TW199186B - - Google Patents

Description

190186 Ββ 經濟部中央標準局員工消費合作社印- 五、發明説明（3) 發明節Β 本發明為有關製造醯基胺基酸消旋酶之醱酵方法，用 於此方法之新穎徹生物，及用於製造此新穎徹生物之新穎 DNA片段。 發明背軎 醯基胺基酸消旋SI廣泛分佈於放線菌，為催化具光學 活性之Ν -醯基胺基酸使之消旋，但無法作用於具光學活性 之胺基酸之特殊_，且其性質已知之甚詳（美國專利號碼 4,981,799;文獻摘要記載於 1990Annual Meeting of the Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and A g r 〇 c h e m i s t r y，3 6 8 頁，1 9 9 0 ). 如上述，醯基胺基酸消旋酶為有用之酶，可用於製造 具光學活性之胺基酸。然而，至目前為止，尚没有發展出 令人滿意，低成本及高效率以製造此酶之方法，因此，尚 待發明更方便之方法。 在這些情況下，本發明人做了徹底之研究且發表以 A.fli y c ο I a t 〇 p s i s sp, TS-1-60製造胺醯酸消旋酶之報告（文 獻摘·要載於 the 1990 Annual Meeting of the Japan Society for Bioscience, Biotechnolozy, and Agrochemistry,第368頁，1990年），且他們成功地從 Lmj c ο 1 a t 〇 p s i s sp. TS-：l-60選殖了编碼醛基胺基酸消旋 _2DNA,在進一步研究後，現在究成了本發明。 發明槪沭 本發明提供含编碼醯基胺基酸消旋_之基因之DNA片 .裝- 訂. •鮮· 本紙張反Jt適用中國國家標準（CN'S)甲4規格（210 X 297公釐） 3 199186 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印*1衣 五、發明説明（4) 段，具嵌入此DNA片段之媒傳者，一種以此媒傳者轉形及 能製造醒基胺基酸消旋as之新穎擻微生物，包括以此徹生 物製造醯基胺基酸消旋酶之方法。 匯示：> 簡菫銳 第1圖顯示在實例？所確認之編碼醯基胺棊酸消旋_之 基因之鹼基序列；第2圖顯示在實例1所得之含编碼醯基肢 基酸消旋_之基因的DNA片段限制酶切割圖；第3圖顯示製 備質匾PRA4之步驟；第4圖顯示製備質體PRA7之步驟；第5 圖顯示製備質體PRA4A之步驟；第6圖顯示製備質體PRA7A 之步驟；第7圖顯示製備質髏PRA4N之步驟；第8圖顯示製 備質體PRA4NB之步驟；且第9圖顯示製備質體pET-3cN之步 驟。 較滴當具髅窨例；> 詳沭 含编碼醯基胺基酸消旋酶之基因之本發明DNAH段（以 下有時也稱為编碼基胺基醯酸消旋酶之DNA或簡稱為醯基 胺基酸消旋酶DNA),首次由本發明人發現，且可由製造醯 基胺基酸消旋酶之放線菌，如，鍵徽菌sp. Y-53( streptomyces sp. Y - 5 3 ； I F 0 1 4 5 9 6； FERM P-9518)或 A m y c o la t o p s i s s p . T S - ：l - 6 0 ( I F 0 1 5 0 7 9 ; F E R Μ B P - 3 0 9 2 ) 及其它，分離相關之DNA製造之，將此DNA嵌入噬菌體或質 體，將所得之重組噬®體或質體使宿主轉形，培養所得之 轉形菌株，以適當之方法（如使用醯基胺基酸消旋酶抗體 之免疫分析法或使用DNA探針之斑點或菌落雜化法）由轉形 菌株中分離含所欲得DNA之噬_體或質體，切開由噬菌體 各紙張尺度迺用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐) ^ (請先閲^背面之注意半^再塡邛本頁) 199186 經濟部中央標準局S工消費合作社印製 五、發明説明（5 ) 或質體所得之選殖DNA,將此選殖DNA缅選殖至適當之質體 。所得之DNA可嵌入質體或噬菌髏，且所得之重組物可用 於使宿主（如大腸桿菌，放線菌或酵母菌）轉形。 上述之IFO號碼表示在大阪醱酵中心（IFO)之寄存號碼 ;而卩〖1^ P或FERM BP號碼表示在通商産莱省工業技術院 撤生物工業技術研究所（FRI)之寄存號碼，後文同此。 Aaiyco 1 atops i s sp . T S - 1 - 6 0之典型礅菌學性質如下 〇 (a )形態 在營養液體培養基中[如胰蛋白分解酶大豆液（ Becton Dickinsor)],於 28t!下，振盪 24 至 48 小時後，受 質菌絲髏分裂成類似桿狀細菌或分枝短_絲之小片段。 受質菌絲體在瓊脂培養基中為曲折形。空氣中菌絲體 通常為直線或彎曲的（Rectus Flexibilis)。 在瓊脂培養基ISP-2及ISP-7可觀察到Acoremium。孢 子為表面光滑之圖柱形（0.3至0.5X 0.6至2.3w m)。 (b)培養待質 在不同培養基TS-1-60菌株之培養待質示於表2。在表 1之顔色為經由與美國Container公司第4版之“色諝手册 ”之顔色片比較後決定之。 --------------- J----^ J ------裝------訂------線 (請先開讀背面之注意事項再塡寫本寅) 卷紙張尺J1適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） τ i 9918ο Λβ Β6 五、發明説明（6 ) 表1在不同培養基中，菌株Κ-1-60之培養待性 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 培養基 生 長 空氣菌絲體之顔色受質菌絲體之顔色 (反面顔色） 溶解色素 蔗糖硝酸瓊脂 不良 稀，白 淡象牙白(2ca) 無 葡萄耱-天冬醯胺瓊脂 多，平 中量，白 淡象牙白(2ca)至 無 珍粉紅(3ca) 甘油-天冬醒胺瓊脂 多，皺 多，棉質白 淡白(2ea) 無 無機塩-澱粉理脂 不良 稀，白 無色至 .