BR112019008321A2 - célula e método de produção de ramnolipídeo que tem atividade de glicose desidrogenase reduzida e seu uso - Google Patents

Abstract

a invenção se refere a células que produzem ramnolipídeos e são geneticamente modificadas, de modo que tenham uma atividade reduzida em comparação com o tipo selvagem das mesmas, de uma glicose desidrogenase e a um método para produzir ramnolipídeos com o uso das células de acordo com a invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “CÉLULA E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEO QUE TEM ATIVIDADE DE GLICOSE DESIDROGENASE REDUZIDA E SEU USO”

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A invenção refere-se a células que produzem ramnolipídeos e são geneticamente modificadas, de modo que tenham uma atividade reduzida em comparação com o tipo selvagem das mesmas, de uma glicose desidrogenase e a um método para produzir ramnolipídeos com o uso das células de acordo com a invenção.

TÉCNICA ANTERIOR [002] O documento DE102012201360 descreve células que produzem ramnolipídeos e são geneticamente modificadas, de modo que tenham atividades reduzidas ou aumentadas em comparação com o tipo selvagem das mesmas, de certas enzimas e combinações de enzima, o que significa que as células produzem vantajosamente os ramnolipídeos, e um método para produzir ramnolipídeos com o uso das células de acordo com a invenção.

[003] É um objetivo da invenção fornecer células que têm um rendimento aumentado de ramnolipídeos com base na fonte de carbono usada.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [004] Constatou-se que, surpreendentemente, as células descritas abaixo têm capacidade de alcançar o objetivo supracitado.

[005] A invenção fornece células que produzem ramnolipídeos e são geneticamente modificadas, de modo que tenham uma atividade reduzida, em comparação com o tipo selvagem das mesmas, de uma glicose desidrogenase.

[006] A invenção fornece adicionalmente um método para produzir ramnolipídeos com o uso das células supracitadas como biocatalisadores.

[007] Uma vantagem da presente invenção é que é possível usar os organismos que não são patogênicos e são fáceis de cultivar.

[008] Outra vantagem da presente invenção é que é possível usar uma grande

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2/54 seleção de fontes de carbono.

[009] Uma vantagem adicional é que não é necessário, em todas as circunstâncias, usar óleos como substrato único ou como cossubstrato.

[010] Outra vantagem é que é possível, com o auxílio da invenção, produzir ramnolipídeos que têm propriedades definidas e moduláveis.

[011] Uma vantagem adicional é que é possível produzir ramnolipídeos com rendimentos superiores de carbono e de espaço-tempo do que com as células sem alteração nessas atividades.

[012] A presente invenção, portanto, fornece uma célula, preferencialmente uma célula isolada com capacidade de produzir pelo menos um ramnolipídeo, caracterizado por ter sido geneticamente modificado, de modo que, em comparação com o tipo selvagem da mesma, tenha uma atividade reduzida de pelo menos uma enzima E-ι, que catalisa a conversão de D-glicose e quinona para D-glicono-1,5lactona e quinol.

[013] O termo “tipo selvagem” de uma célula denota, no presente documento, uma célula cujo genoma está presente em um estado conforme surgiu naturalmente através da evolução. O termo é usado tanto para a célula inteira quanto para genes individuais. O termo tipo selvagem, portanto, particularmente não incluir aquelas células ou genes cujas sequências de genes foram pelo menos parcialmente modificadas pelo homem, por meio de técnicas recombinantes. O termo “tipo selvagem” denota, em particular, o fenótipo, o genótipo ou o gene que ocorre com maior frequência em número em uma população natural de organismos.

[014] No contexto da presente invenção, é entendido que o termo “ramnolipídeo” significa um composto da fórmula geral (I) ou o sal do mesmo,

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fórmula geral (I), [015] em que [016] m = 2, 1 ou 0, em particular, 1 ou 0, [017] n = 1 ou 0, em particular, 1, [018] R¹ = radical orgânico que tem 2 a 24, preferencialmente, 5 a 13 átomos de carbono, em particular, opcionalmente ramificado, opcionalmente substituído, em particular, hidroxissubstituído, opcionalmente insaturado, em particular, opcionalmente monoinsaturado, bi-insaturado ou tri-insaturado, radical de alquila, preferencialmente um selecionado a partir do grupo que consiste em pentenila, heptenila, nonenila, undecenila e tridecenila e (CH₂)_O-CH₃ em que o = 1 a 23, preferencialmente 4 a 12, e [019] R² = independentemente um do outro, radical orgânico idêntico ou diferente, que tem 2 a 24, preferencialmente, 5 a 13 átomos de carbono, em particular, opcionalmente ramificado, opcionalmente substituído, em particular, hidroxissubstituído, opcionalmente insaturado, em particular, opcionalmente monoinsaturado, bi-insaturado ou tri-insaturado, radical de alquila, preferencialmente um selecionado a partir do grupo que consiste em pentenila, heptenila, nonenila,

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4/54 undecenila e tridecenila e (CH₂)_O-CH₃ em que o = 1 a 23, preferencialmente 4 a 12. [020] ist.

[021] Se a célula de acordo com a invenção puder produzir um ramnolipídeo em que m = 1, é preferencial que o radical determinado por meio de R¹ e R² seja

[022] derivado de ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3hidroxioctanoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3-hidroxidecenoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidodecenoico, ácido 3hidroxidodecenoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3-hidroxidecenoil-3hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecenoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3hidroxidecanoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidodecenoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3hidroxitetradecenoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3hidroxidodecenoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3hidroxitetradecanoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3hidroxidecanoil-3-hidroxitetradecenoico, ácido 3-hidroxitetradecenoil-3hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3hidroxidodecenoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3hidroxidodecenoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxitetradecanoico, ácido 3hidroxitetradecanoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil-3hidroxitetradecanoico, ácido 3-hidroxi-hexadecanoil-3-hidroxitetradecanoico, ácido 3

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5/54 hidroxitetradecanoil-3-hidroxi-hexadecanoico ou ácido 3-hidroxi-hexadecanoil-3hidroxi-hexadecanoico.

[023] É evidente para uma pessoa versada na técnica, que uma célula de acordo com a invenção também pode realizar misturas de vários ramnolipídeos da fórmula gera! (!).

[024] Nessa conexão, é preferencial que as células de acordo com a invenção possam realizar misturas de ramnolipídeos da fórmula geral (I), caracterizado por n = 1 em mais de 80% em peso, preferencialmente mais de 90% em peso, particularmente, de preferência, mais de 95% em peso dos ramnolipídeos produzidos e o radical determinado por meio de R¹ e R² é derivado de ácido 3hidroxidecanoil-3-hidroxioctanoico ou ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidecanoico em menos que 20% em peso, preferencialmente menos do que 15% em peso dos ramnolipídeos produzidos, em que a % em peso específica é baseada na soma de todos os ramnolipídeos da fórmula gera! (!) produzidos.

[025] Os números de acesso listados no contexto da presente invenção correspondem às entradas de banco de dados do banco de proteína do NCBI com uma data de 26.01.2016; geralmente, no presente caso, o número de versão da entrada é identificado por “.número” como, por exemplo, “.1”.

[026] A menos que declarado de outro modo, todas as porcentagens (%) dadas são as porcentagens em massa.

[027] A expressão “atividade reduzida de uma enzima E_x” usada é consequentemente entendida de modo a significar preferencialmente atividade diminuída por um fator de pelo menos 0,5, particularmente, de preferência, peio menos 0,1, ainda preferencialmente, pelo menos 0,01, ainda de modo adicionalmente preferencial, pelo menos 0,001 e, com máxima preferência, peio menos 0,0001. A expressão atividade reduzida também inclui ausência de atividade detectável (atividade nula).

[028] Os métodos para diminuir as atividades enzimáticas em micro-organismos são conhecidas por uma pessoa versada na técnica. As técnicas de biologia

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6/54 molecular, em particular, são úteis no presente documento. Por exemplo, a atividade de uma certa enzima pode ser diminuída por mutação alvejada ou por outras medidas conhecidas por uma pessoa versada na técnica para diminuir a atividade de uma certa enzima. As instruções para modificar e reduzir a expressão de proteína e diminuição de atividade de enzima associada especificamente para Pseudomonas e Burkholderia, em particular, para interromper os genes específicos, podem ser encontradas por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, no documento Dubeau et al. 2009, BMC Microbiology 9:263; Singh & Rõhm. Microbiology. 2008, 154:797 a 809 ou Lee et al. FEMS Microbiol Lett. 2009, 297(1):38 a 48. As formas preferenciais de diminuir a atividade enzimática da enzima E-ι que são descritas abaixo podem ser, de modo similar, preferencialmente usadas para que atividades de enzima adicionais sejam diminuídas no contexto da presente invenção.

[029] As células preferenciais de acordo com a invenção são caracterizadas por a diminuição na atividade enzimática seja alcançada por modificação genética do gene que codifica a enzima E-ι, em que a dita modificação é selecionada a partir do grupo que compreende, preferencialmente que consiste em inserção de DNA estranho no gene, deleção de pelo menos partes do gene, mutações pontuais na sequência genética, especialmente em ou de sequências reguladoras, como, por exemplo, promotores e terminadores ou de sítios de ligação ribossômica.

[030] Nesse contexto, entende-se que o DNA significa qualquer sequência de DNA que é estranha ao gene (e não ao organismo), isto é, as sequências de DNA endógeno também podem funcionar como DNA estranho nesse contexto. Nesse contexto, o gene é particularmente, de preferência interrompido por inserção de um gene de marcador de seleção; o DNA estranho, portanto, é um gene de marcador de seleção, em que a inserção preferencialmente ocorreu por recombinação homóloga no locus do gene.

[031] As células alternativamente preferenciais de acordo com a invenção são caracterizadas pela diminuição na atividade enzimática são alcançadas por um silenciamento de gene alvejado, transcricional ou pós transcricional do gene que

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7/54 codifica a enzima Ε_Ί, especialmente com o auxílio de pelo menos uma ligação de repressor ao promotor do que codifica a enzima Ε_Ί, por meio de degradação de mRNA mediada por nonsense (NMD) e interferência de RNA (RNAi), em que RNAi preferencialmente usa metodologia de microRNA (miRNA) ou do método de RNA de pequena interferência (siRNA), por meio do qual o mRNA da enzima Et é degradado.

[032] De acordo com a invenção, é preferencial que Ei seja uma glicose 1desidrogenase de EC 1.1.5.2. Particularmente, as enzimas preferenciais E-ι são selecionadas a partir das enzimas codificadas por um gene de gcd e, ainda, enzimas que têm uma sequência de polipeptídeos na qual até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido são modificados em relação às enzimas codificadas por um gene de gcd por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência das enzimas codificadas por um gene de gcd.

[033] Em particular, as enzimas Ei são selecionadas a partir das enzimas Ei que têm a sequência de polipeptídeos AAN67066.1 ou que têm uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido são modificados em relação a AAN67066.1 por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência AAN67066.1.

[034] As células de acordo com a invenção podem ser procariotas ou eucariotas. As mesmas podem ser células de mamífero (como células humanas), células vegetais ou micro-organismos como leveduras, fungos ou bactérias, em que

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8/54 os microorganismos são particularmente preferenciais e as bactérias e leveduras têm a maior preferência.

[035] Ademais, é vantajoso, de acordo com a invenção, quando a célula de acordo com a invenção é uma célula que, como tipo selvagem, pode produzir polihidroxialcanoatos que têm comprimentos de cadeia do monoalcanoato de Ce a C16. Tais células são, por exemplo, Burkholderia sp., Burkholderia thailandensis, Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas citronellolis, Pseudomonas resinovorans, Comamonas testosteroni, Aeromonas hydrophila, Cupriavidus necator, Alcaligenes latus e Ralstonia eutropha. Nesse contexto, as células preferenciais da invenção são geneticamente modificadas, de modo que, em comparação com o tipo selvagem das mesmas, podem produzir menos poli-hidroxialcanoatos.

[036] Dentro do grupo de bactérias, uma preferência particular é dada, em particular, a Pseudomonasputida, Escherichia colie Burkholderia thailandensis.

[037] As cepas iniciais das células de acordo com a invenção podem ser produtoras de ramnolipídeo naturais, aquelas células que já produzem ramnolipídeos como tipo selvagem, ou células nas quais a produção de ramnolipídeo se tornou possível apenas por tecnologia genética.

[038] Em ambos os casos, as células preferenciais de acordo com a invenção se beneficiam com o dato de que foram geneticamente modificadas de modo que, em comparação com o tipo selvagem das mesmas, têm uma atividade aumentada de pelo menos uma das enzimas selecionadas a partir do grupo E₂, E₃ e E₄, em que a enzima E₂ é com capacidade de catalisar a conversão de 3-hidroxialcanoil-ACP por meio de ácido-ACP 3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico para ácido hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico, em que a enzima E₃ é uma ramnosiltransferase I e é com capacidade de catalisar a conversão de dTDP-ramnose e 3-hidroxialcanoil-3hidroxialcanoato para a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoato, e em que a enzima E₄ é uma ramnosiltransferase II e que pode catalisar a conversão de

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9/54 dTDP-ramnose e a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoato para a-Lramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoato.

[039] A enzima E₂ é preferencialmente selecionada a partir de enzimas que são codificadas por um gene de rhIA e, também, enzimas que têm uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido são modificados em relação às enzimas codificadas por um gene de rhIA por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda têm pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência, 80%, em particular, mais do que 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência das enzimas codificadas por um gene de rhIA.

[040] A enzima E₃ é preferencialmente selecionada a partir de enzimas que são codificadas por um gene de rhlB e, também, enzimas que têm uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido são modificados em relação às enzimas codificadas por um gene de rhlB por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda têm pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência, 80%, em particular, mais do que 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência das enzimas codificadas por um gene de rhlB.

[041] A enzima E₄ é preferencialmente selecionada a partir de enzimas que são codificadas por um gene de rhlC e, também, enzimas que têm uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido são modificados em relação às enzimas codificadas por um gene de rhlC por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda têm pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência, 80%, em particular, mais do que 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência das enzimas codificadas por um gene de rhlC.

