JPH06502762A

JPH06502762A - フレームワーク変異抗体およびそれらの調製物

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Publication number: JPH06502762A
Application number: JP3516449A
Authority: JP
Inventors: ゴーマン，スコット，デビッド
Original assignee: ザ　ウエルカム　フアウンデーション　リミテッド
Priority date: 1990-09-17
Filing date: 1991-09-16
Publication date: 1994-03-31
Also published as: AU660151B2; GB9020282D0; IL99499A; ID1044B; DE69124387D1; KR100217212B1; US20070212753A1; CA2091769C; AU8508891A; CA2091769A1; US7098006B1; EP0549581B2; MX9101117A; KR930702535A; IL99499A0; USRE43898E1; EP0549581A1; DK0549581T3; NZ239826A; EP0549581B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】フレームワーク変異抗体およびそれらの調製物本発明は、改変抗体およびそれらの調製物に関するものである。本発明は、典型的にはヒト化抗体の製造に適用可能である。

抗体類は、典型的にはジスルフィド結合により互いに結合される２つの重鎮および２つの軽鎖を含んでなる。

各軽鎖は、それぞれの重鎮にジスルフィド結合により結合している。各重鎮は、その一端部に可変部分を有し、これは多数の定常部分に続いている。軽鎖は、その一端部に可変部分を有し、他端部に定常部分を有している。

軽鎖可変部分は、重鎮の可変部分と並んで配置されている。軽鎖および重鎮の定常部分は、抗体の抗原に対する結合とは直接には関連しない。

軽鎖および重鎮の各対の可変部分は、抗原結合部位を形成する。軽鎖および重鎮上のこの部分は、同様な一般構造を育し、各部分は、それらの配列が比較的に保存的であって、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されてた４つの部分のフレームワークを含んでなる。４つのフレームワーク領域は、広くベータシート配置をとり、またＣＤＲは、ベータシート構造を連結するか、ある場合にはその一部を形成しているループを形成する。

該ＣＤＲは、フレームワーク領域によって密接して保持され、他の部分のＣＤＲと共に、抗原結合部位の形成に寄与する。

ＣＤＲか、抗体の可変部分のフレームワークとは異なる種から誘導された改変抗体の調製は、ＥＰ−Ａ−０２マウスモノクローナル抗体から誘導されてよい。このようなヒト化抗体は、ヒトに投与された場合に、ラットまたはマウス抗体に対してヒトに生じる免疫応答に比較すると、無視できる免疫応答を引き出す。ヒト化ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体は、ＥＰ−Ａ−０３２８４０４に開示されている。

我々は、ここに改変抗体の新規な調製方法を発明した。

従前の提案とは対照的に、これは、ＣＤＲではなく可変部分のフレームワークの改変に関連している。この方法は、たとえば変形すべきヒトのフレームワーク等をコートするｃＤＮＡがあらかじめ存在することを必要とせず、先行技術の方法よりも技術的に容易であるという優位点を存している。

従って、本発明は、抗体類の可変部分のＣＤＲが第１の哺乳動物種から誘導され、抗体類の可変部分のフレームワークおよび存在する場合には各定常部分が第２の別の哺乳動物種から誘導される抗体類の調製方法であって・（ｉ）前記第１の種の抗体類の可変部分をコードするＤＮＡのフレームワークコート領域を、前記第２の種から誘導される前記フレームワークかコードされるように変異させ：および（１１）前記抗体類を、工程（ｉ）の変異ＤＮＡを用いて発現させることを含んでなる抗体類の調製方法を提供する。

従って、抗体の一方たまは両方の鎖の可変部分は＝（ａ）前記第１の種の選択されるべき抗体類の可変部分のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を決定し；（ｂ）前記可変部分のフレームワークを改変すべく抗体のフレームワークを決定し：（Ｃ）前記可変部分をコードするＤＮＡのフレームワークコード領域を、変異フレームワークコード領域が工程（ｂ）で決定されるフレームワークをコードするように変異せしめ：（ｄ）工程（Ｃ）で得られる変異ＤＮＡを、前記第２の種の定常部分をコードするＤＮＡと連結して、該ＤＮＡを発現ベクター中にクローニングし；ならびに（ｅ）該発現ベクターを適合する宿主細胞内に導入し、該宿主細胞を抗体類が発現される条件下で培養することによって改変され得る。

該抗体類は、相補的抗体類と共に発現されてもよい。

相補鎖の少なくとも可変部分、および、そのまたはそれぞれの定常部分のフレームワークは、一般的には前記第２の種からも誘導される。軽鎖および重鎮は、同時に発現されてもよい。いずれか一方または両方の鎖か、本発明の方法により調製されてもよい。好ましくは、肉類のＣＤＲは、選択された同じ抗体から誘導される。両方の一発現鎖を含んでなる抗体か回収され得る。

該抗体は、好ましくは天然型抗体またはその断片の構造を存する。従って抗体は、完全な抗体、（Ｆａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、軽鎖二量体または重鎮を含んでよい。

該抗体は、ｒｇＧ　１、ＩｇＧ　２、ＩｇＧ　３もしくはＩｇＧ　４等の［ｇＧ、ＩｇＭ、　［ｇＡ、　［ｇＥまたは［ｇＤであってよい。別法として、抗体は、ＷＯ３６１０１５３３に記述されている型のキメラ抗体であってもよい。

ＷＯ３６１０１５３３によるキメラ抗体は、抗原結合領域およ、び非−イムノグロブリン領域を含んでなる。該抗原結合領域は、抗体軽鎖可変部分および重鎮可変部分である。典型的には、該キメラ抗体は、軽および重鎮の両者の可変部分を含む。非−イムノグロブリン領域は、典型的には非−イムノグロブリン蛋白質であって、酵素領域、既知の結合特異性を存する蛋白質から誘導される領域、蛋白質トキシンまたは遺伝子により発現される任意の蛋白質てあってもよい。キメラ抗体の２つの領域は、開裂可能なリンカ−配列を介して連結されてもよい。

本発明は、好ましくは、抗体、典型的にはラットまたはマウス抗体等のモノクローナル抗体をヒト化するために使用される。従って、得られる抗体のフレームワークおよび定常部分は、ヒトのフレームワークおよび定常部分てあり、その一方、該抗体の軽および／または重鎖のＣＤＲは、ラットまたはマウスのＣＤＲである。好ましくは、すべてのＣＤＲかラットまたはマウスＣＤＲである。該抗体は、ラットまたはマウスＣＤＲを保有するヒトのＩｇＧ　ｌ　、　［ｇＧ　２、［ｇＧ　３、［ｇｏ　４等のＩｇＧ　：　［ｇＭ　；ＩｇＡ　：　ＩｇＥまたは［ｇＤであってもよい。

本発明の方法は、得られる抗体か、それらが誘導される抗体の抗原結合能か維持されるような方法で遂行される。抗体は、本発明に従って、該抗体の可変部分をコードするＤＮＡのフレームワークコード領域を変異させることにより改変される。この抗体および改変された抗体は、両者ともに同じ抗原に対して結合可能である。

出発抗体は、典型的には選択された特異性の抗体である。この特異性か維持されることを確実なものとするために、抗体の可変部分フレームワークが、好ましくは他の種の抗体の可変部分フレームワークにほとんど近似するように改変される。「はとんど近似する」とは、アミノ酸配列においてほとんど相同的であることを意味している。好ましくは、２個の可変部分の間に少なくとも５０％の相同性かあることを意味する。

モノクローナル抗体の改変には、４つの一般的工程かある。それらは；（１）出発抗体の軽および重鎮可変部分のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を決定すること；（２）改変抗体の設計、すなわち改変工程で使用する抗体フレームワーク領域を決定すること：（３）実際の改変の方法論／技術；ならびに（４）トランスフェクションおよび改変抗体の発現である。

これらの４つの工程は、抗体のヒト化に関連して以下に説明される。しかしなから、それらは非−ヒト種の抗体の改変にも同様に適用されるであろう。

抗体の改変には、抗体の重および軽鎖可変部分のアミノ酸配列のみを知る必要かある。定常部分の配列は、それらか改変の方策に影響しないため、無関係である。抗体の可変部分アミノ酸配列決定の最も単純な方法は、重および軽鎖可変部分をコードするクローン化ｃＤＮＡから行なうものである。

所定の抗体の重および軽鎖可変部分のｃＤＮＡをクローニングするためには、２つの一般的方法がある＝（１）慣用のｃＤＮＡライブラリーによる方法、または（２）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による方法である。これらの方法は、両者ともに広く知られている。ｃＤＮＡのヌクレオチド配列が与えられた場合、この情報を、抗体可変部分の推定されるアミノ酸配列に翻訳することは容とのヒト抗体配列を改変に使用するかを決定するためには、考慮すべきいくつかの因子かある。軽および重鎮の改変は、互いに独立して考慮されるか、基本的には理由はそれぞれについて同様である。

この選択方法は、以下の理由に基つく。

所定の抗体の抗原特異性および親和性は、可変部分ＣＤＲのアミノ酸配列によって本質的に決定される。可変部分フレームワーク残基は、直接的寄与がほとんどまたは全く無い。フレームワーク領域の本質的機能は、ＣＤＲを抗原認識のためにそれらの適切な空間的配置に保持することである。従って、ゲラ歯頚のＣＤＲをヒト可変部分フレームワーク中に置換することは、ヒト可変部分がそれらか由来するゲラ歯頚の可変部分に高度に相似的である場合には、それらの正しい空間的配置の維持をもたらすてあろう。従って、ヒト可変部分は、好ましくはそれかゲラ歯頚の可変部分に高度に相似的であるように選択される。

好適なヒト抗体可変部分の配列は、以下のように選択され得る・１、　コンピュータプログラムを使用し、利用可能なすべての蛋白質（およびＤＮＡ）データベースを、ゲラ歯頚可変部分に最も相同的なヒト抗体可変部分配列をめて検索する。これは、ＦＡＳＴＡと称されるプログラムを用いて容易に行なわれ得るが、他の適当なプログラムも利用可能である。適当なプログラムの出力は、ゲラ歯頚抗体に最も相同的な配列、各配列に対する相同性の百分率、およびゲラ菌類配列に対する各配列の整列である。これは、重および軽鎖可変部分配列の両者について独立して行なわれる。

