JPH10512742A - コリネ型細菌中で遺伝子発現を調節するｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、コリネ型細菌のリンゴ酸合成遺伝子の前方に存在し、この細菌から単離されるＤＮＡ- フラグメントに関する。たん白質をコードする任意の構造遺伝子がこのＤＮＡ- フラグメントの後方に挿入される。この様な構造体をコリネ型細菌に形質転換した後、ＤＮＡ- フラグメントの後方に挿入された構造遺伝子の発現を調節する。更に、本発明は、形質転換されたコリネ型細菌を培養することによって任意のたん白質を合成する方法に関する。このタイプの細菌は、コリネ型細菌のリンゴ酸合成から単離されたＤＮＡ- フラグメントを複製形で含有し、この後方に合成されるべきたん白質をコードする構造遺伝子が挿入される。合成されるべきたん白質をコードする構造遺伝子はその前方に存在するＤＮＡによって調節されるので、適する誘導物質が培地に添加されると構造遺伝子が発現し、所望のたん白質が合成される。

Description

【発明の詳細な説明】 コリネ型細菌中で遺伝子発現を調節するＤＮＡ 本発明は、コリネ型細菌中で遺伝子発現を調節するＤＮＡに関する。 個々の細菌は増殖の過程で細胞物質を新たに合成することが認められる。多く の細胞成分、たとえばアミノ酸及びポルフィリンが、クエン酸回路の代謝物質か ら出発して新たに生成される。これは、クエン酸回路から抽出される代謝物質が 新たに合成されることを予測させる。酢酸塩、エタノール又は脂肪酸上で微生物 を増殖する場合、クエン酸の代謝物質がグリオキシル回路として呼ばれる反応系 列によって新たに合成され（Kornberg，Biochem J 99（1966）1-11）、グリオキ シル回路の鍵酵素は、イソクエン酸- リアーゼ及びリンゴ酸- 合成の酵素である 。上記酵素は多くの細菌中、酢酸塩、エタノール又は脂肪酸上での増殖で必要と されるが炭水化物上での増殖では必要とされないので、２つの酵素の活性又は新 しい合成はしばしば培地の炭素源によって調節される。 捍状形態に基づき、コリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glut amicum）及びこれに近い種類のＣ．メラセコラエ(melassecolae)、ブレビバクテ リウムフラバム(Brevibacterium flavum)及びＢ．ラクトフエルメントウム(lact ofermentum)がコリネ型細菌に加えられる。更に上記種類は“グルタミン酸細菌 ”に属する。というのはこれが一定の増殖条件下で多量のグルタマートを培地中 に析出するからである。上記種類の微生物は極めて工業上重要である。というの はこれがアミノ酸、プリン及びたん白質の製造に使用されるからである。C.グル タミクム、C.メラセコラエ、B.フラバム及びB.ラクトフエルメントウムに関して 酢酸塩又はエタノール上での増殖がすでに認められ、これらがグリコキシル回路 、すなわちイソクエン酸- リアーゼ及びリンゴ酸- 合成の酵素も含有することが 分った（概要に関して Kinoshita，Amino acids，in Biology of industrialorg anisms，1985，pp．115-142，Benjamin/cummings出版参照）。 この細菌が長い間工業的に使用されているけれども、最近になってようやく分 子生物学的方法が開発された。この方法によればコリネ型細菌を使用目的によっ て遺伝子レベルで変化させることができる。一般にクローン化すべき遺伝子は、 ベクター上でその特有のプロモーターの調節下でクローン化され、このベクター は高いコピー数でコリネ型細菌中に存在する。その際多くの場合に、個々の遺伝 子の著しい過剰発現がコリネ型細菌の増殖で、同時に所望の生成物の生産に不利 に作用することが分った。これは、対応する遺伝子生成物の過剰生産が細胞の物 質代謝内で毒性作用を生じ、それによってこの細胞の増殖が遅くなることに起因 的過剰発現、たとえば調節されていないホモセリン- デヒドロゲナーゼをコード するhoml-遺伝子の自家過剰発現である（Reinscheid等，Appl Environm Microbi ol 60(1994)，126-132）。