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10/54 [042] O que é particularmente preferencial para E₂, E₃ e E₄:

a enzima E₂ é selecionada a partir do grupo que consiste em, pelo menos uma enzima E_2a que tem sequência de polipeptídeos ADP06387.1, ou que tem uma sequência de polipeptídeos na qual até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido são modificados em relação à sequência de referência ADP06387.1 por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência ADP06387.1, em que se entende que a atividade enzimática para uma enzima E_2a significa a habilidade para converter 3-hidroxidecanoil-ACP por meio de ácido-ACP 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico em ácido hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, pelo menos uma enzima E_2b que tem sequência de polipeptídeos AIP29471.1, CBI71021.1, NP_252169.1, ABR81106.1, YP_439272.1, YP_111362.1, YP_110557.1, YP_105231.1, ZP_02461688.1, ZP_02358949.1, ZP_01769192.1, ZP_04893165.1, ZP_02265387.2, ZP_02511781.1, ZP_03456835.1,

ZP_03794633.1, YP_990329.1, ZP-02408727.1, YP_002908243.1, ZP_04884056.1, YP_004348703.1, ZP_04905334.1, ZP_02376540.1, EGC99875.1, ZP_02907621.1, YP-001811696.1, ZP_02466678.1, ZP_02891475.1, YP_776393.1,

YP-002234939.1, YP_001778804.1, YP_371314.1, ZP_04943305.1, YP_623139.1, ZP_02417235.1 ou ZP_04892059.1 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido são modificados em relação ao número de acesso particular supracitado por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem o número de acesso particular supracitado, em que se entende que a atividade enzimática para uma

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11/54 enzima E₂b significa a habiiidade para converter 3-hidroxitetradecanoil-ACP por meio de ácido-ACP 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico em ácido hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, a enzima E₃ é selecionada a partir do grupo que consiste em, pelo menos uma enzima E_3a que tem a sequência de polipeptídeos ADP06388.1, YP_001347032.1, CBI71029.1, YP_002439138.1, CBI71031.1, NP_252168.1, CBI71034.1, CBI71028.1, AAA62129.1 ou ZP_04929750.1 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido são modificados em relação ao número de acesso particular supracitado por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima tem o número de acesso particular supracitado, em que se entende que a atividade enzimática para uma enzima E_3a significa a habilidade de converter dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico em ácido a-L-ramnopiranosil-3hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, pelo menos uma enzima E₃b que tem sequência de polipeptídeos AJY01590.1, ABR84881.1, NP_252168.1, FN601364.1, YP_440074.1,

ZP_05590657.1, ZP_04520374.1, ZP_00438360.2, ZP_00438209.2,

YP-001074761.1, ZP_04811084.1, YP_110558.1, YP_111361.1, ZP_02492857.1, YP-337246.1, YP_001061811.1, YP_105607.1, ZP_02371503.1, ZP_02503962.1, ZP_03456839.1, ZP_02461690.1, ZP_03794634.1, ZP_01769736.1,

ZP_01769308.1, ZP_02358948.1, ZP_02487736.1, ZP_02408758.1,

YP-002234937.1, ZP_02891477.1, YP_001778806.1, YP_623141.1, YP_838721.1, ZP_04943307.1, YP_776391.1, YP_004348704.1, ZP_02907619.1, YP_371316.1,

ZP_02389948.1, YP_001811694.1, YP_002908244.1, ZP_02511808.1,

ZP_02376542.1, EGC99877.1, ZP_02451760.1 ou ZP_02414414.1 ou que tem uma sequência de polipeptídeos na qual até 25%, preferencialmente até 20%,

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12/54 particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido são modificados em relação ao número de acesso particular supracitado por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem o número de acesso particular supracitado, em que se entende que a atividade enzimática para uma enzima E_3b significa a habilidade de converter dTDPramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico em ácido a-Lramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, e a enzima E₄ é selecionada a partir do grupo que consiste em, pelo menos uma enzima E_4a que tem a sequência de polipeptídeos NP_249821.1 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido são modificados em relação à sequência de referência NP_249821.1 por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência NP_249821.1, em que se entende que a atividade enzimática para uma enzima E_4a significa a habilidade de converter dTDP-ramnose e ácido a-L-ramnopiranosil-3hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico em ácido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-Lramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, pelo menos uma enzima E_4b que tem a sequência de polipeptídeos AJY02981.1, FN601387.1, FN601391.1 YP_440071.1, ZP_02375899.1,

ZPJ32466676.1, YP_001075863.1, ZP_02408796.1, YP_335530.1, ZP_01769176.1, YP_105609.1, ZP_01770867.1, ZP_04520873.1, YP_110560.1, YP_001024014.1, ZP_03450125.1, YP_001061813.1, YP_111359.1, ZP_00440994.2, ZP_03456926.1, ZP_02358946.1, ZP_00438001.2, ZP_02461478.1, ZP_02503929.1,

ZP_02511832.1, YP_004348706.1, ZP_04898742.1, YP_002908246.1,

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ZP_02382844.1, EGD05167.1, YP_001778808.1, ΥΡ_001811692.1,

ΥΡ_002234935.1, ΥΡ_371318.1, ΥΡ_623143.1, ΥΡ_776389.1, ΖΡ_02891479.1, ΖΡ_02907617.1, ΖΡ_02417424.1 ou ΖΡ_04898743.1 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido são modificados em relação ao número de acesso particular supracitado por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem o número de acesso supracitado, em que se entende que a atividade enzimática para uma enzima E_4b significa a habilidade de converter dTDP-ramnose e ácido a-Lramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico em ácido a-Lramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3hidroxitetradecanoico.

[043] É claro que as atividades especificamente indicadas acima para as enzimas E_2a a E_4b são apenas uma seleção exemplificativa específica de um espectro mais amplo de atividade das enzimas supracitadas; a atividade mencionada em cada caso é aquela para a qual um método de medição confiável está disponível para uma dada enzima. Portanto, é claro que uma enzima que converte um substrato que tem um radical de C₁₀-alquila saturada e não ramificado, igualmente, irá converter - embora, possivelmente com atividade reduzida - aqueles substratos que têm um radical de C₆-alquila ou Ci₆-alquila, que também podem possivelmente ser ramificados ou insaturados.

[044] As células preferenciais de acordo com a invenção são capazes, como tipo selvagem, de não produzir quantidades ou produzir quantidades não detectáveis de ramnolipídeos e, ademais, preferencialmente, como tipo selvagem, não têm atividade ou têm atividade não detectável das enzimas E₂, E₃ e E₄.

[045] De acordo com a invenção, é dada a preferência às células que têm atividades aumentadas das seguintes combinações de enzima:

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E₂, E3, E4, E₂E₃, E2E4, E3E4 e E₂EsE4, das quais a combinação

E₃, E3E4 e E₂E₃E₄, em particular E₂E₃E₄ é particularmente preferencial.

[046] Em uma modalidade preferencial da célula de acordo com a invenção que tem uma atividade aumentada da combinação enzimática E₂E₃E₄, n é preferencialmente = 1.

[047] No contexto da presente invenção, 0 termo “atividade aumentada de uma enzima” deve ser entendido preferencialmente de modo a significar uma atividade intracelular aumentada.

[048] Em princípio, um aumento na atividade enzimática pode ser alcançado aumentando-se 0 número de cópias da sequência (ou sequências) genética que codificam para a enzima, com 0 uso de um promotor forte ou um sítio de ligação ribossômica aprimorado, atenuando-se a regulação negativa de expressão de gene, por exemplo, com 0 uso de reguladores de transcrição, ou intensificando-se a regulação positiva de expressão de gene, por exemplo, com 0 uso de reguladores de transcrição, alterando-se 0 uso de códon do gene, aumentando-se, de várias formas, a meia vida do mRNA ou da enzima, modificando-se a regulação da expressão do gene ou com 0 uso de um gene ou alelo que codifica para uma enzima correspondente com atividade aumentada e combinando-se essas medidas como for adequado. O aumento na atividade é preferencialmente aumentado de acordo com a invenção aumentando-se 0 número de cópias da sequência genética que codifica para enzima em comparação com 0 tipo selvagem. A incorporação de uma cópia de uma sequência genética, que não estava presente anteriormente no tipo selvagem, corresponde de modo autoevidente a um aumento no número de cópias de 0 a 1.

[049] As células geneticamente modificadas de acordo com a invenção são geradas, por exemplo, através de transformação, transdução, conjugação ou uma combinação desses métodos, com um vetor que contém 0 gene desejado, um alelo desse gene ou partes do mesmo e opcionalmente um promotor que possibilita que 0

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15/54 gene seja expressado. A expressão heteróloga é alcançada, em particular, integrando-se o gene ou alelos no cromossomo da célula ou um vetor de replicação de modo extracromossômico.

[050] Uma visão geral das opções para aumentar a atividade enzimática em células é dada para piruvato carboxilase a título de exemplo no documento DE-A100 31 999, que é aqui incorporado a título de referência e cuja revelação forma parte da revelação da presente invenção em relação às opções para aumentar a atividade enzimática em células.

[051] A expressão das enzimas ou genes especificados acima e todas as enzimas ou genes especificados abaixo é detectável com o auxílio de separação de gel de proteína de 1 dimensão e 2 dimensões e a identificação óptica subsequente da concentração de proteína no gel com o uso de software de avaliação adequada. Se o aumento em uma atividade enzimática for baseado exclusivamente em um aumento na expressão do gene correspondente, o aumento na dita atividade enzimática pode ser quantificado de uma maneira simples comparando-se as separações de proteína de 1 dimensão ou 2 dimensões entre a célula de tipo selvagem e geneticamente modificada. Um método costumeiro para preparar géis de proteína no caso de bactérias corineformes e para identificar as ditas proteínas é o procedimento descrito por Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001)). A concentração de proteína, de modo semelhante, pode ser analisada por hibridização de Western blot com o uso de um anticorpo específico para que a proteína seja detectada (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2^â Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. EUA, 1989) e avaliação óptica subsequente com o uso de software adequado para determinação de concentração (Lohaus e Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32 a 39; Lottspeich (1999) Angewandte Chemie 111: 2.630 a 2.647). A atividade de proteínas de ligação de DNA pode ser medida por meio de ensaios de deslocamento de banda de DNA (também chamado de retardação de gel) (Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2.151 a 2.155). O efeito de proteínas de ligação de DNA sobre a

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16/54 expressão de outros genes pode ser detectado por vários métodos de ensaio de gene repórter bem descritos (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2- Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. EUA, 1989). As atividades enzimáticas entracelulares podem ser determinadas por vários métodos descritos (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5.624 a 5.627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2.277 a 2.284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816 a 823). Se nenhum método específico para determinar a atividade de uma enzima particular forem declarados nas explicações abaixo, o aumento na atividade enzimática e, ainda, a diminuição em uma atividade enzimática são preferencialmente determinados por meio dos métodos descritos em Hermann etal., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32 a 39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630 a 2647 (1999) e Wilson etal., Journal of Bacteriology 183: 2.151 a 2.155 (2001).

[052] Se o aumento na atividade enzimática for alcançado por mutação do gene endógeno, tais mutações podem ser geradas de uma maneira não direcionada de acordo com métodos clássicos, por exemplo, por radiação de UV ou por agentes químicos que causam mutação ou especificamente por meio de métodos de engenharia genética como deleção (ou deleções), inserção (ou inserções) e/ou substituição (ou substituições) de nucleotídeos. As células modificadas são obtidas por essas mutações. Particularmente, os mutantes preferenciais de enzimas também são particularmente aquelas enzimas que não são mais submetidas à inibição de substrato, produto ou retroalimentação, ou pelo menos, são menos submetidas em comparação com a enzima de tipo selvagem.

[053] Se o aumento na atividade enzimática for alcançado aumentando-se a síntese de uma enzima, o número de cópias dos genes relevantes, por exemplo, é aumentado ou a região reguladora ou promotora ou o sítio de ligação ribossômica, que é localizada a montante do gene estrutural, é mutada. Os cassetes de expressão que são incorporados a montante do gene estrutural têm um efeito similar. Adicionalmente, por meio de promotores induzíveis, é possível aumentar a

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17/54 expressão em qualquer momento desejado. Ademais, entretanto, os chamados intensificadores também podem ser atribuídos ao gene de enzima como sequências reguladoras, que, de modo semelhante, causam a expressão de gene aumentada por meio de interação aprimorada entre a RNA polimerase e o DNA. A expressão também é aprimorada por medidas para prolongar a vida útil do mRNA. Ademais, a atividade enzimática também é intensificada prevenindo-se a degradação da proteína enzimática. No presente documento, os genes ou construtos de gene estão presentes em plasmídeos de diferentes números de cópias ou são integrados no cromossomo e amplificados. Alternativamente, além disso, a superexpressão dos genes relevantes pode ser alcançada por modificação da composição de meio e cultura. As instruções em relação a isso podem ser encontradas por uma pessoa versada na técnica em, entre outros, Martin et al. (Bio/Technology 5, 137 a 146 (1987)), em Guerrero et al. (Gene 138, 35 a 41 (1994)), Tsuchiya e Morinaga (Bio/Technology 6, 428 a 430 (1988)), em Eikmanns et al. (Gene 102, 93 a 98 (1991)), em EP-A-0 472 869, no documento n^a U.S. 4.601.893, em Schwarzer and Pühler (Bio/Technology 9, 84 a 87 (1991)), em Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126 a 132 (1994)), em LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1.001 a 1.007 (1993)), no documento WO-A-96/15246, em Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), no documento JPA-10-229891, em Jensen e Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191 a 195 (1998)) e em manuais conhecidos de genética e biologia molecular. As medidas descritas acima, como as mutações, também resultam em células geneticamente modificadas.