上記の分析は、最初にヒトイムノグロブリン配列のみを含む部分データベースをあつらえておいた場合に、より容易に行なわれる。このことは、２つの利点を有する。第１には、分析が、データベース内のすへての配列ではなく興味ある配列のみに限定されるため、実際の計算時間が大幅に減少される。第２の利点は、ヒトイムノグロブリン配列のみに分析を限定することにより、出力か、ゲラ菌類イムノグロブリン配列の存在によって混乱することがない。データベース中には、ヒトのものよりもかなり多くのゲラ菌類イムノグロブリン配列がある。

２、　ゲラ書類抗体の可変部分（上記から）に対して、全体的に最も高い相同性を有するヒト抗体可変部分の配列をリスト化する。フレームワーク領域およびＣＤＲ内の相同性の間に区別を付けない。全体としての相同性を考慮する。

３、　ゲラ歯頚のＣＤＲのものとは異なる長さのＣＤＲを有するヒト配列を、考慮から除外する。ＣＤＲ３の長さは、通常かなり可変的であるため、この規則はＣＤＲ３には適用しない。ゲラ書類抗体のＣＤＲ長と同し長さを有するヒト配列は、場合により全く、またはほとんど存在しない。

このような場合、この規則を緩めることかでき、ＣＤＲ長において１個以上の差異を有するヒト配列も許容され得る。

４、　残るヒト可変部分から、ゲラ歯頚のものに対して最も相同性か高い１つか選択される。

５、　実際に改変された抗体（最終結果）は、ゲラ菌類抗体から誘導されるＣＤＲおよび上記で選択されたヒト抗体由来の可変部分フレームワークを含まなけれ所望の改変抗体をコードするｃＤＮＡは、好ましくはゲラ歯頚抗体可変部分の配列が、本来決定されたゲラ歯頚ｃＤＮＡて始まるように作製される。ゲラ酸類可変部分アミノ酸配列は、選択されたヒト抗体可変部分の配列と比較される。ゲラ歯頚の可変部分フレームワークの残基は、該ゲラ菌類フレームワークをヒトフレームワークと同一とするために対応するヒトにおける残基に変更する必要のあるものか選出される。ゲラ線類フレームワーク配列をヒトのものと同一にするために、ゲラ線類フレームワーク配列に付加または削除する必要かある残基も存在するであろう。

ゲラ菌類可変部分フレームワークが所望の残基を含むように変異させるために使用され得るリボヌクレオチドか合成される。それらのオリゴヌクレオチドは、任意の便利な大きさであり得る。それは、通常は、長さにおいて利用可能な特定の合成装置の能力によって制限される。

オリゴヌクレオチド−指向性インビトロ変異生成の方法は、周知である。

ＣＤＲをヒトフレームワークにスプライシングする方法に対する本発明の改変方法の利点は、（１）この方法は、改変すべきヒトフレームワークをコードするｃＤＮＡかあらかじめ存在することを必要としないこと、および（２）ＣＤＲのスプライシングは、通常、変異原性オリゴヌクレオチドとヒト抗体可変部分との間には相同性か低い大きな領域が存在するため、技術的により容易である。

このことは、ヒト抗体可変部分のフレームワークが、ゲラ歯頚のものに対して最も相同性が高いものを選択しているため、事実である。

変形物の全体を最初から合成する方法に対する本発明の改変方法の利点は、技術的に容易であることである。

改変された可変部分を最初から合成することは、更なる数個のオリゴヌクレオチド、ならびにより多くの日数および労力を必要とし、また技術的困難も生じるであろう。

工程４：トランスフェクションおよび改変抗体の発現抗体改変のための変異生成反応に続いて、ｃＤＮＡが、軽または重鎮定常部分をコードする適当なりＮＡに連結され、発現ベクター中にクローン化され、および哺乳動物細胞中にトランスフェクトされる。これらの工程は、定型的様式で遂行される。従って、改変抗体は：ａ）少なくともＩｇ重鎖または軽鎖の可変部分をコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結された適当なプロモータを含む複製可能な第１の発現ベクターを調製し、該可変部分は、第１の抗体由来のフレームワーク領域および異なる特異性の第２の抗体由来のＣＤＲの少なくとも一部を含むＣＤＲを含有し：ｂ）必要に応じて、少なくとも相補的な１ｇ軽鎖または重鎖の可変部分をコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結された適当なプロモータを含む複製可能な第２の発現ベクターを、それぞれ調製し：Ｃ）細胞系を、調製された第１のまたは両方のベクターで形質転換し：ならびにｄ）前記形質転換細胞を培養して前記改変抗体を産生させる、工程によって調製される。

好ましくは、工程ａ）のＤＮＡ配列は、可変部分ならびに抗体鎖のその、またはそれぞれの定常部分の両者をコードするものであり、ここでその、またはそれぞれの定常部分は第１の抗体から誘導される。該抗体は、回収され、精製され得る。改変抗体を産生すへく形質転換される細胞系は、モルモット卵巣（ＣＨＯ）細胞系、または育利にはミエローマ、ハイブリドーマ、トリオーマもしくはりオドローマ細胞系等のリンパ系に由来する不死化哺乳動物細胞系であってよい。該細胞系は、例えばＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス等のウィルスを用いた形質転換により不死化されたＢ細胞のような正常リンパ様細胞も含む。最も好ましくは、該不死化細胞系は、ミエローマ細胞系またはその誘導体である。

改変抗体の産生に使用する細胞系は、好ましくは哺乳動物細胞系であるか、細菌細胞系または酵母細胞系等の他の任意の適当な細胞系を別法として使用することもできる。特に、Ｅ、　ｃｏｌｉ−誘導細胞系が使用できることか予想される。

ミエローマ細胞系等のある種の不死化リンパ様細胞系は、それらの正常状態において単離されたＩｇ軽または重鎮を分泌することか知られている。そのような細胞系を工程（ａ）で調製されたベクターにより形質転換する場合には、正常分泌鎖が、工程（ａ）で調製されたベクターによりコードされるＩｇ鎖の可変部分に相補的である場合、工程（ｂ）の工程を行なう必要がない。

しかしながら、不死化細胞系が相補鎖を分泌しない場合には、工程（ｂ）を行なう必要があるであろう。この工程は、工程（ａ）で調製されたベクターを、該ベクターが改変抗体の軽または重鎮の可変部分のみならず、相補的可変部分もコードするように、更に操作することによって行なわれる。

別法として、工程（ｂ）は、該不死化細胞系を形質転換するために使用する第２のベクターを調製することによって行なわれる。この別法は、より容易な構造構築を導くが、抗体の効率的産生を導かないであろう点において第１の方法より好ましくない。

該不死化細胞系か相補的軽または重鎮を分泌する場合には、形質転換細胞は、例えば適当な細菌細胞を該ベクターにより形質転換し、次いて該細菌細胞を不死化細胞とスフ二ロプラスト融合により融合させることによって生成され得る。別法として、ＤＮＡはエレクトロポレーションまたは他の適当な方法によって、直接に不死化細胞に導入され得る。

かくして、抗体は、抗体鎖の可変部分のＣＤＲか、第１の種の抗体の対応するＣＤＲに相同であり、かつ該抗体の可変部分のフレームワークおよび定常部分か、第２の別種の哺乳動物種の抗体の対応するフレームワークおよび定常部分に相同であるように産生される。典型的には、軽鎖または重鎮の可変部分の３種のＣＤＲの全てか第１の種から誘導される。

本発明方法は、ヒトＣＤ４抗原に対する抗体を得るために適用された。従って、この発明は、ヒトＣＤ４抗原に結合可能である抗体を提供するもので、ここにおいて該抗体の軽鎖のＣＤＲがアミノ酸配列：ＣＤＲＩ：　ＬＡＳＥＤＩＹＳＤＬＡＣＤＲ２：　ＮＴＤＴＬＱＮＣＤＲ３：　ＱＱＹＮＮＹＰＷＴを有し、該抗体の重鎮のＣＤＲかアミノ酸配列：ＣＤＲＩ：　ＮＹＧＭＡＣＤＲ２：　Ｔｌ５ＨＤＧＳＤＴＹＦＲＤＳＶＫＧＣＤＲ３：　ＱＧＴＩＡＧＩＲＨを育し、かつ可変部分のフレームワークおよび、存在する場合には、各類のその、またはそれぞれの定常部分か、哺乳動物の非うット種から誘導される。

該抗体は、好ましくは天然型抗体またはその断片の構造を存している。該抗体は、従って、完全抗体、（Ｆａｂ’　）２断片、Ｆａｂ断片、軽鎖２量体または重鎮を含む。

該抗体は、［ｇＧ　ｌ　、　ＩｇＧ　２、［ｇＧ　３もしくは［ｇｏ　４等の［ｇＧ、［ｇＭ、ＩｇＡ、［ｇＥまたは［ｇＤであってよい。別法として、該抗体はＷＯ３６１０１５３３に記述されている型のキメラ抗体であってもよい。

ＷＯ３６１０１５３３によるキメラ抗体は、抗原結合領域および非−イムノグロブリン領域を含んでなる。該抗原結合領域は、抗体軽鎖可変部分および重鎮可変部分である。典型的には、該キメラ抗体は、軽および重鎮の両者の可変部分を含む。該非−イムノグロブリン領域は、そのＣ−末端が抗原結合領域に融合される。典型的には、該非−イロノグロブリン領域は、非−イムノグロブリン蛋白質であって、酵素領域、既知の結合特異性を有する蛋白質から誘導される領域、蛋白質トキシンまたは遺伝子により発現される任意の蛋白質であってよい。キメラ抗体の２つの領域は、開裂可能なリンカ−配列を介して連結されていてもよい。

