NO891713L - Monoklonale antistoffer til vevplasminogenaktivator (t-pa) - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører hybride cellelinjer (lymfocytt-hybridomer) for fremstilling av monoklonale antistoffer mot human vevplasminogenaktivator (t-PA), slike homogene mono-spesifikke antistoffer og deres anvendelse for å forlenge den funksjonelle halveringstid av t-PA i pattedyr.

Human vevtype-plasminogenaktivator (t-PA), en énkjedet serinprotease med Mr 68.000, er en fysiologisk nøkkelregulator for fibrinolyse. Den omdanner zymogenet plasminogen til plasmin, det enzym som bryter ned fibrinnettverket i tromben (Coilen (1980) Thromb. Haemostatis £3:77-82; Rijken og Coilen

(1981) J. Biol. Chem. 256 :7035-7041). I nærvær av en klump størknet blod binder både t-PA og plasminogen seg til fibrin og danner et ternært kompleks hvor plasminogen aktiveres effektivt (Holyaerts et al., J. Biol. Chem. 257:2912-2919; Ranby (1982) Biochim. Biophys. Acta 704:461-469). Affiniteten til t-PA for fibrin gjør t-PA til et blodklump-spesifikt og nyttig trombolytisk middel (Van de Werf et al. (1984), Circulation 6^:605-610) som er blitt godkjent for human anvendelse ved behandlingen av akutt hjerteinfarkt, og forventes å bli godkjent for behandling av andre trombesykdommer, inkludert lungeembolisme og dyp venetrombose. T-PA gir begrenset omdannelse av plasminogen i fravær av fibrin, slik at dens virkninger er tilbøyelige til å bli lokalisert til stedet for en trombe med begrenset systemisk proteolyse. I tillegg til å binde til plasminogen og fibrin binder t-PA

seg til en hurtigvirkende plasminogenaktivatorinhibitor

(PAI-1) som er blitt identifisert i blodplasma og i dyrknings-mediet til forskjellige celler, og som regulerer t-PA-aktivitet ved å danne kompleks med og nøytralisere serin-proteasen (Van Mourik et al. (1984), J. Biol. Chem. 259:14914-14921; Colucci et al. (1985), J. Clin. Invest. 7_5:818-814; Almer og Ohlin (1987), Thromb. Research 4_7: 335-339) . PAI-1 henvises også til som PAI i denne søknad.

Omsetningen av t-PA i plasma er hurtig med en in vivo funksjonell halveringstid på 2 - 6 minutter, avhengig av

arten (Korninger et al. (1981), Thromb. Haemostasis _4_6 :658-661; Verstraete et al. (1985), J. Pharmacol. Exp. Ther.

235:506-512). Eksogent innført t-PA tas hurtig opp og akku-muleres i leveren (Fuchs et al. (1985) Blood 65:539-544; Emeis et al. (1985) Thromb. Haemostasis 5_4: 661-664) . Slike observasjoner tyder på at fjerning av plasma-t-PA, på samme måte som for visse andre serumglycoproteiner (Ashwell og Harford (1982), Ann. Rev. Biochem. 5_1: 531-554) , kan formidles gjennom en interaksjon med en bestemt hepatittcelle-overflate-reseptor, etterfulgt av internalisering og nedbrytning i cellen. Den nylige påvisning av et nytt opptaksssystem med høy affinitet for rekombinant t-PA på rottehepatocytter understøtter denne hypotese (Bakhit et al. (1987), J. Biol. Chem. 262:8716-8720).

Det er et betydelig behov for en modifisert t-PA som bibeholder sin trombolytiske effektivitet in vivo, men som ikke underkastes hurtig nedbrytning etter administreringen.

En slik modifisert t-PA ville ha forøkt utnyttbarhet for behandling av trombesykdommer, slik som akutt hjerteinfarkt.

Figur 1 viser virkningen av flere mAb-er på den fibrin-avhengige plasminogenaktiveringsvirkning av t-PA. Virkning ble bestemt spektrofotometrisk ved å bruke det kromogene substrat S-2251 etter inkubasjon av t-PA i 1 time ved 37°C

i nærvær av: (A) AE5, (0) BA10, (□) CD2, (•) DB10, (■) EG2, (A) MOPC-21 og (V) ikke noe antistoff. Alle t-PA-konsentrasjoner er angitt i internasjonale enheter (IU) ved sammen-ligning med det internasjonale referansepreparat for t-PA.

Figur 2 viser virkningene av flere mAb-er på den fibrin-uavhengige amidolytiske virkning av t-PA. Virkningen ble bestemt spektrofotometrisk under anvendelse av det kromogene substrat S-2288 etter inkubasjon av t-PA i 1 time ved 37°C i fravær eller nærvær av de forskjellige antistoffene. Symbolene er de samme som beskrevet i forklaringen til

figur 1.

Figur 3 viser nivået av t-PA-aktivitet (under anvendelse av S-2251-substratet) i arterieblodprøver fra en kanin på tidspunkter etter intravenøs injeksjon av t-PA (0), t-PA-holdig mAb IG12 (A) og t-PA—holdig mAb EG2 (■) . Den in vivo funksjonelle halveringstid av t-PA er angitt ved

hjelp av de prikkede linjene.