[054] Para aumentar a expressão dos genes particulares, os plasmídeos episomais, por exemplo, são usados. Em princípio, como plasmídeos ou vetores, todas as modalidades disponíveis àqueles versados na técnica para esse propósito são possíveis. Tais plasmídeos e vetores, por exemplo, podem ser inferidos a partir das brochuras de Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech ou Gibco BRL. Os plasmídeos e vetores adicionalmente preferenciais podem ser encontrados

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18/54 em: Glover, D. M. (1985) DNA cloning: a practical approach, Volumes I a III, IRL Press Ltd. , Oxford; Rodríguez, R.L. e Denhardt, D. T (eds) (1988) Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179 a 204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990) Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3 a 7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. e Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2- ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque.

[055] O vetor de plasmídeo que contém o gene a ser amplificado é, então, transferido para a cepa desejada por conjugação ou transformação. O método de conjugação é descrito, por exemplo, em Schãfer et at.. Applied and Environmental Microbiology 60: 756 a 759 (1994). Os métodos para transformação são descritos, por exemplo, em Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356 a 362 (1988), Dunican e Shivnan, Bio/Technology 7: 1.067 a 1.070 (1989) e Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123: 343 a 347 (1994). Após a recombinação homóloga por meio de um evento de cruzamento, a cepa resultante compreende pelo menos duas cópias do gene em questão.

[056] No contexto da presente invenção, o aumento na atividade de uma enzima é alcançado particularmente, de preferência, por um aumento, em comparação com a célula de tipo selvagem, no número de cópias da região que codifica a enzima considerada, especialmente em conjunto com um promotor forte e, no caso de enzimas já presentes no tipo selvagem, com o uso um promotor mais forte em comparação com aquele presente no gente de tipo selvagem.

[057] A expressão “uma atividade aumentada, em comparação com o tipo selvagem da mesma, de uma enzima E_x” usada acima e nas explicações abaixo sempre deve ser preferencialmente entendida de modo a significar uma atividade da enzima particular E_x aumentada por um fator de pelo menos 2, particularmente, de preferência, pelo menos 10, de modo adicionalmente preferencial, pelo menos 100, ainda de modo adicionalmente preferencial, pelo menos 1.000 e, com máxima preferência, pelo menos 10.000. Ademais, a célula de acordo com a invenção que tem uma atividade aumentada, em comparação com o tipo selvagem da mesma, de

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19/54 uma enzima E_x, em particular, também inclui uma célula, cujo tipo selvagem não tem atividade ou pelo menos nenhuma atividade detectável dessa enzima E_x, e que exibe apenas atividade detectável dessa enzima E_x após aumentar a atividade enzimática, por exemplo, por superexpressão. Nesse contexto, o termo superexpressão ou a terminologia aumento na expressão usada nas explicações abaixo também inclui o caso de que uma célula inicial, por exemplo, uma célula de tipo selvagem, não exibe expressão ou pelo menos nenhuma expressão detectável e a síntese detectável da enzima E_x é induzida apenas por métodos recombinantes. [058] As modificações de resíduos de aminoácido de uma dada sequência de polipeptídeos, que não leva a uma alteração significativa nas propriedades e a função do dado polipeptídeo são conhecidas pela pessoa versada na técnica. Portanto, é possível, por exemplo, realizar o intercâmbio de aminoácidos conservados; em que exemplos de tais substituições adequadas de aminoácido são: Ala com Ser; Arg com Lys; Asn com Gin ou His; Asp com Glu; Cys com Ser; Gin com Asn; Glu com Asp; Gly com Pro; His com Asn ou Gin; He com Leu ou Vai; Leu com Met ou Vai; Lys com Arg ou Gin ou Glu; Met com Leu ou He; Phe com Met ou Leu ou Tyr; Ser com Thr; Thr com Ser; Trp com Tyr; Tyr com Trp ou Phe; Va! com lie ou Leu. Também é um fato conhecido que as modificações, em particular na terminação N ou C de um polipeptídeo na forma de, por exemplo, inserções ou deleções de aminoácido frequentemente não têm uma influência significativa sobre a função do polipeptídeo.

[059] A “identidade de aminoácido” em conexão com as enzimas usadas no contexto da invenção é determinada com o auxílio de métodos conhecidos. Em geral, é feito o uso de programas de computador especiais com algoritmos que consideram exigências específicas.

[060] Os métodos preferenciais para determinar a identidade inicialmente geram o maior alinhamento entre as sequências a serem comparadas. Os programas de computador para determinar a identidade incluem, mas sem limitações, o pacote de programa de GCG incluindo

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20/54 [061] GAP (Deveroy, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), página 387), Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicina (Wi), e BLASTP, BLASTN E FASTA (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), páginas 403 a 410). O programa BLAST pode ser obtido a partir do Centro Nacional para Informações de Biotecnologia (National Center For Biotechnology Information (NCBI)) e a partir de outras fontes (BLAST Handbook, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al., acima).

[062] O algoritmo de Smith-Waterman conhecido pode ser usado de modo semelhante para determinar as identidades.

[063] Os parâmetros preferenciais para determinar a “identidade de aminoácido” são, ao usar o program de BLASTP (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), páginas 403 a 410):

Limiar Esperado: 10

Tamanho de palavra: 3

Matriz: BLOSUM62

Custos de Gap:

Ajustes composicionais:

Existência: 11; Extensão: 1

Ajuste de matriz de pontuação composicional condicional [064] Os parâmetros acima são os parâmetros-padrão para comparação de sequência de aminoácidos.

[065] O programa GAP é, de modo semelhante, adequado para uso com os parâmetros acima.

[066] No contexto da presente invenção, uma identidade de 60% de acordo com o algoritmo acima significa 60% de identidade. O mesmo se aplica às identidades superiores.

[067] A atividade de uma enzima pode ser determinada perturbando-se as células que contêm a dita atividade de uma maneira conhecida por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, com o auxílio de uma laminadora de microesfera,

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21/54 uma prensa francesa ou um desintegrador ultrassônico e, então, removendo-se as células intactas, os detritos de célula e auxílios de perturbação, como microesferas de vidro, por exemplo, por 10 minutos de centrifugação a 11.000 x g e 4 °C. Com o uso do extrato bruto livre de célula resultante, então, é possível executar os ensaios de enzima com detecção de LC-ESI-MS subsequente dos produtos. Alternativamente, a enzima pode ser enriquecida ou, de outro modo, purificada à homogeneidade de uma maneira conhecida por uma pessoa versada na técnica através de métodos cromatográficos (como cromatografia de afinidade de ácido níquel-nitrilotriacético, cromatografia de afinidade de estreptavidina, cromatografia de filtração de gel ou cromatografia de troca iônica).

[068] É trivial e mencionado apenas visando a completude que, para determinar uma atividade aumentada ou reduzida em comparação com o tipo selvagem de uma célula, uma cultura de referência de tipo selvagem é usada, a qual foi exposta às mesmas condições que a amostra a ser determinada.

[069] A atividade de uma enzima Et é determinada com o uso de extratos livres de célula com o auxílio do Kit de Ensaio Colorimétrico de Glicose Desidrogenase da Abeam (Art. n^s ab102532) de acordo com as exigências do fabricante.

[070] A atividade da enzima E₂ é determinada com o uso dos extratos brutos livres de célula obtidos como descrito acima, da seguinte forma: Um ensaio padrão contém 100 μΜ de E. coli ACP, 1 mM de β-mercaptoetanol, 200 μΜ de malonilcoenzima A, 40 μΜ de octanoil-coenzima A (para E_2a) ou dodecanoil-coenzima A (para E₂t>), 100 μΜ de NADPH, 2 pg de FabD de E. coli, 2 pg de FabH de Mycobacterium tuberculosis, 1 pg de FabG de E. coli, 0,1 M de tampão de fosfato de sódio, pH 7,0, e 5 pg de enzima E₅ em urn volume final de 120 μΙ. O ACP, βmercaptoetanol e tampão de fosfato de sódio são pré-incubados a 37 °C por 30 min para reduzir o ACP completamente. A reação é iniciada por adição de enzima E₂. As reações são interrompidas com o uso de 2 ml de água que foi acidificada ao pH 2,0 com o uso de HCI e, então, extraídas duas vezes com o uso de 2 ml de de clorofórmio/metanol (2:1 (v:v)). A separação de fase é executada por centrifugação

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22/54 (16.100 g, 5 min, TA). A fase orgânica inferior é removida, totalmente evaporada em uma centrífuga a vácuo, e o sedimento é coletado em 50 μΙ de metanol. Os constituintes não dissolvidos são sedimentados por centrifugação (16.100 g, 5 min, TA) e a amostra analisada por meio de LC-ESI-MS. Os produtos são identificados por análise dos traços de massa correspondentes e dos espectros de MS².

[071] A atividade da enzima E₃ é, então, determinada com o uso dos extratos brutos livres de célula obtidos como descrito acima, da seguinte forma: Um ensaio padrão pode consistir em 185 μ! de 10 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 10 μΙ de 125 mM de dTDP-ramnose e 50 μΙ de extrato bruto de proteína (aproximadamente 1 mg de proteína total) ou proteína purificada em solução (5 pg de proteína purificada). A reação é iniciada pela adição de 10 μΙ de 10 mM de solução etanólica de ácido 3hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico (para E_3a) ou ácido 3-hidroxitetradecanoil-3hidroxitetradecanoico (para E₃t>) e incubada a 30 °C por 1 h com agitação (600 rpm). A reação é, então, misturada por adição com 1 ml de acetona. Os constituintes não dissolvidos são sedimentados por centrifugação (16.100 g, 5 min, TA) e a amostra analisada por meio de LC-ESI-MS. Os produtos são identificados por análise dos traços de massa correspondentes e dos espectros de MS².

[072] A atividade da enzima E₄ é, então, determinada com o uso dos extratos brutos livres de célula obtidos como descrito acima, da seguinte forma: Um ensaio padrão pode consistir em 185 μΙ de 10 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 10 μΙ de 125 mM de dTDP-ramnose e 50 μΙ de extrato bruto de proteína (aproximadamente 1 mg de proteína total) ou proteína purificada em solução (5 pg de proteína purificada). A reação é iniciada pela adição de 10 pl de 10 mM de solução etanólica de ácido a-Lramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico (para E_4a) ou ácido a-Lramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico (para E₄t>) e incubada a 30 °C por 1 h com agitação (600 rpm). A reação é, então, misturada por adição com 1 ml de acetona. Os constituintes não dissolvidos são sedimentados por centrifugação (16.100 g, 5 min, TA) e a amostra analisada por meio de LC-ESI-MS. Os produtos são identificados por análise dos traços de massa correspondentes e

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23/54 dos espectros de MS².

[073] É vantajoso quando, adicionaimente em relação a E-ι, a célula de acordo com a invenção foi geneticamente modificada, de modo que, em comparação com ο tipo selvagem da mesma, tenha atividade aumentada, como fornecido em detalhes abaixo, de pelo menos uma das enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em [074] pelo menos uma enzima E₅, uma dTTP:a-D-glicose-1-fosfato timidililtransferase, EC 2.7.7.24, particularmente selecionada a partir das enzimas codificadas por um gene rmIA ou rfbA ou que tem uma sequência de polipeptídeos na qual até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido das enzimas codificadas por um gene rmIA ou rfbA são modificados por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima codificada por um gene rmIA ou rfbA, em que é entendido que a atividade enzimática para uma enzima E₅ significa a habilidade de converter a-D-glicose 1-fosfato e dTTP em dTDP-glicose, [075] pelo menos uma enzima E₆, uma dTDP-glicose 4,6-hidroliase, EC 4.2.1.46, particularmente selecionada a partir das enzimas codificadas por um gene rmlB ou rfbB ou que tem uma sequência de polipeptídeos na qual até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido das enzimas codificadas por um gene rmlB ou rfbB são modificados por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima codificada por um gene rmlB ou rfbB, em que é entendido que a atividade enzimática para uma enzima E₆ significa a habilidade de converter dTDPglicose em dTDP-4-desidro-6-desoxi-D-glicose, [076] pelo menos uma enzima E₇, uma dTDP-4-desidrorramnose 3,5

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24/54 epimerase, EC 5.1.3.13, particularmente selecionada a partir das enzimas codificadas por um gene rmlC ou rfbC ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido das enzimas codificadas por um gene rmlC ou rfbC são modificados por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima codificada por um gene rmlC ou rfbC, em que se entende que a atividade enzimática para uma enzima E₇ significa a habilidade de converter dTDP-4-desidro-6-desoxi-D-glicose em dTDP-4-desidro-6desoxi-L-manose e [077] pelo menos uma enzima E₈, uma dTDP-4-desidrorramnose redutase, EC 1.1.1.133, particularmente selecionada a partir das enzimas codificadas por um gene rmlD ou rfbD ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido das enzimas codificadas por um gene rmlD ou rfbD são modificados por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima codificada por um gene rmlD ou rfbD, em que é entendido que a atividade enzimática para uma enzima E₈ significa a habilidade de converter dTDP4-desidro-6-desoxi-L-manose em dTDP-6-desoxi-L-manose.

[078] A atividade da enzima E₅ é determinada com o uso das amostras obtidas como descrito acima para as enzimas E₂ em E₄, incubando-se a-D-glicose 1-fosfato (1,3 mM) com dTTP (5 mM) e 5 pg de enzima purificada E₅ em 50 μΙ de tampão de fosfato de sódio, pH 8,5, e interrompendo-se a reação após 5, 10 e 20 min de incubação a 30 °C por adição de 20 μΙ de clorofórmio. A mistura é, então, submetida a vórtice e centrifugada por 5 min a 16.000 g e temperatura ambiente. A fase aquosa é transferida para um novo tubo de reação e a fase orgânica é re-extraída com o uso

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25/54 de 80 μΙ de água. Ambas as fases aquosas são combinadas e analisadas por HPLC. Isso envolve o uso de coluna de Phenosphere ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) ou uma coluna de Spheresorb ODS2 (250 x 4,6 mm; Waters, Milford, EUA). Os analitos são eluídos com o uso de 0,5 M de KH₂PO₄ (Eluente A) a uma taxa de fluxo de 1 ml min^-1 por 15 min, seguido de um gradiente linear até 80% de Eluente A e 20% de metanol ao longo de um período de 14 min a uma taxa de fluxo de 0,7 ml min^-1. Os analitos que eluem a partir de colunas de ODS2 são, então, injetados em uma coluna de troca iônica de Phenosphere SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) e os analitos são eluídos a uma taxa de fluxo de 1 ml min^-1 e com um gradiente de formato de amônio linear (2 a 600 mM ao longo de 25 min). A dTDP-glicose, então, é quantificada por meio de sua absorção de UV com o uso de um detector de arranjo de fotodíodo (DAD). O máximo de absorção de timidina é 267 nm. A calibração é executada com o uso de açúcares de nucleotídeo autentico (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA).