本発明は、ラットまたはマウスＣＤ４抗体等のＣＤ４抗体をヒト化するために好適に使用される。得られる抗体のフレームワークおよび定常部分は、従ってヒトのフレームワークおよび定常部分てあり、一方該抗体の軽および／または重鎖のＣＤＲは、ラットまたはマウスのＣＤＲである。該抗体は、ラットまたはマウスのＣＤＲを保持するヒトのＩｇＧ　１　、　ＩｇＧ　２、ＩｇＧ　３、［ｇｏ　４等の［ｇＧ　：　［ｇＭ　；　ＩｇＡ　；　［ｇＥ　；　ＩｇＥまたは［ｇＤであってもよい。

好ましくは、抗体重鎮のフレームワークは、ヒト抗体Ｋ　ＯＬ　（Ｓｃｈｍｉｄｔ　ら、Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、３６０　７１３−７４７．１９８３）の対応するフレームワークに相同的である。この場合のフレームワーク４の第６番目の残基は、ＴｈｒまたはＰｒｏが好適であり、Ｔｈｒか好ましい。この残基は、ＫＯＬ抗体重頑可変部分において１２１番目の残基てあり（Ｓｃｈｍｉｄｔら、ｌ　９８３　）　、Ｋａｂａｔにより、１０８位として同定されているＣＫａｂａｔ　ら、”５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　１ｎｔｅｒｅｓｔ”　、　ＵＳ　Ｄｅｐｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄｔ（ｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅ　、ＩＪＳ　Ｇｏｖｅｒｍｅｎｔ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　０ｆｆＩｃｅ、　１　９８７）。別法として、抗体重鎮のフレームワークは、ヒト抗体Ｎ　Ｅ　Ｗ　（５ａｕｌら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５３　：　５８５−５９７．１９７８）の対応するフレームワークに相同的である。この場合、フレームワーク１の最終残基は、好適にはＳｅｒまたはＴｈｒ、より好ましくはＳｅｔである。この残基は、３０位にある（Ｋａｂａｔ　ら、１９８７）、好ましくは、抗体軽鎖のフレームワークは、蛋白質ＲＥＩ（Ｅｐｌ）ら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　±５，５１３−５２４．１９７４）の可変部分フレームワークに相同的である。

ＣＤ４抗体の一方または両方の鎖のフレームワーク領域は、本発明の方法により改変され得る。別法として、ＣＤ４抗体の一方または両方は、ＥＰ−Ａ−０２３９４００に記述された方法によって改変されてもよい。ＥＰ−Ａ−０２３９４００の方法は、フレームワークの置換ではなく、むしろＣＤＲの置換に関する。該ＣＤＲは、晴乳動物非−ラット種、典型的にはヒトから誘導されるフレームワークに接合される。このことは、補乳動物非うット種由来の抗体の軽または重鎖のＣＤＲ−コード領域に対するオリゴヌクレオチド−指向性インビトロ変異生成によって達成される。このような場合においてオリゴヌクレオチドは、生じるＣＤＲ−接合抗体が、上記に示した軽鎖ＣＤＲＩ〜３および重鎖ＣＤＲｌ〜３を有するように選択される。

改変ＣＤ４抗体は、抗原に対する耐性を誘発するため使用され得る。それは、リューマチ性関節炎等の自己免疫疾患を緩和するために使用され得る。それは、移植片拒絶を防ぐために使用され得る。器官移植片または骨髄移植等の移植片に対する許容性は、移植を可能とする。

また改変ＣＤ４抗体は、アレルギーを緩和するためにも使用され得る。アレルゲンに対する耐性も達成し得る。

ＣＤ４抗体は、消耗性でも非消耗性であってもよい。

消耗性抗体は、インビボにおいて標的細胞の５０％以北、例えば９０〜９９％を消耗させる抗体である。非消耗性抗体は、インビボにおいて標的細胞の５０％未満、例えばｌＯ〜２５９６、好ましくは１０％未満を消耗させる。

ＣＤ４抗体は、単独で、あるいは非消耗性抗体もしくは消耗性ＣＤ８抗体と共に投与され得る。消耗性または非消耗性のＣＤ４抗体、および消耗性または非消耗性ＣＤ８モノクローナル抗体は、いずれの順て順次投与されても、また同時に投与されてもよい。付加的な抗体、薬剤または蛋白質が、該抗体類の前、同時または後に投与されてもよい。

ＣＤ４抗体、および適当な場合ＣＤ８抗体は、例えば静脈内的に、非経口的に与えられる。該抗体は、注射により、または浸出により投与され得る。この目的のために、該抗体は更に医薬的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物として調剤される。例えばリン酸緩衝食塩水溶液等の適当な担体または希釈剤が使用され得る。

患者に投与される非消耗性または消耗性ＣＤ４および、所望によりＣＤ８抗体の量は、患者の年齢および体重、治療されるべき症状ならびに耐性を誘発する必要かある抗原等を含む種々の因子に依存する。モデルとしてのマウス系では、いずれの１回あたりにも、ｌμｇ〜２ｍｇ、好ましくは４００μｇ〜１ｍｇの抗体か投与された。ヒトにおいては、３〜５００ｍｇ、例えば５〜２００ｍｇの抗体か、１回あたりに投与されるであろう。多くの場合このような投与は、数週間、典型的には３週間にわたって与えられる。

耐性を誘発することか望まれる外来抗原は、ＣＤ４抗体（消耗性または非消耗性）および／またはＣＤ８抗体（消耗性または非消耗性）投与の前、同時あるいは後に宿主に対して投与される。しかしなから、典型的には、抗原は抗体投与の開始から１週間後に投与され、また最終の抗体投与の３週間前に終了する。

かくして、抗原に対する耐性が、非消耗性または消耗性ＣＤ４およびＣＤ８ｍＡｂ、およびｍＡｂに乗じた抗原の投与によって、宿主に誘発される。患者は、非消耗性または消耗性ＣＤ４およびＣＤ　８　ｍＡｂに乗じて外科的に手術され、器官移植または骨髄移植等の組織移植を受ける。

対象が既に保有している抗原に対しても、耐性が誘発され得る。長期間の特異的耐性は、多発性硬化症またはリューマチ性関節炎等の自己免疫疾患の治療のために、自己抗原に対して誘発され得る。自己免疫疾患を患う患者の症状は、従って緩解され得る。

以下の例は、本発明を例示するものである。添付される図面において：図１は、ラットＣＤ４抗体の軽鎖可変部分のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。各行の最初および最後のアミノ酸またはヌクレオチドの番号は、それぞれ左および右のマージンを示している。塩基対ｌ−２６９（ＨｉｎｄｌＩ［−Ｐｖｕ　ＩＩ）および５７７−６２０（（Ｂｇｌ　ＩＩ／Ｂｃｌ　Ｉ）− ＢａｍＨＩ）は、ベクターＭ１３ＶＫＰＣＲ３の部分であり、その一方、塩基対２７〇−５７６は、ＣＤ４抗体軽鎖可変部分（ＶＬ　）のＰＣＲ生成物由来のものである。ＣＤＲ（箱内）か、既知の免疫学的配列との比較により同定される（Ｋａｂａｔら、５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　１ｎｔｅｒｅｓｔ。

ＵＳ　Ｄｅｐｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅ　、　ＬＩＳＧｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　０ｆｆｉｃｅ、　ｌ　９　８　７）　。

図２は、改変ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体の軽鎖ｃ　ＤＮＡのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。

各行の最初および最後のアミノ酸またはヌクレオチドの番号は、それぞれ左および右のマージンを示している。

ＣＤＲは、箱により同定されている。

図３は、改変ＣＤ４抗体の軽鎖ｃＤＮＡであるＣＤ４ＶＬＲＥＩのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。各行の最初および最後のアミノ酸またはヌクレオチドの番号は、それぞれ左および右のマージンを示している。ＣＤＲは、箱により同定されている。

図４は、ラットＣＤ４抗体の重鎮可変部分のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。各行の最初および最後のアミノ酸またはヌクレオチドの場合は、それぞれ左および右のマージンを示している。ＣＤＲは、箱により同定されている。塩基対１−２７２　（ＨｉｎｄＩ［Ｉ　−Ｐｓｔ　［）および６０３−８１７　（ＢｓｔＥＩ［−ＢａｍＨＩ　）は、ベクターＭ１３Ｖ、ＰＣＲ１の一部であり、一方、塩基対２７３−６０２は、ＣＤ４抗体重鎮可変部分（Ｖｌｌ）のＰＣＲ生成物に由来する。

図５は、改変ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体の重鎖ｃ　ＤＮＡのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。

ＣＤＲは、箱により同定されている。

図６は、改変ＣＤ４抗体の重＠　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡであるＣＤ４Ｖ、ＮＥＷ−Ｔｈ　ｒ”のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。各行の最初および最後のアミノ酸またはヌクレオチドの番号は、それぞれ左および右のマージンを示している。ＣＤＲは、箱により同定されている。

図７は、改変ＣＤ４抗体の重鎖ｃＤＮＡであるＣＤ４Ｖ　ＭＮ　Ｅ　Ｗ　Ｓ　ｅ　ｒ　”のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。各行の最初および最後のアミノ酸またはヌクレオチドの番号は、それぞれ左および右のマージンを示している。ＣＤＲは、箱により同定されている。

図８は、ヒトミエローマ蛋白質ＫＯＬの重鎮可変部分（Ｖ）のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲは、箱により同定されている。この配列は、５ｗ１ｓｓ　−Ｐｒｏｔ蛋白質配列データベースから採られた。

図９は、改変ＣＤ４抗体の重鎮７部分であるＣＤ４ＶＨＫＯＬ−Ｐ　ｒ　ｏ”３のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。各行の最初および最後のアミノ酸またはヌクレオチドの番号は、それぞれ左および右のマージンを示している。ＣＤＲは、箱により同定されている。

図１Ｏは、イムノグロブリンプロモータを伴わない改変ＣＤ４抗体の重鎮７部分であるＣＤ４Ｖ、ＫＯＬ−Ｐｒｏ１１３のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。各行の最初および最後のアミノ酸またはヌクレオチドの番号は、それぞれ左および右のマージンを示している。ＣＤＲは、箱により同定されている。