しかし突然変異していない遺伝子の過剰発現がC．グ ルタミクムの増殖に対する相同系中で有害であることも知られている（たとえば Eikmanns等，Microbiology 140（1994）181701828）。更にコリネ型細菌から由 来しない遺伝子がこの細菌中で過剰発現しなければならないことがしばしば起る 。対応する遺伝子生成物による増殖の阻害を受け入れることなくコリネ型細菌中 で所望の遺伝子を発現するために、種々の可能性が存在する。所望される遺伝子 は、１個のコピー数でコリネ型細菌の染色体中に組込まれる。この遺伝子のコピ ーのみが細菌中に存在するので、一般に対応する遺伝子生成物による毒性作用は 全く生じない。この処理の欠点は所望の目的を達成するために必要な方法にある 。そのために挿入された遺伝子の１個のコピー数によって所望された物質の十分 の量はめったに生じない。 コリネ型細菌の染色体中に遺伝子を組込む代りに、コリネ型細菌中で僅かなコ ピー数のベクター上で遺伝子をクローン化する。これは、対応する遺伝子生成物 が比較的僅かな量で産生され、それによって大部分は細胞に有害でないという利 点を有する。確かにこの場合産生された遺伝子生成物の比較的僅かな量はバイオ テクノロジーによる利用にとって不利である。 したがって細菌の産生又は増殖へのこの遺伝子生成物の不利な作用を避けるた めに、特定の時点でのみ所望の遺伝子生成物を多量に産生することが望まれる。 この目的を達成するために、所望の遺伝子をその特有のプロモーターの不在下に 調節可能なプロモーターの後方でクローン化することが提示されている。調節可 能な大腸菌プロモーターｌａｃ、ラムダＰ_L及びｔｒｐに関して、これらはコリ ネ型細菌中で種々の遺伝子の調節された発現に使用することができることはすで に知られている（Tsuchiya及びMorinaga，Bio/Technology 6（1988）428-431） 。にもかかわらずこのプロモーターは種々の欠点を有する：その１つは上記プロ モーターがコリネ型細菌から由来せず、外因性ＤＮＡである。コリネ型細菌中に この様なプロモーターが送り込まれることによって、これらは組換え型細菌とな り、これに対してより厳しい安全性がとわれる。もう１つは３つのプロモーター の夫々が遺伝子の誘発に必要である条件が工業的にあまり重要でないことである 。したがってｌａｃ- プロモーターは遺伝子の誘発のためにかなり高価な物質Ｉ ＰＴＧを必要とし、これがこのプロモーターの工業的規模での使用を不利にする 。プロモーターラムダＰ_Lが熱によって活性化される。しかし熱が細菌を傷つけ るばかりでなく、産生された生成物にも有害に影響する。その結果としてこのプ ロモーターはコリネ型細菌にとって全く工業上重要でない。ｔｒｐ- プロモータ ーはトリプトファン- 欠乏によって活性化される。コリネ型細菌は一般にトリプ トファン欠乏下に害を受けるので、このプロモーターを使用することがコリネ型 トリプトファン- 欠乏- 突然変異体の産生を予測させる。この様な突然変異体の 回収は比較的に費用がかかるので、ｔｒｐ- プロモーターも従来コリネ型細菌で のバイオテクノロジー工業で全く利用されない。 容易に挿入できる、価格上有利な物質によって調節されるコリネ型プロモータ ーが調節可能なプロモーターにとって理想的なケースである。従来唯一知られて いるコリネ型プロモーターは、イソクエン酸- リアーゼに対する遺伝子のプロモ ーターである（ヨーロッパ特許公開第0530765 号公報）。このプロモーターは糖 が培地中に存在しない限り、遺伝子の発現を生じる。しかしほとんどの発酵培地 中に糖が炭素源として使用されるので、糖の存在下に価格上有利な誘導物質によ って遺伝子の発現を生じる調節可能なプロモーターを得ることが重要である。 したがって本発明の課題は、培養培地の炭素源に関係なくコリネ型細菌中で種 々の遺伝子の調節された発現を可能にするＤＮＡ- フラグメントを調製すること にある。 