Et panel av monoklonale antistoffer (mAb-er) rettet

mot t-PA, ble frembrakt og vist å utvise forskjellige og nyttige egenskaper. Interaksjonen av disse mAb-er med t-PA

blekarakterisert, inkludert bestemmelse av deres virkninger på funksjonell aktivitet av t-PA og på interaksjonen mellom t-PA og dens hurtigvirkende spesifikke inhibitor, PAI-1.

Disse mAb-er definerer minst tre distinkte epitoper på t-PA, inkludert det katalytiske sete og t-PA-reseptorbindingssetet.

Spesifisiteten til mAb-ene ble fastlagt i ELISA-er under anvendelse av t-PA-belagte mikrotiterbrønner, og i en fast fase-RIA hvor bindingen av jodert t-PA til antistoffene ble fortrengt ved hjelp av overskudd t-PA. Denne RIA ble anvendt til å bestemme bindingskonstanter for hvert t-PA-8 — 1

spesifikt antistoff som varierte fra 4,9 x 10 M til

9-1

2,3 x 10 M . Dette panelet av antistoffer ble grovklassi-fisert i tre kategorier basert på de forskjellige virkningene på både plasminogenaktivatoraktiviteten og den amidolytiske aktivitet av t-PA, som nærmere redegjort for i eksempel 3. Antistoffene AE5, BA10 og EG2 som utviste neglisjerbare eller små inhibitorvirkninger i disse analysene, omfatter en bred klasse som er kjennetegnet ved gjenkjennelse av epitoper som ligger fjernt fra det katalytiske sete til t-PA. CD2 er,

på grunnlag av dens tilnærmet totale inhibering av t-PA-aktivitet i begge analysene, tilsynelatende rettet mot en epitop i eller nær det katalytiske sete. DB10 utgjør, på grunnlag av dens delvise inhibitoreffekt, en tredje type som mest sannsynlig er rettet mot en determinant nært opp til,

men utenfor det katalytiske sete.

T-PA syntetiseres som et énkjede-protein, men omdannes av plasmin til en tokjedet form hvor H-kjeden, lokalisert i N-endeseksjonen av molekylet, er forbundet ved hjelp av en disulfidbinding til L-kjeden i den C-terminale ende

(Pennica et al. (1983), Nature 301:214-221). Nyere undersøk-elser under anvendelse av sted-spesifikke monoklonale antistoffer (Holvoet et al. (1986), Eur. J. Biochem. 158:173- 177)

og t-PA-delesjonsmutantproteiner (MacDonald et al. (1986), Gene _42: 59-67) har utvetydig vist at L-kjeden til t-PA alene er ansvarlig for substratspesifisiteten og serinprotease-aktiviteten til molekylet. Det er da klart at epitopen gjenkjent av CD2, og sannsynligvis den som gjenkjennes av DB10, befinner seg i L-kjeden. Undersøkelser har også avslørt at et PAI-bindingssete på t-PA er lokalisert i eller nær det katalytiske sete på L-kjeden (Van Zonnevelt et al. (1986),

J. Cell. Biochem. 32:169-178). På grunnlag av denne informa-sjon ville man forutsi det nøyaktige inhiberingsmønster som faktisk utvises av dette panel av antistoffer på t-PA-PAI-interaksjonen: CD2>DB10>EG2,AE5,BA10.

Med hensyn til egenskaper ligner derfor CD2 på monoklonale antistoffer frembrakt av Loskutoff og medarbeidere (Schleef et al. (1986), Thromb. Haemostatis 5_6: 328-332) og Coilen og medarbeidere (Holvoet et al. (1987), Blood 69^: 284-289), som begge er bundet til fri t-PA, men ikke t-PA kompleksdannet til PAI. Disse mAb-er er anvendbare i immunologiske analyser med hensyn på t-PA i biologiske prøver. t-PA samlet opp fra humant plasma (Holvoet et al. (1987), Blood 6_9 : 284-289) , og de fleste cellelinjer (Levin (1983), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:6804-6808) er enten delvis eller fullstendig kompleksdannet med PAI(er), og det er viktig å

skjelne mellom denne frie (aktive) og kompleksdannede t-PA (inaktive) for å bestemme slike prøvers fibrinolytiske aktivitet. På grunn av dens gjenkjennelse av PAI-bindings-området på t-PA representerer CD2 et reagens som er i stand til å skjelne fri t-PA fra t-PA-inhibitorkomplekser, i mot-setning til antistoffene AE5, BA10 og EG2.

En annen anvendelse av disse antistoffene er for analysering og endring av reguleringen av t-PA-aktivitet. Reguleringen av fibrinolyse in vivo er avhengig av interaksjonen mellom t-PA og minst fire separate proteiner: plasminogen, fibrin, PAI og en celleoverflatereseptor

(Van Zonnevelt et al. (1986), J. Cell. Biochem. 32:169-178). Typen av interaksjon mellom t-PA og disse fire proteinene

er ikke blitt fullstendig klarlagt ennå. Antistoffer rettet

mot hvert av disse proteinbindingsområdene på t-PA-molekylet ville utgjøre svært nyttige reagenser for å inhibere disse protein-interaksjonene slik at deres rolle når det gjelder å regulere t-PA-aktivitet kan fastlegges. CD2-epitopen er lokalisert til det katalytiske sete på t-PA.