[079] A atividade da enzima E₆ é, então, determinada com o uso de amostras obtidas como descrito acima para as enzimas E₂ a E₄, incubando-se dTDP-a-Dglicose (1,3 mM) com 5 pg de enzima purificada E₆ em 50 μΙ de tampão de fosfato de sódio, pH 8,5, e interrompendo-se a reação após 5, 10 e 20 min de incubação a 30 °C através da adição de 20 μΙ de clorofórmio. A mistura é, então, submetida a vórtice e centrifugada por 5 min a 16.000 g e temperatura ambiente. A fase aquosa é transferida para um novo tubo de reação e a fase orgânica é re-extraída com o uso de 80 μΙ de água. Ambas as fases aquosas são combinadas e analisadas por HPLC. Isso envolve o uso de coluna de Phenosphere ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) ou uma coluna de Spheresorb ODS2 (250 x 4,6 mm; Waters, Milford, EUA). Os analitos são eluídos com o uso de 0,5 M de KH₂PO₄ (Eluente A) a uma taxa de fluxo de 1 ml min^-1 por 15 min, seguido de um gradiente linear até 80% de Eluente A e 20% de metanol ao longo de um período de 14 min a uma taxa de fluxo de 0,7 ml min^-1. Os analitos que eluem a partir de colunas de ODS2 são, então, injetados em uma coluna de troca iônica de Phenosphere SAX (250 x 4,6 mm;

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Phenomenex, Torrance, EUA) e os analitos são eluídos a uma taxa de fluxo de 1 ml min^-1 e com um gradiente de formato de amônio linear (2 a 600 mM ao longo de 25 min). A dTDP-glicose e dTDP-4-desidro-6-desoxi-D-glicose são, então, quantificadas por meio de sua absorção de UV com o uso de um detector de arranjo de fotodfodo (DAD). O máximo de absorção de timidina é 267 nm. A calibração é executada com o uso de açúcares de nucleotídeo autentico (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA).

[080] A atividade da enzima E₇, então, é determinada com o uso das amostras obtidas como descrito acima para as enzimas E₂ a E₄, incubando-se, primeiro, dTDP-a-D-glicose (1,3 mM) com 5 pg de enzima purificada E₆ em 50 μΙ de tampão de fosfato de sódio, pH 8,5, por 10 min em 30 °C. Em seguida, 0,5 pg de enzima purificada E₇ é adicionado, e a reação é interrompida após 5, 10 e 20 min de incubação a 30 °C por adição de 20 μΙ de clorofórmio. A mistura é, então, submetida a vórtice e centrifugada por 5 min a 16.000 g e temperatura ambiente. A fase aquosa é transferida para um novo tubo de reação e a fase orgânica é re-extraída com o uso de 80 μ! de água. Ambas as fases aquosas são combinadas e analisadas por HPLC. Isso envolve o uso de coluna de Phenosphere ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) ou uma coluna de Spheresorb ODS2 (250 x 4,6 mm; Waters, Milford, EUA). Os analitos são eluídos com o uso de 0,5 M de KH₂PO₄ (Eluente A) a uma taxa de fluxo de 1 ml min^-1 por 15 min, seguido de um gradiente linear até 80% de Eluente A e 20% de metanol ao longo de um período de 14 min a uma taxa de fluxo de 0,7 ml min”¹. Os analitos que eluem a partir das colunas de ODS2, então, são injetados em uma coluna de troca iônica de Phenosphere SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) e os analitos são eluídos a uma taxa de fluxo de 1 ml min”¹ e com um gradiente de formato de amônio linear (2 a 600 mM ao longo de 25 min). A dTDP-glicose, dTDP-4-desidro-6-desoxi-D-glicose e dTDP-6-desoxi-Lmanose, então, são quantificadas por meio de sua absorção de UV com o uso de um detector de arranjo de fotodíodo (DAD). O máximo de absorção de timidina é 267 nm. A calibração é executada com o uso de açúcares de nucleotídeo autentico (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA).

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27/54 [081] A atividade da enzima Eg, então, é determinada com o uso das amostras obtidas como descrito acima para as enzimas E₂ a E₄, incubando-se, primeiro, dTDP-a-D-glicose (1,3 mM) com 5 pg de enzima purificada E₆ em 50 pl de tampão de fosfato de sódio, pH 8,5, por 10 min em 30 °C. Em seguida, 5 pg de enzima purificada E₇ e 0,5 pg de enzima purificada Eg e, ainda, NADPH (10 mM) são adicionados, e a reação é interrompida após 5, 10 e 20 min de incubação a 30 °C por adição de 20 pl de clorofórmio. A mistura é, então, submetida a vórtice e centrifugada por 5 min a 16.000 g e temperatura ambiente. A fase aquosa é transferida para um novo tubo de reação e a fase orgânica é re-extraída com o uso de 80 pl de água. Ambas as fases aquosas são combinadas e analisadas por HPLC. Isso envolve o uso de coluna de Phenosphere ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) ou uma coluna de Spheresorb ODS2 (250 x 4,6 mm; Waters, Milford, EUA). Os analitos são eluídos com o uso de 0,5 M de KH₂PO₄ (Eluente A) a uma taxa de fluxo de 1 ml min^-1 por 15 min, seguido de um gradiente linear até 80% de Eluente A e 20% de metanol ao longo de um período de 14 min a uma taxa de fluxo de 0,7 ml min^-1. Os analitos que eluem a partir das colunas de ODS2, então, são injetados em uma coluna de troca iônica de Phenosphere SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) e os analitos são eluídos a uma taxa de fluxo de 1 ml min^-1 e com um gradiente de formato de amônio linear (2 a 600 mM ao longo de 25 min). A dTDP-glicose, dTDP-4-desidro-6-desoxi-D-glicose, dTDP-6-desoxi-L-manose e dTDP-4-desidro-6-desoxi-L-manose, então, são quantificadas por meio de sua absorção de UV com o uso de um detector de arranjo de fotodíodo (DAD). O máximo de absorção de timidina é 267 nm. A calibração é executada com o uso de açúcares de nucleotídeo autentico (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA).

[082] De acordo com a invenção, é dada a preferência às células que têm atividades aumentadas das seguintes combinações de enzima:

EgEg, E5E7, EgEg, EgE₇, EgEg, E₇Eg, EgEgE₇, EgEgEg, EgE₇Eg, EgE₇Eg, e₅e₆e₇e₈, das quais a combinação

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E₅E₆E₇E₈ é particularmente preferencial.

[083] Particularmente, de preferência, as atividades aumentadas das combinações de enzima supracitadas podem ser combinadas com aquelas das enzimas E₂ a E₄ descritas acima, em que a combinação [084] E₂E₃E₄E₅E₆E₇E₈ [085] é particularmente preferencial.

[086] É adicionalmente vantajoso e, portanto, preferencial quando, adicionalmente, em relação à E_1? a célula de acordo com a invenção foi geneticamente modificada, de modo que, em comparação com o tipo selvagem da mesma, tenha uma atividade aumentada de pelo menos uma enzima E₉, que é um transportador de glicose. Particularmente, de preferência, é feito uso, no presente documento, de transportadores de glicose que são estranhos à célula de acordo com a invenção, portanto, aqueles que não estão presentes no genoma de tipo selvagem.

[087] As enzimas preferenciais E₉ são particularmente selecionadas a partir das enzimas codificadas por um gene galP, glf, iolT1, glcP, gluP, SemiSWEET ou glcU e sistemas de PTS (consistindo nos componentes enzima I, HPr, enzima HA, enzima IIB e enzima IIC, em que é possível que as enzimas HA, IIB e IIC estejam presentes como proteínas de fusão) ou enzimas que têm uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido das enzimas codificadas por gene galP, glf, iolT1, glcP, gluP, SemiSWEET ou glcU e sistemas de PTS são modificados por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima codificada por gene galP, glf, iolT1, glcP, gluP, SemiSWEET ou glcU e sistema de PTS, em que se entende que a atividade enzimática para uma enzima E₉ significa a habilidade de colocar 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4

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29/54 il)amino)-2-desoxiglicose (2-NBDG) na célula.

[088] Para as sequências de polipeptídeos supracitadas, o gene ίοΠΊ é especialmente aquele dentre C. glutamicum, o gene glcP é especialmente um a partir de M. smegmatis, S. frigidimarina ou S. amazonensis, o gene gluP é especialmente aquele de B. abortus, o gene SemiSWEET é aquele de L biflexa e o gene glcU é especialmente um a partir de B. subtilis ou S. xilosus.

[089] A atividade da enzima E₉ pode ser determinada com o auxílio do Kit de Enasio com base em Célula de Absorção de Glicose, item n^e 600470 de Cayman Chemicals, especificamente de acordo com as instruções do fabricante datadas em 9 de outubro de 2015.

[090] Em conjunto com a atividade aumentada de pelo menos uma enzima Eg, pode ser vantajoso de acordo com a invenção e, portanto, preferencial quando a célula de acordo com a invenção tem, como tipo selvagem, uma enzima Ei₀, um transportador de glicose de ABC, e é caracterizada por ter sido geneticamente modificada de modo que, em comparação com o tipo selvagem da mesma, tem uma atividade reduzida da enzima E₁₀, que coloca 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4il)amino)-2-desoxiglicose (2-NBDG) na célula. A atividade da enzima Ew pode ser determinada como descrito acima para E₉. É claro para uma pessoa razoável versada na técnica que, para essa finalidade, as células que meramente se diferem na modificação genética diretamente direcionada à diminuição na atividade de E₁₀ são diretamente comparadas uma com a outra para determinar se há uma diferença na atividade.

[091] Particularmente, de preferência, as atividades modificadas das enzimas supracitadas estão nas combinações [092] E₂E₃E₄E₉Eio, EgEgEyEgEgEio s E2E₃E4E5EgE7EgE₉Eio, em que [093] E2E₃E₄E5EgE7EgE₉Eio é particularmente preferencial.

[094] Ademais, é vantajoso, de acordo com a invenção, quando a célula de acordo com a invenção é uma célula que, como tipo selvagem, pode produzir polihidroxialcanoatos que têm comprimentos de cadeia do monoalcanoato de Cg a Cig.

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Tais células, por exemplo, são Burkholderia sp., Burkholderia thailandensis, Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas citronellolis, Pseudomonas resinovorans, Comamonas testosteroni, Aeromonas hydrophila, Cupriavidus necator, Alcaligenes latus e Ralstonia eutropha. Nesse contexto, as células preferenciais da invenção são geneticamente modificadas, de modo que, em comparação com o tipo selvagem das mesmas, podem produzir menos poli-hidroxialcanoatos.

[095] Tais células são, por exemplo, descritas em Ren et al., Journal Applied Microbiology and Biotechnology, junho de 1998, 49(6):743-50 como GPp121, GPp122, GPp123 e GPp124, em Huisman et al., J Biol Chem. 5 de fevereiro de 1991 ;266(4):2191 -8 como GPp104 e em De Eugenio et al., Environ Microbiol. 2010, 12(1):207-21 como KT42C1 e em Ouyang et al. Macromol Biosci. 2007. 7(2):227-33 como KTOY01 e KTOY02.

[096] Tal célula com capacidade de produzir menos poli-hidroxialcanoatos, em comparação com o tipo selvagem da mesma, é, em particular, caracterizada por ter, em comparação com o tipo selvagem da mesma, uma atividade reduzida de pelo menos uma enzima Eu, [097] em que Eu é uma poli-hidroxialcanoato sintase de EC:2.3.1.-, preferencialmente codificada por um gene phaC, especialmente um gene phAd ou phaC2, ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido das enzimas codificadas por um gene phaC, especialmente um gene phAc1 ou phaC2, é modificada por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima codificada por um gene phaC, especialmente um gene phAd ou phaC2, em que se entende que a atividade enzimática para uma enzima Eu significa a habilidade de converter a 3

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31/54 hidroxialcanoil-coenzima A em ácido poli-3-hidroxialcanoico, especialmente a 3hidroxidecanoil-coenzima A em ácido poli-3-hidroxidecanoico.

[098] Particularmente, as enzimas preferenciais Eu são selecionadas a partir das enzimas que têm a sequência de polipeptídeos AAM63407.1 ou AAM63409.1 ou que têm uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido são modificados em relação ao número de acesso particular supracitado por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem o número de acesso particular supracitado.

[099] A atividade da enzima En pode ser determinada de modo espectrofométrico. Após a adição de todos os componentes, a mistura de ensaio contém 108 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 6,0 a 25 °C), 33 mM de gliconato de sódio, 0,22 mM de 2,6-diclorofenolindofenol (sal de sódio), 1,3 mM de metossulfato de fenazina e 0,005% (p/v) de albumina do soro bovino. A mistura de ensaio é equilibrada a 25 °C até que a absorção a 600 nm fique constante. A reação, então, é iniciada por adição de extratos livres de célula que contêm a atividade a ser medida e o declive na absorção é registrado a 600 nm e 25 °C por cerca de 5 minutos. A concentração de 2,6-diclorofenolindofenol é determinada de modo espectrofométrico, presumindo-se um coeficiente de absorção molar de 10 mM’¹ cm' ¹ a 600 nm. Uma atividade enzimática de 1 unidade é definida como a quantidade de enzima que leva à redução de 1,0 pmol de 2,6-diclorofenolindofenol por minuto a 25 °C e pH 6,0.

