JPH06506203A - レセプター誘発結合部位に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 レセプター誘発結合部位に対するモノクローナル抗体産業上の利用分野 本発明は、リガンドをレセプターに結合してレセプター−リガンド複合体を形成 する際にリガンド上に誘発される抗体結合部位に関する。更に、そのようなレセ プター誘発結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体並びに関連の治療及び診 断方法に関する。

背景技術 リガンドと細胞表面のレセプター分子との相互作用は、生物学的過程の証明とな る。そのような相互作用の例としては、エイズウィルス（ｌ（ＩＶ）のエンベロ ープタンパク質（ｇｐ１４０）の一部により形成されるリガンドとＴ細胞上のＣ Ｄ４レセプターとの結合、免疫系における自己／非自己判別過程において多数の リガンドと相互作用する主要な組織適合性複合体のレセプター及びフィブリノー ゲンリガンドと血小板上のＧＰＩＩｂ−１１１ａとの相互作用がある。フィブリ ノーゲン　ＧＰＩＩｂ−１１１ａリガンド−レセプターの組み合わせは、血液凝 固、血栓形成に特に興味深いものであり、リカンドとレセプターの例として以下 で用いられる。

当該技術は、リガンドとレセプターの結合及び非結合形態を識別する免疫学的方 法を、その能力がレセプター・リガンド複合体形成により仲介された生理的メカ ニズムの状態を決定することができるために、長い間探究してきた。最近まで、 免疫学的方法でそのような決定をする努力は、生物試料が結合（複合）及び遊離 両形態のリカンドとレセプターを含むことがあるために失敗していた。

例えば、血栓症にかかっている患者の血管系は、フィブリノーゲンとＧＰＩＩｂ −１１１ａの非結合形態及び表面上にフィブリノーゲン：　ＧＰＩ　Ｉｂ−１１ １ｅ複合体を有する血小板を含有する。フィブリノーゲン・ＧＰＩＩｂ−１１１ ａ？Ｊｊ合体は、非結合フィブリノ−ケンと非結合Ｇｌ’１ｌｂ−１１１ａに共 通した抗原決定基を発現するので、現在の免疫学的方法より血栓状態あるいは血 栓部位を確認することを困難にしている。

最近、Ｆｒｅｌ　ｉｎｇｅｔ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２６３： １２３９７−１２４０２（＋９８８）は、Ｇｌ’１ｌｂ−１P１ａ がリガンドに結合された場合にのみＧＰＩｌｂ−１１１ａで発現される抗原決定 基を同定したことを報告している。即ち、Ｆｒｅｌ　ｉｎｇｅｒ等によって述べ られた抗原決定基は、レセプター：リガント複合体のレセプターによって発現さ れたものである。

人工の非レセプター表面に結合するりガント上に発現された抗原決定基と免疫反 応するモノクローナル抗体の調製も報告されている。５ｏｒｉａ等、Ｊ、Ｃｏ１ １ｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｒａｃｅ　Ｓｃｉ、、１０７　：２０４−２０８（１９８ ５）には、プラスチック吸着フィブリノーゲン及びプラスチック上に吸着された あるいは溶液中に遊離した、いわゆるフィブリノーゲンＤ断片に結合する架橋フ ィブリン断片と免疫化することにより誘発されたＤＳＢ２と呼ばれる特定のモノ クローナル抗体が記載されている。報告によれば、この抗体は、液相フィブリノ ーゲンあるいは溶液中の場合のいわゆるフィブリノーゲンＥ断片に結合しない。

更に、Ｎｉ１ｓｓｏｎ等、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｉｍｍｕｎｕｌ、、２４：４８７−９ ４（１９８７）には、ザイモサンＡに粒子結合した補体Ｃ３断片と免疫反応する が、可溶性Ｃ３断片とはしないモノクローナル抗体の調製が報告されている。ザ イモサンＡに結合するタンパク質の種類は、共有化学結合を含むものである。

他の報告として、Ａｂｒａｍｓ等、Ｂｌｏｏｄ（Ｓｕｐｐｌ、　Ｉ）、７０：３ ５５ａ（Ｄｅｃ、　１９８７）には、９Ｆ９と呼ばれるモノクローナル抗体が簡 単に論じられており、発行されたアブストラクトの中で血小板結合フィブリノー ゲンに結合すると述べられている。しかしながら、この簡単な報告は、モノクロ ーナル９Ｆ９の特異的結合性を特徴としていない。

可溶化フィブリノーゲンと免疫反応する多数のモノクローナル抗体が報告されて いる。その１つは、Ｌｉｎｄｏｎ等、Ｂｌｏｏｄ　、６８：３５５−３６２（Ａ ｕｇ、　１９８８）である。その文献には、市販の抗ヒトフィブリノーゲンモノ クローナル抗体並びにＤ及びＥ断片に対するアフィニティー精製ポリクローナル 抗体の用途が報告されている。

発明の概要 本発明は、レセプター結合リガンドによって発現されるレセプター誘発抗体結合 部位（ＲＩＢＳ）の存在によって、レセプターに特異的に結合したりガントと非 結合リガンドとを識別することができるという発見を含むものである。即ち、そ こでリガンドがレセプターに特異的に結合する場合に決定基は発現されるが、レ セプターとりガントが結合されない場合には発現されないある種の抗原決定基を 発見した。

ＲＩＢＳは、認識レセプターに結合するリガンドの特異的相互作用のために、リ ガンド上に発現される。ＲＩＢＳは、タンパク質がプラスチック吸着タンノくり 質のような別の表面と非特異的に相互作用する場合あるいはタンパク質が表面と 共有化学結合で相互作用する場合に露出される抗原決定部位ではない。後者のこ れら２種の例は、上記５ｏｒｉａ等及びＮｉ１ｓｓｏｎ等の文献に開示されてお り、本明細書で定義したＲ　Ｉ　Ｂ　Ｓを生しる特異的レセプターリガンド結合 相互作用を含んでいない。

また、レセプターと結合する場合にはリガンドと免疫反応するが、相互に特異的 に結合しない場合にはレセプターあるいはリガンドのいずれとも免疫反応しない 抗体分子も本発明によって企図される。好ましい実施態様においては、本発明の 抗体は、ヒトフィブリノーゲン上に局在したＲＩＢＳを認識する。

このような抗体は、フィブリノーゲンとレセプター、好ましくは血小板上のＧＰ ｆｌｂ−１１１ａとの相互作用の結果として誘発されるＲＩＢＳを認識する。本 発明の抗体は、過剰量の血漿フィブリノーゲンの存在下でさえも、結合フィブリ ノーゲンと選択的に免疫反応する。これらの抗体のユニークな特性によって、有 用な種々の診断系及び治療方法が提供される。

本発明の好ましい実施態様は、レセプターリガンド複合体によって発現したレセ プター誘発結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体である。モノクローナル 抗体は、２Ｇ５．２ＦＩＯ１３Ｇ１１及び４６１Ｏと称する抗体からなる群より 選ばれることが好ましい。モノクローナル抗体は、７Ｎイブリドーマ２Ｇ５、ハ イブリドーマ２ＦＩＯ、ハイブリドーマ３Ｇ１１及びハイブリドーマ４ＧＩＯか らなる群より選ばれたハイブリドーマによって産生される。

本発明のもう１つの実施態様は、細胞培養組成物であって、ａ）　ＧＰＩＩｂ− １１１ａ・フィブリノーゲン複合体によって発現したレセプター誘発結合部位と 免疫反応する抗体を産生ずるｌＸイブリドーマ２Ｇ５、ハイブリドーマ２ＦＩＯ 、ハイブリドーマ３Ｇｌｌ及びハイブリドーマ４Ｇ１０からなる群より選ばれた ／％イブリドーマ。

ｂ）ハイブリドーマによって分泌された抗体分子；及びＣ）ハイブリドーマ用培 養基； を含む組成物である。

更に、レセプター−リガンド複合体の存在を検出する方法が企図され、この系は 、レセプター−リガンド複合体によって発現したレセプター誘発結合部位（ＲＩ ＢＳ）と免疫反応するモノクローナル抗体を含み、ＲＩＢＳは非結合レセプター 又は非結合リガンドによって発現しない。レセプター複合体は、ＧＰＩｌｂ−１ １１ａ　：フイブリノーゲンであることが好ましい。モノクローナル抗体を生体 内の表示手段に結合する方法も好ましい。

本発明のもう１つの態様は、血液試料においてＣＰＩｌｂ−１１１ａ　：フィブ リノーゲン複合体の存在をアッセイするキット形態の診断系であって、この複合 体によって発現されたＲＩＢＳと免疫反応するモノクローナル抗体を含む診断系 である。

本発明のもう１つの実施態様は、哺乳動物における生体内血栓の分散方法であっ て、モノクローナル抗体−プラスミノーゲン活性化酵素複合体におけるモノクロ ーナル抗体領域がＣＰＩｌｂ−１１１ａ　：フィブリノーゲン複合体によって発 現したＲＩＢＳと免疫反応する該複合体の有効量を該哺乳動物に静脈投与するこ とを含む方法である。プラスミノーゲン活性化酵素が組織プラスミノーゲン活性 化因子であり、モノクローナル抗体が２Ｇ５．２ＦＩＯ１３Ｇ１１及び４Ｇ１０ からなる群より選ばれることが好ましい。

本発明のもう１つの態様は、哺乳動物における血栓の生体内検出であって、ａ） 血栓を示すＧＰＩｌｂ−１＋１ａ　：フィブリノーゲン複合体によって発現した ＲＴＢＳと免疫反応するモノクローナル抗体の有効量を該哺乳動物に静脈投与し ：ｂ）投与された哺乳動物を、モノクローナル抗体がＧＰＩＩｂ−１１１ａ　： フイブリノーゲン複合体と免疫反応するのに十分な所定時間維持してその免疫反 応生成物を形成させ： Ｃ）工程（ｂ）で形成した免疫反応生成物の存在、即ち、血栓の存在を分析する ；を含む検出である。

また、レセプター−リガンド複合体によって発現しる本ＲＩＢＳを含むアミノ酸 残基配列において対応するポリペプチドも企図される。好ましい実施態様におい ては、ポリペプチドは、ＧＰＩｌｂ−１１１ａ　：フィブリノーゲン複合体のＲ ＩＢＳに対応するアミノ酸残基配列を含む。ポリペプチドの全配列がヒトフィブ リノーゲンのγ鎖の対応ＲＩＢＳアミノ酸配列色配列であることが更に好ましい 。特に好ましいポリペプチドは、約４０個までのアミノ酸残基を含み、式：％式 ％ を有するアミノ酸残基配列を包含する。ポリペプチドは、式：Ｈ−Ｌｙ　ｓ　− Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ　−３ｅ　ｒ　−Ｍｅ　ｔ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙ ｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅ　ｔ　−Ｌｙｓ@−ＯＨ を有することが最も好ましい。

本発明は、また、例えば、ポリペプチドが表面上に固定化される場合のように、 レセプター−リガンド複合体のリカンド分子のＲＩＢＳエピトープに似ている本 ポリペプチドと免疫反応する抗体である。本発明の抗体は、また、ポリペプチド に対応するアミノ酸残基配列を含むレセプター−リガンド複合体と免疫反応する ことが好ましい。これに関して特に好ましい抗体は、ＡＴＣＣ受託番号１−ＩＢ ９８４７を有するハイブリドーマ２Ｇ５によって分泌される。

本ポリペプチドと抗体は、多くの治療及び診断プロトコールを与える。例えば、 −学的に許容しうる賦形剤と混合する場合のように、患者を本ポリペプチドで治 療することにより患者においてレセプター−リガンド複合体と免疫反応すること から本抗体を阻害及び／又は中和する方法が予想される。即ち、上記ポリペプチ ドは、抗体と競合して免疫反応することにより、患者における遊離抗体の存在を 減少させる。

本ポリペプチドと抗体に対して企図されるもう１つの使用方法は、抗体を含む溶 液において抗体の存在を検出することである。即ち、その溶液を固定化した本ポ リペプチドを有する表面上に移すことができ、抗体がポリペプチドと反応して検 出可能な免疫複合体を形成することが好ましい。免疫複合体の存在は、溶液中の 抗体の存在を示している。

更に企図される用途としては、抗体を含む溶液、例えば、溶液中の不純物から本 抗体を単離することである。表面上に固定化された本ポリペプチドに抗体含有溶 液を通過させることができ、引き続き抗体が置き換えられる。標的抗体は集める ことにより、精製される。

図面の簡単な説明 図１は、Ｍａｂ　２Ｇ５の血小板結合フィブリノーゲンに対する結合を示す。ｌ ！Ｊ−ｚＧ５　（０，１μＭ）の血小板（ｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏ＠／ｍｌ）の結合は、 １μＭフィブリノーゲンなしく斜線）又はあり（黒）で、非賦活化、ＡＤＰ（ｔ ｏμＭ）賦活化又はα−トロンビン（０，５単位／ｍｌ）賦活化血小板を用いて 行った。実験を平行して、！？Ｓ１−フィブリノーゲン（０，３μＭ）単独の結 合を測定した（白）。

図２は、Ｍａｂ　２Ｇ５と反応するＤｌｏｏのタンパク質分解断片の単離を示す 。Ｄｌｏｏをプラスミンで消化し、固定化２Ｇ５のアフィニティークロマトグラ フィーにかけた。図Ａは、２８０ａｍにおける吸光度でモニターしたクロマトグ ラムであり、非結合（Ｆ）と結合（Ｂ）画分を示す。結合物質をプールし、逆相 Ｖｙｄａｃ　Ｃ１８カラムのＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）にかけた 。図Ｂは、２８０ａｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

ミノ酸残基を結合してペプチド又はポリペプチドを形成する。アミノ酸残基配列 は、便宜上、その構成アミノ酸に対して１文字又は３文字略号で表される。本明 細書で用いられるアミノ酸の略号は、３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，６１，８２２（ｂ）（２ ）に規定されているものであり、次の対応表に転載する：対応表 Ｆ　Ｐｈｅ　フェニルアラニン Ｍ　Ｍｅｔ　メチオニン Ａ　Ａｌａ　アラニン Ｓ　Ｓｅｒ　セリン ！１１ｅ　イソロイシン Ｐ　ｌ’ｒｏ　プロリン に　Ｌｙｓ　リシン ＨＨｉｓ　ヒスチジン Ｑ　Ｇｉｎ　グルタミン Ｅ　Ｇｌｕ　グルタミン酸 Ｚ　Ｇｌｘ　Ｇｌｕ及び／又はＧｌｎ ｗＴｒｐ　）リプトファン ＲＡｒｇ　アルギニン １）　Ａｓｐ　アスノくラギン酸 Ｎ　Ａｓｎ　アスパラギン Ｂ　ＡＳＸ　Ａｓｎ及び／又はＡｓｐ ＣＣｙｓ　システィン Ｊ　Ｘａａ　不特定 本明細書においてアミノ酸残基配列を含む個々の残基は、アミノ酸残基配列を組 み込んでいる分子が所望の機能特性を保持する限り、Ｄ又はＬ異性体であっても よい。また、アミノ酸残基配列は、翻訳後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒド ロキシル化、グリコジル化アミノ酸残基又はジスルフィド結合により結合された 残基を含めてもよい。更に、アミノ酸残基配列は、修飾されたあるいは特殊なア ミノ酸を１個以上、例えば、３７　Ｃ，Ｆ、　Ｒ，旧、　８２２（ｂＸ４）で挙 げられているものを含めることができ、これらを参考として本明細書に引用する 。アミノ酸残基配列は、その構成アミノ酸に対応した略号で表すことができ、２ つの隣接した略号間のハイフンは、対応する残基間のペプチド結合を示している 。

