JP6461078B2 - ラムノリピドを生産するための細胞および方法 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、ラムノリピドを生産するための細胞および核酸ならびにそれらの使用、およびラムノリピドを生産するための方法に関する。
先行技術
界面活性剤は、現在、本質的には石油化学原料を主原料として生産される。再生可能原料系の界面活性剤の使用は、石油化学原料の不足が予見できるためおよび再生可能原料系または生分解性の製品の需要が増大しているため、好適な代替手段である。ラムノリピドは、1個(モノラムノシル脂質)または2個のラムノース基(ジラムノシル脂質)と、1個または2個の3−ヒドロキシ脂肪酸残基とで構成される(Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, pages 3037-51を参照されたい)。それは、界面活性剤として使用するためのあらゆる種類の用途で必要とされる界面活性を有する(Leitermann et al., 2009を参照されたい)。これらの脂質は、現在、さまざまなヒト病原性細菌および動物病原性細菌の野生型単離株、特定的にはシュードモナス属(Pseudomonas)およびバークホルデリア属(Burkholderia)の代表種を用いて、生産される(Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, pages 3037-51を参照されたい)。これらの生産生物が疾患を引き起こし得るという事実により、従来方式で生産されたラムノリピドの顧客満足度は、かなり著しく低減される。さらに、より高い安全性要件も、設備投資の増大および追加の後処理工程の可能性に起因して生産コストに影響を及ぼす。これらの生産生物を利用してある程度高い産物濃度さらには空時収率および/または炭素収率を達成することが可能であるが、これは、単独基質または共基質として植物油の使用を必要とする(Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, pages 3037-51を参照されたい)。しかしながら、植物油は、たとえば、グルコース、スクロース、もしくはポリサッカリド(たとえば、デンプン、セルロース、ヘミセルロースなど)、グリセロール、CO、CO、またはCHなどの他の炭素源と対比して、比較的高価な原料である。さらに、ラムノリピドは、発酵プロセスで激しい起泡を生じやすいという界面活性剤の特性が顕著である。このことは、とくに、親油性基質が利用される場合にあてはまる。この問題は、たとえば、グルコース、スクロース、ポリサッカリド(デンプン、セルロース、ヘミセルロース)、またはグリセロールなどの水溶性基質の使用では、著しく軽減される。最後に、野生型単離株により生産されるラムノリピドの性質には、限られた範囲内で影響を及ぼし得るにすぎない。現在までのところ、これは、もっぱら、プロセス管理の最適化を介して行われる(pH、酸素供給量、培地組成、供給戦略、窒素供給量、温度、基質の選択など)。しかしながら、用途に適合する産物の性質に調整できるように、たとえば、種々のラムノリピド種の比(ラムノースおよび3−ヒドロキシ脂肪酸基の数)または3−ヒドロキシ脂肪酸基の鎖長および飽和度などの産物の特定の性質に非常に特定的な影響を及ぼすことが望ましいであろう。ラムノリピドは、家庭用途、清浄化用途、化粧用途、食品加工用途、医薬用途、植物保護用途、および他の用途で界面活性剤として広範に利用されることになれば、現在利用されている界面活性剤と競合した状態になるのは避けられない。これらは、非常に低コストで、顧客に対して明らかな健康リスクがなく、かつ明確に規定された調整可能な製品仕様で生産可能な大量化学品である。したがって、ラムノリピドもまた、できるかぎり低コストで、顧客に対して健康リスクがなく、かつできるかぎり詳細に規定された性質をもたせて、生産されなければならない。ラムノリピドは、たとえば、グルコースやグリセロールなどの便利な炭素源に基づいて、GRAS生物(generally regarded as save)ですでに生産されているが、これは、この場合、もっぱら、モノラムノシル脂質である(Ochsner et al. Appl. Environ. Microbiol. 1995. 61(9):3503-3506)。一方、Cha et al. in Bioresour Technol. 2008. 99(7):2192-9には、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)由来の遺伝子rhlAおよびrhlBの導入によるP.プチダ(P. putida)におけるダイズ油からのモノラムノシル脂質の生産が記載されている。
したがって、規定された調整可能な性質を有するモノおよびジラムノシル脂質の安価さおよび健康の観点から安全な生産についての必要性が増大している。この調整は、たとえば、個別の酵素活性の供給バランスをとってモノラムノシル脂質の富化を低減することにより、実施可能である。しかしながら、この調整はまた、たとえば、基質特異性に関して、つまり、たとえば、ラムノリピドに組み込まれるヒドロキシ脂肪酸の鎖長に関して、特定の性質を有する酵素を用いることにより、実施可能である。したがって、本発明は、安全な生産宿主を用いて容易に入手可能な炭素源からラムノリピドを生産する可能性を提供するという目的を有する。
発明の説明
驚くべきことに、以下に説明される細胞およびこの細胞を利用した方法が、明示された本発明の目的の解決に寄与することを見いだした。したがって、本発明は、ラムノリピドを生成可能であり、かつ野生型と比較して遺伝子産物rhlA、rhlB、およびrhlCの相同体の遺伝子産物の少なくとも1つの増大された活性を有する細胞に関する。本発明はさらに、生体触媒としての以上に挙げた細胞と単純な炭素源とを用いたラムノリピドの生産方法に関する。
非病原性でありかつ培養が単純である生物を利用可能なことは、本発明の利点である。単独基質または共基質としての油の使用が必要ないことは、さらなる利点である。他の利点は、本発明を利用して、規定された調整可能な性質を有するラムノリピドを生産可能なことである。ジラムノシル脂質を生産可能であることは、本発明の他の利点である。さらなる利点は、活性が増強されていない細胞を用いるよりも高い空時収率および炭素収率でラムノリピドを生産可能なことである。
冒頭に挙げた目的の達成への寄与は、一般式(I)

(式中、
m=2、1、または0、特定的には1または0、
n=1または0、特定的には1、
およびR=互いに独立して2〜24個、好ましくは5〜13個の炭素原子を有する同一または異なる有機基、特定的には、任意選択により分枝状、任意選択により置換型、特定的にはヒドロキシ置換型、任意選択により不飽和、特定的には任意選択によりモノ、ジ、またはトリ不飽和のアルキル基、好ましくは、ペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニル、およびトリデセニル、ならびにo=1〜23、好ましくは4〜12の(CH−CHからなる群から選択されるもの)
で示される少なくとも1種のラムノリピドまたはその塩を生成可能な細胞、好ましくは単離細胞によりなされ、それは、野生型と比較して、酵素E、E、およびEの少なくともの1つの増大された活性を有するように遺伝子改変されたものであり、ここで、酵素Eは、3−ヒドロキシアルカノイル−ACPから3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカン酸−ACPを経由するヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカン酸への変換を触媒可能であり、酵素Eは、ラムノシルトランスフェラーゼIであり、かつdTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートからα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒可能であり、酵素Eは、ラムノシルトランスフェラーゼIIであり、かつdTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートからα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒可能であり、ここで、これらの酵素E、E、およびEは、好ましくは、
ポリペプチド配列の配列番号2を有する酵素E1a、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号2と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号2を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E1a、ただし、酵素E1aの酵素活性は、好ましくは3−ヒドロキシデカノイル−ACPから3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸−ACPを経由するヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号18を有する酵素E1b、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号18と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号18を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E1b、ただし、酵素E1bの酵素活性は、好ましくは3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸−ACPを経由するヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号78を有する酵素E1c、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号78と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号78を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E1c、ただし、酵素E1cの酵素活性は、好ましくは3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸−ACPを経由するヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号80を有する酵素E1d、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号80と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号80を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E1d、ただし、酵素E1dの酵素活性は、好ましくは3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸−ACPを経由するヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号82を有する酵素E1e、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号82と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号82を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E1e、ただし、酵素E1eの酵素活性は、好ましくは3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸−ACPを経由するヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