この課題は、本発明によれば、コリネ型細菌のリンゴ酸合成遺伝子の前方に存 在し、この細菌から単離されるＤＮＡ- フラグメントによって解決される。この フラグメントはＤＮＡフラグメントの後方に挿入されかつたん白質をコードする 、任意の構造遺伝子の発現を、ベクターへの組込み及びコリネ型細菌の形質転換 の後に調節する。 コリネ型細菌中でのリンゴ酸合成遺伝子の発現が、誘導物質たとえば乳酸塩、 ピルビン酸塩及び（又は）酢酸塩の存在によって誘発されることは、確かめられ ている。この誘発、特に酢酸塩による誘発は、更に他の炭素源が培地中にある場 合も行われる。糖の存在下又は複合培地中でさえも顕著な誘発が酢酸塩によって 行われる。 コリネ型細菌のリンゴ酸合成遺伝子の前方に存在するＤＮＡ- フラグメントの 単離の後に、合成すべきたん白質をコードする構造遺伝子がこのフラグメントの 後方に挿入され、この構造体をベクター中に連結し、次いでコリネ型細菌中で形 質転換する。この様な形質転換体の培養の間、任意の時点で培地に誘導物質、た とえば乳酸塩、ピルビン酸塩、好ましくは酢酸塩を加える。その後、構造遺伝子 が所望の時点で発現し、それによって所望のたん白質が合成される。それ故に本 発明により調製されたＤＮＡ- フラグメントは、コリネ型細菌中で種々の遺伝子 の調節された発現を可能にする。単離されたＤＮＡそれ自体がコリネ型細菌から 由来するので、上記調節は、相同系中で行われる。したがって本発明によるＤＮ Ａ- 領域は、初回で相同系中で価格上有利な誘導物質、たとえば酢酸塩によって 及び発酵培地の組成に関係なくコリネ型細菌中の遺伝子を調節し、発現させるこ とができる。 コリネバクテリウムグルタミクムのリンゴ酸合成- 遺伝子の前方に存在し、こ の細菌から単離されるＤＮＡ- フラグメントを調製するのが好ましい：すなわち Ｃ．グルクミクムからリンゴ酸合成(aceＢ)の遺伝子を発現及び調節に必要な構 造体と共に単離し、配列する。ＤＮＡ- 配列及びこれから誘導されたアミノ酸配 列を、表２中に示す。表２中で aceＢ- 遺伝子のリボソーム結合部位に下線を引 き、“ＲＢＳ”で表わす。 aceＢの転写の位置(potentielle)ターミネーターを 、対向する矢印で表わす。 リンゴ酸合成- 遺伝子の前にあるＤＮＡ領域（表２によるヌクレオチド１ない し５７４）が、他の遺伝子の調節された発現も生じることが認められる。 実施例： １．種々の培地上で増殖後にコリネバクテリウムグルタミクムの細胞抽出物中で のリンゴ酸合成活性試験 Ｃ．グルタミクム- 株ＡＴＣＣ１３０３２（野性型）の抽出物中で、種々の培 地上で増殖後にリンゴ酸合成（ＭＳＹ）の活性を測定して、炭素源がこの酵素活 性に影響することを調べる。更に細胞を１４時間１０ｍｌ ２×ＴＸ- 完全培地 (Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Laboratory Press)中で３０℃で振盪培養する（１２０ＵｐＭ）。次い で細胞を遠心分離して沈降させ、同一緩衝液１ｍｌ中に取る。次いで得られた細 胞懸濁液を夫々培地６０ｍlに植菌し、光学密度（ＯＤ₆₀₀）１．０が得られる。 使用された培地は２×ＴＹ- 完全培地であるか又は炭素源として夫々１％のグル コース、酢酸塩、ピルビン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、フマール酸 塩又はグルタミン酸塩を有する最小培地（Eikmanns等，Appl Microbiol Biotech nol 34（1991）617-622）を使用する。培養液を新たに３０℃で培養し、ＯＤ₆₀₀ を追跡する。８〜１０のＯＤ₆₀₀を得ると同時に、細胞を遠心分離して集め、緩 衝液ｐＨ７．６（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ）で１回洗滌し、同一緩衝液１ｍｌ中 に取り、Branso-Sonifier Ｗ２５０（１０分間、２０％の間隔及び三十ワットの 出力で脈動させる）中で超音波処理して、清毒する。