無 (ISP培養基4) 淡象牙白(2ca) 酪胺酸瓊脂 多 多,棉質白 淡白(2ea) 淡黃 (ISP培養基7) 營養瓊脂 中等 無 淡象牙白(2ca) 無 酵母抽取物-麥穿抽 多，雛 中量，白 蜜金黃(2ic) 淡黃 取物琪脂 (ISP培養基2) 具皸裂之 突起 燕麥片麵 中量，平 不良，白 淡象牙白(2ca)至 無 (ISP培養基3) 淡白 （2ea) -------------------------装------訂------線 <請乇閲背面之注*事項再域•寫本頁> 本紙張尺度適用中國國家標準（CN'S)甲4规格（210 X 297公坌） 199186 Αβ 五、發明説明（7 ) (c)生理待性 黑色素之形成 無 凝乳 無 乳之陳化 無 凝膠之液化 無 澱粉之水解 無 氣化m耐受性（％) 5< > 6 生長溫度範圍（tn 13-37 生長適宜溫度（t： ) 20-30 無生長溫度（υ) 40 (d )碩源之利用 (請先閲讀背面之注意事項再塡1;.本頁) 丨裝. 經濟部中央標準局員工消費合作社印轚 有：L -阿拉伯糖，D -木糖，D-葡萄糖，D -果糖，肌 醇，D-甘露糖醇 無：蔗糖，L -鼠李糖，植物密糖 適於此DNA嵌入之質體有得自大腸桿菌之PBR322[ Gene , 2^_ 9 5 (1977)], PBR 3 2 5 [Gene , 1 2 1 (1978)]及 PUC13 [Gene . 1.9 , 259, 1982)]tt可使用任何其它可在宿 主内複製及維持之質體，可供DNA嵌入之噬菌體媒傳者， 例如· Agtll[Young, R. a.nd Davis, R.， Proc. Natl. A c a d . S c i . U . S . A . , 8JLu_ 1 1 9 4 ( 1 9 8 3 )]。也可使用其它可 在宿主内繁殖之噬菌體媒傳者。 將此DNA嵌入質體方法，例如，描述於Maniatis, T. e t a 1. , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,第239頁（1982)所述之方法。適合於將DNA嵌 本紙張又度通用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公坌） 7 19918 A6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（8) 入噬菌讎媒傳者之方法，例如Hyunh, T.V.等.，DNA Cloning, a practical approach, 1 . 49(1985)將所得之 重组質髅或噬菌體媒傳者，導入適當之宿主，如，大腸桿 菌。 此大腸桿菌之實例，例如•大腸桿菌k 1 2 :，D Η 1 [ P r 〇 c . Natl. Acad. Sci. 6 0 . 1 60 ( 1 96 8 ) ] , JM103 [ Hucl. Acids Res., 9 . 309 (1981)3» JA221[J· Mol. Biol·. 1 2 0 . 5 1 7 ( 1 9 7 8 )], HB101[J. Mol. Biol·. 4_1^_ 459 (1969)]及 C6 0 0 [Genetics , 39^ 44 0 ( 1 9 5 4 ) ] 〇 以質體使宿主轉形之方法，例如以Maniatis, T.等 人在 Molecular Cloning， Cold Spring Harbor Laboratoty,第239頁（1982年）所描述之氣化鈣法，或以 氣化鈣/氣化铷法。可使用，如，體外包裝技術將睡菌體 媒傳者導入生長之大腸捍菌内。 可以上述方法等獲得含醛基胺基酸消旋酶DNA之放線 菌DNA庫。 例如，可使用 Huynh等[ANA Cloning， a practical approach, 1_*_49(1985)]使用噬菌塍媒傳者Xgtll及酸基 胺基酸消旋》抗體，或以依據A m y c ο 1 at o p s i.a_ sp . TS - 1 -60-衍生醛基胺基酸消旋《之胺基酸序列，而化學合成之 寡核苷酸為探針之菌落雜化法，或斑點雜化法[Maniatis T.等..Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, (l982)]〇 若需要或適當時，此經選殖之酸基胺基酸消旋酶之 (請先閱..»背面之注意事項再瑣璉本頁) —裝· 訂 本紙張又度適用中國國家標準（CN’S〉f 4现格（210 X四7公坌） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 193166 A6 B6 —*- » mi — i 丨·丨_ ' —'- ------ —— - - - 五、發明説明（9) DNA可缠選殖至如 pBR322, PUC12, pUC13, pUC18, pUC19 ,p U C 1 1 8或p ϋ C 1 1 9之質體内。 所得 DNA以如 the Maxam-Gilbert法[Maxam, A.M. and Gilbert, W . , P r o c . Natl. Acad. Sci. U.S.A., 7Λ . . *)3 0 ( 1 9 77 >1^ =t M * ns · . c, u I , It u c ! ·.