から選択される少なくとも1種の酵素Eと、
ポリペプチド配列の配列番号4を有する酵素E2a、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号4と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号4を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E2a、ただし、酵素E2aの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号20を有する酵素E2b、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号20と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号20を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E2b、ただし、酵素E2bの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号84を有する酵素E2c、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号84と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号84を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E2c、ただし、酵素E2cの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号86を有する酵素E2d、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号86と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号86を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E2d、ただし、酵素E2dの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号88を有する酵素E2e、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号88と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号88を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E2e、ただし、酵素E2eの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
から選択されるポリペプチド配列を有する少なくとも1種の酵素Eと、
ポリペプチド配列の配列番号6を有する酵素E3a、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号6と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号6を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E3a、ただし、酵素E3aの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号22を有する酵素E3b、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号22と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号22を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E3b、ただし、酵素E3bの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号90を有する酵素E3c、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号90と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号90を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E3c、ただし、酵素E3cの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号92を有する酵素E3d、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号92と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号92を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には92%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E3d、ただし、酵素E3dの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
から選択される少なくとも1種の酵素Eと、
からなる群から選択される。
一般的に概観するには、図1を比較されたい。
細胞の「野生型」とは、本明細書では、ゲノムが進化により自然に形成された状態にある細胞を意味する。この用語は、細胞全体と個別遺伝子との両方に用いられる。したがって、「野生型」という用語は、特定的には、遺伝子配列が少なくとも部分的に組換え法により人為的に改変された細胞や遺伝子を包含しない。「ラムノリピド」という用語は、本発明との関連では、一般式(I)で示される化合物またはその塩を意味するものとみなされる。酵素E1a〜E3bの実際に以上に示された活性が、以上に挙げられた酵素のより広範な活性範囲のうちの特別な例示的選択肢にすぎないことは、明らかであり、挙げられたそれぞれの活性は、信頼性のある測定法が所与の酵素の場合に利用可能なものである。したがって、非分枝状飽和C10−アルキル基を有する基質の酵素が同様に、たとえ任意選択により活性低下を伴ったとしても、任意選択により分枝状または不飽和でもあり得るCまたはC16−アルキル基を含有する基質を変換することは、明らかである。
「酵素の増大された活性」という用語は、好ましくは、増大された細胞内活性を意味するとみなされるものとする。細胞内の酵素活性を増大させるための次に続く実施形態は、酵素E〜Eの活性の増大だけでなく、活性を任意選択により増大可能なすべての後述の酵素に対してもあてはまる。原理的には、酵素活性の増大は、酵素をコードする1種もしくは複数種の遺伝子配列のコピー数を増大させることにより、強力なプロモーターもしくは改良されたリボソーム結合部位を用いることにより、転写レギュレーターなどを用いて遺伝子発現の負の調節を低減するかもしくは遺伝子発現の正の調節を増幅することにより、遺伝子のコドン使用頻度を改変することにより、種々の方法でmRNAもしくは酵素の半減期を増大させることにより、遺伝子の発現の調節を改変することにより、または増大された活性を有する適切な酵素をコードする遺伝子もしくは対立遺伝子を利用することにより、さらには任意選択によりこれらの手段を組み合わせることにより、達成可能である。本発明によれば、遺伝子改変細胞は、たとえば、所望の遺伝子、この遺伝子の対立遺伝子、またはその一部を含有し、かつ任意選択によりその遺伝子の発現を可能になるプロモーターを含有するベクターを用いて、形質転換、形質導入、接合、またはこれら方法の組合せにより、生産される。異種発現は、特定的には、細胞の染色体内へのまたは染色体外で複製するベクター内への遺伝子または対立遺伝子の組込みにより、達成される。独国特許出願公開第10031999号には、ピルビン酸カルボキシラーゼにより例示される細胞内の酵素活性の増大可能性についての一般的概観が与えられており、これは、参考文献として本明細書に組み入れられ、細胞内の酵素活性の増大可能性に関するその開示内容は、本発明の開示の一部を形成するものとする。以上のおよびすべての後述の酵素または遺伝子の発現は、一次元および二次元タンパク質ゲル分離、それに続く適切な解析ソフトウェアを用いたゲル中タンパク質濃度の光学的同定により、検出可能である。酵素活性の増大が、排他的に、対応する遺伝子の発現の増大に基づく場合、酵素活性の増大の定量は、野生型細胞と遺伝子改変細胞との間で一次元または二次元タンパク質分離を比較することにより単純な方式で決定可能である。コリネ型細菌の場合のタンパク質ゲルの調製およびタンパク質の同定のための慣用的方法は、Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001))により記述された手順である。タンパク質濃度は、同様に、検出対象のタンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットハイブリダイゼーション(Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989)およびそれに続く濃度決定に適切なソフトウェアを用いた光学的分析(Lohaus and Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999) Angewandte Chemie 111: 2630-2647)により、分析可能である。DNA結合タンパク質の活性は、DNAバンドシフトアッセイ(ゲル遅延とも呼ばれる)を利用して測定可能である(Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155)。他の遺伝子の発現に及ぼすDNA結合タンパク質の作用は、種々の詳細に記載されたレポーター遺伝子アッセイ法により検出可能である(Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989)。細胞内酵素活性は、種々の記載の方法に従って決定可能である(Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627、Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823)。以下の実施形態で特定の酵素の活性を決定する実用的方法が示されていない場合、酵素活性の増大の決定さらには酵素活性の減少の決定は、好ましくは、Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001)、Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998)、Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999)、およびWilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001)に記載の方法を利用して行われる。酵素活性の増大を内因性遺伝子の突然変異により達成する場合、そのような突然変異は、たとえば、UV照射もしくは突然変異原性化学物質などを用いた従来法によりランダムに行うか、または欠失、挿入、および/もしくはヌクレオチド交換などの遺伝子工学的方法を利用して選択的に行うか、のいずれかである。改変細胞は、これらの突然変異により得られる。酵素のとくに好ましい突然変異体はまた、特定的には、もはやフィードバック阻害性も産物阻害性も基質阻害性もない酵素であるか、またはそうした阻害性が少なくとも野生型酵素と比較して低減された範囲内にある酵素である。酵素活性の増大を酵素合成の増大により達成する場合、対応する遺伝子のコピー数を増大させるか、または構造遺伝子の上流に位置するプロモーターおよび調節領域またはリボソーム結合部位を突然変異させる。構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットも、同様に機能する。そのほかに、誘導性プロモーターを利用して、任意の所望の時点で発現を増大させることが可能である。