細胞フラグメントを分離す るために、ホモジナートを３０分間１３０００ＵｐＭでシグマ２Ｋ１５Kuhl遠心 分離機中で４℃で遠心分離し、次いで澄明な上澄み（粗抽出物）をＭＳＹ- 活性 の測定のために使用する。 酵素テストは、１．０ｍｌの最終容量で５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．６ ）、４０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ Ｎａ- グリオキシラート、０．１５ｍＭア セチル- 補酵素及び粗抽出物を含有する。混合物を３０℃で培養する。２分の時 間間隔を経て、吸光吸収を２３２ｎｍで測定する。これはアセチル- ＣｏＡのチ オエステル生成の分解によって生じる。２３２ｎｍでアセチル- ＣｏＡの吸光係 数は、４．５ｍＭ^-1ｃｍ^-1である（Stadtman，Methods in Enzymolgy，第３巻、 1957，ニューヨーク：Academic Press）。粗抽出物のたん白質含有量は Biuret- 法（Bradford，Anal Biochem 72（1976）248-254）によって測定される。得られ た特異的リンゴ酸合成活性を表１中に示す。 表１から明らかな様に、ＭＳＹの活性は２×ＴＹ- 完全培地上で並びに炭素源 としてグルコース、クエン酸塩、コハク酸塩、フマール酸塩又はグルタル酸塩を 有するＣｇｃ- 最小培地上で増殖した場合約０．０４Ｕ／ｍｇたん白質である。 炭素源として乳酸塩又はピルジン酸塩を有するＣａｃ- 最小培地上で、ＭＳＹ- 活性は０．１７３Ｕ／ｍｇたん白質又は０．１９２Ｕ／ｍｇたん白質の値に上昇 する。最も高いＭＳＹ- 活性は、酢酸塩を有するＣｇｃ- 最小培地上で増殖した 場合２．２１２Ｕ／ｍｇたん白質で観察される。酢酸塩が上記培地に添加される 場合、同様にこれは０．５００Ｕ／ｍｇたん白質ないし１．３３０Ｕ／ｍｇたん 白質の値に著しいＭＳＹ- 活性上昇を生じる。この結果は、Ｃ．グルタミクム中 でＭＳＹの活性が培地の炭素源によって調節されることを示す。 ２．コリネバクテリウムグルタミクムからＭＳＹ- 遺伝子を単離及びサブクロー ニング Ｃ．グルタミクムからＭＳＹ- 遺伝子(aceB)を単離するために、コスミドｐＨ Ｃ７９（Hohn 及び Collins，Gene 11（1980）291-298）に基づいてコリネ細菌 コスミド- 遺伝子バンクを公知方法(Sambrook 等，Molecular Cloning，A Labor atory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Laboratory Press)に従って使用 する。更にＣ．グルタミクムから染色体ＤＮＡを単離し(Eikmanns等，Microbiol ogy 140（1994）1817-1828)、制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分的に分解する。コスミ ドｐＨＣ７９のＢａｍＨＩ- 切断部位中に得られたフラグメントを連結した後に 、混合物はラムダバクテリオファージのたん白質外被中にパッケージングされ、 大腸菌- 株ＥＤ８６５４（Murray等，Mol Gen Genet 150（1977）53-61）をこれ でトランスフェクションする。ラムダファージのたん白質外被中に組換え体コス ミドをパッケージングすることは、Sternberg 等の方法(Gene 1（1979）255-280 )に従って、大腸菌ＥＤ８６５４のトランスフェクションは、Sambrook等の方法( Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Labo atory Press)に従って行われる。得られた組換え体大腸菌- クロー ン全部で３０個から、対応するコスミドを単離し（Sambrook等，Molecular Clon ing，A Laboratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Laboratory Press） 、制限分析を酵素 Hind IIIを用いて行う。