ペプチド／ポリペプチド・　ポリマーは、少なくとも２個のアミノ酸残基を含み 、隣接の残基は、１つの残基のα−アミノ基と隣接の残基のα−カルボニル基の 間のペプチド結合で連結されている。ポリペプチドの一次構造は、ポリマーの一 方の末端の第一アミン基ともう一方の末端のカルボン酸基を有する。即ち、ポリ ペプチドは、下記式で表される。

Ｈ−［ＮＨ−ＲＣＨ−Ｃ（０）　］　、　−０Ｈ（式中、Ｒはあるアミノ酸残基 に特有の側鎖てあり、ｌはポリマーを含むアミノ酸残基数であり、２以上である 。）ポリペプチドは、１個以上のアミノ酸残基配列を含むことができる。また、 水溶液中のポリペプチドは、通常、１個以上の双性イオンの形であり、これは溶 液のｐＨに左右される。

タンパク質：　タンパク質は、約５０個以上のアミノ酸残基を含む単一のポリペ プチド又はセットの架橋ポリペプチドである。タンパク質は、同一ポリペプチド 鎖内にあるいは隣接したポリペプチド間に化学架橋、即ち、ジスルフィド橋を有 してもよい。タンパク質は、グリコジル化することができ、その場合、糖タンパ ク質と呼ばれる。

レセプター：　レセプターは、リガンドと呼ばれる他の分子と特異的に結合して レセプター−リガンドタンパク質又は糖タンパク質複合体を形成する生物学的に 活性なタンパク質性分子をいう。

リガンド及び認識（Ｃｏｇｎａｔｅ）リガンド：　これらのりガントは、特定の レセプター分子と特異的相互作用により結合する構造タンパク質を含む分子をい う。

抗原決定基又は抗原：　抗原決定基又は抗原は、抗体結合部位と免疫学的に結合 する抗原の実際の構造部分を意味する。これらの用語は、エピトープと同じ意味 でも用いられる。

新抗原（Ｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎ）　・　本明細書で定義される新抗原は、レセ プターに結合する前のリガンドによって発現しないが、リガンド−レセプター複 合体によって発現する新規な抗原決定基である。

刺夏ｖｊ　ｉ　ｃ）抗原決定基：　認識（特異）レセプターに結合する際にリガ ンドタンパク質のコンホーメーンヨン変化により形成される新抗原決定基を意味 する。即ち、本明細書で記載されるリガンドは、リガンドがレセプターに特異的 に結合していない限り、陰性抗原決定基を発現しない。

レセプター誘発結合部位（ＲＩＢＳ）：　ＲＩＢＳは、レセプター−リガンド複 合体のりガント部分によって発現されるが、非結合リガンドあるいは非占有レセ プターによっては発現しない新抗原決定基である。ＲＩＢＳは、′高次（Ｃｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）”あるいは“逐次（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｉ）”である ことができる。ＲＩＢＳは、レセプター結合により誘発されたりガントの特異的 変化の結果、即ち、“陰性抗原決定基”である。

炸倦　文法上種々の形の用語抗体は、本明細書では、免疫グロブリン分子及び免 疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗体結合部位又はパラトープ を含む分子を意味するために用いられる。具体的な抗体分子は、無傷（ｉｎｔａ ｃ【）の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子及び免疫グロ ブリン分子の一部であり、当該技術においてＦａｂ、Ｆａｂ’　、Ｆ（ａｂ’　 ）２及びＦ（Ｖ）として知られるものが挙げられる。

抗体結合部位：　抗体結合部位は、抗原と特異的に結合する（抗原と免疫反応す る）重鎮及び軽鎖可変及び超可変域を含む抗体分子の構造上の部分である。種々 の形の用語免疫反応は、抗原決定基含有分子と、全抗体分子又はその一部のよう な抗体結合部位を含む分子との間の特異結合を意味する。

モノクローナル抗体二　文法上種々の形の用語モノクローナル抗体は、特定の抗 原と免疫反応することができる実質的に１種のみの抗体結合部位を含む抗体分子 の集団を意味する。即ち、モノクローナル抗体は、典型的には免疫反応する抗原 に対してｍ−の結合親和性を示す。従って、モノクローナル抗体は、複数の抗体 結合部位を有する抗体分子、各々が異種抗原に対して免疫特異的な、例えば、二 特異性モノクローナル抗体を含んでもよい。

Ｂ、レセプター誘発結合部位及びポリペプチド前に述べたように、リガンド−レ セプター複合体形成は、多くの生物学的過程の中心である。そこでリガンド−レ セプター形成に伴う生物学的機能と共に、更に微妙な変化が生しることが見出さ れた。その変化は、複合体形成の際にレセプターと結合相互作用に起因するりガ ント分子のコンホーメーションにある。リガンドコンホーメーションの変化は、 実質的に複合体の形成の際にのみ発現される新抗原決定基の形成を生じる。新抗 原決定基は、本明細書においてレセプター誘発結合部位（ＲＩＢＳ）を意味する 。

リガンドとしてのフィブリノーゲンをレセプターとしてのＧＰＩＩｂ−１１［ａ に結合することにより形成された複合体によって発現されるＲＩＢＳは、ＲＩＢ Ｓ形成事象の例として本明細書で例示的に用いられる。フィブリノーゲン−ＧＰ ＩＩｂ−１１１ａ複合体と免疫反応し、フィブリノーゲン−ＧＰＩＩｂ−１１１ ａ複合体として存在しない場合にはリガンドあるいはレセプターと実質的に反応 しないモノクローナル抗体もまた抗−ＲＩＢＳ　（あるいは更に簡単に、ＲＩＢ Ｓ）モノクローナル抗体の例として本明細書で用いられる。

本明細書で詳細に述べる具体的なＲＩＢＳ及びＲＩＢＳモノクローナル抗体の他 に、更に数種のりガント−レセプター複合体が文献に報告されている。本発明は 、本明細書で記載した手法を用いて、そのような複合体もまたＲＩＢＳを形成し 、モノクローナル抗体をそのＲＩＢＳに生しることを企図する。そのようなモノ クローナル抗体は、リガンド結合レセプター形成体のりガント部分とのみ免疫反 応し、遊離レセプター又は遊離リガンドと免疫反応しない。そのようなＲＩＢＳ モノクロ−カル抗体を用いたものは、遊離リガンド及び遊離レセプターのいずれ かあるいは双方の存在下でリガンド−レセプター複合体、即ち、占有されたレセ プター又は占有されたりガントの存在及び量を分析することができる。

ＲＩＢＳ形成性リガンド及びレセプターの組み合わせの例を下記表１に挙げる。

これらの組み合わせは、単に例示するためのものであり、本ＲＩＢＳを形成する ことができるレセプター−リガンドの組み合わせを限定するものではない。

表１ リガンドレセプターの組み合わせ リガンド　レセプター　引用Ｎｏ。

フォンビルプラント因子　ＧＰＩｌｂ−１１１ａ　１ビトロネクチン　ＧＰＩＩ ｂ−４１１ａ　ｌフィブロネクチン　フィブロネクチンレセプターＩＣＡＭ−Ｉ 　ＬＦ＾−１Ｉ Ｃ３ｂｉ　ＣＲ３補体レセプター　４ Ｃ３ｄ　ＣＲ２補体レセプター　５ ＨＩＶ−ｇｐ１４０　ＣＤ４　Ｔ細胞レセプター　〇ＦＳｌ＋放出タンパク質　 ＦＲＰレセプター　７Ａｐｏ　Ｂ−１００アポリポタンパク質レセプター　８Ｉ Ｌ−２インターロイキンレセプター　９免疫グロブリン　Ｆｃレセプター　１０ 絨し性性腺刺激ポルモン　ソマトスタチンレセプター　１１ＰＤＧＦ　ＰＤＧＦ レセプター　１２ トランスフエリン　トランスフェリンレセプター　１３１　ＲｕｏｓｌａｈＬｉ 等、５ｃｉｅｎｃｅ　、２３８：４９１−４９７　（１９８７）。

２　）１ｏｒｗｉｔｚ等、Ｊ、　Ｃｅｌ　１．　Ｂｉ吐、１０１：２１３４　（ １９８５）。

３　Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｓ等、Ｎａｔｕｒｅ、３１８：４７０　（１９８５） 。

４　Ｗｒｉｇｈｔ等、ＰＮＡＳ、８４：１９６５　（＋９８７）。

５　Ｎｅｍｅｒｏｗ等、Ｊ、　Ｖｉ　ｒ吐、５５：３４７　（＋９８５）。

ＯＧｕｙａｄｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ、　３２０：６６２　（１９８７）。

７　Ｙｕ等、Ｎａｔｕｒｅ、３３０ニア６５　（１９８７）。

８　Ｙａｍａｄａ等、Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、８０：５０７　（ １９８７）。

９　Ｄｏｗｅｒ等、１ｍｍｕｎｏ１．Ｔｏｄａｙ　、８：４６　（１９８７）。

１０　Ａｎｄｅｒｓｏｎ等、Ｊ、　１ｗ＋ｕｎｏｌ　、　１３Ｂ：２２５４　（ １９８７）。

１１　ＫｉｆｆＩ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩＬ、２６２：４７０　（＋９ ８７）。

１２　Ｋｅａｔｉｎｇ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　、　２５２ニア９３２　（ １９８７）。

１３　Ｋｏｈｇｏ等、Ｂｌｏｏｄ　、７０：１９５５　（１９８７）。

本発明の１実施態様においては、ポリペプチドは、リガンドのＲＩＢＳにおける レセプター−リガンド複合体のりガントのエピトープに似ていることが予想され る。従って、本ポリペプチドは、ＲＩＢＳの領域にリガンドと対応するアミノ酸 残基配列を有する。

好ましい実施態様においては、ＲＩＢＳを定義するヒトフィブリノーゲンのγ鎖 にアミノ酸残基配列に対応するアミノ酸残基配列を含む。ポリペプチドの全配列 は、フィブリノーゲン領域と同一であるが、未変性のフィブリノーゲンの場合に も予想されるポリペプチドの保存的置換に似ていることが最も好ましい。

従って、本発明の好ましい態様においては、本発明のポリペプチドは、下記式で 表されるアミノ酸残基配列を有する。

Ｈ−Ｘ　、　−Ｙ−Ｘ　１ｌｌ−ＯＨ （式中、Ｙはヒトγ鎖フィブリノーゲンアミノ酸残基配列の群より選ばれたアミ ノ酸残基配列であり：Ｘ１はｎ＝ｏの場合存在せず、ｎ＝１の場合約３０個まで の残基を含むＮ−末端（リーダーセグメント）アミノ酸残基配列であり：Ｘ１は ｍ−〇の場合存在せず、ｍ＝１の場合約３０個まての残基を含むＣ−末端（テー ルセグメント）アミノ酸残基配列である。）全ポリペプチドは、約４０個までの アミノ酸残基を含み、約３０個までの残基が好ましく、約２０個までの残基が最 も好ましい。

Ｙは、残基３６３前後から残基３９３前後までのヒトフィブリノーゲンのγ鎖の アミノ酸残基配列と対応することが好ましい。Ｙは、式：　Ａｓｎ−Ｇｌｙ−１ １ｅ−１１ｅ−Ｔｒｐ−Ａ　ｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ− Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｍｅ　ｔ　−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒで示さ 黷驛Aミ ノ酸残基配列を有することが更に好ましい。Ｙは、式：　Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒ ｇ−Ｔｒｐ４ｙｒ−５ｅｒ−Ｍｅｔ−１，ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅ ｔ−Ｌｙｓを有することが最も好ましい。

Ｘｌ又はＸ、、がアミノ酸残基配列である場合、ｘｏ又はＸ、は約２０個までの 残基を含むことが好ましく、約１０個までの残基が更に好ましく、約５個までの アミノ酸残基が最も好ましい。典型的には、Ｘ、及びＸ□は、各々ヒトフィブリ ノーゲンに対応して見られる配列と同一のアミノ酸残基配列を有する。

更に好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは下記式を有する。

１ｌ−Ｙ−０１１ （Ｙは」二で定義した通りである。） 本発明のポリペブチ）−は、本明細書で記載した手段により、種々の有用な抗体 を生成するために用いることができる。ポリペプチドの有用性は、下記に示され る論理から明らかになるであろう。

典型的には、本ポリペプチドは、グリコジル化されない、即ち、ペプチド合成の 標準的ｆ、法又は本発明の組換えＤＮＡ分子の原核宿主発現により直接合成され る。真核的に産生された本発明のポリペプチドは、典型的にはグリコジル化され る。

本ポリペプチドは、得られたポリペプチド分子が所望の特性を示す限り、挿入、 欠失及び保存的又は非保存的なアミノ酸残基の置換のような種々の変化を組み込 むことができる。本明細書で言う“所望の特性”は、ポリペプチドが適切な宿主 内で免疫原性であり、ポリペプチドに対して、好ましくは、例えば、血小板上で 発現されたＧＰＩＩｂ−１１１ａ−フィブリノーゲン複合体に対して抗体を生成 することができることを包３する。更に、ポリペプチドは抗原性であるので、抗 体はポリペプチド、好ましくはＧＰＩｌｂｌｌｌａ−フィブリノーゲン複合体と 免疫反応する。

本ポリペプチドが上記で示したものに対応する配列の保存的置換を組み込む場合 、置換アミノ酸残基は、得られたポリペプチドがフィブリノーゲン配列と異なる （以外の）アミノ酸残基配列を有するように別の生物学的に類似したアミノ酸残 基に置換される。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又 はメチオニンのような疎水残基を別の疎水残基に置換することを包含する。また 、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパ ラギン等の極性残基をこのグループの別の基に保存的に置換することができる。

また、置換されたアミノ酸残基が置換されないもとの基のアミノ酸残基に置き換 わる場合、保存的置換を組み込んでいるポリペプチドの別の態様が生じる。置換 アミノ酸の例は、３７　Ｃ，Ｆ、　Ｒ，！１３１．８２２（ｂＸ４）にあり、ご れらの種類を参考として本明細書に引用する。ポリペプチドがフィブリノーゲン の配列に対応し、１種以上の保存的置換を有するアミノ酸残基配列を有する場合 、未変性タンパク質のアミノ酸残基の好ましくは約２０％以上、更に好ましくは 約１０％以上は置換されない。特に好ましい保存的に置換されたポリペプチドは 、上記で同定されたもののようなヒトγ鎖アミノ酸残基配列のモノ置換類縁体で ある。

