JPH03505665A

JPH03505665A - ヒト１０２因子の軽鎖領域に対するモノクローナル抗体及びその調製方法及び利用方法

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Publication number: JPH03505665A
Application number: JP1507315A
Authority: JP
Inventors: ピクスリー，ロビン　エイ．; コールマン，ロバート　ダブリュー．
Original assignee: テンプル　ユニバーシティ　オブ　ザ　コモンウェルス　システム　オブ　ハイアー　エデュケイション
Priority date: 1988-06-09
Filing date: 1989-05-26
Publication date: 1991-12-12
Also published as: ATE129902T1; DE68924773T2; DE68924773D1; WO1989011865A1; EP0419574A4; US4963657A; CA1315716C; EP0419574B1; EP0419574A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ヒト■因子の軽鎖領域に対するモノクローナル抗体及びその調製方法及び利用方法免亘立玉Ｉこの発明は、はとんどすべてのヒトの血液中に見出される蛋白質であるヒト罰因子の軽鎖領域に対するモノクローナル抗体産生のためのヒト雑種細胞系統に関する。

この発明は、また、これらの細胞系統により産生される抗体及びそれを利用する治療及び生化学的方法に関係する。

児互Ｊと１旦ヒト罰因子は、チモーゲン形態の単一ポリペプチド鎖として血液中に存在する蛋白質である。その血漿中の濃度は約２９μｇ／ｍｌである。刈因子は、８０ｋＤの、β−グロブリンの移動度を持つ、５９６アミノ酸及び１６．８％の炭水化物を含む糖蛋白質である。

ＭｃＭｕｌｌｅｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０巻、５３７８頁（１９８５）；Ｆｕｊｉｋａｗａら。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８巻、１０９２４頁（１９８３）、Ｘｌｌ因子は、接触活性化系の最初の相に関与し、おそら（、接触活性化において活性化される第一の因子である。それは、炎症、補体活性化及び繊維素溶解現象の機構に関係する＃　Ｃｏｌｍａｎら、Ｊ。

Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７３巻、１２４９頁（１９８４）；Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈら、Ｊ、Ｃ１１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、６２巻、５４頁（１９７８）。

ヒト店因子は、文献に記載されており、“Ｈａｇｅ−ｍａｎ因子”及び“ＨＦ” と同意語である。その生理的活性化物質であるカリクレインによるイン・ビトロでの活性化は、Ｘ［ｌａ因子として知られる、開裂した形態の℃因子を生じる。

後者は、５０ｋＤのアミノ末端鎖及び２８ｋＤのカルボキシ末端軽鎖のジスルフィド結合で結ばれた二本の鎖から成る。Ｘ［Ｉａ因子の軽鎖は、酵素活性部位すなわちアミノ酸セリン、アスパラギン酸及びヒスチジンの“触媒性三つ組（ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｔｒｉａｄ）”を含む。

ＸＯａ因子の重鎮は、表面結合領域を含む。ヒトＸＩＩａ因子は、文献に記載されており、“活性Ｈａｇｅｍａｎ因子”、“アルファＸＩＩａ因子”、“ＨＦａ ”及び“Ｘ［ｌａＨＭ’Ｗ因子”と同意語である。

３２ｋＤａの、更にＸ［ｌａ因子の開裂した産物である店因子フラグメント（ＸＩＩｆ）は、ジスルフィド橋で２−４ｋＤａの重鎮のカルボキシ末端フラグメントに結合された２８ｋＤａの軽鎖から成る。Ｘｌ１ｆ因子は、文献に記載されており、“■因子フラグメント”、“ベータＸＩ［ａ因子”、”ＨＦｆ”及び“Ｘ［ｌａＬＭＷ因子”と同意語である。

他の、カリクレイン、トリプシン、プラスミン及び自己活性化による、開裂した形態の店因子は、文献に記載されている。Ｄｕｎｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５７巻、１７７９頁（１９８２）；ＭｏｒｇｏｌｉｓＪ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、（Ｌｏｎｄｏｎ）１４４巻、１頁（１９５ｇ）：Ｋａｐｌａｎら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ。

１３３巻、６９６頁（１９７１）。

イン・ビトロでの、■因子の活性酵素ｍａ因子への活性化は、自己活性化、蛋白質加水分解による開裂、コンホメーション変化又はこれらの機構のいくつかの組み合わせによって、負に帯電した面上で生じる。負に帯電した雇因子活性化表面を持つ非生理的物質は、硝子、カオリン、セライト、デキストラン硫酸、エラグ酸、スルファチド及びコレステロール硫酸塩を含む。■因子を活性化する生物学的物質は、コンドロイチン硫酸、ヘパリン及びいくつかの肥満細胞のプロテオグリカンを含む。

Ｈｏ　、ｊ　ｉ　ｍ　ａら、Ｂ　ｌ　ｏｏｄ、６３巻、１４５３頁（１９８４）。

■因子の活性化による接触系の活性化は、凝固及びブラジキニンの遊離を導（。

一つの反応によって、表面に結合したＸＪｌａ因子は、刈因子と酵素基質複合体を形成し、刈因子のその活性型であるＸｌａ因子への変換を触媒する。ＸＩ因子は、ジスルフィド結合で結ばれた二本の同一のポリペプチド鎖から成る１６０ｋＤａのプロ酵素である。疋因子は、血漿中で、１２０ｋＤａの蛋白質の高分子量キニノゲン（”ＨＭＷＫ”）と化学量論的な非共有結合の複合体を作って結合する。ＨＭＷＫは、ｘ［ｌａ因子の触媒による刈因子のＸｌａ因子への変換において非酵素的補助因子として働く。ＸＩａ因子は、更に、残りの凝固カスケードの順次的活性化を導（■因子を活性化する。　他の反応によって、表面結合性のｘ［ｌａ因子は、プレカリクレインを開裂して、活性な酵素カリクレインへと活性化する。プレカリクレインは、ＨＭＷＫと複合体を作っている８８ｋＤａのプロ酵素である。カリクレインは、ＨＭＷＫを、もっとも強力な血管拡張性のペプチドどして知られる遊離のブラジキニンへと開裂させる。

カリクレインは、また、ＸＩＩａ因子をもう一度開裂させてＸｌ１ｆ因子を形成し、それは再び溶液中に拡散しつる。カリクレインは、また、活性化物質の表面から解離して、溶液中に拡散し、表面上のどこか他の場所で■因子を更に活性化することも出来る。Ｃｏｌｍａｎら、Ｊ。

ＣＩ　ｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　、７３巻、１２４９頁（１９８４）。

Ｘ［ｌａ因子及び■ｆ因子はどちらも刈因子を活性化するが、Ｅａ因子の方が、恐らく、ＸＵａ因子の重鎮上のいくつかの構造によって、より効果的である。しかしながらＸＩＩａ因子及びＸ１ｌｆ因子は、どちらも、プレカリクレインのカリクレインへの変換において、等しく強力である。

ダラム陰性菌による敗血症は、入院患者の死亡及び廃疾の主要な原因であり、毎年数十万人が発生している。

一度低血圧症が、細菌又は細菌内毒素に関係して起きると、死亡率は、４０−６０％の範囲である。他の頻発する合併症は、広範な血管内凝固による出血である。

Ｃｏ　１ｍａｎら、Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｍｅｄ、、３０巻３５９頁（１９７９）。この状態を特徴付ける微小血管の血栓症は、凝固蛋白質及び血小板の消耗及び不適当なｔ血による出血を導く。

ダラム陰性菌による敗血症の患者において経験された低血圧症及び出血は、共に、接触活性化系の細菌又はその内毒素による活性化によるものである。その内毒素は刈因子の活性化を引き起こす。活性酵素ＸＯａ因子は、更に、その二つの基質、刈因子とプレカリクレインに作用して、凝固及びブラジキニンの生成をもたらす。

臨床及び実験的証拠は、カリクレイン活性化及びその結果のブラジキニンの生成はダラム陰性菌による敗血症患者で経験された初期の相の低血圧の原因であるということを示した。Ｘ［Ｉａ因子により引き起こされた■因子（残りの凝固カスケードの順次的活性化を導（）の活性化の臨床的結果は、続発症、出血及び／又は血栓症を伴う広範囲の血管内凝固である。

現在、低血圧の敗血症の治療は、体積超過（ｖｏｌｕｍｅｏｖｅｒｌｏａｄ）及び広範囲の血管内凝固のヘパリン治療のため出血の増加の危険のために困難である。この状態では最初の４８時間以内における死亡率が５０％なので、治療への新しいアプローチが必要である。必要なものは、ダラム陰性菌による敗血症患者に見られる接触系の活性化及びブラジキニンの遊離を制御するためのＸｌ１ａ因子に特異的な阻害剤である。