Selv om t-PA er et sterkt fibrinolytisk middel, er en ulempe som er forbundet med dets terapeutiske bruk, den hurtige fjerningen fra blodomløpet ved hjelp av leveren; mer enn 50% av den t-PA som er til stede i plasmaet, fjernes innen 5 minutter etter avslutning av infusjonen. Dette nødvendig-gjør administrering av t-PA ved kontinuerlig intravenøs infusjon over tre timer ved behandling av akutt hjerteinfarkt. Den anbefalte terapeutiske dose av t-PA hos mennesker er

100 mg, selv om en dose på over 100 mg kan være påkrevet (Verstraete et al. (1985) Lancet 1:842-847); dette skyldes delvis den korte systemiske halveringstid. Disse høye dosene av t-PA kan være ansvarlig for bivirkningene som er iakttatt i t-PA-behandlede pasienter, særlig systemisk blødning. Offisiell merking for t-PA advarer faktisk om at en dose på 150 mg ikke bør brukes på grunn av forbindelsen med blød-ninger i hodet. Ifølge foreliggende oppfinnelse er det vist at modifikasjon av t-PA ved dannelse av et kompleks med visse t-PA-spesifikke mAb-er for å forhindre gjenkjennelse av leverens fjerningsmekanisme, som tilsynelatende omfatter en spesifikk hepatocyttreseptor, resulterer i en økt funksjonell halveringstid for enzymet in vivo. En t-PA med lengre in vivo halveringstid burde muliggjøre bruk av lavere doseringer for å oppnå trombolytisk effektivitet sammen med for-delene ved redusert systemisk blødning, redusert proteolyse av plasmaproteiner, mer bekvemme doseringsskjemaer, inkludert en kortere periode med administrering, og redusert kostnad pr. terapeutisk dose. Med den nåværende kostnad for en om-gang med t-PA-terapi på over US# 2000 er utsikten til å redusere t-PA-doseringen svært viktig for å muliggjøre bredere utnyttelse av legemidlet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer monoklonale antistoffer (mAb-er), eller deler derav, som er spesifikke

for human t-PA og som har de følgende egenskaper:

1) mAb-ene har ingen betydelig inhibitoreffekt (dvs. ikke mer enn 10%) på den katalytiske aktivitet av t-PA; 2) mAb-ene øker den funksjonelle halveringstiden til t-PA i et pattedyr med minst 100%; 3) mAb-ene har en høy affinitet for t-PA, dvs. en 7 -1

Ka med hensyn til t-PA pa minst 1x10 M og fortrinnsvis minst 1x10 8 M — 1. mAb-ene ifølge oppfinnelsen antas å øke den funksjonelle halveringstid til t-PA ved å inhibere bindingen av t-PA til celleoverflatereseptorer som er ansvarlige for t-PA-fjerning. En betydelig grad av inhibering av bindingen av t-PA til celleoverflatereseptorer, over 50%, er sannsynligvis nødvendig for å forlenge halveringstiden i en klinisk betydelig utstrekning. Slike mAb-er, eller deler derav, er nyttige i fibrinolytisk terapi ved at de øker aktiviteten av t-PA. Evnen til å oppnå mAb-er med disse ønskede egenskaper er uventet og ikke-nærliggende basert på vår begrensede kjennskap til t-PA's interaksjon med cellulære reseptorer,

og rollene til disse interaksjonene i regulering av t-PA-aktivitet. Særlig var det ikke forutsibart at hepatisk reseptorbinding kunne inhiberes ved hjelp av en mAb uten å inhibere også den katalytiske aktivitet av t-PA. De relative bidrag av PAI og de hepatiske fjerningsmekanismene på t-PA-inaktivering er dessuten fortsatt ikke godt forstått, og det var tidligere ikke kjent at blokkering av hepatisk celle-binding uten å endre bindingen av t-PA til PAI faktisk ville forlenge den in vivo funksjonelle halveringstid til t-PA. Dessuten bør det erkjennes at molekylstrukturen til den hepatiske t-PA-reseptor og egenskapene til t-PA-reseptor-interaksjonen ikke er godt forstått. Mens mAb-ene ifølge oppfinnelsen antas å forlenge den funksjonelle halveringstid til t-PA ved å inhibere hepatisk fjerning, er således det kvantitative forhold mellom inhibering av hepatisk celle-binding og forlengelse av t-PA-halveringstid ikke blitt fullstendig belyst, og oppfinnelsen er ikke ment å være begrenset til mAb-er som virker ved den postulerte mekanisme til å forlenge halveringstid.