図１１は、改変ＣＤ４抗体の重鎮７部分であるＣＤ４Ｖ　ＨＫ　ＯＬ　Ｔ　ｈ　ｒ　’　”のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。各行の最初および最後のアミノ酸またはヌクレオチドの番号は、それぞれ左および右のマージンを示している。ＣＤＲは、箱により同定されている。

図１２は、イムノグロブリンプロモータを伴わない改変ＣＤ４抗体の重鎮７部分であるＣＤ４Ｖ、ＫＯＬ−Ｔｈｒ””のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。各行の最初および最後のアミノ酸またはヌクレオチドの番号は、それぞれ左および右のマージンを示している。ＣＤＲは、箱により同定されている。

図１３はＹＮＢＪ６．１．８およびＣＤ４Ｖ、ＫＯＬ−Ｔｈｒ”’抗体のアビディティを比較するＥＬＩＳＡの結果を示す。Ｘ軸は、ＹＮＢ４６．１．８　（三角形）またはＣＤ４Ｖ、ＫＯＩＬ−Ｔｈｒ”３　（丸）抗体の濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。Ｙ軸は、４９２十ノメータにおける光学密度を示す。

）ＣＤ４抗体クローンＹＮＢ４６．１．８　（［ｇＧ、、、カッパ軽鎖セロタイプ）は、ラット膵臓細胞とＬｏｕ株ラッうミエローマ細胞系Ｙ３−Ａｇ１．　２．　３　（Ｇａｌｆｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、２７７：１３１−１３３．１９７９）との間の融合の結果生じたものであり、ヒトＣＤ４抗原をコードする相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を含む発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたラットＴ細胞系ＮＢ２−６ＴＧに対する結合によって選択された（　Ｍａｄｄｅｎら、Ｃｅ１ｌ、土２：９３−１０４．１９８５）、抗体を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により精製した。

抗体可変部分の単離　ＣＤ４抗体のｖＬおよびＶ８部分をコードするｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法（０ｒｌａｎｄｉ　ら、ＰＮＡＳＵＳＡ、８互：３８３３−３８３７．１９８９）を若干修飾することにより単離した。ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを、グアニジンチオシアネート法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、±８：５２９４．１９７９）により単離し、全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムに通し、溶離させることによりポリ（Ａ）ＲＮＡを単離した（ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ　、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、６９　：　１４０８、ｌ　９７２）。使用の直前に、ポリ（Ａ）″ ＲＮＡを７０°Ｃにて５分間加熱し、氷上で冷却した。２５μｍの第１鎖合成反応物は、５μｇのポリ（Ａ）”　ＲＮＡ、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｎｔ（トリス−ＨＣＩ（４２℃でｐ８８．２　）　、ｌ　ＯｍＭ　ｕｇｃ１２．１００ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭジチオスレイトール、２３単位の逆転写酵素（ＡｎｇｌｉａｎＢｉｏｔｅｃ、　Ｃｏ１ｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｕ、　Ｋ、　）　、３．５　ｐｍｏｌｅのｖＬ部分−特異的オリゴヌクレオチドプライマＶｘｌＦＯＲ（５’ 　−ｄ　（ＧＴＴ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＴＴＧＧ　ＴＣＣＣ））またはＶ工部外−特異的プライマＶ、ＩＦＯＲ−Ｂ　（５’　−ｄ　（ＴＧＡ　ＧＧＡＧＡＣＧＧＴ　ＧＡＣＣＧＴ　ＧＧＴ　ＣＣＣＴＴＧ　ＧＣＣ））を含んで構成され、これを２ｏ″Ｃにて５分間、次いで４２℃にて９０分間インキュベートした。

引続く５０μｌのＰＣＲ増幅物を、５μｌの第１鎖合成反応物（未精製）、５００μＭ（７）各ｄＮＴＰ、６７ｍＭトリス−ＨＣｌ　（２５°Ｃｌ、：ＴｐＨ８，８）、１７　［１１Ｍ　（ＮＨ４）２ｓ０４．１０　ｍＭ　ＭｇＣｈ、２０８ｇ　／ｍｌゼラチン、５単位のＴＡＱＤＮＡボリメラーセ（Ｋｏｃｈ−Ｌｉｇｈｔ　、　Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ　。

ｔＪ、に、）、ならびに（各）　２５　ｐｍｏｌｅのブライ７ＶＫＩＦＯＲおよびＶＫ　ＩＢＡＣＫ　（５’　−ｄ　（ＧＡＣＡＴＴ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＡＣＣＣＡＧ　ＴＣＴＣＣＡ））　をＶＬ部分に対シテ、またはＶＨＩＦＯＲ−■および混合ブライｖＶ、ＩＢＡＣＫ　（５’　ｄ　（ＡＧＧＴ（ＣＧ）（ＣＡ）Ａ（ＧＡ）ＣＴＧ　ＣＡＧ（ＧＣ）ＡＧ　ＴＣ（ＴＡ）ＣＧ））をｖ１１部分に対して用いて構成した。反応物を、鉱油にて覆い、９５°Ｃ（変性）にて１．５分間、３７°Ｃ（ＶＬ）または５０℃（Ｖ８　、アニーリング）にて１．５分間、および７２°Ｃ（伸長）にて３分間の３０サイクルに、Ｔｅｃｈｎｅ　Ｐ　ＨＣ− １プログラム可能周期反応装置を用いてかけた。最終サイクルは、１０分間の伸長時間を含めた。

試料を一２０°Ｃにて凍結し、鉱油（−２０°Ｃでは粘性液体）を吸引にて除去した。水性相を解凍し、ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲルにおける電気泳動により精製し、次いで、Ｐｖｕ　ＩＩとＢｇｌ　ＩＩ　（Ｖ、　’）またはＰＳＴ　ＩとＢｓｔＥ］Ｉ　（Ｖ、Ｉ）制限酵素のいずれかにより二重消化し、ベクターＭｌ　３ＶＫＰＣＲ３（Ｖ、部分について：０ｒｌａｎｄｉ　ら、１９８９）のＰｖｕ　Ｉ［およびＢｃｌ　［制限部位、またはベクターＭ、、Ｖ□ＰＣＲＩ　（Ｖ、部分について）のＰｓｔ　［およびＢｓｔＥＩ［制限部位にクローン化した。結果において記述するように、ｖＬ部分のクローンか、Ｙ３−Ａｇ１．２．３ＶＬ部分（７）ＣＤＲ２１：特異的す”Ｐ　−標識オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって最初にスクリーニングされた。このプローブにハイブリッドしないＶ５部分クローンおよびＶ８部分クローンを、ジデオキシ鎖停止法（Ｓａｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　見　５４６３．　１９７７）により配列改変軽鎖を、改変ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体（ＲｅｉＣｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３−３２７．１９８８）の全ＶＬおよびカッパ定常（Ｃ，）部分をコードする７４８塩基の単８３１　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａテンプレート上で、３種のオリゴヌクレオチドを用いて同時にブライミングすることにより、Ｍ１３ベクター中にてオリゴヌクレオチド−指向性インビトロ変異生成によって構築した。３種のオリゴヌクレオチド［５ｌ−ｄ（ＡＧＡＧＴＧ　ＡＣＣＡ？’ＣＡＣＣＴＧＴ　ＣＴ入ＧＣ入λＧＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣＡＴＴ　’Ｊ’ＡＣＡＣＴ　ＧＡ？’　ＴＴλＧＣＡ　ＴＧＧ　ＴＡＣＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＣＣＡ）、５’−ｄ（ＣＩ’Ｇ　ＣＴＧ　ＡＴＣＴＡＣＡＡＴ　ＡＣＡａτＡＣＣ世ＣＡＡ　ＡＡＴＧＧＴ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＡＧＣＡＧＡ　’ ！ＴＣ）　、　５１（（ＡＴＣＧＣＣＡｃｅ　ＴＡＣＴＡＣＴＣＣＣＡＡ　Ｃ入ＧＴ入丁入入ＣＡ入ＴＴ入Ｔ　ＣＣＧ　ＴＧＧ　入ＣＧ　ＴＩ’ＣＧＧＣα■弱庶）】は、改変ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体■５部分（Ｒｅｉｃｈｍａｎら、１９８８）の一部であるＲＥＩに基づくヒト抗体ＶＬ部分フレームワーク内の３種のＣＤＲをそれぞれ置換するように設計されている。３種の変異オリゴヌクレオチドのそれぞれを含むクローンを、ヌクレオチド配列決定により同定し、切断ＳＶ４０プロモータにより運転されるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（Ｒｉｎｇｏｌｄら、Ｊ、　Ｍａｔ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、１　：　Ｉ　６５−１７５．　１９８１）を含む発現ベクターｐＨβＡＰｒ　−１ＣＧｕｎｎｉｎｇら、ＰＮＡＳ、８４：４８３１− ４８．３５．１９８７）のＨｉｎｄｎＩ部位にすＮＥＷに基づく改変重鎮の２種類、すなわちＣＤ４Ｖ）Ｉ　ＮＥＷ−Ｔｈ　ｒ”およびＣＤ４Ｖ）Ｉ　ＮＥＷ− ３ｅｔ”を創製した。ＣＤ４Ｖ、ＮＥＷ−Ｔｈｒ”（図６）は、３０位においてスレオニンをコードし、一方、ＣＤ４Ｖｓ　ＮＥＷ　−Ｓ　ｅ　ｒ　”　（図７）は、３０位においてＳｅｔをコードしている。便宜上、第１にはＣＤ４Ｖ、ＩＮＥＷ−Ｔｈｒ”を、改変ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体（Ｒｅｉｃｈｍａｎら、１９８８）の全重鎮をコードする１４６７塩基の単鎖ｃＤＮＡテンプレート（図５）上で、３種のオリゴヌクレオチドを用いて同時にブライミングすることにより、ベクターＭ１３ｍｐ１８中でオリゴヌクレオチド−指向性インビトロ変異生成によって構築した。３種のオリゴヌクレオチド［５’−ｄ（ＴＣＴ　ＧＧＣ’！ＴＣＡＣＣＴＴＣＡｃｅ　ＡＪＬＣ’ｒＡ’ｒ　ＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＧＧ　ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＣｃＴ）、５ ’−ｄ（ｌｌａ　ｍ　ＧＡＧ　％Ｇ　入ＴＴＧｌｌ；Ａ　ＡＣＣＡＴＴＡＧ′ｒＣＡＴ　ＧＡ’ｒ　ＧＧｒ　ＡＧＩ”　ＧＡＣＡＣＴ　？＾ｃ　’ｍ’　ｃａλ ＧＡＣ’ｒＣ！’ｃＴＧ　ＡＡＧ　ＧＧＧ　ＡＧＡ　ＧＴＣ）　、５’−ｄ（ＧＴＣＴＡＴ　ＴＡＴ　ＴＧＴ　ＧＣＡ　ＡＨＡ　（ＪＡ　ＧＧＣＡＣＴ　ＡＴＡ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　Ａ’ｒＡ　ＣＣＴ　ＣＡＣＴＧＧ　ＧＧＴ　ＣＡｊＬ　ＧＧＣＡＧＯＣＴＣ））は、改変ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体（Ｒｅｉｃｈｍａｎら、１９８８）の一部であるＮＥＷに基つ＜Ｖ、部分内の３１１１の相補性決定領域（ＣＤＲ）をそれぞれ置換するように設計されている。３ｆ！ｌの変異オリゴヌクレオチドのそれぞれを含むクローンを、ヌクレオチド配列決定により同定した。