関連する問題において、臨床的証拠は、いくつかの市販の血液製剤において、活性罰因子誘導体の存在のために副反応が起こるということを示唆する。ガラス瓶への分画により調製された■因子を含むヒト血漿画分は、ブラジキニン（■因子活性化の副産物）の注射に似て、患者に顕著な顔面紅潮と低血圧を与えることが観察された。動脈性低血圧がそのような試料を与えられた患者に起こることが報告された。アルブミン置換体への反応はそのような産物中のｘ［ｌｆ因子の存在によるものであることが示された。更に、イン・ビボにおけるＸｌ１ｆ因子の存在は、直ちに血圧を５０％下げる。従って、その血液製剤中の存在は除かれなくてはならない。必要なことは、血液製剤などの液体をその液体中に存在するであろうＸ［ｌｆ因子及び関連する活性■因子誘導体を除くことにより精製する有効な手段である。

ＫｏｈｌｅｒとＭｉ　１ｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５４巻、４９３−４９７頁（１９７５）は、ミエローマ細胞を免疫されたマウスの膵臓細胞に融合して連続的細胞系統を作った報告の最初のものである。これらの雑種細胞系統すなわちバイプリドーマは、親のミエローマ細胞も免疫された膵臓細胞も持たない特徴を有する。ハイブリドーマは、継続的に、均一な（モノクローナル）抗体を産生できる。ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの仕事の前には、ポリクローナル抗血清しか得られなかった。

ハイブリドーマ作成のための技術は現在は広（文献に記載されている（例えば、眩匹吐坦藍」匹江一旦り二とｉｄｏｍａｓ：Ａ　　Ｎｅｗ　　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　　Ｉｎ　　Ｂｉｏｌｏ　　１ｃａｌ　　Ａｎａｌ　　ｓｉｓ　　、　　Ｒ。

Ｈ，Ｋｅｎｎｅｔ、　Ｔ、　Ｊ、　ＭｃＫｅａｒｎ及びに、　Ｂ、　Ｂｅｃｈｔｏ１編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ及びＬｏｎｄｏｎ　（１９８０）　）が、上手にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得るための、すべての抗体に用い得る一般的方法はない。融合技術は、望む抗原に対するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを得るために、それぞれの場合ごとに変えられなければならない。単一の抗原に特異的な抗体を得るためには、免疫感作のための高度に精製された抗原を供するための労力を要する精製技術が要求される。任意の与えられた抗原に対するモノクローナル抗体の産生け、まだ非常に経験的な方法である。

■因子に対するモノクローナル抗体で、分子の重鎮領域内のエピトープに対するものは報告された。

Ｓｍａｌｌら、Ｂ　１　ｏｏｄ、６５巻、２０２頁（１９８５）；５ａｉｔｏら、Ｂｌｏｏｄ、６５巻、１２６３頁（１９８５）；Ｐｉｘｌｅｙら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２巻、１０１４０頁（１９８７）。しかしながら、軽鎖が、プレカリクレインのカリクレインへの開裂及び■因子のＸＩＩａ因子への活性化に触媒能力のある活性酵素部位を含むので、重鎮に対するモノクローナル抗体はせいぜいこれらの酵素活性を部分的にブロックできるだけである。

ヒト罰因子に対するポリクローナル抗体は報告された。Ｌａｍｍ１ｅら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１５６巻、１１８−１２５頁（１９８６）；　Ｌａｍ− ｍ１ｅら、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、、４１巻、７４７−７５９頁（１９８６）。

そのような抗体は、ポリクローナルであるので、単一の抗原決定基に特異的ではない。

ここで用いられる“■因子の軽鎖”又は“■因子の軽鎖領域”は、■因子、Ｘ［ｌａ因子及びＸ［Ｉｆ因子中の、２８ｋＤａの、ヒト店因子の活性酵素部位を含むカルボキシ末端部分を意味する（上述の部分が自由であるか又は他のペプチド鎖に共有結合しているかは考慮しない）。同様に、ここで用いられる“■因子の軽鎖を含む免疫原”は、２８ｋＤａの軽鎖を含む■因子、Ｘ［ｌａ因子、Ｘ［［ｆ因子及び他の開裂した形態のヒト罰因子を含み、また、２８ｋＤａの軽鎖自身をも含むであろう。

ここで用いられる“モノクローナル抗体（時々は”Ｍａｂ”と略言される）”という表現は、完全な抗体だけでなく、抗原と結合できるそのフラグメントをも含むが、必ずしもＦａｂ及びＦ　（ａｂ’　）ｔフラグメントに限定されない。

ここで用いられる“血漿製剤（ｂｌｏｏｄ　ｐｌａｓｍａｐｒｏｄｕｃｔ）”という表現は、ヒト血漿すなわち一種以上の特異的蛋白質を含む画分などのヒト血漿画分又はそのような血漿蛋白質の精製された試料を意味する。

ｌユニ［この発明によって、ヒト店因子の軽鎖領域内の抗原決定基に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生ずる細胞系統を提供する新しいハイブリドーマが調製された。各ハイブリドーマは、ミエローマ系統由来の細胞と前もってヒト店因子軽鎖を含む免疫原で免疫されたドナー由来の膵臓細胞の融合により雑種を形成した細胞を含む。実例としてのハイブリドーマは、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−９７０３、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−９７０４及びＡＴＣＣ＃ＨＢ−９７０５を含む。そうして作られた各抗体は、ヒト団因子の軽鎖領域の抗原決定基に特異的である。精製されたモノクローナル抗体は、本質的に、他のヒト蛋白質に対する免疫グロブリンを含まない。ハイブリドーマはインビトロで培養されて、抗体を分泌するであろう。

この発明の雑種細胞系統は、最初に膵臓細胞ドナーをヒト店因子軽鎖を含む免疫原で免疫することによって作られるであろう。精製されたヒトＸＯｆ因子は、好ましい免疫原である。膵臓細胞は、ミエローマ細胞と融合促進剤の存在下で融合される。融合された細胞は、希釈され、別々の穴の中で、融合してないミエローマ細胞を養わない培地中で培養される。各穴の上清は、ヒトＸＩＩｆ因子に対する抗体の存在が酵素結合イムノソルベントアッセイ（“ＥＬＩＳＡ″′）によってアッセイされる。ヒトＸ［Ｉｆ因子に結合する抗体を分泌するハイブリドーマが選択され、クローン化される。

ハイブリドーマは、適当な培地中で培養され、抗体は上清から回収される。別法として、クローンはマウスの腹腔内に移され、その結果生じる望む抗体を含む悪性の腹水及び血清が採取される。

ヒト店因子及び■因子軽鎖を含む■因子フラグメントを液体から除くための方法もまた提供される。ヒト店因子の軽鎖領域内の抗原決定基と結合する固定化モノクローナル抗体が液体と接触させられる。ｘｎ因子及びその軽鎖を含むフラグメントはそこから吸収される。血液製剤は、この方法で、うまく■因子及び■因子軽鎖含有フラグメントを除去精製されるであろう。

それ故に、ヒト窟因子の軽鎖領域に対する抗体を産生ずるバイブリドーマを提供することはこの発明の目的である。

ヒト店因子の軽鎖に対する本質的に均一な抗体を提供することはこの発明の他の目的である。

ヒト■因子及びその活性フラグメントを、血漿製剤などの液体から除くための方法を提供することは、この発明の他の目的である。

興味ある検体中の■因子のレベルを決定するための方法を提供することはこの発明の目的である。

ヒトＸＤａ因子又はＸ［Ｉｆ因子の、ヒトの病気の状態の時の活性のイン・ビボでの阻害のための治療上の方法を提供することはこの発明の他の目的である。

主題のハイブリドーマは、ここでは、それらによって産生される抗体に割り与えられたものと同じ番号によって同定される。従って、例えば、“ＢａＦ２”という名称はバイプリドーマＬＨ９Ｂ６Ｆ５及びこのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に付属する。

言及される物質が何であるか、すなわち抗体かハイブリドーマかは、文脈から明らかである。

主題のハイブリドーマは、１９８８年４月２８日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　％Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２に寄託され下記のＡＴＣＣ受理番号を与えられた：　ＩＢ２Ｄ２Ｅ１０には＃ＨＢ−９７０３　；　５Ｇ３Ｃ６Ｂ７には＃ＨＢ−９７０４及びＩ　Ｈ９Ｂ６Ｆ５には＃ＨＢ −９７０５゜ＩＬＩ盆呈皇皇上且図１は、カリクレインで開裂された却因子フラグメントのウェスタンプロット／ＥＬ　Ｉ　ＳＡの写真であり、各軽鎖の抗体（ＢａＦ２、Ｃ６Ｂ７、Ｄ２Ｅ１０）はＸｌ１ｆ因子（３０ｋＤａ）並びにチモーゲン■因子（８０ｋ　Ｄａ）及び他の軽鎖領域を含む画分と反応するということを示している。

図２は、血漿中のヒト店因子の凝固剤活性のモノクローナル抗体Ｂ６Ｆ５　（白ぬきの正方形）、Ｃ６Ｂ７（塗りつぶされた丸）及びＤ２Ｅ１０　（白ぬきの三角形）による中和のプロットである。罰因子の凝固剤活性の阻害のパーセンテージ（縦座標）は、純粋なモノクローナル抗体のモル濃度（横座標）に対してプロットされる。