Acids Res., 9 . 309 (1981)]或去氣雜法[Mizusawa, S. et a 1 . , Nuc 1 . Acids Res . , UL_ 1319 (1986)]排出序列 ，然後此鹼基序列，再與已知之胺基酸序列比較而證實醯 基胺基酸消旋_之存在。當並無涵蓋编碼醯基胺基酸消旋 酶之所有區域時，以DNA片段為探針行菌落雜化，續選殖 至醯基胺基酸消旋以補滿失去之區域。 上述方式，得编碼醯基胺基酸消旋_之DNA。 下文所述在實例1所得之编碼醯基胺基酸消旋酶之DNA ，為依本發明编碼醯基胺基酸消旋酶之DNA之典型實例。 其限制酶切割圖示於第2圖。 為改良質體，如上述方法選殖之编碼醯基胺基酸消旋 _之DNA可適當直接使用，或需要時，例如於限制_消化 之後或於定點突變[Me.thods in Enzymology, 1 0 0. 4 6 8 ( 1 98 3 )]之後使用。 上述编碼N -醛基胺基酸消旋ΘΙ之選殖DNA,可使用如 lac啓動基因，tac啓動基因[de Boyer, H.A.，Canstock,_ L.J. .Vasser, M . , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80 ,21(1980)], T7啓動基因[Tabor, S·, Richardson, C.C Proc. Neal. Sci. U.S.A., 82 . 1 0 7 4 ( 1 9 8 5 )]之啓動基 (請先閲讀背面之注念事項再"-Τ本頁) 丨裝， .π. -綿- 私紙張又度適用中國國家標準（CKS)甲4规格（210 X 297公坌） 9 ±99186 A6 ____B6_ 五、發明説明（1 0 ) 因，以使之於大腸桿菌中大置表現。 培養以上述選殖DNA轉形之撤生物（如放線菌，大賜桿 菌，酵母菌），而後在培養基内生産醯基胺基酸消旋酶並 回收之。 可以上述方法，改進II基胺基酸消旋酶太身之性質 (如_活性，穩定性）。 可以如變鈴青鍵徽，菌（Streptomyces lividans )TK64 及大賎桿菌ΗΒ101為表現之宿主。其它放線菌，其它大賭 桿菌菌株，枯草桿菌，或酵母菌也可。 基本上已知放線菌之轉形法，可以Hopwood, D.A.等 之方法彳了之（述於 Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual) 〇 也已知大腸桿菌之轉形法，可以在Maniatis T. et a 1 . , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, page 239, 1982所述之氛化0法，或氱化鈣 /氛化鋤法行之。 大腸桿菌 E R - 4 ( IF 0 1 5 0 8 3 ; F E R Μ B P - 3 0 9 1 )為依本發 明轉形菌株之典型實例。 當然也可經適當遘擇受體有機體以本文之方法輕易地 製造不同之轉形菌株。 所得之轉形菌株以已知之方法培養。培養放線菌之播 種培養基如下：3%甘油，0.5%多朦，0.3%肉抽取物，0.( -乙醯基- DL -甲硫胺酸，ΡΗ7.2;生産培養基如下：1.7% 胰蛋白酶-處理過之酪蛋白，0.3%以木瓜蛋白_處理過之 (請先間讀背面之注意事項再堉寫本頁) .裝. .1T. .線. 經濟部中央標準局W工消費合作社印製 本紙張度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公發) ^ 199186 A6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 B6 五、發明説明$1 ) 去脂大豆粉.0.5%氛化鈉，0.25%磷酸氫二鉀，1%¾萄 糖，0.05%N-乙醯基-DL-甲硫胺酸，pH7.0。通常在15〜 40C,以24〜3010較適當，培養10〜96小時，以24〜72小 時較適當。蒲要時，可充氣及/或振盪之。培養大腸捍菌 時，以LB培養基為培養基Π %多陳，0.5%酵母抽取饬， 0.5%氣化鈉）。通常在15〜40它（最好在24〜37=)下培養 10〜96小時（最好24〜48小時）。若需要，可充氣及/或振 盪之。 培養完成後，分離細胞及上清液。保留在細胞内之醯 基胺基酸消旋酶以通常在這方面使用之方法，如，超音波 ，以French Press,法破裂，研磨等機械破裂，或溶菌酶 處理之細胞破裂法，抽取之。此抽取物以通常蛋白質純化 法如塩析，等電沉澱法，凝膠過濾法，離子交換層析法， 疏水層析法，或高效液態層析，純化於所得抽取物中之醯 基胺基酸消旋酶，如此可得所需之醯基胺基酸消旋酶。 以己知之方法（日本專利公開公報JP01-137973)測定 以上法所得醯基胺基酸消旋酶之活性。因而，50〜100W1 之_谘液加至含25mM N -乙醯基- DL -甲硫胺酸，2roM氯化鈷 ,2wL -醯_及50bM Tris-HCl缓衝液（ΡΗ7.5)之反應培養 基中，而後在30¾下反應5分鐘，再煮沸3分鐘以中止反應 。一單位_之定義為每分鐘形成1m mol L -甲硫胺酸之_ 之置。 本文使用之鹾基，胺基酸等之縮寫或符號為IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature 所建議 ‘紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 1 1 (請先閲讀背面之注意事項再場鸾本頁) -装. 訂_ ,線.

