CN101402674B - 附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了附睾蛋白酶抑制剂即Eppin的功能肽段，选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示氨基酸序列中的任一种，其成分单一、结构简单、激发的免疫反应针对性强；与所述Eppin的功能肽段具有至少80％序列相同性的多肽可用于构建免疫原，其能提高Eppin的功能肽段的免疫原性，刺激机体产生特异性抗体，降低血清中Eppin水平，诱导高效、安全、可逆的抗生育作用；本发明免疫原可以和药学上可接受的载体组成药物组合物，用于制备男性避孕疫苗，具有广阔的应用前景。

Description

附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段及应用。

背景技术

人口、资源和环境问题是严重影响本世纪人类生存和经济社会发展的关键问题，避孕节育研究受到极大重视。迄今为止，男性避孕方法还局限于传统的体外排精、绝育术和使用避孕套等，尚无高效、方便、安全、可逆的避孕新措施问世。

几十年来，研究者都试图以生殖相关激素和精子特异性蛋白为靶抗原，将免疫方法应用于男性生育控制，但仍存在诸多问题，如尚未找到最佳的特异性靶抗原，天然抗原的弱抗原性和免疫耐受，免疫避孕效果不理想等。这些问题已成为避孕疫苗发展和应用的巨大障碍。

2001年，人类附睾蛋白酶抑制剂(epididymal protease inhibitor，Eppin)首次被发现，其在睾丸和附睾中优势表达，主要分布于精子表面和精浆中。用保留羧基端的Eppin截短蛋白免疫的雄性猕猴出现可逆性的不育(避孕率7/9，可逆率5/7)，精液分析发现精子的前向运动能力减弱，而精子的数量及体内雄激素水平不受影响，亦未见自身免疫性疾病的发生，表明Eppin是一种极有发展前途的靶抗原，但其为自身抗原，故仍存在免疫原性弱和免疫耐受等问题，此外，未对Eppin中可能导致远期毒副反应的不良肽段做剔除或加工。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供Eppin的功能肽段，选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示氨基酸序列中的任一种。

本发明的目的之二在于提供一种免疫原，包含与所述Eppin的功能肽段具有至少80％序列相同性的多肽。

进一步，包含所述Eppin的功能肽段；

进一步，由Eppin的功能肽段与载体蛋白偶联而成；

进一步，所述载体蛋白选自匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。

本发明的目的之三在于提供一种药物组合物，包含免疫学有效量的所述免疫原和药学上可接受的载体。

本发明的目的之四在于提供能够与所述Eppin的功能肽段特异性结合的抗体。

本发明的目的之五在于提供所述Eppin的功能肽段在制备免疫原中的应用。

本发明的目的之六在于提供所述药物组合物在制备男性避孕疫苗中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了Eppin的功能肽段，选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示氨基酸序列中的任一种，其成分单一、结构简单、激发的免疫反应针对性强；与所述Eppin的功能肽段具有至少80％序列相同性的多肽可用于构建免疫原，其能提高Eppin的功能肽段的免疫原性，刺激机体产生特异性抗体，降低血清中Eppin水平，诱导高效、安全、可逆的抗生育作用；本发明免疫原可以和药学上可接受的载体组成药物组合物，用于制备男性避孕疫苗，为男性避孕的临床主动免疫治疗提供新的手段，具有重要的理论价值和广阔的应用前景，能够产生重大的社会效益和经济效益。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为阳性克隆质粒pPET-32a-Eppin双酶切产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图；

图2为Eppin工程菌表达产物的12％SDS-PAGE图；

图3为重组Eppin的12％SDS-PAGE图；

图4为抗Eppin多克隆抗体的12％SDS-PAGE图。

具体实施方式

本发明采用错位重复套式方法，将Eppin分成32个多肽片段，再将各多肽片段与载体蛋白偶联制得32个免疫原，各免疫原作体外抗Eppin特异性抗体识别检测，再将各免疫原分别与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂组成组合物，以此组合物免疫雄性小鼠，进行体内免疫原性检测和抗生育能力研究，由此筛选出数个免疫原性强、抗体产生稳定、具有高效抗生育能力的免疫原，从而获得Eppin的功能肽段，选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示氨基酸序列中的任一种，其成份单一，结构简单，激发的免疫反应针对性强。