図３は、ヒトＸ１ｌｆ因子のアミド分解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）活性の、モノクローナル抗体Ｂ６Ｆ５　（白ぬきの正方形）Ｃ６Ｂ７　（塗りつぶされた九］及びＤ２Ｅ１０（白ぬきの三角形）による濃度依存性の阻害のプロットである（合成基質Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ−２３０２）により決定された）。

図４は、ヒトＸ［ｌａ因子のアミド分解活性の、モノクローナル抗体Ｂ６Ｆ５　（白ぬキノ正方形）、Ｃ６Ｂ７　（塗りつぶされた丸）及びＤ２Ｅ１０　（白ぬきの三角形）による濃度依存性の阻害のプロットである（合成基質Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡにより決定された）。

図５は、Ｘ［Ｉｆ因子によるプレカリクレインのカリクレインへの変換の阻害のプロットである。精製されたヒトＸ１ｌａ因子は、最初、精製されたモノクローナル抗体８６Ｆ５（白ぬきの正方形）、Ｃ６Ｂ７（塗りつぶされた丸）又はＤ２Ｅ］Ｏ（白ぬきの三角形］と示された濃度でインキュベートされた。プレカリクレインが、それから、混合物に加えられ、２０分間インキュベートされた。アリコートが、基質Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ａｒｇ−ｐＮＡにより、カリクレイン開裂をテストされた。

図６は、Ｘ［［ａ因子による℃因子のＸｌａ因子への変換の阻害のプロットである。精製されたヒトＸ１ｌａ因子は、最初、精製されたモノクローナル抗体Ｂ６Ｆ５　（白ぬきの正方形）、Ｃ６Ｂ７（塗りつぶされた丸）又はＤ２Ｅ１０（白ぬきの三角形）と示された濃度でインキュベートされた。ＨＭＷＫ、デキストラン硫酸及び刈因子の混合物は、各店因子−ｍＡｂ混合物に加えられ、６０分間インキュベートされた。アリコートが、それから、合成基質ｐｙｒｏ−Ｇｌ　ｕ− Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡを用いてＸｌａ因子開裂をテストされた。

Ｂの・　な予日この発明の細胞雑種は、ヒト店因子、ＸＯａ因子及び■ｆ因子（これらは、すべて■因子軽鎖領域を含む）と反応するモノクローナル抗体を産生ずる。抗体により認識される工とｌ・−プは、したがって、■因子の軽鎖領域内に局在化されている。抗体は、有意にヒト■因子の凝固剤活性を阻害し、有意にＸ［ｌｆ因子のアミド分解活性を阻害する。これらの発見は、エピトープが■因子の軽鎖領域内に局在化していることを示す。軽鎖特異性は、更に抗体が有意に、ＸＩＩｆ因子によるプレカリクレインの活性化を阻害するという事実によって支持され、それは、■因子の軽鎖領域のその自然の基質の一つに作用することからのブロックを示している。

この発明のモノクローナル抗体は、ヒト抗原に特異的であり、ラット、マウス、豚、うさぎ又はハムスターの血漿中の罰因子の凝固活性を阻害しない。

調製された３種類のモノクローナル抗体は、サブクラスＩ　ｇ　Ｇ　＋に由来し、に−軽鎖を含む。精製された抗体は、非還元性の１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上では２００ｋＤａの見かけの分子量を持ち、ジチオスレイトールでの還元時には５０ｋＤａ及び２８ｋＤａのフラグメントを生成する。

この発明のモノクローナル抗体は、適当なホストを■ｆ因子で免疫することにより調製される。免疫原は、表面活性化された又はカリクレイン活性化された精製された罰因子からイオン交換クロマトグラフィー技術により単離されるであろう。Ｐｉｘｌｅｙら、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、２５６巻、４９０頁（１９８７）。別法として、Ｘ［Ｉｆ因子は、直接、血漿から、Ｔａｎｋｅｒｓｌｅｙら、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、２５巻、３０７頁（１９８２）で述べられたイオン交換技術により単離されるであろう。この発明による固定化モノクローナル抗体との結合を含む他の精製方法が使われるであろう。

一つの方法によって、マウスは精製されたＸ１ｌｆ因子で免疫される。他の株も用いられ得るが、ＢＡＬＢ／ＣＡｎＳｋｈマウスが好ましい。免疫感作のスケジュール及び投与される免疫原の濃度は、有用な量の適切に感作された肺臓細胞を生成するようなものでなければならない。

免疫感作のための生活規制（下記に詳述）が完了した時、マウスは犠牲にされ、膵臓が取り出される。肺臓細胞の適当な媒質中での懸濁液が調製される。膵臓当たり約２．５−５ｍ１の媒質で十分である。イン・ビトロの細胞懸濁液のプロトコールは、良く確立されている。

肺臓細胞は、マウスミエローマ細胞と融合促進剤によって融合される。好ましい融合促進剤は、分子量１３００−１．６００　ｋ　Ｄ　ａのポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）である。他の融合促進剤は用いられつるであろう。マウスミエローマ細胞系統は、雑種を選択できるように、“薬剤耐性”型のものが望ましい。最も頻繁に用いられるクラスのミエローマは、８−アザキノリン耐性の細胞系統であり、それらは広く知られており、入手可能である。これらの細胞系統は、酵素ヒボキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠き、そのため、“ＨＡＴ”　（ヒボキサンチン−アミノプテリンチミジン）培地中で生存できない。遺伝子型においてコンピテントな雑種の成育を支持する培地中で選択され得る異なる遺伝的欠失（例えば、他の酵素の欠失、薬剤感受性など）を持つミエローマ細胞の使用もまた可能である。更に、い（つかの環境においては分泌性のミエローマ細胞系統が用いられ得るにもかかわらず、ミエローマ細胞系統は、それ自身はいかなる抗体をも産生しないということが示唆される。

好ましい融合促進剤は平均分子量１３００−１６００ｋＤａのＰＥＧ　（ＡＴＣＣから入手可能）であるが、他の知られている融合促進剤は用いられつるであろう。

細胞の融合は、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｈｂｒｉｄｏｍａｓ：ＡＮｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　Ｉｎ　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　Ａｎａｌ　５ｉｓ（Ｋｅｎｎｅｔｔ、Ｒ，Ｈ。

ＭｃＫｅａｒｎ、　Ｔ、　Ｊ、とＢｅｃｈｔｏｌ、に、Ｂ、編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ及びＬｏｎｄｏｎ、　３６８−３６９頁、１９８０年）中のＴ、Ｊ、ＭｃＫｅａｒｎ　、　＋Ｆｕｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　ａｎ　Ａｄｈｅｒｅｎｔ　Ｍｏｎ。

１ａｙｅｒ”で述べられた方法などにしたがって、粘着性の単一層上で行われるであろう。他の融合技術は用いられうるであろう。ミニローマ細胞に対する細胞比２−５：１の肺臓細胞が用いられるであろう。この比は、膵臓又はミエローマ細胞の起源によって変えられるであろう。

融合していないミエローマ細胞、融合していない肺臓細胞及び融合した細胞の混合物は、別々の隔室（例えばミクロ滴定プレートの穴）中での、融合していないミエローマ細胞を養わないであろう選択培地中での培養へと分配される。細胞の分配は、隔室当たりに望ましい細胞数が分離されるように統計的に計算された量の希釈剤中での再懸濁化によるであろう。Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ３７４頁、ＭｃＫｅａｒｎ、Ｔ、Ｊ、、”Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｃｅ１ｌＬｉｎｅｓ　ｂｙ　Ｌｉｍｉｔｉｎｇ　Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｆｌｕｉｄ　Ｐｈａｓｅ”を見よ。

ＨＡＴが培地として用いられる場合は、融合していない８−アザグアニン耐性のミエローマ細胞は成育しないであろう。融合していない肺臓細胞は、悪性ではないので、普通は、数日後に死ぬ。培養はそれらが死滅するのに十分な時間性われる。融合した細胞は、選択培地中で繁殖を続け、成長する。

雑種細胞を成育させている各容器又は隔室内の上清はＸ［ｌｆ因子に対する抗体の存在がスクリーニングされ、評価される。任意の適当な抗体結合方式の検出手段（例λば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイなと）が用いられるであろう。

選択及びクローニングの後、罰因子軽鎖領域に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマのイン・ビトロ培養、又はイン・ビボでのマウスの腹膜浸出物の誘導によって産生されるであろう。最初の方法はより高純度のモノクローナル抗体を産生ずるであろう。抗体は望まない免疫グロブリンを本質的に含まない上清から回収される。２５−５０μｇ　／　ｍ　ｌの抗体濃度がこの方法で可能である。血清（牛胎児血清など）を含む増殖培地中には少量の他の免疫グロブリンが存在する。