本発明のポリペプチドは、当業者に既知の任意のペプチド合成法により合成する ことができる。数種の利用できる手法の概要は、Ｊ、　Ｍ、　５ｔｕａｒｄ、　 Ｊ、　Ｄ、　Ｙｏｕｎｇ　、５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎ ｔｈｅｓｉｓ″、Ｗ、Ｈ，Ｐｒｅｅｍａｎ　、　Ｃｏ、　、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃ ｉｓｃｏi１９６９）、 Ｊ、ＭｅｉｎｈＯｆｅｒ　＋　Ｈｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　 Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”　Ｖｏｌ、２　、　ｐｐ、４６　、　Ａモ≠р■高奄■ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）＋９８３及び米国特許第４，６３１，２１１に あり、この説明を参考として本明細書に引用する。本発明で使用するのに必要な ポリペプチドが比較的短い（長さが約４０個より少ないアミノ酸残基）場合、一 般的には、直接ペプチド合成法が好ましく、通常、メリフィールド法［Ｍｅｒｒ ｉｆｉｅｌｄ　ＪＡＣ３，８５：２１４９（１９６３）］のような固相法が用い られる。

更に、本発明の態様は、本発明のポリペプチドを適切な医薬賦形剤と、好ましく は単位剤形として混和して含むポリペプチド組成物である。ポリペプチド組成物 は、本発明のポリペプチドと免疫反応する抗体分子を“中和する”ために用いる ことができる。即ち、本ポリペプチド分子と免疫反応する哺乳動物内に存在する 抗体分子は、ペプチドと抗体の複合体形成のために、哺乳動物内の循環から効果 的に取り除くことができる。

本発明の好ましい態様は、抗体がポリペプチド組成物中のポリペプチドを認識す る場合であり、血小板上で発現されるヒトＧＰＩＩｂ−１１１ａと免疫複合体を 形成したヒトフィブリノーゲンのＲＩＢＳエピトープを定義する。特に好ましい 実施態様は、前記アミノ酸残基配列又は保存的に置換されたその配列を含むポリ ペプチドで中和された２Ｇ５　）Ｍｂを使用する。

本発明のもう１つの態様では、本ポリペプチドは、本明細書で記載した方法でポ リペプチドと免疫反応する抗体を生成するために用いることができる。ポリペプ チドは、単独であるいは別の化学物質群、例えば、キャリヤ分子と複合して動物 を免疫するために用いられる。宿主に許容される任意のキャリヤ群が予想される 。

Ｃ，モノクローナル抗体 本発明のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、リガンドのレセプター誘発結合部位 と免疫反応する抗体分子を含むことが特徴である。本発明のＭＡｂは、ＲＩＢＳ と免疫反応するが、非結合（遊離）リガンドあるいはレセプターと、即ち、リガ ンド又はレセプターが溶液中に遊離している場合、実質的に免疫反応しないこと により、リガンドのレセプター結合と非結合形態とを識別することができる。本 発明のＭＡｂは、リガンド−レセプター複合体とのモノクローナル抗体免疫反応 が遊離リガンド又は非結合レセプターと競合結合することにより、約１５％以下 、好ましくはもっと低く阻害される場合には、本明細書に記載される別の種類と “実質的（ご免疫反応しない。

好ましいｌ実施態様においては、本ＭＡｂは、シトアドヘシンーリガンド複合体 によって発現されたＲＩＢＳと免疫反応する抗体分子を含む。シトアドヘシンは 、その全てがアミノ酸残基配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸又はＲＧ Ｄを含むリガンドに結合するレセプター分子の上位系に付された名称である。

［ＰＩｏｗ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３：６００ ２　（１９８６）］、この上位系は、インテグリンとも名付けられている。　［ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ　、２３８：４９１−４９７　（１９８ ７）］。

本明細書において具体的な興味深い個々のシトアトへシンは、ＧＰＩ　Ｉｂ−＋ 　１１ａであり、血小板フィブリノーゲンレセプターとしても知られる。

本発明の好ましいモノクローナル抗体は、次のハイブリドーマの１種によって分 泌（産生）される：　ＡＴＣＣ受託番号１１８９８４７を有するハイブリドーマ ２Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号１１８９８４４を有するハイブリドーマ２ＦＩＯ１Ａ ＴＣＣ受託番号ＨＢ９８４５を有する／％イブリドーマ３Ｇ１１及びへＴＣＣ受 託番号）ＩＢ９８４６を有するハイブリドーマ４Ｇ１０゜上記ハイブリドーマは 、ブダペスト条約に基ついて１９８８年９月２９日にアメリカン・タイプ・カル チュア・コレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｍ　Ｄｒｉｖ ｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　％ＭＤ、　２０８５２　、ｔｌｓＡに寄託された。

Ｄ、モノクローナル抗体組成物の製造方法本発明は、レセプター誘発結合部位と 免疫反応するモノクローナル抗体を形成する方法に関する。この方法は、次の工 程を含むものである。

（ａ）動物にレセプター−リガンド複合体を免疫する。これは、典型的には、免 疫原の免疫学的に有効な量、即ち、免疫応答を十分生じる量を免疫学的にコンピ テントな哺乳動物に投与することにより行われる。哺乳動物はウサギ、ラット又 はマウスのような鰯歯類が好ましいが、ヤギ、ウマ及びサルのような他の哺乳動 物を用いることもできる。次いで、哺乳動物は、レセプター−リガンド複合体と 免疫反応する抗体分子を分泌する細胞を産生ずるのに十分な時間維持される。

（ｂ）次いで、免疫した哺乳動物から取り出した抗体分泌細胞の懸濁液を調製す る。これは、典型的には、哺乳動物の膵臓を取り出し、当該技術において周知の 方法を用いて生理学的に許容しつる培地に個々の膵臓細胞を機械的に分けること により行われる。

（ｃ）懸濁した抗体産生細胞を形質転換された（“不死性を獲得された″）細胞 系を産生ずることができる形質転換物質で処理する。形質転換物質及び不死性を 獲得した細胞系を産生ずるそれらの使用は、当該技術において周知であり、エプ スタインパールウィルス（ＥＢＶ）　、シミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）、 ポリオーマウィルス等のＤＮＡウィルス、モロニーマウス白血病ウィルス（Ｍｏ −ＭｕＬＶ）　、ラウス肉腫ウィルス等のＲＮＡウィルス、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８ ．６５３　、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４等の骨髄腫細胞が挙げられる。

好ましい実施態様においては、形質転換物質で処理すると、懸濁肺臓細胞を適切 な細胞系のマウス骨髄腫細胞と適切な融合プロモーターを用いて融合することに よりハイブリドーマの産生が生しる。好ましい比率は、約１０”牌細胞を含む呼 局液中１骨髄腫細胞に対して約５牌臓細胞である。好ましい融合プロモーターは 、平均分子量約１０００〜約４０００を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ 　１０ｏｏとして市販されている）であるが、当該技術において既知の他の融合 プロモーターも用いられる。

用いられる細胞系は、非融合骨髄腫細胞が選択培地中で生存しないが、ハイブリ ッドは生存するので、いわゆる“薬剤耐性”型であるべきであることが好ましい 。最も一般的な種類は、８−アザグアニン耐性細胞系であり、これは、酵素ヒボ キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼが欠損しているので、Ｈ ＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）培地で支持されない。ま た、一般的には、用いられる骨髄腫細胞系はいわゆる“非分泌”型であって、そ れ自体抗体を産生じないが、分泌型が用いられることが好ましい。しかしながら 、ある場合には、分泌骨髄腫系が選ばれる。

（ｄ）次いて、形質転換細胞を、好ましくはモノクローン性にクローン化する。

クローン化は、非形質転換細胞を支持しない組織培養基中で行われることが好ま しい。形質転換細胞がハイブリトーマである場合、これは、別の容器で、非融合 骨髄腫細胞を支持しない選択培地中の非融合肺細胞、非融合骨髄腫細胞及び融合 細胞（ハイブリドーマ）の混合液を非融合細胞を十分死滅することができる時間 （約１週間）希釈培養することにより行われる。希釈及び培養は、別の容器で行 われ、希釈は、限界希釈とし、各々別の容器（例えば、ミクロリットルプレート の各ウェル）中で特定の細胞数（例えば１−４）を単離するように、希釈容量が 統計的に算出される。培地は、薬剤耐性（例えば、８−アザグアニン耐性）非融 合骨髄腫細胞系を支持しないもの（例えば、ＨＡＴ培地）である。

（ｅ）クローン化形質転換細胞の組織培養基を遊離リガンドと免疫反応せず、レ セプター−リガンド複合体の一部として存在する場合にリガンドと免疫反応する 分泌抗体分子の存在について評価する。この評価は、後述される周知の免疫学的 手法を用いて行われる。

け）所望の形質転換細胞が工程（ｅ）で同定されると、それが選ばれ、適切な時 間適切な組織培養基中で増殖され、次いで、所望の抗体を培養上清から回収する 。適切な培地及び培養時間の長さも、当該技術において周知であり、容易に決定 される。

極めて高い濃度のわずかに純粋でないモノクローナル抗体を生産するために、ハ イブリドーマが発育できるマウス又は他の哺乳動物、好ましくは同系又は半間系 マウスに所望のハイブリドーマを注入することができる。適切なインキュベーシ ョン時間の後、ハイブリドーマは抗体産生腫瘍を形成させ、宿主マウスの血流及 び腹腔浸出液（腹水）に高濃度の所望の抗体（約５−２０ｍｇ／ｎ＋Ｉ）が生し る。

これらの組成物の調製に有効な培地及び動物は、当該技術において周知で市販さ れており、合成培養基、通交系マウス等が挙げられる。合成培地の例は、４．５ 訓／１グルコース、２０ＩＩｗｌグルタミン及び２０％ウシ胎児血清で補足され たダルベツコの最小必須培地［ＤＭＥＭ　；　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ等、Ｖｉｒｏｌ 、８：３９６　（１９５９月である。通交系マウス株の例は、Ｂａ１ｂ／ｃであ る。

上記の方法で産生されたモノクローナル抗体は、ＲＩＢＳ含有免疫反応生成物の 形成が所望される、例えば、診断及び治療法で用いることができ、以下で詳細に 述べられる。そのような用途としては、例えば、生体試料においてフィブリノー ゲン結合血小板を検出する本発明の診断法及び系、例えば、血栓の生体内検出、 血栓の分散又は血栓の画像診断の場合が挙げられる。

ＲＩＢＳモノクローナル抗体は、典型的には、水性組成物中で用いられる。この 組成物は、入手した組織培養基もしくは腹水又は希釈された形とすることができ る。このような組成物は、典型的には、試験管内で用いられる。

生体内で使用する場合、ＲＩＢＳモノクローナル抗体は、典型的には、硫酸アン モニウムでの沈澱、アフィニティー精製法等により精製され、次いで、薬学的に 許容しうる希釈剤の水性組成物中で用いられる。ＲＩＢＳモノクローナル抗体の 水性組成物中の濃度は、所望の用途に適するように調節される。

Ｅ、治療方法及び組成物 前述の任意の寄託ハイブリドーマによって分泌されたモノクローナル抗体及び同 様の免疫特異性を有する抗体は、血餅又は血栓に関する領域で特に有効である。

これは、抗−ＲＩＢＳモノクローナル抗体が結合フィブリノーゲンを含む活性化 血小板に存在するフィブリノーゲン−ＧＰＩＩｂ−１１１ａレセプター複合体と 免疫反応し、血小板結合フィブリノーゲンが血栓形成に関係があるためである。

更に、ＲＩＢＳモノクローナル抗体は、循環面に生体内で存在する可溶性フィブ リノーゲンと免疫反応しないはずであるので、１種以上のモノクローナル抗体の 使用により免疫反応の極端な特異性を有することができる。

本抗体組成物の数種の好ましい用途を下記に述べる。

１、血栓分散 本発明の１態様は、血栓の分散方法である。ここで、ＡＴＣＣ寄託／１イブリド ーマ２Ｇ５．２Ｆ１０．３Ｇ１１及び４Ｇ１０の少なくとも１種によって産生さ れたモノクローナル抗体の抗体分子をプラスミノーゲン活性化酵素に化学的に結 合して、複合体の抗体部分のそのＲＩＢＳに対する結合が実質的に損傷されてお らず、酵素のプラスミノーゲン活性化因子活性も損傷されていない複合体を形成 する。複合体の両方の部分の活性が実質的に損傷されていない抗体−タンパク質 複合体の調製方法は、当業者に周知である。

プラスミノーゲン活性化酵素は、体組織の繊維素溶解又はフィブリノーゲン分解 な（７で血栓溶解を誘発する組織プラスミノーゲン活性化因子のようなプロトロ ンビン溶解類の繊維素溶解剤群を意味する。企図される他の繊維素溶解剤は、プ ロアクヂベーターグラスミノーゲンと相互作用するものであり、ストレプトキナ ーゼ、ウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−Ｐ Ａ）が挙げられるがこれらに限定されない。

本方法によれば、前記複合体の血栓分散量を含む薬学的に許容しうる水性組成物 を分散されるべき血栓を有するヒトのような哺乳動物に静脈注射又は注入等によ り投与される。このように治療された哺乳動物は、複合体の抗体部分が血小板結 合フィブリノーゲン複合体と免疫反応し、複合体のプラスミノーゲン活性化酵素 部分がプラスミノーゲンを活性化するのに十分な時間維持される。複合体の除去 は困難で時間を要する仕事であるので、治療された哺乳動物はそれ自体が通常の 手段で複合体を取り除くのに十分な時間維持される。

２、血栓形成のドｌ止 大手術、例えば、冠動脈バイパス手術後の最も重要な数日間に人のような血栓形 成の危険にある動物に対して、もう１つの治療方法が予想される。

ここで、薬学的に許容しうる水性組成物に存在するＡＴＣＣ寄託／１イブリドー マ２Ｇ５．２ＦＩＯ１３Ｇ１１及び４Ｇ１０の少なくとも１種によって産生され た抗体分子を含むモノクローナル抗体の血栓阻止量を血栓形成が阻止されるべき ヒトのような哺乳動物に投与する。治療された哺乳動物（投与されだ哺乳動物） は、投与されたＲＩＢＳモノクローナル抗体が通常の手段でその動物から取り除 かれるのに十分な時間維持される。

本方法において、ＲＩＢＳモノクローナル抗体と結合フィブリノーゲンを含む活 性化血小板との免疫反応は、血栓形成を阻止する。ＲＩＢＳモノクローナル抗体 が血小板上のフィブリノーゲン−Ｇｌ’１ｌｂ−１１１ａ複合体と免疫反応し、 血中のフィブリノーゲンと免疫反応しないので、治療された動物の正常な機能が 損傷されないことは当然のことである。

関連の実施態様においては、血小板含有溶液にＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマ２Ｇ ５．２Ｆ１０．３Ｇ１１及び４ＧＩＯの少なくとも１種によって産生されたモノ クローナル抗体分子を含む薬学的に許容しうる水性組成物を投与することを含む 血小板凝集を阻止する方法が企図される。抗体の血小板凝集阻止量は、血小板凝 集阻止が所望される動物の動物体に生体内投与されるか又は血小板含有溶液、例 えば血漿又は血液と試験管内で混合される。ＲＩＢＳモノクローナル抗体と血小 板上のフィブリノーゲン−ＧＰＩｌｂ−１１１ａ複合体との免疫反応は、血小板 凝集を阻止する免疫反応生成物を形成する。