しかしながら、それに加えて、「エンハンサー」もまた、RNAポリメラーゼとDNAとの間の改良された相互作用を利用して同様に増大された遺伝子発現を引き起こす調節配列として酵素遺伝子に帰属可能である。mRNAの寿命の延長手段の結果として、同様に発現が改良される。さらに、酵素タンパク質の分解の予防により、同様に酵素活性が増大される。遺伝子または遺伝子構築物は、この場合、異なるコピー数を有するプラスミド中に存在するか、または染色体中に組み込まれて増幅される。他の選択肢として、さらに、培地組成および培養管理の改変により、関係する遺伝子の過剰発現を達成することが可能である。当業者であれば、このための方策が、とくに、Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987))に、Guerrero et al. (Genes 138, 35-41 (1994))、Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))に、Eikmanns et al. (Genes 102, 93-98 (1991))に、欧州特許出願公開第0472869号に、米国特許第4,601,893号に、Schwarzer and Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991))に、Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))に、LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))に、国際出願公開第96/15246号に、Malumbres et al. (Genes 134, 15-24 (1993))に、特開平10−229891号に、Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))に、ならびに遺伝学および分子生物学の公知の教科書に、見いだされる。以上に記載の手段は同様に、突然変異のように遺伝子改変細胞をもたらす。たとえば、エピソームプラスミドは、それぞれの遺伝子の発現を増大させるために利用される。好適なプラスミドまたはベクターは、原理的には、当業者がこの目的に利用可能なすべての実施形態である。そのようなプラスミドおよびベクターは、たとえば、Novagen、Promega、New England Biolabs、Clontech、またはGibco BRLの会社のパンフレットから入手可能である。さらなる好ましいプラスミドおよびベクターは、Glover, D. M. (1985) DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd. , Oxford、Rodriguez, R.L. and Denhardt, D. T (eds) (1988) Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham、Goeddel, D. V. (1990) Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7、Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに見いだしうる。次いで、増幅対象の遺伝子を含有するプラスミドベクターは、接合または形質転換により所望の株に変換される。接合方法は、たとえば、Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994)に記載されている。形質転換方法は、たとえば、Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988)、Dunican and Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989)、およびTauch et al., FEMS Microbiology Let-ters 123: 343-347 (1994)に記載されている。「交差」イベントを利用した相同的組換えの後、得られる株は、関係する遺伝子の少なくとも2つのコピーを含有する。
以上でおよび以下の実施形態で用いられる表現の「野生型と比較して増大された酵素Eの活性」とは、常に、好ましくは少なくとも2倍、とくに好ましくは少なくとも10倍、さらに好ましくは少なくとも100倍、それよりさらに好ましくは少なくとも1,000倍、最も好ましくは少なくとも10,000倍に増大されたそれぞれの酵素Eの活性を意味するものとみなされる。さらに、「野生型と比較して増大された酵素Eの活性」を有する本発明に係る細胞はまた、特定的には、野生型がこの酵素Eの活性を含有していないかまたは少なくとも検出可能な活性を含有しておらず、かつたとえば過剰発現により酵素活性を増大させた後にのみ、この酵素Eの検出可能な活性を呈する、細胞を含む。これとの関連では、「過剰発現」という用語または以下の実施形態で用いられる「発現を増大させる」という表現はまた、出発細胞たとえば野生型細胞が発現を有していないかまたは少なくとも検出可能な発現を有しておらず、かつ酵素Eの検出可能な合成が組換え法によってのみ誘導される場合を包含する。
所与のポリペプチドの性質および機能に有意な変化をもたらさない所与のポリペプチド配列のアミノ酸基の変化は、当業者に公知である。したがって、たとえば、「保存アミノ酸」は、相互に交換可能であり、そのような好適なアミノ酸置換の例は、Serに対してAla、Lysに対してArg、GlnまたはHisに対してAsn、Gluに対してAsp、Serに対してCys、Asnに対してGln、Aspに対してGlu、Proに対してGly、AsnまたはGlnに対してHis、LeuまたはValに対してIle、MetまたはValに対してLeu、ArgまたはGlnまたはGluに対してLys、LeuまたはIleに対してMet、MetまたはLeuまたはTyrに対してPhe、Thrに対してSer、Serに対してThr、Tyrに対してTrp、TrpまたはPheに対してTyr、IleまたはLeuに対してValである。たとえばアミノ酸の挿入または欠失の形での、とくにポリペプチドのN末端またはC末端での変化が、多くの場合、ポリペプチドの機能に有意な影響を及ぼさないことは、同様に公知である。
酵素の活性は、当業者に公知のように、たとえば、ボールミル、フレンチプレス、または超音波破砕機を利用して、この活性を含有する細胞を破壊し、続いて、13,000rpmおよび4℃で10分間遠心分離して、細胞、細胞片、および破壊助剤たとえばガラスビーズなどを分離除去することにより、決定可能である。次いで、得られる無細胞粗抽出物を用いて、産物の後続LC−ESI−MS検出による酵素アッセイを行うことが可能である。他の選択肢として、クロマトグラフィー法(たとえば、ニッケル−ニトリロ三酢酸アフィニティークロマトグラフィー、ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィー)により当業者に公知のように酵素を富化することが可能であるか、さもなければ、均一になるまで精製することが可能である。次いで、以上に記載したように得られたサンプルを用いて、酵素Eの活性を次のようにして決定する。標準的アッセイは、120μLの最終体積中に、100μMの大腸菌(E. coli)ACP、1mMのβ−メルカプトエタノール、200μMのマロニル−補酵素A、40μMのオクタノイル−補酵素A(E1a用)、またはドデカノイル−補酵素A(E1b用)、100μMのNADPH、2μgの大腸菌(E. coli)FabD、2μgのマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)FabH、1μgの大腸菌(E. coli)FabG、0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0、および5μgの酵素Eを含有する。ACP、β−メルカプトエタノール、およびリン酸ナトリウム緩衝液を37℃で30分間プレインキュベートしてACPを完全に還元する。酵素Eの添加により反応を開始する。HClでpH2.0に酸性化された2mlの水を用いて反応を停止し、続いて、2mlのクロロホルム/メタノール(2:1(v:v))で2回抽出する。遠心分離(16,100g、5分、RT)により相分離を行う。下側有機相を除去し、真空遠心分離機で完全に蒸発させ、沈降物を50μlのメタノール中に取り込む。不溶分を遠心分離(16,100g、5分、RT)により沈降させ、サンプルをLC−ESI−MSにより分析する。対応する質量トレースおよびMSスペクトルを解析することにより産物の同定を行う。
次いで、以上に記載したように得られたサンプルを用いて、酵素Eの活性を次のように決定する。標準的アッセイは、溶液中の、185μlの10mMトリスHCl(pH7.5)、10μlの125mM dTDP−ラムノース、および50μlのタンパク質粗抽出物(約1mgの全タンパク質)または精製タンパク質(5μgの精製タンパク質)で構成可能である。3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸(E2a用)または3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸(E2b用)の10mMエタノール性溶液10μlの添加により反応を開始し、振盪(600rpm)しながら30℃で1時間インキュベートする。続いて、1mlのアセトンで反応を処理する。不溶分を遠心分離(16,100g、5分、RT)により沈降させ、サンプルをLC−ESI−MSにより分析する。対応する質量トレースおよびMSスペクトルを解析することにより産物の同定を行う。
次いで、以上に記載したように得られたサンプルを用いて、酵素Eの活性を次のように決定する。標準的アッセイは、溶液中の、185μlの10mMトリスHCl(pH7.5)、10μlの125mMのdTDP−ラムノース、および50μlのタンパク質粗抽出物(約1mgの全タンパク質)または精製タンパク質(5μgの精製タンパク質)で構成可能である。α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸(E3a用)またはα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸(E3b用)の10mMエタノール性溶液10μlの添加により反応を開始し、振盪(600rpm)しながら30℃で1時間インキュベートする。続いて、1mlのアセトンで反応を処理する。不溶分を遠心分離(16,100g、5分、RT)により沈降させ、サンプルをLC−ESI−MSにより分析する。対応する質量トレースおよびMSスペクトルを解析することにより産物の同定を行う。
以下の酵素の組合せ:
、E、E、E、E、E、およびE
の増大された活性を有する本発明に係る細胞が好ましく、このうち、組合せ
、E、およびE、特定的にはE
は、とくに好ましい。
酵素の組合せEの増大された活性を有する本発明に係る細胞の好ましい実施形態では、nは、好ましくは=1である。
本発明に係る細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。これらは、哺乳動物細胞(たとえば、ヒト由来細胞など)、植物細胞、または微生物、たとえば、酵母、菌類、もしくは細菌であり得る。中でも、微生物はとくに好ましく、細菌および酵母は最も好ましい。好適な細菌、酵母、または菌類は、特定的には、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) GmbH (DSMZ), Brunswick, Germanyに細菌、酵母、または菌類の株として寄託された細菌、酵母、または菌類である。本発明に好適な細菌は、
http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm、
に列挙された属に属し、本発明に好適な酵母は、
http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm
に列挙された属に属し、本発明に好適な菌類は、
http://www.dsmz.de/species/fungi.htm
に列挙されたものである。
本発明に係る好ましい細胞は、アスペルギルス属(Aspergillus)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、バチルス属(Bacillus)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、パラコッカス属(Paracoccus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、カンジダ属(Candida)、ピキア属(Pichia)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、クルイベロマイセス属(Kluyveromyces)、サッカロマイセス属(Saccharomyces)、エシェリキア属(Escherichia)、ザイモモナス属(Zymomonas)、ヤロウイア属(Yarrowia)、メチロバクテリウム属(Methylobacterium)、ラルストニア属(Ralstonia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、ロドスピリラム属(Rhodospirillum)、ロドバクター属(Rhodobacter)、バークホルデリア属(Burkholderia)、クロストリジウム属(Clostridium)、およびカプリアビダス属(Cupriavidus)のものであり、中でも、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アルカリゲネス・ラタス(Alcaligenes latus)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、バークホルデリア・アンドロポゴニス(Burkholderia andropogonis)、B.ブラシレンシス(B. brasilensis)、B.カレドニカ(B. caledonica)、B.カリベンシス(B. caribensis)、B.カリオフィリ(B. caryophylli)、B.フンゴラム(B. fungorum)、B.グラジオリ(B. gladioli)、B.グラセイ(B. glathei)、B.グルマエ(B. glumae)、B.グラミニス(B. graminis)、B.ホスピタ(B. hospita)、B.クルリエンシス(B. kururiensis)、B.フェナジニウム(B. phenazinium)、B.フィマタム(B. phymatum)、B.フィトファーマンス(B. phytofirmans)、B.プランタリイ(B. plantarii)、B.サッカリ(B. sacchari)、B.シンガポレンシス(B. singaporensis)、B.ソルディディコラ(B. sordidicola)、B.テリコラ(B. terricola)、B.トロピカ(B. tropica)、B.ツベラム(B. tuberum)、B.ウボネンシス(B. ubonensis)、B.ウナマエ(B. unamae)、B.ゼノボランス(B. xenovorans)、B.アンチナ(B. anthina)、B.ピロシニア(B. pyrrocinia)、B.タイランデンシス(B. thailandensis)、カンジダ・ブランキイ(Candida blankii)、カンジダ・ルゴサ(Candida rugosa)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クルベロマイセス・ラクティス(Kluveromyces lactis)、メチロバクテリウム・エクストルクエンス(Methylobacterium extorquens)、パラコッカス・ベルスタス(Paracoccus versutus)、シュードモナス・アルゼンチネンシス(Pseudomonas argentinensis)、P.ボルボリ(P. borbori)、P.シトロネロリス(P. citronellolis)、P.フラベセンス(P. flavescens)、P.メンドシナ(P. mendocina)、P.ニトロレデュセンス(P. nitroreducens)、P.オレオボランス(P. oleovorans)、P.シュードアルカリゲネス(P. pseudoalcaligenes)、P.レジノボランス(P. resinovorans)、P.ストラミネア(P. straminea)、P.オーランティアカ(P. aurantiaca)、P.オーレオファシエンス(P. aureofaciens)、P.クロロラフィス(P. chlororaphis)、P.フラギ(P. fragi)、P.ルンデンシス(P. lundensis)、P.タエトロレンス(P. taetrolens)、P.アンタークティカ(P. antarctica)、P.アゾトフォルマンス(P. azotoformans)、「P.ブラッチフォルダエ(P. blatchfordae)」、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)、P.ブレンネリ(P. brenneri)、P.セドリナ(P. cedrina)、P.コルガタ(P. corrugata)、P.フルオレッセンス(P. fluorescens)、P.ゲッサルディイ(P. gessardii)、P.リバネンシス(P. libanensis)、P.マンデリイ(P. mandelii)、P.マルギナリス(P. marginalis)、P.メディテラネア(P. mediterranea)、P.メリディアナ(P. meridiana)、P.ミグラエ(P. migulae)、P.ムシドレンス(P. mucidolens)、P.オリエンタリス(P. orientalis)、P.パナシス(P. panacis)、P.プロテオリティカ(P. proteolytica)、P.ローデシアエ(P. rhodesiae)、P.シンキサンタ(P. synxantha)、P.チベルバレンシス(P. thivervalensis)、P.トラシイ(P. tolaasii)、P.ベロニイ(P. veronii)、P.デニトリフィカンス(P. denitrificans)、P.ペルツシノゲナ(P. pertucinogena)、P.クレモリコロラタ(P. cremoricolorata)、P.フルバ(P. fulva)、P.モンテイリイ(P. monteilii)、P.モッセリイ(P. mosselii)、P.パラフルバ(P. parafulva)、P.プチダ(P. putida)、P.バレアリカ(P. balearica)、P.スツッツェリ(P. stutzeri)、P.アミグダリ(P. amygdali)、P.アベラナエ(P. avellanae)、P.カリカパパヤエ(P. caricapapayae)、P.チコリー(P. cichorii)、P.コロナファシエンス(P. coronafaciens)、P.フィクセレクタエ(P. ficuserectae)、「P.ヘリアンティ(P. helianthi)」、P.メリアエ(P. meliae)、P.サバスタノイ(P. savastanoi)、P.シリンガエ(P. syringae)、P.トマト(P. tomato)、P.ビリディフラバ(P. viridiflava)、P.アビエタニフィラ(P. abietaniphila)、P.アシドフィラ(P. acidophila)、P.アガリシ(P. agarici)、P.アルカリフィラ(P. alcaliphila)、P.アルカノリティカ(P. alkanolytica)、P.アミロデラモサ(P. amyloderamosa)、P.アスプレニイ(P. asplenii)、P.アゾティフィゲンス(P. azotifigens)、P.カナビナ(P. cannabina)、P.コエノビオス(P. coenobios)、P.コンゲランス(P. congelans)、P.コスタンチニイ(P. costantinii)、P.クルシビアエ(P. cruciviae)、P.デルヒエンシス(P. delhiensis)、P.エクスシビス(P. excibis)、P.エクストレモリエンタリス(P. extremorientalis)、P.フレデリクスベルゲンシス(P. frederiksbergensis)、P.フスコバギナエ(P. fuscovaginae)、P.ゲリディコラ(P. gelidicola)、P.グリモンティイ(P. grimontii)、P.インディカ(P. indica)、P.ジェッセニイ(P. jessenii)、P.ジンジュエンシス(P. jinjuensis)、P.キロネンシス(P. kilonensis)、P.クナックムッシイ(P. knackmussii)、P.コーリエンシス(P. koreensis)、P.リニ(P. lini)、P.ルテア(P. lutea)、P.モラビエンシス(P. moraviensis)、P.オティティディス(P. otitidis)、P.パチャストレラエ(P. pachastrellae)、P.パレロニアナ(P. palleroniana)、P.パパベリス(P. papaveris)、P.ペリ(P. peli)、P.ペロレンス(P. perolens)、P.ポアエ(P. poae)、P.ポハンエンシス(P. pohangensis)、P.サイクロフィラ(P. psychrophila)、P.サイクロトレランス(P. psychrotolerans)、P.ラトニス(P. rathonis)、P.レプティリボラ(P. reptilivora)、P.レシニフィラ(P. resiniphila)、P.リゾスファエラエ(P. rhizosphaerae)、P.ルベッセンス(P. rubescens)、P.サロモニイ(P. salomonii)、P.セギティス(P. segitis)、P.セプティカ(P. septica)、P.シミアエ(P. simiae)、P.スイス(P. suis)、P.サーモトレランス(P. thermotolerans)、P.アエルギノサ(P. aeruginosa)、P.トレマエ(P. tremae)、P.トリビアリス(P. trivialis)、P.ツルビネラエ(P. turbinellae)、P.ツティコリネンシス(P. tuticorinensis)、P.ウムソンゲンシス(P. umsongensis)、P.バンコウベレンシス(P. vancouverensis)、P.ブラノベンシス(P. vranovensis)、P.キサントマリナ(P. xanthomarina)、ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)、ロドスピリラム・ルブラム(Rhodospirillum rubrum)、ロドバクター・スファエロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)(特定的にはシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida))およびザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)およびバークホルデリア・タイランデンシス(Burkholderia thailandensis)は、とくに好ましい。
本発明に係る好ましい細胞は、野生型としてはラムノリピドを形成しないかまたは検出可能量のラムノリピドを形成せず、さらに野生型としては、好ましくは、酵素E、E、およびEの活性を有していないかまたはそれらの検出可能な活性を有していない。