イン・ビトロでのバイプリドーマの培養によって得られるもの以上の抗体濃度が必要とされる場合は、主題のハイブリドーマは同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）の又は半回系（ｓｅｍｉｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）のマウスの腹膜腔に注射されるであろう。適当な期間のインキュベーションの後で、ハイブリドーマは、注射されたマウスの腹膜浸出物の１ｍｌ当たり４−１０ｍｇの抗体を産生ずるであろう抗体分泌性の腫瘍の形成を引き起こす。マウスは血中及び腹水中に自然抗体を持っているので、宿主のマウスからの約５％のコンタミネーションは避けられない。腹水のモノクローナル抗体の精製は、これらの夾雑物を除去するであろう。その結果生じる抗体は高力価であり、１　：３０００００以上の希釈において活性である。

下記は、この発明による細胞系統の調製の一つの典型的な手順であるが、それに制限されることを意図するものではない。

■、土ｊｕｉ９」ｌニＸｌ１ｆ因子は、精製された店因子の活性混合物から下記の様にして単離された。

プラスチック製の容器及びカラムが精製手順を通して用いられる。すべての透析チューブ及びプラスチック容器ハ、２　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのポリブレン水溶液ですすがれてから、水ですすがれる。すべてのステップは、指示される場合を除いては、室温で行われる。窟因子の濃縮は陽圧透析（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｄｉａｌｙｓｉｓ）により４℃で行われる。

Ａ、！！ＪＬｕ−二工］旧１±」弓１１精製された℃因子は、下記のＰｉｘｌｅｙ　Ｒ，Ａ、とＣｏ１．ｍａｎ。

Ｒ，Ｗ、、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、　、　４１巻、８９頁（１９８６）の手順によって調製される。この方法は、店因子の亜鉛キレートアフィニティー樹脂に選択的に結合する能力に依るものである。

４％のクエ〉・酸ナトリウムを抗凝固剤として含む新鮮な凍結された血漿（４００５ｍ　ｌ　）は、大豆）・リブシン阻害剤（”５ＢＴＩ”）（０，１ｍｇ／ｍｌ）及びボリフ’ｖ　ン（０、３６ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）を含むポリプロピレン容器中で３７℃で素早く解凍され、下記の処理を受しプた：１　゛屏、２５− ５０％：結晶硫酸アンモニウム（１４４ｇ／Ｌ血漿）がゆっくりと血漿に溶解され、３０分間攪拌された。溶液は、１３６８０Ｘｇで、３０分間遠心分離された。硫酸アンモニウム（１５８ｇ／Ｌ）がデカンテーションで分は取られた上清に室温でゅっ（つと溶かされ、６０分間攪拌された。沈殿は、最少量（１ｉ）（７）０．０２５Ｍ　　Ｎａ、ＨＰＯ，，０，８Ｍ　　ＮａＣｌ０、２ｍｇ／ｍｌ　５ＢＴＩ、　０．３６ｍｇ／ｍｌポリブレン、０．０２％　ＮａＮｘ　、ｐＨ６，５に溶がされ、２０ρの同じ緩衝液（ＳＢＴＩは含まない）に対して、２回緩衝液を換えて、−晩、４℃で透析された。

？キレートクロマトグラフ　−＃１：透析された溶液は、１０分間、４０００Ｘｇで遠心分離され、透析の間に形成された沈殿を除去した。３００ｍ１の平衡化された亜鉛キレートセファロースが、減圧されたプラスチック製のブフナー漏斗上に置かれた。溶液はゆっくりと樹脂の間を流され、採取された。樹脂は、平衡化された緩衝液で洗われ、２８０ｎｍの吸光度の読みが０．１を下回るまで、各５００ｍ１の画分が集められた（約１１℃）。樹脂は、それから、２〜３βのカコジル酸塩緩衝液（０，０２Ｍ　　カコジル酸す）　リウム、０．１５ＭＮａＣｌ、Ｏ，１ｍｇ／ｍｌ　　５ＢＴＩ、０．０３ｍｇ／ｍｌ　　ポリブレン、０．０２％　ＮａＮ５．ｐＨ５，５）で、この画分の吸光度の読みがＯ，ｌを下回るまで洗われた。店因子画分は、１ｏβの酢酸塩緩衝液（０，１Ｍ　　酢酸ナトリウム、０．８Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ１，０、１ｍｇ／ｍｌ　５ＢＴ１．０．０３ｍｇ／ｍｌポリブレン、０．０２％　ＮａＮｉ　、ｐＨ４，５）で溶出された。この画分は罰因子の凝固剤活性がアッセイされた。■因子画分はプールされ、２０Ｉ２のりん酸塩−酢酸塩緩衝液（０，２５Ｍ　　Ｎａａ　ＨＰＯ４，０，００５Ｍ　酢酸ナトリウム、０．８Ｍ　　ＮａＣ１，０，００１ｍｇ／ｍｌポリブレン、ｏ、０２％　ＮａＮ５、ｐＨ６，５）に対して、−晩、緩衝液を２回交換して、４℃で透析された。

キレートクロマトグラフ　−＃２：透析された朋因子画分は、１２０ｍ１のりん酸塩−酢酸塩緩衝液で平衡化された亜鉛キレートセファロースを含むカラム（２゜５ｘ２５ｃｍ）に加えられ、２Ｉ２の同じ緩衝液で、−晩１００　ｍ　ｌ　／　ｈ　ｒの流速で洗われた。２５０ｍ１ずつのｐＨ６，５及び４．０のりん酸塩 −酢酸塩緩衝液のｐＨ勾配がカラムに加えられ、続いて、１００　ｍ　ｌのｐＨ４，０で洗われ、５ｍｌずつの画分が集められた。

５００μｍずつのアリコートが、分析のために、ポリプロピレンのエッペンドルフチューブ中に取られ、この両分とアリコートは一７０℃に凍結された。この勾配のアリコートは、蛋白質、■因子凝固剤活性及びＳ−２３０２アミド分解活性が分析され、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（”ＳＤＳ　　ＰＡＧＥ” ）にもかけられた。罰因子を含むと決定された両分はプールされ、部分的に、ｐＨｓ、５のりん酸塩−酢酸塩緩衝液に対する陽圧透析によって濃縮された。

’ｊ　）ｕ　ｍＵ　：　Ｘｌｌ因子凝固活性の５０−１００単位を含むアリコートは、りん酸塩−酢酸塩緩衝液で平衡化されたＢｉｏｇｅｌ　Ａ　０．５の１．５Ｘ８８ｃｍカラム（流速１ｍｌ／分）に加えられた。２ｍｌずつの画分が集められ、蛋白質、凝固剤活性及びＳ−２３０３アミド分解活性が分析され、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた。２ｍｌずつの画分は凍結された。精製された■ 因子を含むと決定された画分け、解凍され、りん酸塩−酢酸塩緩衝液に対する陽圧透析によって濃縮された。

Ｂ、ｙＩＩζ　の店ｆ　　への゛刈因子は、Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、　２２５巻、７２８１頁（１９８０）で述べられたもの及びＰｉｘｌｅｙら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６０巻、１７２３頁（１９８５）で報告されたものに類似の方法でＸｌ１ｆ因子へ変換された。この方法に従って、カリクレイン（０，４μｍｏｌ）は精製された店因子（２，２μｍ０１）と、緩衝液（０，０２Ｍ　　トリス、０．０２ＭＮａＣ１，０，１％　ＰＥＧ　　８０００、ｐＨ７，５）中で３７℃で、４０−６０分間、ポリプロピレン製の試験管中でインキュベートされた。カリクレインは、■因子、Ｘ［ｌａ因子及びＸ［Ｉｆ因子から、インキュベーション用緩衝液で平衡化された微小ＱＡＥセファロースカラム（２ｍｌ）上で分離された。カリクレインは、０．１Ｍ　　ＮａＣ１を含むこの緩衝液で溶出することにより完全に除去された。■因子、Ｘｌ１ａ因子及びＸ［ｌｆ因子は、２４ｍ１のＯ，］−００，６Ｍ　ＮａＣ１勾配で連続的に溶出された。

各１ｍｌの画分は、存在する蛋白質の特徴を決定するための５ＤＳ−ＰＡＧＥ、凝固活性及び基質Ｓ−２３０２に対するアミド分解活性によって特徴付けられた。試料は用いられるまで一３０℃に凍結された。

上記の免疫原調製法は亜鉛キレートクロマトグラフィー法を精製された■因子を得るために採用したが、別因子を単離する他の方法は用いられ得るであろう。他の単離手順は、異なるｐＨ及びイオン強度条件下での硫安沈殿及びイオン交換クロマトグラフィーからなる。更に、■因子単離のための他の方法は、イムノアフィニティー精製法において店因子重鎮に対するモノクローナル抗体を用いる。Ｐｉｘｌｅｙら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２６２巻、１０１４０頁（１９８７）。ここで言及される任意の方法は、精製され、機能的に活性な刈因子産物（それは、ＸＩＩｆ因子に変換されて、この発明の実施において免疫原として働くであろう）を提供する。

