u-ra3-52, suc2) foram cultivadas em 10 mL de YEPD (2% de glicose; 2% depeptona; 1% de extrato de lêvedo Difco) e coletadas em uma DOeoonm de 0,6a 0,8. As células foram lavadas com 5 mL de solução A (sorbitol a 1 M; bici-na a 10 mM pH 8,35; de etileno glicol a 3%), ressuspenso em 0,2 mL de so-lução A e armazenadas em -70°C.

DNA de plasmídeo, que compreende o gene que codifica TFPImut3EA (5 pg), e DNA de veículo (50 pg) de DNA de esperma de arenqueforam adicionados às células congeladas. As células foram, então, descon-geladas por agitação a 37°C durante 5 minutos. Depois de adição de 1,5 ml_de solução B (PEG 1000 a 40%; bicina a 200 mM pH 8,35), as células foramincubadas a 30°C durante 60 minutos, e, depois de peletização, lavadas com1,5 mL de solução C (NaCl a 0,15 M; bicina a 10 mM pH 8,35) e ressuspen-sas em 100 pL de solução C. O plaqueamento ocorreu em um meio de sele-ção com 2% de ágar. Os transformantes foram obtidos depois de incubaçãoa 30°C, durante 3 dias.

Exemplo 3

Preparação de TFPI mut3EA por fermentação das células de leveduraSoluções nutrientes

As seguintes soluções nutrientes foram usadas para fermenta-ção de células de levedura para expressar TFPI mut3EA:

<table>table see original document page 13</column></row><table>Solução de elementos traço 4 (solução SL4):

Titriplex ΠΙ (Merck 8418) 5 g

FeSO4-TH2O (Merck 3965) 2 g

ZnSO4 · 7H20 (Merck 8883) 0.1 g

MnCl2 · 4H20 (Merck 5927) 30 mg

H3BO3 (Merck 165) 0.3 g

CoCl2 · 6H20 (Merck 2533) 0.2 g

CuCl2 ·2Η20 (Merck 2733) 10 mg

NiCl2 -6H20 (Merck 6717) 20 mg

Na2MoO4 ·2Η20 (Merck 6521) 30 mg

Os ingredientes da solução SL4 foram dissolvidos em águadesmineralizada e o pH foi ajustado para pH 3 - 4 com NaOH. A solução nu-triente foi completada para 1.000 ml_ com água desmineralizada e armaze-nada em alíquotas a -20°C.

Os ingredientes de soluções nutrientes SD2 e SC5 foram prepa-radas em água desmineralizada e o pH foi ajustado para pH 5,5. A esterili-zação ocorreu a 1210C durante 20 minutos. Glicose foi dissolvida em 1/5 dovolume exigido em água desmineralizada, esterilizada de maneira separada,e, depois do resfriamento, adicionada à solução nutriente restante.

Estoques de Cepas

Estoques de cepas de todos os transformantes de levedura fo-ram estabelecidos por mistura de alíquotas de 1 mL de uma pré-cultura com1 mL de solução de glicerol a 80 e armazenamento a -140°C.

Pré-culturas

As fermentações de pré-culturas foram realizadas em frascosagitados de 50 mL (para culturas principais de pequenos volumes) ou emfrascos agitados de 1 litro (para culturas principais de volumes intermediá-rios), carregadas com, respectivamente, 10 ou 100 mL de solução nutrienteSD2. A inoculação ocorreu com um estoque de cepas ou com uma únicacolônia a partir de uma placa de ágar com SD2. As culturas foram incubadascom agitação contínua (240 rpm) a 28 - 30°C, durante 2 - 3 dias.

Fermentações de Culturas Principais

As fermentações de culturas principais em uma pequena escalaocorreu com o uso de um frasco agitado de 1 litro carregado com 100 mL desolução nutriente SC5. De maneira usual, a inoculação ocorreu com 3 mL dapré-cultura descrita acima. As culturas foram, então, incubadas com agitaçãocontínua (240 rpm) a 28 - 30°C, durante 4 dias.