前述の単−ＲＩＢＳモノクローナル抗体は、上記方法の各々で用いることができ るし、１種以上を含む混合液を用いることもてきる。即ち、４種のＡＴＣＣ寄託 ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体の各々はＲＩＢＳモノク ローナルである特性を共有するが、各抗体結合部位は同一のエピトープと免疫反 応しない。従って、モノクローナル抗体の混合物（単独又は複合体として）を用 いるので結合部位の単一結合フィブリノーゲン分子に対する複数結合が生しるこ とができることによる利点が得られる。

上記２つの方法はフィブリノーゲン−ＧＰＩｌｂ−１１１ａ複合体と特異的に免 疫反応するＲＩＢＳモノクローナル抗体によって記載されているが、ＲＩＢＳを 含む他のリガンド−レセプター複合体の場合、同様の方法が適用できる。

有効成分として抗体分子を含む薬学的に許容しつる水性組成物の調製は、当該技 術において十分に理解される。典型的には、そのような組成物は、液剤又は懸濁 液剤のように注射用剤として調製されるが、注射の前に水性液に溶解又は懸濁す るのに適した固体も調製することができる。製剤を乳化することもてきる。

複合体又はモノクローナル抗体単独は、たいてい、周知である薬学的に許容しう る且つ複合体又はモノクローナル抗体と適合しうる賦形剤と混合される。適切な 賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等 及びその組み合わせである。更に、場合によって、組成物は有効成分の有効性を 高める補助物質、例えば湿潤又は乳化剤、ｐｉ緩衝剤の少量を含むことができる 。

複合体又はモノクローナル抗体は、中和された薬学的に許容しうる塩として上記 水性組成物に処方することができる。薬学的に許容しうる塩としては、無機酸例 えば塩酸又はリン酸あるいは有機酸、例えば、酢酸、酒石酸、マンデル酸等と生 成される酸付加塩（酵素又は抗体分子の遊離アミノ基と生成される）が挙げられ る。遊離カルボキシル基と生成される塩もまた、無機塩基、例えば、水酸化ナト リウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は第２鉄及び有機塩基、例えば 、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２エチルアミノエタノール、ヒスチ ジン、プロカイン等から誘導することができる。

治療用抗体分子含有組成物は、慣用的には、例えば、単位用量の注射により、静 脈投与される。組成物は、投薬処方と適合しうる方法でまた治療的に、即ち、血 栓分散又は血栓阻止に有効な量で投与される。

３　抗体中和 ４−発明のポリペプチドと免疫反応する抗−ＲＩＢＳ抗体を“中和”又は阻害す る治療方法も予想される。従って、抗体が過度に血小板凝集を阻害する場合のよ うに、容認できない高レベルで患者に存在する抗体の濃度は、前述のポリペプチ ドの治療的に自効な量を叱責に投与することにより効果的に低下させることがで きる。典型的には、ポリペプチドは無菌医薬組成物としてまた本明細書に記載さ れる単位剤形で投与される。

４・携堡徒 本発明の接種物に関する“単位用量”は、動物に対する単位投薬として適切な物 理的に分離している単位を意味し、各々の単位は、要求される希釈剤、即ち、キ ャリヤ又は賦形剤と共に所望の免疫原作用を生じるように算出された活性物質の 所定量を含有する。本発明の新規な単位用量の基準が定められ、本明細書で詳細 に開示される（ａ）活性物質のユニークな特徴及び達成されるべき具体的な免疫 原作用並びに（ｂ）動物において免疫用の活性物質を配合する当該技術の固有の 制約に直接的に左右され、これらは本発明の特徴である。

単位剤形は、典型的には、水性組成物を生成するために、凍結又は乾燥抗体カニ ら水、食塩水又はリン酸塩緩衝食塩水のような生理的に許容しうる（容認しうる ）希釈剤又は賦形剤に分散することにより調製される。そのような希釈剤は、当 該技術において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃ ｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　、　１６ｔｈ　Ｅｄ、、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ ｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ　、　Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ　（１９８０）　 ｐ、　１４６５−１４６７■qべら れている。

網形には、希釈剤の一部としてアジュバントを含めることもできる。完全フロイ ンドアジュバント（ＣＦＡ）　、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）及び ミョウバンのようなアジュバントは、当該技術において周知の材料であり、数社 から市販されている。

投与されるべき抗体組成物の量は、特に、治療されるべき動物種、動物の大きさ 、血栓のサイズ（既知の場合）、存在するフィブリノーゲン結合血小板の量及び 複合体又はモノクローナル抗体を使用する患者の能力に左右される。投与される べき必要な複合体又はモノクローナル抗体の正確な量は、実施者の判断にがかっ ており、特にヒトが治療される動物である場合、各個体に特有のものである。

しかしながら、投薬範囲は、治療的に有効な血液濃度を特徴とすることができ、 本発明の抗体含有複合体又は抗体単独の濃度から、約０．Ｏ１〜約１００μ藺、 好ましくは約０．１〜１０μＭの範囲とすることができる。

開始投与及び追加注射の適切な用法も変化しうるが、典型的には、開始投与後、 引き続き注射又は他の投与により１時間以上の間隔て繰り返し投与される。また 、血中の治療的に有効な濃度を維持するのに十分な連続静脈注入も予想される。

Ｆ８診断系 本発明のキット形態の診断系は、少なくとも１回の分析に十分な量で、本発明の ＲＩＢＳモノクローナル抗体、例えば４種のＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマの１種 によって産生されたものを別個のパッケージ試薬として含む。ＲＩＢＳとＲＩＢ Ｓモノクローナル抗体との免疫反応の存在を表示する標識も、同−又は別のパッ ケージに含めることが好ましい。パッケージ試薬の使用書も典型的には含められ る。

使用書には、典型的には、試薬濃度又は少なくとも１回の分析方法のパラメータ ー、例えば、混合されるべき試薬と試料の相対量、試薬／試料混合物の維持時間 、温度、バッファー条件等を記載する実質的な方法が含まれる。

本発明の１実施態様は、血液又は血漿のような血小板含有血液試料中のフィブリ ノーゲン結合血小板を分析するキット形態の診断系である。系は、レセプターリ ガンド複合体によって発現されるＲＩＢＳと免疫反応するモノクローナル抗体を 含むパンケージを含む。モノクローナル抗体の抗ＲＩＢＳ抗体分子は、次のハイ ブリドーマ：ハイブリドーマ２Ｇ５、ハイブリドーマ２Ｆ１０、ハイブリドーマ ３Ｇ１１及びハイブリドーマ４ＧＩＯの１種によって産生されたものであること が好ましい。

抗体分子は、１個以上の特定のモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体組 成物として存在することが好ましい。更に、抗体分子が放射性核種標識、好まし くは１２８１−標識に結合するキットが好ましい。有効な標識は後述される。

もう１つの実施態様においては、本発明の診断系は、生体内血栓の存在を分析す るのに適切である。系は、レセプター−リガンド複合体によって発現されるＲＩ ＢＳと免疫反応するモノクローナル抗体分子を含むパッケージを含む。存在する 抗体分子は、２Ｇ５．２Ｆ１０．３Ｇ１１及び４Ｇ１０からなる群より選ばれた ハイブリドーマによって分泌されたものであることが好ましい。抗体分子は、生 体内標識又は表示手段に結合されることが好ましい。

生体内画像診断用キットは、たいてい、試験管内分析に用いられるが、逆が当て はまる必要がないことは理解される。例えば、生体内研究に用いられるモノクロ ーナル抗体は、水性組成物及び試薬の任意の緩衝塩であるべきであるように発熱 原因物質を除くべきである。発熱原因物質含量を除くことは、試験管内分析には 必要ない。更に、生体内画像診断に有効な表示手段は、後述される試験管内で用 いられるものと典型的に異なる。即ち、分析系は、生体内画像診断に適切であり 、適切な緩衝塩、水溶液及び表示手段は、同−又は別のパッケージ中キットの一 部として輛えられる。

好ましい実施態様においては、本発明の診断系は、更に本発明の抗体分子を含む 免疫反応複合体の形成を指示することができる標識又は表示手段を包含する。

本明細書で用いられる文法車種々の形の用語標識及び表示手段は、複合体の存在 を示す検出しつるシグナルの発生に直接的にあるいは間接的に関与するシグナル 原子及び分子を意味する。生体内標識又は表示手段は、ヒト体内で有効なもので あり、”　’　Ｉｎ　％　”ＴＣｌｌｌＧａ、…Ｒｅ及び＋３２１が挙げられる 。

任意の標識又は表示手段は、本発明の複合体又はモノクローナル抗体組成物の一 部である抗体分子に結合又は組み込むことができ、それらの原子又は分子は、単 独で又は別の試薬と連結して用いることができる。そのような標識はそれら自体 臨床診断化学において周知であり、別の新規なタンパク質方法及び／又は系で用 いられる限りにおいては、本発明の一部を構成する。

標識の抗体への結合、即ち、標識化は、当該技術において周知のことである。

例えば、ハイブリドーマによって産生された抗体分子は、培養基中に成分として 与えられた放射性同位元素含有アミノ酸の代謝取り込みにより標識することがで きる。例えば、Ｇａ１ｆｒｅ等、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　、７３：３−４ ６　（１９８１）参照。活性化官能基によるタンパク質複合又は結合法が特に適 用しつる。例えば、Ａｕｒａ＋ｎｅａｓ等、５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、、Ｖｏｌ、８５ｕｐｐ１．７：７−２３　（１９７８）　、Ｐｏｄｗｅｌｌ 等、ＢｉｏＬｅｃｈ、、３：８８X−８９４ （１９８４）及び米国特許第４．４９３．７９５号参照。

試験管内診断系には、好ましくは別のパッケージとして、特異的結合物質を含め ることもてきる。“特異的結合物質”は、本発明のモノクローナル抗体を選択的 に結合することができる分子成分であるが、本発明の抗体分子自体ではない。

具体的な特異的結合物質は、第２抗体分子、補体タンパク質又はその断片、Ｓ、 アウレウスプロティンＡ等である。本発明のＲＩＢＳモノクローナル抗体がリガ ンド−レセプター複合体との免疫複合体の一部として存在する場合、特異的結合 物質はそのモノクローナル抗体と結合する。好ましい実施態様においては、特異 的結合物質は標識される。しかしながら、診断系が標識されない特異的結合物質 を含む場合、特異的結合物質は、典型的には、増幅手段又は試薬として用いられ 、標識した第２試薬が特異的結合物質（増幅手段）に結合する。これらの実施態 様においては、増幅手段がＲＩＢＳモノクローナル抗体含有免疫複合体に結合さ れる場合、標識第２試薬は増幅手段と特異的に結合することができる。

本発明の診断用キットは、血清、血漿又は尿のような体液試料中のりガント−レ セプター複合体、例えば、フィブリノーゲン結合血小板の存在又は量を検出する ために、　”ＥＬＩＳＡｎ法で用いることができる。“ＥＬＩＳＡ”は、酵素結 合免疫吸着剤検定を意味し、試料中に存在する抗原又は抗体量を検出及び定量す るために、固体支持体及び酵素−抗原又は酵素−抗体を形成する固相マトリック スに結合された抗体又は抗原（ここては、ＲＩＢＳ含有リガンド−レセプター複 合体）を使用する。ＥＬＩ　ＳＡ法の説明は、１９８２年にＬｏｓ　Ａｌｔｏｓ 　、　ＣＡのＬａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓにより出 版されたり、　Ｐ、　Ｓｉ　ｔｅｓ等、Ｂａ５ｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ 　Ｉｍｍｕ■ ｏｌｏｇｙの第４版、第２２章並びに米国特許第３．６５４．０９０号、同第３ ．８５０．７５２号及び同第４．０１６．０４３号にあり、これらを全て参考と して本明細書に引用する。

好ましいＥＬＩＳＡキット実施態様においては、本診断系において別にパッケー ジされる固体支持体を形成するために、本発明の抗体分子は固体マトリックスに 付着される。抗体は、典型的には、水性培地から吸着により固体マトリックスに 付着するが、当業者に周知の他の付着方法も用いられる。

リガンド−レセプター複合体又はその成分の１つに結合する標識特異的結合物質 又は非標識特異的結合物質と特異的結合物質に結合する標識第２試薬もまた、キ ット中に１個又は２個の別のパンケージとして各々含まれる。マトリックス結合 抗体の例としてＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマの１種によって産生されたモノクロ ーナル抗体の１種を用いた市販されている標識抗フィブリノーゲン抗体は、特異 的結合物質の例である。

有効な固体マトリックスは、当該技術において周知である。そのような材料とし ては、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｉｓｃａｔａ ｗａｙ、　ＮＪ）から商標ＳＥｒ’ＨＡＤＥＸとして人手できる架橋デキストラ ン：アガロース；　Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ　、ＩＬのＡｂｂｏｔｔ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手てきる約１μから約５Ｉ径まてのポリスチレンビ ーズ：ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロ ース−又はナイロンベースのシート、ストリップ又はパドルのようなウェブ；又 はポリスチレン又はポリ塩化ビニル製等のチューブ、プレート又はミクロリット ルプレートのウェルが挙げられる。

本明細書で記載される任意の診断系のモノクローナル抗体（標識又は非標識）、 標識特異的結合物質又は増幅試薬は、液状分散液又は実質的な乾燥末、例えば、 凍結乾燥体として溶液に供給することができる。表示手段が酵素である場合には 、酵素の基質も、キット系の別のパッケージとして備えられる。前記マイクロタ イタープレートのような固体支持マトリックス及び１種以上のバッファーもまた 、本診断用アッセイ系において別のパッケージ品として含められる。

診断系に関して本明細書で述べたパッケージは、診断系で慣用的に利用されるも のである。そのようなパッケージとしては、ガラス及びプラスチック（例えば、 ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリカーボネート）ビン、バイアル、プラス チック及びプラスチックホイル積層外包等が挙げられる。

Ｇ−分艶牌 本発明は、例えば、血栓又はフィブリノーゲン結合血小板、好ましくは６円１ｂ −１１１ａ・フィブリノーゲンにあるレセプター−リガンド複合体を検出方法に 関する。

この方法は、レセプター誘発結合部位（ＲＩＢＳ）の発現とレセプター−リガン ド複合体のりガント部分のＲＩＢＳと免疫反応するが、非結合レセプター又は非 結合リガンドと反応しないモノクローナル抗体分子を利用する。そのような免疫 複合体を形成するために用いられる周知の多（の臨床診断化学があることを、当 業者は理解するであろう。即ち、具体的な分析法を本明細書で述べるが、本発明 がそのように限定されるものではない。

１、血栓検出 更に詳細には、ヒトのような哺乳動物において血栓の存在を検出する方法が企図 される。生体内表示手段に結合される抗体分子を含む本発明のモノクローナル抗 体の画像診断有効量を含む水性組成物をその治療を必要としている哺乳動物、例 えば、ヒトに静脈投与する。