第２に、ＣＤ　４　ＶＨＮＥＷ　Ｓ　ｅ　ｒ　”を、ＣＤ４Ｖ　ｓ　Ｎ　Ｅ　Ｗ　Ｔ　ｈ　ｒ　”をコードする１４５８塩基の単鎖ｃＤＮＡテンプレート（図６）上で単一のオリゴヌクレオチドを用いてブライミングすることにより、ベクターＭ１３ｍｐ１８中でオリゴヌクレオチド−指向性インビトロ変異生成によって創製した。オリゴヌクレオチド（５’　−ｄ　（ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＣＣＴ　ＴＣＡ　ＧＣＡＡＣＴ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　Ｔ））は、３０位の残基を、スレオニン（ＡＣＣ）からセリン（ＡＧＣ）に変異させるように設計されている。この変異オリゴヌクレオチドを含むクローン（図７）は、ヌクレオチド配列決定により同定された。クローンＣＤ４ＶＨＮＥＷ−Ｔｈｒ”およびＣＤ４ＶＨＮＥＷ−３ｅ　ｒ”の二重鎖形態を、発現ベクターｐＮＨ３１６の旧ｎｄｌＩ［部位に旧ｎｄＩ［断片としてサブクローン化した。ベクターｐＮＨ３１６は、メタロチオニンブロモータにより運転されるネオマイシン耐性遺伝子を含むように操作されたｐＨ βＡＰｒ　−１の修飾版である（Ｇｕｎｎｉｎｇ　ら、ＰＮＡＳ、８４：４８３１−４８３５゜変重鎮可変部分、および発現ベクター構築物ＫＯＬに基づく改変重鎮の２種類、すなわちＣＤ４Ｖｓ　Ｋ　ＯＬ　−Ｔ　ｈ　ｒ　”’およびＣＤ４Ｖ１．ＩＫＯＬ−Ｐｒｏ’目を創製した。ＣＤ４Ｖ、ＫＯＬ−Ｔｈｒ”’は、１１３位においてスレオニンをコートＬ（図１１）、一方、ＣＤ４Ｖｓ　ＫＯＬ −Ｐｒｏ”’は、１１３位がプロリンをコードしている（図９）。便宜上、第１にはＣＤ　４　ＶＨＫＯＬ　Ｔ　ｈ　ｒ　”’を、Ｍ１３ｍｐｌＢ中にクローン化されたラットＣＤ４抗体のＶ、部分（図４）をコードする８１７塩基の旧ｎｄＩ［Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片を含む単鎖ＤＮＡテンプレートについて、ラットのフレームワーク領域をＫＯＬのヒトフレームワーク領域で置換するように設計された５種類のオリゴヌクレオチド［５ｌ−ｄ（ＣＡＣＴＣＣＣＡＧ　ＧＴＣＣＡＡ　ＣＴＧＧＴＧＧλＧ　ＴＣ’！’　ＧＧＴ　ＧＧＡ　ＧＧＣＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧ）、５菅−ｄ（入入ＧＧＴＣＣＣＴＧ＾Ｇ　ＡＣＴ　ＣＴＣＣＴＧ　Ｔ！’ＣＣＴＣＣＴＣＴＧＧ　Ａ’！’ｌ’　ＣＡ’ｒ　Ｃ’！Ｔ　ＣＡＧ　’！’ＡＡ　Ｃτ入ＴＧＧＣ入’１’　Ｇ）、５ｌ−ｄ（ＧＴＣＣＧＣＣＡＧ　ＧＣ’！’　ＣＣＡ　ＧＧＣＡＡＧ　ＧＧＧ　ＣＴＣＧ入ＧＴＧＧ）、　５’−ｄ（ＡＣＴ　ＡＴＣＴＣＣＡＧＡ　ＩＸＡＴ　ＡＡ’！”　ＡＧＣＡＡＡ　ＡＡＣＡｃｅ　Ｃ？Ａ　冨ｃ’ｒｃｃＡＫＡπ　Ｇ）、５ｌ−ｄ（ＡＣＡ　ＧＴＣ丁ＧＡ　ＧＧＣＣＣＧ　ＡＧＧ　入ＧＡ　ＣＧＧ　ＧＣＧτＧ？　Ａ’！ ’ｌ”Ｉ’ＣＴ　ＧＴＧ　ＣＡＡ　ＧＪＬＣＡＡＧ　ＧＧＡ　Ｃ’３３を用いて同時にブライミングすることによって、オリゴヌクレオチド−指向性インビトロ変異生成により創製した。５種の変異オリゴヌクレオチドのそれぞれを含むクローンを、ヌクレオチド配列決定により同定した。ＣＤ４Ｖ）ｌ　ＫＯＬ−Ｐｒｏ ”を、第２にＭＩ３ｍｐｌＳ中にクローン化されたＣ　Ｄ　４　Ｖｓ　ｋ　ＯＬ　Ｔ　ｈ　ｒ　”３をコードする８１７塩基の旧ｎｄ　ＩＩＩ　−ＢａｍＨＩ断片を含む単鎖ＤＮＡテンプレートについて、オリゴヌクレオチド［５”−ｄ（ＴＧＧ　ＧＧＣＣＡＡ　ＧＧＧ　ＡＣＣＣＣ（：　ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣ，Ｔ ’ＣＡ）　］を用いてブライミングすることによって、オリゴヌクレオチド−指向性インビトロ変異生成により創製した。この変異オリゴヌクレオチドを含むクローンを、ヌクレオチド配列決定により同定した。

ＣＤ　４　Ｖ＋＋　ＫＯＬ　Ｔｈ　ｒ　””　（図Ｉｆ）およびＣＤ４Ｖ、ＫＯＬ−Ｐｒｏ’目　（図９）をコードするクローンの二重鎖ＤＮＡ形態からイムノグロブリンプロモータを、最初の１２５　ｂｐ　（ＨｉｎｄＩ［Ｉ−Ｎｃｏ　Ｉ　）のＨｉｎｄＩ［Ｉ　−Ｎｃｏ　１オリゴヌクレオチドリン力−断片［５’− ｄ（入ＧＣ’ｆｆｒ　ＡＣＡ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　ＣＡＣＡＣＡ　ＧＧＡ　ＣＣＴ　ＣＡＣ）およびその重複する相複鎖５ｌ−（１（ＣＡＴ　ＧＧＴ　ＧＡＧ　ＧＴＣＣＴＧ　ＴＧＴ　にＣＴ　ＣＡＧ　ＴＡＡ　ＣＴＧ　ＴＡＡ）　］による置換（両方について）によって除去した。ここては７３１ｂｐの旧ｎｄＩＩＩ　−ＢａｍＨＩ断片である生成したクローンＣＤ４Ｖ、ＫＯＬ−Ｔｈｒ１１３　（図１２）およびＣＤ４ＶＨＫＯＬ　Ｐｒ　ｏ”３　（図１０）を、別々−、ヒトローン化されている発現ベクターｐＨ／３ＡＰｒ　−１−ｇＪ）ｔ（Ｇｕｎｎｉｎｇ　ら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７６．１３７３．１９８７）の旧口ｄｌＩ［およびＢａｍＨＩクローニング部位にサブクローン化した。従って、トランスフェクトされ、抗体重鎮として発現された場合には（下記参照）、これらの改変ＶＨ部分は、ヒトｒｇＧ　１定常部分と連結されている。

蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣ３）分析改変抗体のＣＤ４抗原に対する結合の相対親和性をＦＡＣ３分析によって評価した。この分析において使用されるＣＤ４−発現細胞は、ヒトＣＤ４抗原（Ｍａｄｄｏｎら、Ｃｅ１ｌ　４２，９３−１０４．１９８５）をコードする相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を含む発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたクローン化うットＴ細胞系ＮＢ２−６ＴＧであった。細胞は、フルオレセイン−接合ヒツジ抗−ヒト抗体に続いて、適切な改変抗体を用いて染色される（Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ　Ｌｔｄ、　Ｂｉｒｍｊｎｇｈａｍ、　ＬＩＫ）　。

対照の染色（表１参照）は、細胞染色の第１段階において抗体を含まない。平均細胞蛍光量は、０ｒｔｈｏ　Ｆ　Ａ　ＣＳを用いて決定された。

抗体アビディティ分析ラットＹＮＢ４６．１．８抗体および改変ＣＤ４Ｖ。

ＫＯＬ−Ｔｈｒ”３抗体の相対アビディティを、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により評価した。