No caso das fermentações de culturas principais na escala in-termediária, foi empregado o sistema de biorreator a partir de Wave Biotech(Tagelswangen, CH). Especificamente, 1.000 mL de meio SC5 foram inocu-Iados com 30 mL de pré-cultura e incubados em uma Wavebag" com umataxa de agitação de 32/min durante 4 dias (ângulo: 10°; suprimento de ar:0,25 litros/min). O pH das culturas foi monitorado no dia 1 a 3 e ajustado pa-ra pH 5 - 6, se necessário com a 5 M NaOH. No dia 1 a 3, 1 mL de soluçãode extrato de lêvedo com 50% de força e 4 mL de solução de glicose a 4 Mforam adicionados a cada uma das culturas de 100 mL.

No caso das culturas de 1.000 mL, de maneira apropriada, 10 ou40 mL das soluções nutrientes foram adicionadas de maneira contínua du-rante o dia. Para monitorar o crescimento, a DOeoo nm das culturas foi deter-minada em vários tempos.

Depois de 4 dias, os sobrenadantes livres de células foram cole-tados por centrifugação (15 min a 6.000 rpm em um rotor JA14).

Exemplo 4

Purificação de TFPI mut3EA a partir dos sobrenadantes de células de leve-dura fermentadas

NaOH a 1M foi adicionado aos sobrenadantes livres de célulascontendo TFPI mut3EA preparados na fermentação de cultura principal atéque o pH fosse de 7,8. Partículas suspensas presentes no sobrenadantesforam sedimentadas por centrifugação a 2.000 rpm a 4°C (15 min; Beckman-Allegra 6KR). O sobrenadantes foi carregado a 1 mL/min por sobre uma co-luna de tripsina-agarose de 10 mL (Sigma-T1763). A coluna foi, então, lava-da com 70 mL de Tris a 50 mM pH 7,8, NaCI a 250 mM e com a 50 mL deTris a 50 mM pH 7,8, NaCI a 600 mM. TFPI mut3EA foi, então, eluído com180 mL de KCI a 50 mM/HCI a 10 mM pH 2,0. As frações de 2 mL foram co-letadas em tubos, cada um dos quais continha 500 pL de Tris a 200 mM pH7.6, NaCl a 2 M para neutralização. Frações contendo TFPI mut3EA foramidentificadas via a inibição de tripsina no ensaio descrito abaixo.

Frações que inibem tripsina foram reunidas e dialisadas em umtubo de diálise com um corte de 1.000 Dálton (Spectra/POR6) duas vezescontra 2 litros de Tris a 50 mM pH 7,5 de cada vez. O dialisado foi concen-trado através de uma membrana de ultrafiltração com um corte de 1.000 Dál-ton em uma célula agitada Amicon 8200. A concentração de proteína foi,então, determinada usando-se um teste Coomassie plus (Pierce, 23236)conforme indicado pelo fabricante. A concentração de proteína medida esta-va tipicamente entre 0,1 e 6 mg/mL.

Alternativamente, as frações que inibem tripsina foram reunidasdepois da purificação sobre tripsina-agarose e misturadas com o mesmovolume de TFA a 0,1%, e carregadas por sobre uma coluna Source 15 RPC.A coluna foi lavada com 6 mL de TFA a 0,1% (tampão de HPLC-A) e, então,TFPI mut3EA foi eluído com um gradiente de 25 mL para tampão de HPLC-B a 50% (TFA a 0,1%, acetonitrila a 60%) e com um gradiente de 5 mL adi-cional para tampão de HPLC-B a 100%. Os eluados contendo TFPI mut3EAforam Iiofilizados e o Iiofilizado foi absorvido em 250 μί de Tris a 50 mM pH7,5 por fração.