調べられたコスミド２４個は挿入体 を有すること、そしてその挿入体は約３５ｋｂの大きさを示すことが分る。コス ミド- 保有大腸菌- クローン全部で２２００個を一緒にし、この混合物から公知 方法（Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Cold S pring Harbour Laboratory Press）に従ってコスミド- ＤＮＡを調製する。Ｃ． グルタミクムからaceＢ- 遺伝子を単離するために、コスミド- 遺伝子バンクを ＭＳＹ- 欠落大腸菌- 突然変異ＤＶ２１Ａ０５（Vanderwinkel及び De Vliegher e Eur J Biochem 5（1968）81-90）中で公知方法（Sambrook等，Molecular Clon ing，A Laboratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Laboratory Press） に従って形質転換する。突然変異ＤＶ２１Ａ０５は、そのＭＳＹ- 欠落のゆえに 唯一の炭素源として酢酸塩上でもはや増殖することができない。この突然変異体 中でコスミド- 遺伝子バンクの形質転換後、クローン全部で１０００個が得られ る。このうち唯一の炭素源として酢酸塩を有するＭ９- 最小培地（Sambrook等， Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Labo ratory Press）上でクローン全部で３個の増殖が認められる。このクローンから 対応するコスミド（Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Handbook， 1989，Cold Spring Harbour Laboratory Press）を単離し、大腸菌- 突然変異Ｄ Ｖ２１Ａ０５中で新たに形質転換した後、生じたクローンを唯一の炭素源として 酢酸塩を有するＭ９- 培地上で新たに増殖することができる。これは３つのコス ミド上にＣ．グルタミクムからのaceＢ- 遺伝子が局在されていることを推定さ せる。 Ｃ．グルタミクムからのaceＢ- 遺伝子を比較的小さいフラグメント上で制限 するために、３つのコスミドを制限酵素 Sau３Ａによって部分的に分解し、公知 方法(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Cold Sp ring Harbour Laboratory Press)に従って０．８％寒天ゲル上で電場中で分離す る。３．０ｋｂないし６．０ｋｂの大きさの範囲のフラグメントを電気溶離（Sa mbrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Laboratory Press）によってゲルから単離し、ベクターｐＨＣＹＣ１８ ４のＢａｍＨＩ- 切断部位（Chang 及び Cohen，J Bacterlol（1978）1141-1156 ）に連結する。連結混合物を用いて大腸菌ＤＶ２１Ａ０５を形質転換し、得られ た形質転換体を単独の炭素源として酢酸塩上で増殖する、その可能性について新 たに調べる。この方法で新たにクローンを単離し、突然変異ＤＶ２１Ａ０５のそ のプラスミドが酢酸上で増殖することができる。夫々の組換え体株から対応する プラスミドを単離し、制限酵素地図を表記する。プラスミドの１つ、ｐＡＢ- １ ７の制限酵素地図を図１に示す。このプラスミドから公知方法でＭＳＹをコード するＤＮＳ- フラグメントを、ＢｆｒＩ- ＰｖｕＩ- 制限によって３ｋｂフラグ メントとして単離し、Ｃ．グルタミクム／大腸菌- ペンデル(Pendel)ベクターｐ ＥＫＯ(Eikmanns等，Gene 102（1991）93-98)に連結する。ベクター中で挿入体 の配向に基づき、新しく構成されたプラスミドをｐＥＫＢ１ａ及びｐＥＫＢ１ｂ と呼ぶ。