本発明によれば、本発明に係る細胞が、野生型としてC〜C16のモノアルカノエート鎖長を有するポリヒドロキシアルカノエートを形成可能な細胞であれば、有利である。そのような細胞は、たとえば、バークホルデリア属(Burkholderia)の種、バークホルデリア・タイランデンシス(Burkholderia thailandensis)、シュードモナス属(Pseudomonas)の種、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)、シュードモナス・オレオボランス(Pseudomonas oleovorans)、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・シトロネロリス(Pseudomonas citronellolis)、シュードモナス・レジノボランス(Pseudomonas resinovorans)、コマモナス・テストステロニ(Comamonas testosteroni)、アエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、カプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)、アルカリゲネス・ラタス(Alcaligenes latus)、およびラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)である。これとの関連では、本発明に係る好ましい細胞は、その野生型と比較して、より少量のポリヒドロキシアルカノエートを形成可能なように遺伝子改変される。そのような細胞は、たとえば、De Eugenio et al., Environ Microbiol. 2010. 12(1):207-21、およびRehm et al., Appl Environ Microbiol. 2001. 67(7):3102-9に記載されている。野生型と比較してより少量のポリヒドロキシアルカノエートを形成可能なそのような細胞は、特定的には、野生型と比較して少なくとも1種の酵素EまたはE10の低減された活性を有することを特徴とし、
ここで、Eは、ポリヒドロキシアルカン酸シンターゼEC:2.3.1.であり、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号30もしくは配列番号32を有するもの、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号30もしくは配列番号32と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号30もしくは配列番号32を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有するものを表し、ただし、酵素Eの酵素活性は、3−ヒドロキシアルカノイル−補酵素Aからポリ−3−ヒドロキシアルカン酸への変換能力、特定的には、3−ヒドロキシテトラデカノイル−補酵素Aからポリ−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとし、
10は、3−ヒドロキシアルカノイル−ACP:補酵素A転移酵素、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号34もしくは配列番号36を有するもの、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号34もしくは配列番号36と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号34もしくは配列番号36を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有するものを表し、ただし、酵素E10の酵素活性は、3−ヒドロキシアルカノイル−ACPから3−ヒドロキシアルカナノイル−補酵素Aへの変換能力、特定的には、3−ヒドロキシアルカナノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−補酵素Aへの変換能力を意味するとみなされるものとする。
一般的に概観するには、図1を比較されたい。
次いで、酵素E〜Eに対して以上に記載したように得られたサンプルを用いて、最初に、560μlの100mMトリス/HCl、pH7.5と、DMSO中の20μlの35mM DTNBと、20μlの41mM 3−ヒドロキシデカノイル−補酵素Aと、を混合することにより、酵素Eの活性を決定する。続いて、100μlのトリス/HCl、pH7.5中の5μgの精製酵素Eを添加し、続いて、経時的な412nmの吸光度の増大(5,5’−ジチオビス(2−ニトロベンゾエート)(DTNB)を添加してSH基を遊離させることにより引き起こされる)(ΔE/分)を分光光度計で連続的に1分間記録する。
次いで、酵素E〜Eに対して以上に記載したように得られたサンプルを用いて、酵素E10の活性を決定する。標準的アッセイは、200μlの全体積で50mMトリスHCl、pH7.5中に、3mM MgCl、40μMヒドロキシデカノイル−補酵素A、および20μM大腸菌(E. coli)ACPを含有する。50μlのトリス/HCl、pH7.5中の5μgの精製酵素E10の添加により反応を開始し、30℃で1時間インキュベートする。50%(w/v)トリクロロ酢酸および10mg/mlのBSA(30μl)の添加により反応を停止する。5,5’−ジチオビス(2−ニトロベンゾエート)(DTNB)を添加してSH基を遊離させることにより引き起こされる412nmの吸光度の増大を経時的に記録することにより、放出された補酵素Aを分光光度法で決定する。
したがって、用いられる「酵素Eの低減された活性」という表現は、好ましくは少なくとも0.5倍、とくに好ましくは少なくとも0.1倍、さらに好ましくは少なくとも0.01倍、それよりさらに好ましくは少なくとも0.001倍、最も好ましくは少なくとも0.0001倍に低減された活性を意味するものとみなされる。「低減された活性」という表現はまた、検出可能な活性を含まない(「ゼロの活性」)。特定の酵素の活性の低減は、たとえば、選択的突然変異により、または特定の酵素の活性を低減させる当業者に公知の他の手段により、実施可能である。微生物中の酵素活性を低減させる方法は、当業者に公知である。とくに、ここでは分子生物学的技術を取り上げる。当業者であれば、とくにシュードモナス属(Pseudomonas)およびバークホルデリア属(Burkholderia)でのタンパク質発現の改変および低減ならびに酵素活性の付随的低下のための手引き、特定的には、特定遺伝子の中断のための手引きは、たとえば、Dubeau et al. 2009. BMC Microbiology 9:263、Singh & Rohm. Microbiology. 2008. 154:797-809、またはLee et al. FEMS Microbiol Lett. 2009. 297(1):38-48に見いだされる。本発明に係る好ましい細胞は、酵素活性の低減が、前記核酸配列の1つを含む遺伝子の改変により達成されることを特徴とし、この改変は、遺伝子中への外来DNAの挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列中の点突然変異、RNA干渉(siRNA)、アンチセンスRNA、またはその遺伝子にフランキングする調節配列、たとえば、プロモーターやターミネーターなどもしくはリボソーム結合部位の改変(挿入、欠失、もしくは点突然変異)を含む群、好ましくはそれらで構成される群から選択される。外来DNAは、これとの関連では、遺伝子(生物ではない)に対して「外来」である任意のDNA配列を意味するものとみなされる。すなわち、内因性DNA配列もまた、これとの関連では、「外来DNA」として機能し得る。これとの関連では、遺伝子は、選択マーカー遺伝子の挿入により中断されることがとくに好ましく、したがって、外来DNAは、選択マーカー遺伝子であり、好ましくは、挿入は、その遺伝子座での相同的組換えにより行われたものである。
本発明に係る細胞の好ましい実施形態では、関係する細胞は、野生型と比較して低減されたポリヒドロキシアルカノエート合成を有するシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)細胞である。そのような細胞は、たとえば、Ren et al., Journal Applied Microbiology and Biotechnology 1998 Jun, 49(6):743-50にGPp121、GPp122、GPp123、およびGPp124として、Huisman et al., J Biol Chem. 1991 Feb 5; 266(4):2191-8にGPp104として、さらにはDe Eugenio et al., Environ Microbiol. 2010. 12(1):207-21にKT42C1として、およびOuyang et al. Macromol Biosci. 2007. 7(2):227-33にKTOY01およびKTOY02として、記載されており、本発明に係る好ましい細胞である。
本発明に係る細胞が、m=1を有するラムノリピドを形成可能である場合、RおよびRにより定義される基

は、3−ヒドロキシオクタノイル−3−ヒドロキシオクタン酸、3−ヒドロキシオクタノイル−3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシオクタン酸、3−ヒドロキシオクタノイル−3−ヒドロキシデセン酸、3−ヒドロキシデセノイル−3−ヒドロキシオクタン酸、3−ヒドロキシオクタノイル−3−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシドデカノイル−3−ヒドロキシオクタン酸、3−ヒドロキシオクタノイル−3−ヒドロキシドデセン酸、3−ヒドロキシドデセノイル−3−ヒドロキシオクタン酸、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデセン酸、3−ヒドロキシデセノイル−3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシデセノイル−3−ヒドロキシデセン酸、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシドデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシドデセン酸3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシテトラデセン酸、3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシデセン酸、3−ヒドロキシドデセノイル−3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸、3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシテトラデセン酸、3−ヒドロキシテトラデセノイル−3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシドデカノイル−3−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシドデセノイル−3−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシドデカノイル−3−ヒドロキシドデセン酸、3−ヒドロキシドデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸、3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸、3−ヒドロキシヘキサデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸、3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシヘキサデカン酸、または3−ヒドロキシヘキサデカノイル−3−ヒドロキシヘキサデカン酸から誘導されることが好ましい。
当業者であれば、本発明に係る細胞がまた、一般式(I)で示される異なるラムノリピドの混合物を生成可能であることは、明らかである。