Exemplo 5

Determinação da potência inibidora de TFPI mut3EA para tripsina, plasminae calicreína de plasma

A potência inibidora de TFPI mut3 sobre as atividades enzimáti-cas de tripsina, plasmina e calicreína de plasma foram determinadas com oauxílio de substratos fluorogênicos em ensaios bioquímicos em placas demicrotitulação de 384 cavidades brancas. O tampão de ensaio era compostopor Tris/Cl a 50 mM, pH 7,4, NaCI a 100 mM, CaCl2 a 5 mM, 0,08% (p/v) deBSA. As condições de ensaio foram, especificamente, como se seguem:

<table>table see original document page 16</column></row><table><table>table see original document page 17</column></row><table>

10 μL. de uma diluição serial de TFPI mut3EA foram introduzidosem cada cavidade e pré-incubada com 20 μΐ_ de enzima a TA durante 5 mi-nutos. A reação foi, então, iniciada por adição de 20 μΙ_ de substrato a cadauma. A medição ocorreu depois de 60 - 90 minutos em uma leitura Tecancom um comprimento de onda de excitação de 360 nm e com um compri-mento de onda de emissão de 465 nm. Gráficos de dose - atividade e cons-tantes de inibição semimáximas (valores de Cl50) foram determinadas usan-do o programa de computador GraphPad Prism (versão 4.02).

Exemplo 6

Inibição de fibrinólise por variantes de hTFPI D1

O efeito das variantes de hTFPI D1 foi testado em um modelo defibrinólises in vitro e comparado com o efeito de Trasylol (aprotinina). Plasmacitrado humano foi misturado com o fator de tecido (TF) a 0,13 pM e 164U/mL de ativador de plasminogênio de tecido (tPA) e com variantes de hTF-Pl D1 ou aprotinina em várias concentrações (0,06 μΜ a 15 μΜ) e incubadosa 37°C durante 40 minutos. Solução salina fisiológica foi usada como contro-le. A formação de coágulo por TF e a subseqüente Iise de coágulo por tPafoi determinada por medições da densidade óptica (DO405 nm) com um TecanSafire. A área sob a curva (AUC) resultante a partir disso foi calculada e Ian-çada em gráfico contra as concentrações das substâncias. Uma redução naAUC significa a inibição de fibrinólise. Em experimentos posteriores, a fibri-nólise foi definida como diminuição relativa na DO óptica depois da formaçãode coágulo. A inibição da diminuição relativa na DO é a medida da atividadeantifibrinolítica. A atividade antifibrinolítica de TFPI mut3EA e de TFPImut4EA era comparável àquela de Trasylol.

Exemplo 7

Inibição de coagulação por variantes de hTFPI D1

O efeito de variantes de hTFPI D1 foi testado em um modelo decoagulação in vitro e comparado com o efeito de Trasylol (aprotinina). Plas-ma citrado humano foi misturado com CaCI2 a 12 mM para induzir a coagu-lação e com as variantes de hTPFI D1 ou aprotinina em várias concentra-ções (0,1 μΜ a 25 μΜ). Solução salina fisiológica foi usada como controle. ADO a 405 nm foi determinada como uma medida da coagulação durante aincubação a 37°C durante 90 minutos. O tempo de coagulação semimáximafoi calculado a partir disso. Um prolongamento do tempo de coagulação se-mimáxima significa inibição de coagulação. Por comparação com Trasylol, aatividade anticoagulante de TFPI mut3EA foi aumentada e aquela de TFPImut4EA foi ligeiramente aumentada.

Exemplo 8

Efeito hemostático de variantes de hTFP! D1 em um modelo de sangramen-to em ratos

Ambas as veias jugulares de ratos anestesiados foram canula-das com um cateter de polietileno. Para prolongar o tempo de sangramentonormal, os ratos foram infundidos com tPA (ativador de plasmina de tecido)(8 mg/Kg/h) ao longo de todo o experimento. 10 minutos depois do início dainfusão com tPA, os animais foram tratados com as variantes de hTFPI D1ou Trasylol (aprotinina) por infusão ou com administração de pílula grande esubseqüente infusão de manutenção combinadas. No primeiro experimento,TFPI mut3EA ou Trasylol foram administrados em uma dose de 6 mg/Kg/hpor infusão contínua. No segundo experimento, os animais foram tratadoscom TFPI mut4EA ou Trasylol em doses de 1,5 mg/Kg (pílula grande) e 3mg/Kg/h (infusão) até 5 mg/Kg e 10 mg/Kg/h. Solução salina fisiológica foiusada como controle em ambos os experimentos. 15 minutos depois do iní-cio da infusão, uma transecção da cauda (2 mm) foi realizada, a ponta dacauda foi imersa em solução salina fisiológica a 37°C, e o tempo de sangra-mento foi determinado. O tempo de sangramento foi definido como o interva-Io de tempo entre a transecção e o final visível de sangramento. O encurta-mento do tempo de sangramento era a medida do efeito hemostático. O efei-to hemostático de TFPI mut3EA e TFPI mut3EA era comparável àquele deTrasylol.