[0100] É adicionalmente vantajoso e, portanto, preferencial quando, adicionalmente, em relação à E_1; a célula de acordo com a invenção foi geneticamente modificada de modo que, em comparação com o tipo selvagem da mesma, tenha uma atividade reduzida de pelo menos uma enzima E₁₂, que é um gliconato 2-desidrogenase de EC 1.1.1.215.

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32/54 [0101] As enzimas preferenciais Ε_Ί2 são particularmente selecionadas a partir das enzimas codificadas por um gene gad ou que têm uma sequência de polipeptídeos na qual até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido das enzimas codificadas por um gene gad são modificadas por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima codificada por um gene gad, em que se entende que a atividade enzimática para uma enzima E₁₂ significa a habilidade de converter gliconato em 2-desidrogliconato.

[0102] A atividade da enzima Ε_Ί2 pode ser determinada por quantificação da coenzima A (CoA) liberada na polimerização da 3-hidroxidecanoil-coenzima A. A mistura de ensaio contém 2 mM de 3-hidroxidecanoil-CoA, 40 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 7,5), 10 mM de ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB) e 1 mg/ml de albumina do soro bovino. A reação é iniciada por adição de extratos livres de célula que contêm a atividade a ser medida e a absorção é registrada a 412 nm e 30 °C. A concentração de CoA é determinada de modo espectrofométrico, presumindo-se um coeficiente de absorção molar de 13.600 M’¹ cm'¹ a 412 nm. Uma atividade enzimática de 1 unidade é definida como a quantidade de enzima que leva à liberação de 1,0 pmol de CoA por minuto a 30 °C e pH 7,5.

[0103] É adicionalmente vantajoso e, portanto, preferencial quando, adicionalmente, em relação à E_1; a célula de acordo com a invenção tiver sido geneticamente modificada, de modo que, em comparação com o tipo selvagem da mesma, tenha uma atividade aumentada de pelo menos uma enzima Ei₃, que catalisa a exportação de um ramnolipídeo da fórmula gera! (!) a partir da célula para o meio circundante.

[0104] No caso de células reaiizadas de acordo com a invenção, E₁₃ é selecionada a partir do grupo que consiste em enzimas E₁₃ que têm a sequência de polipeptídeos AAG04520.1, AJY02996.1, ZP_05590661.1, YP_439278.1,

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ΥΡ-440069.1, ΖΡ-04969301.1, ΖΡ_04520234.1, ΥΡ_335528.1, ΥΡ_001075859.1, ΥΡ_001061817.1, ΖΡ_02487499.1, ΥΡ_337251.1, ΖΡ_04897712.1, ΖΡ_04810190.1, ΥΡ_990322.1, ΖΡ_02476924.1, ΖΡ_04899735.1, ΖΡ_04893873.1, ΖΡ_02365982.1, ΥΡ_001062909.1, ΥΡ_105611.1, ΖΡ_03794061.1, ΖΡ_03457011.1, ΖΡ_02385401.1, ΖΡ_02370552.1, ΥΡ_105236.1, ΖΡ_04905097.1, ΥΡ_776387.1, ΥΡ_001811690.1, ΥΡ_004348730.1, ΥΡ_004348708.1, ΥΡ_371320.1, ΥΡ_623145.1,

ΥΡ_001778810.1, ΥΡ_002234933.1, CCE52909.1, ΥΡ_002908248.1,

ZPJ34954557.1, ΖΡ_04956038.1, ΖΡ_02408950.1, ΖΡ_02375897.1,

ΖΡ_02389908.1, ΥΡ_439274.1, ΥΡ_001074762.1, ΥΡ_337247.1, ΥΡ_110559.1, ΖΡ_02495927.1, ΥΡ_111360.1, ΥΡ_105608.1, ΖΡ_02487826.1, ΖΡ_02358947.1, ΥΡ_001078605.1, ZPJ30438000.1, ΖΡ_00440993.1, ΖΡ_02477260.1, ΥΡ_371317.1, ΥΡ_001778807.1, ΖΡ_02382843.1, ΥΡ_002234936.1, ΥΡ_623142.1,

ΖΡ_02907618.1, ΖΡ_02891478.1, ΥΡ_776390.1, ΖΡ_04943308.1, ΥΡ_001811693.1, ΖΡ_02503985.1, ΥΡ_004362740.1, ΥΡ_002908245.1, ΥΡ_004348705.1,

ΖΡ_02408798.1, ΖΡ_02417250.1, EGD05166.1, ZPJJ2458677.1, ΖΡ_02465793.1, ΥΡ_001578240.1, ΖΡ_04944344.1, ΥΡ_771932.1, ΖΡ_02889166.1,

ΥΡ_002232614.1, ΖΡ_03574808.1, ΖΡ_02906105.1, ΥΡ_001806764.1,

ΥΡ_619912.1, ,ΥΡ_001117913.1, ΥΡ_106647.1, ΥΡ_001763368.1, ΖΡ_02479535.1, ΖΡ-02461743.1, ΥΡ_560998.1, ΥΡ_331651.1, ΖΡ_04893070.1, ΥΡ_003606714.1, ΖΡ_02503995.1, ΖΡ_06840428.1, ΥΡ_104288.1, ΖΡ_02487849.1, ΖΡ_02353848.1, ΥΡ-367475.1, ΖΡ_02377399.1, ΖΡ_02372143.1, ΥΡ_001897562.1, ΖΡ_02361066.1, ΥΡ_440582.1, ΖΡ_03268453.1, ΑΕΤ90544.1, ΥΡ_003908738.1, ΥΡ_004230049.1, ΖΡ_02885418.1, CDH72316.1, WP_001297013.1, WP_010955775.1,

WP_010955671.1, WP_010955672.1, WP_010955673.1, WP_010952401.1, WP_010952402.1, WP_010952403.1, WP_010952855.1, WP_010954573.1, WP_010954631.1, WP_010954632.1, WP_010954404.1, WP_004575310.1 ou ZP_02511831.1 ou que têm uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, particularmente, de preferência, até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido são modificados em

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34/54 relação ao número de acesso particular supracitado por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10%, preferencialmente 50%, particularmente, de preferência, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem o número de acesso particular supracitado, em que se entende que a atividade enzimática para uma enzima Ε_Ί3 significa a habilidade para exportar um ramnolipídeo da fórmula geral (I) a partir da célula para o meio circundante.

[0105] A atividade da enzima E₁₃,então, pode ser determinada com o uso dos extratos brutos livres de célula obtidos como descrito acima, determinando-se a quantidade da enzima E₁₃ produzida. Isso é baseado na suposição de que mais enzima E_n por unidade de biomassa tem capacidade de exportar mais ramnolipídeo da fórmula geral (I) a partir da célula para o meio circundante. Tal quantificação pode ser executada por detecção imunológica por meio de anticorpos específicos para enzima E₁₃ (consultar Kurien, T. B., Scofield, R. H (Eds.). Protein Blotting and Detection: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology, Volume 536. 1^â Ed., Humana Press. N.Y. EUA, 2009) ou por métodos de espectrometria de massa (consultar Schmidt, A., Kellermann, J. & Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. Proteomics 5, 4 a 15 (2005)).

[0106] Alternativamente, a atividade da enzima E₁₃ também pode ser determinada executando-se ensaios de absorção com o uso de ramnolipídeos identificados de modo radioativo e vesículas tipo dentro-fora produzidas a partir das células de acordo com a invenção. O procedimento geral, por exemplo, é descrito em Nies DH. The cobalt, zinc, and cadmium efflux system CzcABC from Alcaligenes eutrophus functions as a cation-proton antiporter in Escherichia coll.J Bacteriol. 1995, 177(10):2707-12 or Lewinson O, Adler J, Poelarends GJ, Mazurkiewicz P, Driessen AJ, Bibi E. The Escherichia coli multidrug transporter MdfA catalyzes both electrogenic and electroneutral transport reactions.Proc Natl Acad Sci EUA. 18 de fevereiro de 2003;100(4):1667-72.

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35/54 [0107] Particularmente, de preferência, as atividades modificadas das enzimas supracitadas estão nas combinações [0108] E2E3E4E13, E2E3E4E9E-10E13, EgEgEyEgEgE-io E-13 e

E2E3E4E5E6E7E8E9E-10E13, em que [0109] E2E3E4E5E6E7E₈E9EioE₁₃é particularmente preferencial.

[0110] As células de acordo com a invenção podem ser vantajosamente usadas para produzir ramnolipídeos.

[0111] Portanto, a invenção fornece adicionalmente 0 uso de células de acordo com a invenção para produzir compostos da fórmula geral (I).

[0112] A presente invenção fornece adicionalmente um método para produzir ramnolipídeos, especialmente aqueles da fórmula geral (I), [0113] em que [0114] m = 2, 1 ou 0, em particular, 1 ou 0, [0115] n = 1 ou 0, em particular, 1, [0116] R¹ e R² = radical orgânico mutuamente independente, idêntico ou diferente, que tem de 2 a 24, preferencialmente 5 a 13 átomos de carbono, em particular, radical de alquila opcionalmente ramificado, opcionalmente substituído, particularmente, substituído por hidróxi, opcionalmente insaturado, em particular, opcionalmente, monoinsaturado, bi-insaturado ou tri-insaturado, preferencialmente, aqueles selecionados a partir do grupo que consiste em pentenila, heptenila, nonenila, undecenila e tridecenila e (CH₂)o-CH₃ em que 0 = 1 a 23, preferencialmente 4 a 12, [0117] que compreende as etapas de método de [0118] I) colocar a célula de acordo com a invenção em contato com um meio que contém uma fonte de carbono [0119] II) cultivar a célula sob condições que permitem que a célula produza ramnolipídeo a partir da fonte de carbono e [0120] III) isolar opcionalmente os ramnolipídeos produzidos.

[0121] As células geneticamente modificadas de acordo com a invenção podem

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36/54 ser colocadas em contato com o meio de cultura e, assim, cultivadas de uma maneira contínua ou descontínua em um processo por batelada ou em um processo por batelada alimentado ou o processo por batelada alimentado repetido para os propósitos de produzir os produtos supracitados. Também é concebível um processo semicontínuo, como descrito no documento GB-A-1009370. Uma visão geral de métodos de cultivo conhecidos está disponível no manual por Chmiel (“Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik” [Bioprocess technology 1. Introduction to Bioprocess Technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no manual por Storhas (“Bioreaktoren und periphere Einrichtungen” [Bioreactors and Peripheral Devices] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

[0122] O meio de cultura a ser usado precisa satisfazer as demandas das cepas particulares de uma maneira adequada. As descrições de meios de cultura de várias cepas de levedura são, por exemplo, incluídas em “Nonconventional yeast in biotechnology” (Ed. Klaus Wolf, Springer-Verlag Berlin, 1996).

[0123] A fonte de carbono usada pode consistir em carboidratos como, por exemplo, glicose, sacarose, arabinose, xilose, lactose, frutose, maltose, melaços, amido, celulose e hemicelulose, óleos vegetais e animais e gorduras como, por exemplo, óleo de soja, óleo de cártamo, óleo de Arachis, óleo de erva, óleo de jatrofa, gordura de coco, óleo de semente de abóbora, óleo de linhaça, óleo de milho, óleo de semente de papoula, óleo de onagra, óleo de oliva, óleo de palmiste, óleo de palma, óleo de colza, óleo de gergelim, óleo de girassol, óleo de semente de uva, óleo de noz, óleo de gérmen de trigo e gordura de coco, ácidos graxos, como, por exemplo, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido araquidônico, ácido beênico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido gama-linolênico e o éster metílico ou etílico dos mesmos e, ainda, misturas de ácido graxo, monoglicerídeos, diglicerídeos e triglicerídeos contendo os ácidos graxos recém-mencionados, álcoois como, por exemplo, glicerol, etanol e metanol, hidrocarbonetos como metano, gases

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37/54 carbonáceos e misturas de gás, como CO, CO2, gás efluente ou de síntese, aminoácidos como L-glutamato ou L-valina ou ácidos orgânicos como, por exemplo, ácido acético. Essas substâncias podem ser usadas individualmente ou como uma mistura. É dada preferência particular ao uso de carboidratos, especialmente de monossacarídeos, oligossacarídeos ou polissacatídeos como a fonte de carbono, como descrito no documento n^Q U.S. 6.01.494 e n^Q U.S. 6.136.576, e de hidrocarbonetos, especialmente de alcanos, alcenos e alcinos e, ainda, os ácidos monocarboxílicos derivados dos mesmos e os monoglicerídeos, diglicerídeos e triglicerídeos derivados dos ditos ácidos monocarboxílicos, e de glicerol e acetato. É dada um preferência muito particular aos monoglicerídeos, diglicerídeos e triglicerídeos que têm os produtos de esterificação de glicerol com ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido araquidônico, ácido beênico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico e/ou ácido gama-linolênico.

[0124] Uma vantagem principal da presente invenção é que as células de acordo com a invenção podem produzir ramnolipídeos a partir das fontes de carbono mais simples como, por exemplo, glicose, sacarose ou glicerol, 0 que significa que não é necessário fornecer fontes de carbono de cadeia mais longa no meio durante 0 método de acordo com a invenção. Portanto, no caso de disponibilidade insuficiente, é vantajoso que 0 meio na etapa I) do método de acordo com a invenção não contém quantidades ou nenhuma quantidade detectável de ácidos carboxílicos que têm um comprimento de cadeia maior do que seis átomos de carbono ou ésteres ou glicerídeos deriváveis dos mesmos.

[0125] A fonte de nitrogênio usada pode consistir em compostos contendo nitrogênio orgânico como peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, milhocina, refeição de feijão-soja e ureia ou compostos inorgânicos como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio, amônia, hidróxido de amônio ou amônia aquosa. As fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou como uma mistura.