これとの関連では、本発明に係る細胞は、一般式(I)で示されるラムノリピドの混合物を生成可能であることが好ましく、特徴として、生成されるラムノリピドの80重量%超、好ましくは90重量%超、とくに好ましくは95重量%超で、nは=1であり、かつRおよびRにより定義される基は、生成されるラムノリピドの10重量%未満、好ましくは5重量%未満、とくに好ましくは2重量%未満で、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシオクタン酸または3−ヒドロキシオクタノイル−3−ヒドロキシデカン酸から誘導され、指定された重量%は、生成される一般式(I)で示されるすべてのラムノリピドの和を基準とする。
本発明に係る細胞が、野生型と比較して、以下のものからなる群から選択される酵素の少なくとも1つのそれぞれの場合に以下に明記される活性が増大されるように、E〜Eに対して追加的に遺伝子改変されたものであれば有利である。
少なくとも1種の酵素E、dTTP:α−D−グルコース−1−リン酸チミジリルトランスフェラーゼ、EC2.7.7.24、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号10を有するもの、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号10と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号10を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有するもの、ただし、酵素Eの酵素活性は、α−D−グルコース−1−リン酸およびdTTPからdTDP−グルコースへの変換能力を意味するとみなされるものとする、
少なくとも1種の酵素E、dTTP−グルコース−4,6−ヒドロリアーゼ、EC4.2.1.46、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号12を有するもの、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号12と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号12を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有するもの、ただし、酵素Eの酵素活性は、dTDP−グルコースからdTDP−4−デヒドロ−6−デオキシ−D−グルコースへの変換能力を意味するとみなされるものとする、
少なくとも1種の酵素E、dTDP−4−デヒドロラムノース−3,5−エピメラーゼ、EC5.1.3.13、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号14を有するもの、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号14と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号14を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有するもの、ただし、酵素Eの酵素活性は、dTDP−4−デヒドロ−6−デオキシ−D−グルコースからdTDP−4−デヒドロ−6−デオキシ−L−マンノースへの変換能力を意味するとみなされるものとする、ならびに
少なくとも1種の酵素E、dTDP−4−デヒドロラムノースレダクターゼ、EC1.1.1.133、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号16を有するもの、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号16と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号16を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有するもの、ただし、酵素Eの酵素活性は、dTDP−4−デヒドロ−6−デオキシ−L−マンノースからdTDP−6−デオキシ−L−マンノースへの変換能力を意味するとみなされるものとする。
酵素Eの活性は、酵素E〜Eに対して以上のように得られたサンプルを用いて、50μlのリン酸ナトリウム緩衝液pH8.5中でdTTP(5mM)および5μgの精製酵素Eと共にα−D−グルコース−1−リン酸(1.3mM)をインキュベートし、30℃で5、10、および20分間インキュベートした後、20μlのクロロホルムを添加して反応を停止することにより、決定される。次いで、混合物を撹拌し、16,000gおよび室温で5分間遠心分離する。水性相を新しい反応容器に移し、有機相を80μlの水で再度抽出する。両方の水性相を合わせ、HPLCにより解析する。ここでは、Phenosphere ODS2カラム(250×4.6mm、Phenomenex, Torrance, USA)またはSpheresorb ODS2カラム(250×4.6mm、Waters, Milford, USA)を使用する。0.5M KHPO(溶出液A)を用いて1ml・分−1の流量で15分間にわたりアナライトの溶出を行い、続いて、80%溶出液Aおよび20%メタノールまでのリニアグラジエントを用いて0.7ml・分−1の流量で14分間にわたり溶出を行う。次いで、ODS2カラムから溶出したアナライトをPhenosphere SAXイオン交換カラム(250×4.6mm、Phenomenex, Torrance, USA)に注入し、1ml・分−1の流量およびアンモニウムホルメートリニアグラジエント(25分間にわたり2から600mMへ)を用いてアナライトを溶出させる。次いで、フォトダイオードアレイ検出器(DAD)を用いてdTDPグルコースの定量をそのUV吸収により行う。チミジンの吸収極大は267nmである。基準ヌクレオチド糖(Sigma-Aldrich, Munich, USA)により検量を行う。
次いで、酵素E〜Eに対して以上のように得られたサンプルを用いて、50μlのリン酸ナトリウム緩衝液pH8.5中で5μgの精製酵素Eと共にdTDP−α−D−グルコース(1.3mM)をインキュベートし、30℃で5、10、および20分間インキュベートした後、20μlのクロロホルムを添加して反応を停止することにより、酵素Eの活性を決定する。次いで、混合物を撹拌し、16,000gおよび室温で5分間遠心分離する。水性相を新しい反応容器に移し、有機相を80μlの水で再度抽出する。両方の水性相を合わせ、HPLCにより解析する。ここでは、Phenosphere ODS2カラム(250×4.6mm、Phenomenex, Torrance, USA)またはSpheresorb ODS2カラム(250×4.6mm、Waters, Milford, USA)を使用する。0.5M KHPO(溶出液A)を用いて1ml・分−1の流量で15分間にわたりアナライトの溶出を行い、続いて、80%溶出液Aおよび20%メタノールまでのリニアグラジエントを用いて0.7ml・分−1の流量で14分間にわたり溶出を行う。次いで、ODS2カラムから溶出したアナライトをPhenosphere SAXイオン交換カラム(250×4.6mm、Phenomenex, Torrance, USA)に注入し、1ml・分−1の流量およびアンモニウムホルメートリニアグラジエント(25分間にわたり2から600mMへ)を用いてアナライトを溶出させる。次いで、フォトダイオードアレイ検出器(DAD)を用いてdTDP−グルコースおよびdTDP−4−デヒドロ−6−デオキシ−D−グルコースの定量をそれらのUV吸収により行う。チミジンの吸収極大は267nmである。基準ヌクレオチド糖(Sigma-Aldrich, Munich, USA)により検量を行う。
次いで、酵素E〜Eに対して以上に記載したように得られたサンプルを用いて、最初に50μlのリン酸ナトリウム緩衝液pH8.5中で5μgの精製酵素Eと共にdTDP−α−Dグルコース(1.3mM)を30℃で10分間インキュベートすることにより、酵素Eの活性を決定する。続いて、0.5μgの精製酵素Eを添加し、30℃で5、10、および20分間インキュベートした後、20μlのクロロホルムの添加により反応を停止する。次いで、混合物を撹拌し、16,000gおよび室温で5分間遠心分離する。水性相を新しい反応容器に移し、有機相を80μlの水で再度抽出する。両方の水性相を合わせ、HPLCにより解析する。ここでは、Phenosphere ODS2カラム(250×4.6mm、Phenomenex, Torrance, USA)またはSpheresorb ODS2カラム(250×4.6mm、Waters, Milford, USA)を使用する。0.5M KHPO(溶出液A)を用いて1ml・分−1の流量で15分間にわたりアナライトの溶出を行い、続いて、80%溶出液Aおよび20%メタノールまでのリニアグラジエントを用いて0.7ml・分−1の流量で14分間にわたり溶出を行う。次いで、ODS2カラムから溶出したアナライトをPhenosphere SAXイオン交換カラム(250×4.6mm、Phenomenex, Torrance, USA)に注入し、1ml・分−1の流量およびアンモニウムホルメートリニアグラジエント(25分間にわたり2から600mMへ)を用いてアナライトを溶出させる。次いで、フォトダイオードアレイ検出器(DAD)を用いて、dTDP−グルコース、dTDP−4−デヒドロ−6−デオキシ−D−グルコース、およびdTDP−6−デオキシ−L−マンノースの定量をそれらのUV吸収により行う。チミジンの吸収極大は267nmである。基準ヌクレオチド糖(Sigma-Aldrich, Munich, USA)により検量を行う。
次いで、酵素E〜Eに対して以上に記載したように得られたサンプルを用いて、最初に50μlのリン酸ナトリウム緩衝液pH8.5中で5μgの精製酵素Eと共にdTDP−α−Dグルコース(1.3mM)を30℃で10分間インキュベートすることにより、酵素Eの活性を決定する。続いて、5μgの精製酵素Eおよび0.5μgの精製酵素EさらにはNADPH(10mM)を添加し、30℃で5、10、および20分間インキュベートした後、20μlのクロロホルムの添加により反応を停止する。次いで、混合物を撹拌し、16,000gおよび室温で5分間遠心分離する。水性相を新しい反応容器に移し、有機相を80μlの水で再度抽出する。両方の水性相を合わせ、HPLCにより解析する。ここでは、Phenosphere ODS2カラム(250×4.6mm、Phenomenex, Torrance, USA)またはSpheresorb ODS2カラム(250×4.6mm、Waters, Milford, USA)を使用する。0.5M KHPO(溶出液A)を用いて1ml・分−1の流量で15分間にわたりアナライトの溶出を行い、続いて、80%溶出液Aおよび20%メタノールまでのリニアグラジエントを用いて0.7ml・分−1の流量で14分間にわたり溶出を行う。次いで、ODS2カラムから溶出したアナライトをPhenosphere SAXイオン交換カラム(250×4.6mm、Phenomenex, Torrance, USA)に注入し、1ml・分−1の流量およびアンモニウムホルメートリニアグラジエント(25分間にわたり2から600mMへ)を用いてアナライトを溶出させる。次いで、フォトダイオードアレイ検出器(DAD)を用いて、dTDP−グルコース、dTDP−4−デヒドロ−6−デオキシ−D−グルコース、dTDP−6−デオキシ−L−マンノース、およびdTDP−4−デヒドロ−6−デオキシ−L−マンノースの定量をそれらのUV吸収により行う。チミジンの吸収極大は267nmである。基準ヌクレオチド糖(Sigma-Aldrich, Munich, USA)により検量を行う。
以下の酵素の組合せ:E、E、E、E、E、E、E、E、E、E、Eの増大された活性を有する本発明に係る細胞が好ましく、このうち、組合せEは、とくに好ましい。