本发明包括与所述Eppin的功能肽段具有至少80％序列相同性的多肽。在本领域中，具有至少80％序列相同性的多肽基本上可以保持原肽段的生物学活性。这些多肽包括但不限于：(1)有一个或几个氨基酸残基被取代、缺失或/和插入的多肽，取代或插入的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；(2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽。根据本文的教导，这些多肽属于本领域技术人员公知的范围。

本发明包括一种免疫原，其包含与Eppin的功能肽段具有至少80％序列相同性的多肽。本发明免疫原的免疫学有效量可根据用药途径、患者的年龄、体重、健康状况和个体反应等变化，通常剂量为每千克体重1-5毫克，这一剂量可以一次或多次施用。

本发明还包括一种药物组合物，其包含免疫学有效量的所述免疫原和药学上可接受的载体，可用于制备男性避孕疫苗等药物形式。所述药学上可接受的载体一般应与免疫原相容且不能对受体有害，例如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等。本领域普通技术人员可以很容易地确定药物剂型，包括速释或/和缓释制剂。各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。所得药物制剂可以通过任何一种便利的途径施用，包括皮下的、口服的、肌内的、腹膜内的，或其他肠胃外的或肠道的途径。

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、Eppin的功能肽段的筛选和鉴定

1、重组Eppin的制备

(1)Eppin重组表达载体的构建

根据Eppin保守区设计并合成如下引物：F1：5′-atgggatcttctggacttttgag-3′，R1：5′-tcagggaaagcgtttattcttgc-3′；以健康人睾丸组织cDNA(Clontech公司)为模板，以F1和R1为上、下游引物进行PCR扩增，PCR产物经质量百分浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收纯化，将纯化的PCR产物插入载体pCR 2.1-TOPO TA(Invitrigon公司)，再转化入CaCl₂法制备的DH5α大肠杆菌感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，酶切法鉴定阳性克隆质粒并测序，获得长402bp、包含全部开放阅读框(0RF)区域的Eppin基因；

根据Eppin基因的ORF序列，设计并合成如下引物：F2：5′-cgcggatccggatcttctggacttttgagcctc-3′，下划线部分为BamH I酶切位点；R2：5′-cccaagcttgggaaagcgtttattcttgcaggtg-3′，下划线部分为Hind III酶切位点；以前面获得的阳性克隆质粒为模板，以F2和R2为上、下游引物进行PCR扩增，PCR产物经鉴定、纯化后用BamH I和Hind III双酶切，再与同样经BamH I和HindIII双酶切的原核表达载体PET-32a进行连接，连接产物转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，酶切法鉴定阳性克隆质粒，双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示：1泳道为EcoT14I酶切的λ-DNA分子量标准(λ-EcoT14 I digest DNA Marker，TAKARA公司)，2泳道为DNA分子量标准，3泳道为双酶切产物，结果双酶切产物显示两条DNA带，其中一条约400bp，与目的片段大小一致；将鉴定正确的阳性克隆质粒测序，序列顺序正确的阳性克隆质粒即为成功构建的重组表达载体pPET-32a-Eppin；

(2)Eppin工程菌的构建

将步骤(1)所得重组表达载体pPET-32a-Eppin转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，酶切法初步鉴定有无插入片段后，再通过序列测定确保插入方向正确，质粒序列正确的阳性克隆即为成功构建的Eppin工程菌；

(3)Eppin的诱导表达

将步骤(2)所得Eppin工程菌接种于100mL含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的液体LB培养基中，于温度37℃、250r/min振摇培养过夜，将所得菌液按1：100(体积比)转入已预热至温度37℃的液体LB培养基中，继续振摇培养至A₆₀₀达到0.6，加入终浓度为0.01mol/L的异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导剂，继续培养3小时后，于温度4℃、5000g离心10分钟，收集细菌沉淀，于冰浴中加入1×结合缓冲液(即浓度为20mmol/L、pH值为7.9的Tris-HCl缓冲液，含有浓度为100μg/mL的溶菌酶、浓度为6mol/L的尿素、浓度为5mmol/L的咪唑和浓度为0.5mol/L的NaCl)，混匀，于冰浴中短时超声破碎细菌，再于温度4℃、15,000g离心20分钟，收集上清液；