Exemplo 9

Efeito antitrombótico de TFPI mut4EA em um modelo de desvio arterioveno-so (AV) em ratos

O efeito antitrombótico de TFPI mut4EA foi investigado em ummodelo de desvio arteriovenoso em ratos. A artéria carótida e a veia jugularde ratos anestesiados foram canulados com um cateter de polietileno, e oscateteres foram conectados em conjunto por um pequeno pedaço de tubo(desvio). Um laço de náilon grosseiro foi introduzido no tubo e serviu comosuperfície trombogênica. A formação de trombo foi seguida depois de circu-lação extracorpórea do sangue através do desvio durante 15 minutos. Otrombo resultante foi, então, removido a partir do tubo, e o peso do trombofoi determinado. Os ratos foram tratados com TFPI mut4EA ou Trasylol (a-protinina) por administração de pílula grande e infusão de manutenção sub-seqüente. As doses empregadas foram de 0,15 mg/Kg (pílula grande) e 0,3mg/Kg/h (infusão) até 5 mg/Kg e 10 mg/Kg/h. A solução salina fisiológica foiusada como controle. A redução no peso de trombo foi a medida do efeitoantitrombótico. TFPI mut4EA mostrou um efeito antitrombótico comparávelàquele de Trasylol.

Exemplo 10

Influência de Trasylol e de TFPI mut4EA sobre o tempo de sangramentomesentérico relativo em ratos

Ratos Wistar (250 - 300 g) foram anestesiados intraperitoneal-mente (tiopental sódico, 100 mg/Kg) e dotados com um cateter de veia. De-pois de abertura do abdômen, um laço do intestino delgado foi transferidopara o lado de fora. Enquanto se irrigava com solução de solução salinamorna, uma pequena artéria mesentérica foi servida com o auxílio de micro-tesouras sob um estereomicroscópico. O tempo de sangramento de três cor-tes de controle antes da administração da substância e de um corte depoisde administração da substância de teste foram medidos. O tempo de san-gramento depois do tratamento com a substância foi relacionado ao tempode sangramento de controle antes da administração da substância a cadaanimal individualmente.

Trasylol reduziu o tempo de sangramento mesentérico de manei-ra dependente de dose (figura 11). A administração de 1,5 mg/Kg de Trasylolcomo pílula grande com infusão subseqüente (3 mg/Kg/h) não teve quais-quer efeitos significativos sobre o tempo de sangramento. Uma dose maiselevada de 5 mg/Kg como pílula grande com 10 ou 30 mg/Kg/h como infusãoreduziu o tempo de sangramento de maneira correspondente em 28,5 ±7,4% e 42,7 ± 4,2%.

TFPI mut4EA (figura 12) reduziu o tempo de sangramento me-sentérico de uma maneira similar a Trasylol. A administração de 5 mg/Kg deTFPI mut4EA como pílula grande e 10 mg/Kg/h como infusão encurtaram otempo de sangramento em 23,6%. O maiores efeitos de TFPI mut4EA foramobservados depois de administração de 5 mg/Kg, como pílula grande, e de30 mg/Kg/h, como infusão. Nessa dose, TFPI mut4EA reduziu o tempo desangramento em 31,7%.

