PL168844B1

PL168844B1 - Sposób wytwarzania nowego inhibitora czynnika nekrotyzujacego nowotwory TNF PL PL

Info

Publication number: PL168844B1
Application number: PL90286089A
Authority: PL
Inventors: Michael T Brewer; Karin K Hale; Michael W King; Tadahiko Kohno; Charles Squires; Robert C Thompson; Rebecca W Vanderslice; James Vannice
Original assignee: Synergen Inc
Priority date: 1989-07-18
Filing date: 1990-07-17
Publication date: 1996-04-30
Also published as: NZ234499A; IL131281A0; EP0422339A1; GR3026416T3; EP0790306A2; HK1014539A1; NO306728B3; AU647397B2; IL95031A0; JPH03163099A; IE990595A1; DK0422339T3; CA2021369A1; PT94754B; ATE162801T1; DE69031997D1; PL286089A1; US6541620B1; FI903591A0; AU5897690A

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowego inhibitora czynnika nekrotyzujacego no- wotwory TNF, o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 19, metoda rekombinacji, znamienny tym, ze przygotowuje sie sekwencje DNA ukierun- kowujaca komórke gospodarza na produkcje inhibitora TNF, klonuje sie te sekwencje DNA w wektorze nadajacym sie do wprowadzania i replikacji w ca- lych komórkach, przy czym wektor ten zawiera elementy operacyjne potrzebne do ekspresji tej sekwencji DNA, wprowadza sie wektor zawierajacy syntetycz- na sekwencje DNA i elementy operacyjne do komórki gospodarza zdolnej do ekspresji DNA kodujacego inhibitor TNF, hoduje sie komórke gospodarza w warunkach pozwalajacych na amplifikacje wektora i ekspresje infibitora, zbiera sie ten inhibitor i pozwala na przyjecie przez ten inhibitor aktywnej struk- tury trzeciorzedowej o aktywnosci inhibitora TNF. 6. Sposób wytwarzania nowego inhibitora czynnika nekrotyzujacego nowotwory TNF, o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig 38, me- toda rekombinacji, znamienny tym, ze przygotowuje sie sekwencje DNA ukierunkowujaca komórke gospodarza na produkcje inhibitora TNF, klonuje sie te sekwencje DNA w wektorze nadajacym sie do wprowadzania i repli- kacji w calych komórkach, przy czym wektor ten zawiera elementy opera- cyjne potrzebne do ekspresji tej sekwencji DNA, wprowadza sie wektor zawierajacy syntetyczna sekwencje DNA i elementy operacyjne do komórki gospodarza zdolnej do ekspresji DNA kodujacego inhibitor TNF, hoduje sie komórki gospodarza w warunkach pozwalajacych na amplifikacje wektora i ekspresje inhibitora, zbiera sie inhibitor i pozwala na przyjecie przez ten inhibitor aktywnej struktury trzeciorzedowej o aktywnosci inhibitora TNF 10. Sposób wytwarzania nowego inhibitora czynnika nekrotyzujacego nowotwory TNF, wybranego z grupy obejmujacej inhibitor TNF o pierw- szych 184 aminokwasach jak przedstawiono na fig 38 (inhibitor TNF A 51), inhibitor TNF o pierwszych 182 aminokwasach jak przedstawiono na fig 38 (inhibitor TNF A 53), i deghkohzowany inhibitor TNF o calkowitej sekwen- cji aminokwasów przedstawionej na fig 38, metoda rekombinacji, zna- mienny tym, ze przygotowuje sie sekwencje DNA ... FIG 19 FIG 38 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania inhibitora czynnika nekrotyzującego nowotwory (TNF) metodą rekombinacji DNA.

Czynniki nekrotyzujące nowotwory są klasą białek wytwarzanych przez szereg typów komórek, obejmujących monocyty i makrofagi. Przynajmniej dwa czynniki nekrotyzujące nowotwory były opisane wcześniej, zwłaszcza TNF alfa i TNF beta (limfotoksyna).

Znane czynniki TNF wykazują ważne fizjologiczne działanie na szereg różnych komórek docelowych, biorących udział w odpowiedzi immunologicznej typu zapalnego. Białka te stymulują zarówno fibroblasty jak i komórki synowialne (komórki warstwy maziowej torebki stawowej) do wydzielania latentnej kolagenazy i prostaglandyny E2 oraz powodują resorpcję szpiku kostnego przez osteoblasty. Białka te zwiększają również powinowactwo powierzchniowe komórek śródbłonkowych do granulocytów · obojętnochłonnych. Powodują one również aktywność koagulacyjną komórek śródbłonkowych i redukują ich zdolność do rozpuszczania skrzepów. Dodatkowo odwracają aktywność adipocytów (komórek tkanki tłuszczowej) od gromadzenia lipidów przez zahamowanie ekspresji enzymu lipazy lipoproteinowej. •Czynniki TNF pobudzają komórki wątroby (hepatocyty) do syntezy klasy białek, znanych pod nazwą Odczynów fazy ostrej i mają działanie pyrogenne na podwzgórze. Dzięki poznaniu tych aktywności stało się jasne, że czynniki TNF odgrywają istotną rolę w odpowiedzi organizmu na stres, infekcję i zranienie. Patrz, np. artykuły P.J. Selby i in. w: Lancet, 27 lutego, 1988, str. 483; H.F. Starnes. Jr. i in. w: J.Clin. Invest. 82:1321 (1988); A. Oliff i in. w Cell 50: 555 (1987) i A.Waage i in. w: Lancet, 14 lutego, 1987, str. 355.

Jednak oprócz normalnych dobroczynnych efektów czynników TNF, wykryto okoliczności, w których ich aktywność jest szkodliwa. Na przykład, TNF alfa wstrzyknięty zwierzętom powoduje objawy szoku septycznego; obserwowano też wzrost poziomu endogennego TNF po wstrzyknięciu bakterii lub bakteryjnych ścian komórkowych. TNF powoduje również martwicę jelita i ostre zapalenie płuc oraz stymuluje katabolizm białek mięśni. Dodatkowo, zdolność czynników TNF do zwiększania poziomu kolagenazy w węzłach artretycznych i do kierowania chemotaksją i migracją leukocytów i limfocytów może być również odpowiedzialna za degradację chrząstki i proliferację tkanki synowialnej w tej chorobie. Tym, samym, czynniki TNF mogą być pośrednikami zarówno w ostrych jak i chronicznych stanach immunopatologicznych w reumatycznym artretyzmie. Czynniki TNF mogą być również odpowiedzialne za pewne anomalie w krzepnięciu krwi poprzez zmienianie funkcji komórek śródbłonkowych. Ponadto nadmierna produkcja TNF była obserwowana u pacjentów chorych na

168 844

AIDS; mogła ona być powodem stanów gorączkowych, odpowiedzi ostrej fazy i kacheksji (charłactwa)obserwowanych zarówno w przebiegu tej choroby jak i w leukemii.

W tych i innych przypadkach, w których TNF wykazuje szkodliwe efekty, wydaje się konieczne z punktu widzenia klinicznego zastosowanie inhibitora działania TNF. Inhibitory TNF, systematycznie stosowane, mogłoby się okazać skutecznymi lekami przeciwko szokowi septycznemu i kacheksji. Stosowane miejscowo, mogłoby zapobiegać niszczeniu tkanki w zapaleniu stanów i w miejscach innych stanów zapalnych. Ponadto inhibitory TNF mogłoby być nawet bardziej efektywne, gdyby były podawane w połączeniu z inhibitorami interleukiny-I (IL-1).

Jedna z terapeutycznych możliwości przeciwdziałania aktywności TNF dotyczy poziomu odpowiedzi komórkowej na białko. Wydaje, się, że TNF oddziaływuje na komórki za pośrednictwem klasycznego szlaku z wykorzystaniem receptorów jako pośredników. Zatem działanie TNF może regulować każda cząsteczka, która przeszkadza TNF w wiązaniu się z jego receptorami, zarówno przez blokowanie receptora, jak i przez blokowanie samego TNF. Kierując się tymi przesłankami, autorzy wynalazku poszukiwali sposobu otrzymywania białek i związków małocząsteczkowych, które były zdolne do inhibicji TNF w wyżej opisany sposób.

Sposób wytwarzania inhibitora czynnika nekrotyzującego nowotwory TNF metodą rekombinacji DNA, charakteryzuje się tym, że przygotowuje się sekwencję DNA ukierunkowującą komórkę gospodarza na produkcję białka o aktywności inhibitora TNF, klonuje się w wektorze tę sekwencję DNA nadającą się do wprowadzenia replikacji w całych komórkach, przy czym wektor ten zawiera elementy operacyjne do ekspresji tej sekwencji DNA, wprowadza się wektor zawierający syntetyczną sekwencję DNA i elementy operacyjne do komórki gospodarza zdolnej do ekspresji DNA kodującego inhibitor TNF, hoduje się komórki gospodarza w warunkach pozwalających na amplifikację wektora i ekspresję inhibitora, zbiera się ten inhibitor i pozwala na przyjęcie przez ten inhibitor aktywnej struktury trzeciorzędowej o aktywności ndubitora TNE

Sposób wytwarzania inhibitora czynnika nekrotyzującego nowotwory TNF metodą rekombinacji DNA kodującego TNF będący przedmiotem niniejszego wynalazku, pozwala na wytworzenie inhibitorów TNF a dodatkowo także biologicznie aktywnych analogów tego inhibitora. Otrzymywane sposobem według wynalazku oczyszczone postacie inhibitora TNF, których aktywność jest skierowana przeciwko TNF alfa pozwala na określenie ich sekwencji aminokwasowej. Oczyszczone postacie inhibitora TNF, otrzymywanego sposobem według wynalazku, są cenne jako preparaty lecznicze o aktywności skierowanej przeciwko TNF. Również oczyszczone kombinacje inhibitorów TNF i inhibitorów IL-1, mogą być wartościowe jako preparaty lecznicze, wykazujące działanie skierowane zarówno przeciwko IL-1 jak i TNF.

Realizując sposób według wynalazku, wyizolowano przynajmniej dwa białkowe inhibitory TNF o właściwościach hamujących działanie TNF. Białka te, o masie cząsteczkowej 30 kDa i 40 kDa otrzymano w postaci oczyszczonej. Otrzymano sekwencję ammokwasową białkowego inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa. Poznano również sekwencję aminokwasową białkowego inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa. Zarówno inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa, jak i inhibitor TNF o masie 40 kDa otrzymane sposobami według wynalazku są nowymi, wcześniej nie opisanymi białkami.

Autorzy prezentowanego wynalazku otrzymali klon ludzkiego genomowego DNA, który zawiera gen kodujący białko o masie cząsteczkowej 30 kDa. Zidentyfikowano źródło komórkowe tego białka, otrzymano klon cDNA i określono sekwencję kwasu nukleinowego genu kodującego to białko. Dodatkowo, gen ten umieszczono na wektorze i wykryto ekspresję białka w komórkach gospodarza. Ponadto proces ten udoskonalono w celu otrzymania oczyszczonego białka w postaci aktywnej.

Zidentyfikowano komórki, które produkują białko o masie cząsteczkowej 40 kDa, otrzymano klon cDNA i określono sekwencję kwasu nukleinowego genu kodującego to biał168 844 ko. Pełne klony cDNA, kodujące zarówno prekursor inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa, jak i prekursor inhibitora TNF o masie 40 kDa zostały poddane ekspresji w komórkach ssaków w celu otrzymania zwiększonej ilości miejsc wiązania TNF na powierzchni komórek.

Gen kodujący dojrzałą formę białka o masie cząsteczkowej 30 kDa został poddany ekspresji w E.coli. Trzy oddzielne geny kodujące całość lub części dojrzałego białka o masie cząsteczkowej 40 kDa były również poddawane ekspresji w E.coli. Wszystkie trzy wytwarzane białkowe inhibitory TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa, dojrzały inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa, inhibitor TNF A 51 o masie cząsteczkowej 40 kDa i inhibitor TNF A 53 o masie cząsteczkowej 40 kDa wykazywały aktywność skierowaną przeciwko TNF.

Dojrzały inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa, izolowany z podłoża stabilizowanego ludzkimi komórkami linii U937 oraz inhibitor TNF A 51 o masie cząsteczkowej 40 kDa i inhibitor TNF A 53 o masie cząsteczkowej A 53 określono wspólną nazwę inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa.

Inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa ma aktywność inhibitora TNF alfa. Inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa wykazuje aktywność hamującą działanie zarówno TNF alfa jak i TNF beta.

Sposób według wynalazku umożliwia wytwarzanie na dużą skalę tych inhibitorów TNF z wykorzystaniem technologii rekombinacji DNA. Inhibitory te powinny nadawać się do wykorzystania przy sporządzaniu receptur farmaceutycznych, użytecznych w leczeniu stanów patafizjologicznych, spowodowanych przez TNF.

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia oznaczenie cytotoksyczności TNF przy braku’ i w obecności /-x-x-/ inhibitora TNF 30 kDa. TNF w różnych stężeniach inkubowano z inhibitorem TNF 30 kDa lub bez. Oznaczenie cytotoksyczności przeprowadzano zgodnie z opisem podanym w przykładzie I.

Figura 2 przedstawia oznaczenie przesunięcia w natywnym żelu, gdzie a oznacza sam TNF, b oznacza TNF + inhibitor TNF (30 kDa).

Figura 3 przedstawia barwienie inhibitora TNF (30 kDa) peroksydazą i konkanawaliną A (Can A). Około 200 ng każdego białka rozdzielono w 14% żelu akrylamidowym w siarczanem dodecylu (żel SDS-PAGE) i przeniesiono na filtr nitrocelulozowy Glikoproteiny zidentyfikowano przy pomocy barwienia peroksydazą i Con A. Na rysunku a oznacza wzorzec masy cząsteczkowej, b oznacza albuminę z jaja kurzego (ovoalbuminę), c: oznacza albuminę z surowicy wołu i d oznacza inhibitor TNF (30 kDa).

Figura 4 przedstawia deglikozylację inhibitora TNF (30 kDa). Około 200 ng inhibitora TNF (30 kDa) poddano chemicznej deglikozylacji (ścieżka C) według opisu podanego w przykładzie I.

Figura 5 przedstawia działanie N-glikanazą na inhibitor TNF (30 kDa). Oczyszczony inhibitor TNF (30kDa) został poddany jodowaniu przy użyciu odczynnika Boltona-Huntera, a następnie zdenaturowana forma jodowanego inhibitora tNf (30 kDa) została poddana działaniu N-glikanazy przez 6 godzin w temperaturze 37°C. Na tej fig. a oznacza natywny inhibitor TNF (30 kDa), a b oznacza deglikozylowany inhibitor TNF (30 kDa).

Figura 6a przedstawia profil elucji przy OD_2g0 201 moczu z kolumny wypełnionej złożem DEAE Sefarozy CL-6B.

Figura 6 b przedstawia autoradiogram odpowiadającego przesunięciu żelu natywnego, pokazujący szczyt inhibitora TNF (30 kDa) we frakcjach 57-63, odpowiadających stężeniu 80 mM NaCl.

Figura 7 przedstawia profil elucji 0,05 M buforem sodowofosforanowym o pH 2,5 przy OD ₂₈₀ z kolumny powinowactwa do TNF.

Figura 8a i 8c przedstawiają profile elucji przy OD₂₁₅ i OD,_S() oczyszczenia inhibitora TNF (30 kDa) na kolumnie ze złożem RP 8 wraz z wynikami oznaczenia biologicznego L929 frakcji z kolumny RP8, pokazującego szczyt inhibitora TNF (30 kDa) we frakcjach 28-31, od6

168 844 powiadających stężeniu około 18% acetonitrylu i we frakcjach 35 i 36, które wynosi około 21 % acetonitrylu.

Figura 8b przedstawia barwienie srebrem rozdzielonych w 15% żelu SDS-PAGE puli białek, które zeszły z kolumny, wypełnionej złożem RP8. Barwienie to pokazuje pojedynczy prążek wielkości 30 kDa.

Figura 9a przedstawia oczyszczenie peptydu, otrzymanego przez trawienie inhibitora TNF (30 kDa) endoproteazą Lys-C.

Figura 9b przedstawia oczyszczenie alkilowanego peptydu, otrzymanego przez trawienie inhibitora TNF (30 kDa) endoproteazą (*) Lys-C.

Figura 10 przedstawia oczyszczenie dwóch alkilowanych peptydów, otrzymanych przez trawienie inhibitora TNF (30 kDa) endoproteazą (*) Asp-N.

Figura 11a i 11b przedstawiają oczyszczenie peptydu, otrzymanego przez trawienie endopeptydazą V 8 zredukowanej, karboksymetylowanej formy inhibitora TNF (30 kDa).

Figura 12 przedstawia sekwencję aminokwasów obecną w inhibitorze TNF (30 kDa). Puste miejsca (-) w sekwencji oznaczają te reszty, które nie zostały z całą pewnością zidentyfikowane przez sekwencjonowanie białka. C* oznacza zidentyfikowaną przez obecność 3H w reszcie karboksymetylocysteinę.

Figura 13 przedstawia sekwencję DNA klonu genomowego, kodującą przynajmniej część inhibitora TNF (30 kDa).

Figura 14 przedstawia przynajmniej 70% dojrzałej sekwencji aminokwasowej preferowanego inhibitora TNF.

Figura 15 przedstawia wykrycie inhibitora TNF w supematancie U927 przez oznaczenie przesunięcia w żelu.

Figura 16 przedstawia wykrycie inhibitora TNF we frakcji hplc z supematantu U937.

Figura 17 przedstawia hybrydyzację metodąNortherna, zgodnie z przykładem IV.

Figura 18 przedstawia deglikozylowany inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa, związany z TNF. Glikozylowany i deglikozylowany inhibitor TNF inkubowano z żelem powinowactwa TNF, a następnie frakcje niewiążące się z kolumną i eluaty z żelu powinowactwa analizowano na żelu SDS-PAGE. Na tej fig. przedstawiono następujące frakcje niewiążące się z kolumną: (11) TNF-INH (inhibitora TNF), zredukowanego i utlenionego, (21), deglikozylowanego TNF-INH, zredukowanego i utlenionego, (51) natywnego TNF-INH i eluaty: (12) TNF-INH, zredukowanego i utlenionego, (22) deglikozylowanego TNF-INH, zredukowanego i utlenionego i (52) natywnego TNF=INH.

Figura 19 przedstawia kompletną sekwencję aminokwasową inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa.

Figura 20 przedstawia sekwencję cDNA, kodującą sekwencję aminokwasową pokazaną na fig. 19.

Figura 21 przedstawia kompletną sekwencję cDNA, kodującą prekursor inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa.

Figura 22 przedstawia sekwencję DNA w pobliżu początku genu kodującego inhibitor TNF 30 kDa w plazmidzie pTNFIX-1.

Figura 23 przedstawia plazmid pCMVXV beta TNFBP stop A.

Figura 24 przedstawia plazmid pSVXVTNFBP stop A.

Figura 25 przedstawia profil elucji przy OD,_I5 inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa z E.coli z kolumny, wypełnioną złożem RP 8. Wyniki testu biologicznego L929 są również oznaczone znakiem (-x-x).

Figura 26 przedstawia barwiony srebrem rozdział frakcji z kolumny RP 8 z fig. 25 w 14% żelu SDS-PAGE.

Figura 27 przedstawia profil elucji przy OD,_]5 inhibitora TNF z linii komórkowej U937 z kolumny wypełnionej złożem RP 8. Wyniki biologicznego testu L929 są również pokazane za pomocą kresek. Widoczne są dwa charakterystyczne szczyty inhibitora TNF.

168 844

Figura 28 przedstawia barwiony srebrem 14% żel SDS-PAGE z rozdziałem frakcji z kolumny RP 8. Frakcja numer 30 zawiera inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa, a frakcja numer 35 zawiera inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa.

Figura 29 przedstawia profil elucji OD,₁₅ z oczyszczania inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa, pochodzącego z moczu. Drugie szczyty inhibicji TNF z poszczególnych chromatografii RP 8 połączono i zanalizowano na kolumnie RP 8. Aktywność inhibicyjna jest zaznaczona za pomocą kresek. Różnica między szczytem OD₂₁₅ i szczytem aktywności odzwierciedla martwą objętość kolumny między detektorem i kolektorem frakcji.

Figura 30 przedstawia barwiony srebrem 14%o żel SDS-PAGE z rozdziałem frakcji moczu na złożu RP 8. Frakcja numer 32 zawiera inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa.

Figura 31 przedstawia końcową sekwencję aminokwasów z inhibitorów (30 kDa i 40 kDa) pochodzących z linii komórkowej U937 i pochodzącego z moczu inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa.

Figura 32 przedstawia oczyszczenie peptydu, otrzymanego przez trawienie endopeptydazą V 8 inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa.

Figura 33 przedstawia oczyszczenie peptydu, otrzymanego przez trawienie endoproteazą Arg-C inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa.

Figura 34 przedstawia oczyszczenie trawionego trypsynąpeptydu Arg-C16.

Figura 35 przedstawia oczyszczenie trawionego chymotrypsyna peptydu Arg-C10.

Figura 36 przedstawia strukturę pierwszorzędową inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa.

Figura 37 przedstawia fragment sekwencji cDNA, kodującego inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa wraz z przewidywaną sekwencją aminokwasową produktu translacji.

Figura 38 przedstawia kompletną sekwencję aminokwasów inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa.

Figura 39 przedstawia całkowitą sekwencje cDNA, kodującą prekursor inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa wraz z wydedukowanym produktem translacji.

Figura 40 przedstawia oznaczenie cytotoksyczne TNF beta (limfotoksyny) w obecności (o-o) inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa, w obecności (.-.) inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa i bez inhibitora (x-x).

Figura 41 przedstawia ekspresję sekwencji cDNA, kodującej inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa, w linii komórkowej COS7. Komórki COS były transfekowane plazmidami, stosowanymi w procedurze z użyciem lipofektyny według Feignera i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. /USA/ 84, 7413-1987). 3,4xl0⁵ komórek inkubowano z oznaczoną ilością [¹²⁵ I] TNFa przy specyficznej aktywności 5,6xl0⁴ cpm/ng i oznaczono ilość izotopu związanego przez komórki. Niezamalowane symbole oznaczają całkowitą ilość cpm związaną przez komórki po 4 godzinach inkubacji w 4°C. Zamalowane symbole oznaczają ilość związanego [¹²-5 I] TNFa w obecności 180-krotnego nadmiaru nieznakowanego radioaktywnie TNFa.

Figura 42 przedstawia ekspresję sekwencji cDNA, pokazanej na rycinie 39 i kodującej inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa, w komórkach COS7. Warunki oznaczenia są takie, jak przedstawiono na rycinie 41. Zaciemnione symbole oznaczają związany p²⁵1] TNFa w obecności 180-krotnego nadmiaru nieznakowanego radioaktywnie TNFa.

Figura 43 przedstawia cytotoksyczne oznaczenie frakcji HPLC RPC-8 ludzkich monoeytów poddanych działaniu PMA (forbolu mirystynian-12, octan-13) i PHA (fitohemaglutyniny) przez 24 godziny.

Figura 44 przedstawia profil elucji ze złoża RPC-8 inhibitora TNFA 51 o masie cząsteczkowej 40 kDa, analizę frakcji żelu poliakrylamidowym z SDS (PAGE) (B) i oznaczenie cytotoksyczne, wykonano na komórkach linii L929 (C).

Figura 45 przedstawia profil elucji inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa A 53 z kolumny wypełnionej złożem RPC-8 (A), analizę frakcji w żelu SDS-PAGE (B) i wyniki oznaczenia cytotoksycznego w komórkach L929 (C).

168 844

Niżej opisano bardziej szczegółowo postacie sposobu według wynalazku oraz podano przykłady, ilustrujące sposób według wynalazku.

1. Inhibitor

Jak już wspomniano, sposób według wynalazku dotyczy wytwarzania inhibitorów TNF, wyizolowanych w oczyszczonej postaci. Inhibitor TNF wydzielono z moczu. Sposób według wynalazku obejmuje wytwarzanie oczyszczonych inhibitorów TNF, które są biologicznie równoważne inhibitorowi wyizolowanemu z moczu. W całym opisie, każda wzmianka o inhibitorze TNF lub po prostu o inhibitorze powinna być interpretowana w odniesieniu do inhibitorów zidentyfikowanych i opisanych w niniejszym zgłoszeniu.

Przez równoważnik biologiczny, tak jak termin ten jest używany w opisie, rozumie się związki, wytworzone sposobem według wynalazku, która są zdolne zapobiegać działaniu TNF w podobny sposób, lecz niekoniecznie do tego samego stopnia jak natywny inhibitor wyizolowany z moczu. Stosowane w opisie określenie istotnie homologiczny, oznacza stopień homologii do natywnego inhibitora TNF izolowanego z moczu w nadmiarze, który nie został osiągnięty dla żadnego z opisanych poprzednio inhibitorów TNF. Pożądany jest stopień homologii ponad 70%, jeszcze bardziej pożądany jest stopień homologii ponad 80%, a optymalne są stopnie homologii ponad 90%, 95% lub nawet 99%. Optymalne grupy inhibitorów TNF wykazują ponad 95% homologii do natywnego inhibitora. Procent homologii opisany tutaj jest obliczony jako procent reszt aminokwasowych, znajdujących się w krótszej z dwóch sekwencji, zestawionych ze sobą identycznymi resztami aminokwasowymi w sekwencjach porównywanych. Porównanie tych sekwencji umożliwiło wprowadzenie czterech przerw na odcinku długości 100 aminokwasów. Metoda ta została przedstawiona przez Daynhoffa w: Atlas of Protein Sequence and Structure (Atlas sekwencji i struktury białek), t.5, str. 124 (1972), National Biochemical Research Fundation, Waszyngton, D.C., co zostało wykorzystane w niniejszym opracowaniu. Termin istotnie homologiczny obejmuje również te inhibitory TNF, które można izolować za pomocą reakcji krzyżowej z przeciwciałami przeciwko opisanemu inhibitorowi lub, których geny mogą być izolowane przez hybrydyzację z fragmentami lub całym ganem opisanego inhibitora.