投与された哺乳動物は、標識抗体分子が血栓の一部として血小板結合フィブリノ ーゲン複合体と免疫反応するのに十分な所定時間維持される。次いで、形成され た任意の標識免疫複合体の存在、好ましくは位置について、本哺乳動物を分析す るごとにより、血栓が検出され、好ましくは位置が確認される。標識ＲＩＢＳモ ノクローナル抗体が、通常、標識又は表示手段として放射性核種を含有する場合 、画像診断分析は、よく知られている通常の放射線画像診断技術により行われる 。このような技術は、血栓の相対的に高い濃度の放射能標識と相対的に低い体組 織量の放射能標識とを識別することができる。相対的に長命の放射性同位元素を 使用する場合、投与された哺乳動物は、標識モノクローナル抗体の実質的な体組 織クリアランスが放射能標識の自然放射能シグナルの相対的に一層低い量を与え るのに十分な時間維持される。

２、生体試料中のフィブリノーゲン結合血小板の検出血小板含有及び／又は遊離 フィブリノーゲン含有生体試料、好ましくは血液又は血液の血小板含有部分のよ うな体液試料中のフィブリノーゲン結合血小板の存在、好ましくは量を検出する 競合的あるいは非競合的な種々の異種及び同種分析プロトコールを用いることが できる。例えば、ヘパリン保存（凝固していない）血液試料と前述の寄託ＲＩＢ Ｓ抗体分子の１種の１２″ｌ標識形態を混合する。意味のある結果が得られるよ うに血液試料の量及び濃度並びに標識モノクローナル抗体が用いられることは当 然のことである。このように生成された免疫反応混合物は、試料中に存在するフ ィブリノーゲン結合血小板が標識抗体と免疫反応し、標識免疫反応生成物を生成 するのに十分な時間生物分析条件下で維持される。次いで、標識免疫反応生成物 が存在する場合、存在してもよい非反応標識抗体から分離する。同種分析におい ては、分離は、典型的には試料に存在する血小板の全てを十分ベレット化する遠 心分離による。ＥＬＩＳＡのような異種分析においては、免疫反応生成物は固体 支持体に結合され、分離は典型的には非結合Ｒ［３Ｓ抗体が捨てられ固体支持体 結合免疫反応生成物が残る洗浄工程で行われる。

ＲＩＢＳ含有リガンド−レセプター複合体と免疫反応させるために、非標識ＲＩ ＢＳモノクローナル抗体が用いられる場合、第２の混合物が前述の分離された免 疫複合体と標識結合試薬又は増幅手段として用いられる非標識結合試薬との間で 生成される。この反応混合物は、第２結合複合体が最初に生成された免疫複合体 と特異的結合試薬との間で生成するのに」−分な時間生物学的条件下で維持され る。

特異的結合試薬が抗体分子を含む場合、その第２結合複合体は第２免疫複合体で ある。Ｓ、アウレウスプロティンＡが用いられる場合、第２結合複合体は、結合 が抗体結合部位によらず、その複合体は結合複合体と呼ばれることが最良である 。

免疫複合体は特異的結合複合体であるので、特異的結合試薬と最初に名付けられ た免疫複合体との間で生成された複合体は第２結合複合体である。第２結合複合 体は、その後、前述の技術により、存在してもよい未反応特異的結合試薬から分 離され、標識の存在により免疫複合体の存在が決定され、好ましくは定量される 。

特異的結合試薬を標識せず、増幅手段として用いられる場合、存在する場合には 上記の分離第２結合複合体と標識含有第２結合試薬から第３混合物が生成される 。標識試薬が混合されなかった上記方法において、第２結合複合体の標識の存在 がめられないことは当然のことである。本方法の態様として、前記維持及び分離 工程が繰り返され、標識含有第３結合複合体が形成され、保持される。その後、 標識の存在、好ましくは量がめられる。

即ち、本分析の上記態様の各々において、標識の存在、好ましくは量は、フィブ リノーゲン結合血小板の存在、好ましくは量をめるための基準を示している。

上記分析を行う研究者は、存在する標識の量がめられるまで、通常、１種以上の 免疫複合体又は結合複合体が実際に生成されたかどうかがわからないことは留意 される。しかし、ＲＩＢＳ含有複合体が実際に存在するかのように一定の分析方 法の工程全てが行われる。

ＲＩＢＳモノクローナル抗体のユニークな特異性のために、上記分析はフィブリ ノーゲン結合血小板用及び前記画像診断分析は血栓用とすることができ、好まし くは遊離血小板と遊離フィブリノーゲンの双方、即ち、非複合化血小板及びフィ ブリノーゲンの存在下で行われる。結果として、生体試料の分離及び洗浄工程の ような特殊な処理操作は、分析においてその試料を使用する前には行う必要がな い。この特徴は、ＲＩＢＳモノクローナル抗体を用いる全ての分析に共通であ３ 、抗体検出 本抗体を、例えば、血液試料中に検出する方法も予想される。この方法は、下記 工程を含む。

（ａ）抗体を含むことが疑われる水溶液を表面、例えば、セファロースカラム上 に固定化された本発明のポリペプチドに加え；（ｂ）抗体−ポリペプチド免疫複 合体が形成されるように十分な時間及び所定の反応条件下で抗体を固定化ポリペ プチドと接触させて維持し；（ｃ）試験された溶液中の抗体の存在に関係がある 形成された免疫複合体の存在をめる。検出は、周知である抗体の放射能標識化、 結合抗体のＥＬｒＳＡ分析等によることができる。

生物検定の条件は、本発明の抗体分子の生物活性及び分析されるべきフィブリノ ーゲン結合餌小板又は他のＲＩＢＳ含有複合体を維持するものである。それらの 条件としては、約４〜約４５℃、好ましくは約３７℃の温度範囲、約５〜９、好 ましくは約７のｐＨ値範囲及び蒸留水から約１モルの塩化ナトリウムまで変動し 、好ましくは生理的食塩水程度のイオン強度が挙げられる。このような条件を最 適化する方法は、当該技術において周知のことである。

実施例１ ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の産生標準ハイブリドーマ技術を用いて 、モノクローナル抗体を産生じた。簡単に言えば、Ｂａ１ｂ／ｃ？ウスを免疫し 、引き続き、Ｃｉｅｒｎｉｅｗｓｋｉ等、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ 、、４８：３３−３７　（１９Ｆ１２）に記載されているように実質的に調製し たフィブリン０−二量体免疫原のマウス１匹につき約５０ミクログラム（μｇ） を３回追加免疫した。

引き続いて、抗体が免疫原と免疫反応した免疫マウス１匹からの１．２３ｘｌＯ ”牌細胞を２．４８　ｘ　ｌ　Ｏ’　Ｐ３Ａｇ８６５３．１マウスミエローマ細 胞と細胞融合プロモーターポリエチレングリコール４０００の存在下で混合した 。こうして形質転換した抗体産生細胞を１ウエルにつき約３ＸＩＯ’細胞密度で ９６ウエルマイクロタイターに移し、培養した。

培養約１４日後に生存可能なハイブリドーマを含むと思われる２３５ウエルから の組織培養上清を抗−ＲＩＢＳの存在についてラジオイムノアッセイによりスク リーンした。簡単に言えば、ｌμｇ／ｍｌのフィブリノーゲンあるいは低密度リ ポタンパク質（ＬＤＬ）を含むリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）　Ｉ　００　ミク ロリットル（μＩ）（対照）を固相マトリックスとして平底９６ウエルボリビニ ルマイクロタイタープレートのウェルに混合した。次いで、プレートを４℃で約 １６〜２０時間維持して固体支持体を形成するためにウェルの表面にフィブリノ ーゲン又はＬＤＬを吸着させた。被覆溶液を振盪により除去し、ウェルを洗浄し 、１００μＩの阻止溶液（５％正常ヤギ血清を含むＰＢＳ）を各ウェルに混合し て過剰のタンパク質結合部位を封鎖した。

ウェルを３７℃で約３０分間維持した後、阻止溶液を除去した。次いで、各ウェ ルに１００μｌの（ａ）ＰＢＳで１：１０に希釈したハイブリドーマ組織培養上 清又は（ｂ）競合阻害剤としてフィブリノーゲン１００μｇ／ｍｌを含むＰＢＳ で１：１０に希釈したハイブリドーマ上清を混合した。こうして生成した免疫反 応混合液を室温において約１６〜２０時間４℃で維持して固相結合免疫反応生成 物及び非結合モノクローナル抗体分子を含む液相を形成した。

次いで、各ウェルに１００μｍの１２５１−標識ヤギ抗マウスＩｇＧを混合した 。こうして生成した標識免疫反応混合液を４℃で約６〜２０時間維持して１！５ １−標識固相免疫反応生成物を生成した。固相及び液相を分けて非結合１２％■ −標識ヤギ抗マウスＩｇＧを除いた。各ウェルに対して＋２６１−結合量をγシ ンチレーションによりめた。

フィブリノーゲン被覆ウェル中のＬＤＬ−被覆ウェルからめた少なくとも約３倍 量の非特異的結合１２５Ｉの存在は、組織培養上清中の抗フィブリノーゲン抗体 の存在を示した。免疫反応混合液中液相フィブリノーゲン競合阻害剤の存在によ るし上記（ｂ）］固相結合１１１１の約１５％以下の減少は、組織培養上清中抗 ＲＩＢＳ抗体の存在を示した。

−１−記スクリーニング操作により、フィブリノーゲン：　ＧＰＩ　１ｂ−１１ １ａ複合体と結合する抗体Ｒ［ＢＳ抗体を作成する２Ｇ５．２ＦＩＯ１３Ｇ１１ 及び４Ｇ１０と称する４種のハイブリドーマの同定が得られた。ハイブリドーマ は次のＡＴＣＣ寄託番号を有する。２Ｇ５（１１８９８４７）　、２Ｆ１００１ Ｂ９８４４）、３Ｇ１１（ＨＢ９８４５）及び４Ｇ１０（ＨＢ９８４６）。

４種の上記ハイブリドーマの各々を限界希釈により２回クローン化し、引き続き 腹水液を作成するために用いた。次いで、プロティンＡセファロースを用いて腹 水液から抗体を単離した。

Ｍａｇｅ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、７０：１４２− ５０　（１９８０）の方法に従って、プロティンＡセファロース−単離Ｍａｂ　 ２Ｆ１０をパパインで（ＭＡｂのパパインに対する重量２００：１）３７℃で６ 時間消化して、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）のＦａｂ断片を含む組成物を調製 した。プロティンＡセファロースのクロマトグラフィーにより、消化されない抗 体とＦｃ断片をＦａｂ断片から除いた。セファロースから得られたＦａｂ断片を 集めて２ＦｌＯＦａｂ標品を形成した。

実施例２ 活性化血小板」二のフィブリノーゲン　ＧＰＩＩｂ−ＩｌｌａＲＩ　Ｂ　Ｓの検 出ハイブリドーマ２Ｇ５．２ＦＩＯ及び３Ｇ１１により作成したモノクローナル 抗体、即ち、各々ＭＡｂ　２Ｇ５、ＭＡｂ　２ＦｌＯ及び鵬ｂ３Ｇ１１を細胞表 面結合ＲＩＢＳとの免疫反応能について試験した。４種のモノクローナルの各々 を標準クロラミン−Ｔ法を用いて１２″Ｉ標識した。Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ等、Ｂ ｉｏ、Ｃｈｅｍ、Ｊ、　、８９：１１４−１２３　（１９６３）。

ヒルジン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍ ｆｌｌ）を１ｍｌにつき０．０６単位（Ｕ／＋＋１）の処方濃度で含む５ｍｌの ＡＣ，Ｄ　（０，０６５Ｍクエン酸、０．０８５Ｍクエン酸ナトリウム、２％デ キストロース）に６ミリリツトル（ｎ＋１）のヒト全血を集め、１２ＱＸｇで１ ５分間遠心した。得られた血小板を多く含む血漿を示す上清を回収し、単離し、 更に＋２００Ｘｇで遠心して単離した血小板のベレットを形成した。

単離した血小板をｌ　ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び１　ｍｇ ／ｍｌのデキストロースを含む２ｍｌのカルシウムを含まないタイロードバッフ ァー（０，１３Ｍ　ＮａＣ１，０，００２６Ｍ　ＫＣＩ、０．００２　Ｍ　Ｍｇ Ｃ１２−６１１２０，５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　、０．０１２　Ｍ　ＮａＨＣＯ＋、 ｐＨ７C２） に呼局した。次いで、同一のタイロードバッファーで平衡化したセファロースＣ ＬＺＢカラム（全床容量４０ｍｌ；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、、Ｐｉｓｃ ａｔａｗａｙ、　ＮＪ）に血小板懸濁液を加えた。洗浄血小板をＣＬ２Ｂカラム の空隙から最終容量的４〜５＋ｎ＋で回収した。

次いで、アデノシンジホスフェート（ＡＤＰ）と１０マイクロモル（μＭ）の濃 度まであるいはトロンビンと０．１単位／ｍｌの濃度まで混合（７て洗浄血小板 の試料を賦活化した。ＡＤＰ−賦活化血小板の数試料をフィブリノーゲンとフィ ブリノーゲン濃度ｌ−まで混合した。

非賦活化対照数試料を含む血小板の各試料に１２５Ｉ−標識ＭＡｂをｌθナノモ ル（ｎＭ）の濃度まで混合した。こうして生成した免疫反応混合液を２２℃で３ ０分間維持して免疫反応生成物を形成した。０．３ｍｌの２０％スクロースによ り遠心分離して、免疫反応生成物を非結合”’ｌ−ＭＡｂから分離した。血小板 ペレットに結合した１２”＋−ＭＡｂの量をシンチレーション分光測定によりめ た。

下記表２に示される本実験の結果は、抗ＲＩＢＳモノクローナル抗体が非賦活化 血小板と実質的に免疫反応しないことを示す。しかしながら、血小板をＡＤＰ又 はトロンビンのようなアゴニストで賦活化すると、細胞上にＭＡｂとフィブリノ ーゲン・ＧＰＩＩｂ−１１１ａ複合体との著しい免疫反応が得られる。血小板の ＡＤＰ又はトロンビンによる賦活は、血小板内在性フィブリノーゲンの分泌及び ＧＰＩｌｂ−１１１ａによる表面結合を生しる。外在性フィブリノーゲンの添加 は、”ＳＩ−ＭＡｂの賦活化血小板への結合を中和（阻害）しないので、ＭＡｂ がＲＩＢＳ特異性であることを示す、即ち、これらは溶液中で遊離フィブリノー ゲンと免疫反応しない。同様の結果がＭＡｂ　４Ｇ１０て得られた。

表２ １２’＋−＊ｂ結合（ｃｐｍ／血小板）血小板　２Ｇ５　２Ｆ１０　３ＧＩＩ 非賦活化　１，２００　２．８００　１．３００ＡＤＰ−賦活化　３３．７５０ 　４３．６００　３１．５５０ＡＤＰ−賦活化＋フィブリノーゲン　３５，６０ ０　５１．３００　３０．１５０トロンビン賦活化　２８．６２０　３２，００ ０　２８，４００外在的に添加されたフィブリノーゲンが細胞結合でなく（即ち 、細胞レセプター−リガンド複合体の一部ではない）　、ＭＡｂ　２Ｇ５．２Ｆ １０．３Ｇ１１及び４ＧＩＯとフィブリノーゲン：　ＧＰＩ　Ｉｂ−１１１ａ複 合体との免疫反応性を中和しない点を強調するために、２〜３ｍｇ／ｍｌのフィ ブリノーゲンを含有する血小板を多く含む血漿を用いてＭＡｂと血小板との免疫 反応性を試験した。