本発明によれば、アシル−ACPおよびマロニル−補酵素Aから3−ケトアシル−ACPへの変換および/または3−ケトアシル−ACPから(R)−3−ヒドロキシアルカノイル−ACPへの変換をもたらす酵素反応が増大されるように、本発明に係る細胞が脂肪酸生合成で遺伝子改変されたものであれば、有利であり得る。追加的または代替的に、本発明によれば、(R)−3−ヒドロキシアルカノイル−ACPからtrans−2−エノイル−ACPへの変換および/またはtrans−2−エノイル−ACPからアシル−ACPへの変換をもたらす酵素反応が低減されるように、本発明に係る細胞が脂肪酸生合成で遺伝子改変されたものであれば、有利であり得る。アシル−補酵素Aからtrans−2−エノイル−補酵素Aへの変換および/またはtrans−2−エノイル−補酵素Aから(S)−3−ヒドロキシアルカノイル−補酵素Aへの変換をもたらす酵素反応が増大されるように、本発明に係る細胞が脂肪酸のβ酸化で遺伝子改変されたものであれば、同様に有利であり得る。追加的または代替的に、本発明によれば、(S)−3−ヒドロキシアルカノイル−補酵素Aから3−ケトアシル−補酵素Aへの変換および/または3−ケトアシル−補酵素Aからアシル−補酵素Aおよびアセチル−補酵素Aへの変換をもたらす酵素反応が低減されるように、本発明に係る細胞が脂肪酸のβ酸化で遺伝子改変されたものであれば、有利であり得る。一般的に概観するには、図1を比較されたい。
本発明に係る細胞は、ラムノリピドの生産に有利に使用可能であるので、それに続いて、この脂質は、任意選択により精製されるので、本発明に係る細胞が、野生型と比較して細胞から周囲培地中への一般式(I)で示されるラムノリピドの輸送を触媒する少なくとも酵素Eの増大された活性を有するものであれば、有利である。
好ましくは、これとの関連では、タンパク質Eは、ポリペプチド配列の配列番号8、配列番号24、配列番号26、もしくは配列番号28を有する酵素E、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号8、配列番号24、配列番号26、もしくは配列番号28と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号8、配列番号24、配列番号26、もしくは配列番号28を有する酵素の酵素活性の少なくとも50%で、好ましくは65%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素Eからなる群から選択される。ただし、酵素Eの酵素活性は、一般式(I)で示されるラムノリピドを細胞から周囲培地中に輸送する能力を意味するとみなされるものとする。本発明に係る細胞のさらなる好ましい実施形態は、以下に挙げる本発明に係るベクターまたは核酸の少なくとも1つを含有することを特徴とする。
本発明に係る細胞は、ラムノリピドの生産に有利に使用可能である。したがって、本発明のさらなる対象は、一般式(I)で示される化合物を生産するための本発明に係る細胞の使用である。
本発明のさらなる対象は、以下のプロセス工程、
I)本発明に係る細胞を、炭素源を含有する培地と接触させる工程と、
II)細胞による炭素源からのラムノリピドの生成を可能にする条件下で細胞を培養する工程と、
III)任意選択により、生成されたラムノリピドを単離する工程と、
を含む、一般式(I)
(式中、
m=2、1、または0、特定的には1または0、
n=1または0、特定的には1、
およびR=互いに独立して2〜24個、好ましくは5〜13個の炭素原子を有する同一または異なる有機基、特定的には、任意選択により分枝状、任意選択により置換型、特定的にはヒドロキシ置換型、任意選択により不飽和、特定的には任意選択によりモノ、ジ、またはトリ不飽和のアルキル基、好ましくは、ペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニル、およびトリデセニル、ならびにo=1〜23、好ましくは4〜12を有する(CH−CHからなる群から選択されるもの)
で示されるラムノリピドの生産方法である。
本発明に係る遺伝子改変細胞は、以上に挙げた産物の生産の目的で、バッチプロセス(バッチ培養)またはフェドバッチプロセス(供給プロセス)または繰返しフェドバッチプロセス(繰返し供給プロセス)で栄養培地と連続的または非連続的に接触させることが可能であり、したがって、培養可能である。また、英国特許出願公開第1009370号に記載されるように半連続プロセスも考えられる。公知の培養方法の概要は、Chmielの教科書("Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik" [Bioprocess Technology 1. Introduction to the Bioprocess Technique] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))またはStorhasの教科書("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen" [Bioreactors and Peripheral Devices], Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)に記載されている。使用される培養培地は、それぞれの株の要求を好適に満たさなければならない。さまざまな酵母株の培養培地の説明は、たとえば、"Nonconventional yeast in biotechnology" (Ed. Klaus Wolf, Springer-Verlag Berlin, 1996)に含まれている。使用される炭素源は、炭水化物、たとえば、グルコース、スクロース、アラビノース、キシロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン、セルロース、およびヘミセルロースなど、植物および動物の油および脂肪、たとえば、ダイズ油、サフラワー油、ラッカセイ油、アサミ油、ジャトロファ油、ヤシ脂肪、カラバッシュ油、アマニ油、トウモロコシ油、ケシ種子油、マツヨイグサ油、オリーブ油、パーム核油、パーム油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ブドウ種子油、クルミ油、コムギ胚芽油、およびヤシ油など、脂肪酸、たとえば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、γ−リノレン酸、およびそのメチルエステルもしくはエチルエステル、さらには脂肪酸混合物など、直前に挙げた脂肪酸を含有するモノ、ジ、およびトリグリセリド、アルコール、たとえば、グリセロール、エタノール、およびメタノールなど、炭化水素、たとえば、メタンなど、炭素を含有するガスおよびガス混合物、たとえば、CO、CO、合成ガス、もしくは煙道ガスなど、アミノ酸、たとえば、L−グルタメートもしくはL−バリンなど、または有機酸、たとえば、酢酸などであり得る。これらの物質は、単独でまたは混合物として使用可能である。炭素源としての炭水化物、特定的には、モノサッカリド、オリゴサッカリド、またはポリサッカリドの使用は、米国特許第6,01,494号および米国特許第6,136,576号に記載されており、さらには炭化水素、特定的には、アルカン、アルケン、およびアルキン、さらにはそれらから誘導されるモノカルボン酸、ならびにこのモノカルボン酸から誘導されるモノ、ジ、およびトリグリセリド、さらにはグリセロールおよびアセテートの使用は、とくに好ましい。グリセロールと、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレイン酸、および/またはγ−リノレン酸と、のエステル化産物を含有するモノ、ジ、およびトリグリセリドは、なかでもとくに好ましい。本発明に係る細胞が、本発明に係る方法の実施時に長鎖状C源を培地中に提供する必要なく、最も単純な炭素源、たとえば、グルコース、スクロース、またはグリセロールなどからのラムノリピドを生成可能であることは、本発明の大きな利点である。したがって、本発明に係る方法の工程I)の培地が、6個超の炭素原子の鎖長を有するカルボン酸またはこれから誘導可能なエステルもしくはグリセリドを含有しないかあるいはその検出可能量を含有しないことは、入手不可能な場合、有利である。
使用される窒素源は、有機窒素含有化合物、たとえば、ペプトン、酵母エキス、肉抽出物、麦芽エキス、コーンスティープ水、ダイズミール、および尿素など、または無機化合物、たとえば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウム、アンモニア、水酸化アンモニウム、もしくはアンモニア水などであり得る。窒素源は、単独でまたは混合物として使用可能である。
使用されるリン源は、リン酸、リン酸二水素カリウム、もしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩であり得る。さらに、培養培地は、増殖に必要な金属塩、たとえば、硫酸マグネシウムや硫酸鉄などを含有しなければならない。最後に、アミノ酸やビタミンなどの必須の増殖促進剤を以上に挙げた物質に加えて利用することが可能である。さらに、好適な前駆体を培養培地に添加することが可能である。前記供給原料は、単一バッチの形態で培養物に添加可能であるか、または培養時に好適な形で供給可能である。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、もしくはアンモニア水などの塩基性化合物、またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物は、培養物のpH調整のために好適に利用される。消泡剤、たとえば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどは、泡発生を抑制するために利用可能である。好適な選択的作用物質、たとえば、抗生物質などは、プラスミドの安定性を維持するために培地に添加可能である。好気的条件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、たとえば、空気などが培養物中に組み込まれる。培養物の温度は、通常は20℃超、好ましくは25℃超であり、40℃超も可能であり、この場合、有利には95℃、とくに好ましくは90℃、最も好ましくは80℃の培養温度を超えない。本発明に係る方法の工程III)では、細胞により生成されたラムノリピドを、任意選択により、細胞および/または栄養培地から単離することが可能であり、単離のために、複合組成物から低分子量物質を単離するための当業者に公知のすべての方法、たとえば、濾過、抽出、吸着(クロマトグラフィー)、または結晶化などが可能である。
さらに、産物相は、バイオマスの残渣および種々の不純物、たとえば、油、脂肪酸、および他の栄養培地成分などを含有する。不純物の分離は、好ましくは、無溶媒プロセスで行われる。したがって、たとえば、pHの調整を容易にするために、産物相を水で希釈することが可能である。次いで、酸またはアルカリによりpHを低下または上昇させてラムノリピドを水溶性の形態に変換することにより、産物相および水性相をホモジナイズすることが可能である。場合によっては、より高い温度でたとえば60〜90℃で絶えず攪拌しながらインキュベートすることにより、水性相中へのラムノリピドの可溶化を支援することが可能である。その後、続いてアルカリまたは酸によりpHを低下または上昇させることにより、水性相から容易に分離できるように、ラムノリピドを水不溶性の形態に再度変換することが可能である。次いで、産物相を水で1回または数回洗浄して、水溶性不純物を除去することが可能である。油残渣は、たとえば、好適な溶媒を利用して、有利には有機溶媒を利用して、抽出により分離することが可能である。アルカン化合物たとえばn−ヘキサンなどは、溶媒として好ましい。以上に記載の無溶媒プロセスの代わりに、好適な溶媒、たとえば、エチルアセテートやブチルアセテートなどのエステルを用いて、水性相からの産物の分離を行うことが可能である。前記抽出工程は、任意の所望の順序で行うことが可能である。これとの関連では、溶媒とくに有機溶媒が好ましく利用される。n−ペンタノールは、溶媒として好ましい。溶媒を除去するために、たとえば、蒸留が行われる。続いて、凍結乾燥された産物を、たとえば、クロマトグラフィー法を利用してさらに精製することが可能である。例として、この時点では、好適な溶媒を利用した沈殿、好適な溶媒を利用した抽出、複合体化、たとえば、シクロデキストリンもしくはシクロデキストリン誘導体を利用した複合体化、結晶化、クロマトグラフィー法を利用した精製もしくは単離、または容易に分離可能な誘導体へのラムノリピドの変換が挙げられ得る。