Najlepsze inhibitory pochodziły z moczu i po raz pierwszy zostały wyizolowane w postaci oczyszczonej. Stosowane w opisie określenie czysta postać lub postać oczyszczona, używana w odniesieniu do opisanych tutaj inhibitorów TNf, oznacza preparat zasadniczo wolny od innych białek, które nie są białkowymi inhibitorami TNF. Pożądane inhibitory TNF w prezentowanym wynalazku są czyste przynajmniej w 50%, jeszcze bardziej cenione w 75% i optymalne - w 80%, 95% i 99%. Preparatyka białkowego inhibitora TNF jest wystarczająco czysta, aby umożliwić zastosowanie jednej z powszechnie stosowanych technik określenia sekwencji aminokwasów, bez przeprowadzania następnych etapów oczyszczania, jak czyniono to poprzednio.

Przy użyciu metod prezentowanych w przykładach wyizolowano przynajmniej dwa inhibitory TNF. Te dwa inhibitory mają odpowiednio przeciętną masę cząsteczkową około 30 kDa i około 40 kDa, określoną na podstawie migracji w żelu SDS-PAGE. Inhibitor o masie 30 kDa eluuje się z kolumny z DEAE CL6B celulozy 80 milimolamym NaCl w buforze Tris, pH 7,5. Sekwencję inhibitora o masie cząsteczkowej 30 kDa przedstawiono na fig. 19, a sekwencję aminokwasową inhibitora o masie cząsteczkowej 40 kDa przedstawiono na fig. 38. Wykazano, że inhibitor TNF o masie 30 kDa hamuje aktywność TNF alfa i ma niewielki wpływ na aktywność TNF beta. Inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa charakteryzuje się silnie hamującym działaniem zarówno na TNF alfa jak i na TNF beta (limfotoksynę).

2. Inhibitor izolowany z hodowli komórek linii U937.

Inhibitory TNF izolowano także z hodowli ludzkich komórek linii U937. W hodowli tej zidentyfikowano i wyizolowano z niej dwa białka o aktywności inhibitorów TNF. Oba inhibitory TNF, będące białkami o masie cząsteczkowej 30 kDa i 40 kDa., wykazują istotną homologię do inhibitorów TNF o masie odpowiednio 30 kDa i 40 kDa izolowanych z moczu i są im biologicznie równoważne.

168 844

3. Struktura inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa.

Inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa izolowany z moczu jest glikoproteiną, zawierającą przynajmniej jedną resztę węglowodanową. Naturalny inhibitor TNF jest deglikozylowany i zachowuje zdolność do wiązania się z TNF. Całkowicie i częściowo deglikozyłowany inhibitor TNF o masie 30 kDa ma masę cząsteczkową około 18 kDa.

Zidentyfikowana sekwencja genowa, kodująca białko o masie cząsteczkowej 30 kDa nie zawiera kodu terminacyjnego, więc może brać udział w tworzeniu sekwencji aminokwasowej białka o masie 18 kDa. Wynalazcy wysuwają teorię (nie ograniczając się jednak jej założeniami w swoich badaniach), że białka wytwarzane in vivo zawierają dodatkowe sekwencje aminokwasowe. Zgodnie z tą teorią, kodowane białko jest cząsteczką receptorową dla TNF. Białko inhibitorowe, kodowane przez cDNA posiada sekwencję hydrofobową, która prawdopodobnie jest zgodna z sekwencjami aminokwasowymi dwóch regionów receptora TNF: regionu zakotwiczającego receptor w błonie komórkowej i regionu wiążącego TNF, wystającego poza błonę komórkową na zewnątrz komórki. Zgodnie z tą hipotezą i opisem w przykładzie 19, cDNA był poddany ekspresji w komórkach COS, co doprowadziło do wzrostu ilości miejsc wiążących TNF na powierzchni komórki. Odkryte inhibitory TNF są zatem częściami cząsteczki receptora. Te wiążące fragmenty zidentyfikowono jako receptory rozpuszczalne w odniesieniu do innych cząsteczek, wykazujących aktywność zarazem wiążącą i hamującą (na przykład inhibitor IL-2 /interleukiny 2/).

Teoria ta pozostaje w logicznym związku z brakiem kodu termicznego w sekwencji nukleotydowej, kodującej białko o masie cząsteczkowej 30 kDa, która mogłaby odpowiadać końcowej części białka, jak zostało to przewidziane dzięki znanej sekwencji wyizolowanego czynnika o właściwościach inhibitora TNF. Teoria ta jest również zgodna z faktem, że sekwencja nukleotydowa, leżąca poza wyżej wspomnianą, w której powinien znajdować się kodon terminacyjny, koduje serie aminokwasów hydrofobowych.

Sposób według wynalazku obejmuje zatem wytwarzanie nie tylko części zidentyfikowanych i opisanych inhibitorów TNF, ale również wszystkie białka, zawierające każdy fragment sekwencji aminokwasowej, kodowany przez sekwencje cDNA zidentyfikowane i opisane w niniejszym opisie.

4. Struktura inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa.

Inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa, wyizolowany z hodowli komórek ludzkich linii U937 i zidentyfikowany w moczu jest glikoproteiną, zawierającą przynajmniej jedną resztę węglowodanową. Naturalny inhibitor TNF o masie 40 kDa jest deglikozylowany. Deglikozylowany inhibitor TNF o masie 40 kDa. zachowuje zdolność do wiązania zarówno TNF alfa jak i TNF beta (limfotoksyny). Wynalazcy przypuszczają, że inhibitor TNF o masie 40 kDa również jest rozpuszczalnym receptorem. Zidentyfikowana sekwencja genowa, kodująca białko o masie 40 kDa nie zawiera kodonu terminacyjnego jak można przewidywać dla sekwencji aminokwasowej deglikozylowanego inhibotora TNF o masie 40 kDa. Jak opisano w przykładzie XX, cDNA był poddawany ekspresji w komórkach COS, co spowodowało wzrost ilości miejsc wiązania dla TNF na powierzchni komórki.

Zastosowano gen kodujący dojrzałe białko o masie 40 kDa, wyizolowano z hodowli ludzkich komórek U937, zidentyfikowane poprzednio w moczu oraz większych i mniejszych części tego genu aż do tych obszarów, których produkty nie mają żadnej aktywności hamującej. Jak to przedstawiono w objaśnieniu do fig. 38, dojrzały inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa ma region bogaty w reszty proliny, usytuowany w pobliżu przewidywanego C-końca białka. Inhibitory TNF o. masie 40 kDa, w których całość lub część rejonu bogatego w reszty prolinowe nie jest zawarta w białku, lecz białko to mimo tego pozostaje aktywnym inhibitorem TNF, są również wytwarzane sposobem według wynalazku. Dwa skrócone w ten sposób białka opisano niżej w przykładach XVII i XXIII, i ze względu na ich związek z inhibitorem TNF o masie 40 kDa nazywano je inhibitorem TNFM 51 o masie 40 kDa i inhibitorem TNF Δ 53 o masie 40 kDa. Wszystkie części tego zgłoszenia, odnoszące się w ogólności

168 844 do inhibitora TNF o masie 40 kDa będą obejmowały dojrzałe białko o masie 40 kDa, jak również inhibitor TNF o A 51 o masie 40 kDa i inhibitor TNF A 53 o masie 40 kDa.

Powszechne jest przekonanie, że przynajmniej jeden z receptorów TNF jest zdolny do wiązania zarówno TNF alfa jak i TNF beta, podczas gdy inne receptory -TNF są zdolne do wiązania tylko TNF alfa. Pozostaje to w zgodzie z prezentowanymi tutaj odkryciami, że spośród dwóch zidentyfikowanych inhibitorów TNF, które są przypuszczalnie aktywnymi fragmentami miejsc receptorowych TNF, jeden kierują swoją aktywność tylko przeciwko TNF alfa, a drugi jest aktywny zarówno przeciwko TNF alfa jak i TNF beta.

5. Wytwaazznie iifiiibitora ottzymanego metodami DNA.

Opisana metoda rekombinacji DNA służy do wytwarzania inhibitora TNF sposobem według wynalazku. Aktywne miejsce produktu otrzymywanego sposobem według wynalazku funkcjonuje w sposób równoważny biologicznie funkcjonowaniu inhibitora TNF, wyizolowanego z moczu. Naturalna lub syntetyczna sekwencja DNA może być użyta do bezpośredniego wytwarzania takich inhibitorów TNF.

(a) W sposobie tym przygotowuje się sekwencję DNA ukierunkowującą komórkę gospodarza na produkcję białka o aktywności inhibitora TNF, klonuje się tą sekwencję DNA w wektorze, zawierającym elementy potrzebne do ekspresji tej sekwencji DNA, wprowadza się ten wektor, zawierający syntetyczną sekwencję DNa i elementy operacyjne do komórki gospodarza, zdolnej do ekspresji DNA, kodującego inhibitor TNF (lub jego prekursor), hoduje się komórki gospodarza w warunkach pozwalających na emplifikncję wektora i ekspresję inhibitora lub jego prekursora, uzyskuje się inhibitor lub jego prekursor i tworzy się warunki, pozwalające inhibitorowi na utworzenie aktywnej struktury trzeciorzędowej, dzięki której posiada on aktywność inhibitora TNF lub może podlegać procesowi dojrzewania, w wyniku którego dopiero osiągnie tę aktywność.

W jednej z postaci sposobu według wynalazku inhibitor TNF jest produkowany przez komórkę gospodarza w postaci białka prekursorowego. To białko prekursorowe podlega procesowi dojrzewania w jednym lub większej licznie etapów i pozwala, za pomocą powszechnie stosowanych technik, na przeprowadzenie procesu przestrzennego formowania jego cząsteczki w taki sposób, że cząsteczka ta nabiera aktywności inhibitora TNF.

(b) Stosowana sekwencja DNA

Sekwencje DNA, które były brane pod uwagę do stosowania w sposobie według wynalazku, omówiono częściowo w przykładach VI, XIVa,XVII. Sekwencje te obejmują syntetyczne i naturalne fragmenty DNA jak również ich kombinacje. Naturalne sekwencje zawierają dodatkowo segmenty cDNA lub genomowego DNA.

Środki do syntetycznego tworzenia sekwencji polinukleotydowych, kodujących białko identyczne z białkiem kodowanym przez sekwencje polinukleotydowe cDNA lub genomowe, są jedną z powszechnie znanych technik. W celu poznania obecnego stanu technik związanych z syntezą polmukleotydów, patrz: Matteucci, M.D. i Caruthers, M.H. w J. Am. Chem. Soc. 103; 3185 oraz Beaucage, S.L. i Caruthers, M.H. w Tetrahedron Lett. 22: 1859 (1981) i instrukcja, dołączona do syntetyzatora oligonukleotydów typu ABI (do każdej z tych pozycji odnoszono się praktycznie w niniejszej pracy).

Te syntetyczne sekwencje mogą być identyczne z sekwencjami naturalnymi, szczegółowo opisanymi niżej lub mogą zawierać zmienione nukleotydy. W jednym z opisanych przypadków, jeżeli sekwencja zawiera pojedyncze nukleotydy różne od występujących w opisanych tu naturalnych sekwencjach DNA, przewidziano, że te inne sekwencje nadal kodują polipeptyd o takiej samej strukturze jak inhibitor TNF izolowany z moczu. W innym przypadku syntetyczna sekwencja posiadająca o innych nukleotydach będzie kodować polipeptyd, który ma taką samą aktywność jak opisany tutaj inhibitor TNF.

Dodatkowo, sekwencja DNA może być fragmentem naturalnej sekwencji, to znaczy fragmentem polinukleotydowym, który występuje w naturze i który został wyizolowany i oczyszczony po raz pierwszy przez autorów prezentowanego wynalazku. W jednym przypadku sekwencja DNA jest fragmentem restrykcyjnym wyizolowanym z biblioteki cDNA.

168 844

W innym przypadku, sekwencja DNA jest izolowana z biblioteki genomu ludzkiego. Przykład biblioteki, użytecznej w tym przypadku, został przedstawiony przez Wymana i in. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 2880-2884.

W celu ’ osiągnięcia optymalnej wersji tej biblioteki naturalną sekwencję DNA przygotowuje się:

(a) sporządzając bibliotekę’ ludzkiego cDNA, korzystnie z komórek linii U937. zdolnych do wytwarzania inhibitora TNF, (b) w wektorze i komórce zdolnej do amplifikacji i ekspresji całości lub części tego cDNA, przeszukując tę bibliotekę ludzkiego DNA co najmniej jedną sondą molekularną, zdolną do wiązania genu kodującego inhibitor TNF lub jego produktu białkowego;

(c) identyfikując co najmniej jeden klon, zawierający gen kodujący ten inhibitor, na podstawie zdolności tego klonu do wiązania co najmniej jednej sondy molekularnej dla genu lub jego produktu białkowego;

(d) kodując ten gen lub część genu kodującego inhibitor z wybranego klonu lub klonów, i (e) przyłączając gen lub jego odpowiednie fragmenty do elementów operacyjnych, niezbędnych do utrzymania i ekspresji genu w komórce gospodarza.

Naturalne sekwencje DNA, stosowane w sposobie według wynalazku, przygotowuje się:

(a) sporządzając ludzką bibliotekę genomową, korzystnie w gospodarzu recBC, sbc; a zwłaszcza w szczepie CES 200;

(b) przeszukując tę ludzką bibliotekę genomową co najmniej jedną sondę molekularną, zdolną do wiązania genu kodującego inhibitor TNF lub jego produktu białkowego;

(c) identyfikując co najmniej jeden klon, zawierający gen kodujący inhibitor, na podstawie zdolności tego klonu do wiązania przynajmniej jednej sondy molekularnej genu lub jego produktu białkowego.;

(d) izolując gen kodujący inhibitor ze zidentyfikowanego klonu lub klonów, i (e) przyłączając ten gen lub jego odpowiednie fragmenty do elementów operacyjnych niezbędnych do utrzymania i ekspresji tego genu w komórce gospodarza.

Trzecią potencjalną metodę identyfikacji i izolacji naturalnych sekwencji DNA, stosowanych w sposobie według wynalazku realizuje się:

(a) sporządzając mRNA z komórek wytwarzających inhibitor TNF;

(b) syntetyzując z tego mRNA jedno- lub dwuniciowy cDNA;

(c) amplifikując specyficzne dla inhibitora TNF sekwencje DNA, obecne w tej mieszaninie sekwencji cDNA za pomocą łańcuchowych reakcji polimerazy DNA stosując startery przedstawione w tabeli V;

(d) idenyfikując produkty reakcji łańcuchowej polimerazy PCR, zawierające sekwencje obecne w innych sondach oligonukleotydowych, przedstawionych w tabeli V, za pomocą analizy blottingu metodą Southema;

(e) subklonując tak zidentyfikowane fragmenty DNA w wektorach M13 umożliwiające bezpośrednie sekwencjonowanie sekwencji DNA;

(f) izolując klony cDNA z biblioteki cDNA z zastosowaniem wytworzonych sekwencji DNA, i (g) przyłączając gen lub jego odpowiednie fragmenty do elementów operacyjnych DNA, niezbędnych do utrzymania i ekspresji genu w komórkach gospodarza.

Do zastosowania wyżej opisanej metody wygodne byłoby znalezienie dwóch miejsc restrykcyjnych zlokalizowanych we wnętrzu odpowiedniego genu lub jego fragmentu kodującego natywne białko lub jego część. Miejsca te powinny znajdować się w pobliżu końca sekwencji kodującej. Ten kodujący segment DNA, zawierający odpowiedni gen lub jego fragment wyodrębnia się następnie z pozostałego materiału genetycznego przy użyciu odpowiednich endonukleaz restrykcyjnych. Po wycięciu, 3' i 5' końce sekwencji DNA oraz połączenia intronów i egzonów rekonstruuje się w celu otrzymania odpowiedniej sekwencji DNA kodującej N12

168 844 i C- koniec oraz wnętrze białkowego inhibitora TNF. Ponadto sekwencję tę rekonstruuje się w postaci nadającej się do połączenia z operacyjnymi elementami DNA.

Jak opisano niżej w przykładzie XVII, sekwencja DNA użyta do ekspresji inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40kDa może być modyfikowana przez usunięcie zarówno 153 jak 159 par nukleotydów z genu kodującego dojrzały inhibitor TNF o masie 40 kDa, izolowany z podłoża stabilizowanego ludzkimi komórkami U937 i zidentyfikowany w moczu. Gen Δ 53 otrzymano przez usunięcie z orginalnego genu obszaru kodującego szlak prolinowy na C-końcu białka, a gen Δ 51 otrzymano przez przybliżenie C-końca genu, kodującego inhibitor TNF o masie 40 kDa.

Sekwencja DNA, wyizolowana zgodnie z tą metodą z biblioteki cDNA i kodująca przynajmniej część opisanego tutaj inhibitora TNF o masie 30 kDa, została zdeponowana w American Type Cultural Collection w Rockville, M.D. pod numerem 40645.

Sekwencja DNA, wyizolowana zgodnie z tymi metodami z biblioteki cDNA i kodująca przynajmniej część opisanego tu inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa, została zdeponowana w American Type Cultural Collection, Rockville, MD, pod numerem 68204.

6. Wektory

Mikroorganizmy, zwłaszcza E. coli.

Wektory, rozważane pod względem przydatności do stosowania w sposobie według wynalazku, obejmowały wszystkie rodzaje wektorów, do których mogła zostać wbudowana omawiana wyżej sekwencja DNA, razem z pożądanymi lub niezbędnymi elementami operacyjnymi, i które to wektory mogły być następnie wprowadzone do komórki gospodarza i podlegać tam replikacji. Najlepsze do tego celu były wektory z dobrze poznanymi miejscami restrykcyjnymi oraz posiadające elementy operacyjne pożądane lub konieczne do transkrypcji sekwencji DNA. Tym niemniej można wyobrazić sobie stosowanie jeszcze nie opisanych wektorów, mogące zawierać jedną lub więcej opisanych tutaj sekwencji DNA. W szczególności pożądane jest, aby wszystkie te wektory charakteryzowały się niektórymi lub wszystkimi z niżej wymienionych cech: (1) minimalną ilością sekwencji DNA organizmu-gospodarza; (2) stabilnym utrzymywaniem i namnażaniem w komórkach żądanego gospodarza; (3) wysoką ilością kopii w żądanym gospodarzu; (4) posiadaniem promotora, podlegającego regulacji i zorientowanego w sposób, który umożliwia mu rozpoczynanie transkrypcji żądanego genu; (5) posiadaniem przynajmniej jednego markera, kodującego cechę selekcyjną, która umożliwia odróżnienie plazmidów, w które została wbudowana obca, żądana sekwencja DNA od plazmidów niezrekombinowanych; (6) posiadaniem sekwencji DNA, będącej sygnałem zakończenia transkrypcji.

Wektory stosowane w sposobie wynalazku do klonowania i ekspresji żądanych sekwencji DNA, posiadały różne elementy operacyjne. Te elementy operacyjne, zawierają przynajmniej jeden promotor, przynajmniej jedną sekwencję Shine-Dalgamo i kodon startowy oraz przynajmniej jeden kodon terminacyjny. Bardziej doskonałe elementy operacyjne mają również co najmniej jeden operator, co najmniej jedną sekwencję liderową dla białka, które ma być eksportowane z przestrzeni wewnątrzkomórkowej, co najmniej jeden gen kodujący białka regulatora i inne sekwencje DNA potrzebne łub korzystne do przeprowadzenia odpowiedniej transkrypcji i translacji DNA wektora.

Niektóre z tych elementów operacyjnych mogą być obecne w każdym z korzystnych wektorów, stosowanych w sposobie według wynalazku. Przyjęto, że każdy dodatkowy element operacyjny, który mógłby okazać się potrzebny, może być dołączony do wektora przy użyciu powszechnie znanych metod, zwłaszcza opisanych w niniejszym opisie.

W praktyce istnieje możliwość skonstruowania każdego z tych wektorów w taki sposób, aby można było je łatwo izolować, dzielić na różne składowe, a następnie składać te sekwencje w różnych kombinacjach. Jest to udogodnienie polegające na tym, że można otrzymać szereg funkcjonalnych genów z łożonych z kombinacji tych elementów i sekwencji DNA regionów kodujących. Ponadto wiele tych elementów może znaleźć zastosowanie w więcej niż jednym gospodarzu. Dodatkowo zaplanowano, że wektory te, w pewnych korzystnych posta168 844 ciach sposobu według wynalazku, zawierają regulacyjne sekwencje- DNA (operatory) lub inne sekwencje zdolne do kodowania białek regulacyjnych.

fil Regulatory \ z w

Regulatory w jednej z postaci sposobu według wynalazku służą do zapewnienia ekspresji sekwencji DNA w pewnych warunkach środowiska i, w innych warunkach środowiska, będą umożliwiały transkrypcję i odpowiednią ekspresję białka, kodowanego przez tę sekwencję DNA. Szczególnie korzystne jest, że segmenty regulacyjne są umieszczone w wektorze w taki sposób, że ekspresja żądanej sekwencji DNA nie zachodzi lub zachodzi w znacznie zredukowanym stopniu w nieobecności na przykład izopropylu-beta-D-galaktozydu (IPTG). W tej sytuacji, hodowla transformowanych mikroorganizmów zawierających żądaną sekwencję DNA może rosnąć do żądanej gęstości, zanim zostanie rozpoczęta ekspresja inhibitora TNF. W tej postaci sposobu według wynalazku, ekspresję żądanego białka inkubuje się przez dodanie do środka mikroorganizmów substancji, powodującej ekspresję odpowiedniej sekwencji DNA po osiągnięciu przez hodowlę żądanej gęstości.

(ii) Promotory

Wektory ekspresyjne muszą zawierać promotory, które mogą być użyte przez organizm gospodarza do ekspresji jego własnych białek. Do tego celu od dawna powszechnie stosuje się system promotora laktazowego; wyizolowano również i scharakteryzowano inne promotory mikroorganizmów, które można użyć do ekspresji rekombinacyjnego inhibitora TNF.

(iii) Terminator transkrypcji

Opisane tutaj terminatory transkrypcji służą do stabilizacji wektora. W szczególności włączono do niniejszego opisu sekwencje opisane przez M. Rosenberga i D. Courta w: Ann. Rev. Genet. 13: 319-353 (1979).

(iv) Sekwencje nie podlegające translacji.

Należy zauważyć, że w korzystnej postaci sposobu według wynalazku może być wymagana rekonstrukcja 3' lub 5' końca regionu kodującego w celu umożliwienia włączenia do transkryptu genowego 3' lub 5' końca sekwencji nie podlegającej translacji. Wśród tych sekwencji nie podlegających translacji są takie, które stabilizują mRNA; sekwencje te opisali U. Schmeissner, K. McKenney,,M. Rosenberg i M. Court w: J. Mol. Biol. 176: 39-53 (1984). Sekwencje te znalazły zastosowanie w sposobie według wynalazku.

(v) Miejsca wiążące rybosomy

Ekspresja obcych białek w mikroorganizmach wymaga pewnych elementów operacyjnych, do których należą (aczkolwiek nie wyczerpują. zestawu koniecznych elementów) miejsca wiążące rybosomy. Miejsce wiążące rybosomy jest sekwencją, która rybosom rozpoznaje i wiąże się do niej w procesie inicjacji syntezy białka, jak to przedstawili L. Gold i inni w: Ann. Rev. Macrobio, 35: 557-580 lub D.M. Marquis i inni w Gene 42: 175-183 (1986), co zastosowano w praktyce w sposobie według wynalazku. Optymalną sekwencją wiążącą rybosomy jest GAGGCGCAAAAA(ATG).

(vi) Sekwencja sygnałowa i złącze translacji.

Dodatkowo pożądane jest, aby sekwencja, kodująca odpowiedni sygnał (lider) sekrecyjny była obecna na 5' końcu genu, jak to przedstawiono w pracy M.E. Watsona i in. w: Nacleic Acid Res. 13: 5145-5163, co podano w odnośnikach, jeśli białko to ma być wydzielane z cytoplazmy. DNA, kodujący sekwencję sygnałową musi znajdować się w pozycji, umożliwiającej produkcję białka fuzyjnego, w którym sekwencja ta bezpośrednio i kowalencyjnie jest połączona z inhibitorem. Taka postać białka jest zapewniona przez brak sygnałów terminacji transkrypcji i i translacji między tymi dwoma kodującymi sekwencjami DNA (sekwencją sygnałową i sekwencją inhibitora). Obecność sekwencji sygnałowej jest wymagana z jednego lub więcej powodów, wymienionych niżej. Po pierwsze, obecność tej sekwencji może ułatwiać przeprowadzanie procesu dojrzewania inhibitora TNF w komórce gospodarza. W szczególności, sekwencja sygnałowa może ukierunkowywać cięcie enzymatyczne pierwotnego produktu translacji przez peptydazę sygnałową, które prowadzi do jeje usunięcia z pozostawieniem peptydu o sekwencji aminokwasowej, która ma potencjalną aktywność dojrzałego biał14

168 844 ka.Po drugie, obecność sekwencji sygnałowej może ułatwiać oczyszczenie inhibitora TNF poprzez skierowanie tego białka na zewnątrz komórki. W niektórych gatunkach makroorganizmów, będących gospodarzami, obecność odpowiedniej sekwencji sygnałowej, pozwala na transport kompletnego białka do przestrzeni periplazmatycznej, jak to się dzieje w przypadku, E. coli. W przypadku niektórych szczepów E. coli i Saccharomyces oraz szczepów Bacillusi Pseudomonas, odpowiednia sekwencja sygnałowa pozwala na transport białka przez błonę komórkową i na zewnątrz komórki. W tej sytuacji, białko może być oczyszczone z białek zewnątrz-komórkowych. Po trzecie, w przypadku niektórych białek wytwarzanych sposobem według wynalazku, obecność sekwencji liderowej może być konieczna do zlokalizowania kompletnego białka w środowisku, gdzie białko przybiera aktywną strukturę, która to struktura ma odpowiednią aktywność białka.