Ｔ１．Ｌ炎五道４匹の雄又は雌の８−１０週齢のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　Ａ　ｎ　Ｓｋｈマウスは、完全フロインドアジュバントに含まれる１回当たり３５μｇの蛋白質で皮下的に免疫され（０週目）、それから、５週目に再び不完全フロインドアジュバントに含まれる１回当たり３５μｇの蛋白質で皮下的に免疫された。血液が、７週目に、取り出され、ＥＬＩＳＡを用いて免疫原に対する抗体がスクリーニングされた。１１１週目、１回当たり、０．１５Ｍ　　ＮａＣ１に含まれる５０Ｍｇの免疫原が腹腔内に注射された。４日後、血液が、軽く麻酔をかけられた各マウスの眼窩後部叢（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ　ｐｌｅｘｕｓ）から取り出され、そして２匹の最も強い陽性のマウスが膵臓ドナーとして選ばれた。これらの動物の膵臓は無菌的に取り出され、５０Ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン又は”ＰＥＮ／５ＴＲＥＰ”（Ｇｉｂｃｏ）が加えられたハンクスの平衡塩類溶液（’ＨＢＳＳ”　、Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ　　Ｉ　　ｓ　　−１ａｎｄ、ＮＹ）を含む組織培養皿（１５Ｘ６０ｍｍ）の中に置かれた。後者はペニシリンとストレプトマイシンの混合物である。膵臓は、それから、他のＨＢＳＳを含む培養皿に移された。膵臓は無菌のビンセットで細片に切られ、それから、遠心用チューブに移され、それは大きな砕片が沈殿するように２分間水中に置かれた。細胞懸濁液は他の遠心用チューブに移され、１０分間、１２０Ｏｒｐｍで回転された。上清を捨てた後、細胞は５−５−１Ｏの０．１７Ｍ　　ＮＨ，Ｃ１（水冷）中に再懸濁され、水中に５分間置かれ、赤血球を溶解させるために時々攪拌された。細胞懸濁液は穏やかに正常血清で１＝１に希釈されたＨＢＳＳｌｏｍｌに重層され、１２００ｒｐｍで１Ｏ分間遠心分離された。牛胎児血清（“ＦＣＳ”）が正常血清として用いられるであろう。細胞はそれから、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（”ＤＭＥ−。

Ｇｉｂｃｏ）で３回洗われた。細胞の数と生育力が、それから測定された。ハイブリダイゼーション手順で用いられるＳ　Ｐ　２　／　Ｏ−Ａ　ｇ　１４ミエローマ細胞は、溶解されていない肺臓細胞と同じ方法で洗われた。

■　、　　　　　　　卑　　　　　　　　　　　の　５融合の日、上記の免疫されたものと同じ株のマウス由来の免疫されていない肺臓細胞は、免疫感作及びＤＭＥでのｆｃ浄を除いて、同じ手順に従って処理された。これらの免疫されていない肺臓細胞は下記の様に養育細胞層を調製するために用いられた。免疫されていない細胞はＤＭＥ＋ＨＡＴ＋２０％　ＦＣＳ中に、２−４Ｘ　１０’細胞／　ｍ　１の密度に再懸濁された。これらの細胞は、９６穴プレート（１−２Ｘ１０ ’細胞／穴）上にまかれ、５％　ＣＯ２中で、３５℃で、−晩、雑種細胞を置く前の無菌検査としてインキュベートされた。

■、ハイブリダイゼーション融合は下記の様に行われたｍ　１．５ｍ　ｌの免疫された肺臓細胞及び１．５ｍ、１のＳＰ２１０−Ａｇ１４細胞はコンカナバリンＡでコートされたプレート上にピペットで移された。各タイプの細胞の密度は、肺臓細胞のＳＰ２１０−Ａｇ１４細胞に対する比が２−３：１（全体で７−１０ｘｌＯ’細胞／プレート）になるように調整された。プレートは、それから、５％　ＣＯ３中で、３７℃で、４５−６０分間インキュベートされ、細胞がコンカナバリンＡに付着された。融合は、１ｍｌの５０％ＤＭＥ　：　ＰＥＧ溶液を各プレートに、１滴ずつ加えることにより行われた。プレートは、最初の１滴が加えられてから、１５秒間放置された。細胞は、それから、５ｍｌのＤＭＥで２回洗われた。プレート当たり５ｍｌのＤＭＥ＋２０％　ＦＣＳが加えられた後、細胞は一晩インキユベートされた。

■、ハイブリドーマの′　　　び一晩のインキュベーションの後、上記のハイブリダイゼーション手順による細胞は、遠心用チューブに移され１５００ｒｐｍで、１５分間回転された。上清は捨てられた。各チューブからの細胞は、４０−４５ｍ１のＤＭＥ＋ＨＡＴ＋２０％　ＦＣＳ中に懸濁され、上記の“■、養育膵臓細胞層の調製”で調製された免疫されていない肺臓細胞の養育細胞層を含む９６穴プレートに移された（０．１ｍｌ細胞懸濁液／穴）。プレートは、１０％　Ｃ０２中で、３７℃で、湿った環境中で培養された。細胞は、３−５日成長させられ、その後、０．１ｍｌのＤＭＥ＋ＨＡＴ＋２０％　ＦＣＳが各穴に加えられた。雑種は毎日調べられた。融合の３〜４週後、細胞はＤＭＥ＋ＨＡＴ＋１０％　ＦＣＳ　（アミノプテリンを含まない）に切り替えられた。免疫原に反応性の抗体な伴うハイブリドーマの培養は選択され、そして限界希釈法によってクローン化及びサブクローン化された。（Ｍｏｎ。

ｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　、　３４７頁、ＭｃＫｅａｒｎ、　Ｔ、　Ｊ、　−Ｃｌｏｎｉｎｇｏｆ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｃｅ１ｌ　ｂｙ　Ｌｉｍｉｔｉｎｇ　Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＦｌｕｉｄＰｈａｓｅ”）。ＥＬＩＳＡスクリーニングによって決定された３つの最も強い抗原陽性のサブクローン化された培養（すなわち、５Ｇ３Ｃ６Ｂ７．１Ｈ９Ｂ６Ｆ５及びＩＢ２Ｄ２Ｅ１０）からの細胞が、選択され、前もって１０−１４日間０．５ｍｌのブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を与えられた４匹のＢＡ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの腹腔に注射された（マウス当たり、約２　Ｘ　１．０６細胞を含む０．５ｍｌのＰＢＳ）、７−１４日後、血液が、軽くエーテル麻酔された各マウスの眼窩後部叢から取り出され、腫瘍を誘発された腹水液が採取された。

Ｖｌｌ　、モノクローナル　一体ｌソ１１上記の様に調製された腹水液由来の抗体は、市販のキ・ソ　　ト　　　（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　　　Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ、Ｂｉｏ　　　Ｒａｄ　　　Ｃｏｒｐ、、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ。

ＣＡ）を用いた蛋白質−Ａアフィニティークロマトグラフィーにより精製されるであろう。腹水液は結合用緩衝液で１＝１に希釈される。この粗製物質はＰｒｏｔｅ　ｉ　ｎ−Ａカラムに加えられ、カラムは、２８０ｎｍの吸光度が０．０２５以下になるように結合用緩衝液で洗われる。抗体は、それから、酸性緩衝液で溶出される。溶出のピークは、ｐＨが中和され、プールされ、濃縮され、そして０．０２Ｍ　　トリス、Ｏ，１５Ｍ　　ＮａＣＬ、０．０３％　アジ化ナトリウム、ｐＨ７，５に対して透析される。抗体の濃度は、２８０ｎｍの吸光度の読みにより測定され、ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌが、１％の吸光係数を１４゜２として計算される。最終的抗体濃度は２−５ｍｇ／ｍｌの範囲内である。モノクローナル抗体の濃度は、抗体の分子量として１５０ｋＤａを用いて、ｍ　ｇ　／　ｍ　１がらμｍｏｌに変換されるであろう。

■、モノクローナル　　の、　・レモノクローナル抗体のサブクラスはマウス免疫グロブリンザブタイプ同定キット（Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて決定された。モノクローナル抗体Ｇ６Ｆ５、Ｃ６Ｂ７及びＤ２Ｅ１０はすべてサブクラスＩ　ｇ　Ｇ　＋　、に軽鎖と同定された。最終的抗体試料の性質は、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２２７巻、６８０頁（１９７０）の変法に従って、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された。すべてのモノクローナル抗体は非還元条件下では、約２００ｋＤａの単一バンドとして観察された。還元時には、精製された抗体は５０ｋＤａ及び２８ｋＤａのバンドを生じたが、これは、ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖を表すものである。