Murine monoklonale antistoffer som er spesifikke for t-PA, ble frembrakt og ytterligere undersøkt med hensyn på evne til å inhibere bindingen av t-PA til reseptorer på dyrkede humane lungefibroblastere, og på dyrkede humane hepatomceller. Ett slikt antistoff, betegnet EG2, hadde ingen inhibitorvirkning på den katalytiske aktivitet av t-PA, målt ved hjelp av in vitro funksjonelle analyser. Et hybridom som fremstiller monoklonalt antistoff EG2, er blitt deponert ved American Type Culture Collection og har fått deponeringsnr. HB 9690. Fjerningsundersøkelser in vivo, utført i kaninen med enten t-PA- eller t-PA-EG2-komplekser, indikerte at dette antistoff forlenget funksjonstiden til t-PA signifikant. I denne dyremodellen ble den in vivo funksjonelle halveringstid til t-PA økt fra 4,6 minutter i fravær av EG2 til 15 minutter i nærvær av EG2. EG2 synes å virke ved å redusere den hepatiske fjerning av t-PA ved å inhibere bindingen av t-PA til dens reseptor, uten å forstyrre dens katalytiske aktivitet. Monoklonale antistoffer som EG2, kan danne kompleks med t-PA slik at man får et mer langvarig fibrinolytisk middel. I kraft av naturen til den unike antistoff komponent , representerer et slikt kompleks et nytt fibrinolytisk middel med økt utnyttbarhet.

Det potensielle problem med immunogenisitet når man innfører murine antistoffer i mennesker, kan reduseres eller elimineres ved: 1) å benytte mindre, mindre immunogene fragmenter av murine antistoffer, slik som Fab-fragmenter (Garvey et al. (1977), Methods in Immunology, W.A. Benjamin, Reading, MA); 2) å benytte humane monoklonale antistoffer (Schlom et al. (1980), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 27:6841-6845; Satoh et al. (1983), N. Engl. J. Med. 309:217-220); eller 3) å benytte human-mus-kimære antistoffer fremstilt ved hjelp av genteknikk (Oi et al. (1986), BioTechniques 4_: 214-221). Dessuten vil den anbefalte administrering av t-PA (eller i dette tilfelle, t-PA-mAb-kompleks) som en enkel behandlingsomgang over et forholdsvis kort tidsrom etterfulgt av den forholdsvis hurtige fjerning fra plasmaet, minimalisere sannsynligheten for at en betydelig immunrespons mot et murint mAb, eller et fragment derav,

ville utvikles.

Ved å danne kompleks av t-PA og et spesifikt monoklonalt antistoff med de ovenfor beskrevne egenskaper,

skapes en "annen-generasjons" t-PA med forlenget biologisk halveringstid. Et slikt molekyl kan ha brede anvendelser innen fibrinolytisk terapi i kraft av dets evne til å moderere en av hovedbegrensningene til t-PA: dets hurtige fjerning fra blodomløpet. Et slikt t-PA-mAb-kompleks burde muliggjøre en kortere administreringstid enn den langvarige tre-timers infusjonsterapi som for tiden anvendes. Et slikt t-PA-mAb-kompleks burde også muliggjøre bruk av lavere doseringer av t-PA for å oppnå lokal trombolytisk effektivitet samtidig som bivirkninger reduseres, slik som systemisk blødning.

Monoklonale antistoffer rettet mot bestemte epitoper lokalisert langs t-PA-molekylet, har flere viktige anvendelser. Disse omfatter bruken av slike mAb-er i kvantifis-eringen og rensingen av t-PA, ved undersøkelse av interaksjonen til t-PA med fibrin, plasminogen, inhibitorer og reseptorer, og som prober for å undersøke den biologiske aktivitet av t-PA.

Dosering og administrering

Et t-PA-mAb-kompleks vil bli administrert som en steril, ikke-pyrogen intravenøs oppløsning. Den vandige parenterale bærer kunne f.eks. være "Sterile Water for Injection USP", 0,9% "Sodium Chloride for Injection USP" eller 5% "Dextrose Injection USP". Andre passende additiver som er kjent for fagfolk innen fremstilling av farmasøytiske preparater, kan tilsettes etter ønske. Se f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences. mAb-t-PA-komplekset kan fremstilles i et stabilt preparat klart for administrering, eller for fortynning i en passende intravenøs oppløsning. For å øke produktholdbarhetstid kan mAb og t-PA alternativt ut-formes hver for seg, f.eks. som et sterilt lyofilisert pulver som skal rekondisjoneres aseptisk, eller som en bufret oppløsning. mAb-t-PA-komplekset ville da bli fremstilt umiddelbart før administrering.

T-PA og mAb bør være til stede i et molart forhold

på 1:1, eller sammen med et passende overskudd mAb slik at praktisk talt all t-PA vil bli bundet. F.eks. ville en dose på 50 mg t-PA (molekylvekt 68.000 dalton) kreve minst 110 mg mAb (molekylvekt omtrent 150.000 dalton). På samme måte som t-PA bør mAb-t-PA-komplekset fortrinnsvis administreres som en enkel behandlingsomgang, og som skal startes opp så

hurtig som mulig etter diagnose av akutt hjerteinfarkt eller annen trombotisk tilstand som skal behandles. Doseringen av mAb-t-PA-kompleks som er påkrevet, vil variere avhengig av det omfang som halveringstiden til t-PA forlenges til, ved hjelp av den bestemte mAb som anvendes. Som kjent for fagfolk innen teknikken, vil individuell pasientdosering også avhenge av slike faktorer som pasientvekt, den kliniske situasjons alvorlighet og tilstedeværelsen av faktorer som øker risikoen for blødning.