19918S A 6 bo 五、發明説明（1 2 ) 或一般用於柑關領域者。實例示於下。至於以光學異構物 型發生之胺基酸，除非特別標明，使用之縮寫表示L異構 物。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 DN A 去 氧 核 糖核酸 A 腺 嗦 昤 C 胞 嘧 淀 G 鳥 嗦 昤 T 胸 腺 喃 啶 A 1 a 丙 胺 酸 A r g 精 胺 酸 A s n 天 冬 醯 胺 Asp 天 冬 胺 酸 C y s 半 胱 肢 酸 Gin 穀 胺 醯 胺 G 1 u 穀 胺 酸 G 1 y 甘 胺 酸 His 組 /Ah 織 胺 酸 lie 異 亮 胺 酸 Leu 亮 胺 酸 L y s 離 胺 酸 Met 甲 硫 胺 酸 Phe 苯 丙 胺 酸 Pro 腩 胺 酸 S e r 絲 胺 酸 T h r 释 m 醉 (請屯閲‘？？背面之注*?^項再塡窝本頁) 裝- .緯. 本紙張卿中國國家標準（⑽甲劇一公楚） 36199186 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 五、發明説明（13 ) Tr Ρ 色 胺 酸 Ty Γ 酪 胺 酸 Va 1 纈 胺 酸 奮 例 下 列 實 例 可進 步 解 釋 本 發明 ，而非 m 制 本發 明之領 域 〇 S. 例 1 Am γ 〇 ft 1 _aJt. O D R 1 5 s P • TS -1 -60染色體D N A 之 分離 0 Α οι γ 0 jlL at Q P si s P • TS -1 - 6 0在含2 0 ID 1胰蛋白_大豆 液 (Β e c to η D i c k i η S 0 η ) 之 200 m 1錐形瓶内， 於2 8 C下振盪 培 養 42小 時 ο 所得 之 濕 細 胞 (4 g )懸 浮在20 ml 之 缓衝 液A [ 〇. 3Μ蔗 糖 » 25 mM EOTA, 2 5m Μ T r i s -HC 1 缓 衝 液 (pH8 )], 接 著 » 在 加 入 蛋白 溶 菌 酶 使 濃 度為 2 m g / m 1 後 t 懸浮 液在37 V 缓 缓 地 振 盪 1小時。 然後， 加8 m I 2% SDS 至 此懸 浮液， 接 著 故 鞍 輕 打 m 2或3次 0 加 入 5 π 1氣仿及5 m 1 缓 衝 液A- 飽和之 酚 » 整 値 混 合 物經 齡 離 心 (3 ,000 r p m , 20分） 以 抽 取DNA。三 次 重 覆 此 酚 押 取後 » 加 1/ 10 體 積之 3M乙酸 鉀 及 2倍體積之 冰 冷 乙 醇 至 DNA溶液， 以沉澱DNA。 以離心 收 集 沉澱 之 DN A， 再 以 7 0 96 乙 醇 洗滌 之 0 真 空 乾 燥， 儲存之 〇 背 例 2 编 碼 醯 基 胺基 酸 消 旋 m 之 基因 之選殖 (請先間讀背面之注念事項再塡寫本頁) —裝· .1T· (A)基因庫之製備 (a )以限制酶H_a_e_ ϋ部分消化 以限制US H a e M (Takara Shuzo)部分消化實例1所分 本紙張尺及適用中國國家標準（CKS)甲4規格（210 X 297公釐） 1 3 A6 B6 五、發明説明（14 ) (請先閲，:!?背面之注意事項再塡寫本頁) 離之 Amvcolatopsis sp. TS-1-60 之染色體 DNA。而後，在 含 10mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.5), 7mH氣化錳，60mM氮化 鈉，7mM 2-氫硫基乙醇，5wg供應體DNA及10單位之ILa_e_ I,總體積50wl之反應糸統内，在3710下，反應2分鐘。 以酚-氮仿處理，將反應混合物去蛋白質；加2醭積之乙醇 以回收消化之DN Α。 (b)甲基酶反應 以E部分消化之DNA片段，在EjLa_ R I位之腺苷部 分上甲基化。如此，5wg之部分消化DHA片段，在37t：下， 在含IOObiM Tr i s-HC 1缓衝液（pH8) , 2 m Μ二硫蘇糖醇， 10mM Ε0ΤΑ, S -腺苷甲硫胺酸及40單位之甲基化醮（

Takara Shuzo)總髏積為20«1之反應混合物内，處理60分 鐘。以上述同法回收甲基化DNA片段。 (c )連接者連接 連接E_c_o_ RI連接者至甲基化DNA片段之末端，使用之 Ejl〇_ RI連接者為 d(pGGAATTCC)(Takara Shuzo)。為 了加入 連接者，使用連接套組（Takara Shuzo)。在1613下，總董 20以1含5；1/8 DNA , 2 u \ {2 u g ) Eco R I 連接者，1 6 以 1 溶 經濟部中央標準局R工滴費合作社印製 液A及2/i 1溶液B之混合物，反應16小時。以氛仿/酚處理 反應混合物，再以乙醇沉澱法回收産物DNA.然後乾燥之 Ο (d )以限制酶ELcjcl R I消化 5ug在（c)所得之DNA片段，在37C，以限制酶ELi R I消化3小時。所得D N A片段以電泳分離，獲得1至3 k b p 本紙張又度適闬中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 1 4 Λ 6 ίϊ 6 / Λ. W V ......* " 五、發明説明） (請先閲讀背而之注意事項洱塡寫本頁) 大小之NDA片段，再以酚-氣仿處理及乙醇沉澱，真空乾燥 後，溶於 20//1TNE 缓衝液（10mM Tris-HCl, ImM EDTA,300 mM NaC1 , pH8 . 0 )内 0 (e)以媒傳者（λ gtll)連結及包裝 以 E c 〇 RI及礎酸酶處理 λ gtll (Stratagene Cloning, Systeas,' U.S.A.),然後與 DNAH & (l-3kl>p)連接，再使 用 Gigapack gold(Stratagene C..1 oning Systems, U . S . A . )包裝此連接反應混合物。 (B)探針之製備 由Amycolatopsis sp. TS-1-60産生之醒基胺基酸消 旋酶（純化蛋白質，4mg)以賴胺醯胜肽鐽内切酶處理分裂 成數段胜肽。以逆相層析纯化此胜肽，再確定尖縫2胜肽 之胺基酸序列。序列為Lys Leu Gly Ala Val Gin T 1 p V a 1 A s η I 1 e L y s Pro Gly Arg V a 1 Gly Gly T y r 〇 合成下 列線於割線胜肽部分之寡核甘酸： 5'-GAGATCCTR4AACATCAAGCC-3’ （R4為 G或 C)。