取上清液，以质量百分浓度为12％的分离胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，SDS-PAGE图如图2所示：1泳道为蛋白质分子量标准，2泳道为IPTG诱导后的Eppin工程菌的裂解上清，3泳道为IPTG诱导前的BL21(DE3)大肠杆菌的裂解上清，从图可知，Eppin工程菌在IPTG诱导下高效表达Eppin，表达产物为相对分子质量20000的融合蛋白，包含重组表达载体在Eppin羧基端引入的6个组氨酸(His)标签。

(4)Eppin的纯化

取步骤(3)收集的上清液，利用重组表达载体在Eppin羧基端引入的6个His标签，以Ni²⁺-NTA亲和层析柱(Novagen公司)进行纯化，按照层析柱说明书所述步骤操作，先以洗脱液A(即浓度为20mmol/L、pH值为7.9的Tris-HCl缓冲液，含有浓度为100μg/mL的溶菌酶、浓度为8mol/L的尿素、浓度为400mmol/L的咪唑和浓度为0.5mol/L的NaCl)洗脱非特异性结合蛋白，再以洗脱液B(即浓度为20mmol/L、pH值为7.9的Tris-HCl缓冲液，含有浓度为1mol/L的咪唑和浓度为0.5mol/L的NaCl)洗脱目的蛋白，最后以浓度为0.1mol/L、pH值为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)对洗脱出的目的蛋白进行透析，使蛋白复性，即得重组Eppin；

取重组Eppin，以质量百分浓度为12％的分离胶进行SDS-PAGE，SDS-PAGE图如图3所示：1泳道为重组Eppin，2泳道为蛋白质分子量标准；从图可知，经上述方法纯化的重组Eppin蛋白纯度较高。

2、抗Eppin特异性抗体的制备

(1)抗Eppin多克隆抗体的制备

将浓度为60μg/mL的重组Eppin分别与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等体积混合，充分乳化，制得免疫原，免疫体重2.5-3kg的健康雄性新西兰兔2只。免疫步骤为：首次免疫，以Eppin-弗氏完全佐剂免疫原于兔背部皮下多点注射，每只30μg(1mL)；间隔1周，加强免疫，以Eppin-弗氏不完全佐剂免疫原于兔背部皮下多点注射，每只30μg(1mL)；再间隔2周，重复加强免疫1次；于末次免疫后1周，以重组Eppin为检测抗原，用间接酶联免疫吸附(ELISA)法测定免疫兔血清抗体滴度，对抗体滴度达1：51.2万以上的兔行颈动脉采血，分离血清，用蛋白A亲和层析柱(Pierce公司)进行纯化，即得抗Eppin多克隆抗体；

取抗Eppin多克隆抗体，以质量百分浓度为12％的分离胶进行SDS-PAGE，SDS-PAGE图如图4所示：1和4泳道分别为蛋白质分子量标准，2和3泳道分别为两株纯化的抗Eppin多克隆抗体，从图可知，经上述方法纯化的抗Eppin多克隆抗体纯度高。