マイクロタイタープレートを、可溶性組換えＣＤ４抗原（Ｂｙｕｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３４４　：６６７−７０．　１９９０）によって５０μｌ／ウエル、１０ μｇ／ｍｌにて被覆し、次いて１．０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１００μｍ／ウェルのリン酸緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）によりブロックした。抗体を、Ｏ，Ｉ％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に希釈し、ウェルに室温にて４５分間加えた（５０μｌ／ウエル）。次いてビオチン化ＣＤ４Ｖ、ＫＯＬ−Ｔｈｒ”’抗体（１０μｌ／ウェル；　２０　μｇ　／ｍｌの最終濃度）を、各ウェルに加え更に４５分分間−た。ウェルを、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳにより洗浄し、次いて１：１．０００に希釈された５０μｌのストレプトアビジン−ビオチン化西洋ワサビパーオキシダーゼ複合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ　；　Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ　、　ＵＫ）を各ウェルに加え、３０分分間−た。ウェルを０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳて洗浄し、各ウェルに１００μＩの基質（２５ｍＭクエン酸、５０ｍＭリン酸水素ナトリウム、ｏ、　ｉ％（ｗ／ｖ）０−フェニレンジアミン、０．０４％（ｖ／ｖ）３０％過酸化水素）を加えた。反応を、１．０Ｍ硫酸の５０μｌ／ウエルの添加によって停止させた。４９２ナノメータにおける光学密度（ＯＤ、、、　）を、ＥＬＩＳＡプレート読取装置で測定した。

トランスフェクションジヒト口葉酸還元酵素を欠損するモルモット卵（ＣＨＯ””Ｒ−）細胞（１０’ ／Ｔ−７５フラスコ）を、記述されているように（ＷｉｇＩｅｒら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ７６．１３７３．１９７９）、９μｇの重鎮構築物およびｌ　μｇの軽鎖構築物によって同時にトランスフェクーシヨンした。トランスフェクト生成物を、５％の透析ラン胎仔性血清を含む培地中で選択し、抗体分泌クローンを条件培地のＥＬＩＳＡにより同定した。抗体を、濃縮し、蛋白質Ａセファロース（商標）カラムクロマトグラフィにより精製した。

２、　結果軽鎖および重鎮可変部分ｃＤＮＡのクローニングＣＤ４抗体−分泌ハイブリドーマ細胞由来のＶＬおよびｖ、１部分をコードするｃＤＮＡを、Ｊ領域を経てＮ− 末端部分をコードするｍＲＮＡ　（Ｏｒｌａｎｄｉ　ら、１９８９）の分節を増幅するプライマを使用してＰＣＲにより単離した。ＶＬおよびＶ、部分のＰＣＲ生成物を、Ｍ２Ｓに基づくベクターＭ１３Ｖ、ＰＣＲ３およびＭＩ３Ｖ、ＰＣＲｌにそれぞれサブクローン化した。無作為の７１部分クローンの最初のヌクレオチド配列分析は、はとんとのｃＤＮＡが、抗−ＣＤ４ハイブリドーマの創製のための融合相手として使用したＹ３−Ａｇ１．２．３ラツトミエローマ細胞系（Ｃｒｏｗｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ、１７　：　７９９２．　１９８９）によって発現される軽鎖のＶＬ布部分コードしていることを明らかにした。Ｙ３　Ａｇ１．２．３の軽鎖ｍＲＮＡの発現は、ＣＤ４抗体軽鎖のそれを上回るか、またはＹ３−Ａｇ＋。

２．３軽鎖ｍＲＮＡかＰＣＲにおいて優先的に増幅されるものと思われる。

ＣＤ　４　Ｖ　Ｌ部分のｃＤＮＡを見出す機械を最大にするために、我々は最初にすべてのＭ１３クローンを、Ｙ３−Ａｇ１．　２．　３　（Ｃｒｏｗｅ　ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　。

±ユニ７９９２，１９８９）のＣＤＲ２に相補的な３２ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーションによってスクリーニングにかけた。

引続く配列の分析は、このプローブに相補的な配列を含まないＭ１３クローンに限定した。このようにして、独立したＰＣＲ増幅物からの２種類のｃＤＮＡか、同じ１１部分をコードしていることか同定された。無作為ｖＨ部分ＰＣＲ生成物のヌクレオチド配列分析は、ＶＨ部分ｃ　ＤＮＡの単一種を明らかにした。独立したＰＣＲ増幅物由来の２種類のＶ、ｃＤＮＡクローンが、一方のクローンにおいて１４位の残基のコドンがプロリン（ＣＣＴ）をコードし、第２のクローンの同じ位置がロイシン（ＣＴＴ）をコートしている点を除き、同等な配列を含むことか分かった。

Ｋａｂａｔ　ら、１９８７によると、５９５個の配列決定されたＶＨ部分のうち、５２４個はこの位置にプロリン残基を含み、その一方、わずか６個がロイシンを含んでぃた。従って我々は、例示のためにプロリン−コードクローンを選択した（下記参照）。残基１４は、第１のＶ。

フレームワーク領域内に充分に含まれ、かっＣＤＲに入らないため、抗原結合性に直接には寄与しないものと思われ、またこの位置の不確定性は、引続く改変の方策には影響しなかった。従って、我々は、この配列の不確定性を更には評価しなかった。

ｃＤＮＡ配列およびそれらの推定されるアミノ酸配列は、図１および図４に示されている。更なるｖＬまたはｖ、１部分−コードクローンか見出されなかったため、これらの配列かＣＤ４抗体遺伝子から誘導されたものと推我々の目標は、改変において適切なヒトＶ領域フレームワークを選択することの重要性を調査することであった。２種類の改変方針を採用した。

第１の改変方針第１の方針において、我々はラット誘導ＣＤ４抗体由来のＣＤＲならびに我々が以前に改変ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体に対して成功裏に使用した同じヒトＶ領域フレームワーク配列、すなわちＲＥＩに基づ＜　Ｖ　Ｌ部分についてのフレームワークおよびＮＥＷに基づくＶ□部分についてのフレームワーク（Ｒｅ　ｉｃｈｍａｎｎら、１９８８）を組込んだ改変抗体を創製した。このことは、図２および５にそれぞれ示されている改変ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体の軽鎖および重鎖ｃＤＮＡの６個のＣＤＲを、オリゴヌクレオチド−指向性インビトロ変異生成に付すことによって行なわれた。生じた改変ＣＤ４抗体軽鎖（図３）をＣＤ４Ｖ、、ＲＥＩと称した。２種類のＮＥＷに基づく改変ＣＤ４抗体重鎮を創製した：３０位（フレームワークｌ内）にスレオニン残基をコートするＣＤ４Ｖ、ＮＥＷ−Ｔｈｒ ”（図６）および３０位にセリン残基をコードするＣＤ４Ｖ、ＮＥＷ　Ｓｒｅ” （図７）である。これらの異なる２種類は、３０位かスレオニンまたはセリンのいずれをコードしていても成功裏に改変されたＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体重鎮か、抗原と良く結合するため創製され（Ｒｅ　ｉｃｈｍａｎｎら、１９８８）、我々は、この場合においても両者を試験すべく選択した。

第２の改変方針第２の改変方針においては、我々はＣＤ４抗体ｖ８部分を、ヒト抗体ＫＯＬのＶ。部分フレームワーク配列を含むように改変した。すへての既知のヒト抗体Ｖ□ 部分のうち、ＫＯＬのＶ８部分の全体アミノ酸配列は、ラットＣＤ４抗体Ｖ８部分に対して最も相同的である。ヒト抗体ＫＯＬおよびＮＥＷのＶＨ部分は、ラットＣＤ４抗体ｖ、１部分に対して、それぞれ６６％および４２％の相同性を存する。

ＫＯＬに基づく改変ＣＤ４抗体重１ｖ領域の２種類は、第４フレームワーク領域内の単一のアミノ酸残基について異なるように創製された＝１１３位においてプロリン残基をコードするＣＤ４Ｖ、ＫＯＬ−Ｐｒｏ口３　（図１Ｏ）および１１３位においてスレオニン残基をコードするＣＤ４Ｖ、ＫＯＬ−Ｔｈｒｌ＋’　（図１２）である。

ＣＤ４Ｖｓ　ＫＯＬ−Ｐｒｏ”３は、そのフレームワーク配列か、ＫＯＬ抗体重ＭＶ領域（図８）のものと同一である点において「原型に近い」ものである。

すべての既知のヒト抗体ＶＬ部分のうち、ヒト軽鎖ＮＥＷのｖＬ部分の全体的アミノ酸配列は、ラットＣＤ４抗体のＶＬ部分に対して最も相同的（６７％）である。従って、ＮＥＷに基づく改変ＣＤ４抗体重鎮ＣＤ４Ｖ、ＮＥＷ−Ｔｈｒ３０およびＣＤ４Ｖ、ＮＥＷ−８ｅｒ３０と共に発現されたものと同一の改変軽ｊＪｉｃＤ４ＶＬＲＥＩ（上述）か、ＫＯＬに基づく改変ＣＤ４抗体重鎮ＣＤ４ＶＨＫＯＬ−Ｐｒｏ”３およびＣＤ　４　Ｖｓ　Ｋ　ＯＬ　Ｔ　ｈ　ｒ　目’　と共に発現された。このことは、同じ改変軽鎖の異なる改変重鎮との発現が、各改変重鎮の直接の機能の比較を可能とするために、利点を存する。

要約すれば、４種の異なる改変抗体を創製した。各抗体の改変軽鎖は、ＣＤ４ＶＬＲＥＩと称される。該抗体の改変重鎮は、それぞれＣＤ　４　Ｖ　ＨＮ　Ｅ　Ｗ　−Ｔ　ｈ　ｒ　３’、ＣＤ　４　Ｖ、ＮＥＷ　Ｓ　ｅ　ｒ　”、ＣＤ４Ｖ、ＫＯＬ−ｐ　ｒｏ＋１３、およびＣＤ　４　Ｖｓ　Ｋ　ＯＬ　Ｔ　ｈ　ｒ　”２と称される。各改変重鎮は、同じヒトＩｇＧ　１定常部分を含んでいる。各改変抗体は、同じ改変軽鎖を有しているため、改変抗体の重鎮の名称が、以下では全抗体（軽鎖と重鎮との組合せ）を引用するために使用される。

改変抗体の相対親和性改変抗体の相対親和性は、ＣＤ４抗原−発現細胞に対する結合能力の、種々の抗体濃度における測定によった場合に近接していた。ＦＡＣＳ分析は、染色細胞の平均細胞蛍光量を決定した（表１）。