此寡核苷酸 以傳統方法在5 '端標以3 2 P ,以做探針使用。 經濟部中央橾準局兵工消费合作社印製 (c)醛基胺基酸消旋酶抗體之製備 以約1 m g由Amycolatopsis sp. TS-1-60所得之純化醒 基胺基酸消旋_蛋白質，分4次劑量（400,200,200及200 «g),挑激兔子。結果得含多選殖抗匾之血淸，以 Ouchterlony法定其抗醴力價為16。 (D)以免疫分析篩選 以由 Amycolatopsis s p . TS-1-60來之 λ gtll DHA庫 本紙張尺度边用中a B家楳準(CNS) T4規格(210X297公;¢) 81. 7. 20,000ik(I!) 15 βο 199186 五、發明説明（16 ) 轉移大腸桿菌Y1090,從約200,000斑點中得13陽性斑點。 純化後繁殖之，從其中抽取DNAs,再以Ejul R I切割之， 消化物行電泳分離。由電泳分離之DNA片段，以P32標示之 ，再以上述之探針行南方雜化法。13個重組噬菌體中，2 偁噬菌.體，λ-8及λ-9,以探針雜化。再以λ-9之Ejl^l R I Η段之一部分，製備約600bp之探針。以此探針，與約 50,000値由人81;1101^庫所得之斑點行斑點雜化。結果， 得λ -44,且經仔細研究，發現此含整個编碼醯基胺基酸 消旋酶之D Ν Α。 窨例3 鹼基序列之確定（定序列） 將由 λ -44 分離之 ELc_q_ RI 片段（1.2kbp),以 Messing 等之方法[N u c 1 A c i d s R e s . , 3 0 9 ( 1 9 8 1 )]嵌入大腸桿 菌嗤菌體M13mp8及M13mp9内，再以去氮雜法[Mizusawa, S.等.，Nucl. Acids Res·, Ul^ 1319(1986)]定序列。 結果示於第1圖。源於此龄基序列之部分胺基酸序列，與 由A. CQ 1 a t ο p s i s sp. TS-1-60純化之醯基胺基酸消旋酶 之部分胺基酸序列相吻合。所以，λ-44含编碼醯基胺基 酸消旋酶之基因。 奮例4 以放線菌轉形菌株，生産醛基胺基酸消旋_ 使用變給青鍵徽_ TK64/PRA32。 此菌株之製迫由將從Amycolatopsis sp. TS-1-60 之整艏DMA,抽取之醯基胺基酸消旋酶，嵌人pIJ 7 0 2 (在放 (請先閲'.»背面之注意事項再塡't-'T本頁) -裝. -ΤΓ. 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 本紙張尺度適用中國國家標竿（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 1 6 ^99186

Bo 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（17 ) 線菌使用之質醴），再以所得之重組質體使變鉛青鏈徽菌 TK64轉形。此菌株在28 υ下，,在酵母抽取物-麥穿抽取物 瓊脂斜面培養基（ISP2培養基）培養7天。在每- 200ml錐形 瓶内，將一整圖所形成之孢子，種入20ml無菌播種培養基 内（3%甘油，0.5%多陳，0.3%肉抽取物，0.05%H -乙酵 基-DL-甲硫胺酸，PH7.2),並於28°C,在旋轉搖盪瓶（2 00 rpm)培養48小時。以8ml為一份，將此培養物分配至15ml 小瓶内，再冷凍儲存於-δΟΌ (冷凍庫存培養物）。以lml冷 凍庫存培養物種入上述相同之播種培養基内，再於上述相 同條件下培養，製造第一次後代。以20ml第一代培養物種 入在20升圾口氏燒瓶内之無菌500ml播種培養基内，在28 "C下，在相互振盪器（7 8 s p m )培養7 2小時，以製造第二次 後代。將4公升第二代培養物種入每- 200公升裝入無菌100 公升生産培養基（1.7%胰蛋白_處理之酪蛋白，0.3%木 瓜蛋白_處理之去脂肪大豆粉，0.5%氣化鈉，0.25%磷 酸氫二鉀，1%蕕萄耱，0.05%N-乙醛基DL-甲硫胺酸， PH7.0)之醱酵器内，再於28C下，充氣UOvvni),振盪（ 160 r pm),培養42小時。以同樣方式培養，為對照組之DHA 供應者Amycolatopsis sp. TS-1-60。從K生産之觀點比 較，得知，此轉形菌株有較高生産力。 奮例5 以lac啓動基因，在大腸桿菌内表現之醛基胺基酸消 旋_基因。 從重組噬菌體λ-44,分離含醛基胺基酸消旋酶結構 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 1 7 (請先閲讀背面之注音？事項再堉寫本頁) 裝. 訂. .緯. ；l93166 Λ 6 !s δ 五、發明説明（ 基因之SJL3_ I-XJijl I片段。在多重選殖位上(Sma T-. S a 1 T 位），與lac啓動基因之方位同，將此片段嵌入大腸桿菌質 體PUC118内，得質體pRA4(第3圖），質體PRA4用於使大腸 桿菌JM1 05轉形。 所得之轉形蘭珠 EP-4UF0 15083; FERM BP-3091), 以竹籤挑出，種入含安比西林（50wg/ml)之4ml LB培養基 内（1%多陳，0.5%酵母抽取物，0.5%氯化鈉），在37C, 振盪培養16小時。將〇.3b1—份之培養物，種入30ml含安 比西林（50Wg/ml)之30ml LB培養基内，在37·〇,振盪培 養3小時。加人3 m 1 0 . 1 Μ I P T G (異丙基/3 - D -硫半乳耱吡喃 糖甘（最終濃度ImM)後，再繼缠培養養4小時。收集細胞（ 3,000rpm， 10分），懸浮於 5ml Tris-HCl 缓衝液（50mM, Ρ Η 7 . 5 ),做超音波（4分鐘）。離心（1 5 , 0 0 0 r p in . 1 0分）所得 之細胞破裂産物，上清物以已知之方法，測定醯基胺基酸 消旋酶活性。宿主大腸桿菌JM105所無之醯基胺基酸消旋 SI活性，可以轉形菌株ER-4證實之。酶生産力為64w/升（ 培養基），约為 DHA 供應者 Amvcolatopsis sp. TS-1-60 之 3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫木IK) 裝· 訂_ 線. 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 ο 期 倍啻 酸 基 胺 基0 之 現 表 内 菌 捍 腸 大 在 因 基 啓 C B t 用 使 在 段 Η 此 將 ο 4 段 A R Μ ρ η 體 snd 見 i 5 ί 表1· C 3 a 1 w 2>SJ Ο 5 之 因例因 基實基 _ 從構 旋 結 消 酶 旋 消 酸 基 胺 基0 含 取 切 者 傳 媒 之 體 質 現 表 之 因 基 動 啓 C a t 含 入 嵌 本紙張尺度逍用中國Η家標準(CNS)甲4規格(210父297公_«：)