For å oppnå de snarlige, terapeutiske blodnivåer som er påkrevet for behandling av akutt hjerteinfarkt eller annen akutt trombotisk hendelse, kan det være passende å administrere en bolus av komplekset, etterfulgt av en kontinuerlig intra-venøs innsprøyting i et tidsrom som er tilstrekkelig til å gjøre lokalisert fibrinolyse maksimal. Bruken av et mAb-t-PA-kompleks hvor mAb forlenger den in vivo funksjonelle halveringstid til t-PA, ville forventes å forkorte den på-krevde administreringstid i betydelig grad fra de tre timene som for tiden er anbefalt for t-PA alene. F.eks. øker EG2-antistoffet halveringstiden til t-PA fra 4,6 til 15 minutter, en økning på over 300%.

Eksemplene nedenunder illustrerer oppfinnelsen nærmere. Basert på den foreliggende oppfinnelse forventes det at en person med gjennomsnittlige fagkunnskaper innen teknikken uten unødig eksperimentering vil kunne oppnå andre monoklonale antistoffer som forlenger den funksjonelle halveringstid til t-PA uten i betydelig grad å redusere dens katalytiske aktivitet. Slik det her er brukt, betyr t-PA naturlig human t-PA, rekombinant human t-PA og funksjonelle modifikasjoner derav.

Eksempel 1

Fremstilling av monoklonale antistoffer mot t- PA

Balb/c-mus ble immunisert ved intraperitoneale injeksjoner med 25 yg renset én-kjede-human t-PA (American Diagnostica Inc., Greenwich, CT) i monofosforyl-lipid A-trehalose-dimycolat (MPL-TDM) og forsterket på en tre-ukentlig basis med en lignende dose i TDM. Både én-kjede- og to-kjede-formen av t-PA er aktive og ville forventes å ha lik immunogenisitet. Tre dager etter den tredje eller fjerde injeksjon, da en serumantistoffrespons var påvisbar, ble dyr avlivet og miltcellene fusjonert med P3X63.Ag8.653-myelom-celler under anvendelse av PEG 1500 som beskrevet (Reilly et al. (1987), Biochem. Biophys. Res. Commun. 143:133-139). Etter utvelgelse i HAT-medium ble supernatantene undersøkt med hensyn på spesifikk antistoffproduksjon ved hjelp av en ELISA under anvendelse av mikrotiterplater belagt med 1 yg t-PA pr. brønn. De bundne immunglobuliner ble kvantifisert med alkalisk fosfatase-konjugert geit-anti-mus-IgG. Positive hybridomer ble subklonet ved begrensende fortynning. Store mengder av de monoklonale antistoffene ble renset fra ascitesvæske erholdt i Balb/c-mus ved HPLC under anvendelse av en "Protein-A"-kolonne. Klassebestemmelse ble utført med en isotyping-ELISA.

Supernatanter av hybridomer som skriver seg fra fire separate fusjoner av P3-myelomcellene med miltceller fra t-PA-immuniserte Balb/c-mus, ble undersøkt med hensyn på spesifikk antistoffproduksjon ved hjelp av ELISA under anvendelse av t-PA-belagte plater. Hybridomceller fra 11 positive brønner ble klonet ved begrensende fortynning, og fem av disse klonene som produserte antistoff mot t-PA, ble valgt ut for videre undersøkelser. Disse antistoffene, betegnet AE5, BA10, CD2, DB10 og EG2, ble klassifisert som IgGl-er i typing-ELISA-er.

Eksempel 2

Fast- fase- RIA og bestemmelse av antistoff- assosiasjonskonstanter

Antistoff i 100 yl kultursupernatantprøver ble holdt i "Immunlon II" mikrotiterbrønner som på forhånd var blitt belagt med geit-anti-mus-Ig. Etter vasking med PBS ble 100 yl RIA-buffer (0,05 M Tris-buffer, pH 8,5, 0,1 M NaCl, 0,01 M EDTA, 0,05% Tween<®>20 og 1% BSA), som inneholdt 50.000 cpm [ 125l]t-PA og forskjellige konsentrasjoner av umerket t-PA, tilsatt til hver brønn. Prøver ble inkubert over natten ved 4°C, brønnene ble vasket og fjernet og radioaktiviteten i hver brønn bestemt i en gamma-teller. Assosiasjonskonstantene (Ka-er) til de monoklonale antistoffene for t-PA ble bestemt som beskrevet (Muller (1980), J. Immunol. Meth. 34:345-352)

ved å bruke gjennomsnittet for brønner in triplo.