双方のプラスミドの制限酵素地図は図２中に表わされる。 ３．ＭＳＹ- 構造遺伝子及び制限領域のヌクレオチド配列の分析 配列決定に関して、２つの重複する部分フラグメント；１．６ｋｂ ＢｆｒＩ - ＫｐｎＩ及び１．８ｋｂ ＳｐｈＩ−ＰｖｕＩ- フラグメントをプラスミドｐ ＡＢ- １７から公知方法で単離する。２つのフラグメントの突出末端をクレノウ - ポリメラーゼで補充し、平滑末端とし(Sambrook等，Molecular Cloning，A La boratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Laboratory Press)、プラスミ ドｐＵＣ１８の適する切断部位（Vieira及び Messing，Gene 19（1982）259-268 ）に連結する。得られたプラスミドをHeinkoff 法（Gene 28（1984）351-359） に従って欠失構造を得るために使用し、次いでこれを連鎖停止- 配列決定法(San ger等，Proc Natl Acad Sci USA，74（1977）5463-5467)によって配列決定する 。その際に得られる、３ｋｂＢｆｒＩ- ＰｖｕＩ- フラグメントの全配列を、表 ２中に示す。更に表２中に aceB-遺伝子から導かれた、たん白質配列は、Ｃ．グ ルタミクムからのＭＳＹに対するものである。この配列はこの遺伝子の前方に存 在するリボソーム結合部位及びこの遺伝子の後方に存在する終結構造を転写のた めに複写する。 ４．ＭＳＹ- 遺伝子をプラスミド上に有するＣ．グルタミクム- 株のＭＳＹ- 活 性 エレクトロポレーション(Liebl等，FEMS Microbiol Lett 65（1989）299-304) によって、プラスミドｐＥＫＢ１ａ及びｐＥＫＢ１ｂをＣ．グルタミクム中に挿 入し、得られた菌株をＷＴ（ｐＥＫＢ１ａ）及びＷＴ（ｐＥＫＢ１ｂ）と呼ぶ鵜 公知方法に従って新しく構成されたＣ．グルタミクム- 株を炭素源としてグルコ ース、グルコース／酢酸又は酢酸を有するＣｇｃ- 最小培地上で８〜１０のＯＤ₆₀₀ まで増殖し、粗抽出物を産生し、これ中で特異的ＭＳＹ- 活性を測定する。 測定されたＭＳＹ- 活性を表３中に示す。 Ｃ．グルタミクム- 株ＷＹ（ｐＥＫＢ１ａ）及びＷＴ（ｐＥＫＢ１ｂ）は、す べて３つの炭素源上で、Ｃ．グルタミクム- 野性型（ＷＴ）及び出発ベクターｐ ＥＫＯを有するＣ- グルタミクム- 株ＷＴ（ｐＥＫＯ）に比して著しく高い活性 を夫々が示す。この結果は、３ｋｂ ＢｆｒＩ- ＰｖｕＩ- フラグメント上でＣ ．グルタミクムからの aceB-遺伝子が機能的に存在することを示す。Ｃｇｃ- グ ルコース／酢酸塩上でＣ．グルタミクム- 株ＷＴ（ｐＥＫＢ１ａ）及びＷＴ（ｐ ＥＫＢ１ｂ）を増殖後、ＭＳＹ- 活性は、グルコース上でこの菌株を増殖した場 合よりも約８倍高い。唯一の炭素源として酢酸塩を有するＣｇｃ- 最小培地上で 双方の菌株を増殖した場合、Ｃｇｃ- グルコース上で増殖した場合に比して更に １６ないし１８倍高い。この結果は、単離されたフラグメント上に aceB-遺伝子 の発現及び調節に必要な構造すべて、すなわちプロモーター及び調節配列が存在 することを裏づける。この構造は aceB-遺伝子の前方に存在する。クローン化さ れたフラグメントは本来の aceB-構造遺伝子の前方に更に５８４ｂｐを有するの で（表２参照）、発現及び調節に対する構造遺伝子はこのＤＮＳ- 領域中に局在 しなければならない。 ５．Ｃ．グルタミクムから aceB-遺伝子の調節及び発現試験 ＭＳＹの観察された調節が遺伝子レベルでの調節であり、そして酵素それ自体 の調節でない（たとえば抑制、活性化又は共有変性による）ことを証明するため に、グルコースを有するＣｇｃ- 最小培地上で増殖されたＣ．グルタミクムＷＴ 又はＷＴ(ｐＥＫＢ１ａ)-細胞及び酢酸塩を有する最小培地上で増殖されたＣ． グルタミクムＷＴ(ｐＥＫＢ１ａ)-細胞の粗抽出物をそのたん白質モデル上で試 験する。