Exemplo 11

Investigações do efeito de variantes de hTFPI D1 sobre o sistema cárdio-vascular em ratos anestesiados

Os ratos foram anestesiados com pentobarbital sódico. Duranteo experimento, os ratos respiraram espontaneamente, e a temperatura cor-poral foi mantida constante por uma manta de aquecimento. A pressão desangue arterial foi medida via um cateter na artéria carótida usando umtransdutor de pressão e uma ponte de medição de pressão. O ECG foi regis-trado com os 3 terminais condutores de extremidade-padrão por meio de umamplificador de ECG. Os sinais medidos foram adquiridos, avaliados e ar-mazenados por um programa de computador. A pressão de sangue sistólica,diastólica e média e a taxa cardíaca foram calculados a partir do sinal depressão do sangue. O ECG foi aferido adicionalmente e avaliado manual-mente depois do experimento. Adicionalmente, houve registro análogo dossinais de pressão de sangue e de ECG.

Seguindo a instalação dos cateteres e uma fase de curso (pres-são de sangue constante e taxa cardíaca), TFPI mut3EA ou TFPI mut3EA foiadministrada i.v. como injeção de pílula grande ou infusão contínua. Depoisde um período de observação, o experimento foi terminado por sacrifício dosanimais por uma superdose anestésica.

Exemplo 12

Inibição da quimiotaxia induzida por IL-8 e C5a de neutrófilos por variantesde hTFPI D1

Neutrófilos foram isolados a partir de sangue por métodos pa-drão. Quimiotaxia dos neutrófilos foi realizada em um sistema de duas câma-ras. Uma monocamada de HUVEC foi cultivada sobre a membrana usada(tamanho de poro de 3 μαι, policarbonatos, a partir de Falcon) durante 24horas.

1 χ 105 neutrófilos em meio RPMI 1640, que tinha sido previa-mente carregado com um corante fluorescente, foram colocados na câmarasuperior. A câmara inferior continha concentrações variáveis de estímulos ouuma concentração de estímulo constante (IL-8: 5 nM ou C5a: 10 nM) e con-centrações variáveis das substâncias de teste Trasylol (aprotinina), TFPImut3EA ou TFPI mut4EA. As substâncias a serem investigadas estavampresentes em ambas as câmaras. A mistura de teste foi incubada a 37°C e a5% de CO2 durante 45 minutos. Depois da incubação, as células que tinhammigrado para a câmara inferior foram determinadas (medição de fluorescên-cia, contagem).

Exemplo 13

Inibição do aumento induzido por CAP-37 de permeabilidade por variantesde hTFPI D1

Uma monocamada de confluência de HUVEC foi cultivada sobrea membrana da inserção em um sistema de duas câmaras (Falcon). Paraessa finalidade, 2 χ 105 células foram semeadas por inserção e incubadas(37°C/C02 a 5%) durante 18-20 horas. A continuidade da monocamada foiverificada por meio de uma solução de albumina conjugada com azul de tri-pano antes do início do experimento. A seguir, CAP37 (5 μΜ) foi colocadona câmara superior. A mudança de permeabilidade foi determinada na pre-sença de concentrações variáveis (10 μΜ - 0,01 μΜ) das substâncias de tes-te Trasylol (aprotinina), TFPI mut3EA ou TFPI mut4EA durante 3 horas. Oefluxo da solução de albumina conjugada com azul de triptano serviu, nestecaso, como indicador da mudança de permeabilidade. A DO é medida a 590 nm.Referências

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Wun1 T.-C. et al. (1988). J Biol Chem 263, 6001-6004.Abreviações (em Inglês)

AUC área sob a curvaBPTI inibidor de tripsina pançreática bovinaDIC coagulação intravascular disseminadaDNA ácido deoxirribonucléicoECG eletrocardiogramaHepG2 linhagem de células de hepatoma humanoHPLC cromatografia líquida de alto desempenhohTFPI inibidor 1 de via de fator de tecido humanohTFPI D1 Domínio 1 de Kunitz de inibidor 1 de via de fator de tecido humanoHUVEC células endoteliais de veia umbiljcal humanaCI50 Inibidor de concentração em inibição de 50% de atividade enzimáticaIL-8 interleucina 8i.v. intravenosokDa KilodáltonLACI inibidor de coagulação associado à lipoproteínàM molar (mol por litro)Min MinutoMOF falência de múltiplos órgãosDO AbsorçãoPEG polietileno glicolPCR reação em cadeia com polimeraseRpm rotações por minutoTF fator de tecidoTFA ácido trifluoroacéticoTPA ativador de plasminogênio de tecidoU unidade (unidade de atividade enzimática)