下記表３に示されるように、極めて過剰の遊離フィブリノーゲンにもかかわらず 、４種の”’ｌ）Ｍｂは、血小板懸濁液てフィブリノーゲン：　ＧＰＩＩｂ−１ １１ａ　ＲＩＢＳと免疫反応した。

表３ １２　Ｓ　Ｉ−ＭＡｂ結合（ｃｐｍ／血小板）血小板　２Ｇ５　２ＦＩＯ３Ｇ１ １　４Ｇ１０非賦活化　＋７４　６６２　２１８　６７８ＡＤＰ−賦活化　＋７ ．８２３　７．４７＋　２０．３８２　１９．５４０４種の寄託ＭＡｂのＲＩＢ Ｓに対する特異性を示したように、ＧＰＩＩｂ−１１１ａ血小板糖タンパク質レ セプターを有する血小板よりむしろＭａｃ−１を含む細胞を用いて、類似のＭＡ ｂ結合実験を行った。Ｍａｃ川及びＧＰＩＩｂ−１１１ａ共にレセプター−リガ ンド型のフィブリノーゲンに特異的に結合するが、この２つの相互作用は異なっ た生物学的結宋を生しる。この結合実験においては、４種の寄託ＲＩＢＳはフィ ブリノーゲン−Ｍａ　ｃ−１複合体との免疫反応を示さないが、フィブリノーゲ ンＧＰＩ　１ｂ−１１１ａ攬合体中のフィブリノーゲンとは免疫反応する。従っ て、試験した４種のＭＡｂは、ＧＰＩＩｂ−１１１ａを含む複合体で発現された フィブリノーゲン上のＲＩＢＳと特異的に免疫反応するが、Ｍａｃ−１と複合体 を形成した場合フィブリノーゲン上のＲＩＢＳとは免疫反応しない。

実施例３ ＲＴＢＳ抗体による血小板凝集阻止 実施例２て調製した２００μｍの単離血小板をＢＳＡとデキストロース（各１ｍ ｇ／ｍｌ　）、フィブリノーゲン（１ｍＭ）　、カルシウム（５ｍＭ）及び実施 例２て調製した下記表４に示される種々の量で存在するＭＡｂ　２Ｆ１０のＦａ ｂ断片を含む１９０７ｚｌのタイロードバッファーと混合した。次いで、１Ｊｚ ｌのＡＤＰ　（タイロードバッファー中８０μＭ）を混合して血小板凝集を促進 した。この混合液を３７℃で維持するとともに混合液の光透過の経時変化をＤｕ ａｌ　Ｓａｍｐｌｅ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　Ｍｅｔｅｒ（ＭｏｄｅＩ　ＤＰ −２４７Ｅ、　５ｉｅｎｃｏ　Ｉｎｃ、　、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｃｏ）を用い てモニターした。

２００μｍのＰＲＰ及び２００μｍのタイロードバッファーを含む溶液を用いて 凝集メーターを検定して光透過の低いベースラインを対照凝集の場合５％に、抗 体存在下の凝集の場合１０％に設定した。１００＋ｎｌのＰＲＰ及び３００μＩ のタイロードバッファーの混合液を用いて１００％光透過の上限を一様に設定し た。

抗体による血小板凝集阻止を測定した際に得られた結果を表４に示し、ＡＤＰを 混合した約３〜４分後に測定した際に抗体を存在させずに得られた光透過（１０ ０％）の％として表す。

表４ ＭＡｂ　２ＦＩＯによる血小板凝集阻止Ｆａｂｆａ度　透過％ ０　μＭ　＋００ ０．２５　μＭ　７９ ０．５　μＭ　６２．５ ■、２５　μＭ　３４．５ １．８７　μＭ　１７．５ 表４の結果は、ＭＡｂ　２Ｆ１０断片が用量依存性の血小板凝集を生じることを 示している。即ち、結果は、フィブリノーゲンＧＰＩＩｂ−１１１ａ複合体に特 異的なＲＩＢＳと免疫反応する本発明の抗体を用いた場合、血小板凝集を阻止す るのに有用な有効用量及び血栓形成のような血小板凝集に関与する過程を示して いる。

実施例４ ２Ｇ５　ＭＡｂの特性 ２Ｇ５と称するモノクローナル抗体は、に軽鎖を含むサブクラスのＩｇＧである 。

精製抗体の産生、精製及び特徴は、別に記載されている［Ｚａｍｒｒｏｎ等、Ｔ ｈｒｏｍｂ　）ｌａｅｍｏｓｔ、６４：４１　（１９９０）］、精精製体を標準 法［Ｇｕｅｓｄｏｎ等、Ｊ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｓ＋　ＣｙｔｏｃｈｅＩＩ、２７ ：１１３１　（１９７９）］に従ってビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　ＳＬａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）で　、クロラ ミンＴ変法［ＭｃＣｏｎａｈｅｙ等、ＩｎｔＡｒｃｈ　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｌ 　１ｍｎｕｎｏ１．２９：１８１（１９７９）］により１２５１で比活性的１μ Ｃｉ／μｇに標識した。抗体のＦａｂ断片を酵素の基質に対する比率１　：　１ ．００　（２／２）のパパイン消化（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｆｆＬＣｏ、　、Ｓｔ ルｏｕｉｓ、　ＭＯ）により３７℃で６時間調製した［Ｐｏｒｔｅｒ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ　Ｊ　、７３：１１９（１９５９）］　ｏ非消化抗体及びＦｃ断片をプ ロティンＡセファ０−ス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　ＡＢ、　１Ｊｐｐｓａｌａ　 、　Ｓｗｅｄｅｎ）のり０７トグラフイーで除いた。抗体の完全な消化Ｆａｂ標 品の精製を５ＤＳ−ＰＡＧ［！で確認した。本実験で用いるフィブリノーゲンに 対する他のモノクローナル抗体をフィブリンＤ二量体で免疫したマウスから誘導 し、２Ｇ５と同一プロトコールにより腹水から精製した。

フィブリノーゲンを新鮮なヒト血液からエタノール示差沈殿で精製し［Ｄｏｏｌ ｉｔｔｉｅ等、Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１１８：４５６ 　（１９６７）］　、前述のように１ｆｆｉｉｌで放射能標識した［ＭｃＣｏｎ ａｈｅｙ等、Ｉｎｔ　Ａｒｃｈ　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｌ　１ｒＮｎｕｎｏ１． ２９：１８１（１９６６月。フィブリノーゲンのプラスミン消化を記載されてい るプロトコールに従って行った［Ｖｅｒａｄｉ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 　２５：５１９（＋９８６）］　ｏ　５＋ｎＭ　Ｃａ２＋を含むＯ，ｌ　５Ｍ　 ＮａＣｌ。

０、０５Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４中フイブリノーゲン（２ｍｇ／ｍｌ）をま ず、プラスミノーゲン（２０μｇ／ｍｌ、最終濃度）及びストレプトキナーゼ（ ＳｉｇｍａＸ　２００単位／ｍｌ、最終濃度）を加えて生成したプラスミンで３ ７℃において１時間消化した。この消化物中の優性物質Ｄ１００　（、分子量約 １００．０００の断片）を２Ｇ５カラムのアフィニティークロマトグラフィーで 単離した（下記参照）。５＋ｎＭＣａ２＋の代わりに５ｍＥＧＴＡｔ［エチレン −ビス（オキシエチレンニトリロ）］四酢酸１を含むトリスバッファーに試料を 透析し、プラスミノーゲン／ストレプトキナーゼ混合液と３７℃で４時間インキ ュベートして追加の消化を行った。選択実験として、単離Ｄ１００を更にＣａ” ＋を存在させずにプラスミンで３７℃で２４時間消化し、８時間後プラスミンの 第２添加により補足した。トラシノール（ＦＢＡ　Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌ 　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹＸ　２００力リクレイン阻害単位／ｍｌ）を加 えてタンパク質分解を終結させた。

実施例５ 血小板結合性実験 ０、１％ウシ血清アルブミンを含有する２価のイオンを含まないタイロードバッ ファー、ｐＨ７，３中で示差遠心分離し、次いで、セファロース２Ｂによりゲル ろ過して、血小板を新鮮なヒト血液から単離した［　Ｍａｒｇｕｅｒｉｅ等、Ｊ 　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　。

２５５：１５４（１９８０）　］。抗体の血小板に対する結合を次のように行っ た。血小板を２価のイオンを含まないタイロードバッファーにｌ　ｘ　ｌ　Ｏ＠ ／ｍｌで懸濁した。ＣａＣ１７、最終濃度ｌ−及び賦活物質、１０μＭＡＤＰ又 は０．５単位／ｍｌα−トロンビンを血小板に加えた。賦活物質としてトロンビ ンを用いた場合、トロンビンを加えて５分後に３０ｎＭＤ−フェニルアラニル− し−プロリル−アルギニンケトン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ＋ａ）を加えて酵素を不 活化した。次いで、１１６１−標識抗体を最終濃度０．１μ藺で加え、ＩμＭフ ィブリノーゲンなし又はありで結合性を測定した。平行して、細胞に結合する１ ２１１−フィブリノーゲンを０．３μＭのリガンドで［Ｍａｒｇｕｅｒｉｅ等、 Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　、　２５５：１５４　（１９８０）］に記載されてい るように測定した。反応混合液の５０μｍ分量を２０％スクロースにより遠心分 離して、血小板結合リガンドを遊離リガンドから分離し、結合されたりガント分 子を比活性に対して計算した。

実施例６ 血小板結合性の検討 ヒトフィブリノーゲン（０，３μＭ）及びＣａＣＩｚ（１ｍ）の存在下で血小板 を３７℃で攪拌した。次いで、異なった濃度（θ〜２μＭ）の２Ｇ５、そのＦａ ｂ断片又は匹敵するサブクラスの対照抗体を加え、１０μＭ　ＡＤＰを加えて凝 集を開始させた。二試料アグレゴメータ（Ｓｉｅｎｃｏ　、　Ｉｎｃ、、Ｍｏｒ ｒｉｓｏｎＳＣＯ）を用いて、血小板懸濁液による光透過の変化として凝集をモ ニターした。

実施例７ 酵素結合免疫吸着剤検定法（ＢＬＩＳＡ）ポリビニルマイクロタイターウェルを ２μｇ／ｍ　ｌの濃度の１００μＩタンパク質て４℃において一晩被覆した。１ ％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ　（０，２５ＭＮａＣｌ　、Ｏ，Ｏ１Ｍリン 酸塩バッファー、ｐＨ７，３）でボストコートし、次いで、ＰＢＳ−０，０５％ トウィーン２０で洗浄し、非標識又はビオチル化抗体と２時間インキュベートし た。次いで、プレートをＰＢＳ−１−ウィーン２ｏで広範囲にわたって洗浄し、 アルカリ性ホスファターゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に結合した第２抗体又はア ビジンと１時間インキュベートした。洗浄後、基質ｐ−ニトロフェニルホスフェ ートを用い、４０５ｎｍの吸光度を測定して、結合を定量した。競合実験を行う 場合には、競合物質を抗体と２２℃で１５分間インキュベートした後、マイクロ タイタープレートのウェルに加えた。

実施例８ ペプチド合成及びタンパク質のアミノ酸配列決定フィブリノーゲンγ鎖のセグメ ントに対する配列に対応するペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓから購入したフェニルアセトアミドメチル樹脂と【−ブトキシカルボニルアミ ノ酸を用いてＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３０型ペプチドシンセ サイザー（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）による固相合成により調製した。

ＣＩ８μＢｏｎｄａｐａｋカラムを用いたＨ　Ｐ　Ｌ　ＣてＯ，１％トリフルオ ロ酢酢酸中上セトニトリル直線勾配により、ペプチドの均質性を分析し、〉８５ ％均質であることが判明した。６Ｎ　ＨＣｌ中で２４時間の加水分解物によるペ プチドのアミノ酸組成をめ、結果は理論収量と一致した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーブルー染色によって確認された選択バンドに対し て、タンパク質のアミノ酸配列をめた。問題のバンドをゲルがら切り取り、　［ Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　、　２６２：１００３５（ １９８７）　］に記載されているように直接気相シークエネーター（Ａｐｐｌｉ ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７５Ａ型）のＮＨ，−末端アミノ酸配列分析に かけた。ヒト、ウシ及びラットフィブリノーゲンの個々の連鎖のアミノ酸配列の 線列をＲｉｘｏｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２：３２３７（１９８３） ；Ｃｈｕｎｇ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２：３２４４i１ ９８３）　；Ｃｈｕｎｇ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２：３２５０（１９ ８３）；　Ｃｒａｂｔｒｅｅ等、Ｃｅ１ｌ　３１：１５９（P９８２） 及びシーンバンクデータベースより入手した。

実施例９ 分析操作 製造業者の指示書に従って、精製抗体をＣＮＢｒ活性化セファロース４　Ｂ（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）に結合することにより、２Ｇ５のアフィニティークロマトグ ラフィーを行った。

置換度は、沈降ゲル１ｍｌに対して結合される抗体１ｍｇとした。２２℃におい てＰＢＳ−０，０４％アジドで平衡化した１、　Ｉ　Ｘ４．５　ｃｍのカラムで アフィニティークロマトグラフィーを行った。試料をカラムに加え、結合物質を ＩＭの水酸化アンモニウム（ｐＨ１１，５）で溶離した。５Ｏ３−ＰＡＧＥをレ ムリ［Ｌａｅｍｌ　ｉ、Ｎａｔｕｒｅ、　２２７：２８０（１９７０）　］のバ ッファー系で垂直スラブゲルにより行った。ウニタンプロット分析の場合、タン パク質試料を５Ｏ３−ＰＡＧＥで分解し、イモピロンＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐ ｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に電気泳動的に移した。移動物をビオチニル 化形態の抗体（５μｇ／ｍｌ）でプローブし、アビジン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ）及び酵素基質ブロモクロロインドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾ リウム（Ｓｉｇｍａ）に結合したアルカリ性ホスファターゼで可視化した。タン パク質溶液の１滴を直接イモピロン膜に加えてドツトプロット分析を行った。吸 着タンパク質との抗体反応性を［Ｚａｍａｒｒｏｎ等、Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｍ ｏｓｔ、６４：４１（１９９０）　］に記載されているように可視化シタ。

実施例ＩＯ 実施例１〜９の検討 ２Ｇ５によって認識された血小板結合フィブリノーゲンにょるＲＩＢＳの発現以 前の研究においては［Ｚａｍａｒｒｏｎ等、Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｍｏｓｔ、６ ４：４１　（１９９０）］　、プラスチックマイクロタイタープレート又はろ紙 に固定化したフィブリノーゲンと反応する２Ｇ５モノクローナル抗体が証明され たが、２Ｇ５は可溶性フィブリノーゲンと反応しなかった。本実験で提起された 最初の問題は、血小板の表面上のＧＰＩＩｂ−１１１ａ、そのレセプターに対す るフィブリノーゲンの結合が認識されたエピトープも露出したかどうか；即ち、 レセプターの占有がフィブリノーゲンリガンド内のコンホーメーンヨン変化を誘 発してＲＩＢＳエピトープを誘発するかどうかであった。