組み合わされたウェスタンプロット／ＥＬＩＳＡ技術（Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６巻、４３５０頁（１９７９））が、カリクレインで開裂された■因子を用いて、モノクローナル抗体により認識されるエピトープが店因子の軽鎖領域内に存在することを確認するために行われた。その処理は、手短に言えば、下記のようである。精製されたカリクレインにより開裂された罰因子は、１２％アクリルアミドランニングゲル及び４％アクリルアミトスクツキングゲルを用いて、非還元条件下で、５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた。５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、それから、電気的に蛋白質のバンドをポリビニリデンジフルオリド（”ＰＶＤＦ”　）メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移す電気溶出装置（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）に移された。トランスファーの後、メンブレンは、２時間、”ＢＬ　ＯＴ　Ｔ　Ｏ ”　と共にインキュベートされることによりブロックされた（　Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、Ｔｅｃｈｎ、、１巻、３頁（１９８４１）。ブロックされた蛋白質を含むメンブレンは、それから、２時間、室温で、０．１５Ｍｇ　／　ｍ　１の精製されたマウスモノクローナル抗体を含むＢＬＯＴＴＯ中でインキユベー　トされた。メンブレンは、それから、３回０．１％　Ｔ　Ｗ　ｅ　ｅ　ｎ　−２０デタージエントを含むＢＬＯＴＴＯで洗われた。メンブレンは、それから、アルカリホスファターゼと結合した抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を含むＢＬＯＴＴＯ中で、２時間、室温でインキュベートされた。メンブレンは、それから、３回０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＢＬＯＴＴＯで洗われ、アルカリホスファターゼの基質（ニトロ−ブルー　テトラゾリウム（“ＮＢＴ”）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（“ＢＣＩＰ”）、共にＳｉｇｍａ社製、を含む）中に展開された。これは、抗原−モノクローナル抗体（アルカリホスファターゼポリクローナル抗体）複合体が存在するところでは、着色された沈殿を生じる。

結果は、図１に示されている。レーン１．２及び３は３種類のモノクローナル抗体（Ｂ　６　Ｆ　５、Ｃ６Ｂ７及びＤ２Ｅ１０）すべてが、■因子及びその軽鎖を含む開裂産物と反応することを示す。各Ｍａｂは、店因子チモーゲン（８０ｋＤａ）、Ｘｌ１ｆ因子（３０ｋ　Ｄ　ａ）及び他の軽鎖領域を含む開裂産物と反応した。軽鎖領域の最小の形態であるＸｌ１ｆ因子との反応は、３つのレーンすべてで示された。これらの結果は、モノクローナル抗体の雇因子の軽鎖領域に対する特異性を示す。

この発明のモノクローナル抗体は、下記の実験で立証されたように、ヒト店因子の凝固剤活性を阻害する。

Ｏ１３μＭの店因子を含む正常ヒト血漿のプールは、各モノクローナル抗体と、抗体濃度を増加させながら、１０分間、３７℃でインキュベートされた。その時点で、１０μｍのアリコートが３つずつ取り出され、０．４ｍｌの１．２５ｍｇ／ｍｌのカオリン、０．０５％イノシチン（ｉｎｏｓｉｔｈｉｎ）　、　　１　／　４に希釈された店因子欠失血漿及び０．０１５Ｍ　　トリス、０．１１２５Ｍ　　ＮａＣ１ｐ８７．５の緩衝液を含む１０１０Ｘ７５のポリスチレンチューブに加えられた。混合物は、１秒間、Ｖ　ｏ　ｒ　ｔ、ｅ　ｘミキサーにかけられ、３７℃で、正確に８分間インキュベ−トされた。その時点で、１００μｍの０．０３ＭＣａＣｌ２が混合物に加えられた。混合物は、１秒間、Ｖｏｒｔｅｘミキサーにかけられ、３０秒間、静かにインキュベートされた。チューブは、水浴の中及び外で、凝固終点が観察されるまで、継続的に傾けられ、その時点で時間が秒で記録された。存在する罰因子の濃度は、抗体が存在しない時に作られた ■因子濃度と凝固時間の標準曲線から決定された。モノクローナル抗体Ｃ６Ｂ７、ＢａＦ２及びＤ　２　Ｅ　１．　Ｏは、■因子の凝固剤活性を、最大限で元の ■因子の活性の９２−９４％の飽和レベルで、阻害した。図２を見よ。これら２種類の抗体の飽和濃度は抗体の店因子抗原に対するモル比が２：１から４：１において到達された。モノクローナル抗体Ｄ２Ｅ１０は、■因子の活性を、抗体：抗原のモル比が５＝１の時、最大で７０％阻害した。

Ｘｎｆ及びＸ［ｌａ因子は、低分子合成基質Ｈ−Ｄ−Ｐｒ。

−Ｐ　ｈ　ｅ　−Ａ　ｒ　ｇ　−ｐ　Ｎ　Ａ　（Ｓ　−２３０２、Ｈｅ１ｅｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）を開裂させる。この発明のモノクローナル抗体のＸｌ１ａ及びＸ［ｌｆ因子の酵素活性を阻害する能力は、下記のアッセイによって示された。０．０５Ｍ　　トリス０．１４Ｍ　　ＮａＣ１及び１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，８を含む緩衝液（今後゛緩衝液Ａ”という）中で、０．２μｍ ○１のＸ［ｌｆ又はＸｌ１ａ因子は、異なる濃度のモノクローナル抗体、Ｃ６Ｂ７、ＢａＦ２又はＤ２Ｅ１０と１０分間、３７℃で、３通りインキュベ−１・された。

その時点で、１０μｌのアリコートが取り出され、１６５μｍの緩衝液Ａ及び２５Ｌ、ｌの４ｍＭ　　Ｓ−２３０２水溶液を含むミクロ滴定プレートの穴（最終的Ｓ−２３０２濃度は０．５ｍＭ）に加えられた。アミド分解反応は、室温で、３０分間進められ、それから、反応は、１００μｍの２０％　酢酸の添加により終結された。ミクロ滴定プレートは、それから、４０５　ｎｍで、ミクロ滴定プレートリーダー（Ｂｉｏｒａｄ）上で読まれた。アッセイは、Ｘ［ｌｆ及びＸ１ｌａ因子に関して濃度依存性であることが見いだされた。阻害パーセントは、各抗体濃度での読みの平均と０％での読みの平均の比を取ることにより決定され、それから、阻害パーセントに変換された。０％阻害の値は、モノクローナル抗体の存在しない時に得られた読みの平均である。

Ｓ−２３０２アツセイの結果は、図３及び４に示されている。３種類のモノクローナル抗体は、すべて、ＸＯｆ因子の、Ｓ−２３０２上での発現を、約２０−４０％阻害し、Ｘ［］ａ因子を約２０−３０％阻害した。結果は、店ｆ因子の活性が影響されることから、モノクローナル抗体により認識されるエピトープが店因子の軽鎖領域にあることを更に確実にした。ペプチド開裂活性の廃止が完全でないので、エピトープは酵素の触媒部位に直接局在化してはいない。どのような理論にも縛られた（ないがエピトープはＳ−２３０２基質結合部位の近（に局在化していて、モノクローナル抗体が基質Ｓ−２３０２０結合の立体的な阻害を引き起こすのであろう。あるいは、モノクローナル抗体は、触媒部位からもつと離れたエピトープに結合していて、Ｘｌ１ｆ因子のコンホメーション変化を引き起こし、Ｓ−２３０２基質へのアフィニティーを下げているのであろう。

この発明のモノクローナル抗体は、■ｆ因子の大きな基質であるプリカリクレインを開裂させる活性をプロ・ンクできる。後者は、分子量が６１１．６Ｄａｌ、かないＳ−２３０２と比べて、８８ｋＤａの分子量を持つ。抗体の■ｆ因子によるプレカリクレインの開裂の阻害能力は下記のアッセイにより測定された。三重に、Ｘ［Ｉｆ因子（０，０４２μＭ）は、異なる濃度のモノクローナル抗体Ｂ６Ｆ５、Ｃ６Ｆ７及びＤ２Ｅ１０と緩衝液Ａ中で１０分間、３７℃でインキュベートされた。プレカリクレインが、それから、加えられ（プレカリクレインの最終濃度は０．６６μＭであり、ＸＩＩｆ因子は０．０３５μＭである）、溶液は更に２０分間３７℃でインキュベートされた。その時用、で、５０ＬＬｌの溶液が、１２５μｍの緩衝２７５　Ａ及び２５μｌの４ｍＭ　　Ｓ−２３０２を含むミクロ滴定プレートに加えられた（Ｓ−２３０２の最終濃度は０．４４ｍＭ）。基質反応は室温で２０分間進められ、反応は１００μｌの２０％酢酸の添加により終了させられた。ミクロ滴定プレートは、それから、４０５ｎｍで読まれた。

Ｘ［ｌｆ因子によるプレカリクレインの活性化は、述べられた方法により濃度依存性であることが見出された。阻害％は、各モノクローナル抗体濃度での読みの平均とモノクローナル抗体の存在しない（０％）ときに得られた読みの平均の比の比較により決定された。その値が、それから、阻害％に変換された。アッセイの結果は図５に示されている。すべての抗体はプレカリクレイン開裂を３０−４０％阻害した。