Descrição das Figuras

A figura 1 mostra a seqüência de aminoácidos de algumas vari-antes preferidas de acordo com a invenção de hTFPI D1, também as se-qüências de aprotinina (BPTI) e hTFPI D1.

A figura 2 mostra o efeito de Trasylol (aprotinina) e da variantede acordo com a invenção TFPI mut3EA (Seq. Ne 19) sobre a fibrinólise emplasma humano (in vitro).

A figura 3 mostra o efeito de Trasylol (aprotinina) e da variantede acordo com a invenção TFPI mut3EA (Seq. Ne 19) sobre a coagulaçãoem plasma humano (in vitro).

A figura 4 mostra o efeito de Trasylol (aprotinina) e da variantede acordo com a invenção TFPI mut3EA (Seq. N9 19) sobre o tempo desangramento no rato na presença de tPA (in vivo).

A figura 5 mostra a seqüência de nucleotídeos e a seqüência deaminoácidos derivada do domínio hTFPI D1 sintética (hTFPI D1, em negrito),clonado no vetor plU10.10.W. Seqüências de reconhecimento das enzimasde restrição (BsaBI, Xhol) usadas para a subclonagem estão sublinhadas.

A figura 6 mostra a seqüência de nucleotídeos e a seqüência deaminoácidos derivada do domínio hTFPI D1 sintético (hTFPI D1, em negrito),clonado no vetor plU3.12.M. Seqüências de reconhecimento das enzimas derestrição (Hindlll, BamHI) usadas para a subclonagem estão sublinhadas, eos iniciadores de PCR empregados t~em um fundo em cinza.

A figura 7 mostra o efeito de Trasylol (aprotinina) e da varianteTFPI mut4EA de acordo com a invenção (Seq. N2 20) sobre a fibrinólise emplasma humano (in vitro).

A figura 8 mostra o efeito de Trasylol (aprotinina) e da varianteTFPI mut4EA de acordo com a invenção (Seq. Ne 20) sobre a coagulaçãoem plasma humano (in vitro).

A figura 9 mostra o efeito de Trasylol (aprotinina) e da varianteTFPI mut4EA de acordo com a invenção (Seq. Ns 20) sobre o tempo desangramento no rato na presença de tPA (in vivo).

figura 10 mostra o efeito antitrombótico de Trasylol (aprotinina) eda variante TFPI mut4EA de acordo com a invenção em um modelo de des-vio arteriovenoso (AV) em rato.

A figura 11 mostra o efeito de Trasylol sobre o tempo de san-gramento mesentérico relativo em ratos. O tempo de sangramento depois daadministração da substância de teste foi relacionado ao tempo de sangra-mento de controle médio antes da administração da substância. Os valoresforam mostrados como média ± desvio-parão médio, η = 8.

* diferença significativa a partir do veículo, P < 0,05; *** diferençasignificativa a partir do veículo, P < 0,001.

A figura 12 mostra o efeito da variante TFPI mut4EA de acordocom a invenção sobre o tempo de sangramento mesentérico relativo em ra-tos. O tempo de sangramento mesentérico depois da administração da subs-tância de teste foi relacionado ao tempo de sangramento de controle médioantes da administração da substância. Os valores foram mostrados comomédia ± desvio-parão médio, η = 8.

** diferença significativa a partir do veículo, P < 0,01; *** diferen-ça significativa a partir do veículo, P < 0,001.

A figura 13 mostra a inibição da quimiotaxia induzida por IL-8 deneutrófilos pela variante TFPI mut4EA de acordo com a invenção.

A figura 14 mostra a inibição do aumento induzido por CAP-37de permeabilidade pela variante TFPI mut4EA de acordo com a invenção.