この分析から、改変ＣＤ４抗体は、ＣＤ４抗原に対して広い濃度範囲にわたって種々の程度で結合することか明らかになった。最初に表１の実験ｌを考察しよう。

ＣＤ　４　Ｖ、ｌｋ　ＯＬ　Ｔ　ｈ　ｒ　”’抗体をＣＤ４Ｖ、ＮＥＷ−Ｔｈｒ ”抗体と比較してみると、両抗体ともに対照としての改変ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体と比へた場合にＣＤ４ゝ細胞に結合することは明らかである。しかしなから、ＣＤ　４　ＶＨＫ　ＯＬ’　Ｔ　ｈ　ｒ　”’抗体は、ＣＤ４゜細胞に対してＣＤ　４　ＶＨＮ　Ｅ　Ｗ　Ｔ　ｈ　ｒ　″。より大きい親和性をもって結合する。ＣＤ　４　Ｖ　ｓ　Ｋ　ＯＬ　Ｔ　ｈ　ｒ　”　”抗体の試験した最低濃度（２，５μｇ／ｍｌ）は、ＣＤ　４　ｖＨＮ　ＥＷ　Ｔ　ｈ　ｒ　”抗体の試験した最高濃度（１６８μｇ／ｍｌ）とほぼ等しい平均細胞蛍光量を与えた。実験２は、ＣＤ４ＶＮ　ＮＥＷ−Ｓｅｔ”抗体か、ＣＤ４Ｖ、ＮＥＷ−Ｔｈ　ｒ２０よりも若干良好にＣＤ４”細胞と結合することを示している。わずかに２．５μｇ／ｍ１のＣＤ４Ｖ）Ｉ　ＮＥＷ−３ｅ　ｔ”が、１０μｓ／ｍｌのＣＤ４Ｖ、ｌ　ＮＥＷ　Ｔｈ　ｒ”抗体とほぼ同等な平均細胞蛍光量を与えるために必要である。実験３は、ＣＤ　４　Ｖ　Ｈｋ　ＯＬ　Ｔ　ｈｒ’　１３抗体か、ＣＤ４Ｖ、ＫＯＬｐ　ｒ　ｏ　口３抗体より若干良好にＣＤ４”細胞と結合するであろうことを示している。

これらのアッセイから、ＣＤ４＋細胞に対する親和性については、ＫＯＬに基つく改変抗体か、ＮＥＷに基づく改変抗体よりかなり優れていることが明らかである。

また、あるにしても僅かな差異かＣＤ４Ｖ、ＮＥＷ−Ｔｈｒ３０抗体とＣＤ４ＶＨＮＥＷ−３ｅ　ｒ”抗体との間にあり、また、ＣＤ　４　ＶＨＫ　ＯＬ　Ｔ　ｈ　ｒ　””抗体とＣＤ４　Ｖｓ　Ｋ　ＯＬ　Ｐ　ｒ　ｏ　””との間についても同様である。

かくして、これらの改変抗体の順位は、それらのＣＤ４”細胞に対する相対的親和性に基づいて導かれる：上記実験で使用された改変ＣＤ４抗体が、それぞれ同様な重鎮定常部分を育し、かつ同じ改変軽鎖を伴っていたことを再度述べておかなければならない。従って、観察されたＣＤ４＋細胞に対する結果の差異は、それらの重鎖Ｖ領域の差異によるものである。

ラットＹＮＢ４６．１．８抗体および改変ＣＤ４ＶＨＫＯＬ−Ｔｈｒ１１ｆｆ抗体の相対アビディティラットＹＮＢ４６．１．８抗体および改変ＣＤ４Ｖ。

ＫＯＬ−Ｔｈｒ”’抗体の相対アビディティを、ＥＬＩＳＡにより評価した。このアッセイにおいては、各抗体か、ビオチニル化ＣＤ　４　Ｖ、　ＫＯＬ−Ｔｈ　ｒ　ｌ＋３抗体の可溶性組換えＣＤ４抗原への結合を阻害する能力を測定した。実験結果を図１３に示す。ビオチニル化ＣＤ４ＶＨＫＯＬ　Ｔｈｒ”３抗体の阻害は、非標識ＣＤ４ＶＨＫＯＬ−Ｔｈ　ｒ　””およびＹＮＢ４６．Ｉ、８抗体の両者共に光学密度０．３近傍では線形であった。光学密度０．３を与えるＣ　Ｄ　４　Ｖｏ　Ｋ　ＯＬ　Ｔ　ｈ　ｒ　””およびＹＮＢ４６．１．８抗体の濃度は、それぞれ２８．７および１．５６４ｇ　／ｍｌてあった。従って、ＹＮＢ４６．１゜８抗体ノアヒデイテイハ、ＣＤ４Ｖ、ＫＯＬ−Ｔｈｒ”’抗体のものより２８．７／１．５６または約１８倍良いものと評価できる。この実験は、アフイニテイを与えるものではなく、大まかな相対アビディティを与えるものであることに注意しなければならない。う・ソトＹＮＢ４６．１．８抗体は、ＣＤ４Ｖ、ＫＯＬ−Ｔｈｒ”３抗体のものとは異なる定常部分を有しており、このことは、それらのＣＤ４抗原に対する実際のアフイニティとは無関係に、該抗体かどの程度に良＜ＣＤ４抗原に結合するかに影響を与える。改変抗体のＣＤ４抗体に対する実際のアフイニテイは、大なり小なりＹＮＢ４６．１．８抗体と同程度であろう。他の改変抗体ＣＤ４ＶＨＫＯＬ−Ｔｈ　ｒ”　３　、ＣＤ４ＶＨＮＥＷ−３ｅ　ｒ”およびＣＤ４Ｖ、ＮＥＷ−Ｔｈ　ｒ　３０については、このアッセイにおける試験を行なっていない。