W jednej z korzystnych postaci sposobu według wynalazku dodatkowa sekwencja DNA bezpośrednio poprzedza sekwencję DNA, kodującą inhibitor TNF. Ta dodatkowa sekwencja DNA funkcjonuje jako złącze translacji, to znaczy koduje ona RNA (przylegający do RNA, kodującego inhibitor TNF), który, ustawia rybosomy w pozycji przylegające do miejsca wiążącego je. W jednej z postaci wynalazku, złącze translacji otrzymuje się stosując sekwencję DNA.

TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG.

Metody te są obecnie powszechnie znane i stosowane w otrzymywaniu złączy translacyjnych.

(ii) Terminator translacji.

Omawiane tutaj terminatory translacji służą do zatrzymania translacji mRNA. Mogą być one naturalne, jak to opisano przez J. Kohli w: Mol. Gen. Genet. 182: 430-439; lub syntetyczne, jak opisał to R.F. Petterson w Gene 24:15-27 (1983), i co również zastosowano w niniejszym wynalazku.

(viii) Markery selekcyjne.

Pożądane jest, żeby wektor do klonowania zawierał marker selekcyjny, na przykład marker oporności na antybiotyk lub inny marker, który warunkuje ekspresję cechy selekcyjnej przez organizm gospodarza. W jednej postaci wynalazku, w wektorze znajduje się gen warunkujący oporność na ampicylinę podczas gdy w innych plazmidach znajdują się geny, warunkujące oporność na tetracyklinę lub chloramfenikol.

Ta oporność na antybiotyki lub inne markery selekcyjne ułatwia częściowo selekcję transformatorów. · Dodatkowo, obecność takich markerów selekcyjnych w wektorze do klonowania może być wykorzystana do zapobiegania zakażeniu hodowli przez inne mikroorganizmy. W tej postaci wynalazku, czystą kulturę transformowanych mikroorganizmów-gospodarzy otrzymuje się przez hodowlę w warunkach wymagających do przeżycia indukowanego fenotypu.

Omawiane tu elementy operacyjne otrzymywano rutynowymi metodami, podanymi w cytowanej literaturze lub przykładach. Ogólne przykłady tych elementów przytoczone przez B. Lewina W: Genes (Geny), Willey and Sons, New Jork (1983), zastosowano w sposobie według wynalazku. Różne przykłady odpowiednich elementów operacyjnych można znaleźć w omawianych wyżej wektorach i można je znaleźć w przeglądzie publikacji, omawiających podstawową charakterystykę wyżej wspomnianych wektorów.

Po zsyntetyzowaniu i wyizolowaniu wszystkich koniecznych i wymaganych części składowych wyżej wymienionego wektora, wektor składano z nich według ogólnie znanych metod. Jest przyjęte że składanie wektorów, wykonywane zgodnie z powszechnie stosowanymi technikami, nie wymaga wcześniejszego przeprowadzania dodatkowych eksperymentów. Na przykład, podobne sekwencje DNA można wprowadzać do odpowiednich wektorów do klonowania, jak przedstawił to Maniatis i in. w: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1984). Metody stosowane przez autorów tej pracy wykorzystano w sposobie według wynalazku.

168 844

Dodatkowo należy stwierdzić, że w konstrukcji wektorów do klonowania w sposobie według wynalazku, wieloskładnikowe kopie sekwencji DNA i towarzyszące im elementy operacyjne mogą być umieszczone w każdym wektorze. W takiej postaci wynalazku, organizm gospodarza może produkować większą ilość kopii żądanego inhibitora TNF w przeliczeniu na ilość cząsteczek wektora. Ilość kopii sekwencji DNA, która może być umieszczone w wektorze, jest ograniczana tylko wielkością otrzymanego w ten sposób zrekombinowanego wektora. Wielkość ta nie może przekroczyć pewnej granicy, poza którą wektor jest niezdolny do transformacji komórek odpowiedniego gospodarza oraz replikacji i transkrypcji w tych komórkach, (b) Inne mikroorganizmy

W sposobie według wynalazku wykorzystano wektory, odpowiednio do użycia w organizmach innych niż E. coli. Wektory te opisano w tabeli 1. Dodatkowo, pewne korzystne wektory są omówione niżej.

Tabela 1.

Gospodarze	Regulowane promotory	Induktor	Terminator transkrypcji	Stabilizacja mRNA	Miejsce startu transkrypcji i peptyd sygnałowy	Marker	Miejsce wiązania rybosomów
E. coli	Lac¹, Tac²Lambda pL Trp⁵	IPTG wzrost temperatury dodanie IAA lub pozbawienie tryptofanu	rmB⁶ rrnC7	ompA⁸lambda int⁹trp1	bla‘1 ompA‘1 phoS	ampicylina'1 tetracyklina' 41⁵ chloramfe- nikol'6
Bacillus	^xalfa amylaza¹⁷ ^xsubtylizy- na^ls χρ-431 spac-F⁶	IPTG	E.coli rm rrn BT.T²⁰		neutralna proteaza B.amy²1 alfa amylaza B.amy²2 subtolizyna B.subt.23	Kan^r24 Cam^r2⁵	neutralna proteaza B. amy alfa amylaza B. amy2²
Pseudomo- nas	Trp²⁷(E.coli) Lac(E.coli) Tac(E.coli)	dodanie IAA lub pozbawienie tryptofanu IPTG			fosfolipaza C²⁸ egzotoksyna A²8	sulfonamid30 streptomy- cyna30	Trp (E.coli)
Drożdże	Gal 131 1032 Adb 133 Π³⁴ Pho5	pozbawienie glukozy i galaktozy pozbawienie glukozy pozbawienie fosforanu	Cyc1 Una czynnik alfa Sac 2		inwertaza3⁶ kwaśna fosfataza36 czynnik alfa	Ura 337 Leu 2’8 His 3 Tap 1

x nie podlegający regulacji

168 844

1. Backman K., Ptashne M., Gilbert W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 4174-4178 (1986).

2. de Boer H.A., Comstock L.J. i Vasser M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983).

3. Shimatake H., Rosenberg M. Nature 292, 128-132 (1981)

4. Derom C., Gheysen D. i Fiers W. Gene 17, 45-54 (1982)

5. Hallewell R.A. I Emtage S. Gene 9, 27-47 (1980)

6. Brosius J., Dull T.J., Sleeter D.D. i Noller H.F. J. Mol. Biol. 148 107-127 (1981)

7. Normanly J., Ogden R.C., Horvath S.J. I Abolson J., Nature 321, 213-219 (1980)

8. Belasco G., Nilsson G., von Gabain A., Cohen S.N., Cell 46, 245-251 (1986)

9. Schmessner U. McKenney K., Rosenberg M. i Court.J., J.Mol. Biol. 176, 39-53 (1984)

10. Mott. J.E., Galloway J.L. i Platt T. EMBO J. 4,1887-1891 (1985)

11. Koshland D. i Botstein D., Cell 20, 749-760 (1980)

12. MowaN.R.. Kakamura K., Inouye M., J.Mol. Biol. 143, 317-328 (1980)

13. Surin B.P., Jans D.A.,Fimmel A.L., Shaw D.C., Cox G.B. i Rosenberg H., J.Bacteriol 157, 772-778 (184)

14. Sutcliffe J.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3737-3741 (1978)

15. Peden K.W.C., Gene 22, 277-280 (1983)

16. Alton N.K. i Vapnek D., Nature 282, 864-869 (1979)

17. Yang M., Galizzi A. i Henner D., Nuc. Acids Res. 11(2), 237-248 (1983)

18. Wong S.L., Price C.W., Goldfarb D.S. i Doi R.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1184-11888 (1984)

19. Wang P. -Z. i Doi R.H., J. Biol. Chem. 251, 8619-8625 (1984)

20. Lin C. -K., Quinn L.A., Rodriquez R. L. J. Celi Biochem. Suppl. (9B), str. 198 (1985)

21. Vasantha N., Thompson L.D., Rhodes C., Banner C., Nagle J. i Filpula D. J. Bact. 159(3), 811-819 (1984)

22. Plava J., Sarvas M., Lehtovaara P., Sibazkov M. i Kaarriainen L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5582-5585 (1982)

23. Wang S. -L., Priece C.W., Goldfarb, D.S. i Doi R.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1184-1188 (1984)

24. Sullivan M.A., Yasbin R.E., Young F.E., Gene 29, 21-46 (1984)

25. Vasantha N., Thompson L.D., Rhodes C., Banner C., Nagle J. i Filula D., J. Bact. 159(3), 811-819(1984)

26. Yansura D.G. i Henner D.J. PNAS 81, 439-443 (1984)

27. Gray G.L., McKeown K.A., Jones A.J.A., Seeburg P.H. i Heyneker H.L., Biotechnology, 161-165 (1984)

28. Lory S. i Tai P.C., Gene 22, 95-101 (1983)

29. Liu P.V., J. Infect. Dis., 130 (dodatek), 594-599 (1974)

Wood D.G., Hollinger M.F. i Tindol M.B., J. Bact. 145, 1448-1451 (1981)

31. St. John T.P. i Davis R.W., J. Mol. Biol. 152, 285-315 (1981)

32. Hopper J.E. i Rowe L.B. J. Biol. Chem. 253, 7566-7569 (1978)

33. Denis C.L., Ferguson J. i Young E.T., J. Biol. Chem. 258, 1165-1171 (1983)

34. Lutsdorf L., Megnet R., Archs. Biochem. Biophys. 126, 933-944 (1968)

35Meyback B., BajwaN., Rudolph H., Hinnen A., EMBO J. 6: 675-680 (1982)

36. Watson M.E., Nucleic Acid Research 12, 5145-5164 (1984)

37. Gerband C. i Guerinau M., Curr. Genet. 1, 219-228 (1980)

38. Hinnen A., Hicks J.B. i · Fink G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929-1933 (1978)

39. Jabbar M.A., Sivasubramanian N. i Nayak D.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2019-2023 (1985).

168 844 (i) Wektory Pseudomonas

Kilka wektorów plazmidowych, które są zdolne do autonomicznej replikacji w szeregu bakterii Gram-ujemnych, znajduje również korzystnie zastosowanie w przypadku gospodarzy z rodzaju Pseudomonas. Niektóre z nich opisane przez Ta.it R.C., Close T.J., Lundcjuist, R.C., Hagiya M., Rodriquez R.L. i Kado C.J. W; Biotechoology (biotechnologia), maj 1983, str.269-275; Panopoulos N.J. w: Genetic Engioeeriog in the Plant Sciences (Inżynieria genetyczna w naukach o roślinach), Praeger Publishers, Nowy Jork, Nowy Jork, str. 163-185 (1981) i Sakaaucki K. wtCunrenn Topicc in Mickrbiorogg aian Immuuologg 99: 31-45 (1992), zastosowano w sposobie według wynalazku.

W jednym ze szczególnie korzystnych konstruktorów użyto plazmidu RSF1010 i jego pochodnych opisanych przez Bagdasarian M., Bagdasarian Colemans S. i Timmis

K.N. w: Plasmids of medical, Eoviroomeotal and Commercial Umportanke, Timmis K.N. i Puhler A. ed., Elsevier/North Holland Biomediknl Press (1979), które zastosowano również w sposobie według wynalazku. Zaletami RSF1010 są: jego stosunkowo mała wielkość, duża liczba kopii plazmidu, który łatwo transformuje i stabilnie utrzymuje się zarówno w E.coli jak i w gatunkach Psecdomoons. W tym systemie może być pożądane użycie systemu ekspresyjnego Tac, jak to opisano dla Escherichia, odkąd okazało się, że promotor trp E.coli jest właściwie rozpoznawany przez polimerazę RNA Pseudomonas, jak przedstawił to Sakagucki K. w: Current Topics in Miarobiology and Immunology 96: 31-45 (1982) i Gray G.L., McKeown K.A., Jones A.J.S., Seeburg P.H. i Heyneker H.L. w: Biotechnolog^ (biotechnologia), luty 1984, str. 161-165. Aktywność trnosarypcyjoą. można następnie maksymalizować w razie potrzeby zamianą promotora na przykład na promotor trp E.coli lub P. nercginosn. Ponadto, grn lacZ z E.coli może być również włączony do plazmidu w celu osiągnięcia efektu regulacyjnego.

Translacja może być sprzężona z inicjacją translacji w przypadku zarówno każdego z białek Pseudomonas, jak i z miejscami inicjacji każdego z p^Rkowanych na wysokim poziomie białek z rodzaju wybranego do wewnątrzkomórkowej ekspresji inhibitora. W tych przypadkach, kiedy nie są dostępne jako gospodarze szczepy Pseudomonas niezdolne do restrykcji (r) wydajność transformacji koostrcataLmi plazmidowymi E.coli jest niska. Zatem przed transformacją żądanego gospodarza wymagane jest pasażowanie wektorów do klonowania dla Pseudomona-s w szczepach rm+ (niezdolne do restrykcji, zdolne do modyfikacji) innych gatunków, jak przedstawił to Bagdasnrino i in. w: Plasmids of Medical, Eovironmeotnl and Commerkinl Importaoke, str. 411-422, wyd. Timmis and Puhler, Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979).

(ii) Wektory Bacil^s

Ponadto, mstaieje korzystny system ekspresyjny w gospodarzach z rodzaju Bacillus z użyciem plazmidu pUB110 jako wektora do klonowania. Podobnie jak w innych systemach gospodarz-wektor, możliwa jest w baciltas ekspresja inhibitora TNF, stosowanego w sposobie według wynalazku, zarówno w formie białka wewnątrzkomórkowego jak i wydzielanego na zewnątrz. Prezentowana postać wynalazku obejmuje oba systemy. Wektory, zdolne do replikacji w Bacillus i E.coli są dostępne do sporządzania różnych konstrukcji genetycznych i testowania wielu genów, jak opisali to Dubnau D., Gryczan T., Contente S. i Shivakumar A.G. W Geoetik Eng^er-ing, t.2, wyd. Setlow i Hollander, Plenum Press, Nowy Jork, Nowy Jork, str. Π5-131 (1980), co wykorzystano w sposobie według wynalazku. W celu osiągnięcia ekspresji i sekrecji inhibitora TNF z B. subtilis, najkorzystniejsze jest podłączenie sekwencji sygnałowej alfa-amylazy do kodującego regionu białka. W celu otrzymania wewnątrzkomórkowej syntezy inhibitora, przenośna sekwencja DNA będzie podłączona w sposób umożliwiający transkrypcję do miejsca wiążącego rybosomy w sekwencji liderowej alfa-amylazy.

Transkrypcja każdego z tych konstruktorów może kierować promotor alfa-amylazy lub jego pochodna. Pochodna ta zawiera sekwencję ontywoego promotora alfa-amylazy, rozpoznawaną przez polimerazę RNA, lecz przyłącza się również do regionu operatorowego lac. Podobne hydrobowe promotory, skonstruowane z promotora genu peoicylioazy i operatora

168 844 lac, funkcjonują i podlegają regulacji w gospodarzach Bacillus, jak przedstawili to D.G. Yansura i Henner w: Genetics and Biotechnology of Bacilli, wyd. A.T. Ganesan i J.A. Hoch, Academic Press, str. 249-263 (1984). Gen LacI z E.coli może być również włączony do plazmidu w celu osiągnięcia efektów regulacyjnych.

(iii) Wektory Clostridium

Dobrze funkcjonującym wektorem w Clostridium jest plazmid pJU12, opisany przez Squires i innych w J. Bacteriol. 159: 465-471 (1984), który zastosowano w sposobie według wynalazku, transformujący C. perfringens przy użyciu metody według D.L. Heefner i innych, opisanej w J. Bacteriol. 159: 460-464 (1984), którą posługiwano się przy opracowywaniu wynalazku. W plazmidzie tym transkrypcję kieruje promotor genu warunkującego oporność na tetracyklinę. Translakcja jest sprzężona z sekwencją Shine-Dalgame z tego samego genu tet, w sposób ściśle analogiczny do nakreślonych w zarysach metod używanych w stosunku do innych gospodarzy.

(iv) Wektory drożdżowe

Utrzymanie obcego DNA wprowadzonego do drożdży może być osiągnięte kilkoma metodami, jak opisali to D. Botstein i R.W. Davis w Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathern, wyd. Jones and Broach, str. 607-636 (1982), co znalazło zastosowanie w sposobie według wynalazku. Jeden z lepszych systemów ekspresyjnych dla organizmów-gospodarzy z rodzaju Saccharomyces wprowadza się kodujący inhibitor TNF w plazmidzie 2-mikronowym. Zaletami kolistej cząsteczki DNA są: stosunkowo wysoka liczba kopii i stabilność w szczepach cir'. Wektory te posiadają również sygnał startu replikacji i przynajmniej jeden z markerów oporności na antybiotyki z plazmidu pBR322, co umożliwia ich replikację i selekcję w E.coli. Dodatkowo plazmid posiada sekwencję wielkości 2 mikronów i gen LEU2 z drożdży, znoszący mutację leu2 w defektywnych szczepach drożdży.

Przyjęto, że lepiej jest, jeśli rekombinacyjne inhibitory TNF, które mają być ostatecznie produkowane w drożdżach, są najpierw wprowadzone przy użyciu wektorów do Escherichia coli. Zrekombinowane wektory ulegają replikacji w tych komórkach, a po amplifikacji można je izolować i oczyszczać. Następnie wektor można wprowadzać do drożdży jako docelowego gospodarza do produkcji inhibitora TNF.

(c) Komórki ssaków cDNA, kodujący inhibitor TNF, może służyć jako gen do ekspresji inhibitora w komórkach ssaków. Powinien on posiadać sekwencję efektywnie wiążącą rybosomy, jak opisał to Kozak w Nucleic Acids Research 15: 8125-8132 (1987), co zastosowano w sposobie według wynalazku, jak również sekwencję sygnałową (patrz punkt 3(a) (vi), pozwalającą na uwalnianie z komórki dojrzałego białka. Restrykcyjny fragment DNA, niosący kompletną sekwencję cDNA, może być umieszczony w wektorze ekspresyjnym, posiadającym promotor i enhancer (sekwencję wzmacniającą) transkrypcji, jak opisali to L. Guarente w Celi 52: 303-305 (1988) i J.T. Kadonaga i in. w: Cell 51: 1079-1090 (1987); informacje z obu tych publikacji znalazły zastosowanie w sposobie według wynalazku. Promotor może podlegać regulacji jak w plazmidzie pMSG (Pharmacia, numer katalogowy 27450601), jeżeli konstytutywna ekspresja inhibitora wpływa szkodliwie na wzrost komórek. Wektor powinien posiadać kompletny sygnał poliadenylacji, opisany przez F.M. Ausubel i in. w: Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, (1987), do czego odniesiono się w przedstawionych eksperymentach. Sygnał poliadenylacji warunkuje prawidłowy proces transkrypcji i dojrzewania mRNA. W końcu, wektor powinien posiadać sekwencję sygnałową startu replikacji i przynajmniej jeden marker oporności na antybiotyk z plazmidu pBR322, pozwalające na replikację i selekcję w E.coli.

W celu selekcjonowania stabilnych linii komórkowych produkujących inhibitor TNF, ten wektor ekspresyjny może zawierać gen, kodujący marker selekcyjny taki jak marker oporności na antybiotyk lub gen znoszący mutację defektywnej linii komórkowej, jak gen kodujący reduktazę dwuhydrofolianową (dhfr),używany do transformacji linii komórkowej dhfr, jak

168 844 opisał to Ausubel i in., supra. Alternatywna metoda polega na jednoczesnej transformacji (kotransformacji) plazmidem z markerem selekcyjnym i wektorem ekspresyjnym.

7. Komórki gospodarzy (transformacja)

Otrzymany wektor przenosi się do odpowiedniej komórki gospodarza. Może to być komórka mikroorganizmu lub ssaka.

(c) Mikroorganizmy

Powszechnie wiadomo, że wybór odpowiednich elementów regulacyjnych jest warunkiem zdolności jakiegokolwiek mikroorganizmu do przyjęcia egzogennego DNA i ekspresji kodowanych przez niego genów oraz sekwencji im towarzyszących. Po wybraniu odpowiedniego organizmu-gospodarza, wprowadza się do niego wektor przy pomocy powszechnie stosowanych metod. Przykłady tych metod można znaleźć w: Advanced Bacterial genetics R.W. i in., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork (1980), wykorzystanej w niniejszej pracy. W przypadku jednej z postaci wynalazku, dla którego transformacja zachodzi w niskich temperaturach, operowanie różnymi temperaturami zapewnia regulację ekspresji genów dzięki użyciu odpowiednich elementów regulacyjnych, jak to przedstawiono wyżej. W innej postaci wynalazku, gdzie w wektorze są umieszczone regulatory osmotyczne, regulacja koncentracji soli podczas transformacji zapewnia odpowiednią kontrolę ekspresji obcych genów.

Jest również korzystne, jeśli gospodarz jest względnym (fakultatywnym) beztlenowcem (anaerobem) lub tlenowcem (aerobem). Odpowiednimi gospodarzami do użycia w tym przypadku są drożdże i bakterie. Gatunki drożdży, spełniające ten warunek, należą do rodzaju Saccharomyces, zwłaszcza są to Saccgaromyces cerevisiae. Gatunki bakterii, spełniające ten warunek, należą do rodzaju Bacillus, Escherichia i Pseudomonas i są nimi korzystnie Bacillus subtilis i Escherichia coli. Dodatkową listę komórek-gospodarzy zamieszczono wyżej w tabeli 1.

(d) Komórki ssaków

Wektor można wprowadzać do komórek ssaków w hodowli za pomocą kilku technik, na przykład koprecypitacji DNA z fosforanem wapnia, elektroporacji lub fuzji protoplastów. Najlepsze wyniki daje metoda koprecypitacji z fosforanem wapnia, opisana przez Ausubel i innych (patrz wyżej).

Wiele stałych typów komórek podlega transformacji i jest zdolnych do przeprowadzenia transkrypcji i translacji sekwencji cDNA, procesu dojrzewania prekursora inhibitora TNF i wydzielania dojrzałego białka. Jednak rozmaite typy komórek różnią się pod względem sposobu glikozylacji wydzielanych białek i potranslacyjnych modyfikacji reszt aminokwasowych, jeśli takie procesy zachodzą. Z tego wynika, że idealnym typem komórki jest komórka produkująca rekombinacyjny inhibitor TNF identyczny z naturalną cząsteczką.

8. Hodowla komórek otrzymanych metodami inżynierii genetycznej.

Komórki gospodarzy hodowano w warunkach odpowiednich dla ekspresji inhibitora TNF. Mówiąc ogólnie, warunki te, specyficzne dla komórki gospodarza, można z łatwością określić za pomocą powszechnie stosowanych metod, opisanych w cytowanej literaturze i w opisie wynalazku. Na przykład, Bergey's Manual Determinative Bacteriology, wyd. 8, Williams and Wilkins Company, Baltimore, Maryland, którymi posługiwano się opracowując sposób według wynalazku, zawiera informacje o hodowli bakterii. Podobne informacje o hodowli drożdży i komórek ssaków można znaleźć w: R. Pollack, Mammalian Cell Culture, Cold Spring Harbor Laboratories (1975).

Wszystkie warunki niezbędne do regulacji ekspresji sekwencji DNA, zależne od elementów operacyjnych umieszczonych lub już obecnych w wektorze, mogą wywierać swój wpływ na poziomie transformacji lub hodowli. W jednej z postaci wynalazku, komórki rosną do osiągnięcia dużej gęstości hodowli w odpowiednich warunkach regulacyjnych, które hamują ekspresję sekwencji DNA. Kiedy zostanie osiągnięta optymalna gęstość komórek, warunki środowiska zamienia się na odpowiednie do ekspresji DNA. Wytwarzanie inhibitora TNF będzie zachodzić w krótkim przedziale czasu, następującym po osiągnięciu przez hodowlę gęs20

168 844 tonci bliskijż aptymalnAt, i inhibitor TNF uoyakaje się po pAwnym czasie od momentu zaindukaNonia ekspresji.

9. Oczyezczanie (a) Inhibitor TNF otroymaky z miksoasęakiomóN. W Worzyatkej postaci sposobu według wykolaoCu, reComb1naoyjne iAhibitas TNF jest oooysoooaky w kastępstNie odoyaCakio t upsojekijgo ρ^υοΑΐο struktury oWteNnAt. Postać ta jAst Caroyatka, pakieNaż uwoża się, uoysWśkij dużych ilonci biołka o w'łanoiwej strukturzA przAstrz.eonet jest ułatwiooj, jenit białko oastało paproAdkto ocoysoooake. JedkaWżA w altArkateNkej i również Worzystnet postaci sposobu według Nykalaoku, inhiaitas TNF może być poddany aCłoeokiu w swoją aktywką strukturę przAd aooesoczaniem. W jASzooe innej koroystnej postaci wynalooCu, 1nhialtar TNF występujA w prawidłowo uformowaiA psojatsoAkkiA, aktyNkAt postaci bezponrAdkia po adoeakakiu z hodowli.