更に上記株を公知方法に従って対応する培地上で増殖し、粗抽出物を産 生し、これを Laemmli法(Nature 227（1970）680-685)に従って変性条件下１２ ．５％ポリアクリルアミドゲル上で分離する（図３）。粗抽出物中のＭＳＹ- た ん白質バンドの局在化のために、Ｃ．グルタミクムからのＭＳＹを均質性になる まで精製し（補遺１参照）、粗抽出に並行して、電気泳動を変性条件下に行う（ 図３）。Ｃｇｃ- 酢酸塩上でＣ．グルタミクムＷＴを増殖した後、ＭＳＹの高さ で、Ｃｇｃ- グルコース上でのこの株の増殖後よりも明らかに強いたん白質バン ドが認められる。菌株ＷＴ（ｐＥＫＢ１ａ）は、Ｃｇｃ- 酢酸塩上での増殖後極 めて強いＭＳＹ- たん白質バンドを示す。このバンドの強度から、この菌株中の ＭＳＹが全細胞たん白質の約２０％を占めていると評価することができる。この 結果は、aceBの発現及び調節に不可欠な構造体が誘発された条件下多量のたん白 質の新しい合成をもたらすことを示す。更に酢酸塩上で増殖後のＭＳＹ- 活性の 観察された増加はＭＳＹ- たん白質の新しい合成に起因するものとする結果によ って明白である。 ６．独立系中で機能性について aceＢ- 遺伝子の前方に存在するＤＮＳ- 領域の 試 験 ace Ｂ- 遺伝子の前方のＤＮＳ- 領域を、公知方法で５７４ｂｐ ＢｆｒＩ- ＤｒａＩ- フラグメントとして単離し、突出末端をクレノウ- ポリメラーゼで補 充し、平滑末端とし、クレノウ- ポリメラーゼで満たされた、ベクターｐＥＫｐ １ＣｍのＳａｌＩ- 切断部位（Eikmanns等，Gene 102（1991）93-98）に連結す る。このプラスミドは挿入部位の後方にクロラムフエニコール- アセチルトラン スフエラーゼ- 遺伝子(cat)を有するが、特有のプロモーター不在下、すなわち プラスミドｐＥＫｐ１ＣｍによってＣａｔ- 遺伝子がＣ．グルタミクム中で読み 取られない。ベクターｐＥＫＰ１ＣｍにＢｆｒＩ- ＤｒａＩ- フラグメントを連 結した後、Ｃａｔ- 遺伝子の前方にＢｆｅＩ- ＤｒａＩ- フラグメントを配向す ることは、ace β- 遺伝子の前に配向することに相当することが公知方法による 配列決定によって保証される。対応するプラスミドはｐＩＷＩと呼ばれる。公知 方法によるＣ．グルタミクムへのプラスミドｐＩＷＩの挿入後、この菌株中でク ロラムフエニコール- アセチルトランスフエラーゼ（ＣＡＴ）の活性を、Ｃｇｃ - グルコース、Ｃｇｃ- グルコース／酢酸塩又はＣｇｃ- 酢酸塩上での増殖後に測 定する。更に試験すべき菌株を公知方法に従って上記培地上でＯＤ₆₀₀８〜１０ まで培養し、粗抽出物を産生し、これ中で特異的ＣＡＴ- 活性を Shaw 法(Meth Engymol 43（1975）737-755)に従って測定する。試験は最終容量１．０ｍｌ中に １００ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．８、１ｍＮアセチル- 補酵素Ａ、１ｍＭ５ ．５- ジチオビス-(２- ニトロ安息香酸)及び粗抽出物を含有し、２．５ｍＭク ロラムフエニコールを用いて開始する。混合物を３０℃で培養する。２分間の間 隔を経て、４１２ｎｍで吸光吸収を測定する。粗抽出物のたん白質含有量は、Bi uret法(Bradford，Anal Biochem 72（1976）248-254)によって測定される。得ら れた特異的ＣＡＴ- 活性を表４中に示す。Ｃ．グルタミクムＷＴ中で試験される 条件下でＣＡＴ- 活性は認められないか、組換え体株Ｃ．グルタミクムＷＴ（ｐ ＩＷＩ）はすべて炭素源でＣＡＴ- 活性を示す。勿論Ｃｇｃ- グルコース上での 増殖直後Ｃｇｃ- グルコース／酢酸塩上での増殖後に比して約２０倍低く、しか もＣｇｃ- 酢酸塩上での増殖後に比して５０- 倍少ない。この結果は、単離され た５７４ｂｐ ＢｆｒＩ−ＤｒａＩ- フラグメントがフラグメントの調節された 遺伝子発現を可能にすることを裏づける。フラグメントの誘発は酢酸塩によって 糖の存在のみで行われる。 補遺１． Ｃ．グルタミクムからのＭＳＹの精製 Ｃ．