図１は、ＧＰＩＩｂ−１１１ａのフィブリノーゲンとの変化しつる占有を生じる 条件下で放射能標識抗体の洗浄ヒト血小板に対する結合を示している。フィブリ ノーゲンは非賦活化血小板への結合が最少であり、抗体もまた、外在的に添加さ れたフィブリノーゲンのあり又はなしで細胞に結合することができない。血小板 のＡＤＰ賦活は、ＧＰＩＩｂ−１１１ａを潜在状態からフィブリノーゲンを結合 するのに適格な状態に転換する。フィブリノーゲンなしでのフィブリノーゲンの 賦活は、抗体結合のわずかな増加しか誘発しなかった。

しかしながら、フィブリノーゲンが存在する場合、ＡＤＰ賦活細胞に対して多く の抗体結合が観察された。フィブリノーゲンの存在下でＡＤＰに結合する抗体の 増加分は、約１７倍であった。これらの同一実験条件下で３人の異なるドナーの 血小板を用いたこの増加分は、１７．２±２．４倍であった。添加フィブリノー ゲンの０．１％しか混合液中で血小板結合されないと考えると、抗体の細胞結合 フィブリノーゲンの結合は非常に選択的である。血小板結合フィブリノーゲンの 識別も、細胞が異種のアゴニスト（トロンビン）で賦活される場合に生した。ト ロンビン賦活血小板はまた、外在的に添加されたフィブリノーゲンの存在下で抗 体を結合した。抗体のトロンビン賦活血小板に対する適度な結合は、添加フィブ リノーゲンなしてさえも観察され、分泌される内在フィブリノーゲンへの抗体の 結合を表すことができ、細胞表面上のＧＰＩＩｂ−１１１ａに結合されるように なる［Ｃｏｕｒｔｏｉｓ等、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　１５９：６１（ ＋９８６）］　ｏ纏めて考えると、これらの観察は、血小板上のＧＰＩＩｂ−Ｉ ｌｌａへのフィブリノーゲンの結合が２Ｇ５によって認識されたエピトープを露 出することを示している。

血小板凝集に関する２Ｇ５の作用 フィブリーゲンのその血小板レセプターに対する結合は、血小板凝集に必要な段 階である。初期の研究においては、この細胞−細胞相互作用について無傷２Ｇ５ の作用は、添加フィブリノーゲンの存在下ＡＤＰで賦活した洗浄血小板を用いて 分析された。下記表５に示されるように、最終濃度１μ輌において、２Ｇ５は血 小板凝集を完全に消滅させた。フィブリーゲンに対して他の３種の抗体を対照と して試験した。これらの抗体の２種、抗−Ｆｇ−８８及び抗−Ｆｇ−８５は、血 小板凝集に影響しなかった。３番目の対照抗体、抗−Ｆｇ−１２８も血小板凝集 を消滅させた。

抗−Ｆｇ−１２８の阻止活性の基準は、血小板に結合するフィブリノーゲンの阻 害によるものとすることができ、即ち、０．６μＭ濃度の抗−Ｆｇ−１２８は… １−フィブリノーゲン結合を阻止した。

表５ 血小板凝集及び血小板に結合するフィブリノーゲンに関するフィブリノーゲン抗 体の作用 血小板に結合するフィ 抗体　濃度（μＭ）　血小板凝集の阻止％　ブリノーゲンの阻止Ｘ２Ｇ５　１　 １００　０ 抗−Ｐｇ−１２８０，６ｔｏｏ　８１ 抗−Ｆｇ−８８１０ＮＤ 抗−Ｆｇ−８５１０ＮＤ 血小板凝集について２Ｇ５の作用を更に調べた。抗体のＦａｂ断片は、血小板凝 集の阻止力を保持した。Ｆａｂ断片の阻止活性は用量依存性であり、この機能応 答の完全な阻止は、２μＭ濃度の断片で得られた。Ｆａｂ断片は、それ以後の凝 集応答を阻害するにもかかわらず、血小板の形状変化が生じることによって示さ れるように血小板賦活を妨害しない。

２Ｇ５エピトープの局在化 ２Ｇ５エピトープは、以前には、フィブリノーゲンγ鎖及びフィブリノーゲンの 高分子１！（Ｍ、・＋００．０００）プラスミン分解産物、０１００によって発 現されることが知られていた［Ｚａｍａｒｒｏｎ等、Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｍｏ ｓｔ、６４：４１　（１９９０）］。即ち、エピトープは、フィブリノーゲンの Ｄドメインのγ鎖セグメント中に残る。Ｄｌｏｏは、２つの形態、ＤＩＡ及び１ 月で存在することが知られており、γ鎖セグメントのアミノ末端基でのみ異なっ ている。これらのＤ１００断片は、共にγ鎖のカルボキシ末端（残基４１１）を 含むが、ＤＩＡはγ６５て開始し、ＤＩはγ８５で開始する［Ｖｅｒａｄｉ等、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｆｒｙ、　２５：５１９（１９８６）］。

初期段階として、認識されたエピトープが７６５〜８５セグメントに関係するか をめることを必要とした。フィブリノーゲンをＣａ２゛のあり（消化物Ｉ）又は なしく消化物２）のプラスミンで消化した。これらの消化物を固定化２Ｇ５のア ノフィニティークロマトグラフィーにかけると非結合（消化物ｌ及び２から各々 Ｆ１及びＦ２）と塩基性ｐＨて溶離する結合画分（Ｂｌ及びＢ２）を得た。これ らの両分を５ＤＳ−ＰＡＧＥ、次いて電気泳動移動後、クーマシーブルー染色又 はウェスタンイムノブロッティングで分析した。Ｄ断片の最も高い分子量のもの だけがアフィニティーカラム及びイムノブロッティングにより２Ｇ５と反応した 。Ｍ。

・８５−９１．０００の低分子量り断片は消化物２の中に検出されたが、これら は抗体と反応せず、エピトープのＤｌｏｏに対する制限が証明された。還元条件 下で５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけると、Ｂ１及びＢ２は類似パターン：　Ｍ、　＝　 ４０．０００の二重バンド（β及びγ鎖残鎖）及びＭ、　＝　１４，０００の単 一バンド（α鎖残鎖）を示し、［Ｖａｒａｄｉ″４Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 ２５：５１９（１９８６）；　５ｏｕｔｈａｎ等Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６ ０：１３０９５（＋９８５）コに記■■ れている報告と一致した。

Ｍｌ・４０．０００バンドをゲルから切り出し、ＮＨ，−末端アミノ酸配列分析 にかけた。得られた配列は、Ｂｌ及びＢ２両分のＭ、＝４０．０００バンドに対 して各々ＡＩＱＬ■及びＳＲＫＭＩ、であった。両開列共にフィブリノーゲンγ 鎖の中に見られ、最初の配列はγ鎖残基６５〜７０に対応し、二番目は残基８５ 〜８９に対応する。フィブリノーゲンβ鎖の残基１３４〜１３Ｂに対応する配列 ＤＮＥＮＶも存在した。これらの結果は、２Ｇ５によって認識されたエピトープ が７６５〜８５の中にないことを示している。更に、低分子量り断片が抗体と反 応しないことは、γ鎖のカルボキシ末端がエピトープ発現に対してそのままの形 でなければならないことを示している［Ｖａｒａｄｉ等　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　２５：５１９（１９８６）　］。

次の実験においては、アフィニティーカラムからの結合画分を更にプラスミンで 消化してＤ１００全てが低分子量形に分解することを確実にした。次いで、この 消化物をアフィニティーカラムに再び加え、結合物質を塩基性ｐＨで溶離した。

２８０ｒ＋＋ｎでモニターしたクロマトグラムを図２八に示す。カラムに加えた 物質の大部分を結合画分として回収した。しかし、５Ｏ３−ＰＡＧＥ　（７，５ 〜２０％勾配アクリルアミドゲル）で分析すると、クーマシーブルー染色バンド は検出されなかった。

次いで、結合物質をプールし、リン酸で中和し、逆相Ｖｙｄａｃ　Ｃ１８カラム のＨＰＬＣて分別した。２８０ｒ＋＋ｎでモニターしたＨＰＬＣプロファイルを 図２Ｂに示す。

保持時間約４分で１本の主要ピークのみが検出された。

異なる溶離時間からの両分を集め、凍結乾燥し、ＰＢＳに再溶解し、次いでＥＬ ＩＳＡ法で２０５の固定化フィブリノーゲンに対する結合の阻害能を試験した。

阻止活性を有する両分（Ｎｏ、Ｉ）のみが４分のＨＰＬＣカラムから溶離するも のに対応し、２８０ｎｍ吸光度ピークを含んだ。対照として、アフィニティーカ ラムからの溶離バッファーをリン酸で中和し、ＨＰＬＣカラムに加えた。Ｎｏ、 １に等価な両分を集め、ＥＬＩＳＡ法で試験すると、阻止活性は検出されなかっ た。このアッセイにおいては、Ｄｌｏｏの血漿消化物は活性を保持し、更に血漿 消化でのエピトープＲＩＢＳ−１の安定性が証明された。

次いで、選択されたＨＰＬＣ画分をＮＨ２−末端アミノ酸配列分析にかけた。収 量は低かった（ｌ〜２ピコモル範囲）が、これはプロセシングである遮断が生じ たことを示しており、次の配列：　ＧＧＴＹが得られた。これらの４種の残基は 、フィブリノーゲンγ鎖の３５１〜３５４に対応する。これらの結果は、２Ｇ５ が残基３５１からγ鎖のカルボキシ末端に向かって伸びているセグメントの中に あることを示している。

２Ｇ５エピトープの合成 ２Ｇ５エピトープのフィブリノーゲンγ鎖のカルボキシ末端領域に対する局在化 を証明するために、更にその構造を定義するために、γ鎖の残基３４０〜４１１ に対応する一組の重なりペプチドを合成した。これらのペプチドに対する抗体の 直接結合をまず評価した。マイクロタイタープレートをペプチド（ＰＢＳ中ＩＯ μｇ／ｍｌ）でコートし、アルカリ性ホスファターゼ結合の第２抗体を用いて、 ２Ｇ５（５０μｇ／ｍｌ）の結合をめた。表６に示されるように、抗体は２つの ペプチド、Ｐ３及びＰ４と強く反応した。これらのペプチドは、重なっており、 γ鎖の残基３６５〜３８３（Ｐ３）と残基３７３〜３８５（Ｐ４）に対応する。

ＧＰＩｌｂ−１１１ａに対する対照のモノクローナル抗体は、これらの２種又は 他の任意のペプチドと反応しなかった。反応が可溶性Ｄ１００又はその血漿消化 物で阻害されたので、Ｐ３及びＰ４に結合する２Ｇ５の特異性が証明され、Ｐ４ の場合、Ｄｌｏｏ又はその血漿消化物のＩＣ５０値は、各々１５０μｇ／＋ｎｌ 及び３０μｇ／ｍｌであった。

表６ ２Ｇ５　ＭＡｂと合成ペプチドとの反応性１ペプチド　アミノ酸配列　残基　４ ０５　ｒｕｎにおける吸光度ＰＩ　ＨＡＧＨＬＮＧＹＹＹＱＧＧＴＹＳＫＡ　Ｆ ｇ　、　、　、　、、　、　、　０．０８６Ｐ２　ＧＧＴＹＳＫＡＳＴＰＮＧＹ ＤＮＧＩ　ＩＷＡ　Ｆｇ　２　ｓ　＋　−ｔ　ｏ　０．０９７Ｐ３　ＮＧＩ　Ｉ ＷＡＴＷＫＴＲＷＹｓＭＫＫＴｒ　Ｆｇ　、１ｓ−ａｓ　０．５２０Ｐ４　ＫＴ ＲＷＹＳＭＫＫＴＴｈ！Ｋ　Ｐｇ　、　、　、　、　、、　０．６２４Ｐ５　Ｙ ＳＩ＋ｌＫＫＴＴＭＫＩＩＰＦＮＲＬＴＩＧ　Ｆｇ　５７７−ｏＩＯ，０９９Ｐ ａ　ＭＫＩ　ＩＰＦＮＲＬＴＩＧＥＧＱＱＩＩＬ　Ｆｇ　、、、−、、、０，０ ４５Ｐ７　ＱＱＨＩＩＬＧＧＤＫＱＡＧＤＶ　Ｆｇ　１ｔｓ−ｔ　、　、　０． ０７１８２Ｇ５抗体とマイクロタイターで固定化したペプチドの反応性をＥＬＩ ＳＡ法で評価した。結果を４０５ｒｕｅにおける吸光度として表す。

もう１組の実験においては、マイクロタイタープレートをアフィニティー精製Ｄ １００で被覆し、２Ｇ５の本断片に対する結合の合成ペプチドの阻害能を評価し た。

Ｐ４は固定化した０１００に結合する抗体を阻害したが、Ｐ２は効果がなかった 。

（Ｐ３は異常なふるまいをし、恐ら＜Ｐ３ペプチドの固定化断片に対する結合の ため、阻害よりむしろ増加するか又は反応に影響しなかった。）Ｐ４の阻止活性 は、可溶性Ｄ１００又はその血漿消化物で観察されたものと極めて似ていた。

Ｐ４ペプチドもまた、アフィニティークロマトグラフィーにより２Ｇ５と反応す ることがわかった。Ｐ４　（ＰＢＳ１ｍｌ中１　ｍｇ）を抗体カラムに加え、カ ラムを広範囲に洗浄した後、結合ペプチドを塩基性ｐＨで溶離し、その回収物を 定量した。２８０　ｔｕｎｉこおける吸光度により、４４μモルのペプチドがカ ラムに結合されたことが推定された。カラム中の２６μモルの抗体全てが完全に 機能したとすると、ペプチドの回収は、抗体１モル当たり結合したペプチド２モ ルの理論限度に近かった。同一条件下でＰ２ペプチドをカラムに加えた場合には 、検出しうる物質はカラムから溶離されなかった。更に、Ｐ４をアルブミン−セ ファロースカラムに加えた場合にも、ペプチドはカラムに結合されなかった。

２Ｇ５エピトープを確定する際の特定のアミノ酸及びタンパク質コンホーメーシ ョンの役割 ２Ｇ５とウシ及びラットフィブリノーゲンとの反応性の分析は、ＲＩＢＳ−１に 対する詳細な構造上の要求に洞察を与えた。ドツトプロット分析により、ラット とウシフィブリノーゲンをｌ　ｍｇｌｏｌでろ紙に加えると、抗体と反応しなか ったが、同一分析において１０ｍｇ／ｎｌでヒトフィブリノーゲンとの反応が示 された。

表７に示されるように、ラット及びウシフィブリノーゲンγ鎖中に対応する配列 を有するγ鎖のＰ４配列、Ｌｙｓ３７３−　Ｌｙｓ３８５の線列は、１個のアミ ノ酸のみの相違を示した。即ち、ヒトフィブリノーゲンのりシン３８１はラット フィブリノーゲンではグルタミンに置き換えられ、ヒトフィブリノーゲンのトレ オニン３７４はウシフィブリノーゲンではセリンに置き換えられる。