この発明のモノクローナル抗体は、Ｘ［ｌａ因子の刈因子（１２０ｋＤａのチモーゲン蛋白質であり、凝固カスケードにおけるＸＯａ因子の生理的基質である）を開裂して活性化する能力も又ブロックできる。三重に、■ａ因子（０，０４４ μＭ）は異なる濃度のモノクローナル抗体Ｃ６Ｂ７、ＢａＦ２又はＤ２Ｅ１０と０．０５Ｍ　　トリス、０．１５Ｍ　　ＮａＣ１及びｉｍＭ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，８を含む緩衝液中で１０分間３７℃でインキュベートされた。ＨＭＷＫ、ＸＩ因子及びデキストラン硫酸はそれぞれ最終濃度が０．４．０．２及び１０Ｍｇ／ｍｌになるように、そして団因子は最終濃度が、抗体の存在時及び非存在時に０．０２２μＭになるように加えられた。刈因子活性化反応は１時間室温で行われた。その時点で、１０μｍの溶液が、０．０２Ｍ）リス、０．１５ＭＮａＣ１，２ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．１％　ＰＥＧｐＨ７，４を含む７０μｌの緩衝液（今後は“緩衝液Ｃ−と呼ぶ）を含むミクロ滴定プレートの穴に加えられ、８０μ ｍのｘ１因子用合成基質ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒ。

−Ａｒｇ−ｐＮＡ　（Ｓ−２３６６）が最終濃度０．９７５μＭになるように加えられた。この基質反応は１ｅ分間室温で行われた。反応は１００μｍの５０％酢酸の添加により終了された。ミクロ滴定プレートは、それから４０５ｎｍで読まれた。阻害％は、抗体が存在しないとき又は非特異的なマウスモノクローナル抗体が存在するとき（０％）に得られる読みの平均の比の比較により決定された。その値は、それから、阻害％に変換された。

疋因子のＸ１ｌａ因子による活性化は、この発明の軽鎖モノクローナル抗体の存在時、６０％阻害されることが見出された（図６）。この結果は、触媒部位の直接のブロックは起きないが、第２の刈因子結合部位がブロックされるか又は店因子の軽鎖領域がかき乱されることを再び示す。

Ｘｌ１ａ及びＸ！Ｉｆ因子の酵素活性の阻害に加えて、この発明のモノクローナル抗体は、ｘｎ因子フラグメント及び他の開裂された■因子産物を市販の血漿製剤などの液体がら除去する有効な方法を提供することにおいて有用である。

臨床的な証拠は、いくつかの市販の血漿製剤において活性化された■因子誘導体の存在のために副反応が起きるということを示唆する。共有結合で結合されたこの発明の抗■因子軽鎖モノクローナル抗体を含むイムノアフィニティー樹脂の利用は、これらの副反応を引き起こす活性化された又は潜在的に活性な店因子誘導体を特異的に除去するために用いられ得る。抗体が罰因子及び酵素的に活性な領域を含むフラグメントに結合すると、その結果、可溶性血漿製剤から罰因子酵素活性又は潜在的酵素活性が除去される。モノクローナル抗体は都合よくこの目的のために様々な不溶性の支持体に共有結合的に結合されることにより固定化され得る。活性化されたアガロースは好ましい抗体固定化物質であり、イムノアフィニティー樹脂を作るのにこの発明のモノクローナル抗体と共に便利に用いられるであろう。市販の活性化アガロース標品はシアノゲンブロミドー活性化アガロース（ＣＮＢｒ−活性化セファロース４　Ｂ　、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）及び活性スクシンイミドエステルに結合されたアガロースビーズを含む（”Ａｆｆｉｇｅｌ　１０”、Ｂｉｏｒａｄ；”Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＣＨ５ｅｐｈａｒｏｓｅ “、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。蛋白質の活性化アガロースゲルへの共有結合による結合の方法はこの分野ではよく知られている。蛋白質の活性化ゲルマトリックスへの共有結合は蛋白質中のりジン残基のε−アミノ基を介して起きる。

適当なカップリング用緩衝液は、例えば、燐酸緩衝生理食塩、Ｏ，ＩＭ　　はう酸ナトリウム又はＯ，ＬＭ　　重炭酸ナトリウムを含む。カップリング反応は典型的には１−２時間室温で、又は−晩４℃で達成される。カップリング用緩衝液中の典型的な蛋白質濃度は２−２０ｍｇ／ｍ１である。結合反応の完了後、任意の残っているマトリックス中の反応性の基は不活性化されなくてはならない。典型的には、不活性化はＩＭ　エタノールアミンを使い、ＨＣｊでｐＨ８に滴定され、１−２時間室温で行なわれるであろう。こうして生成されたイムノアフィニティー樹脂は便利に適当なカラムに詰められる。

■因子による夾雑物を精製する必要のある血漿製剤（ｐＨ７−９）はイムノアフィニティーカラムに乗せられる。■因子の形態のものは吸収され、従ってその結果の溶出物は罰因子及び■因子活性化フラグメントを含まナイ。イムノアフィニティー樹脂は、結合している罰因子形態のものを低ｐＨの緩衝液で除去し、それから、カラムをｐＨ７−９の溶液で再平衡化することにより便利に再生できる。

この点で、イムノアフィニティー樹脂は他の利用サイクルのために調製される。

この方法で精製され得る血漿製剤は、例えば、■因子及び■因子（血友病の治療に用いられる）　、Ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｉｂｒａｎｄ病の治療に用いられるＷｉｌｌｉｂｒａｎｄの因子、アルブミン（血液量減少、低蛋白血症及び低アルブミン血症なとの疾患の治療に用いられる）、血漿、血小板、クリオプレシピテートＡＨＦ　（血中蛋白質因子■、因子■、フィブリノゲン、アルファ、プロテアーゼ阻害剤及び抗トロンビンＤＩの源を提供する）、血漿蛋白質画分（例えば、”　ＰＲＯＴＥＮ、ＡＴＥ”　（Ｔｒａｖｅｎｏｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　））及び罰因子活性型を含むすべての他の血漿製剤を含む。

このタイプのイムノアフィニティー樹脂はヒト罰因子及び罰因子軽鎖を含む開裂産物の血漿又は他の源からの単離にもまた便利に用いられるであろうということばすぐに認められるであろう。

この発明のモノクローナル抗体は又治療において罰因子の酵素活性をイン・ビボで阻害するのに有用であると信じられている。それらはもつと後の凝固酵素及びダラム陰性菌による敗血症の影響を促進する血管に作用するペプチドの形成を阻害する。抗体は接触系の活性化（それはブラジキニンの遊離、並びに好中球の刺激をもたらす）のブロックに用いられるであろう。抗体は、従って罰因子の影響を、酵素作用の阻害によって中和するのに治療上有用であると信じられている。

この発明の抗体は、興味のある検体特にヒト血漿中の罰因子のレベルの変化を検出するのに有用である。任意の興味ある検体中の■因子の検出及び定量は様々な免疫学的方法によって行われるであろう。一般的に、そのような方法は、検体とこの発明のモノクローナル抗体の一つとの接触、抗体により結合された抗原の量の直接又は間接のアッセイ方法による測定を含む。そのようなアッセイは、例えば、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ、競争的酵素結合イムノソルベントアッセイ（”ＣＥＬＩＳＡ”）、ラジオイムノアッセイ、蛍光アッセイ、放射免疫拡散法、沈降、凝集及び電気免疫拡散法を含む。

ウェスタンプロット技術においてポリクローナル抗体を用いる血漿中の店因子の濃度の測定は報告された。　Ｌａｍｍ１ｅら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５６巻、１１８−１２４頁　（１９８６）、　Ｌａｍｍ１ｅらＴｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　４１巻、　７４７−７５９頁（１９８６）。この技術は直にこの発明のモノクローナル抗体を使うように改良されるであろう（報告された手順中では、ポリクローナル抗体が代わりに用いられる）。

この発明のハイブリドーマの調製及びその結果生成されろモノクローナル抗体の製造、精製及び特徴付けはここで述べられるように行われるであろう。主題のモノクローナル抗体はハイブリドーマのマウス腹腔内への注射及び血液及び腹水の採取により調製されるが、抗体は又ハイブリドーマのこの分野の熟練者には知られているイン・ビトロ技術による培養によっても得られる。

ここで述べられた３種類のモノクローナル抗体はサブクラスＩ　ｇＧｌに属するが、それはこれらが同じ“不変゛領域を持つことを意味する。特異的抗原に対する抗体は不変領域及び“可変”領域を持つ。後者は機能的に抗原を認識する。可変領域は、不変領域のクイブに関わりなく抗原を認識する。従って、ここで述べられた特徴を示すモノクローナル抗体はサブクラスＩ　ｇ　Ｇ　Ｉ、Ｉ　ｇＧ２．Ｉ　ｇＧｓ　、Ｉ　ｇＭ、ＩｇＡ又は他のＩｇクラスであろう。免疫グロブリンクラス（Ｉ　ｇ）中の差異は抗体の抗原に対する反応性のパターンに影響しないのですべてのヒト■因子軽鎖領域に対するモノクローナル抗体はＩｇクラス又はサブクラスに関わらずこの発明の中に含まれると考えられる。