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38/54 [0126] A fonte de fósforo usada pode ser ácido fosfórico, fosfato de di-hidrogênio de potássio ou fosfato de hidrogênio de dipotássio ou os sais contendo sódio correspondentes. Ademais, o meio de cultura deve conter sais de metais como, por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro que são necessários para o crescimento. Por fim, as substâncias de crescimento essencial como os aminoácidos e as vitaminas podem ser usadas em adição às substâncias mencionadas acima. Ademais, os precursores adequados podem ser adicionados ao meio de cultura. Os materiais de partida supracitados podem ser adicionados à cultura na forma de uma única batelada ou ser adequadamente alimentados durante o cultivo.

[0127] Para controlar o pH da cultura, é feito uso adequado de compostos básicos como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa ou compostos ácidos como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. Para controlar a evolução da espuma, é possível usar antiespumantes como, por exemplo, ésteres de poliglicol de ácido graxo. Para manter a estabilidade de plasmídeos, é possível adicionar ao meio substâncias seletivas adequadas como, por exemplo, antibióticos. Para manter as condições aeróbicas, as misturas de gás oxigenoso e oxigênio, por exemplo, ar, são introduzidas na cultura.

[0128] A temperatura da cultura é normalmente mais de 20 °C, preferencialmente mais de 25 °C, e também pode ser mais de 40 °C, uma temperatura de cultivo de 95 °C, particularmente, de preferência, 90 °C e, com máxima preferência, 80 °C vantajosamente não sendo excedido.

[0129] Na etapa III) do método de acordo com a invenção, os ramnolipídeos produzidos pelas células podem ser opcionalmente isolados das células e/ou do meio de cultura, sendo que é possível usar, para os propósitos de isolamento, todos os métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica para isolar substâncias de baixo peso molecular a partir de composições complexas como, por exemplo, filtração, extração, adsorção (cromatografia) ou cristalização.

[0130] Ademais, a fase de produto contém remanescentes de biomassa e várias impurezas, como óleos, ácidos graxos e outros constituintes do meio de cultura. As

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39/54 impurezas são preferencialmente removidas em um processo livre de solvente. Por exemplo, a fase de produto pode ser diluída com água para facilitar o ajuste de pH. A fase de produto e a fase aquosa, então, podem ser homogeneizadas transferindose os ramnolipídeos para uma forma solúvel em água reduzindo-se ou elevando-se o pH por meio de ácidos ou alcalinos. Potencialmente, a solubilização dos ramnolipídeos na fase aquosa pode ser suportada por incubação a temperaturas relativamente altas, por exemplo, a partir de 60 a 90 °C, e mistura constante. Como um resultado da elevação ou do rebaixamento subsequente do pH por meio de alcanlinos ou ácidos, os ramnolipídeos, então, podem ser transferidos para uma forma insolúvel em água novamente e, portanto, podem ser facilmente separados da fase aquosa. A fase de produto, então, pode ser adicionalmente lavada com água uma ou mais vezes para remover impurezas solúveis em água.

[0131] Os resíduos de óleo, por exemplo, podem ser removidos por extração por meio de solventes adequados, vantajosamente por meio de solventes orgânicos. Um alcano como, por exemplo, n-hexano é preferencial como solvente.

[0132] Como uma alternativa ao processo livre de solvente descrito acima, o produto pode ser removido da fase aquosa com o uso de um solvente adequado, por exemplo, um éster como, por exemplo, acetato de etila ou acetato de butila. As etapas de extração indicadas podem ser executadas em qualquer ordem desejada. [0133] No presente documento, os solventes são preferencialmente usados, em particular, solventes orgânicos. O solvente preferencial é n-pentanol. O solvente é removido, por exemplo, por destilação. Em seguida, o produto liofilizado pode ser adicionalmente purificado, por exemplo, por meio de métodos cromatográficos. Os exemplos que podem ser mencionados nesse ponto incluem precipitação com o uso de solventes adequados, extração com o uso de solventes adequados, formação de complexos, por exemplo, por meio de ciclodextrinas ou derivados de ciclodextrina, cristalização, purificação ou isolamento por meio de métodos cromatográficos ou transferência dos ramnolipídeos para derivados facilmente removíveis.

[0134] Um procedimento de isolamento de ramnolipídeo particularmente

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40/54 adequado na etapa de método III) compreende as subetapas de método de [0135] A) transferir os ramnolipídeos para um meio aquoso que tem um pH menor do que 6, [0136] B) colocar o meio em contato com pelo menos um solvente orgânico para obter um sistema de múltiplas fases e remover a fase aquosa, [0137] C) aumentar o pH para um pH de 6 ou maior para obter um sistema orgânico de múltiplas fases, [0138] D) remover uma fase orgânica enriquecida com ramnolipídeo e [0139] E) opcionalmente, purificar adicionalmente o ramnolipídeo.

[0140] Uma descrição detalhada de como executar essa modalidade preferencial da etapa de método III) é fornecida no documento n^s U.S. 20140148588.

[0141] A presente invenção fornece de modo semelhante os ramnolipídeos obteníveis com o uso do método de acordo com a invenção, especialmente, ainda, as misturas de ramnolipídeo descritas acima obteníveis com o uso do método de acordo com a invenção.

[0142] Vantajosamente, os ramnolipídeos e misturas obteníveis com o uso do método de acordo com a invenção podem ser usados em agentes de limpeza, em formulações farmacêuticas ou cosméticas e em formulações de coproteção.

[0143] Portanto, a presente invenção fornece adicionalmente o uso de ramnolipídeos obtidos com o uso do método de acordo com a invenção para produzir formulações farmacêuticas, dermatológicas ou cosméticas, formulações de coproteção e, ainda, produtos de cuidados e agentes de limpeza e concentrados de tensoativos.

[0144] Os exemplos apresentados a seguir descrevem a presente invenção a título de exemplo, sem qualquer intenção de que a invenção, cujo escopo de aplicação está aparente a partir da totalidade da descrição e das reivindicações, seja limitada às modalidades específicas nos exemplos.

[0145] As seguintes figuras são um componente dos exemplos:

[0146] Figura 1: Os rendimentos totais das cepas PP-155 e PP-099 [Aged] em

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41/54 experimentos paralelos (ciclos n^a 1 a 3) e a comparação de valores de média.

EXEMPLOS:

Exemplo 1 (não inventivo): Foi feito uso da cepa BS-PP-155 (P. putida KT2440 Aupp + pACYCAThõ{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa ]{Talk}; clone 1).

[0147] Construção da cepa BS-PP-155 [0148] Para a expressão heteróloga dos genes rhIA, rhlB e rhlC e dos genes rmlB, rmlD, rmIA e rmlC, ambos de P. aeruginosa, o plasm ideo pACYCAThõ{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD} [rhlABÇ_Pa] {Talk} [araC_Ec] {ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk} foi construído. O plasmídeo contém, primeiramente, um operón sintético que consiste nos genes rhIA e rhlB (que codificam uma ramnosiltransferase 1) e rhlC (que codifica uma ramnosiltransferase 2) a partir de P. aeruginosa DSM1128 (SEQ ID No 1) e, em segundo lugar, um operón que consiste nos genes rmlB (que codificam uma dTDP-D-glicose 4,6-desidratase), rmlD (que codifica uma dTDP-4-desidrorramnose redutase), rmIA (que codifica uma glicose-1fosfato timidililtransferase) e rmlC (que codifica uma dTDP-4-desidrorramnose 3,5epimerase) a partir de P. aeruginosa DSM 19880 (SEQ ID No 2). Os genes rhIABC estão sob o controle do promotor de PRh_a induzível por ramnose; os genes rmIBDAC estão sob o controle do promotor de Pbad induzível por arabinose. Situada a jusante das duas estruturas de operón há uma sequência de terminador (rrnB T1T2). Os genes rmIBDAC foram amplificados a partir do DNA genômico de P. aeruginosa DSM19880 e o operón de rhIABC sintético foi obtido por síntese de gene. O cassete de promotor de P^a (SEQ ID No 3) e o cassete de promotor de Pbad (SEQ ID No 4) e, ainda, a sequência de terminador (SEQ ID No 5) foram amplificados a partir de DNA de E. coli genômico. Embora os genes rhIABC sejam exigidos para a síntese de di-ramnolipídeos, os genes rmIBDAC são necessários para a provisão de dTDPL-ramnose ativada.

[0149] O vetor é baseado no plasmídeo pACYC184 (New England Biolabs,

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Frankfurt am Main, Alemanha) e porta uma origem de p15A de replicação para replicação em E. coli e uma origem de pVS1 de replicação para a replicação em P. putida. A origem de pVS1 de replicação foi amplificada a partir do plasmídeo de Pseudomonas, pVS1 (Itoh Y, Watson JM, Haas D, Leisinger T, Plasmid 1984, 11(3), 206-20). A parte de vetor e os fragmentos de DNA foram clonados com o uso de um kit de montagem de DNA in vitro comercialmente disponível (por exemplo, Kit de Clonagem de Amontagem de DNA NEBuilder HiFi, de acordo com as instruções do fabricante (NEB; Frankfurt am Main, Alemanha)). As células beta de E. coli 10 quimicamente competentes (NEB, Frankfurt/Main, Alemanha) foram transformadas de uma maneira conhecida por uma pessoa versada na técnica. A inserção correta dos genes-alvo foi verificada por análise de restrição e a autenticidade das regiões homólogas introduzidas confirmadas por sequenciamento de DNA. O tamanho do plasmídeo resultante pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD} [rhlABC_Pa] {Talk} [araC_Ec] {ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk} (SEQ ID No 6) é 17.337 bp.

[0150] Em seguida, o plasmídeo foi introduzido em P. putida KT2440 Δυρρ. Essa cepa é usada como a cepa inicial para a construção de deleções de gene sem marcador em P. putida (Graf & Altenbuchner, 2011, Applied and Environmental Microbiology, Volume 77, No. 15, 5549-5552, DQI:10.1128/AEM.05055-11). O método é baseado em um sistema de contrasseleção negativo para P. putida, que utiliza a atividade de uracil fosforribosiltransferase e a sensibilidade de P. putida em direção ao antimetabólito, 5-fluorouracila. A deleção do gene upp não tem efeito sobre a biossíntese de ramnolipídeo.

[0151] A transformação de P. putida KT2440 Δυρρ com o vetor pACYCAThô{PrhaSR} [rhaSR_Ec] {PrhaBAD} [rhlABC_Pa] {Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk} foi executada como descrito em Iwasaki et al. (Iwasaki K, Uchiyama H, Yagi O, Kurabayashi, T, Ishizuka K, Takamura Y, Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851 a 854). O DNA de plasmídeo de cada um dentre 10 clones foi isolado e analisado. Uma cepa que porta o plasmídeo foi chamada de P. putida KT2440 Δυρρ pACYCATh5-{PrhaSR} [rhaSR_Ec] {PrhaBAD}

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43/54 [rhlABC_Pa] {Talk}[araC_Ec] {ParaBAD} [rmlBDAC_Pa] {Talk}.

[0152] A produção biotecnológica de tensoativo foi executada no sistema de fermentação paralela de 8 vezes “DASGIP” de Eppendorf.

[0153] Para a fermentação, os reatores de 1 I foram usados. As sondas de pH foram calibradas por meio de uma calibração de dois pontos com soluções de medição de pH 4,0 e pH 7,0. Os reatores foram preenchidos com 300 ml de água e autoclavados por 20 min a 121 °C para assegurar a esterilidade. A água foi removida na manhã seguinte em um banco limpo e substituída por meio de fermentação estéril (autoclavado: 2,2 g/l de (NH₄)₂SO₄, 0,02 g/l de NaCI, 0,4 g/l de MgSO₄ x 7H₂O, 0,04 g/l de CaCI₂ χ 2H₂O, separadamente esterilizados: 2 g/l de KH₂PO₄, 15 g/l de glicose, 10 ml/l de solução de elemento de resquício M12 [filtrada de modo estéril: 0,2 g/l de ZnSO₄ x 7H₂O, 0,1 g/l de MnCI₂ x 4H₂O, 1,5 g/l de citrato de Na₃ x 2H₂O, 0,1 g/l de CuSO₄ x 5H₂O, 0,002 g/l de NiCI₂ x 6H₂O, 0,003 g/l de Na₂Mo0₄ x 2H₂O, 0,03 g/l de H₃BO₃, 1 g/l de FeSO₄ x 7H₂O]). Subsequentemente, as sondas de pO₂ foram calibradas por meio de uma calibração de um ponto (agitador: 600 rpm/areação: 10 sl/h de ar), e as linhas de agente de alimentação de correção e do agente de indução foram limpas por meio de limpeza no local. Para essa finalidade, as mangueiras foram purgadas com 70% de etanol, então, com 1 M de NaOH, então, com água desmineralizada estéril e, por fim, com os meios particulares.

[0154] O uso de 100 μΙ de uma criocultura, a cepa (P. putida KT2440 Aupp + pACYCAThõ{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa ]{Talk} foi primeiramente cultivada de um dia para outro a 30 °C e 200 rpm por aproximadamente 18 h em 25 ml de meio de LB1 (10 g/l de hidrolisado de caseína, 5 g/l de extrato de levedura, 1 g/l de NaCI) em um frasco aletado de 250 ml contendo 50 mg/l de canamicina. Após a medição da densidade óptica da cultura, 50 ml de meio de semeadura estéril (autoclavado: 4,4 g/l de Na₂HPO₄ * 2H₂O, 1,5 g/l de KH₂PO₄, 1 g/l de NH₄CI, 10 g/l de extrato de levedura, separadamente esterilizado: 20 g/l de glicose, 0,2 g/l de MgSO₄ * 7H₂O, 0,006 g/l de FeCI₃, 0,015 g/l de CaCI₂, 1

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44/54 ml/l de solução de elemento de resquício SL6 [filtrado de modo estéril: 0,3 g/l de H3BO3, 0,2 g/l de CoCI₂ x 6H₂O, 0,1 g/l de ZnSO₄ x 7H₂O, 0,03 g/l de MnCI₂ x 4H₂O, 0,01 g/l de CuCI₂ x 2H₂O, 0,03 g/l de Na₂Mo0₄ x 2H₂O, 0,02 g/l de NiCI₂ x 6H₂O]) em um fraco aletado de 500 ml foram inoculados a partir da pré-cultura de LB com 0 uso de um OD₆oo inicial de 0,2 e incubado por aproximadamente 7 h a 30 °C e 200 rpm. A uma densidade óptica de aproximadamente OD₆oo 8, a cultura principal foi inoculada com 0 uso de uma OD₆oo inicial de 0,7.