W pewnych NaruACach, inhibitor TNF aaieęa adpowiAdAte, oCtyNką strukturę po ekspresji w ęospnear/.ach-m.ikroorgoniomaoa i tsaksposciA tego białWa proeo ńcianWę WamósWaNe, błonę lub do przAatrojki pesiplaomotecokAj. W aęólkanoi może to ooohodzić, jeśli DNA, Wadutący aekNekct- aygnołoNą oostoł psoyłąoooky do DNA kodatąoega biołko segalaoejkA, Jeśli inhibitor TNF nij przybiero odpONiedkiej, aCtyNkAt atruCtaey, to wtedy Nsoystkte powstałe mostki eNustocooWowA i/lub wiezooio AieWonwalAkcetke będą kiaocooke psoeo ooynAiCi djkotusująoj i redukujące, oa przykład chlorek guanidyny i bAta-mAsCoptaAtśkol, zakim inhibitor TNF a-eoie miał możliwość osieękięcio swojAŻ oCtyNket struktury po saocieńcoekiu i utlenijoiu tych oisoooących coyAoików w WaktsoloNOoych NaeukCaoh.

W celu proepsaNadoekia aooyaoooAkia przed lub po ueosmaNakiu atsuCtusy pszestrzAAkjj, używa się pANkyoh Womaikocti kaat-pującyoh technik: chromatografio onikawymiAOka (z oastasoNakiem moko Q lub DEAE-aAeoroze), sączenie maleCuloskA (z oaataaoNakiem aupAsaoe), ohcomataagoiłkaNaAiA (MaAaP), ohromoaaęsofia addoiołyNań hydrofobowych (octylalub ejkelasAearoza). Szczególnie NostoncioNą techniką oCaoała się chromatografia powikaNaotNa z użyciem TNF (opisano w psoyCładoie I).

(b) Inhibitor TNF produWaNOAe w WomósWooh ssoków.

Iohiattar TNF proeuCoNaky w Womórkaoa aaaków ocoysoooo stę za stab1ltzoNOoet pożyNCi Atopami, aaAtmującymt chromatografię jaoaNemtAooą i chromatografię pawinoNactNO z użyciem TNF, żoW opisako to w psoyCłaeotA I. Jest to ocoyNiste w pasówkoo1u ze stasaNOoymi tAoaotkomi, Wtórych różne modyfiCocje i Nostakty mogą być stasoNane w spasabij wjdług Nyoolooka.

JaW oaonoooako poproedkio, inhibitory TNF, uzyskane sposobAm według NynalpoCu, są proeN·ideNPOA do użycio jaWo ρ.αρο.ο,ζ lAczniczj i tym somym gotowa postoć tego leWu musi oaNierać eosmokolagtookie dopusoooolne konniC. W ŻAdnAj z pastaoi Nykalooku, inhiaitose TNF mogą być oaAmtconie modyfiWawake w celu udosWokolekio włanciNonoi eormakokiketycokyoa cząsteczek. ProyWłodAm może być psoełączokiA inhiaitasów TNF do polimAróN o dużej mosij cząsteczkowej, takich joW glikol palietylenaNy. DodotWaNa, inhibitory inteslAuktny-t mogą być podawooA łączniA z inhibitorami TNF. Ta komaikocjA tesopeutyookA mogą być szozAgólniA użyteczne w leczeniu ohosóa zapolkeca i degekesaoytkech.

Sposób według NenalooWu ilustrują przyWłody karzyatkeoh jego postaci. Wszystkie ο.,ζkuły i aenonntki cytowake w kast-pująoych przeWłaeaca były NeWasoystake w opsacowoniu sposobu według NynolaoWu.

PszeCład I. ProygatowywoktA biołjW

A. Materiały

Gen TNF alfa (TNFo) zoCupiaAo od British Btotechoalogy, Limited, Oxearg. Eoglaid. Złoże DEAE-SApharołe CL-6B i FPLC Mono^ HR5/5 HR10/00 zaWupioAo od

Phosmaoio, Ioc., Piacotowoe, New Jassaz. Złoże Affigel-15 i zestaw do azkaczakia białko BioRc, zaWuptano od BioRad, Richmond, Califomta, TweAn 20, NodaroNęglak amokONy, fosforon ładoNe, PMSF, wadoroN-glak sodowe, dtt1atre1tol, fiolet Csystol1oone i ρΙζ^οιcynę D zoCup1ano od Sigmo ChAmical ^οροαζ, St. Louis, Missouri, Eneoprote1naz- Lys-C,

168 844 endoproteinazę Asp-N i TRIS zakupiono od Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indinana, Heksafluoroaceton zakupiono od ICN Biochemicals, Costa Mesa, California, Bromek cyjanu, kwas trifluorooctowy i chlorowodorek guanidyny zakupiono od Pierce Chemicals, Rockford, Illinois. Acetonitryl i wodę do HPLC zakupiono od J.T. Baker Chemical Company, Phillipsburg, New Jersey. Mocznik zapupiono od Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland. Kwas [³H]ejodooctowy zakupiono od New England Nuclear, Boston, Massachusetts. [¹²5J]-TNFa zakupiono od Amersham, Arlington Heights, Illinois. Otrzymany metodami rekombinacyjnymi ludzki TNFa zakupiono od Amgen, Thousand Oaks, California. Kolumny C 8 do chromatografii z odwróconymi fazami (25 cm x 4,6 mm) otrzymano od Synschrom, Inc., Lafayette, Indiana. Kolumnę C 8 o małej średnicy do chromatografii z odwróconymi fazami (7 pm, 22 cm x 2,1 mm) otrzymano od Applied Biosystems, Foster City, California, 96-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania (Corning) zakupiono od VWR Scientific, Batavia, Illinois. Podłoże McCoys 5A i płodową surowicę bydlęcą zakupiono od Gibco, Grand Island, New York. Podłoże RPM-1 1640 i L-glutaminę zakupiono od Mediatech, Herndon, Virginia. Trypsynę zakupiono od K.C. Biologicals, St. Lenexa, Kansas. Linie komórkowe ME 180 i L929 otrzymano od American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

B. Oznaczenia inhibitora TNF.

Do zidentyfikowani inhibitora TNF używano dwóch typów oznaczenia. Jednym z nich jest oznaczenie cytotoksyczności, drugim oznaczenie przesunięcia w żelu.

1. Oznaczenie cytotoksyczności.

Oznaczenie cytotoksyczności przeprowadzono z traktowanymi aktynomycyną D komórkami ME180 i komórkami L929, jak opisali Ostrove i Gifford (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 160, 354-358 (1979) i Aggarwal i Essalu (j. Biol. Chem. 262,10000-10007 (1987). Komórki L929 (CCLI: American Type Culture Collection) przechowywano w podłożu McCoy'a 5A zawierającym 10% płodową surowicę bydlęcą. Hodowle traktowano krótko 0,25% trypsyną w roztworze fizjologicznym zawierającym 5 mM EDTA i ponownie zawieszano w świeżym podłożu. Około 2 x 10⁴ traktowanych trypsyną komórek na studzienkę wysiewano na 96-studzienkowe płytki (Corning), i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Następnie dodawano aktynomycyny D do końcowego stężenia 0,25 pg/ml. Po dwóch godzinach do studzienek dodawano próbki zawierające TNF i inhibitor TNF i i inkubację w tej samej temperaturze kontynuowano przez noc. Po przeprowadzeniu oceny mikroskopowej podłoże dekantowano, a studzienki przemywano PBS. Studzienki napełniano następnie na 5 minut roztworem 0,1% fioletu krystalicznego, 10% formaldehydu i 10 mM fosforanu potasowego, pH 6,0, przemywano dokładnie wodą i suszono. Barwnik ekstrahowano 0,1 M cytynianem sodowym w 50% etanolu, pH 4,2. Absorbancję barwnika w żywych komórkach oznaczano przy długości fali 570 nm używając czytnika do mikropłytek (Molecular Devices Corp. CA (California). Przykład tego oznaczenia przedstawiono na fig. 1. W obecności inhibitora TNF cytotoksyczny wpływ TNF był obniżony.

2. Oznaczenie przesunięcia w żelu.

Oznaczenie przesunięcia w żelu obejmuje stosowanie układu natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Tę natywną elektroforezę w 4% żelu przeprowadzono według Hedricka i Smitha (Arch. Biochem. and Biophysics 126, 155-164 (1968). Jodowany TNF (Amersham) mieszano z inhibitorem TNF z przykładu I.C. po chromatografii przeprowadzonej na kolumnie C 8 i inkubowano przez 30 minut do 2 godzin. Mieszaninę tę, oraz sam jodowany TNF nakładano na 4% natywny żel i poddawano elektroforezie. Po utrwaleniu żelu 10% kwasem octowym i przemyciu, przeprowadzono radioautografię. Jak przedstawiono na fig. 2, kompleks TNF i inhibitor TNF migruje inaczej niż sam TNF. To oznaczenie przesunięcia w żelu stosowano do określania, które frakcje eluatów po chromatografii na kolumnie DEAE CL6B zawierają inhibitor TNF.

C. Oczyszczanie inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa.

Dwadzieścia litrów moczu pacjenta, u którego stwierdzono zaburzenia w pracy nerek zatężono do 200 ml stosując membranę Amicon YM5. Koncentrat dializowano następnie

16S 844 w temperaturze 4°C wobec 0,025 M Tris-Cl, pH 7,5, a następnie wirowano w rotorze JA14 przy 10 000 obrotów na minutę przez 30 minut. Supernatant nakładano następnie na kolumnę DEAE Sepharose CL-6B0 wymiarach 40 x 4,5 cm zrównoważoną 0,025 M Tris-Cl, pH 7,5, i płukano dużą objętością dopóki OD,₈₀ wypływu nie powróciło do poziomu wyjściowego. Rozdziału dokonywano stosując liniowy gradient od 0-0,05 M chlorku sodowego w 0,025 M Tris-Cl pH 7,5 i monitorowano przez pomiar OD,_g0. Zbierano frakcje z kolumny i oznaczano aktywność inhibitora TNF stosując oznaczenie natywnego żelu. Frakcje inhibitora TNF uległy elucji w raczej ostrym piku przy 80 mM NaCl.

Figura 6a przedstawia profil OD₂₈o chromatografii na DEAE Sepharose CL-6B 20 litrów moczu. Figura 6b przedstawia autoradiogram odpowiadający oznaczeniu w natywnym żelu wskazując na występowanie piku inhibitora TNF we frakcjach 57-63, który występował przy 80 mM stężeniu NaCl.

Inhibitor TNF oczyszczano dalej stosując kolumnę powinowactwa do TNF. TNF otrzymany metodami rekombinacyjnymi ulegał ekspresji w BL21/DE3 w ilości około 10-20% całkowitego białka komórkowego. Osad komórek prasowano stosując prasę komórkową pod ciśnieniem 138 000 kPa, i materiał rozpuszczalny dializowano w temperaturze 4°C wobec 0,025 M Tris-Cl, pH 8,0. Oddializowany lizat filtrowano przez membranę o średnicy porów 0,2 μιη. i nakładano na kolumnę FPLC Mono-Q zrównoważoną 0,025 M Tris-Cl, pH 8,0. Zastosowano liniowy gradient NaCl od 0 do 0,5 M w 0,025 M Tris-Cl, pH 8,0. i monitorowano przez pomiar OD,^. Zbierano frakcje o objętości 1 ml i analizowano pod kątem czystości przez SDS-PAGE. Otrzymana pula TNFa była w około 90% czysta w oparciu o żel SDS-PAGE barwiony błękitem Coomasiego, i była w pełni aktywna w oparciu o oznaczenie białka metodą Bradforda przy zastosowaniu jako standardu lizozymu, i biooznaczenie ME180, z zastosowaniem TNFa Amgena jako standardu (Bradford, M.Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).

TNF zatężano w Amicon centroprep-10 do około 25 mg/ml, dializowano wobec 100 mM NaHCO.,, pH 8,5 i sprzęgano ze złożem Affigel-15 przy stosunku 25 mg TNF/ml złoża. Wydajność sprzęgania wyższa od 80% uzyskanej w złożu o wysokiej pojemności, stosowanym do dalszego oczyszczania inhibitora TNF. Do puli białka oczyszczanego na DEAE CL-6B dodawano PMSF do końcowego stężenia 1-4 mM i naładano w temperaturze 4°C na kolumnę powinowactwa do TNF o wymiarach 4 x 1 cm zrównoważoną 0,025 M Tris-Cl z szybkością przepływu 0,1 ml/minutę. Kolumnę płukano następnie 0,025 M Tris-Cl, pH 7,5 dopóki OD5_go wypływu nie powróciło do poziomu wyjściowego. Kolumnę eluowano następnie 0,05 M fosforanem sodowym (NaPhos), pH 2,5, i monitorowano OD^. Figura 7 przedstawia profil elucji 0,05 M fosforanem sodowym pH 2,5 przy OD5₈o z kolumny powinowactwa do TNF.

Inhibitor TNF oczyszczano do homogenności przez HPLC z odwróconymi fazami na kolumnie Syncropak RP-8 (C8). Zbierano pik OD5₈o z kolumny powinowactwa do TNF i bezzwłocznie nakładano na kolumnę RP-8 zrównoważoną 0,1% TFA/H,O, stosowano liniowy· gradient, z szybkością 1%/minutę, 0,1% TFA/acetonitryl od 0-50%, i monitorowano przez pomiar OD515 i OD_2M. Zbierano frakcje i oznaczano aktywność biologiczną stosując komórki L929 i oznaczenie w natywnym żelu opisane w przykładzie I. B.

Oba te oznaczenia wskazywały na występowanie aktywności biologicznej we frakcjach 28-32, odpowiadających pikowi OD5,5 i OD₂₈0 i ulegającym elucji przy 18% acetonitrylu.

Figura 8a przedstawia profil elucji puli po chromatografii powinowactwa do TNF na kolumnie Syncropak RP-8 z odpowiadającą aktywnością biologiczną z oznaczenia cytotoksyczności wobec komórek L929. Figura 8b przedstawia barwiony srebrem 15% żel redukujący po SDS-PAGE puli białka po chromatografii na RP-8 wskazując na obecność pojedynczego prążka w pozycji odpowiadającej masie 30 kDa.

D. charakterystyka składnika białkowego o masie cząsteczkowej 30 kDa inhibitora TNF.

168 844

Inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa jest glikoproteinąjak stwierdzono stosując konkanawalinę A-peroksydazę po przeniesieniu białka na sączek nitrocelulozowy. Metoda ta jest zmodyfikowaną metodą Wooda i Sarinana (Analytical Biochem. 69, 320-322 (1975)), którzy identyfikowali glikoproteiny bezpośrednio w żelu akryloamidowym. Barwienie glikoproteiny peroksydazą przeprowadzano stosując Con A. skoniugowaną i nieskoniugowaną z peroksydazą. Jeśli stosowano nieskoniugowaną Con A, sączek nitrocelulozowy inkubowano przez jedną godzinę w roztworze zawierającym Con A (0,5 mg/ml, Miles Laboratory) w buforze fosforanowym, pH 7,2 (PBS), następnie przemywano 3x5 minut. Przemyte sączki inkubowano przez jedną godzinę w peroksydazie chrzanu (0,1 mg.ml, Sigma Chemical). Po przetrzymywaniu w PBS (3 x 15 minut) sączek zanurzono w roztworze zawierającym 3 mg/ml 4-chloro-1-naftolu (sigma Chemical) i 12,5 pl/ml nadtlenku wodoru do pojawienia się zabarwienia. Glikoproteina widoczna była jako plama o barwie purpurowej. Zdjęcie, przedstawione na fig. 3, wykonano natychmiast po wywołaniu filtru.

Chemiczną deglikozylację inhibitora TNF przeprowadzano metodą Edge'a, Faltynek, Hofa, Reicherta i Webera (Analytical Biochem, 118, 131-137 (1981). Mieszaninę 0,25 ml anizolu (Eastman Kodak) i 0,5 ml kwasu trifluorometanosulfonowego (Eastman Kodak) schładzano do temperatury 4°C, a następnie w 3pl tej mieszaniny, rozpuszczano l-200ng suchego inhibitora tNf. Probówkę napełniono azotem, następnie inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. To zdeglikozylowane białko poddawano analizie na SDS-PAGE (fig. 4). Masa cząsteczkowa traktowanego chemicznie inhibitora TNF wynosi około 18 000 daltonów. Widoczny był także prążek odpowiadający masie cząsteczkowej 14 000, lecz mógł to być proteolityczny fragment zdeglikozylowanego inhibitora TNF.

Deglikozylację enzymatyczną z zastosowaniem N-glikanazy przeprowadzono według sposobu podanego przez producenta (Genzyme Corp) z tym wyjątkiem, że inhibitor TNF inkubowano z N-glikanazą przez 5 do 6 godzin zamiast przez noc. Masa cząsteczkowa zdeglikozylowanej formy zdenaturowanego inhibitora TNF wynosi około 20 000 daltonów (fig. 5). Jeśli inhibitora nie denaturuje się przed deglikozylacją, masa cząsteczkowa zdeglikozylowanego białka wynosi około 26 000 daltonów.

E. Zdeglikozylowany inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa wiąże się z TNF.

Znakowany radioaktywnie inhibitor TNF (30 kDa) traktowano TFMSA (kwasem trifluorometanosulfonowym) w celu usunięcia węglowodanów, i TFMSA oddzielano od białka przez HPLC. Frakcję białkową mieszano w temperaturze 4°C przez jedną godzinę z TNF-Affigel, i cały niezwiązany materiał usuwano przez wirowanie, TNF-Affigel przemywano dużą objętością 50 mM NaPO₄, pH 2,5. Zmierzono radioaktywność każdej frakcji i analizowano ją także na SDS-PAGE. Niespecyficzne wiązanie inhibitora TNF mierzono stosując Affigel ze związaną anhydrochymotrypsyną (Anhy-CT). Wyniki przedstawiono w tabeli 2. Wyniki te wskazują na wiązanie się zdeglikolizowanego inhibitora TNF. (30 kDa) z TNF.

Tabela 2

Próbka	Typ Powinowactwa	Radioaktywność (CPM)
Frakcja niezwiązana	Eluat
Natywny TNF-INH	TNF	49401 (55,0%)	49401 (45,0%)
Natywny TNF-INH	Anhy CT	8000(0(98,0%)	1789 (2,0%)
TNF-INH traktowany
TFMSA	TNF	13369 (73,0%)	4908 (27,0%)
TNF-INH traktowany
TFMSA	Anhy CT	15682 (94,0%)	962 (6,0%)

W innym doświadczeniu znakowany radioaktywnie inhibitor TNF (30 kDa) redukowano, następnie deglikolizowano stosując N-glikanazę. Po deglikozylacji materiał inkubowano

168 844 przez 10 minut w temperaturze pokojowej z 13 mM utlenionym glutationem (GSSG), i rozcieńczono 5-krotnie 50 mM Tris. następnie dodano cysteiny do końcowego stężenia 5 mM. Materiał inkubowano przez 16 godzin w temperaturze 4°C, a następnie przez jedną godzinę mieszano z TNF-Affigel w temperaturze 4°C. Niezwiązany materiał usuwano, a żel przemywano dużą objętością 50 mM Tris-Cl, pH 7,5. Związany materiał eluowano 50 mM NaP04, pH 2,5. Analizowano radioaktywność każdej frakcji i dla każdej frakcji przeprowadzano SDS-PAGE. Jak widać w tabeli 3 i na fig. 18, zdeglikozylowany i ponownie utleniony inhibitor TNF także wiąże się z TNF.

Tabela 3

Próbka	Typ Powinowactwa	Radioaktywność (CPM)
Frakcja niezwiązana	Eluat
Natywny TNF-INH Natywny TNF-INH (redukowany/ponownie utle-	TNF	18281 (60,0%)	12603 (40,0%)
niany) Traktowany TFMA (redukowany/ponownie utle-	TNF	28589 (94,0%)	1964 (6,0%)
niany) Zdeglikozylowany TNF-INH (redukowany/ponownie utle-	Anhy CT	31371 (98,70%)	412(1,3%)
niany) Zdeglikozylowany TNF-INH (redukowany/ponownie utle-	TNF	25066 (85,0%)	4305 (15,0%)
niany)		AnliyCT	29619 (98,4%)	495 (1,6%)

Przykład II. Sekwencjonowanie inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa.

Stosując sekwenatory białkowe Applied Biosystems, modele 470 i 477, określono sekwencję N-końcową. Przed sekwencjonowaniem peptydy wytworzone przy użyciu różnych enzymów proteoitycznych oczyszczano na kolumnie c8 o małej średnicy do HPLc Applied Biosystems (22 cm x 2,1 mm).

A. Sekwencjonowanie N-końca

Około 250 pmoli inhibitora TNF oczyszczonego przez chromatografię z odwróconymi fazami (RP-8) umieszczono bezpośrednio na sączku polibrenowym i poddawano automatycznej degradacji Edmana, w wyniku której poznano 30 pierwszych aminokwasów cząsteczki.

B. Trawienie natywnego białka endoprotennaąLys-C.

Około 250 pmoli (5 pg) inhibitora TNF, oczyszczonego przez chromatografię z odwróconymi fazami, trawiono 1 pg endoproteinazy Lys-C. 12-godzinne trawienie w temperaturze 25°C przeprowadzano w obecności 1 M mocznika, 0,1% Tween 20 i 150 mM NH₂HCO₃, pH 8,0. Przed oczyszczaniem peptydów, redukowano je inkubując przez 1 godzinę po dodaniu 50-krotnego nadmiaru molowego ditiotreitolu, lub redukowano i alkilowano przez dalszą jedną godzinę inkubacji w temperaturze 37°C używając dwukrotnego nadmiaru molowego kwasu [³H]-jodooctowego w stosunku do ditiotreitolu. Figura 9a przedstawia profil elucji z HPLC z odwróconymi fazami po trawieniu. Figura 9b przedstawia profil elucji z HPLC z odwróconymi fazami po trawieniu i alkilacji.

C. Trawienie natywnego białka endoproteinazą Asp-N.

Około 250 pmoli (5 pg) inhibitora TNF oczyszczonego przez chromatografię z odwróconymi fazami trawiono 0,5-2,5 pg endoproteinazy Asp-N. ^^^18^godzinne trawienie w temperaturze 37°C przeprowadzono w obecności 1 M chlorowodorku guanidyny, 0,01% Tween 20 i 150 mM fosforanu sodowego, pH 8,0.

168 844

Przed oczyszczaniem peptydów, redukowano je i alkilowanojak w przykładzie II. Bi. F'igura 10 przedstawia profil elucji z HPLC z odwróconymi fazami po dwóch takich trawieniach.

D. Redukcja i karboksymetylacja białka.

Inhibitor TNF oczyszczony przez HPLC z odwróconymi fazami redukowano i karboksymetylowano kwasem [³H]-jodooctowym w sposób opisany przez Glazera, i in., w Chemical Modifications of Proteins, str. 103-104 (1975), z tym wyjątkiem, że przeprowadzono przez alkilację dwie kolejne redukcje. Przed trawieniem proteolitycznym białko oczyszczano ponownie przez HPLC z odwróconymi fazami.

E. Trawienie endoproteazę V8 zredukowanego i karboksymetylowanego białka.

Trawienie analityczne przeprowadzono przez rozpuszczenie 55 pmoli (około 1 pg) zredukowanego i karboksymetylowanego inhibitora TNF w 150 mM NaHCO₃, pH 8,0, i trawienie go

0,2 pg proteazy V8 przez 18 godzin w temperaturze 25°C. W wyniku HPLC z odwróconymi fazami (fig. 11a) ujawniono trzy nadające się do sekwencjonowania peptydy co wskazywało na celowość trawienia na większą skalę. Około 220 pmoli (4,5 pg) zredukowanego i karboksymetylowanego inhibitora TNF trawiono 1 pg proteazy V8 przez 5 godzin w temperaturze 25°C, po czym dodano dodatkowo 0,5 pg proteazy i trawienie kontynuowano przez 16 godzin. Figura 11b przedstawia profil elucji z HPLC z odwróconymi fazami po trawieniu V8 na dużą skalę.

F. Całkowita struktura pierwszorzędowa inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa oparta na sekwencji peptydów i sekwencji cDNA.

Różne fragmenty peptydowe ustawiono w szeregu według sekwencji cDNA otrzymanej w przykładzie IV. Przedstawiono to na fig. 19. Resztami niezidentyfikowanymi przez sekwencjonowanie białka są reszty o numerach 14,42, 43,’ 44, 96, 97, 105, 107, 108 i 110 do 119. Sekwencja Gln-Ile-Glu-Asn jest najwidoczniej końcem karboksylowym inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa.

Przykład III. Inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa wytwarzany jest przez komórki U937 stymulowane PMA i PHA.

Zbliżoną do monocytów linię komórkową U937 namnażano w temperaturze 37°C w podłożu RPMI zawierającym 10% płodową surowicę cielęcą do gęstości komórek 1 x 10⁶komórek/ml. Komórki usuwano następnie przez wirowanie i ponownie zawieszano 2 x 106 komórek/ml na 5 różnych szlakach Petri'ego w podłożu RPMI bez surowicy, zawierającym 10 ng/ml PMA (12-mirystyniano-13-octanu forbolu) i 5pl/ml PHA-P (fitohemaglutyniny P). Podłoże z jednej płytki zbierano już po 10 minutach inkubacji i stosowano’ ją jako kontrol czasu zero. Podłoże z pozostałych płytek usuwano kolejno po 24 godz., 48 godz., 72 godz., i 96 godz.,od wysiania. Białko zawarte w tych próbkach zatężano do około 400 pl każde przez traktowanie Centriprep-10 (Amicin Corp). Każdą 400 pl próbkę mieszano następnie z równą objętością preparatu Afigel-15 (Biorad Corp) zawierającego około 10 mg/ml oczyszczonego ludzkiego rekombinowanego TNFa przygotowanego, w naszym laboratorium, Wykazano, że ten TNFa posiadał przed związaniem ze złożem Affigel-15 aktywność biologiczną przejawiającą się toksycznością wobec mysich komórek L929.