8 1X Ι991δδ Λ 6 Η 6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（1号 22 3 - 3 [Brosius, J and Holly, A., Proc. Natl. Acad 5(Μ.Ι).5.Α.,_^_ 6929 Γ 98 4 )]·得質體 PRA7(第 4圖）。此 質體被用為使大腸桿菌JM105轉形。 以實例5所述之方法，培養所得之轉形菌株ER7,再以 已知之方法，測定醯基胺基酸消旋酶之活性，由此可觀察 到比酶之活性Λ酶生産力為3 4 w /升（培養基），钩高於UN a 供應者 Amycolatopsis sp. TS-1-60 1.5倍。 窨例7 起始密碼從GTG轉變成ATG 從重組噬菌體λ -44分離及回收含起始密碼之R I Η段，在於ELd R I位，嵌人質媒傳者p U c 1 1 8 .以所得之 重組質體，使大腸桿® Μ V 1 1 δ 4轉形，由所得之轉形菌株， 以 Vieira等之方法[Methods in Enzymology, 100. 3( 1987)],製備單股DNA。在體外突變条統，轉位2.0( A m e r s h a m ),以含突變點之合成寡核Ϊ酸，做定點突變。 從所得之突變質體PMA1,分離及回收含突變點之I片 段，再與進一步經S_a_£_ I處理之表現質髏PRA4連接，得lac 啓動基因表現質體，PRA4A,其起始密碼已轉變成ATG (第 5圖）。同樣地，從突變質體pMAl分離及回收含突變點之 S-ma I / lac I Η段，再與Sma I / Sac I進一步處理過之表現 質醱pRA7連接，得tac啓動基因之表現質體PRA7A,其中， 起始密碼被轉換成A TG (第6圖）。這些突變表現質塍，用於 使大腸捍菌JM105轉形，分別得轉形菌株ER4A(JM105/pRA4/> 及 ER7A(JM105/pRA7A; IF0 15131， FERM BP-3272)。加入 (請先閲讀背面之注奇〕事項#填寫木页) 裝. 訂 -線· 本紙張尺度边用中國國家樣準(CNS) T4規格(210x297公龙) 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 A 6 ____B6 _ 五、發明説明（2 0) IPTG後，以實例5之方法，培養這些轉形菌株9小時，再以 己知之方法測定醛基胺基酸消旋酶之活性。菌株ER4A之生 産力為740W /升（培養基），菌株ER7A之生産力為19 8w /升 (培養基），分別高於DNA供臛者Amy colatops i s s p . T S - 1 -60约37倍及約i〇倍。 例L 以T7啓動基因，在大腸桿菌内表現之醯基胺基酸 消旋_ 為了在HiLt I/Bjjl Η I位上，在Τ7表現質醱pET-3c [ G e n e , 125 (1987)]内選殖醛基胺基酸消旋_基因， 以定點突變技術，將KjLe_ I位（CATATG)導入起始密碼 及L&X E位（AGATCT)至終止密碼區。 A ) M_d_e_ I位導入 以表現質體PRA4轉形大腸桿菌MV1184,從所得之一値 轉形菌株，以Vieira等之方法，製造單股DNA。以此單股 D N A及含Lit I位（CATATG)之合成寡核¥酸（5’-G AGTTT Γ ATATG CTCCTCC-3’），行定點突變[體外，突變糸 統，轉位2.0(Amersham)],得在起始密碼地區有-1位 之pRA4M (第7圖）。 B ) Rg 1 I位之導人 從質體PRA4N分離含I位之Sjl8_ I / LLajL I片段， 再進一步與Sjl3_ I及ILLdjLM處理過之質腥p U C 11 9連接。所 得之重組質體，用於轉形大腸捍菌MVU84。以Vieira等之 方法，從一所得轉形菌株製造單股DNA。以（A)同樣方法， 用此單股D Η A及含位（AGATCT)之合成寡核节酸（5'_ (請先閱讀背面之注意^項再埙寫木页) 本紙張足度遑用中Β Β家糅準(CNS) Τ4規格(210x297公龙) 20 Λ 6 Μ 6 199186 五、發明説明（2 1) (請先閲讀背面之注意芥項再艰寫木頁) GAGGTAGATCT GGTCGGAT-3’），行定點突變，得在终止密碼 區有位之質體PRA4NB (第8圖）。 C) 表現 將從質體p R A 4 N B ,分離及回收含所述之酶基因之IdjL I / 片段，在其iiJLl位及B a m Η I位之間，嵌入質體 ! PET-3C内，得醛基胺基酸消旋_表現質體PSr-3cW第9圖) 。以此質體轉形大賎桿菌MM294(0E3),得轉形菌株MR-1( IFO 15132, FERM BP-3273)。以實例7所述方法培養此轉 形菌株，以已知方法測量醯基胺基酸消旋酶活性。此酶産 量為1 ,795///升（培養基）。此約高於DNA供應體 Amycolatopsis sp. TS_1_60之 90倍。 D) 轉形菌株MR-1之桶培養（20公升） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印51 將400ml含安比西林（50Wg/isl)之LB培養基，分裝於 一公升錐形瓶内，滅菌之。將一滿圈菌株MR-I之細胞，種 入每一燒瓶内之培養基内。在下，振盪培養（250rpm) 20小時。將1公升所得之培養液種入以多陳（1.5%)補充之 20公升M9培養基内[Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1 9 8 2 )],S 281D,充氣（lOOvvai),攪拌（450rpm)培養34小時。在開始 培養後8小時，加入IPTG,至最後濃度為O.OlmM,在連鑛 加入（150b1/小時）8%葡萄糖及2%多朦之混合溶液下，逛 續培養，完成培養後，離心（l,000rpm, 20分）培養物，得 1,320克濕細胞，以基本上已知之方法測量醯基胺基酸消 旋酶活性，酶産量為22,300單位/公升（培養基）。此約為 21 本紙張尺度边用中國Η家標準(CNS)甲4規格(210X297公龙) ^9186-- 五、發明説明（2¾ D N A 供應體 Amvg〇Ist〇psis_ sp. TS-1-60之 1，1〇〇倍高 (請先閱讀背而之注意事項孙填寫木页) 啻例Q 從大腸捍菌轉形菌株之SS純化 將40ml含安比西林（5〇w g/ml)之LB培餐基，分裝至 200b1雄形瓶内，並滅菌之。