Tabela 1: Definição de um domínio de Kunitz

1 2 3 4 5

1234 5678 9012345 67 8 901234 5678 901234 567 8 9012345678901234 567 8xxxxCxxxxxxGxCxxxxxxXXXxxxxxxCxxFxXXGCxXxxXxXxxxxxCxxxCxxx

X21 = Phe, Tyr, Trp

X22 = Tyr, Phe, Trp, Ala, His

X23 = Tyr or Phe

X35 = Tyr5Phe, Ser

X36 = Gly5 Ser, Arg, Thr

X40 = Gly1 Ala, Arg

X43 = Asn ou -Gly

X45 = Phe ou Tyr

Aminoácidos 1,2,3,4 podem estar ausentesAminoácidos 56, 57, 58 podem estar ausentes<table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table>Tabela 4: Valores de Cl50 de alguns domínios de Kunitz para inibição de trip-sina humana, plasmina e calicreína de plasma

<table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table>

Claims (9)

1. Variantes de hTFPI D1 da fórmula geralMHsFcAFKAx10X11GPCX15Xl6Xl7XlgX19X20X21X22FNiFTRQCEEFiYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRDtendo pelo menos uma mutação nas posições X10, Xn, X15, Xie, X17, Xis, X19,X20. X21 e X22 comparada com a seqüência natural, na qualX10 é o aminoácido D, Ε, Υ, V ou S1X11 é o aminoácido D ou T,X15 é o aminoácido K, ou R,X16 é os aminoácido A1X17 é o aminoácido I, R, S ou A,Xis é o aminoácido Μ, I, F ou H,X19 é o aminoácido Κ, I ou P,X20 é os aminoácido R,X21 é o aminoácido F ou W, eX22 é o aminoácido F ou W,excluindo-se o peptídeo da seqüênciaSEQIDN0I (TFPImutl).

2. Peptídeos de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadicionalmente os aminoácidos E e A no terminal N.

3. Peptídeos de acordo com a reivindicação 1, selecionado apartir do grupo compreendendo:Seq ID N9 3 (TFPI mut13), Seq ID Ne 4 (TFPI mut3), Seq ID Ne 5 (TFPImut4), Seq ID Ne 7 (TFPI mut2), Seq ID N9 8 (TFPI mut5), Seq ID Ne 9 (TFPImut6), Seq ID Ne 10 (TFPI aleatório), Seq ID N9 11 (TFPI mut7), Seq ID Ne-12 (TFPI mut8), Seq ID Ne 13 (TFPI mut9), Seq ID Ns 14 (TFPI mut10), SeqID N9 15 (TFPI mut11) e Seq ID N9 16 (TFPI mut12).

4. Peptídeos de acordo com a reivindicação 2, selecionado apartir do grupo compreendendo:Seq N9 17 (TFPI mut15), Seq N9 18 (TFPI mut13EA), Seq N9 19 (TFPImut3EA), Seq N9 20 (TFPI mut4EA), Seq N9 21 (TFPI mut2EA), Seq N9 22(TFPI mut5EA), Seq N9 23 (TFPI mut6EA), Seq N9 24 (TFPI randomEA), SeqNe 25 (TFPI mut7EA), Seq N9 26 (TFPI mut8EA), Seq N2 27 (TFPI mut9EA),Seq N5 28 (TFPI mutIOEA), Seq Ns 29 (TFPI mut11EA), Seq Ns 30 (TFPImut12EA) e Seq Ns 31 (TFPI mut15EA).

5. DNA que codifica um dos peptídeos como definidos nas rei-vindicações 1 a 4.

6. Vetor, compreendendo o DNA como definido na reivindicação 5.

7. Microorganismo compreendendo o DNA como definidos nasreivindicações 5.

8. Processo para a preparação dos peptídeos como definidosnas reivindicações 1 a 4, por expressão do microorganismo de acordo com areivindicação 5.

9. Medicamento compreendendo um ou mais dos peptídeos co-mo definidos nas reivindicações 1 a 4.