Podłoże inkubowano porcjami w temperaturze pokojowej ze złożem mającym powinowactwo do TNFa przez 2 godz. Po wirowaniu złoża usuwano frakcję niezwiązaną, a następnie złoże przemyto 1 ml (500 pl, 2x) PBS ( roztworem soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem, pH 7,5) zawierającym 0,1% żelatynę. Związany materiał eluowano 25 mM roztworem jednozasadowego fosforanu sodowego, pH 2,5 (400 pL, 2x), 40 pl każdej z niezwiązanej, przemytej i wyeluowanej frakcji suszono zawieszano ponownie w 10 pl 25 mM Tris pH 7,5, mieszano z 2 pl (100 pCi) ^l25J-TNFa (400-800 Ci/mmol, Amersham) i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaniny te mieszano następnie z 5 pl 40% sacharozy i 1 ml 0,1% błękitu bromofenolowego i nakładano na 4% natywny żel poliakryloamidowy, jak opisano w przykładzie I. B. Jak przedstawiono na na fig. 15, podłoża z wszystkich próbek z wyjątkiem kontroli czasu zero wykazywały aktywność wiązania TNFa w tym oznaczeniu.

168 844

Pozostałe 300μ1 z każdej próbki (pierwsza elucja w niskim pH) nakładano na kolumnę HPLC C8 i przez 60 minut er^wano liniowym gradientem nketooitrylu (-%/meoctę, szybkość przepływu 1 ml/minutę, zbierano frakcje o objętości 1 ml. Każdą frakcję suszono i zawieszano ponownie w 50 μΐ PBS + 0,1% żelatyną, 10 μΐ każdej z tych próbek mieszano jak powyżej z DJ-TNFa i analizowano w natywnym żelu poliakr^doamidow-ym. Jak przedstawiono na fig. 16, aktywność wiązania z TNF wykrywa się we frakcjach odpowiadających 33% i 34% acetonk-rylowi.

Przykład IV. Analiza matrycowego RNA z komórek U937 traktowanych PMA/PHA.

Komórki U937 namnażano jak opisano w przykładzie III do gęstości 1 x 10^ć komórek/ml i następnie zawieszano 2 x 10⁶ komórek/ml w podłożu wolnym od surowicy bez lub z PMA (10 ng/ml) i PHA (5 μg/ml): Próbki pobierano po godzinie +/- PMA/PHA i po 17 godz. tylko + PMA/PHA. Z komórek tych przygotowywano metodą Chromkzyńskeego i aakki z wykorzystaniem tiocyjamanu guanidyny, fenolu i chloroformu (Analytical Biochemistry 162; 156-159, (1987)) całkowity RNA. Z całkowitego RNA przygotowano RNA poli A~ przez wiązanie z oligo dT-celulozą (Bethesda Reserch Labs). Osiem mikrogramów każdego poli A+ RNA nałożono następnie na 1,2% żel agarozowy z 6,6 formaldehydem. RNA przenoszono z żelu na błonę zeta do hybrydyzacji (BioRad). Błonę traktowano jak opisano w przykładzie V w celu przeszukania biblioteki ludzkiego DNA genomowego przy użyciu sond oligonukleotydowych. Dodawano 1 x 106 c.p.m./ml znakowanego jedoonikiowego DNA sondy (kinaza poliockleotydown). Sonda ta ma sekwencję:

5' TTGTGGCACTTGGTACAGCAAAT 3' co odpowiada zasadom 410-433 sekwencji przedstawionym na fig. 13. Po hybrydyzacji przez noc w temperaturze 65°C, błonę przemyto raz w temperaturze pokojowej 6 x SsC 1 0,1% SDS i raz w temperaturze 65°C w tym samym roztworze i następnie przez 72 godz. kliszę do nctoradiografii eksponowano na promienie X. Autoradiogram przedstawiony na fig. 17 wykazuje, że traktowanie komórek U937 PAM/PHA w podłożu wolnym od surowicy przez 1 godz. wyraźnie stymuluje ekspresję matrycowego RNA inhibitora TNFa o masie cząsteczkowej 30 kDa i że po 17 godz. trnatownoin RNA ten jest właściwie nieobecny w komórkach. Wielkość cząsteczki matrycowego RNA inhibitora TNFa na podstawie tego doświadczenia wynosi około 2,4 tysięcy par zasad.

Przykład V. Przygotowywanie biblioteki ludzkiego DNA genomowego dla inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa.

Ludzkie DNA genomowe strawiono częściowo restryktazą Sau3AI, selekcjonowano pod kątem wielkości. DNA o średniej wielkości 15KB włączono do miejsca restrykcyjnego BamHI bakteriofaga lambda Charon 30. (Rimm, D.L., Horness, D., Kucera, J. i Blattner, F.R., Gene 12: 301-309 (1980). Faga namoażaoo (were propagatet) i amplifikowano w E. coli CES 200.

A. Sondy

W syntetyzatorze DNA Applied Biosystems zsyntetyzowano cztery zdegenerowane oligooualeotydowe sondy hybrydyzacyjne wymienione w tabeli 4. Każda mieszanina sond składała się ze wszystkich możliwych sekwencji DNA kodujących daną sekwencję peptydu.

Tabela 4

Nazwa peptydu	Sekwencja peptydu	Nazwa sondy	Sekwencja sondy
LysC 18	KEMGQVE	TNFBP-P20	5'TUNAUTUTGNUUUATTUTUTUTT3'
LysC 11	QGKYIHP	TNFBP-P2'	5'UAAGGGNAAAGTATUAUATCU3'
LysC 11	YNDCPG	TNFBP-P3'	5'TATUAATUGATUTGTUUCNGG3'
LysC 11	YIHPQNN	TNFBP-P4	5'TTAGTTTCTGNGGAGTCAGT3'
		N = G, A, T lub C

168 844

Oligonukleotydy znakowano [gamma-³²P] ATP (Amersham Inc., Arlington Heights, IL) i kin<azą polinukleotydową. T4 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, EN) do aktywności właściwej 6-9 x 10⁶ c.p.m./pikomol, zgodnie ze sposobem podanym przez producenta.

B. Metodyka:

Wysiewano 8,4 x 10⁵ fagów lambda zawierających ludzki DNA genomowy i przenoszono na podwójne sączki nitrocelulozowe. Na sączkach tych przeprowadzono hybrydyzację z 1 pmol/ml sondy TNFBP-P2' przez 16 godzin w roztworze zawierającym 1,0 M NaCl, 0,1 M cytrynian sodowy, 2x roztwór Denhardta (Denhardt, D.T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 23: 641-646 (1966)), 0,1% SDS, 0,05% pirofosforan sodowy i 150 μg/ml tRNA drożdży w temperaturze 52°C. Temperatura ta jest o 2°C niższa od Tm obliczonej dla większości bogatych w AT składników tej puli oligonukleotydowej. (Suggs, S.V., w: Developmental Biology Using Purified Genes, (Brown, D.D. i Fox, C.F., red.) Academic Press. New York, str. 683-693 (1981)). Po hybrydyzacji sączki przemywano przez 45 minut w temperaturze otoczenia z trzema zmianami 1M NaCl, 0,1 M cytrynianu sodowego i 0,5% SDS. Trwaiące 8 minut przemywanie przeprowadzano w obliczonej Tm (tj. 2°C powyżej temperatury hybrydyzacji) dla większości bogatych w AT składników tej puli. Sączki następnie suszono i przez 40 godz. poddawano autoradiografii z jednym ekranem wzmacniającym w temperaturze -70°C.

Wykryto jedenaście dodatnio hybrydyzujących łysinek. Wyizolowano je i zamplikowano. Stosując podobną metodykę testowano zdolność tych klonów do hybrydyzacji z TNFBP-P20, TNFBP-P3' i TNFBP-P4. Jeden klon (TNFBP-8) hybrydyzował ze wszystkimi czterema oligonukleotydami. Klon ten oczyszczono z łysinki i zamplifikowano. Stosując Lambda-Sorb (Promega Corporation, Madison, WI) i metodę opisaną przez producenta, przygotowano DNA z tego klonu.

Jeden mikrogram tego DNA trawiono następnie restryktazą Sau3AI i fragmenty subklonowano w strawionym restryktazą BamHI wektorze sekwencyjnym mp18, pochodzącym z faga M13 (Yanish-Perron, C., Viera, J. i Messing, J., Gene 33: 103-119 (1985)). Klony M13 przeniesiono następnie na podwójne sączki nitrocelulozowe i hybrydyzowano z sondami oligonukleotydowymi z tabeli 4, stosując warunki opisane uprzednio, Subklony dodatnie oczyszczono i zsekwencjonowano (Sanger, F. i Coulson, A.R.J., Mol. Biol. 94: 441-448 (1975)) stosując zmodyfikowaną polimerazę DNA T4 (Sequenase, US Biochemical Corp., Cleveland OH), zgodnie ze sposobem podanym przez producenta, i jako startery stosując albo zdegenerowane sondy użyte do identyfikacji klonu, albo sekwencję otrzymaną przy użyciu tych sond. Wśród otrzymanych sekwencji są sekwencje subklonów TNFBP-M13-Sau3A-P2'-2 i TNFBP-M13-Sau3A-P4 i starterów P3, P3', P2', P2 i P4. Dane sekwencyjne przedstawiono na fig. 13. Sekwencja zawiera DNA kodujący co najmniej 48 aminokwasów inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa innych niż te określone przez sondy, co potwierdza, że klon TNFBP8 koduje inhibitor TNF. Sekwencja wykazuje także, że gen inhibitora TNF zawiera przynajmniej jeden intron (GTAGGGGCAA........CCCCATTCACAG), W końcu, sekwencja ta wykazuje, że inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa syntetyzowany jest w postaci białka prekursorowego, i że do wytworzenia dojrzałego, aktywnego białka wymagane jest rozszczepienie proteolityczne sekwencji Arg-Asp.

Przykład VI. Przygotowywanie i przeszukiwanie biblioteki cDNA przygotowanego z mRNA z komórek U937 stymulowanych PMA/PHA.

Doświadczenie opisane w przykładzie IV wykazuje, że komórki U937 traktowane PMA/PHA przez 1 godz. powinny zawierać pulę matrycowego RNA wzbogaconego o mRNA inhibitora TNF (30 kDa). Odpowiednio, przygotowano bibliotekę cDNA z poliA+ RNA otrzymanego z komórek U937 traktowanych PMA/PHA jak opisano w przykładzie IV. Z około 5 μg poliA+ otrzymano dwuniciowy cDNA z tępymi końcami zasadniczo jak opisali Gubler, U. i Hoffman, B.J., (1983 Gene, 25:263), stosując partię testowanych odczynników (Amersham, Arlington Heights, IL), według procedur zalecanych przez producenta. Około 1 μg otrzymanego dwuniciowego cDNA traktowano enzymem metylazą EcoRI i przez ligazę DNA T4 dołączono łącznik EcoRI o sekwencji d(pCCGGAATTCCGG), a następnie trawiono

168 844 endonukleazą EcoRI. DNA ten następnie wbudowano następnie do wektora gtlO opartego na bakteriofagu lambda (Young, R.A. i Davis. R.W. (1983) Peoc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1194-1198), który strawiono restryktazą EcoRI, i produkt upakowano w infekcyjnych cząstkach bakteriofaga lambda używając ekstraktów do pakowania DNA do fagów lambda(Gigapack II Gold), otrzymanych od stratagene (La Jolla, CA), zgodnie z podaną przez nich procedurą. Tego lizatu fagów lambda (biblioteki cDNA) używano następnie do infekowania szczepu E. coli C600 hf1A, i wykazano, że biblioteka zawierała około 2,5 x 10⁶ rekombinantów'.

Około 4 x 10⁴ składników tej biblioteki wysiano na szczepie C600 hf1A (5 x 10⁴ jednostek tworzących łysinki (p.f.u.)/płytkę). Wykonano przeniesienie na nitrocelulozę i sączki traktowano jak opisano w przykładzie V w celu przeszukania ludzkiej biblioteki genomowej. DNA na sączkach hybrydyzowano następnie z tą samą znakowaną ³²p sondą jak opisano w przykładzie IV, z tym wyjątkiem, że temperatura inkubacji wynosiła 42°C. Z 4 x 105 wysianych rekombinowanych fagów, 3 zduplikowane łysinki hybrydyzowały z tą sondą. Wyizolowano je dalej ponownie i testowano jak powyżej z dodatkową sondą syntetyczną posiadającą sekwencję:

5' CCCCGGGCCTGGACAGTCATTGTA 3'

Sonda ta odpowiada zasadom 671-694 ludzkiego klonu genomowego inhibitora TNF, przedstawionego na fig. 13. Obie sondy hybrydyzowały ze wszystkimi trzema łysinkami zidentyfikowanymi na początku.

Po oczyszczeniu łysinek przygotowano DNA z tych trzech klonów i subklonowano w miejscu restrykcyjnym EcoRI wektorów MP18 i MP19 pochodzących z fagą M13, jak opisano w przykładzie V. Każdy z tych cDNA składa się z dwóch fragmentów EcoRI, jednego o długości około 800 par zasad, wspólnego dla wszystkich trzech klonów, i drugiego o długości, w zależności od klonu, 1300 par zasad, 1100 par i 1000 par zasad. Prawdopodobną przyczyną pochodzenia unikalnych fragmentów EcoRI w każdym klonie jest niecałkowita elongacja przez enzym odwrotną transkryptazę podczas syntezy pierwszej nici cDNA. Dlatego też te fragmenty EcoRI prawdopodobnie odpowiadają końcowi 5' mRNA inhibitora TNF, a fragment o długości 88 par zasad końcowi 3'. Potwierdza to sekwencja DNA otrzymana dla tych fragmentów jak opisano poniżej.

Z opisanych powyżej subklonów EcoRI cDNA otrzymano całą cDNA o długości 2100 par zasad. Zastosowano metodę sekwencjonowania z terminacją łańcucha dideoksynukleotydami (Sanger, F. i Coulson. A.R. (1975) J. Mol. Biol. 94: 441-448). Jako enzym elongacyjny zastosowano zmodyfikowaną polimerazę DNA T7, Sequenase (US Biochemical, Cleveland, OH) w sposób opisany przez dostawcę. Starterami sekwencyjnymi były syntetyczne oligonukleotydy przygotowane z ludzkiej sekwencji genomowej inhibitora TNF jak przedstawiono na fig. 13, lub sekwencje otrzymane z zastosowaniem tych starterów. Figura 20 przedstawia produkt translacji sekwencji otrzymany z jednego z klonów cDNA. Sekwencja ta odpowiada sekwencji otrzymanej przez sekwencjonowanie białka jak opisano na fig. 19. Całą sekwencję cDNA ludzkiego inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa z klonu lambda-gt10-7ctnfbp przedstawiono na fig. 21.

Pojedyncza otwarta ramka odczytu rozciąga się od trypletu ATG przy zasadzie 168 do trypletu TGA przy zasadzie 1749. Ta ramka odczytu może kodować polipeptyd o masie cząsteczkowej 62kDa. Co zaskakujące, ta ramka odczytu obejmuje i rozciąga się poza 326 kodonów C-końcowej sekwencji białkowej inhibitora TNF otrzymanego z moczu wydedukowanej na podstawie informacji przedstawionych w przykładzie II. Żaden peptyd otrzymany z oczyszczonego z moczu inhibitora TNF nie może być kodowany przez żadną sekwencję cDNA poza zasadą 771 w żadnej ramce odczytu. Sekwencja określona przez zasady 168-288 prawdopodobnie koduje 40-aminokwasową sekwencję liderową spełniającą funkcję kierowania inhibitora TNF przez błonę komórkową.

Przykład VII. Ekspresja cDNA inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa w Escherichia coli.

168 844

Część cDNA genu inhibitora TNF (30 kDa) kodującą rozpuszczalną aktywność wiązania TNFa przygotowano do ekspresji w E. coli jak opisano poniżej.

Ponieważ w sekwencji cDNA po sekwencji kodującej białko określającej C-końcową część inhibitora TNF pochodzącego z moczu (sekwencja QIEN, zasada 771, fig. 20) nie występuje kodon terminacji, dodano go in vitro poprzez ukierunkowana mutagenezę oligonukleotydu (Biorad, Richmond, CA). Klon M13MP19 fragmentu EcoRI o długości 1300 par zasad z klonu lambda-gt10-7ctnfbp hybrydyzowano z syntetycznym oligonukleotydem:

5' CTACCCCAGATTGAGAATTAAGCTTAAGGGCACTGAGGAC 3'

Po syntezie drugiej nici i translacji odpowiedniego gospodarza, zmutowane klony identyfikowano przez hybrydyzację z opisanym powyżej zmutowanym oligonukleotydem. Identyczność molekularna tak zidentyfikowanych klonów powtarzano przez sekwencjonowanie DNA jak opisano w przykładzie V. Następnie z formy Rf usunięto tak zmutagenizowany fragment klonu o długości 468 par zasad określony przez Styl (pozycja 303) i HindIII określający C-koniec białka, i wbudowano do wektora ekspresyjnego E. coli zawierającego promotor tacI (DeBoer, H.A. i in., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:21-25). Konstrukcję tę wykonano przy użyciu syntetycznej, dwuniciowej sekwencji adaptorowej:

5' GATCCGATCTTGGAGGAATGATTAAATGGACAGCGTTTGCCCC 3'

GCTAGAACCTCCTACTAATTTACCTGTCGCAAACGGGGGTTC

Adaptor ten translacyjnie sprzęga gen inhibitora TNF (forma skrócona, jak opisano powyżej) z pierwszymi 12 kodami genu 10 bakteriofaga T7. Na fig. 22 przedstawiono sekwencję DNA tej konstrukcji od punktu inicjacji translacji przy genie 10 po sekwencję adaptorową. Dla ekspresji w E. coli konieczne jest dodanie do sekwencji genu inhibitora TNF kodonu metioniny (ATG). Plazmid ten nazywano pTNFiX-1.

Przewidywana masa cząsteczkowa tego białka wynosi w przybliżeniu 17 600 Da, co jest masą cząsteczkową bardzo zbliżoną do masy zdeglikozylowanego natywnego inhibitora TNF (30 kDa).

Przykład VIII. Oczyszczanie aktywnego inhibitora TNF (30 kDa) z Escherichia coli.

Komórki z jednego litra hodowli E. coli (pTNFIX-1JM107ion-) namnażanej w warunkach indukujących przez 2 godz. zawieszano ponownie w 10 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, zawierających 2 mM EDTA (bufor TE) i prasowano używając prasy komórkowej pod ciśnieniem 138 000 kPa w temperaturze 4°C. Materiał wirowano przy 20 000 g przez 10 minut. Otrzymany osad przemyto raz buforem TE. Przemyty osad zawieszano ponownie w 2 ml 6-M chlorowodorku guanidyny i inkubowano w temperaturze przez 10 minut. Po inkubacji dodano 80 pl 500 mM DTT, i mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez następne 30 minut. Materiał, który pozostał nierozpuszczony po tym traktowaniu usunięto przez wirowanie przy 20 000 g przez 15 minut. Do supematantu dodano 120 pl 5000 mM utlenionego glutationu, i mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Materiał ten rozcieńczono następnie w 20 ml 0,6% roztworu zasady Tris, i dodano 220 pi 500 mM cysteiny. Inkubację kontynuowano przez następne 16 godzin w temperaturze 4°C. Po 16 godz. inkubacji obserwowano pewną nierozpuszczalną pozostałość. Ten nierozpuszczalny materiał usunięto przez wirowanie przy 20 000 g przez 20 minut. Powstały supernatant dializowano wobec 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, przez 16 godz. w temperaturze 4°C, a następnie wirowano przy 20 000 g przez 10 minut. Do tego supematantu dodano PMSF do końcowego stężenia 4 mM, i materiał ten nakładano na kolumnę powinowactwa do TNF (0,7 x 2 cm) z szybkością przepływu 0,1 ml/minutę. Kolumnę tę płukano dużą objętością 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 , i związane białka eluowano 50 mM NaPO4-HCl, pH 2,5. Eluat w pH 2,5 nanoszono na kolumnę RP8 zrównoważoną uprzednio 0,1% TFA/H,O. Inhibitor TNF eluowano liniowym gradientem 0,1% TFA/acetonitryl przy szybkości 1%/minutę (fig. 25). Frakcje analizowano· przez SDS-PAGE (fig. 26) i w celu zlokalizowania inhibitora TNF przeprowadzano oznaczenia cytotoksyczności (fig.25). Wytworzony w E. coli inhibitor TNF (30 kDa) migruje z szybkością odpowiadającą masie cząsteczkowej około 20 kDa, ponieważ nie jest glikozylowany. Inhibi30

168 844 tor TNF zawierają frakcje o numerach 30 do 35. N-końcowa sekwencja tego materiału wykazuje, że inhibitor TNF wytworzony w E. coli posiada następującą sekwencję:

Met-Asp-Ser-Val-( )-Pro)-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Prio-Gln-Asn-Asn-Ser.

Używając tej procedury, z jednego litra hodowli otrzymano około 40 pg inhibitora TNF (30 kDa). Wydajność wynosiła około 2 do 3%. Wydajność można zwiększyć do ponad 50% przez oczyszczanie inhibitora TNF przed renaturacją.

Przykład IX. Ekspresja genów kodujących inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa w komórkach zwierzęcych.

Ekspresja inhibitora TNF w komórkach zwierzęcych wymaga następujących etapów:

a. Konstrukcja wektora ekspresyjnego.

b. Wybór linii komórkowej-gospodarza.

c. Wprowadzenie wektora ekspresyjnego do komórek gospodarza.

d. Manipulowanie rekombinowanymi komórkami gospodarza w celu zwiększenia poziomu ekspresji TNF-BP.

1. Wektory kkopresyjne inhibitoha TNF przeFnazzone do neodowtoiio w komórkach zwierzęcych mogą być kilku typów, włącznie z silnymi konstytutywnymi konstrukcjami ekspresyjnymi, indukowalnymi konstrukcjami genowymi, jak również wektorami przeznaczonymi do ekspresji w poszczególnych typach komórek. We wszystkich przypadkach w odpowiedniej pozycji w stosunku do sekwencji cDNA wektorów plazmidowych umieszcza się promotory i inne genowe regiony regulatorowe, takie jak sekwencje wzmacniające (indukowalne lub nie) i sygnały ponade^la^. Poniżej podano dwa przykłady takich konstrukcji.

Konstrukcję wykorzystującą silny konstytutywny region promotorowy można wykonać wykorzystując wczesne sygnały kontroli genów cytombgelowiruse (CMV). Plazmid ten można skonstruować używając standardowych technik biologii molekularnej (Mekletis, i in., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratouy, 1982), otrzymany plazmid przedstawiono na fig. 23 (pCMVXV beta TNFBPstopA). Miejsce początku replikacji SV40 jest włączone do tego plazmidu w celu ułatwienia jego stosowania w komórkach COS do szybkiego oznaczania ekspresji. Konstrukcja ta zawiera wczesny promotor i sekwencję wzmacniającą CMV jak opisali Boshart, i in., (Cell 41:521-530, 1985), po którym następuje drugi intron genu B-globiny królika (patrz yan Ooyen i in., Science 206:337-344, 1979), który jest flankowany przez miejsca restrykcyjne BamHI i EcoRI. Intron ten został włączony ponieważ wykazano, że poziom ekspresji ulega zwiększeniu gdy do trekskpybowakych regionów pewnych wektorów ekspresyjnych włączone są introny (Buckman i Berg, Mol. Cell. Biol. 8:4395-4405, 1988). Sygnał poHade^la^ zapewniają sekwencje wirusa małpiego 40 (SV40) (współrzędne mapowe: 2589-2452; patrz Reddy, i in., Science 200:494-502, 1978). Sekwencje cDNA inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa zmodyfikowano jak następuje: rozległy region zlokalizowany w kierunku 3' C-końca oczyszczonego inhibitora TNF z moczu ludzkiego wydelbtoweko i wstawiono kodon stop w pozycji leżącej bezpośrednio za C-końcową asnaragtką. Nibzmodyfikowakb sekwencje cDNA inhibitora tNf o masie cząsteczkowej 30 kDa, w analogicznym wektorze, wbudowano do komórek COS i wykazano, że zwiększają aktywność wiązania TNF takich komórek.

Druga konstrukcja (patrz fig. 24) (pSVXVTNFBP stopA) wykorzystuje silny konstytutywny region promotorowy wczesnego genu z SV40 w układzie takim jak występujące w plazmidzie pSV2CAT (German, i in., Mol. Cell. Biol. 2:5044-1051, 1982). Plazmidem tym należy manipulować w taki sposób aby zastąpić sekwencje kodujące ecetylotpansfepezę chloramfenikolu, cDNA inhibitora TNF przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. Jeszcze raz, zmodyfikowano cDNA inhibitora TNF jak opisano powyżej dla konstrukcji promotora CMV. Wczesny region promotorowy SV40 obejmuje sekwencje od miejsca restrykcyjnego HindIII do miejsca BamHI (współrzędne mapowe: 5090-188; patrz Reddy i in., Science 200:494-502, 1978) i sygnał noltadekylacjl SV40, jak opisano powyżej dla konstrukcji CMV.