グルタミクムからのＭＳＹの精製のために、ＣｇＣ- 酢酸- 培地中で増殖 された培養液６０ｍｌをＯＤ₆₀₀８〜１０で使用する。細胞を５０ｍＭモルホリ ノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）／ＮａＯＨｐＨ６．０ ２０ｍｌで２回洗滌し、 同一緩衝液１ｍｌ中で５Ｕ／ｍｌ ＤＮアーゼ、１５μｇ／ｍｇＲＮアーゼ及び １００μＭフエニルメチルスルホニル- フルオリドの添加後再懸濁する。細胞断 片の破壊及び除去は、すでに知られた方法に従って行われる。すべての精製工程 を４℃で実施する。細胞抽出物を５０ｍＭ ＭＥＳ／ＮａＯＨｐＨ６で１０ｍｌ に希釈する。１８３．０００ｘｇで２時間の超遠心分離後、上澄みを、ＦＰＬＣ - 装置でＨＲ５／５モノＱ- アニオン交換体カラム（PharmaciaLKB，フライブル グ、ドイツ）を用いてクロマトグラフィー分離する。最初のクロマトグラフィー 精製の間、ＭＳＹを０．１Ｍ〜０．４Ｍ ＮａＣｌ- 勾配で５０ｍＭ ＭＥＳ／ ＮａＯＨｐＨ６中に溶離する。第二クロマトグラフィーに対して、部分的に精製 されたＭＳＹの緩衝液を限外濾過によって５０ｍＭ ＭＥＳ／ＮａＯＨｐＨ６か ら５０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ８に変える。第二クロマトグラフィー精製の間 、ＭＳＹを０．２Ｍ〜０．５Ｍ ＮａＣｌ- 勾配で５０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐ Ｈ８中に溶離する。双方のクロマトグラフィー分離の間、流動速度１ｍｌ／分を 調整する。２つの分離の流量は夫々１ｍｌ分画に集められ、ＭＳＹ- 活性を調ベ る。活性を有する分画を夫々一緒にする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 アイクマンス・ベルンハルト ドイツ連邦共和国、デー−52428 ユーリ ッヒ、コペルニクスストラーセ、33 (72)発明者 ザーム・ヘルマン ドイツ連邦共和国、デー−52428 ユーリ ッヒ、ヴェンデリヌスストラーセ、71

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．コリネ型細菌のリンゴ酸合成遺伝子の前方に存在し、この細菌から単離され るＤＮＡ- フラグメントに於いて、これはＤＮＡ- フラグメントの後方に挿入さ れたたん白質をコードする任意の構造遺伝子の発現を、ベクターへの組込み及び コリネ型細菌の形質転換の後に調節することを特徴とする、上記ＤＮＡ- フラグ メント。 ２．コリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum）のリンゴ 酸合成遺伝子に由来する、請求の範囲１記載のＤＮＡ- フラグメント。 チド１ないし５７４のヌクレオチド配列を有する、請求の範囲２記載のＤＮＡ- フラグメント。 ４．後方に挿入された、任意の構造遺伝子を有する、請求の範囲１ないし３のい ずれかに記載のＤＮＡ- フラグメント。 ５．請求の範囲１ないし４のいずれかに記載のＤＮＡ- フラグメントを含有する ベクター。 ６．請求の範囲１ないし４のいずれかに記載のＤＮＡ- フラグメントを複製可能 な形で含有する、コリネ型細菌組換え体。 ７．請求の範囲５記載のベクターを含有する、請求の範囲６記載のコリネ型細菌 組換え体。 ８．誘導物質が添加された培地中で形質転換されたコリネ型細菌を培養すること によって任意のたん白質を合成する方法に於いて、上記細菌はコリネ型細菌のリ ンゴ酸合成遺伝子から単離されたＤＮＡ- フラグメントを複製可能な形で含有し 、ＤＮＡ- フラグメントの後方に合成すべきたん白質をコードする構造遺伝子が 挿入され、このＤＮＡが合成すべきたん白質をコード構造遺伝子の発現を調節し 、それによって構造遺伝子が発現し、所望のたん白質が合成されることを特徴と する、上記たん白質を合成する方法。 ９．培養培地に誘導物質として乳酸塩、ピルビン酸塩、好ましくは酢酸塩を添加 する、請求の範囲８記載の方法。