For hvert av t-PA-hybridomene bandt 100 yl kultur-supernatant mellom 25 og 40% av 3 ng [ 125I]t-PA i fast fase-RIA. Standardkurver ble så frembrakt for hvert antistoff

under anvendelse av disse mengdene antistoff og [ 125I]t-PA,

og fem økende konsentrasjoner av umerket t-PA. Affinitets-konstanter beregnet ifølge metoden til Muller (se ovenfor)

er: AE5, 4,9 x IO<8>M<-1>; BA10, 7,8 x IO<8>M<_1>; CD2,

2,3 x IO9 M<-1>; DB10, 8,4 x IO8 M<-1>; EG2, 1,3 x IO9 M<_1>. Fra standardkurver ble det funnet ut at sensitivitetsgrensene i immunologiske analyser for t-PA med disse antistoffene vari-erer mellom omtrent 1 og 10 ng t-PA pr. 100 yl prøve, eller 10 - 100 ng t-PA pr. ml prøve. Med unntak av DB10 skjelnet antistoffene ikke mellom én-kjede- og to-kjede-formene av t-PA. DB10 oppviste omtrent ti ganger lavere affinitet for to-kjede-artene. Urokinaseoppløsninger opptil 10 yl/ml virket ikke inn på noen av antistoffene i analysen.

Eksempel 3

Innflytelse av monoklonale antistoffer på plasminogen-aktiveringen og den amidolytiske aktivitet av t- PA

Virkningene av monoklonale antistoffer på den fibrin-avhengige plasminogenaktiveringsaktivitet av t-PA ble bestemt ved inkubasjon av t-PA med et ti-ganger molart overskudd av renset antistoff i 1 time ved 37°C før evaluering av dets virkning når det gjelder å frembringe plasmin fra plasminogen. For dette formål ble det brukt en spektrofotometrisk analyse som måler den amidolytiske aktivitet av frembrakt plasmin på det kromogene substrat D-Val-Leu-lys-p-nitroanilid (S2251)

(Zamarron et al. (1984), J. Biol. Chem. 259:2080-2083).

Den fibrin-uavhengige amidolytiske aktivitet av t-PA før og etter forinkubasjon med et ti-gangers molart overskudd av monoklonale antistoffer, ble målt spektrofotometrisk ved 405 nm under anvendelse av det syntetiske substrat D-Ile-Pro-Arg-NH-nitroanilid (S-2288) ved 0,3 mM (Friberger (1982), Scand. J. Chim. Lab. Invent. 42:1-98).

Plasminogenaktivatoraktiviteten av t-PA, før og etter forinkubasjon med et ti-gangers molart overskudd av monoklonale antistoffer, ble målt spektrofotometrisk basert på

det kromogene substrat S-2251. På bakgrunn av de sammenlign-bare affiniteter av antistoffene for t-PA, ble dette samme 20-gangers overskudd brukt for alle antistoffene. På grunnlag av dataene vist i fig. 1, kunne dette panelet av antistoffer grovt oppdeles i tre klasser: fullstendige inhibitorer (CD2), delvise inhibitorer (DB10) og de med begrenset virkning på aktiviteten (AE5, BA10 og EG2). Slik det her er brukt, betyr "begrenset virkning" mindre enn 10% inhibering. Et irrelevant IgGl-antistoff (MOPC-21) hadde ingen virkning på t-PA-aktivitet i denne analysen, noe som viser spesifisiteten av t-PA-antistoffvirkningene.

Ettersom plasminogenaktiveringsaktiviteten til t-PA økes mye av fibrin, kan inhibitorer for denne aktivitet virke på ett av to steder i t-PA: det katalytiske sete eller det fibrinbindende område. For å undersøke disse mulighetene for antistoffene CD2 og DB10, og for å undersøke ytterligere epitopene gjenkjent av dette panelet av monoklonale antistoffer, ble den fibrin-uavhengige amidolytiske aktivitet av t-PA

etter inkubasjon med hvert av antistoffene målt. Denne analysen er basert på t-PA's evne til å spalte det kromogene substrat S-2288, og aktiviteten er ikke avhengig av tilstedeværelsen av fibrin. Figur 2 viser at et lignende mønster ble

iakttatt ved denne analyse som ved S-2251-analysen; CD2 inhiberte fullstendig den amidolytiske aktivitet av t-PA; DB10 var delvis inhiberende; mens AE5, BA10 og kontroll-antistoffet MOPC-21 hadde neglisjerbare virkninger. EG2 økte den amidolytiske aktivitet av t-PA svakt.

Resultatene av begge de kromogene analysene tyder derfor på at CD2 gjenkjenner en epitop på t-PA i eller nær det katalytiske sete mens DB10 gjenkjenner en noe fjernet fra dette sete. De øvrige antistoffene i dette panel synes å binde i epitoper fjernt fra det aktive sete.