168 844

2. Do eWspseat1 inhibitora TNF pszz użyciu op1sooyoh paNeżAj weWtosów w celu ^tNarzek1a aktyNnega białka zoataaawono dwlj owiesz-ce likie WamósWoNe. Lilie WamóskoNe łoaocoCtAsyoowake pod względem zdolności do psamaNak1o ekspresji tego obecnego genu obejmują komórki kesWi mołpy, COS-7, oraz komórki żojniWa chomiCś caińsW1ega (CHO) kie posiadające reeuWtooy d1hedroeal1okONAj (dase-).

3. W celu ustaleuio ciągłej liki WomórkaNet pachadząoej od CHO, któro wydziela inhiaitae TNF o mosie cząsteczkowej 30 kDo od podłoża hodowli kamórkawej, Npsowodzono do teoa kamóSAW dhes- wlozmid eWspremujące inhibitor TNF wraz z plazmidem WlAeującem syntezą reduktazy d1hydsoealioAowAt stasujeo technikę Netreoon1o DNA eaaeosonem wapkiowem, opisaną pszAO Gsohamo 1 van der Eha (Vtealage 52:T56-T67m 1973). Komórki Wtóre pobrały DNA 1 jWspiymują DHFR NysAleWctonoNOAa żoW opisali RiogoM, 1 in., (J. Mol. Appl. Gaja,. 1:165-175, 3903).

T. Komórkami eWspeemującymi WokstsuCoetAlA z genem 1ohib1toso TNF możno manipulować w celu ZNięWazeAia pooiomu Netwoczonia inhiaitasa TNF. Komórki zoNierojąoA ^1tor eksprjsytky dlo ikaibitoeo TNF Nroz z wektorem AWswrAayjkym dhrf ooleży poddoć prooedurzA omplieiWacji genu opisanej przAz RlngoMa i in., (J. Mol. Appl. Geoet. t:t65-t75, 1901) stosując methotseWaak, kompAtycyjkAga aktoganist- ehfr. AmwlteiWacja gAiów prowadzi do zNi-kszAnio liczby Wapiί genów dhee i inhibitora TNF abAOkych w komórWoch, czemu towaroysze zwtęWazAoie paoioma mRNA iAatbitara TNF, co z Wolei wsoNadzi do owięWazonAgo wytworzoma psoez WamórWi białWo 1ohialtoso TNF.

Przykład X. IzoloNOkie dwóch typów tohibitaróN TNF z hodowli U937 i istkiekie drugiego iohiaitaro TNF w moczu ludzkim.

Komórki ludzWie U937 oamAażaoo do gęstanoi 1 x 10⁵ WomósjW/ml w 150 cm³ Wolboch stasutąo podłoże RPMI16T0 zoNiesojąoA 200 tAdnastAk/ml pAnicylloy, 200 tedoostAW/ml ^φtamycyne i 10% płodową aueaNico ωΑ^^ Po tezeoa dniach inWubocji w temperaturze 37°C komórki zaierooa proeo wiroNakiA pcz.z 1500 g przAz 7 minut. KomórWi zaNieazano pakONnij z g-st¢^lśc^^e. 2 x 10⁶/ml w podłożu RMPI15T0 bez suraNicy. KomórWi komAożaAa przAz 2T ęodzike w aaeokonc1 5 pg/ml PHA-P (fitohemoglutyniky 1 10 og/ml PMA (t2-miryłtykiono-tę-aotOA earbalu).

Podłoże po 2T godz. aadoNl1 (TT25 ml) ob1erona przAz NlrowakiA 1 ootężooo stosując sączek Amlcon YM5 do około 100 ml. Motjriał ten psoApusoczako psoAz żel pawikaNOotNo do TNF (0,7 x 2 cm) z aoeaWonoią przepływu 0,1 ml/minutę, 1 żel płukano dużą oajętoncią 50 mM be1ł-HCl, pH 7,5. Związaie białka eluowako 50 mM NoPO₄-HCl, pH 2,5, 1 inhibitor TNF oddz1elooa od ikAych zoAieozeszczającech białek wszaz HPLC-RPC0. JoW widoć na fig. 27, obaASNujA się dwo pliki 1ohibitasa TNF. Analizo SDS-PAGE erakoj1 z RPC0 NyWozujA, że masy ozeateczWaNe biołeW z dwóch plików odwawioeają w wsoybliżAkiu alałWam o mosach oząatAozkaweoh 30 WDo 1 T0 WDa (fig. 20). Biołko o mosie coąatecoWawet 30 kAo (TNF-tNHt) poddano okalizie aeWNeooji N-końcowej, 1 stNiesdooka, że jest to toWa samo sjkwencta opisanego woNyżAj inhibitora TNF o masie cząsteczkowAj 30 WDo z moczu. JednoCżA, sjkwekcjo białkowo białka o masie oząstAooWawet T0 WDo dawadzi, że kie jest oko tokij same joW o masie cząatecoWoNej 30 kAo (patsz wszeWłod 11). Dalsze aczyazcookiA drugiego plWu iAaibitaso TNF z moczu ludzkiego, Nieocokego aWało ecaWoji 35 na fig. 0 ^CaoujA, ża tAst to toWże białko inhibitora TNF o mosij oząatecoWawet T0 WDo (fig. 29 i 30).

Inhibitor TNF o masie cząstACzWawet T0 WDo tAst także gliWawsoteiAą. Stwierdzono to stasujeo po przeotAsiemu białko oo sączek AitrooAlulaoaNe WooWokowolikę A-wesoWsedαz-, ZoW opisano w ρ^Ι^^Α I.D. Na SDS-PAGE NeWooaka, że masa ooąstAozWaNo ikhibitoro TNF o mosij coąstAcoWawet T0 WAa trśWtaNśkego N-gliWanazą wzaosi oWoło 36 WAo, (wotsz procedura apiaono w wroyCłodzie I.D.).

Procedurami podonymi w wrzzkłodziA I.E. woNzżej, możno oWsenlić, że zdegliWozylawśaz iohibitos TNF o mosie oząateozCaNAt T0 kDo toWże wiązA się z TNF olfo. Ponoeto, możio toWże Nykaooć, ża zdAglikoozlaNOkA białko o mosij ozesteoo.CoNet T0 WAa wieooć z TNF beto (limeotokazke).

168 844

Przykład XI. Sekwencjonowanie białka inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa i inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa pochodzących z komórek U937, oraz inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa z moczu.

N-końcową sekwencję białek określono stosując Applied Biosystem Protein Sequencer, model 470. Zsekwencjonowano zarówno białko natywne, jak i redukowane-karboksymetylowane. Około 200 pmoli inhibitorów TNF oczyszczonych przez chromatografię z odwróconymi fazami (RP-8) nałożono na sączek polibrenowy i poddawano automatycznej degradacji Edmana. Otrzymaną sekwencję przedstawiono na fig 31. Można zauważyć, że białko o masie cząsteczkowej 30 kDa pochodzące z komórek U937 jest takie same jak to powstające i zidentyfikowane w moczu. Białko inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa nie jest takie samo jak białko inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa. Białko inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa z moczu nie zawiera reszt aminokwasowych; inaczej, jest takie same jak białko o masie cząsteczkowej 40 kDa pochodzącego z komórek U937.

Przykład XII. Struktura pierwszorzędowa inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa. ’

Około 40 pg zredukowanego i karboksymetylowanego inhibitora TNF (40 kDa) trawiono, jak opisano powyżej, endoproteazą V8 i powstałe peptydy rozdzielano na kolumnie RP 18 (fig. 32). Oczyszczone peptydy zsekwencjonowano używając Applied Biosystem Protein Sequencer, model 470.

Około 90 pg zredukowanego i karboksymetylowanego inhibitora TNF traktowano 5 pg endopeptydazy Arg-C w 0,2 M wodorowęglanie amonowym w temperaturze 37°C. Po 24 godz. traktowania materiał strawiony endopeptydazą Arg-C nakładano na kolumnę HPLC-RP8 w celu rozdzielenia peptydów (fig. 32). Oczyszczone peptydy sekwencjonowano jak uprzednio. Niektóre z peptydów trawiono dalej trypsyną traktowaną TPCK lub chymotrypsyną. Około 500 pmoli peptydu arg-C16 traktowano przez 7 godz. w temperaturze 37°C pg trypsyny traktowanej TPCK (Boehringer Mannheim) w 0,2 wodorowęglanie sodowym i peptydy rozdzielano używając RP8 (fig. 34). Około 200 pmoli peptydu arg-C10 trawiono przez trzy i pół godz. w temperaturze 37°C jednym pg chymotrypsyny (Boehringer Mannheim), i powstałe peptydy rozdzielano na RP 18 (fig. 35).

Częściową strukturę inhibitora TNF (40 kDa) określono przez liniowe ustawienie różnych zachodzących peptydów (fig. 36). Całkowitą strukturę pierwszorzędową inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa przedstawiono na fig. 38. Reszty niezidentyfikowane przez sekwencjonowanie białka wydedukowano przeglądając sekwencję klonu cDNA kodującego inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa co dyskutuje się w przykładzie XIVA i opisano na fig. 39.

Przykład XIII. Identyfikacja klonów cDNA dla inhibitora TNFa o masie cząsteczkowej 40 kDa.

Dane przedstawione w przykładzie IX wykazują, że komórki U937 traktowane PMA i PHA wytwarzają inhibitor TNFa o masie cząsteczkowej około 40 kDa. Białko to oczyszczono i zasadniczo określono jego sekwencję aminokwasową jak opisano w przykładzie XII. Tabela 5 przedstawia sekwencje kilku peptydów pochodzących z tego białka i podaje sekwencje mieszanin sond oligonukleotydowych użytych do izolowania genów kodujących opisany tutaj inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa.

Gen kodujący sekwencje obejmujące inhibitor o masie cząsteczkowej 40 kDa można wyizolować z ludzkiej biblioteki genomowej opisanej w przykładzie V lub biblioteki cDNA skonstruowanej z mRNA otrzymanego z komórek U937 traktowanych przez około 9 godz. PMA i PHA (patrz przykład 14). Każda biblioteka powinna zawierać około 1,0 x 106 rekombinantów.

168 844

Tabela 5

Sekwencja Peptydu	Nazwa sondy	Sekwencja Sondy
EYYDQTA AQUAFT KQEGCR QMUCSKU DQTAQMC PGWYCA	40KD-P2' 40KD-P1 40KD-PG 40KD-P5 40KD-P6' 40KD -P7	C 5'GAATATTATGATCAAACAGC 3' G C C CGG T CC C 5'GTAAAACGAACTTGAGC 3' G G G C G TT T C 5'AAACAAGAAGGATGTCG 3' G G G G CAC T C 5 'UATTTAGAACAACAUATTTG 3' C GCTG G C T C C 5'GATCAAACAGUACAAATGTG 3' C G G G G T T CC CC 5'CCAGGATGGTATTGTGC 3' G G T T

Przykład XIV. Izolowanie sekwencji cDNA inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa z komórek U937 indukowanych PMA/PHA.

mRNA komórek U937 wyizolowano z komórek indukowanych przez 9 godz. PMA/PHA. Selekcjonowano go na kolumnie z oligo-dT, i tak wyizolowany polindenylownoy mRNA użyto do wytworzenia dwuniciowego cDNA stosując odwrotną transkryptazę, a następnie polimeryzację I/RNazę E. coli. Dwcoikiowy cDNA poddawano amplifikacji przez polimeryzację DNA jako startery stosując zdegeoerownoe sondy (40 KD-P1'i 40 KD-P7) przedstawione w tabeli 5. DNA będące produktami tej reakcji testowano biotach Southern'n sondą 40 KD-P6' (patrz tabela 5) identyfikując pojedynczy prążek zawierający tę sekwencję. Prążek ten wyizolowano na żelu agarozowym i włączono do DNA faga M13 (szczep mpl8). Po transformacji szczepu E. coli JM109 i wysianiu na podłożu zawierającym X-gal i IPTG, zidentyfikowano przejrzyste łysinki zawierające właściwą wstawkę cDNA. Sekwencję DNA tego klonu przedstawiono na fig. 37 wraz z produktem translacji przewidzianym na podstawie tej sekwencji. Ta sekwencja ammokwasową odpowiada sekwencji peptydu przedstawionej na fig. 36 (reszty 12-104) i fig. 38.

Przykład XIV A. Izolowanie klonu cDNA inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa z komórek U937 indukowanych PMA/PHA.

Z ludzkich komórek U937, które eksponowano na PHA i PMA przez 9 godz. wyizolowano mRNA (Chirgwm, J.M. i in., Biochemistry 18, 5294-5299). Stosując oligo-dTcelulozę

168 844 z RNA tego oczyszczono mRNA (Aviv, H. i Leder, P., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 1408-1412). 5 pg tego mRNA użyto do syntezy 3pg dwuniciowego cDNA z tępymi końcami (Gubler. U. i Hoffman. B.J.., 1983, Gene 25, 263-269). Po dołączeniu łączników EcoRI, cDNA oczyszczono przez chromatografię kolumnową na Sephacryl S-400 (Pharmacia) i wytrącanie etanolem 100 ng tego cDNA wbudowano na 1 pg trawionego restryktazą EcoRI i traktowanego fosfatazą alkaliczną wektora lambda gtlO i upakowano in vitro stosując Gigapack Gold (Stratagene). Upakowanie cDNA dało 2,5 x 10⁶ rekombinantów po wysianiu na E. coli C600 hfl. 1,2 x 106 rekombinantów tej biblioteki przeszukano podwójną znakowaną ³²P sondą 40 kDa-P6+7 (5' GGG CGT ATG TGC TGT CCT CAC AGG 3'), jak opisali Benton, W.D. i Davis, R.W., 1977, Science 196, 180-182). Wyizolowano dwadzieścia dodatnio hybrydyzujących klonów i ponownie przeszukano sondami 40 KD-P6' i 40KD-P7 (patrz tabela V w przykładzie XIII). Cztery z tych klonów hybrydyzowały z wszystkimi trzema sondami. Jeden z tych klonów, c40DK#6, strawiono restryktazą EcoRI, wyizolowano wstawkę o długości 2,2 tysięcy par zasad i zsubklonowano w obu orientacjach w wektorze pochodzącym od bakteriofaga M13, mp19 (Yarrish-Parron, C., i in., 1985, Gene 33, 103-119). Określono sekwencję obu nici stosując metodę terminacji łańcucha (Sanger, F. i Coulson, A.R., 1975, J. Mol. Biol. 94, 441-448) z polimeraząDNA Tag (U.S. Biochemical). Sekwencję przedstawiono na fig. 39 wraz z wydedukowanym produktem jej translacji. Sekwencja zawiera pojedynczą otwartą ramkę odczytu rozciągającą się od trypletu ATG przy zasadzie 93 poza sekwencję C-końcową białka o masie cząsteczkowej 40 kDa przy tryplecie GAC przy zasadzie 863.

Przykład XV. Inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa hamuje TNF beta, jak również TNF alfa.

Zarówno inhibitor o masie cząsteczkowej 30 kDa, jak i inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa, badano w celu określenia czy są one zdolne także do hamowania aktywności TNF beta (limfotoksyny). Różne stężenie TNF beta (nabytego od Endogen) inkubowano z każdym z inhibitorów przez jedną godz. w temperaturze pokojowej. Powstałe mieszaniny analizowano przez układ oznaczeń wobec komórek L929, jak opisano w przykładzie I.B. 1. dla TNF alfa. Doświadczenia te wykazały, że inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa posiada mały wpływ hamujący na TNF beta. Inhibitor o masie cząsteczkowej 40 kDa wykazywał jednakże znaczące hamowanie TNF beta. Wyniki tych doświadczeń można zobaczyć na fig. 40.

Przykład XVI. Przygotowywanie biblioteki ludzkiego DNA genomowego dla inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa.

Odpowiednią bibliotekę ludzkiego DNA genomowego można otrzymać jak opisano w przykładzie V dla inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa.

Przykład XVII. Przygotowywanie genów do ekspresji cDNA inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa w Escherichia coli.

Części cDNA genu inhibitora TNF (40 kDa) kodujące rozpuszczalne aktywności wiązania TNF (fig. 39) przygotowywano do ekspresji w E coli jak opisano poniżej.

Ponieważ trudno było ostatecznie określić sekwencję C-końcową dojrzałego inhibitora. TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa pochodzącego z moczu lub komórek U937, skonstruowaliśmy trzy pochodne jego sekwencji kodującej cDNA w oparciu o analizę sekwencji klonu cDNA. Pierwsza rozciąga się do przypuszczalnej sekwencji transbłonowej tego białka przy 863 parze zasad (fig. 39) i kończy się sekwencją peptydu... Gly Ser Thr Gly Asp. Dwie następne są o 51 (Δ51) i 53 (Δ53) aminokwasy krótsze od tego klonu, i kończą się odpowiednio przy parach zasad 710 ... Ser Pro Thr, i 704 ... Ser Thr Ser.

Każdy z tych trzech C-klonów utworzono przez mutagenezę in vitro (MutaGene, BioRad, Richmond, CA) klonów M13 cDNA inhibitora TNFa o masie cząsteczkowej 40 kDa. Najpierw utworzono najdłuższy klon przez użycie następujących syntetycznych oligonukleotydów':

1. 5' CAC TGG CGA CTA AGC TTC GCT CTT C 3'

2. 5' GCG GCG CAC GCC GGA TCC GAT CTT GGA GGA TGA TTA AAT GTT GCC CGC CCA G 3'.

168 844

Oligonukleotyd i wprowadza kodon terminacji translacji po 235 aminokwasie, Asp, i tworzy w bym punkcie miejsce rozpoznawane przez endonukleazę resttp/kcyyj-ią. HindIII. Oligonukleotyd 2 dostosowuje N-końcową sekwencję dojrzałego białka, Leu Prp Ala ... 159 para zasad (fig. 39) do ekspresji w E. coli przez 1 (wprowadzenie kodonu dla Met, ATG, w pozycji aminokwasu 1 i 2) wprowadzenie translacyjnej sekwencji sprzęgającej przez 5' miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną BamHI. Zmutagenizowany fragment usunięto przez trawienie restryktazami BamHI/HindIII klonu Rf DNA mutanta M13, i wbudowano plazmidu ekspresyjnego dla E. coli, jak opisano w przykładzie 7. Klony niosące tę konstrukcję genową nazywano TNF 40.

Dwa skrócone klony skonstruowano jak powyżej stosując wyizolowane powyżej zmutagenizowane pochodne M13 klonu inhibitora TNFa o masie cząsteczkowej 40 kDa i następujące oligonukleotydy:

5' GTCCCCCACCTAAGCTTCGGAGTATGG 3' Δ51

5' GTCCACGTCCTAAGCTTCCCACCCGGA 3' Δ53

Te dwa oligonukleotydy wprowadzają kodony terminacji translacji odpowiednio przy parze zasad 710 i 704 (fig. 39). Klony niosące te konstrukcje genowe nazwano odpowiednio TNF:40 51 i TNF: 40 53.

Przykład XVIII. Ekspresja genów kodujących inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa w komórkach zwierzęcych.

Ekspresję klonu inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa można uzyskać jak opisano w przykładzie IX. Rozległy region zlokalizowany w kierunku 3' od C-końca inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa można wydeletować, i wstawić kodon stop do pozycji następującej bezpośrednio po C-końcowym kwasie asparaginowym.

Przykład XIX. Ekspresja całkowitego CDNA kodującego inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa w komórkach ssaków zwiększa ilość miejsc receptorowych dla TNF.

Przygotowano wektor ekspresyjny posiadający włączony cały cDNA inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa (2,1 tysięcy par zasad), przedstawiony na fig. 21, nazwany p30KXVA, który był pod każdym innym względem identyczny z wektorem przedstawionym na fig. 23 (tj. sekwencję TNF-BP przedstawioną na tej fig. zastąpiono cDNA o długości 2,1 tysięcy par zasad wykorzystując unikalne miejsce restrykcyjne EcoRI plazmidu). Dla pełniejszego opisu wektora ekspresyjnego patrz przykład IX. Plazmid ten wprowadzono do komórek COS7 stosując procedurę lipofekcji opisaną przez Feignera i in.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987). Stransfekowane komórki analizowano pod kątem ich zdolności do wiązania ['1⁵J]TNFa. Fig. 41 przedstawia wyniki oznaczeń wiązania komórek transfekowanych wektorem ekspresyjnym p30KXVA i komórek wobec których zastosowano procedurę kontrolną. Ilość miejsc wiążących na komórkach stransfekowanych plazmidem jest znacznie wyższa od ich ilości na komórkach kontrolnych. Klon całkowitego cDNA (tj. otwarta ramka odczytu kodująca białko znacznie większe od pochodzącego z moczu inhibitora o masie cząsteczkowej 30 kDa), rzeczywiście, reprezentuje klon cDNA receptora TNF.

Przykład XX. Ekspresja cDNA kodującego inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa w komórkach ssaków zwiększa ilość miejsc receptorowych dla TNF.

Przygotowano wektor ekspresyjny stosując fragment cDNA o długości 2,4 tysięcy par zasad wyizolowany z opisanego w przykładzie 14A faga lambda #6. Plazmid ten był identyczny z plazmidem opisanym w przykładzie IX (fig. 23) z tym wyjątkiem, że w plazmidzie tym sekwencje cDNA inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa zastąpiono sekwencjami cDNA inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa. Wyizolowano plazmidy z fragmentem restrykcyjnym EcoRI cDNA w każdej orientacji, nazwane p40KXVA (orientacja sensowna ) i p40KXVB (orientacja antysensowna). Plazmidy te zawierały miejsce replikacji SV40, wczesny promotor i sekwencję wzmacniającą, cytomegalowirusa, drugi intron B-globiny królika, cDNA inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa i wczesny sygnał poliadenylacji SV50 (dla pełniejszego opisu tego wektora patrz przykład IX) w plazmidzie opartym o pBR322. Plazmidami tymi transfekowano komórki COS7, dla których następnie oznaczano

168 844 wiązanie TNF (patrz fig. 42). Komórki stransfekowane plazmidem p40KXVA przejawiały większą ilość miejsc wiązanych TNF na powierzchni komórek niż same komórki COS7 lub komórki COS7 stransfekowane plazmidem p40KXVB, sugerując, że cDNA ten koduje receptor TNF. Opracować można inne komórki ssaków, takie jak komórki CHO, które mogą wytwarzać ten receptor lub które wydzielają inhibitor TNF do podłoża hodowli tkankowych sposobami opisanymi w przykładzie IX.

Przykład XXI. Inhibitor wyizolowany z ludzkich monocytów.

Monocyty ludzkie przygotowano z 550 ml krwi jak opisali Hannum, C.H. i in., Naturę 343, 336-340, 1990. Świeżo przygotowanymi monocytami (2 x 10⁷ komórek) zaszczepiono 500 ml wolnego od surowicy podłoża RPMI1640, i traktowano 10 ng/ml PMA i 5qg/ml PHA-P przez 24, 48 i 72 godz. w temperaturze 37°C. Po inkubacji zbierano podłoża przez wirowanie i zatężano do 50 ml. Zatężone podłoża nakładano na kolumnę powinowactwa z TNF (objętość złoża 2 ml) i eluowano kwasem jak w przykładzie I. Wyeluowany materiał oczyszczano dalej stosując kolumnę HPLC RPC-8 w takich samych warunkach jak w przykładzie I, i w każdej frakcji oznaczano cytotoksyczność wobec komórek L929. Fig. 43 przedstawia dwa pili aktywności hamowania TNF. Te dwa piki odpowiadają inhibitorom TNF o masach cząsteczkowych 30 kDa i 40 kDa, których obecność stwierdzono także w podłożu hodowlanym komórek U937 traktowanych PMA i PHA i zidentyfikowanym w moczu.

Przykład XXII. Ekspresja i oczyszczanie krótszych form inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa (Δ51 i Δ53) z E. coli.

Komórki z 300 ml hodowli E. coli (inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa 51 i inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa 53) prowadzących oddzielnie w warunkach indukujących przez 2 godz. zawieszano ponownie w 10 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, zawierającego 2 mM EDTA (bufor TE) i prasowano używając prasy komórkowej przy 20'000 G przez 10 minut. Oczyszczane osady przemywano raz buforem TE. Przemyte osady zawieszano ponownie w 2 ml 6 M chlorowodorku guanidyny/l 00 mM Tris-HCl, pH 8,5/4 mM PMSF i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godz.. Po inkubacji dodawano 500 mM DTT do końcowego stężenia 4 mM i mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez następną godz. Nierozpuszczalny materiał usunięto przez wirowanie przy 20 000 g przez 15 minut. Do supematantu dodawano 500 mM utlenionego glutationu do końcowego stężenia 20 mM, i mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Materiał ten. rozcieńczono następnie 20 ml 0,6% roztworu zasady Tris z 5 mM cysteiną. Po 16 godzinach inkubacji w temperaturze 4°C materiał ten dializowano w temperaturze 4°C przez 3 godz. wobec 300 objętości 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, a następnie wirowano przy 20 000- g przez 15 minut. Supernatant nakładano na kolumnę powinowactwa do TNF (0,7 x 2 cm, 13 mg rhTNF/ml Affigel-10) z szybkością przepływu 0,09 ml/minutę. Kolumnę tę płukano dużą objętością 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Związane białka eluowano 50 mM NaHJ^-HCl, pH 2,5. Kwaśne eluaty nakładano na kolumnę RP8 (2 x 200 mm, spelco), i inhibitory TNF eluowano liniowym gradientem acetonitrylu w 0,1% TFA, z szybkością przepływu 1 ml gradientu na minutę )fig. 44A i 45A). W celu zlokalizowania inhibitorów TNF frakcje oznaczano na cytotoksyczność wobec komórek L929. Główny pik każdego profilu elucji zawiera aktywność hamującą TNF (fig. 44B i 45B). Inhibitory TNF wytworzone w E. coli (inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa Δ53 i inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa Δ51) na SDS-PAGE migrują z oczekiwaną ruchliwością (fig. 44B i 45B). Aminokońcowe sekwencje tych materiałów wykazują, że inhibitory TNF wytwarzane w E. coli posiadają następującą sekwencję:

Met-Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-Phe-ThreProeTyreΔla-Pro-Glu

Używając tej procedury, otrzymano po około 150 μ każdego inhibitora TNF o masie ężąsSeczkowej 40 kDa (Δ51 i Δ53) z 30 ml hodowli. Wydajność wynosiła kilka procent, jednakże, można ją zwiększyć do ponad 30% udoskonalenie każdego etapu tego oczyszczania.