將一湛圈菌株£1{4&之细胞種 入每一燒瓶之培養基内，在371，振盪培養（300γρβ)16小 時。將所得之培養液，以分裝至含400»1無菌LB培養基 之1公升錐形瓶内，在3〇·〇，振盪培養（l50rpin)30小時。 在開始培養後約6小時，加4b1 IPTG(O.IM)至每-燒瓶内（ 最终濃度ImM)。離心（l〇,〇〇〇fP«>，20分）8公升培養液，得 141克濃細胞。 這些細胞懸浮於Tris-HCl缓衝液（5〇mM，PH7.5)内. 成500ml,再以超音波（5分χ3)破裂。加同樣之緩衝液， 及硫酸鎂（最終濃度l〇mM)入細胞破裂之産物溶液，成1公 升，加熱（601C· 30分），再離心（l〇,000rpB· 20分），得 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 940ml上淸液。加107.2克（20%飽和）之硫酸鞍至此上清液 内。所得之溶液在〇υ下，靜置2小時，再離心 ,30分），將所得之上淸液，置於進一步以含20%飽和硫 酸銨之Tris-HCl缕衝液平衡之BUTYL-Toyopearl管柱 U U T Y L - T 0 y ο P e a Γ 1 6 5 0 Μ , T 〇 s 0 h , 4 . 5 X 3 0 c m )中 β 以含 2 0 %飽和硫酸銨之相同缓衝液2公升洗條管柱，再以硫酸钱 溶液由20%飽和至飽和之相同缓衝液溶析。溶析液以 20β1分装收集。在第34至第50分裝部分有酸基睽基酸消旋 _活性。含併活性部分，對相同缓衝液透析，置於進一步 以相同缓衝液平衡之DEAE-T〇y〇pearl管柱（DEAE-T〇y〇Pear 22 本紙张尺度边用中明B家標準(CNS)甲4規格(210X297公龙) 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 ....... Λ 6 ί99 满-^-—---- 五、發明説明（2¾ 650M, Tosoh, 4.lx 16cm)中。以1公升相同缓衝液洗滌管 柱。再以1公升含濃度從0至0.5M氯化納之相同缓衝液溶析 之。溶析液以l〇ml分別收集。在第48至53號部分有醛基胺 基酸消旋酶活性。上述步驟，得在SDS -聚丙烯醯胺凝膠電 泳為單-帶之醯基胺基酸消旋酶1,570單位。從轉形菌株 E R 4 A純化此酶之结果，示於下。 (請先閲讀背面之注意T項再填寫木頁) 步驟 全蛋白總活性比活性純度 産 率 (mg) (單位） (單位/fflg) (倍） {%) 細胞破裂 18000 3180 0.17 1.0 100 熱處理 7123 3256 0.46 2.7 100 BUTYL-Toyopearl 249 1620 6.50 38.2 51 DEAE-Toyopear1 198 1573 13.5 79.4 49 本紙Λ尺度逍用中國Η家樣準(CNS)甲4規格(210x297公釐) 23

Claims (1)

1. '199x86 修 π , -1 .άά#曰 I , i 被充 公告本H3 — ----------—- J 第80103038號專利申請茱 申請專利範圍修正本 (81年12月24日） 1. 一種DNA片段，傜含具有以去氮雜法對DANH段测定β 之下列第1圖之鹺基序列或下列第1圖之编碼相同® 酸之编碼醯基胺基酸消旋酶之基因者，此DNA片段像 可産生醇基胺基酸消旋酶之Amycolatopsis sp.TS-1 菌： 第1 圖 GAATTCCCCC GGTGACCGCC TTCGACCGAG CCGCCTTTTA CGTGATCTCC AAGGAGGAGC Λ GTG ΛΑΛ CTC AGC GGT GTG GAA CTG CGC CGG GTG CAG ATGCCG CTC GTC Met Lys Leu Ser Gly Val Glu Leu Arg Arg Vai Gin Met Pro Leu Yal 15 10 15 GCC CCG TTC CGG ACT TCG TTC GGC ACC CAG TCG GTC CGC CAG CTC TTG Ala Pro The Arg Thr Ser Plie Gly Tlir Gin Ser Val Arg Glu Leu Leu 20 25 30 CTG CTG CGC GCG GTC ACG CCG GCC GGC GAG GGC TGG GGC GAA TGC GTG Leu Leu Arg Ala Val Thr Pru Ala Gly Glu Gly Trp Gly Glu Cys Val 35 40 45 . ACG ATG GCC GGT CCG CTG TAC TCG TCG GAG TAC AAC GAC GGC GCG GAA Thr Met Ala Gly Pro Leu Tyr Ser Ser Glu Tyr Asn Asp Gly Ala Glu 50 55 GU CAC GTG CTG CGG CAC TAC TTG ATC CCG GCG CTG CTG GCC GCG GAA GAC Ilis Val Leu Arg Ilis Tyr Leu lie Pro Ala Leu Leu Ala Ala Glu Asp 65 70 75 80 ATC ACC GCG GCG AAG GTG ACG CCG CTG CTG GCC AAG TTC AAG GGC CAC lie Thr Ala Ala Lys Val Thr Pro Leu Leu Ala Lys Plie Lys Gly His 甲4(210X297公爱）80. 5. 5,0003ί(Η) ί得 i基 得自 -60 60 109 157 205 253 301 349 1 H3 j Q Q 1 R ^ - 85 90 95 · CGG ATG GCC AAG GGC GCG CTG GAG ATG GCC GTG CTC GAC GCC GAA CTC Arg Met Ala Lys Gly Ala Leu Glu Met Ala Val Leu Asp Ala Glu Leu 100 105 110 CGC GCG CAC GAG AGG TCG TTC GCC GCC GAA CTC GCA TCG GTG CGC GAT Arg Ala His Glu Arg Ser Phe Ala Ala Glu Leu Gly Ser Val Arg Asp 115 120 - 125 TCT GTG CCG TGC GGC GTT TCG GTC GGG ATC ATG GAC ACC ATC CCG CAA Ser Val