表１．　改変抗体により染色されるＣＤ４＋細胞の平均対照　Ｓ、Ｏｆｆｊｍ工Ｉニー１９　Ｈｉｎ３ＸＨＭ　Ｇ　Ｗ　Ｓ　ＣＩ　−４４−１９Ｍ　Ｇ　Ｗ　Ｓ　ＣＸ　Ｉ　Ｌ　Ｆ　Ｌ　Ｖ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｔ　−５１１ＡＶＴＶＳｓ　ｔｌｇｊｌａａおｌ７８０　Ａ（、ＣＴＣＣＣＡＣＡＣＴＴＣＡＴＧＣ；ＣＣＡＧＡＧＡＴＴＴＡＴＡＧＧＣＡＴ（：Ｃ８１７−１９Ｂシｉエエエ　ＭＧ　讐　ＳＣＩ　工　Ｌ　− １２Ｆｉ　ｕｒｅ　５　ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ２７０　Ｖ　Ｓ　ＨＥ　Ｄ　！’　Ｅ　Ｖ　Ｋ　Ｆ　Ｎ　Ｗ　ＹＶ　Ｄ　Ｇ　Ｖ　Ｅ　Ｖ　Ｈ２８９９００ＧＴＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＴＣＡＡＧＴｒＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣにＴＧＧＡＣ印ＣＧτＧＣＡＧＧＴにＣＡτ　X５９２９０　Ｎ　Ａ　Ｋ　Ｔ　Ｋ　Ｐ　ＲＥ　Ｅ　Ｑ　Ｙ　Ｎ　Ｓ　Ｔ　Ｙ　ＲＶ　Ｖ　Ｓ　Ｖ　３０９９６０　ＡＡＴＧＣＣＡＡにＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴにＧＴＣＡＣＣＧτ メ@＋ｏ＋ｇ３１０　Ｌ　Ｔ　Ｖ　Ｌ　ＨＱ　Ｄ　Ｗ　Ｌ　Ｎ　Ｇ　Ｋ　Ｅ　Ｙ　Ｋ　ＣＫ　Ｖ　Ｓ　Ｎ　３２９−１９　ＨｉｎｄＸＸ工Ｍ　Ｇ　ｗＳ　ＣＸ　工　Ｌ−１２１１０Ｑに５ＬＶＴＷＳＳＡＳＴＫＧＰＳＩＦＦＰＬ　１２９４２０　ＣＡＡＧＧＣＡにＣＣＴＣＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣ；ＣＣＣＡＴＣＧＩ；ＴＣＩゴＣＣＣＣ香獅S７９１３０　Ａ　Ｐ　Ｓ　Ｓ　Ｋ　Ｓ　Ｔ　Ｓ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｌ　Ｇ　ＣＬ　Ｖ　Ｋ　Ｄ　１４９４８０　ＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＭＱＡＧＣＡＣＷＣＡＧＣＧＧＣＣｎ［５３９１５０ＹＦＰ！：ＰＷ？ＶＳＷ）ｉｓＧＡＬＴｓＧＷＨ１６９２１０ＴＫＶＤＫ）ＣＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰ　２２９２５０　Ｄ　Ｔ　Ｌ　Ｍ　Ｉ　Ｓ　ＲＴ　Ｐ　Ｅ　Ｖ　Ｔ　ＣＶ　Ｗ　Ｖ　Ｄ　Ｗ　Ｓ　Ｒ２６９８４０ｃＡｃＡＣＣＣＴｃＡＴＣａＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣσ−以ｍツＣＡπ匡π；πＣつ論Ｃ―；ＡＥＣＡＣ１１９９Ｆｉ　ｒｅ　６　ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ２７０　ＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ　２８９９００　ＧＡＡｆｌ；ＡＣＣＣＴ（−ＡＧＧＴＣＡＡＧττＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣにＴＣｆｌ；ＡＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴにｃＡＴＡＡＴfＣＣＡＡＧ　９５９２９０ＴＫＰＲΣ　Σ　Ｑ　Ｙ　Ｎ　Ｓ　Ｔ　Ｙ　ＲＶ　Ｖ　Ｓ　Ｖ　Ｌ　Ｔ　Ｖ、　３０９９６０　ＡＣＭＡＧＣＣにＣＣｊＡＡＧＧＡＧＣＡ（ＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣにＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣP０４９３１０ＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬ　３２９１０２０　ＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡにＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣsＣ１０７９３３０ＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶ　３４９１０８０　ＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣにＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡ−ＣＡＧＣＣＣＣＱＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧ@１１３９３５０　Ｙ　Ｔ　Ｌ　Ｐ　Ｐ　Ｓ　ＲＤ　Ｅ　Ｌ　Ｔ　Ｋ　Ｎ　Ｑ　Ｖ　Ｓ　Ｌ　Ｔ　ＣＬ　３６９１１４０　τＡＣＡＣＣＣＴｌｌ；ＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＣ乙ＬＧＧＴＣＡ（、ＣＣＴＣＡＣＣτ fＣＣπ　１１９９３７０　Ｖ　Ｋ　Ｇ　Ｆ　Ｙ　Ｐ　Ｓ　Ｄ　Ｉ　Ａ　Ｖ　Ｅ　Ｗ　Ｅ　Ｓ　Ｎ　Ｇ　Ｑ　Ｐ　Ｅ　３８９１２００　ＧＴＣＡＡＡＧＧｃｒｒＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴ工ＡにＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴ■ｔローＣＣＧｆ：詰Ｇ@１２５９３９０　Ｎ　Ｎ　Ｙ　Ｋ　Ｔ　Ｔ　Ｐ　Ｐ　Ｖ　Ｌ　Ｄ　Ｓ　Ｄ　Ｇ　Ｓ　Ｆ　Ｆ　Ｌ　Ｙ　Ｓ　４０９Ｈ５５ｄエエエ１４４０　ＧＴｆｌ；ＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴｒ　１４５８−１９ＭｉｎｉＸＸ工Ｍ　Ｇ　讐　５ＣＸＸＬ−１２１１０ＱＧＳＬＶＴＶＳＳＡＳ？ＫＧＰＳＶＦＰＬ　１２９４２０　ムに餌請ＺＣ’ｒＣ！ｌ；ＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡ？ＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧ@４７９１３０　ＡＰＳＳＩＵＳＴ３ＣＧＴＡＡＬＧＣＬＷＫＤ　１４９４８０　ＧｃＡＣＣσｃｃ’ｒｃムにＷ℃にσ口を各シュムぶ）χＣロッ認コχロワゴロμ為Ｃ５３９１ｓｏｙｙｐｘｐｖ　τ　Ｙ　Ｓ　Ｗ　Ｎ　Ｓ　Ｇ　Ａ　Ｌ　Ｔ　Ｓ　Ｇ　Ｖ　Ｈ１６９２１０τＫ　”ｉ　Ｄ　Ｋ　Ｋ　Ｖ　Ｅ　Ｐ　Ｋ　Ｓ　ＣＤ　Ｋ　Ｔ　ＲＴ　Ｃ！’　Ｐ　２２９７２０　＾ＣＣＡ＾ＧσｒＧＣＡ　ＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣ；Ｔｆｌ；ＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧ　７７９２３０　ＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＷＦＬＦＰＰＫＰＫ　２４９７８０　ＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴｃＡＡＣＴＣＣ：ｒＧＧＧＧＧＧＡＣＣにＴＣＡＩＩＴ（ＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣ`ＡＧ　８３９２５０　Ｄ　Ｔ　Ｌ　Ｍ　Ｉ　Ｓ　ＲＴ　Ｐ　Ｅ　”ｉｌ　Ｔ　ＣＶ　Ｖ　Ｖ　Ｄ　Ｖ　５　Ｈ２６９８４０ＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＴＣＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣｍＣＧＴｌａＡＧＣＣＡＣ８９９ｖ＝　ｒｅ　７　ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ２７０　Ｅ　Ｄ　Ｐ　Ｅ　Ｖ　Ｋ　Ｆ　Ｎ　Ｗ　Ｙ　Ｖ　Ｄ　Ｇ　Ｖ　Ｅ　Ｖ　ＨＮ　Ａ　Ｋ　２８９Ｈシｍ１ＸＸ工１４４０　にＴＩＪＱＡｃＧＧｃＣＣＣＡＡＧＣ！Ｔ　１４５８１　Ｑ　Ｖ　Ｑ　Ｌ　Ｖ　Ｅ　Ｓ　Ｇ　Ｇ　に　Ｖ　Ｖ　Ｑ　１３５４　Ｄ　Ｇ　Ｓ　Ｄ　Ｑ　ＨＹ　Ａ　Ｄ　Ｓ　Ｖ　Ｋ　Ｇ　ＲＦ　Ｔ　Ｘ　Ｓ　ＲＤ　７３＃ｉｍｌエニー１９　Ｍ　Ｇ　Ｗ　Ｓ　ＣＩ　工Ｌ　Ｆ　Ｌ　Ｖ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｔ　−５ｎ４　ｖｒｖｓｓ　１１８五ａｄｌ！７２１　ＴＡ？ＡＧＧＣＡτＣＣ７３１ｆｉｒｄｘＩｒ −１９Ｋ　Ｇ　Ｗ　Ｓ　ＣＩ　Ｉ　Ｉ、Ｆ　Ｌ　Ｖ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｔ　−５ａＡｉＸ７８０　ＡｒＩｃｒｃｃｃＡｌｌＪｃ！ＴＣＡＴＧＧＣＣＣ８１７ゐ［ヲ１コ −１９Ｈｉｍ工ＩＩ　Ｍ　Ｇ　％Ｉ　Ｓ　ＣＩ　工Ｌ　Ｆ　−１１＋　ＡＡＧ（ＴＴｒＡＣＡＧＴｒＡＣＴＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡτＣＡＴＣＣτＣＴ　U０ −１０　Ｌ　Ｖ　Ａ　Ｔ　Ａ　？　’ ゐ−α ７２１　ＴＡＴＡＧＧＱＡＥＣ７３１Ｆ〕（υ〆ｅＩＥＶ４９２補正書の写しく翻訳文）提出書く特許法＠１８４条ノ８）平成　５年　３月１６日目

Claims

【特許請求の範囲】

１．抗体鎖の可変部分の相補性決定傾城が第１の哺乳動物種から誘導され、かつ可変部分のフレームワークおよび存在する場合には抗体鎖のその、またはそれぞれの定常部分が第２の別の哺乳動物から誘導される抗体鎖を調製するに際し、（ｉ）前記第１の種の抗体鎖の可変部分をコードするＤＮＡのフレームワークーコード領域を変異させて、該変異フレームワークーコード領域に、前記第２の種から誘導される前記フレームワークをコードさせ；および（ｉｉ）工程（ｉ）からの該変異ＤＮＡを使用して前記抗体鎖を発現させること、を含んでなる抗体鎖の調製方法。
２．抗体重鎖の可変部分をコードするＤＮＡのフレームワークーコード傾城が、工程（ｉ）において変異を受ける請求の範囲第１項に記載の方法。
３．抗体軽鎖の可変部分をコードするＤＮＡのフレームワークーコード領域が、工程（ｉ）において変異を受ける請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
４．前記第１種がラットまたはマウスである上記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。
５．前記第２の種がヒトである上記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。
６．（ａ）前記第１の種の選択される抗体鎖の可変部分のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を決定し；（ｂ）前記可変部分のフレームワークが改変されるべき抗体のフレームワークを決定し；（ｃ）前記可変部分をコードするＤＮＡのフレームワークーコード領域を、変異フレームワークーコード領域が、工程（ｂ）で決定されるフレームワークをコードするように変異せしめ；（ｄ）工程（ｃ）で得られる変異ＤＮＡを、前記第２の種の定常部分をコードするＤＮＡと連結して、該ＤＮＡを発現ベクター中にクローン化し；ならびに、（ｅ）該発現ベクターを適合する宿主細胞内に導入し、該宿主細胞を抗体類が発現される条件下で培養することを含んでなる、上記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。
７．別の種の抗体類の最も相同的なフレームワークが、改変されるべき前記可変部分のフレームワークのためのフレームワークとして工程（ｂ）において選択される請求の範囲第６項に記載の方法。
８．前記第１の種の抗体が、ＣＤ４抗体である上記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。
９．前記抗体鎖が相補的抗体鎖と共に発現され、および前記２つの鎖を含む抗体が回収される上記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。
１０．ヒトＣＤ４抗原に結合可能な抗体であって、該抗体の軽鎖のＣＤＲが次のアミノ酸配列：ＣＤＲ１：ＬＡＳＥＤＩＹＳＤＬＡＣＤＲ２：ＮＴＤＴＬＱＮＣＤＲ３：ＱＱＹＮＮＹＰＷＴを有し、該抗体の重鎖のＣＤＲが次のアミノ酸配列：ＣＤＲ１：ＮＹＧＭＡＣＤＲ２：ＴＩＳＨＤＧＳＤＴＹＦＲＤＳＶＫＧＣＤＲ３：ＱＧＴＩＡＧＩＲＨを有し、および各鎖の可変部分のフレームワークおよび存在する場合には、その、またはそれぞれの定常部分が、ラット種ではない哺乳動物から誘導される抗体。
１１．前記ラット種ではない哺乳動物がヒトである請求の範囲第１０項に記載の抗体。
１２．該重鎖の可変部分フレームワークが、蛋白質ＫＯＬの重鎖可変部分フレームワークに相同的である請求の範囲第１１項に記載の抗体。
１３．該重鎖可変部分が図１０または図１２の上側行中に示されたアミノ酸配列を有する請求の範囲第１２項に記載の抗体。
１４．該重鎖の可変部分フレームワークが、蛋白質ＮＥＷの重鎖可変部分フレームワークに相同的である請求の範囲第１１項記載の抗体。
１５．該重鎖可変部分が図６または図７の上側行中に示されたアミノ酸配列を有する請求の範囲第１４項に記載の抗体。
１６．該軽鎖の可変部分フレームワークが、蛋白質ＲＥＩの可変部分フレームワークに相同的である請求の範囲第１１項〜第１５項のいずれか１項に記載の抗体。
１７．該軽鎖が図３の上側行中に示されたアミノ酸配列を有する請求の範囲第１６項に記載の抗体。
１８．製薬学的に許容される担体または希釈剤、および活性成分として請求の範囲第１０項〜第１７項のいずれか１項に記載の抗体を含有してなる医薬組成物。