この発明のモノクローナル抗体は、都合よく、蛋白質分解酵素によって開裂されて、抗原結合部位を保持したフラグメントを生成する。例えば、ＩｇＧ抗体の中性ｐＨでのパパインを用いた蛋白質加水分解処理は、２つの同一のいわゆる”Ｆａｂ”フラグメント（各々は重鎖フラグメント（Ｆｄ）にジスルフィド結合した１本の完全な軽鎖を含む）を生じる。各Ｆａｂフラグメントは一つの抗原結合部位を含む。ＩｇＧ分子の残りの部分は“Ｆ　ｃ　”として知られる２量体である。同様にしてｐＨ４でのペプシンによる開裂はいわゆるＦ　（ａｂ’　）２フラグメントを生じる。

そのようなフラグメントの調製方法はこの分野の熟練者には知られている。Ｇｏｄｉｎｇ、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８３）、１１９−１２３頁を見よ。この発明のモノクローナル抗体の抗原結合部位を含むフラグメント（Ｆａｂ及びＦ　（ａｂ’　）２など）は、免疫原性が減じられているので治療的応用には好ましい。そのようなフラグメントは免疫原性が、免疫原性Ｆｃ蛋白質を含む完全な抗体より弱い。

２度目以降の同じマウスモノクローナル抗体の治療上の投与は、患者のこの分子のＦｃ部分に対する免疫感作のため興味がないであろう。マウスモノクローナル抗体の治療上の利用における感作の影響は、前に同じ患者に投与されたＭ　ａ　ｂ中に含まれる異なるＦｃフラグメントではな（同じＦａｂフラグメントから生成される雑種分子を用いることにより減少されるであろう。そのようなこの発明のモノクローナル抗体から形成される雑種分子が治療に使われるであろうということは予想される。

この発明のヒト罰因子に対するモノクローナル抗体の調製方法（免疫感作、融合及びハイブリドーマの選択を含む）は、ここで明らかにされた細胞系統以外の細胞系統の生成をもたらすであろう。個々のハイブリドーマはそれらが産生ずる抗体によってのみ同定されるであろうから、ヒトＸ［Ｉｆ因子又は刈因子軽鎖に対する任意のハイブリドーマ産生による抗体は、そのような抗体をハイブリドーマを用いて作る方法と同様に、この発明の範囲内に含まれるということが予想される。更に、他のを推動物（ヒト、ラット、ウシ、豚など）由来で、マウス由来でない膵臓細胞及びミニローマが、バイブリドーマを、ここで述べられた方法を用いて作るために使われるということが予想される。

この発明のモノクローナル抗体はバイプリドーマにより産生される。しかしながら、他の細胞不死化の方法がヒト刈囚子軽鎖に対するモノクローナル抗体の産生のために用いられるであろうことは予想される。これらの方法はこの分野の熟練者には知られている。例えば、ヒト抗体産生リンパ球はＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスによる形質転換によって不死化されるであろうｏ　Ｃｈｉｏｒａｚｚｉら、Ｊ。

Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　５６巻、９３０頁（１９８５）　；　５ｔｅｉｎｔｚら、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３２巻、８７７頁（１９８４）。

この発明は、その主旨又は本質的属性を離れることなく、他の特定の形態で具体化されるであろう。従って、参照は前述の明細書よりも添付の請求項（発明の範囲を示す）に対してなされるべきである。

′−−１−：−−−−−−− ８６Ｆ５　　Ｃ６日７　　Ｄ２Ｅ１０ＦＩＧ、　　１［ｍＡｂｌ　　μＭＦＩＧ、　２［ｍＡｂｌ　　μＭＦＩＧ、３［ｍＡｂｌ　　μＭＦＩＧ、　５［ｍＡｂｌ　　ＪＡＭＦＩＧ、　６国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ＸＩＩ因子の軽鎖領域内の抗原決定基に特異的に結合するモノクローナル抗体。
（２）ヒトＸＩＩａ因子に結合する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
（３）ヒトＸＩＩｆ因子に結合する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
（４）ミエローマ系統由来の細胞と前以てヒトＸＩＩ因子軽鎖を含む免疫原で免疫されたドナー由来の脾臓細胞の融合により形成されたハイブリドーマにより産生される請求項１に記載のモノクローナル抗体。
（５）ミエローマ系統由来の細胞と前以てＸＩＩｆ因子で免疫されたドナー由来の脾臓細胞の融合により形成されたハイブリドーマにより産生される請求項４に記載のモノクローナル抗体。
（６）ヒトＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子及びＸＩＩｆ因子の単一の抗原決定基に結合する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
（７）ＩｇＧ１サブクラスの請求項１に記載のモノクローナル抗体。
（８）ミエローマ系統及び脾臓細胞がマウス由来である請求項４に記載のモノクローナル抗体。
（９）ハイブリドーマがＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞と前以て精製されたヒトＸＩＩｆ因子で免疫されたＢＡＬＢ／ｃＡｎＳｋｈマウス由来の脾臓細胞の融合により形成される、請求項８に記載のモノクローナル抗体。
（１０）下記のステップから成る、ヒトＸＩＩ因子軽鎖領域の抗原決定基に結合するモノクローナル抗体の作成方法。（ａ）脾臓細胞ドナーのヒトＸＩＩ因子軽鎖領域を含む免疫原での免疫（ｂ）上記ドナーからの脾臓の摘出及び脾臓細胞懸濁液の作成（ｃ）上記脾臓細胞のミエローマ細胞との融合（ｄ）融合した細胞の別々の穴の中での融合していないミエローマ細胞を養わない培地中での希釈及び培養（ｅ）ハイブリドーマを含む各穴の中の上清のヒトＸＩＩ因子軽鎖領域に対する抗体の存在のアッセイ、及び（ｆ）ヒトＸＩＩ因子軽鎖領域に結合する抗体を分泌するハイブリドーマの選択及びクローニング。
（１１）ドナー細胞及びミエローマ細胞がマウス由来である請求項１０に記載の方法。
（１２）上記のクローンのマウスヘの移植及び望む抗体を含む悪性の腹水又は血清の上記のマウスからの採取を更に含む請求項１１に記載の方法。
（１３）適当な培地中でのハイブリドーマの培養及び培養上清からの抗体の回収を更に含む請求項１１に記載の方法。
（１４）請求項１０、１１、１２又は１３のいずれかに記載の方法によって調製されるモノクローナル抗体。
（１５）ＡＴＣＣ＃ＨＢ−９７０３、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−９７０４及びＡＴＣＣ＃ＨＢ−９７０５から成るグループから選ばれるハイブリドーマの培養及び分泌されたモノクローナル抗体の培養培地からの回収を含むヒトＸＩＩ因子軽鎖領域に対するモノクローナル抗体の作成方法。
（１６）請求項１５に記載の方法により調製されるモノクローナル抗体。
（１７）マウスヘのハイブリドーマＡＴＣＣ＃ＨＢ−９７０３、ＡＴＣＣ＃ＨＢ −９７０４及びＡＴＣＣ＃ＨＢ−９７０５から成るグループから選ばれるハイブリドーマから成るグループから選ばれたハイブリドーマの注射及び分泌されたモノクローナル抗体のマウス腹水液又は血清からの回収のステップから成るヒトＸＩＩ因子軽鎖領域に対するモノクローナル抗体の作成方法。
（１８）請求項１７の方法により調製されるモノクローナル抗体。
（１９）ヒトＸＩＩ因子軽鎖領域の抗原決定基に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する継続的細胞系統、前以てヒトＸＩＩ因子の軽鎖を含む免疫原で免疫されたドナー由来の脾臓細胞に融合されたミエローマの細胞雑種及び上記の雑種の培養培地を含む構成。
（２０）脾臓細胞及びミエローマがマウス由来である請求項１９に記載の構成。
（２１）ミエローマがＡＰ２／Ｏ−Ａｇ１４である請求項２０に記載の構成。
（２２）細胞系統ＡＴＣＣ＃ＨＢ−９７０３。
（２３）細胞系統ＡＴＣＣ＃ＨＢ−９７０４。
（２４）細胞系統ＡＴＣＣ＃ＨＢ−９７０５。
（２５）ヒトＸＩＩ因子及びＸＩＩ因子軽鎖を含むＸＩＩ因子フラグメントの、液体を固定化モノクローナル抗体に接触させ、上記ＸＩＩ因子及びＸＩＩ因子フラグメントを液体から吸収することを含む、液体からの除去方法。
（２６）液体が血漿製剤である請求項２５に記載の方法。
（２７）モノクローナル抗体がＡＴＣＣ＃ＨＢ−９７０３、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−９７０４及びＡＴＣＣ＃ＨＢ−９７０５から成る細胞系統のグループから選ばれる細胞系統により産生される請求項２６に記載の方法。