Oba te inhibitory TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa (51 i 53) hamują nie tylko TNF alfa, ale i TNF beta.

168 844

Przykład XXIII. Ekspresja i oczyszczanie inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa i pełnej długości.

Aktywny inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa oczyszczono ze szczepu E. coli niosącego plazmidy posiadające pełnej długości gen dojrzałego inhibitora o masie cząsteczkowej 40 kDa (jak w przykładzie XII). Do izolacji aktywnego inhibitora użyto tej samej metody jak w przykładzie XXII. Ten aktywny inhibitor hamuje zarówno TNF alfa jak i TNF beta, a sekwencja aminokońcowa jest taka sama jak przedstawiona w przykładzie XXII.

Przykład XXIV. Skład aminokwasowy inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa.

Analizowano całkowity skład aminokwasowy wytworzonego w komórkach U937 dojrzałego inhibitora TNF przez układ analizy PTC-aminokwasów. Stwierdzony i przewidywany skład aminokwasowy dojrzałego inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa o pełnej długości, jak przedstawiono na fig. 38, przedstawiono w tabeli 6.

Przykład XXV. Wytwarzanie chemicznie zmodyfikowanych inhibitorów TNF.

W celu wydłużenia półokresu trwania inhibitorów TNF w osoczu, można utworzyć inhibitory TNF zmodyfikowane chemicznie glikolem polietylenowym. Modyfikacji tej można dokonać przez sieciowanie PEG z resztami cysternowymi cząsteczek inhibitorów TNF. Ponieważ wszystkie reszty cysteiny w inhibitorach TNF tworzą wiązania dwusiarczkowe, można skonstruować zmutowane inhibitory TNF, które zawierają dodatkową resztę cysteiny przy końcu aminowym, w miejscu glikozylacji i przy końcu karboksylowym każdego inhibitora. Mutagenezę przeprowadzać można przez PCR stosując oligonukleotydy zawierające pożądaną mutację. Do inhibitora TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa, dodano dodatkowe reszty cysteiny w pozycjach 1, 14 lub 105. Te mutanty białkowe eksprymowano w E. coli. stosując ten sam układ jak opisano w przykładach VII, XXII i XXIII i renaturowano do aktywnego inhibitora TNF. Zmutowane białka były tak aktywne jak niezmutowane. Przeprowadzi się modyfikację PGE tych białek i oznaczy aktywność. Mutanty o masie cząsteczkowej 40 kDa będzie się konstruować jak powyżej i prowadzić się będzie modyfikacje PGE w celu otrzymania aktywnych białek i zwiększenia stabilność inhibitora TNF.

Tabela 6

	Liczba obliczona na podstawie sekwencji DNA	Liczba oznaczona
1	2	3
Asx	14	13,0
Glx	23	22,6
Ser	25	23,2
Gly	14	17,8
His	4	4,5
Thr	26	23,9
Ala	17	17
Arg	14	15,1
Pro	26	22,3
Val	13	8,7
Ile	4	3,4
Leu	10	8,6

168 844

1	2	3
Phe	5	4,6
Lys	6	5,4
Tyr	5	5,0
Trp	3	NO
Met	3	NO
Cys	22	NO

NO: nie oznaczano

Jest zrozumiałe, że stosowanie procedur według niniejszego wynalazku, w świetle zawartych tu informacji, do określonych układów ekspresyjnych jest w zasięgu możliwości każdego fachowca w tej dziedzinie. Oczywiste jest zatem, że fachowcy ci będą mogli czynić różne modyfikacje i odmiany sposobów i produktów według niniejszego wynalazku. Jest zamiarem, aby niniejszy wynalazek pokrywał te modyfikacje i odmiany, które wchodzą w zakres dołączonych zastrzeżeń i ich równoważników.

FIG. 1

168 844 b Q ©

FIG.2

FIG. 3

WO

168 844

FIG. 6 Δ

47 49 51 53 55 57 59 61 63 65

168 844

FIG. 7

168 844

FIG. 8 A

168 844

FIG.8 Β

168 844

24 26 28 30 32 34 36 38 40

FIG.8C

FIG.9A

168 844

Alkilowany- trawienie TNF-bp endproteazą *Lys-C

FIG.9B

Alkilowany-trawienie TNF-bp endoproteazą*Lys-C odwrócony chromatograf nieparzyste #23,25,27,33,37

FIG. 9 B

168 844

Alkilowany-trawienie TNF-bp endoproteazą *Lys-C odwrócony chromatograf parzyste *24,26,28,32,35

FIG. 9 B

168 844

215

FIG. 10

168 844

FIG. 11A

FIG. TIB

168 844

O Ω *□» £-» α

o ο

CU ο

CU * u Ω Z *

o <N

B *

*

> J	u z	2. u
	z 1	*
o		1		3		z
X		1	*	u		X
X		cn		cn		X
u	*	u		>	*	o
X		w	«Β	u		o
H o		J		w	*	u
CO
U U	*	u		z		>			co
	33		w		E*
									LxZ
I-I		X		X		Q	2
cn		u				X	w
Z		33		X		a	H
z Ol		Z		Cm		>	O
	W		O		E-I
dc							CU
	cn		<	B	o
33				s		cn	Ω
							* o
i-l		E-i	*	u		cn
		Cu				H	Ω !*2
Z		cn	*	u		w

O Ol		o		>		>	* O
	cn		E-i		σ	W

fM		1		Z		o
o		1		Ol		s		χ->
							W	o
>		1		«		w
w		1		W		X
Q	*	u
				«		o	Ω

168 844

CATGCCTGCA GGTCGACTCT AGAGGATCTG GGGCCTACTA GCTTiGAGTT GAGGGAACAA AAATGAACAC 80 90 TOO TB 120 130 140

ACAGGACAACTAGAGAACAATTAAGCATCA GATTGIATGC CCCAACTGTC TAAGTTTCAA GGAAGAACTC

150 Έ0 170 180 Ώ0 200 210

TAAACTTAGT GAGTGGCGTG GCCTGGGCGG AATGTTTCAC TGAGGAAGGA CTTGAGCCAG GGAAGTTTTA

220 230 240 250 260 270 280

GATCTGCTAC CCCTAAGCTT CCCATCCCTC CCTCTCTTGA TGG1GTCTCC TCTATCTGAT TCTTCCCCAG

289 298 307 316 325 334 brCTTi^GSG^WGiGGGAAiSiAĆĆCCTĆAGGGGnAnGTAnGGTĆ Vdl Leu Leu Glu Leu Leu Vq! Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val __343__ 352 __361 _ 370 __ 379 _ 388

CCT CAC CTA GGG GAĆ AGG GAG AAG AGA GAT AGT GIG ΊΒΤ SĆ ĆAAGGA ΔΑΑ W

Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Ara Asp Ser Val Cys Pro Gin Gly Lys Tyr

397 406 415 424 433 444

CG AK TGC TGT ACC AAG TGC CAC ΔΔΔ G GTAGGGCAA Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Ala

ATC CAC CCI CAAAAIAAT Ile His Pro Gin Asn Asn

454 464 474 ' ' 484 ’ ' 494 ’ 504 514

GTGGAAACGG TGAATGCCCT CAGGTCTGGG GTGCTGCTTC TTTCTCTGCT TCTTCCAGTT GTTCTTCCCT

524 534 544 554 564 574 584

AACTTTGCTG TCTCTCCTGG GCTGGGAKT TCTCCCTCCC TCCTCTCCTA GAGACTTCAG GGAATCGGCC

594 604 614 524 634 644 654

CTGGCTGnG TCCCTAGCAT GGGGCTCCTT CCITGTGTTC TCACCCGCAG CCTAACTCTG CGGCCCCATT

664

673

682

691

700

CA CA GGA ACC TAC TTG TAC ΔΔΤ GAC TGT CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACG GAC Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp

709 __ 718 727 736 745 754

TgćagggagtgtgagagćmtcćttćaTcgcttća GAAAAC ĆAĆ CTĆ AGA ĆAC Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Ara His 763 772 781 797 807 817

TGC TTC 25C TGC ICC ATaTSC CCS SJffi GGTGAGTGTG CACAGGCAGG AGAGTCAGGC Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Ara Lys

827 837 847 857 867 877 887

GGGTCTTGAG TGGTGTGTGG GTGCCTGTCT ATGTGCAGGC TGGTGGGTGT GS5CAGGAAG GTGTGTGTT

897 907 917 927 937 947 957

TGGTGGGACA CTGCATGGAT GTGAGTGTGT ATTACAGAGA CACACACTTA GGGGTATGTC AGGAAGGGGA

967 977 987 997 1007 1016

TGCAGGGACA GGAGGATGCA GGACTCATAC CCCATCTTCT CCCCTCACCA GAA MG GGT CAG Glu MET Gly Gin

1025

GTC GSG STC

Val Glu Ile

FIG. 13

168 844

3 4 5 6 7 8 9

Ścieżka 1 - kontrola pozytywna-oczyszczony TNF-BP w kompleksie z¹²⁵I-TNF.

Ścieżka 2-5 -białka z inkubacji w czasie 2^,48,72 i 96godzin z PMA/PHA nie wiążące sie z kolumną powinowadztwa do TNF.

Ścieżka 6-9 - materiał z tych samych inkubacji, który wiąże sie z kolumną powinowadztwa do TNF.

FIG. 15

168 844

27 28 29 fc· . 4 .-· ż

³⁰ 3132 33 31, 35 · “ S ? . $

Frakcje 27, 28 i 29,33 i 3A ilustrują aktywność wiązania TNF.

♦ - odpowiada ścieżce 1 z Fig. 15 — odpowiada ¹²⁵I-TNF.

FIG. 16

168 844

Nr ΡΜΔ / ΡΗΔ

PMA/PKA 1 godz. 1/godz.

9.49 Kb

7.46

4.4

«

FIG. 17

21 51 12 22 52

i tj

168 844

Asp

Ser

Val

Cys

Pro

Gin

Gly

Lys

Tyr

Ile

His

Pro

Gin

Asn

Ser

Ile

Cys

20 Thr

Lys

Cys

His

Lys

Gly

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asp

Cys

Pro

Gly

Pro

Gly

Gin

Asp

Thr

40 Asp

Cys

Arg

Glu

Cys

Glu

Ser

Gly

Ser

Phe

Thr

Ala

Ser

Glu

Asn

His

Leu

Arg

His

Cys

60 Leu

Ser

Cys

Ser

Lys

Cys

Arg

Lys

Glu

Met

Gly

Gin

Val

Glu

Ile

Ser

Cys

Thr

Val

80 Asp

Arg

Asp

Thr

Val

Cys

Gly

Cys

Arg

Lys

Asn

Gin

Tyr

Arg

His

Tyr

Trp

Ser

Glu

Asn

100 Leu

Phe

Gin

Cys

Phe

Asn

Cys

Ser

Leu

Cys

Leu

Asn

Gly

Thr

Val

His

Leu

Ser

Cys

Gin

120 Glu

Lys

Gin

Asn

Thr

Val

Cys

Thr

Cys

His

Ala

Gly

Phe

Leu

Arg

Glu

Asn

Glu

Cys

140 Val

Ser

Cys

Ser

Asn

Cys

Lys

Ser

Leu

Glu

Cys

Thr

Lys

Leu

Cys

Leu

Pro

Gin

Ile

160 Glu

Asn

FIG. 19

168 844

296 305

GAT AGT GTG TGT CCC CAA Asp Ser Val Cys Pro Gin

314

323

332

341

350

359 AAA Lys 413

GGA AAA

TAT Tyr 368

ATC Ile

CAC His

CCT Pro 377

CAA Gin

AAT Asn

AAT TCG

ATT Ile

TGC Cys 335

TGT Cys

ACC Thr

AAG Lys 404

TGC Cys

CAC His

Gly

Lys

Asn 386

Ser

GGA

ACC

TAC

TTG

TAC

AAT

GAC

TGT

CCA

GGC

CCG

GGG

CAG

GAT

ACG

GAC

TGC

AGG

Gly

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asp

Cys

Pro

Gly

Pro

Gly

Gin

Asp

Thr

Asp

Cys

Arg

422

431

440

449

458

467

...

_____

...

GAG

TGT

GAG

AGC

GGC

TCC

TTC

ACC

GCT

TCA

GAA

AAC

CAC

CTC

AGA

CAC

TGC

CTC

Glu

Cys

Glu

Ser

Gly

Ser

Phe

Thr

Ala

Ser

Glu

Asn

His

Leu

Arg

His

Cys

Leu

476

485

494

503

512

521

______

.. _

... . _

____

. ...

____

...

....._

A.GC

TGC

TCC

AAA

TGC

CGA

AAG

GAA

ATG

GGT

CAG

GTG

GAG

ATC

TCT

TGC

ACA

Ser

Cys

Ser

Lys

Cys

Arg

Lys

Glu

MET

Gly

Gin

Val

Glu

Ile

Ser

cys

Thr

530

539

548

557

566

575

. ...

. ..

. ....

.

_____

....

.. ...

. ..

....__

- —

GTG

GAC

CGG

GAC

ACC

GTG

TGT

GGC

TGC

AGG

AAG

AAC

CAG

TAC

CGG

CAT

TAT

TGG

Val

Asp

Arg

Asp

Thr

Val

Cys

Gly

Cys

Arg

Lys

Asn

Gin

Tyr

Arg

His

Tyr

Trp

584

593

602

611

620

629

AGT

GAA

AAC

CTT

TTC

CAG

TGC

TTC

AAT

TGC

AGC

CTC

TGC

CTC

AAT

GGG

ACC

GTG

Ser

Glu

Asn

Leu

Phe

Gin

Cys

Phe

Asn

Cys

Ser

Leu

Cys

Leu

Asn

Gly

Thr

Val

638

647

656

665

674

683

_

. ..

. ......

.. .

...........

-- -

_

ĆAĆ

ĆTC

TCC

TGC

CAG

GAG

AAA

CAG

AAC

ACC

GTG

TGC

ACC

TGC

CAT

GCA

GGT

TTC

Kis

Leu

Ser

Cys

Gin

Glu

Lys

Gin

Asn

Thr

Val

Cys

Thr

Cys

His

Ala

Gly

Phe

692

701

710

719

728

737

__

...........

_ .

_____

_

TTT

CTA

AGA

GAA

AAC

GAG

TGT

GTĆ

TCC

TGT

AGT

AAC

TGT

AAG

AAA

AGC

CTG

GAG

Pne

Leu

Arg

Glu

Asn

Glu

Cys

Val

Ser

Cys

Ser

Asn

Cys

Lys

Ser

Leu

Glu

746

755

764

... ...

. . .

.

__

TGC

ACG

AAG

TTG

TGC

CTA

ccc

CAG

ATT

GAG

AAT

Cys

Thr

lys

Leu

Cys

Leu

Pro

Gin

Ile

Glu

Asn

Fig. 20

168 844

20 30 *0 50 60 70

6atc«ctscg Atcńcecccr caictctatg c<x.6ógTctc αλρχ-ύοααο -raTch<x.«cA ąggcacttcg ao 60 100 110 120 130 140

GACGTCCTGG ACAGACCGAG TCCCGGGAAG CCCCAGCACT GCCGCTGCCA CACTGCCCTG AGCCCAAATG

150 160 171 ISO 139 193 >__________

GGGGAGTGAG ,

AGGCCATAGC TGTCTGGC

ATG GGC

CTC

TCC i

ACC '

GTG i

CCT i

GAC

CTG i

CTG

MET Gly

Leu

Ser

Thr ’

yal l

⁵ro «

Asp i

Leu i

L£u

207

216

225

234

243

252

__

— - . _ -

__

—

___

__

CTG

CCS

CTG

GTG

CTC

CTG

GAG

CTG

TTG GTG

GGA

ATA

TAC

CCC

TCA

GGG

fil I

ATT

Leu

Pro

Uau

Val

Leu

Siu

Leu

Leu vai

Gly

Ile

Tyr

Pro

Ser

Gly

VAl

Ho

261

270

279

283

297

306

. -......

___.

.......

- -

_

______

____

_ -

____

.. - _

GGA

CTG

GTC

CCT

CAL

CTA

GGG

GAC

AGG GAG

AAG

AGA

GAT

AGT

GTG

TGT

ccc

CAA

Gly

Leu

Val

Pro

His

Leu

Gly

Asp

Arg Glu

Lys

Arg

Asp

Ser

Val

Cys

Pro

Gin

315

324

333

342

351

360

GGA AAA Gly Lys

TAT Tyr 369

ATC CAC CCT

CAA Gin

AAT AAT TCG ATT TGC TGT

ACC AAG

TGC Cy»

CAC Hi»

AAA Lys 414

1 la

Mis

Pro 37Θ

Asn

Asn 387

Ser

He

Cys 396

Cys

Thr

Lye 405

GGA

ACC

TAC

TTG

TAC

AAT

GAC

TGT

CCA

GGC

CCG

GGG

CAG

GAT

ACG

GAC

TGC

AGG

Gly

Tnr

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asp

Cys

Pro

Gly

Pro

Gly

Gin

Asp

Thr

Asp

Cys

Arg

423

432

441

450

459

460

GAG

TGT

GAG

AGC

GGC

TCC

TTC

ACC

GCT

TCA

GAA

AAC

CAC

CTC

AGA

CAC

TGC

CTC

Glu

Cys

Glu

Ser

Gly

Ser

Phe

Thr

Ala

Ser

Glu

ASn

His

Leu

Arg

Hio

Cys

Leu

477

4S6

495

504

513

522

AGC

TGC

TCC

AAA

TGC

CGA

AAG

GAA

ATG

GGT

CAG

GTG

GAG

ATC

TCT

TGC

AC A

Ser

Cys

Ser

Lys

Cys

Arg

Ly.

Glu

MET

Gly

Gin

Val

Glu

Ile

Ser

Sar

Cys

Thr

531

540

549

558

567

576

GTG

GAC

CGG

GAC

ACC

GTG

TGT

GGC

TGC

AGG

AAG

AAC

CAG

TAC

CGG

CAT

TAT

TGG

val

Asp

Arg

Asp

Thr

val

Cy»

Gly

Cys

Arg

Lys

Aon

Gin

Tyr

Arg

His

Tyr

Trp

503

594

603

612

621

630

AGT

GAA

AAC

CTT

TTC

CAG

TGC

TTC

AAT

TGC

AGC

CTC

TGC

CTC

AAT

□GG

ACC

GTG

Ser

Glu

Asn

Leu

Phe

Gin

Cys

Phe

Asn

Cyd

Ser

Leu

Cys

Leu

Asn

Gly

Tnr

vai

639

640

657

666

675

604

CAC

CTC

TCC

TGC

CAG

GAG

AAA

CAG

AAC

ACC

GTG

TGC

ACC

TGC

CAT

GCA

GGT

TTC

His

Leu

Ser

Cys

Gin

Glu

Lys

Gin

Asn

Thr

Vai

Cys

Thr

Cys

His

Ala

Gly

Phe

FIG. 21

168 844

593

702

711

720

729

?3β

TTT

CTA

AGA

GAA

AAC

GAG

TST

GTC

TCC

TGT

AGT

AAC

TGT

AAG

AAA

AGC

CTG

GAG

Phe

Leu

Arg

Glu

Asn

Glu

Cys

Val

Ser

Cys

Ser

Aan

Cys

Lys

Sar

Leu

Glu

747

75o

763

774

783

792

TGC

ACG

AAG

TTG

TGC

CTA

CCC

CAG

ATT

GAG

AAT

GTT

AAG

GGC

ACT

GAG

GAC

TCA

Cya

Thr

Lya

Leu

Cys

Leu

Pro

Gln

I le

Glu

Aan

Yal

Lys

Gly

Thr

Glu

Asp

Ser

801

810

819

828

037

346

_____

.. -

- -

, - —

_____

. -

___

TGC

. -

TCC

GGC

ACC

ACA

GTG

CTG

TTG

CCC

CTG

GTC

ATT

TTC

i i i

GGT

CTT

TTA

Gly

Thr

Val

Leu

Pro

Leu

Val

Ile

Phe

Gly

Leu

Cys

Leu

Ser

555

564

573

552

89i

900

CTC

TTC

ATT

GGT

TTA

ATG

TAT

CGC

TAC

CAA

CGG

TGG

AAG

TCC

AAG

CTC

TAC

Leu

Phe

η»

Gly

Leu

ηετ

Tyr

Arg

Tyr

Gln

Arg

Trp

Lys

Ser

Lya

Leu

Tyr

909

915

927

936

945

954

TCC

ATT

GTT

TGT

GGG

AAA

TCG

ACA

CCT

GAA

AAA

GAG

GGG

GAG

CTT

GAA

GGA

ACT

Ser

Ile

Val

Cys

Gly

Lya

Ser

Thr

Pro

Glu

Lya

Glu

Gly

Glu

Leu

Glu

Gly

Thr

963

972

951

990

999

1008

ACT

AAG

CCC

CTG

GCC

CCA

AAC

CCA

AGC

TTC

AGT

CCC

ACT

CCA

GGC

TTC

ACC

Thr

Lya

Pro

Leu

Ala

Pro

Aan

Pro

Ser

Phe

Ser

Pro

Thr

Pro

Gly

Phe

Thr

1017

1026

1035

1044

1053

1062

CCC

ACC

CTG

GGC

TTC

AGT

CCC

GTG

CCC

AGT

TCC

ACC

TTC

ACC

TCC

AGC

TCC

ACC

Pro

Thr

Leu

Gly

Phe

Ser

Pro

Val

Pro

Ser

Thr

Phe

Thr

Ser

Thr

1071

1050

1059

1098

1107

1116

TAT

ACC

CCC

GGT

GAC

TGT

CCC

AAC

TTT

GCG

GCT

CCC

CGC

AGA

GAG

GTG

GCA

CCA

Tyr

Thr

Pro

Gly

Aap

Cya

Pro

Aan

Phe

Ala

Ali

Pro

Arg

Glu

Val

Ali

Pro

1125

1134

1143

1152

1161

1170

CCC

TAT

CAG

GGG

GCT

GAC

CCC

ATC

CTT

GCG

ACA

GCC

CTC

GCC

TCC

GAC

CCC

ATC

Pro

Tyr

Gin

Gly

Ala

Asp

Pro

Ile

Leu

Ala

Thr

Ala

Leu

Ala

Ser

Aap

Pro

Ile

1179

1185

1197

1205

1213

1224

CCC

AAC

CCC

CTT

CAG

AAG

TGG

GAG

GAC

AGC

GCC

CAC

AAG

CCA

CAG

AGC

CTA

GAC

Pro

Aon

Pro

Leu

Gln

Lya

Trp

Glu

Asp

Ser

Ala

His

Lya

Pro

Gln

Sor

Leu

Aap

1233

1242

1231

1260

1269

1279

ACT

GAT

GAC

CCC

GCG

ACG

CTG

TAC

GCC

GTG

GAG

AAC

GTG

ccc

CCG

TTG

CGC

Thr

Aap

Pro

Ala

Thr

Leu

Tyr

Ala

Val

Glu

Asn

Yal

Pro

Leu

Arg

1257

1296

1305

1314

1323

1332

TGG

AAG

GAA

TTC

GTG

ĆGG

CGC

CTA

GGG

CTG

AGC

GAC

CAC

GAG

ATC

GAT

CGG

i CTG

Trp

Lya

Glu

Phe

Val

Arg

Leu

Gly

Leu

Ser

Asp

His

Glu

He

Aap

Arg

Leu

FIG. 21 (ciąg dalszy - 1)

168 844

1341 1330 1339 136Θ 1377 13θό

SAG

CTG

CAG

AAC

GGG

CGC

TGC

CTG

CGC

GAG

6CG

CAA

TAC

AGC

ATG

CTG

GCG

ACC

Glu

Leu

Gin

Asn

Gly

Arg

Cys

Leu

Arg

Glu

Ala

Gin

Tyr

Ser

MET

Leu

Ala

Thr

1395

1404

1413

1422

1431

1440

TGG

AGG

CGG

CGC

acg

CCG

CGG

CGC

GAG

GCC

ACG

CTG

GAG

CTG

GGA

CGC

GTG

Trp

Arg

Thr

Pro

Arg

Glu

AU

Thr

Leu

Glu

Leu

Gly

Arg

val

1449

1458

1467

1476

1495

1494

. -

-

_____

- .

--- .

- - .

-

Ćtc

Sec

GAC

ATG

GAC

CTG

GGC

TGC

CTG

GAG

GAC

ATC

GAG

GCG

CTT

TGC

Leu

Arg

A&p

ηετ

A&p

Leu

Gly

Cye

Leu

Glu

Asp

Ile

Glu

AU

Leu

Cys

1503

1312

1321

1330

1546

1536

____

_____

. - .