ラット及びウシγ鎖配列に対応するペプチドを合成し、マイクロタイタープレー トに固定化し、抗体との反応性をＥＬＩＳＡ法で評価した。ラット及びウシペプ チドのいずれも抗体と反応しないが、同一アッセイにおいてヒトペプチドとの反 応が観察された（表７）。無関係の対照抗体は、同一アッセイにおいてヒトペプ チド及び他の２種のペプチドとも検出しうるシグナルを得ることができなかった 。

表７ ２Ｇ５　ＭＡｂとヒト、ラット及びウジフィブリノーゲンγ鎖の相同ペプチドと の反応性 種　合成ペプチドのアミノ酸配列　４０５　ｎ＋ｎにおける吸光度１ヒト　ＫＴ ＲＷＹＳＭ’ＫＫＴＴＭＫ　Ｏ，６６０ラツト　ＫＴＲＷＹＳＭＫＱＴＴ’ＭＫ 　０．０７０’ｙ　’ｙ　ＫＳＲＷＹＳＭＫＫＴＴＭＫ　０．０４６ヒトフイブ リノーゲンの２０５の発現に関して、還元、アルキル化及び／又は変性の影響も 分析した。ウェスタンイムノブロッティングで評価されたように、分子を６Ｍグ アニン１４Ｃ１で変性するか、ジチオトレイトールで還元するか又はヨード酢酸 でアルキル化した場合、エピトープは維持された。対照的に、変性剤のあり又は なしてフィブリノーゲンが還元及びアルキル化された場合、エピトープはもはや 検出されなかった。対照実験においては、フィブリノーゲンのエピトープを阻害 する同一の条件下で合成Ｐ４ペプチドを還元及びアルキル化した。マイクロタイ ターに固定化すると、処理及び未処理のＰ４と２Ｇ５との反応性は同一であった 。即ち、還元及びアルキル化フィブリノーゲンのＲＩＢＳ−１のロスは、Ｌｙｓ ３７３−Ｌｙｓ３８５の直線配列の外側で起こる変化によると思われる。

即 ＧＰＩ　１ｂ−１ｆ　ｌａは、複数のコンホーメーション状態で存在することが できる［ＰＩｏｗ等、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ 　Ｔｈｒｏ＋ｏｂｏｓｉｓ　５ｖｏ１．９（Ｃｏｆｆｅｒ、Ｂ、　Ｓ、、ｅｄj 、ｐｐ 、１１７−１５６（１９８９）］、ある種のコンホーメーショントランジション は、ＧＰＩｌｂ−１１１ａを潜在状態から、リガンドと結合することがコンピテ ントであるものへ転換する血小板アゴニストで誘発される。また、他のコンホー メーショントランジションは、占有レセプターの生物物理学的及び分光学的特性 の変化［Ｐａｒｉｓｅ等、Ｊ　ＢｉｏｌＣｈｅｎ＋　、２６２：１２５９７（１ ９８７）　］及びＬＩＢＳ！ピトーブの露出［Ｆｒｅｌｉｎｇｅｒ等、ＪＲｉｏ ｔ　Ｃｈｅｗ　、２６３：１２３９７（１９８Ｂ）；Ｆｒｅｌｉｎｇｅｒ等、Ｊ 　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　、２６５：６３４６（１９９O）］ により証明されているレセプターに結合するリガンドによって誘発される。ＲＩ ＢＳエピトープの発現は、レセプターに結合する際にコンホーメーシコンが変化 することも示し、レセプター占有後の事象の動的種類の証明となる。そこでリガ ンド結合が全ＧｐＨｂ−１１１ａから複数のＬＩＢＳエピトープを誘発すること もわかったのと同様に［Ｆｒｅｌ　ｉｎｇｅｒ等、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　、 　２６５：６３４６（１９９０）］　、フィブリノーゲンがこのレセプターに結 合する際に数種の異なるＲＩＢＳエピトープが誘発されることを仮定することは 論理的なことである。２Ｇ５及び９　Ｆ　９　［Ａｂｒａｍｓ等、Ｂｌｏｏｄ　 、　７５：１２８（１９９０）］は、ＲＩＢＳエピトープの異なる２つの例であ 。

ＲＩＢＳ仮説の論理的な延長としては、これらのエピトープが：ｌ）フォンビル プラント因子又はフィブロネクチンのような他のリガンドがＧＰＩＩｂ−１１１ ａに結合する場合：２）フィブリノーゲンが他のインテグリン（例えば、α、β ｓ［ｃｈｅｒｅｓｈ等、Ｃｅ１ｌ、５８：９４５（１９８９）コ又はＭＡＣ−１ ［Ａｌｔｉｅｒｉ等、Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　、１０７＋１８９３（１９８８ ）］又は非インテグリンレセプター［Ｌｅｖｅｓｑｕｅ等、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈ ｅｌｌｌ、　２６５：３２８　（１９９０）］に結合する場合：及び３）リガン ドが他のインテグリン又は非インテグリンに結合する場合に誘発される可能性が 挙げられる。このような予想に対する最初の支持は、ＧＰｌｌｂ−１１１ａに結 合する複数のリガンド及びＧＰＩｌｂ−１１１ａ以外のインテグリンに結合する りガントによって、ＬＩＢＳエピトープが誘発される証明から得ることができる ［　Ｆｒｅｌ　ｉｎｇｅｒ等、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　、２６５：６３４６（ １９９０）：０’　Ｔｏｏｌｅ等、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｑｕｌ、　ｌ：８８３　（１ ９９０）］。

２Ｇ５によって認識されたＲＩＢＳは、局在化すべき最初のＲＩＢＳエピトープ である。γ鎖残基３６５〜３８３に対応するＰ３ペプチド及びγ鎖残基３７３〜 ３８５に対応するＰ４ペプチドの両方が２０５に結合した。即ち、エピトープの 少なくとも一部は、γ鎖の残基３７３〜３８３の中になければならない。残基３ ７７〜３９５に対応するＰ５ペプチドは抗体と反応しないので、２Ｇ５エピトー プを定義する際に、４種の残基（３７３）ＫＴＲＷ（３７６）は重要な要素であ る。

残基３７４に対応する位置のトレオニンをセリンに置き換える単一の保存的置換 は、抗体反応性を無効にするのに十分である。タンパク質分解断片化の分析は、 γ鎖の残基３５１とカルボキシ末端との間の領域にこのエピトープを制限したり 、無関係な局在化の確証を与える。抗体反応性に対してγ３７３〜３７６のＫＴ ＲＷ残基が重要であるにもかかわらず、２Ｇ５エピトープはかなりの複雑さを示 す。３８１の位置のアミノ酸置換もまたエピトープを阻害した。更に、フィブリ ノーゲンの二次及び三次構造は、エピトープに著しく寄与している。即ち、Ｐ４ ペプチドと還元剤及びアルキル化剤との反応が抗体とペプチドとの反応に影響し ないとしても、フィブリノーゲンの還元及びアルキル化は２Ｇ５エピトープを破 壊した。

これらの結果は、抗体と反応するコンホーメーション内の７３７３〜３８５の直 線配列をフィブリノーゲンの二次、三次及び四次構造の少なくとも１つが安定化 しなければならないか又は分子のコンホーメーションの折りたｔこみにより接近 するようになったフィブリノーゲンの第２領域もエピトープの一部であってもよ いことを示している。

二次構造の予想［Ｃｈｏｕ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３＋２２２（１９ ７４）］は、］α−ヘリツシスからβ−７−トまでのトランジションが残基Ｌｙ ｓ３７３て始まり、γ鎖がＧＩＹ３９５て再びヘリクッスコンホーメーションを とり始めることを示している。このような二次構造のトランジションは、たいて いタンパク質分子のエピトープを形成する［Ｔｏｄｄ等、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｒｉｏ ｃｈｅｍ　Ｓｃｉ、７：２１２　（＋９８２）］　。更に、ヒドロ、（シープロ ・ソトにおいては［１１０１１１１等、Ｎａ１ｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　 、７８：３８２４　（＋９８１）］　、この領域は特性上親水性であると予想さ れるので、抗原性に対する本基準に合っている［ＢｅｒｚｏＦｓｋｙ　、　５ｃ ｉｅｎｃｅ　、２２９：９３２　（１９８５）］　。アミノ酸の親水性範囲の芳 香族アミノ酸の存在は、ペプチド内の抗原性の追加決定基であり［Ａｐｐｅｌ等 、Ｊ　１ｍｕｎｏｌ　、１４４：９７６　（１９９０）］　、１３７３〜３８３ はトリプトファンとチロシンの両方を含んでいる。

従って、７３７３〜３８３はフィブリノーゲン分子内にエピトープを形成する確 立が高い。しかし、この領域は未変性分子の２０５抗体に近づくことができない 。

電子顕微鏡によるフィブリノーゲンモデルにおいては［Ｗｅｉｓｅｌ等、５ｃｉ ｅｎｃｅ　、　２３０：１３Ｂ８（１９８５）］　、γ鎖のこの領域は関係のな い球状ドメインの中にあり、この構成は抗体をエピトープに無理に近づけてもよ いと思われる。この説明は、ＲＩＢＳ抗体を産生ずる一般方法に関しである意味 を含んでいる。これは、限られたタンパク質分解の緩和な変性により誘発された ようなりガントの変容形態が抗−ＲＩＢＳを誘発するための免疫原型を与えても よいことを示している。２Ｇ５　ＲＩＢＳの場合には、フィブリノーゲンのタン パク質分解断片が抗体を誘発した。

フィブリノーゲンのγ鎖のカルボキシ末端領域は、フィブリノーゲンのγ２７５ 〜３３０領域の中の重合欠損による単一のアミノ酸置換の局在化によって証明さ れるようにフィブリン重合に重要な役割を果たしている［Ｔｅｒｕｋｉｎａ等、 Ｂｌｏｏｄ　。

７４：２６８１（１９８９）；　Ｒｅｂｅｒ等、Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅ＋＋＋ｏ ｓｔ、５６：４０１（１９８６）；Ｒｅｂｅｒ等、Ｂｌｏｏп@、６７ ：１７５１（１９８６）　；口ａｎｔｉａ等、Ｂｌｏｏｄ　、７５：１６５９（ １９９０）；Ｂａｎｔｉａ等、Ｂｌｏｏｄ　、　７６：２２V９　（１ ９９０）］、更に、Ｖａｒａｄ　ｉ及びＳｃｈｅｒａｇａによる研究［Ｖａｒａ ｄｉ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５：５１９（１９８６）］は、領域γ ３５６〜４０５がフィブリン重合に関与するが、タンパク質コンホーメーション がこの機能を仲介する際に重要な役割を果たしていることを示している［　Ｃｉ ｅｒｎｉｅｗｓｋｉ等、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　、　２６１：９１１６（１９ ８６）コ。

２Ｇ５抗体の血小板凝集及びフィブリン重合両方の阻害能［Ｚａｍｒｒｏｎ等、 Ｔｈｒ。

ｍｂ　Ｈａｅｍｏｓｔ、６４：４１　（１９９０）］は、フィブリノーゲン分子 の２つの機能の間に以前には認識されなかった結合を示している。血小板凝集の 最も簡単なモデルにおいては、単一のフィブリノーゲン分子は、その二量体構造 及びその複数のＧＰＩｌｂ−１＋１ａ相互作用部位によって、隣接の血小板上の レセプター間に直接架橋し、それにより凝集を誘発する。そのような直接架橋モ デルは、特定の血小板標品（ホルムアルデヒド固定化［Ｐｅｅｒｓｃｈｋｅ等、 Ｂｌｏｏｄ　、５７：６６３（１９８１）］又は不応性血小板［Ｐｅｅｒｓｃｈ ｋｅ　、　Ｊ　Ｌａｂ　Ｃ１１ｎ　Ｍｅｄ、　１０６：１１１　（１９８５）］ がフィブリノーゲンのＧＰＩｌｂ−１１１ａに対するそれらの正常な結合にもか かわらず凝集しない理由を説明することができない。直接架橋モデルとのこれら の不一致は、レセプター占有後の事象が血小板凝集に必要であることを示してい る。

本発明は、説明とその実施例によって詳細に記載されているが、ある種の変更が 前記特許請求の範囲の範囲内て行われることは明白であろう。

非賦活性　ＡＤＰ賦活化　トＤンビン 賦活化 図２ 容量（ｍ１１ 溶離時間（分） 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＣＯ７Ｋ　７／１０　８ ３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１５１０６ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　ＺＮＡ　８２１４−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｌ　８ ３１０−２Ｊ（７２）発明者　プラウ　ニドワード　エフアメリカ合衆国　カリ フォルニア州 ９２１２２　サン　ディエゴ　ラウス　ストリート４３５９ Ｉ （７２）発明者　ジンズバーグ　マーク　エフアメリカ合衆国　カリフォルニア 州 ９２１２２　サン　ディエゴ　レシールド　ブレイス　２９４４

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．式： 【配列があります】 を有するアミノ酸残基配列を含む約４０個までのアミノ酸残基を含むポリペプチ ド。
2. ２．式： 【配列があります】 に対応するアミノ酸残基配列及びそのモノ置換類縁体を含む約２０個までのアミ ノ酸残基を含むポリペプチド。
3. ３．式： 【配列があります】 を有する請求項２記載のポリペプチド。
4. ４．式： 【配列があります】 に対応するアミノ酸残基配列を含む約２０個までのアミノ酸残基を含むポリペプ チド。
5. ５．式： 【配列があります】 を有する請求項４記載のポリペプチド。
6. ６．請求項１記載のポリペプチド及び医薬賦形剤を含むポリペプチド組成物。
7. ７．請求項１記載のポリペプチドと免疫反応する抗体。
8. ８．非活性化ヒト血小板と実質的に免疫反応しない請求項７記載の抗体。
9. ９．血小板−フィブリノーゲン複合体の存在下でヒトフィブリノーゲンと実質的 に免疫反応しない請求項７記載の抗体。
10. １０．血小板−フィブリノーゲン複合体と免疫反応する請求項７記載の抗体。
11. １１．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９８４７を有する２Ｇ５；ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９ ８４４を有する２Ｆ１０；ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９８４５を有する３Ｇ１１；及 びＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９８４６を有する４Ｇ１０、からなる群より選ばれたハ イブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体。
12. １２．患者において請求項７記載の抗体と血小板−フィブリノーゲン複合体との 免疫反応を阻害する方法であって、式： 【配列があります】 を有するアミノ酸残基配列を含む約４０個までのアミノ酸残基を含むポリペプチ ドの治療的に有効な量を患者に投与することを含む方法。
13. １３．請求項７記載の抗体を含む溶液において該抗体の存在を検出する方法であ って、 該溶液を表面上に固定化された式： 【配列があります】 を有するアミノ酸残基配列を含む約４０個までのアミノ酸残基を含むポリペプチ ドに供し； 抗体−ポリペプチド免疫複合体を形成するのに十分な時間、前記ポリペプチドと 接触状態で前記抗体を維持し；及び形成した免疫複合体の存在を求めることによ り、溶液中の抗体の存在を求める； ことを含む方法。
14. １４．請求項７記載の抗体を該抗体を含む溶液から単離する方法であって、該溶 液を表面上に固定化された式： 【配列があります】 を有するアミノ酸残基配列を含む約４０個までのアミノ酸残基を含むポリペプチ ドに供し；及び 該固定化ポリペプチドから該抗体を置き換えることにより、抗体を単離する；こ とを含む方法。