Eksempel 4

Virkning av antistoffer på bindingen av t-PA til dens hurtigvirkende inhibitor, PAI- 1

PAI-1, renset fra den humane fibrosarcom-cellelinje HT-1080, og et murint monoklonalt antistoff mot PAI-1 ble levert fra American Diagnostica Inc. (Greenwich, CT). Den følgende fremgangsmåte ble utviklet for å bestemme anti-stoffers evne til å virke inn på bindingen av t-PA til PAI-1. 100 pl av en 500 ng/ml oppløsning av PAI-1 i 0,1 M Tris,

pH 8,0, ble tilsatt til mikrotiterbrønner som tidligere var blitt belagt med 1 yl PAI-1 monoklonalt antistoff og blokkert med BSA. Etter inkubasjon over natten ved 4°C og vasking med Tris-buffer, ble 3 ng<1>25It-PA (50.000 cpm) som var blitt forinkubert i fravær eller nærvær av 1 ug antistoff i 1 time ved 37°C, tilsatt til hver brønn. Etter 1 time ble brønnene vasket, fjernet og radioaktiviteten bestemt i en gamma-teller. For hvert antistoff ble det utført i brønner in triplo.

For å undersøke virkningene av antistoffene på t-PA-PAI-l-interaksjonen, benyttet vi et monoklonalt antistoff for å holde PAI på mikrotiterbrønner. Dette bestemte antistoff som er rettet mot et område på PAI-1 som ikke er involvert i dens binding til t-PA, ble benyttet til å minimalisere potensielle virkninger på proteinstruktur ved immobilisering av PAI direkte på plastbrønnene. Evnen til [ 125I]t-PA, enten i fri form eller i kompleks med de t-PA monoklonale anti stoffer, når det gjelder å binde til den PAI som er holdt fast på mikrotiterbrønner, ble så undersøkt; resultatene er fremlagt i tabell 1. Mønsteret til antistoffvirkningene på denne interaksjon var likt det som iakttas i de funksjonelle analysene, idet CD2-forbehandling resulterer i den største inhibering etterfulgt av DB10. Tilsetning av høye konsentrasjoner av umerket t-PA eller urokinase resulterte i tilnærmet total inhibering av [ 125I]t-PA-PAI-interaksjonen, noe som ville være forventet basert på evnen til PAI-1 når det gjelder å binde begge disse proteinene. Neglisjerbar binding av [ 125I]t-PA ble observert i brønner belagt med bare det monoklonale antistoff mot PAI-1.

TABELL 1

Virkning av monoklonale antistoffer

på bindingen av t- PA til PAI- 1

[<125>l]t-PA, forbehandlet i 1 time ved 37°C med de forskjellige antistoffene, ble evaluert med hensyn på dens evne til å binde PAI-1 fastholdt på mikrotiterbrønner. Data er uttrykt som % binding i forhold til verdien observert med [<125>l]t-PA som var inkudert i 1 time ved 37°C, men i fravær av antistoff. Umerket t-PA og urokinase ble inkludert ved konsentrasjoner på 5 yg i kontrollbrønnene. Hver verdi representerer gjennomsnittet fra brønner in triplo, - standard-avvik.

Eksempel 5

Inhibering av binding av [ 12 5I]t-PA til WI-38 humanfibro-blastere ved hjelp av mAb EG2

Den humane lungefibroblastcellelinje, WI-38, ble erholdt fra American Type Culture Collection. Celler ble holdt i minimalt essensielt medium inneholdende penicillin, streptomycin og 10% kalvefosterserum. Celler ble dyrket til sammenflytning i 24-brønners vevkulturplater. Platene ble vasket tre ganger hurtig med bindingsbuffer (serumfritt medium inneholdende 1 mg/ml bovint serumalbumin) ved 25° under anvendelse av vakuumsug for å fjerne supernatanten, og 200 yl bindingsbuffer inneholdende 0,2 nM [ 125I]t-PA og kon-kurrenter, når slike var anvendbare, ble tilsatt til hver brønn. Etter inkubasjonsperioden, vanligvis ved 25°C, ble celler vasket tre ganger hurtig med fosfatbufret saltoppløs-ning ved 4°C som inneholdt 1 mg/ml bovint serumalbumin.

En halv ml av en 1 x trypsinoppløsning ble så tilsatt til hver brønn for å løsne cellene som ble samlet opp i rør og tellet i en gamma-stråle-teller. Spesifikk binding ble be--7 regnet ved å trekke fra tellingene bundet i nærvær av 10 M umerket t-PA. Celleantall ble oppnådd ved å telle trypsin-iserte cellesuspensjoner i et hemocytometer, og bindings-data ble beregnet som fmol bundet pr. 10 celler. Alle data-punkter er gjennomsnittsverdien for brønner in triplo som varierte mindre enn 5%. Én-kjede-t-PA ble brukt i alle bind-ingsforsøk bortsett fra hvor annet er angitt.

Den spesifikke binding av t-PA til monolag av WI-38 humane lungefibroblastere og til HepG2 humane hepatomceller (eksempel 6) antas bestemt å omfatte spesifikk reseptor-ligand-interaksjon ved at prosessen var mettbar, spesifikk av natur og med høy affinitet.

For å undersøke virkningene av forskjellige mAb-er på bindingen av [<125>l]t-PA til WI-38-fibroblastere ble [ I]t-PA inkubert med omtrent 5 yg av den passende mAb i 30 minutter ved 25°C før dens tilsetning til brønner med WI-38-fibroblastere i den 1-times bindingsperiode som beskrevet ovenfor. Inhiberingsprosenten indusert av hver mAb, ble bestemt i forhold til bindingen observert med [ 12 5I]t-PA som var forbehandlet i 30 minutter ved 25°C i fravær av mAb. Som vist i tabell 2, inhiberte mAb-ene EG2 og AE5 binding i vesentlig grad, mens mAb-er BA10 og BG8 hadde mye lavere inhibitorvirkninger. Et irrelevant mAb, MOPC-21, hadde ingen inhibitorvirkning på [ 125I]t-PA-binding til WI-38-fibroblastere.