[0155] Para onocular os reatores com 0 uso de uma densidade óptica de 0,7, aproximadamente 26 ml foram preenchidos em uma seringa de 30 ml e os reatores foram inoculados por meio de uma agulha através de um septo.

[0156] Q seguinte programa padrão foi usado:

regulador de DO	regulador de pH
Predefinido	0%	Predefinido	0 ml/h
P	0,1	P	5
Ti	300 s	Ti	200 s
Min	0%	Min	0 ml/h
Máx	100%	Máx	40 ml/h

N (Rotação)	de	para	XO2 (mistura de gás)	de	para
Cultivo e	0%	40%	Cultivo e	0%	100%
biotransformação	500 rpm	1.500 rpm	biotransformação	21%	21%

F (taxa de fluxo de gás)	de	para
Cultivo e biotransformação	35%	100%
9 sl/h	72 sl/h

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45/54

Roteiro
Ativado por gatilho	31% de DO (1/60 h)
Indução,	3 h após o
ramnose,	início da
arabinose	alimentação
Gatilho de alimentaçã 0	50% de DO
T axa de alimentaçã 0	1,5 [ml/h]

pH foi ajustado de modo unilateral para pH 7,0 com o uso de amônia (12,5%). Durante o cultivo e a biotransformação, o oxigênio dissolvido na cultura foi mantido constante a 30% por meio da velocidade de agitador e taxa de aeração. A fermentação foi executada como uma batelada de alimentação, em que, a partir do início da alimentação, a alimentação com 2,5 g/lh de glicose por meio de uma alimentação de 500 g/l de glicose foi ativada por meio de um pico de DO. A expressão dos genes introduzidos de modo recombinante foi induzida 3 h após o início da alimentação por uma adição automática de 0,2% (p/v) ramnose e 0,2% (p/v) de arabinose. As quantidades necessárias de açúcar de indução são baseadas no volume inicial de fermentação. Para ambos os açúcares, 220 g/l de soluções de estoque foram usados. A produção de tensoativo foi iniciada a partir do tempo de indução. Todos os dados de medição online como pH, DO, CTR, OTR, mas, ainda, as taxas de fluxo e quantidade dos substratos como solução de amônia para ajuste de pH, a alimentação de glicose ou as taxas de fluxo de indutor foram registradas

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46/54 em log pelo sistema de fermentação de DASGIP.

[0157] Para a análise de fermentação, uma seringa de 10 ml foi usada para extrair e descargar 2 ml como pré-ciclo de cada recipiente. Isso foi seguido mais uma vez por 6 ml para a análise real. O conteúdo de ramnolipídeo, glicose concentração e biomassa seca foi determinado. A fermentação foi finalizada após 65 h.

[0158] A concentração de ramnolipídeo foi determinada por meio de HPLC. 100 μΙ da amostra de fermentação foram misturados por adição com 900 μΙ de 70% (v/v) n-propanol em um tube de Eppendorf e agitado a 30 Hz por 1 min em uma laminadora de Retsch. Em seguida, a amostra foi centrifugada a 13.000 rpm por 5 min e o sobrenadante transferido para um tube de Eppendorf fresco. No caso de uma diluição adicional ser necessária, isso é feito com o uso de 55% de n-propanol. Todos os tubos foram fechados rapidamente para evitar a evaporação. As amostras, então, foram transferidas para ampolas de HPLC e armazenadas a - 20 °C até a medição.

[0159] 1 ml de acetona foi carregado em um tubo de reação de 2 ml com o uso de uma pipeta de deslocamento positivo (Combitip) e o tubo de reação imediatamente fechado para minimizar a evaporação. Isso foi seguido pela adição de 1 ml de caldo de cultura. Após ser submetida ao vórtice da mistura de caldo de cultura/acetona, a dita mistura foi centrifugada por 3 min a 13.000 rpm, e 800 μΙ do sobrenadante transferido para uma ampola de HPLC.

[0160] Um detector de difusão de luz evaporativa (Sedex LT-ELSD, Modelo 85LT) foi usado para a detecção e quantificação de ramnolipídeos. A medição real foi realizada com o uso de um Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, Califórnia) e uma coluna de Resolução Rápida Zorbax SB-C8 (4,6 x 150 mm, 3,5 pm, Agilent). O volume de injeção foi 5 μΙ e o tempo de execução do método foi 20 minutos. TFA 0,1% aquoso (ácido trifluoroacético, solução A) e metanol (solução B) foram usados como fase móvel. A temperatura de coluna foi de 40 °C. O ELSD (temperatura de detector de 60 °C) e o DAD (arranjo de diodo, 210 nm) serviram

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47/54 como detectores. O gradiente usado no método foi:

t [minuto s]	% em volume de Solução B	Taxa de fluxo [ml/min]
0,00	70%	1,00
15,00	100%	1,00
15,01	70%	1,00
20,00	70%	1,00

A biomassa seca foi determinada pipetando-se aproximadamente 1 ml da amostra para um tube de Eppendorf pré-pesado e determinando-se o peso inicial. Em seguida, a amostra foi misturada por adição com aproximadamente 1 ml de água de aqueduto, misturada e centrifugada a 13.000 rpm por 5 min. O sobrenadante foi descartado e o tubo de Eppendorf foi grossamente esfregado. 1 ml de água de aqueduto foi adicionada mais uma vez e a ressuspensão foi executada a 30 Hz por 1 min em uma laminadora de Retsch. Em seguida, a centrifugação foi executada a 13.000 rpm por 10 min, o sobrenadante foi descartado, e o tube de Eppendorf, então, foi seco por esfregação, por exemplo com esfregaço de algodão, sem que a biomassa seja tomada a partir do tube de Eppendorf ao mesmo tempo. As amostras foram secas a 105 °C por 48 h e repesadas após o resfriamento. Uma determinação de duplicata foi executada em cada caso.

[0161] O cálculo de biomassa seca, então, foi executado em Excel:

DW _1(χχ) | £

Peso fniaai - Tara i r

A concentração de glicose foi medida com o auxílio de um Roche Cedex Bio HT como especificado pelo fabricante após a centrifugação e filtração estéril de uma amostra de fermentação.

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48/54 [0162] 3 experimentos são executados, cada um paraieio ao Exemplo 2.

[0163] Exemplo 2: Foi feito uso da cepa BS-PP-099 (P. putida KT2440 Δυρρ + AgfcdpACYCAThõ{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa ]{Talk}).

[0164] A construção de um vetor para a deleção do gene de gcd em Pseudomonas putida KT2440 Δυρρ [0165] Um vetor para a deleção do gene de gcd a partir de P. putida KT2440 Δυρρ, que codifica uma glicose desidrogenase, foi preparada por amplificação de PCR de aproximadamente 680 bp a montante e a jusante do gene de gcd.

[0166] Os seguintes iniciadores foram usados para a amplificação das regiões homólogas a montante e a jusante do gene de gcd:

PCR 1: Região a montante de gcd

4*54 5’- GCCGCTTTGGTCCCGGGTTTCAAGCTCAGCGG -3’ (SEQ ID No 7)

4*57 5’- AAGGCGCGATCGCGGGTTAGAAACTGCTCTGG -3’ (SEQ ID No 8)

PCR 2: Região a jusante de gcd

4*56 5’-CCGCGATCGCGCCTTGTGTCGCGTTTC-3' (SEQ ID No 9)

4*55 5'-GCTTGCATGCCTGCAATGCCGTAGGCTTTGACC-3’ (SEQ ID

No 10)

Os seguintes parâmetros foram usados para a PCR:

Desnaturação:	98 °C	30 s
Desnaturação:	98 °C	10s	30x
Recozimentos:	62 °C	12s	30x
Alongamento:	72 °C	22s	30x
Alongamento final:	72 °C	5 min

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Para a amplificação, o Phusion™ High-Fidelity Master Mix da NEB (Frankfurt am Main, Alemanha) foi usado de acordo com as recomendações do fabricante. 50 μΙ de cada uma das reações de PCR foi, então, resolvida em 1% de gel de TAE agarose. A PCR, a eletroforese de gel de agarose, o manchamento de brometo de etidio do DNA e a determinação dos tamanhos de fragmento de PCR foram realizados de uma maneira conhecida por uma pessoa versada na técnica. Os fragmentos de PCR do tamanho esperado (PCR 1,679 bp (SEQ ID No 11); PCR 2, 682 bp, (SEQ ID No 12)) foram amplificados. Os produtos de PCR foram purificados com o uso do “Kit de Purificação de PCR de QIAquick” de Qiagen como especificado pelo fabricante. Com o uso do Kit de Clonagem de Amontagem de DNA NEBuilder HiFi de acordo com as instruções do fabricante (NEB; Frankfurt am Main, Alemanha), os produtos de PCR purificados foram clonados em um vetor de pKOPp cortado por BamHI e Sbfi (SEQ ID No. 13). As células beta de E. coli 10 quimicamente competentes (NEB, Frankfurt/Main, Alemanha) foram transformadas de uma maneira conhecida por uma pessoa versada na técnica. A inserção correta dos genes-alvo foi verificada por análise de restrição e a autenticidade das regiões homólogas introduzidas confirmadas por sequenciamento de DNA. O resultant vetor de knockout foi chamado de pKOPp_gcd (SEQ ID No. 14).

[0167] Construção da cepa BS-PP-099 [0168] A construção da cepa P. putida KT2440 Δυρρ Aged foi executada com o auxílio do plasmídeo pKOPp_gcd e um método descrito em Graf et ai., 2011 (Graf N, Altenbuchner J, Appl. Environ. Micorbiol., 2011, 77(15):5549; DOI:

10.1128/AEM.05055-11). A sequência de DNA após a deleção de gcd ser descrita em SEQ ID No. 15. A transformação de P. putida KT2440 Δυρρ Δgcd com o vetor pACYCATh5-{PrhaSR} [rhaSR_Ec] {PrhaBAD} [rhlABC_Pa] {Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk} foi executada como descrito em Iwasaki et al. (Iwasaki K, Uchiyama H, Yagi O, Kurabayashi, T, Ishizuka K, Takamura Y, Biosci. Biotech. Biochem. 1994, 58(5):851 a 854). Em seguida, as células foram dispostas em placas de ágar de LB suplementadas com canamicina (50 pg/ml). O

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50/54 plasmídeo pACYCATh5-{PrhaSR} [rhaSR_Ec] {PrhaBAD}[rhlABC_Pa] {Talk} [araC_Ec] {ParaBAD} [rmlBDAC_Pa]{Talk} (SEQ ID No. 6) já foi descrito no Exemplo 1. O DNA de plasmídeo de cada um dentre 10 clones foi isolado e analisado por meio de análise de restrição. Uma cepa que porta o plasmídeo foi chamada de P. putida KT2440 Aupp Aged pACYCAThõ{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk} [araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}.

[0169] A realização técnica foi executada como descrito no Exemplo 1.

[0170] 3 experimentos foram executados, cada um paralelo ao Exemplo 1.

[0171] O que foi avaliado foi o rendimento total, determinado como a soma de biomassa mais ramnolipídeo produzidos divididos por glicose usada e consumida.

[0172] Como pode ser visto na Figura 1, uma cepa de P. putida contendo, não apenas rhIA, rhlB e rhlC, mas também, o gene nativo para glicose desidrogenase alcança um rendimento total de 0,258 [(g de biomassa + g de RL)/g de glicose] em média. Comparando-se a cepa com a deleção do gene de gcd alcança um rendimento total de 0,283 [(g de biomassa + g de RL)/g de glicose] em média.

[0173] Exemplo 3: A construção da cepa Pseudomonas aeruginosa PAO1 Aged [0174] A construção da cepa P. aeruginosa PAO1 Aged é executada com o auxílio de um método descrito em Choi & Schweizer (Choi & Schweizer, MBC Microbiology, 2005 5:30, DOI: 10.1186/1471-2180-5-30). O método permite a produção de deleções de gene sem marcador em P. aeruginosa e é baseado em um sistema de contrasseleção negativo (sacB) com o uso de recombinação homóloga e um sistema de recombinação de Flp-FRT para a remoção do marcador sem seleção. A sequência de DNA após a deleção de gcd ser descrita em SEQ ID No. 16. A realização técnica é executada como descrito no Exemplo 1, com a exceção de que todas as etapas de cultivo são executadas em 37 °C.

[0175] 3 experimentos são executados, cada um paralelo à cepa P. aeruginosa

PAO1.

[0176] O que é avaliado é o rendimento total, determinado como a soma de

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51/54 biomassa mais ramnolipídeo produzidos divididos por glicose usada e consumida. A cepa de P. aeruginosa ainda contendo o gene nativo para glicose desidrogenase alcança, em média, um rendimento total inferior [(g de biomassa + g de RL)/g de glicose] comparada com a cepa que tem a deleção do gene de gcd.

[0177] Exemplo 4 (não inventivo): É feito uso da cepa P. putida KT2440 Aupp + pACYCAThõ{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlAB_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{ Talk}; clone 1).