(2)抗Eppin单克隆抗体的制备

将浓度为60μg/mL的重组Eppin分别与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等体积混合，充分乳化，制得免疫原，免疫体重18-20g的清洁级4-6周龄雄性Ba1b/c小鼠；免疫步骤为：首次免疫，以Eppin-弗氏完全佐剂免疫原于小鼠皮下、腹腔多点注射，每只30μg(1mL)；间隔2周，加强免疫，以Eppin-弗氏不完全佐剂免疫原于小鼠皮下、腹腔多点注射，每只30μg(1mL)；再间隔2周，重复加强免疫1次；于末次免疫后2周，以重组Eppin为检测抗原，用间接ELISA法测定免疫小鼠血清抗体滴度，对抗体滴度达1∶12800以上的小鼠，以不加佐剂的重组Eppin腹腔注射，每只30μg(1mL)；3天后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合；采用无关标签抗原ELISA法测定融合细胞分泌抗体的滴度，以筛选阳性融合细胞，ELISA方法是以重组Eppin为检测抗原，以无关蛋白GST-Bax(即由谷胱甘肽转移酶GST与凋亡调节蛋白Bax组成的融合蛋白)为空白对照，以His空诱标签蛋白为阴性对照，待测孔的吸光度A值大于或等于阴性对照2.1倍者判为阳性；筛选出的阳性融合细胞又进行下一轮培养和筛选，如此往复，直至融合细胞的抗体分泌阳性率达95％以上，共获得稳定分泌抗Eppin单克隆抗体的杂交瘤细胞株10株，用所得杂交瘤细胞株腹腔接种经降植烷预处理的雄性Balb/c小鼠诱生腹水，10天后采集腹水，离心，收集上清，过滤除去杂质，即得含抗Eppin单克隆抗体的腹水，所得含抗Eppin单克隆抗体的腹水采用G蛋白亲和层析柱进行纯化，即得抗Eppin单克隆抗体。

3、Eppin多肽片段的合成

根据Eppin的氨基酸序列，采用错位重复套式方法，将Eppin从氨基(N-)端到羧基(C-)端分解为32条多肽片段，各条多肽片段的简称及序列详见表1，每条多肽片段包含10个氨基酸残基(最靠近C端的片段为9个氨基酸残基)，其中4个氨基酸残基为窗口，6个氨基酸残基为重复序列；采用标准Fmoc方案，在固相多肽合成仪(ABI 431A型)上合成上述32条多肽片段，经高效液相色谱法(HPLC)和质谱法(MS)鉴定，合成的各多肽片段的纯度均大于90％。

表1、Eppin多肽片段的简称及序列

4、免疫原的制备

按多肽片段∶载体蛋白＝40∶1(摩尔比)的比例，将合成的32条Eppin多肽片段分别溶于1mL水，再加入1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)10mg，调节溶液pH值至5，于室温下搅拌10分钟，缓慢加入载体蛋白：匙孔血蓝蛋白(KLH)5mg，继续于室温下搅拌3小时，所得溶液以浓度为0.1mol/L、pH值为7.5的PBS于温度4℃透析过夜，调整偶联蛋白浓度至1mg/mL，真空冷冻干燥，即得32个免疫原。

本发明也可采用牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白，参照上述方法，将Eppin多肽片段与BSA偶联，同样可制得免疫原。

5、免疫原的筛选和鉴定

(1)体外筛选和鉴定

方法：采用间接ELISA法，将制得的32个免疫原分别用包被稀释液(即浓度为0.2mol/L、pH值为9.2-10.7的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)稀释，制成浓度均为25μg/mL的包被液；将各包被液分别加至96孔反应板中，每孔100μl，置温度4℃包被过夜后，弃去包被液，以洗涤液(在1000mL PBS中加入0.5mLTween-20和0.1g硫柳汞，调节pH值至7.4)洗板3次，再加入用PBS稀释至体积百分浓度为5％的小牛血清封闭液，每孔100μL，置温度37℃封闭40分钟，弃去封闭液，以洗涤液洗涤3次，再加入按10倍连续稀释的兔抗Eppin多克隆抗体(稀释度为1∶1000)或小鼠抗Eppin单克隆抗体(稀释度为1∶1000)，每孔100μl，置温度37℃孵育1小时后，弃去抗体溶液，以洗涤液洗板3次，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG或羊抗小鼠IgG(稀释度为1∶5000，Promega公司)，每孔100μl，置温度37℃孵育45分钟后，弃去标记抗体溶液，以洗涤液洗板3次，再加入四甲基联苯二胺(TMB)显色液，置温度37℃孵育10分钟后终止反应，测量450nm波长处的吸光度A值；同时，设阳性对照组(重组Eppin)、阴性对照组(KLH)和空白对照组(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)；结果以三复孔A值均值表示，待测孔A值大于或等于阴性对照2.1倍者判为阳性。