Pro Cys Gly Val Ser Val Gly lie Met Asp Thr He Pro Gin 130 135 140 CTG CTC GAC GTC GTG GGC GGA TAC CTC GAC GAG 6GT TAC GTG CGG ATC Leu Leu Asp Val Val Gly Gly Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Val Arg lie 145 150 155 160 AAG CTG AAG ATC GAA CCC GGC TGG GAC GTC GAG CCG GTG CGC GCG GTC Lys Leu Lys lie Glu Pro Gly Trp Asp Val Glu Pro Val Arg Ala Val 165 '170 175 CGC GAG CGC TTC GGC GAC GAC GTG CTG CTG CAG GTC GAC GCG AAC ACC Arg Glu Arg Phe Gly Asp Asp Val Leu Leu Gin Val Asp Ala Asn Thr 180 185 190 GCC TAC ACC CTC GGC GAC GCG CCG CAG CTG GCC CGG CTC GAC CCG TTC Ala Tyr Thr Leu Gly Asp Ala Pro Gin Leu Ala Arg leu Asp Pro Phe 195 200 205 GGC CTG CTG CTG ATC GAG CAG CCG CTG GAA GAG GAG GAC GTG CTC GGC Gly Leu Leu Leu lie Glu Gin Pro Leu Glu Glu Glu Asp Val Leu Gly 210 215 220 CAC GCC GAA CTG GCC CGC CGG ATC CAG ACA CCG ATC TGC CTC GAC GAG flis Ala Glu Leu Ala Arg Arg lie Gin Thr Fro lie Cys Leu Asp Glu 225 230 235 240 TCG ATC GTG TCG GCG CGC GCC GCG GCG GAC GCC ATC AAG CTG GGC GCG Ser lie Val Ser Ala Arg Ala Ala Ala Asp Ala lie Lys Leu Gly Ala 245 · 250 255 GTC CAA ATC GTG AAC ATC AAA CCG GGC CGC GTC GGC GGG TAC QG GAA Val Gin lie Val Asn lie Lys Pro Gly Arg Val Gly Gly Tyr Leu Glu 260 265 270 GCG CGG CGG GTG CAC GAC GTG TGC GCG GCG CAC GGG ATC CCG GTG TGG Ala Arg Arg Val His Asp Val Cys Ala Ala His Gly lie Pro Val Trp 275 280 285 397 445 493 .541 589 637 685 733 781 829 877 925 甲 4(210X 297公超）80. a 5,00051(H) 2 H3 199186 TGC GGC GGG ATG ATC GAG ACC GGC CTC GGC CGG GCG GCG AAC GTC GCC 973 Cys Gly Gly Met He Glu Thr Gly Leu Gly Arg. Ala Ala Asn Val Ala 290 295 . 300 CTG GCC TCG CTG CCG AAC TTC ACC CTG CCC GGC GAC ACC TCG GCG TCG 1021 Leu Ala Ser Leu Pro Asn Phe Thr Leu Pro Gly Asp Thr Ser Ala Ser 305 310 315 . 320 GAC CGG TTC TAC ΛΛΛ ACC GAC ATC ACC GAG CCG TTC GTG CTC TCC GGC 1069 Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Asp He Tlir Glu Pro Piie Val Leu Ser Gly 325 . 330 335 GGC CAC CTC CCG GTG GCC GAC CGG ACC GGG CCT CGG CGT GGC GCC GAT 1117 Gly His Leu Pro Val Ala Asp Arg Thr Gly Pro Arg Arg Gly Ala Asp 340 345 350 TCC GGA GCT GCT GGA CGA CGT GAC CAC GGC ΑΛΛ CGT GTG GAT CGG TTC 1165 Ser Gly Ala Ala Gly Arg Gly Asp His Gly Lys Gly Val Asp Arg Phe 355 360 365 GTA GCC CGC TAC GAA TTC CGG ACG TAGATTTGGT CGGATCGGAC CAGCCGGTCCG 1219 Val Ala Arg Tyr Glu Phe Arg Arg 370 375 CACGAGGCCG GATCTACCTT CGGGGGGTGC TGACACCGGT GCCGAGCAAA CCGCACACGA 1279 GTCTGGACCC GTCCTCGAAG CTCTCCGGGA CGTGCTCCTC GAGCCGGTCG CCGTCCGCGC 1339 GACACCCGGC GGCAGCTCCG CGGGGTGCTG ATTCACGACC CGCACGACGiV CCCGGAATT 1399 C 1400 2. —種製造醯基胺基酸消旋酶之方法，包括在培養基内， 培養攝帶具有啓動基因例如lac啓動基因，tac啓動基因 ，T7啓動基因及含具有以去氮雜法對DNA片段測定所得 之如申請專利範圍第1項之第1圖之齡基序列或如申請 專利範圍第1項之第1圖之编碼相同胺基酸之编碼醯基 肢基酸消旋_之基因之DNA片段（此DNAH段係得自可産 生醒基胺基酸消旋旗之Amycolatopsis sp. TS-1-60®, )之質體的轉形大腸桿g ( Esfihprirhia col i ),以在培 養液中生産及蓄積醯基胺基酸消旋酶，然後回收此消旋 m 〇 3 甲4(210X297公尨）80. 5 5,000張(H)