[0178] Construção da cepa:

Para a expressão heteróloga dos genes rhIA e rhlB e dos genes rmlB, rmlD, rmIA e rmlC, ambos de P. aeruginosa, o plasmídeo pACYCAThõ{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD} [rhlAB_Pa] {Talk} [araC_Ec] {ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk} é construído. O plasmídeo contém, primeiramente, um operón consistindo nos genes rhIA e rhlB (que codificam uma ramnosiltransferase 1) de P. aeruginosa DSM1128 (SEQ ID No 17) e, em segundo lugar, um operón que consiste nos genes rmlB (que codificam uma dTDP-D-glicose 4,6-desidratase), rmlD (que codifica uma dTDP-4-desidrorramnose redutase), rmIA (que codifica alguma glicose-1 -fosfato timidililtransferase) e rmlC (codifica uma dTDP-4-desidrorramnose 3,5-epimerase) de P. aeruginosa DSM 19880 (SEQ ID No 2). Os genes rhIAB estão sob o controle do promotor de Ppha induzível por ramnose; os genes rmIBDAC estão sob o controle do promotor de Pbad induzível por arabinose. Situada a jusante das duas estruturas de operón há uma sequência de terminador (rrnB T1T2). Embora os genes rhIAB seja necessários para a síntese of monoramnolipídeos, os genes rmIBDAC são necessários para a provisão de dTDPL-ramnose ativada.

[0179] O vetor é baseado no plasmídeo pACYCAThô{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD} [rhlABC_Pa] {Talk} [araC_Ec] {ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk} (SEQ ID No 6) (consultar o Exemplo 1). Para remover o gene rhlC, o vetor foi cortado como Pad e A/s/l. Além de rhlC, uma seção

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52/54 a montante e a jusante de rhIC também é eliminada pela restrição. Essas regiões faltantes são amplificadas por PCR. O modelo usado é o plasmídeo pACYCAThõ{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD} [rhlABC_Pa] {Talk} [araC_Ec] {ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk} (SEQ ID No 6) (consultar o Exemplo 1). A parte de vetor e ambos os fragmentos de PCR são, então, clonados com o uso de um kit de montagem de DNA in vitro comercialmente disponível (por exemplo, Kit de Clonagem de Amontagem de DNA NEBuilder HiFi, de acordo com as instruções do fabricante (NEB; Frankfurt/Main, Alemanha)). As células beta de E. coli 10 quimicamente competentes (NEB, Frankfurt/Main, Alemanha) são transformadas de uma maneira conhecida por uma pessoa versada na técnica. A inserção correta dos genes-alvo é verificada por análise de restrição e a autenticidade das regiões homólogas introduzidas confirmadas por sequenciamento de DNA. O tamanho do plasmídeo resultante pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD} [rhlAB_Pa] {Talk} [araC_Ec] {ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk} (SEQ ID No 18) é 16.359 bp.

[0180] Em seguida, o plasmídeo é introduzido em P. putida KT2440 Δυρρ. Essa cepa é usada como a cepa inicial para a construção de deleções de gene sem marcador em P. putida (Graf & Altenbuchner, 2011, Applied and Environmental Microbiology, Volume 77, No. 15, 5549-5552, DQI:10.1128/AEM.05055-11). O método é baseado em um sistema de contrasseleção negativo para P. putida, que utiliza a atividade de uracil fosforribosiltransferase e a sensibilidade de P. putida em direção ao antimetabólito, 5-fluorouracila. A deleção do gene upp não tem efeito sobre a biossíntese de ramnolipídeo.

[0181] A transformação de P. putida KT2440 Δυρρ com o vetor pACYCAThô{PrhaSR} [rhaSR_Ec] {PrhaBAD} [rhlAB_Pa] {Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk} é executada como descrito em Iwasaki et al. (Iwasaki K, Uchiyama H, Yagi O, Kurabayashi, T, Ishizuka K, Takamura Y, Biosci. Biotech. Biochem. 1994, 58(5):851 a 854). O DNA de plasmídeo de cada um dentre 10 clones é isolado e analisado. Uma cepa que porta o plasmídeo é chamada de P. putida KT2440 Δυρρ pACYCATh5-{PrhaSR} [rhaSR_Ec] {PrhaBAD}

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53/54 [rhlAB_Pa] {Talk}[araC_Ec] {ParaBAD} [rmlBDAC_Pa] {Talk}.

[0182] Exemplo 5 (da invenção): É feito uso da cepa P. putida KT2440 Aupp Aged + pACYCAThõ{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlAB_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{ Talk}) [0183] Construção da cepa P. putida KT2440 Aupp Aged + pACYCATh5{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlAB_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{ Talk}) [0184] Para construir a cepa P. putida KT2440 Aupp Aged + pACYCATh5{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlAB_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{ Talk}), o plasmídeo pACYCATh5-{PrhaSR} [rhaSR_Ec] {PrhaBAD} [rhlAB_Pa] {Talk}[araC_Ec] {ParaBAD} [rmlBDAC_Pa] {Talk} é introduzido na cepa P. putida KT2440 Aupp Aged. A construção da cepa já foi descrita no Exemplo 2 e o plasmídeo construção no Exemplo 4.

[0185] A transformação é executada como descrito em Iwasaki et al. (Iwasaki K, Uchiyama H, Yagi O, Kurabayashi, T, Ishizuka K, Takamura Y, Biosci. Biotech. Biochem. 1994, 58(5):851 a 854). Em seguida, as células são dispostas em placas de ágar de LB suplementadas com canamicina (50 pg/ml). O DNA de plasmídeo de cada um dentre 10 clones é isolado e analisado por meio de análise de restrição. Uma cepa que porta o plasmídeo é chamada de P. putida KT2440 Dupp Dgcd pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk} [araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}.

[0186] A realização técnica é executada como descrito no Exemplo 1.

[0187] 3 experimentos são executados, cada um paralelo ao Exemplo 4.

[0188] O que é avaliado é o rendimento total, determinado como a soma de biomassa mais ramnolipídeo produzidos divididos por glicose usada e consumida.

[0189] A cepa de P. putida, que, além de rhIA e rhlB, contém o gene nativo para glicose desidrogenase, alcança, em média, um rendimento total inferior [(g de biomassa + g de RL)/g de glicose] em comparação com a cepa com a deleção do

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54/54 gene de gcd.

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Célula com capacidade de realizar pelo menos um ramnolipídeo caracterizada por ter sido geneticamente modificada, de modo que, em comparação com o tipo selvagem da mesma, tenha uma atividade reduzida de pelo menos uma enzima Ei, que catalisa a conversão de D-glicose e quinona para D-glicono-1,5lactona e quinol.
2. 2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ter capacidade de produzir, como ramnolipídeo, um composto da fórmula geral (I),

   

   fórmula geral (I), em que m = 1, n = 1 ou 0, e o radical determinado por meio de R¹ e R² é

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   2/6

   

   derivado de ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3hidroxioctanoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3-hidroxidecenoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidodecenoico, ácido 3hidroxidodecenoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3-hidroxidecenoil-3hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecenoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3hidroxidecanoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidodecenoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3hidroxitetradecenoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3hidroxidodecenoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3hidroxitetradecanoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3hidroxidecanoil-3-hidroxitetradecenoico, ácido 3-hidroxitetradecenoil-3hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3hidroxidodecenoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3hidroxidodecenoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxitetradecanoico, ácido 3hidroxitetradecanoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil-3hidroxitetradecanoico, ácido 3-hidroxi-hexadecanoil-3-hidroxitetradecanoico, ácido 3hidroxitetradecanoil-3-hidroxi-hexadecanoico ou ácido 3-hidroxi-hexadecanoil-3hidroxi-hexadecanoico.
3. 3. Célula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por Ei ser

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   3/6 uma glicose 1 -desidrogenase de EC 1.1.5.2.
4. 4. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por ser selecionada a partir do grupo que consiste em Burkholderia sp., Burkholderia thailandensis, Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas citronellolis, Pseudomonas resinovorans, Comamonas testosteroni, Aeromonas hydrophila, Cupriavidus necator, Alcaligenes latus e Ralstonia eutropha.
5. 5. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por ter sido geneticamente modificada, de modo que, em comparação com o tipo selvagem da mesma, tem uma atividade aumentada de pelo menos uma das enzimas selecionadas a partir do grupo E2, E3 e E4, em que a enzima E2 pode catalisar a conversão de 3-hidroxialcanoil-ACP por meio de ácido-ACP 3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico para ácido hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico, em que a enzima E3 é uma ramnosiltransferase I e tem capacidade de catalisar a conversão de dTDP-ramnose e 3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoato para a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoato, e em que a enzima E4 é uma ramnosiltransferase II e tem capacidade de catalisar a conversão de dTDP-ramnose e a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoil-3hidroxialcanoato para a-L-ramnopiranosil-(1 -2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoil3-hidroxialcanoato.
6. 6. Célula, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por E2, E3 e E4 serem codificados por um gene de rhIA, um gene rhlB e um gene rhlC, respectivamente, ou são enzimas que têm uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, preferencialmente até 20%, em particular, preferencialmente até 15%, em particular até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácido são modificados em relação às enzimas codificadas por um gene rhl por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos

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   10%, preferencialmente 50%, em particular preferencialmente 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem sequência de referência das enzimas codificadas por um gene rhl.
7. 7. Célula, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada por ter atividades aumentadas das seguintes combinações de enzima selecionadas a partir de E3, E3E4 e E2E3E4.
8. 8. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada por, em comparação com 0 tipo selvagem da mesma, ter uma atividade aumentada de pelo menos uma das enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pelo menos uma enzima Es, uma dTTP:a-D-glicose-1-fosfato timidililtransferase de EC 2.7.7.24, pelo menos uma enzima Ee, uma dTDP-glicose 4,6-hidroliase de EC 4.2.1.46, pelo menos uma enzima E7, uma dTDP-4-desidrorramnose 3,5-epimerase de EC 5.1.3.13, pelo menos uma enzima Es, uma dTDP-4-desidrorramnose redutase de EC 1.1.1.133.
9. 9. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por, em comparação com 0 tipo selvagem da mesma, ter uma atividade aumentada de pelo menos uma enzima E13, que catalisa a exportação de um ramnolipídeo a partir da célula para 0 meio circundante, selecionado a partir do grupo que consiste em enzimas que têm a sequência de polipeptídeos AAG04520.1, AJY02996.1, ZP_05590661.1, YP_439278.1, YP_440069.1, ZP_04969301.1, ZP_04520234.1, YP_335528.1, YP_001075859.1, YP_001061817.1,

   ZP-02487499.1, YP_337251.1, ZP_04897712.1, ZP_04810190.1, YP_990322.1, ZP_02476924.1, ZP_04899735.1, ZP_04893873.1, ZP_02365982.1,

   YP-001062909.1, YP_105611.1, ZP_03794061.1, ZP_03457011.1, ZP_02385401.1,

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   ZP-02370552.1, YP_105236.1, ZP_04905097.1, YP_776387.1, ΥΡ_001811690.1, ΥΡ-004348730.1, ΥΡ_004348708.1, ΥΡ_371320.1, ΥΡ_623145.1,

   ΥΡ-001778810.1, ΥΡ_002234933.1, CCE52909.1, ΥΡ_002908248.1,

   ΖΡ_04954557.1, ΖΡ_04956038.1, ΖΡ_02408950.1, ΖΡ_02375897.1,

   ΖΡ-02389908.1, ΥΡ_439274.1, ΥΡ_001074762.1, ΥΡ_337247.1, ΥΡ_110559.1, ΖΡ_02495927.1, ΥΡ_111360.1, ΥΡ_105608.1, ΖΡ_02487826.1, ΖΡ_02358947.1, ΥΡ-001078605.1, ΖΡ_00438000.1, ΖΡ_00440993.1, ΖΡ_02477260.1, ΥΡ_371317.1, ΥΡ-001778807.1, ΖΡ_02382843.1, ΥΡ_002234936.1, ΥΡ_623142.1,

   ΖΡ-02907618.1, ΖΡ-02891478.1, ΥΡ_776390.1, ΖΡ-04943308.1, ΥΡ-001811693.1, ΖΡ-02503985.1, ΥΡ_004362740.1, ΥΡ_002908245.1, ΥΡ_004348705.1,

   ΖΡ-02408798.1, ΖΡ_02417250.1, EGD05166.1, ΖΡ_02458677.1, ΖΡ_02465793.1, ΥΡ-001578240.1, ΖΡ_04944344.1, ΥΡ_771932.1, ΖΡ_02889166.1,

   ΥΡ_002232614.1, ΖΡ_03574808.1, ΖΡ_02906105.1, ΥΡ_001806764.1,

   ΥΡ_619912.1, , ΥΡ-001117913.1, ΥΡ_106647.1, ΥΡ-001763368.1, ΖΡ-02479535.1, ΖΡ_02461743.1, ΥΡ_560998.1, ΥΡ_331651.1, ΖΡ_04893070.1, ΥΡ_003606714.1, ΖΡ-02503995.1, ΖΡ_06840428.1, ΥΡ_104288.1, ΖΡ_02487849.1, ΖΡ_02353848.1, ΥΡ_367475.1, ΖΡ_02377399.1, ΖΡ-02372143.1, ΥΡ-001897562.1, ΖΡ-02361066.1, ΥΡ_440582.1, ΖΡ_03268453.1, ΑΕΤ90544.1, ΥΡ_003908738.1, ΥΡ_004230049.1, ΖΡ-02885418.1 ou ΖΡ_02511831.1 ou que têm uma sequência de polipeptídeos em que até 25% dos resíduos de aminoácido são modificados em relação ao número de acesso particular supracitado por deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos e que ainda tem pelo menos 10% da atividade enzimática da enzima que tem o número de acesso particular supracitado.
10. 10. Método para produzir ramnolipídeos caracterizado por compreender as etapas de método de

    I) colocar uma célula, de acordo com pelo menos das reivindicações 1 a 9, que combina essas medidas como for adequado, em contato com um meio que contém uma fonte de carbono

    II) cultivar a célula sob condições que permitem que a célula produza

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    6/6 ramnolipídeo a partir da fonte de carbono e

    III) isolar opcionalmente os ramnolipídeos produzidos.
11. 11. Uso dos ramnolipídeos obtidos com o uso do método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ser para produzir formulações farmacêuticas, dermatológicas ou cosméticas, formulações de coproteção e, ainda, produtos de cuidados e agentes de limpeza e concentrados de tensoativos.