结果：32个免疫原中KLH-YK和KLH-WC既能被抗Eppin多克隆抗体识别，又能被2株抗Eppin单克隆抗体识别，提示YK与WC可能为Eppin的功能肽段。

(2)体内筛选和鉴定

方法：a、实验动物分组：将100只体重为18-20g的清洁级4-6周龄雄性Balb/c小鼠随机分成10组(见表2)：KLH-YK实验组等共8个实验组，阳性对照组(以重组Eppin替代免疫原)和阴性对照组(以KLH替代免疫原)，每组10只；

b、免疫方案：将免疫原KLH-YK等分别稀释于浓度为0.1mol/L、pH值为7.5的PBS中，配制成浓度均为30μg/mL的免疫原溶液，再将各免疫原溶液分别与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等体积混合，充分乳化，制得组合物；免疫步骤为：首次免疫，用免疫原-弗氏完全佐剂组合物注射小鼠双侧后肢足垫，每侧0.3μg(20μL)；间隔1周，加强免疫，用免疫原-弗氏完全佐剂组合物注射小鼠双侧后肢足垫，每侧0.3μg(20μL)；再间隔2周，重复加强免疫1次；

c、免疫原性检测：首次免疫前后，每间隔一定时间，行小鼠尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法测定免疫雄鼠血清中特异性抗体的滴度；

d、抗生育能力检测：于末次免疫后第2周，按雌雄比例1∶1行雌雄小鼠合笼实验，观察雌鼠受孕率和产仔情况。

结果：免疫雄鼠血清中特异性抗体生成情况及雌鼠受孕率和产仔情况见表2，数据显示：首次免疫后第3周，除KLH-FT实验组外，其余各实验组雄鼠血清中即可检出特异性抗体，之后抗体滴度逐渐升高，于首次免疫后第6周达到最高值；阳性对照组雄鼠血清中的抗体生成情况与实验组相同；阴性对照组雄鼠血清中无特异性抗体生成；在雌雄小鼠合笼实验中，除KLH-FT实验组外，其他各实验组免疫后雄鼠的生殖力均受到抑制，表现为与之合笼的雌鼠受孕率与阴性对照组比较，显著下降。

表2、免疫雄鼠血清中特异性抗体生成情况及雌鼠受孕率和产仔情况

基于上述鉴定结果，可得出如下结论：(1)32条多肽片段中YK(SEQ IDNo.1)、WC(SEQ ID No.2)、KV(SEQ ID No.3)、TC(SEQ ID No.4)、FN(SEQ ID No.5)、GQ(SEQ ID No.6)和NN(SEQ ID No.7)与载体蛋白偶联后均能刺激机体产生特异性抗体，可用于制备免疫原；(2)32个免疫原中KLH-YK、KLH-WC、KLH-KV、KLH-TC、KLH-FN、KLH-GQ和KLH-NN不仅能刺激机体产生特异性抗体，而且可以诱导出高效的抗生育作用，可用于制备男性避孕疫苗；3)通过比较各多肽片段的抗生育效应，可以发现TC和FN的效应更突出。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段及应用

<160>7

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>智人(Human)

<400>1

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>智人(Human)

<400>2

<210>3

<211>10

<212>PRT

<213>智人(Human)

<400>3

<210>4

<211>10

<212>PRT

<213>智人(Human)

<400>4

<210>5

<211>10

<212>PRT

<213>智人(Human)

<400>5

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>智人(Human)

<400>6

<210>7

<211>10

<212>PRT

<213>智人(Human)

<400>7

Claims (7)

1.附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.免疫原，其特征在于：由权利要求1所述的附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段与载体蛋白偶联而成。

3.根据权利要求2所述的免疫原，其特征在于：所述载体蛋白选自匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。

4.药物组合物，其特征在于：由免疫学有效量的权利要求2所述的免疫原和药学上可接受的载体组成。

5.能够与权利要求1所述的附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段特异性结合的抗体。

6.权利要求1所述的附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段在制备能够刺激机体产生特异抗附睾蛋白酶抑制剂抗体的免疫原中的应用。

7.权利要求4所述的药物组合物在制备男性避孕疫苗中的应用。

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