Eksempel 6

Inhibering av binding av [ 125I]t-PA til HepG2 humane hepatomceller

Tidligere undersøkelser har beskrevet spesifikk binding av t-PA til rottehepatocytter (Zamarron et al., J. Biol. Chem. 259:2080-2083) og humane endotelceller (Andreasen et

al. (1986), J. Biol. Chem. 261:7644-7651). Hepatocytt-bindingssetet er blitt trukket inn i formidlingen av fjerningen av t-PA fra blodomløpet ved å fremme dets binding, internalisering og nedbrytning av lysomale enzymer (Zamarron et al., J. Biol. Chem. 259:2080-2083).

Ettersom visse mAb-er til t-PA inhiberte t-PA's binding til WI-38-fibroblastere, ble deres virkninger på t-PA-binding til en etablert human hepatomlinje, HepG2, evaluert. For å undersøke virkningene av mAb-er på bindingen av [ 125I]t-PA til humane hepatomceller, ble fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 5, benyttet, bortsett fra at HepG2-celler ble benyttet istedenfor WI-38-fibroblastere. Cellene ble levert fra American Type Culture Collection. Tabell 4 viser at EG2 og AE5 begge var i stand til å blokkere [<125>l]t-PA-binding til disse cellene.

Eksempel 7

Virkning av mAb EG2 på fjerningen av t- PA injisert i kaniner

Intrakatetere av størrelse 22 ble ført inn i øre-arterier hos testkaninene. 20.000 I.U. (0,02 mg) t-PA ble inkubert med 0,4 mg av mAb EG2, mAb BA10 eller et irrelevant mAb som ikke er rettet mot t-PA (IG12) i 30 minutter ved 25°C. mAb-t-PA-oppløsningene ble så injisert intravenøst gjennom en lateral ørevene i kaniner. 2, 4, 6, 10, 15 og 20 minutter etter injeksjon ble arterieblodprøver tatt fra hver kanin og lagret nedfryst før aktivitetsbestemmelser. Plasminogenaktiveringsaktiviteten av t-PA i hver prøve ble så bestemt ved hjelp av den S2251 kromogene analyse beskrevet i eksempel 3. Figur 3 viser at halveringstiden til t-PA som ikke foreligger i kompleks samt den t-PA som er blandet med kon-trollen mAb IG12, basert på funksjonell aktivitet, var omtrent 4,6 minutter. T-PA som dannet kompleks med mAb EG2, utviste imidlertid en mye større halveringstid på omtrent 15 minutter. (mAb BA10 hadde ingen virkning på in vivo halveringstid basert på funksjonell aktivitet av t-PA). Dessuten inhiberte EG2 ikke den funksjonelle aktivitet av t-PA. MAb BA10 hadde ingen virkning på in vivo funksjonell halver ingstid til t-PA. Basert på data presentert i eksemplene 4, 5 og 6, kan den økte in vivo halveringstid til t-PA som har dannet kompleks med EG2, i det minste delvis tilskrives EG2's evne til å inhibere binding og nedbrytning av t-PA ved hjelp av leverceller. Et t-PA-EG2-kompleks utgjør derfor en ny form av t-PA'med de ønskede egenskaper ved å forlenge in vivo dens halveringstid uten å forstyrre dens funksjonelle aktivitet, dvs. EG2 forlenger den in vivo funksjonelle halveringstid til t-PA. Et slikt middel ville være et særlig attraktivt legemiddel for behandling av akutte trombose-sykdommer.

Claims (10)

1. Monoklonalt antistoff, eller Fab-fragment derav, med høy affinitet til t-PA, karakterisert vedat det forlenger den in vivo funksjonelle halveringstid til t-PA i et pattedyr med minst 100% uten i betydelig grad å redusere dens plasminogen-aktivatoraktivitet.

2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1,karakterisert vedat det inhiberer bindingen av t-PA til hepatiske cellereseptorer.

3. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1,karakterisert vedat det er murint.

4. Monoklonalt antistoff ifølge krav 2,karakterisert vedat det er murint.

5. Hybridom, karakterisert vedat det produserer et monoklonalt antistoff ifølge krav 1.

6. Hybridom, karakterisert vedat det produserer et monoklonalt antistoff ifølge krav 2.

7. Hybridom, karakterisert vedat det produserer et monoklonalt antistoff ifølge krav 3.

8. Hybridom, karakterisert vedat det produserer et monoklonalt antistoff ifølge krav 4.

9. Hybridom ifølge krav 8,karakterisert vedat det har de identi-fiserende karakteristika til cellelinjen deponert som ATCC HB 9690 (EG2).

10. Murint monoklonalt antistoff betegnet EG2,karakterisert vedat det er produsert av et hybridom ifølge krav 9.