__

___

_>

esc

GCC

CTC

CCG

CCC

GCS

CCC

AGT

CTT

CTC

AGA

TGA

GGCTSCSCCC

CTGCSGGCAG

Gly

Pro

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ser

Leu

Arg

' 13*i	1376	1586	1396	1606	1616	1626
CTCTAAGSAC	CGTCCTGCGA	GATCGCCTTC	CAACCCCACT	TTTTTCTGGA	AAGGAGGGGT	CCTGCAGGGG
1636	1646	1656	1666	1676	1686	1696
CAAGCAOGAS	CTAGCAGCCG	CCTACTTGGT	GCTAACCCCT	CGATGTACAT	AGCTTTTCTC	AGCTGCCTGC
1706	1716	1726	1736	1746	1736	1766
GCGCCGCCGA	CAGTCAGCGC	TGTGCGCGCG	GAGAGAGGTG	CGCCGTGGGC	TCAAGAGCCT	GAGTGGGTGG
1776	1786	1796	1906	1816	1826	1836
TTTGCGAGGA	TGAGGGACGC	TATGCCTCAT	GCCCGTTTTG	GGTGTCCTCA	CCAGCAAGGC	TGCTCGGGGG
1S46	1836	1866	1876	1886	1896	1906
CCCCTGGTTC	GTCCCTGAGC	CTTTTTCACA	GTGCATAAGC	A6TTTTTTTT	GTTTTTGTTT	TGTTTTGTTT
1916	1926	1936	1946	1956	1966	1976
TGTTTTTAAA	TCAATCATGT	TACACTAATA	GAAACTTGGC	ACTCCTGTCC	CCTCTGCCTG	GACAAGCACA
19S6	1996	2006	2016	2026	2036	2046
TAGCAAGCTG	AACTGTCCTA	AGGCAGGGGC	GAGCACGGAA	CAATGGGGCC	TTCAGCTGGA	GCTGTGGACT
2036	2066	2076	2086
TTTGTACATA	CACTAAAATT	CTGAAGTTAA	AGCTCAAAAA	AA

FIG. 21 (ciąg dalszy - 2)

168 844

Ε<

U

<	3 H	a 0 -P 01
Eh	E-i	a
<	<	Ul
o	U
<	Eh	a
o	<	01	CU
o	O	<
3 o	O <	3 I—I	c ’3 o
O	O	o
	O		w
	E-i	<u	c
Eh	El	Uł	o
Eh	O	Φ	l_
Eh	fcH	r—1	Φ N
Cl	<	H

E-i	U	a
Ei	Eh	a
E-i	<	01
O	O	<
Eh	O
E-i	U	Λ
Eh	<	Eh
Eh	Et	>1
	O	r—ł
<	O	O
Eh	O	-P
<	El	0)
		2

Ol

O*i co

<	U>	O
Ei		u	e
y		<	ι-1			U_
Eh O	O -X *« o	o <	o >1			l·-
Cl		o	Uł
U	5	o	o			σ S·.
Eh	o*	Eh	>1	u	0	O
Eh	(—	O	r-U	u	P	'~
Eh	φ	O	O	u	CU	_Q
O	5	Eh	M	u	03	lc c
O	fil	U	Λ	o	>1	•—
υ	w W	<	E-*	EH	O	·=>
<	O	O	«Ρ	Ei	r-ł	o c
	T—	EH	Φ	Eh	rd	Φ
υ	□	<	2	O	>	$
<	c Φ	U	P	U	p	-X Φ
u	σι	O	0)	O	α>	{/}
o		<	W	<	ω
	,χ					-X
Eh	φ	Eh		O	CU	Φ
Eh		U	r—ł	<	03
<	σ	Ό		o	<	σ
	N					N
<	u	O	4J	o	-Ρ	O
O	O	Eh	Φ	EH	Φ	O
	Cl		2	<	2	CU

168 844

amp

168 844

amp

168 844

Λ2Ί5

F«N

30 31 32 33 34 35 35

168 844

FIG.27

OD57O (próba LS29)

29 30 32 33 3 4 35 36 37 38 39 40

—

168 844

FIG. 29

33 32

30 29 . ί,., ' ··.'·;· · :·'ί

FIG. 30 kDa 30 kDa kDa

168 844

Ll o

in ic c

-Val-( )-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-( )-Asn-( )-IleI θ'

JL

I

W >1

U ł

Jl

X

H i

I a

a)

X

I

	Jl Φ cn	w >1 O		ω >1 U
	1 >1	W		1 W
	r-l	>1		x
	o I	X
	1 0	JL		l JL
	Lł	Φ		0
	CL \|	ω 1		W
	1 a	I ω		ł >1
	r—1			rL
	U	u >		O
	O	1 ω		1 0
	Jl	>*		Jl
	CL I	O t		CL
	ł <a	1 4J		0
	f—ł	0		rL
	< I	S f		O
	JL	a		o
	>1	rL		Li
	Eh	O		CL
	I	\|		1	Γ“·
	0	d		σί	cn
	Jl	r-L		r—1
	CL			rf	co
	Ll	w		ł Jl	l_l_
	X	X		>1
	Eh 1	H 1		&L
	1 Φ	1 c	σ	1 o
□	X	X	Q	Jl
a	CL 1	O f		CL f
.X	aj	Ch	O	JL
o	i—ł	U)		X
-4		rf	«—·	Η
	1	1		ł
	r—ł	JL	—1	<U
en	aJ > t	>» H 1	N O	X CL \|
cn	1 u	1 μ	O	1 tf
Z)	I—ł		£	r—1
N	o 1	£H ł	N	rf 1

LL _c c

<0 l-L <

i o

Lł

CL

I

Φ

X o

i

CP u

<c

I

0) u

LL □

-7 ftf >

H- |

ΓΜ rd

u. O r « jo J c

Glu168 844

FIG. 32

FIG. 33

Arg. C Δ215

168 844

FIG. 34

FIG , 35

168 844

UJ

5*

168 844

5'-CCG Pro

58

GGG Gly

64 AGC Ser 118

73

62 GAA Glu 136

91

100

ACA Thr

TGC cys

CGG Arg 127

CTC Leu

AGA Arg

TAC Tyr

TAT Tvr

GAC Asp 145

CAG Gln

ACA Thr

GCT Ala 154

CAG Gln

ATG MET

GAG GlU 109

CCC Pro

_

TGC

AGC

AAG

TGC

TCG

CCG

GGC

CAA

CAT

GCA

AAA

GTC

TTC

TGT

ACC

AAG

ACC

Cys

Ser

Lys

Cys

Ser

Pro

Gly

Gln

His

Ala

Lys

Val

Phe

Cys

Thr

Lys

Thr

163

172

181

190

199

208

_

TCG

GAC

ACC

GTG

TGT

GAC

TCC

TGT

GAG

GAC

AGC

ACA

TAC

ACC

CAG

CTĆ

TGG

AAC

Ser

Asp

Thr

Val

Cys

Asp

Ser

Cys

Glu

Asp

Ser

Thr

Tyr

Thr

Gln

Leu

Trp

Asn

217

226

235

244

253

262

. -._r

_____

__

_

TOG

GTT

CCC

GAG

TGC

TTG

AGC

TGT

GGC

TCC

CGC

TGT

AGC

TCT

GAC

CAG

GTG

GAA

Trp

Val

Pro

Glu

Cys

Leu

Ser

Cys

Gly

Ser

Arg

Cys

Ser

Asp

Gln

Val

Glu

217

280

289

298

307

316

_

ACT

CAA

GCC

TGC

ACT

CGG

GAA

CAG

AAC

CGC

ATC

TGC

ACC

TGC

AGG

CCC

GGC

TGG

Thr

Gln

Ala

Cys

Thr

Arg

Glu

Gln

Asn

Arg

Ile

Cys

Thr

Cys

Arg

Pro

Gly

Trp

325

TAC Tyr	TGC-3' Cys	Fig	. 37
	Leu Pro Ala Gln	Val Ala Phe Thr	Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser
	Thr Cys Arg Leu	Arg Glu Tyr Tyr	Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys
	Ser Lys Cys Ser	Pro Gly Gln His	Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr
	Ser Asp Thr Val	Cys Asp Ser Cys	Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu
	Trp Asn Trp Val	Pro Glu Cys Leu	Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser
	Asp Gln Val Glu	Thr Gln Ala Cys	Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys
	Thr Cys Arg Pro	Gly Trp Tyr Cys	Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys
	Arg Leu Cys Ala	Pro Leu Arg Lys	Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala
	Arg Pro Gly Thr	Glu Thr Ser Asp	Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro
	Gly Thr Phe Ser	Asn Thr Thr Ser	Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His
	Gln Ile Cys Asn	Val Val Ala Ile	Pro Gly Asn Ala Ser Arg Asp Ala
	Val Cys Thr Ser	Thr Ser Pro Thr	Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val
	His Leu Pro Gln	Pro Val Ser Thr	Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr
	Pro Glu Pro Ser	Thr Ala Pro Ser	Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly
	Pro Ser Pro Pro	Ala Glu Gly Ser	Thr Gly Asp

FIG. 38

168 844

20 30 40 50 60 70

GAATTCGGCG CAGCGGAGCC TGGAGAGAAG GCGCTGS6CT GCGAGGGCGC GAGGGCGCGA GGGCAGGGGG

80 90 > CAACC6GACC CCGCCCGCAC CC ATG GCG HET Ala

101 i CCC GTC Pro Val

110 119 ' GCC GTC TGG GCC GCG CTG GCC

Ala Val

Trp Ala Ala Leu Ala

128

137

146

133

164

173

GTC

GGA

CTG

GAG

CTC

TGG

GCT

GCG

CAC

GCC

TTG

CCC

GCC

CAG

GTG

GCA

TTT

Mai

Gly

Leu

Glu

Leu

Trp

Ala

His

Ala

Leu

Pro

Ala

Gin

Val

Ala

Phe

182

191

200

209

218

227

ACA

CCC

TAC

GCC

CCG

GAG

CCC

GGG

AGC

ACA

TGC

CGG

CTC

AGA

GAA

TAC

TAT

GAC

Thr

Pro

Tyr

Ala

Pro

Glu

Pro

Gly

Ser

Thr

Cys

Arg

Leu

Arg

Glu

Tyr

Asp

236

245

234

263

272

281

CAG

ACA

GCT

CAG

ATG

TGC

AGC

AAG

TGC

TCG

CCG

GGC

CAA

CAT

GCA

AAA

GTC

Gin

Thr

Ala

Gin

KET

Cys

Ser

Lys

Cys

Ser

Pro

Gly

Gin

His

Ala

Lys

Val

290

299

308

317

326

335

TTC

TGT

ACC

AAG

ACC

TC6

SAC

ACC

GTG

TGT

GAC

TCC

TGT

GAG

GAC

AGC

ACA

TAC

Phe

Cys

Thr

Lys

Thr

Ser

Asp

Thr

Val

Cys

Asp

Ser

Cys

Glu

Asp

Ser

Thr

Tyr

344

353

362

371

380

389

ACC

CAG

CTC

TGG

AAC

TGG

GTT

CCC

GAG

TGC

TTG

AGC

TGT

GGC

TCC

CGC

TST

AGC

Thr

Gin

Leu

Trp

Asn

Trp

Val

Pro

Glu

Cys

Leu

Ser

Cys

Gly

Ser

Arg

Cys

Ser

398

407

416

423

434

443

TCT

GAC

CAG

GTG

GAA

ACT

CAA

GCC

TGC

ACT

CGG

GAA

CAG

AAC

CGC

ATC

TGC

ACC

Ser

Asp

Gin

Val

Glu

Thr

Gin

Ala

Cys

Thr

Arg

Glu

Gin

Asn

Arg

Ile

Cys

Thr

452

461

470

479

488

497

TBC

AGG

CCC

GGC

TGG

TAC

TGC

GCG

CTG

AGC

AAG

CAG

GAG

GGG

TGC

CGG

CTG

TGC

Cys

Arg

Pro

Gly

Trp

Tyr

Cys

Ala

Leu

Ser

Lys

Gin

Glu

Gly

Cys

Arg

Leu

Cys

506

513

524

533

542

531

GCG

CCG

CTG

CGC

AAG

TGC

CGC

CCG

GGC

TTC

GGC

GTG

GCC

AGA

CCA

GGA

ACT

GAA

Ala

Pro

Leu

Arg

Lys

Cys

Arg

Pro

Gly

Phe

Gly

Val

Ala

Arg

Pro

Gly

Thr

Glu

560

569

378

5Θ7

596

605

ACA

TCA

GAC

6TG

GTG

TGC

AAG

CCC

TGT

SCC

CCG

GGG

ACG

TTC

TCC

AAC

ACG

ACT

Thr

Ser

Asp

Val

Cys

Lys

Pro

Cys

Ala

Pro

Gly

Thr

Phe

Ser

Asn

Thr

614

623

632

641

650

659

TCA

TCC

ACG

GAT

ATT

TGC

AGG

CCC

CAC

CAG

ATC

TGT

AAC

GTG

GCC

ATC

CCT

Ser

Thr

Asp

Ue

Cys

Arg

Pro

His

Gin

Ile

Cys

Asn

Val

V«1

Ala

Ile

Pro

668

677

686

695

704

713

GGG

AAT

GCA

AGC

A6G

GAT

GCA

GTC

TGC

ACG

TCC

ACG

TCC

CCC

ACC

CGG

AGT

ATG

Gly

Asn

Ala

Ser

Arg

Asp

Ala

Val

Cys

Thr

Ser

Thr

Ser

Pro

Thr

Arg

Ser

HET

722

731

740

749

738

767

eee

CCA

GGG

GCA

ΘΤΑ

CAC

TTA

CCC

CAG

CCA

GTG

TCC

ACA

CGA

TCC

CAA

CAC

ACG

AU

Pro

Gly

Ala

Vol

His

Leu

Pro

Gin

Pro

Vał

Ser

Thr

Arg

Ser

Gin

His

Thr

776

785

794

803

812

821

CAG

CCA

ACT

CCA

GAA

CCC

AGC

ACT

GCT

CCA

AGC

ACC

TCC

TTC

CTG

CTC

CCA

ATG

Gin

Pro

Thr

Pro

Glu

Pro

Ser

Thr

Ala

Pro

Sor

Thr

Ser

Phe

Leu

Pro

HET

830

839

848

857

866

873

GGC CCC A6C CCC CCA BCT GAA GGG AGC ACT GGC GAC TTC GCT CTT CCA GTT GGA Πβ 3Q Gly Pro Sor Pro Pro Ale Glu Gly Ser Thr Gly Asp Phe Ale Leu Pro Val Gly ¹

168 844

Q84 CTG Leu 938

ATT Ile

093 GTG GGT

GTG Yal

ACA Thr

902

911

920

GTG Yal

929

ATA Ile 974

GGA Gly

GCC Ala 956

TTG Leu

GGT Gly

CTA CTA

ATA Ile

GTG Yal 983

AAC Asn

TGT Cys

Yal

Gly 947

Leu 965

Leu

GTC

ATC

ATG

ACC

CAG

GIG

AAA

AAG

CCC

TTG

TGC

CTG

CAG

AGA

GAA

GCC

AAG

Yal

Ile

MET

Thr

Gln

Yal

Lys

Lya

Lys

Pro

Leu

Cys

Leu

Gln

Arg

Glu

Ala

Lys

992

1001

1010

1019

1023

1037

__

. ..

____

_____-

—

- -

GTG

CCT

CAC

TTG

CCT

GCC

GAT

AAG

GCC

CGG

GGT

ACA

CAG

GGC

CCC

GAG

CAG

Yal

Pro

His

Leu

Pro

Ala

Asp

Lya

Ala

Arg

Gly

Thr

Gln

Gly

Pro

Glu

Gln

1046

1055

1064

1073

1082

1091

CAC

CTG

ATC

ACA

GCG

CCG

AGC

TCC

AGC

TCC

CTG

GAG

AGC

TCG

GCC

HiS

Leu

Ile

Thr

Ala

Pro

Ser

Leu

Glu

Ser

Ala

1100

1109

1118

1127

1136

1145

AGT

GCG

TTG

GAC

AGA

AGG

GCG

CCC

ACT

CGG

AAC

CAG

CCA

CAG

6CA

CCA

GGC

GTG

Sor

Ala

Leu

Asp

Arg

Ala

Pro

Thr

Arg

Asn

Gln

Pro

Gln

Ala

Pro

Gly

Yal

1154

1163

1172

1181

1190

1199

GAG

GCC

AGT

GGG

GCC

GGG

GAG

GCC

CGG

GCC

AGC

ACC

GGG

AGC

TCA

GAT

TCT

TCC

Glu

Ala

Ser

Gly

Ala

Gly

Glu

Ala

Arg

Ala

Ser

Thr

Gly

Ser

Asp

Ser

1208

1217

1226

1235

1244

1253

CCT

GGT

GGC

CAT

GGG

ACC

CAG

GTC

AAT

GTC

ACC

TGC

ATC

GTG

AAC

GTC

TGT

AGC

Pro

Gly

His

Gly

Thr

Gln

Yal

Asn

Val

Thr

Cya

Ile

Yal

Asn

Yal

Cys

Ser

1262

1271

1280

1289

129Θ

1307

A6C

TCT

GAC

CAC

AGC

TCA

CAG

TGC

TCC

CAA

GCC

AGC

TCC

ACA

ATG

GGA

GAC

Sar

Ser

Asp

His

Ser

Gln

Cys

Ser

Gln

Ala

Ser

Thr

MET

Gly

Asp

1316

1325

1334

1343

1352

1361

ACA

GAT

TCC

AGC

CCC

TCG

GAG

TCC

CCG

AAG

GAC

GAG

CAG

GTC

CCC

TTC

TCC

AAG

Thr

Asp

Ser

Pro

Ser

Glu

Ser

Pro

Lys

Asp

Glu

Gln

Yal

Pro

Phe

Ser

Lya

1370

1379

1388

1397

1406

1415

GAG

GAA

TGT

GCC

TTT

CGG

TCA

CAG

CTG

GAG

ACG

CCA

GAG

ACC

CTG

GGG

AGC

Glu

Cys

Ala

Phe

Arg

Ser

Gln

Leu

Glu

Thr

Pro

Glu

Thr

Leu

Gly

Ser

1424

1433

1442

1451

1460

1469

ACC

GAA

GAG

AAG

CCC

CTG

CCC

CTT

GGA

GTG

CCT

GAT

GCT

GGG

ATG

AAG

CCC

AGT

Thr

Glu

Lys

Pro

Leu

Pro

Lou

Gly

Yal

Pro

Asp

Ala

Gly

MET

Lys

Pro

Ser

FIG. 39 (ciqg dalszy - 1)

168 844

1478 1488 1498 1508 1518 1528 1538 _>

TAA CCAGGCCGGT GTGGGCTGTG TCGTAGCCAA GGTGGGCTGA GCCCTGGCAG GATGACCCTG

1548	1558	1568	1578	1588	1598	1608
CGAAGGGGCC	CTGGTCCTTC	CAGGCCCCCA	CCACTAGGAC	TCTGAGGCTC	TTTCTGGGCC	AAGTTCCTCT
1618	1628	1638	1648	1658	1668	1678
AGTGCCCTCC	ACAGCCGCAG	CCTCCCTCTG	ACCTGCAGGC	CAAGAGCAGA	GGCAGCGGGT	TGTGGAAAGC
1688	1698	1708	1718	1728	1738	1748
CTCTGCTGCC	ATGGTGTGTC	CCTCTCGGAA	GGCTGGCTGG	GCATGGACGT	TCGGGGCATG	CTGGGGCAAG
1758	1768	1778	1788	1898	1808	1818
TCCCTGACTC	TCTGTGACCT	GCCCCGCCCA	GCTGCACCTG	CCAGCCTGGC	TTCTGGAGCC	CTTGGGTTTT
1828	1838	1848	1858	1868	1878	1888
TTGTTTGTTT	gtttgtttgt	TTGTTTGTTT	CTCCCCCTGG	GCTCTGCCCC	AGCTCTGGCT	TCCAGAAAAC
1898	1908	1918	1928	1938	1948	1958
CCCAGCATCC	TTTTCTGCAG	AGGGGCTTTC	TGGAGAGGAG	GGATGCTGCC	TGAGTCACCC	ATGAAGACAG
1968	1978	1988	1998	2008	2018	2028
GACAGTGCTT	CAGCCTGAGG	CTGAGACTGC	GGGATGGTCC	TGGGGCTCTG	TGCAGGGAGG	AGGTGGCAGC
2038	2048	2058	2068	2078	2088	2098
CCTGTAGGGA	ACGGGGTCCT	TCAAGTTAGC	TCAGGAGGCT	TGGAAAGCAT	CACCTCAGGC	CACTGTGCCC
2108	2118	2128	2138	2148	2158	2168
ACCCCGATTT	AAACTCTTTA	TCTCCCAAAT	GGGAATATAA	GAACCTGTCC	TTTCTATCAC	AAAGGGAGAT
2178	2188	2198	2208	2218
TGTGAGCAAG	AGGGCAATTA	ATAATAATGG	CCAAATAATT	AAAAAAACCT	AATTC

Fig. 39 (cd. 2 )

168 844

FIG. 40

CPM związane A570

[¹²⁵Ι] TNFa (ng)

FIG. 41

168 844 o - komórki COS nietransformowane □ -komórki COS transformowane pA0KXVB δ-komórki COS transformowane p40KXVA

gl fi) £ s

[125i]TNFa (ng) FIG. 42

FIG. 43

168 844

Δ214

-0.0100 0.3920 0.7940 1.1950 . 1.5980 . 2.000

FIG. 4 A

33 34 35 35 37 38 39 40 -

FIG.UB

168 844

15

30 35 40 45 55

FRAKCJE C8

FIG. UC

Δ214

-0.0100 0.3920 0.7940 . 11960 1.5980

FIG.45A

168 844

FIG. 45 Β

168 844

FIG. 45 C

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania nowego inhibitora czynnika nekrotyzującego nowotwory TNF, o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 19, metodą rekombinacji, znamienny tym, że przygotowuje się sekwencję DNA ukierunkowującą komórkę gospodarza na produkcję inhibitora TNF, klonuje się tę sekwencję DNA w wektorze nadającym się do wprowadzania i replikacji w całych komórkach, przy czym wektor ten zawiera elementy operacyjne potrzebne do ekspresji tej sekwencji DNA, wprowadza się wektor zawierający syntetyczną sekwencję DNA i elementy operacyjne do komórki gospodarza zdolnej do ekspresji DNA kodującego inhibitor TNF, hoduje się komórkę gospodarza w warunkach pozwalających na amplifikację wektora i ekspresję infibitora, zbiera się ten inhibitor i pozwala na przyjęcie przez ten inhibitor aktywnej struktury trzeciorzędowej o aktywności inhibitora TNF.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zbiera się inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujący inhibitor TNF stosuje się gen kodujący inhibitor czynnika nekrotyzującego nowotwory TNF.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się gen kodujący inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 30 kDa.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zbiera się deglikolizowany inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 18 kDa.
6. Sposób wytwarzania nowego inhibitora czynnika nekrotyzującego nowotwory TNF, o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 38, metodą rekombinacji, znamienny tym, że przygotowuje się sekwencję DNA ukierunkowującą komórkę gospodarza na produkcję inhibitora TNF, klonuje się tę sekwencję DNA w wektorze nadającym się do wprowadzania i replikacji w całych komórkach, przy czym wektor ten zawiera elementy operacyjne potrzebne do ekspresji tej sekwencji DNA, wprowadza się wektor zawierający syntetyczną sekwencję DNA i elementy operacyjne do komórki gospodarza zdolnej do ekspresji DNA kodującego inhibitor TNF, hoduje się komórki gospodarza w warunkach pozwalających na amplifikację wektora i ekspresję inhibitora, zbiera się inhibitor i pozwala na przyjęcie przez ten inhibitor aktywnej struktury trzeciorzędowej o aktywności inhibitora TNF.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako DNA kodujący inhibitor TNF stosuje się gen kodujący inhibitor czynnika nekrotyzującego nowotwory tNf.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że zbiera się inhibitor TNF o masie cząsteczkowej 40 kDa.
9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że zbiera się inhibitor TNF wykazujący aktywność zarówno wobec TNF alfa jak i TNF beta.
10. Sposób wytwarzania nowego inhibitora czynnika nekrotyzującego nowotwory TNF, wybranego z grupy obejmującej inhibitor TNF o pierwszych 184 aminokwasach jak przedstawiono na fig. 38 (inhibitor TNF Δ 51), inhibitor TNF o pierwszych 182 aminokwasach jak przedstawiono na fig. 38 (inhibitor TNF A 53), i deglikolizowany inhibitor TNF o całkowitej sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 38, metodą rekombinacji, znamienny tym, że przygotowuje się sekwencję DNA ukierunkowującą komórkę gospodarza na produkcję inhibitora TNF, klonuje się tę sekwencję DNA w wektorze nadającym się do wprowadzania i replikacji w całych komórkach, przy czym wektor ten zawiera elementy operacyjne potrzebne do ekspresji tej sekwencji DNA, wprowadza się wektor zawierający syntetyczną sekwencję DNA i elementy operacyjne do komórki gospodarza zdolnej do ekspresji DNA kodującego inhibitor

168 844

TNF, hoduje się komórkę gospodarza w warunkach pozwalających na amplifikację wektora i ekspresję inhibitora„zbiera się ten inhibitor i pozwala na przyjęcie przez ten inhibitor aktywnej struktury trzeciorzędowej o aktywności inhibitora TNF.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że zbiera się inhibitor TNF Δ 51.
12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że zbiera się inhibitor TNF Δ 53.
13. Sposób według zastrz. 11, albo 12, znamienny tym, że zbiera się inhibitor TNF wykazujący aktywność zarówno wobec TNF alfa jak i TNF beta.
14. Sposób według zastrz. 11, albo 12, znamienny tym, że zbiera się deglikolizowany inhibitor TNF.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że zbiera się inhibitor TNF wykazujący aktywność zarówno wobec TNF alfa jak i TNF beta.
16. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że zbiera się deglikolizowany inhibitor TNF o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 38.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że zbiera się inhibitor TNF wykazujący aktywność zarówno wobec TNF alfa jak i TNF beta.