本発明に係る方法を用いて生産可能なラムノリピド、特定的には、本発明に係る方法を用いて生産可能な以上に記載のラムノリピド混合物もまた、同様に本発明の対象である。本発明に係る方法を用いて生産可能なラムノリピドおよび混合物は、清浄剤、化粧製剤または医薬製剤、さらには植物保護製剤で有利に利用可能である。
したがって、本発明のさらなる対象は、化粧製剤、皮膚製剤、または医薬製剤の生産、植物保護製剤の生産、ならびにケア剤および清浄剤および界面活性剤濃縮物の生産のための、本発明に係る方法を用いて得られるラムノリピドの使用である。
「ケア剤」という用語は、ここでは、物品をその元の形態に維持する目的、外的影響(たとえば、時間、光、温度、圧力、汚染、物品に接触する他の反応性化合物との化学反応など)の作用、たとえば、老化、汚染、材料疲労などを低減または回避する目的、さらには物品の所望の好ましい特性を改良する目的を満たす製剤を意味するものとみなされる。たとえば、最後の点に関しては、改良された毛髪光沢または考慮対象の物品のより大きい弾性が挙げられ得る。「植物保護製剤」とは、その調製物の性質上明らかに植物保護に使用される製剤を意味するとみなされるものとする。このことは、除草剤、殺菌類剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、鳥害防御物質、植物栄養素、および土壌構造改良剤よりなるクラスに属する少なくとも1種の化合物が製剤中に含有される場合にとくにあてはまる。本発明によれば、本発明に係る方法を用いて生産されるラムノリピドは、家事用、工業用、特定的には、硬質表面用、皮革用、またはテキスタイル用として、ケア剤および清浄剤で好ましく使用される。
目的の達成への寄与は、少なくともそれぞれの場合に3つのグループ[A1〜G1]、[A2〜G2]、および[A3〜G3]から選択される配列を含有する単離された核酸により提供される。
ここで、
グループ[A1〜G1]は、以下の配列:
A1a)配列番号1で表される配列、ただし、この配列は、3−ヒドロキシデカノイル−ACPから3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B1a)A1a)に属する配列に由来し、かつ配列番号1で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C1a)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは3−ヒドロキシデカノイル−ACPから3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D1a)グループA1a)〜C1a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1a)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシデカノイル−ACPから3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E1a)グループA1a)〜D1a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1a)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシデカノイル−ACPから3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F1a)少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは、少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる、グループA1a)〜E1a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1a)に属する配列の誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、3−ヒドロキシデカノイル−ACPから3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
G1a)グループA1a)〜F1a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1a)に属する配列に対する相補的配列、
A1b)配列番号17で表される配列、ただし、この配列は、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B1b)A1b)に属する配列に由来し、かつ配列番号17で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C1b)配列番号18で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D1b)グループA1b)〜C1b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1b)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E1b)グループA1b)〜D1b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1b)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F1b)グループA1b)〜E1b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1b)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G1b)グループA1b)〜F1b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1b)に属する配列に対する相補的配列、ならびに
A1c)配列番号77で表される配列、ただし、この配列は、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B1c)A1c)に属する配列に由来し、かつ配列番号77で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C1c)配列番号78で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D1c)グループA1c)〜C1c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1c)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E1c)グループA1c)〜D1c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1c)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F1c)グループA1c)〜E1c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1c)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G1c)グループA1c)〜F1c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1c)に属する配列に対する相補的配列、ならびに
A1d)配列番号79で表される配列、ただし、この配列は、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B1d)A1d)に属する配列に由来し、かつ配列番号79で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C1d)配列番号80で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D1d)グループA1d)〜C1d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1d)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E1d)グループA1d)〜D1d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1d)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F1d)グループA1d)〜E1d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1d)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G1d)グループA1d)〜F1d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1d)に属する配列に対する相補的配列、ならびに
A1e)配列番号81で表される配列、ただし、この配列は、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B1e)A1e)に属する配列に由来し、かつ配列番号81で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C1e)配列番号82で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D1e)グループA1e)〜C1e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1e)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E1e)グループA1e)〜D1e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1e)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F1e)グループA1e)〜E1e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1e)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G1e)グループA1e)〜F1e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1e)に属する配列に対する相補的配列、
で構成され、かつ
グループ[A2〜G2]は、以下の配列:
A2a)配列番号3で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B2a)A2a)に属する配列に由来し、かつ配列番号3で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C2a)配列番号4で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D2a)グループA2a)〜C2a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2a)に属する配列と少なくとも80%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E2a)グループA2a)〜D2a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2a)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F2a)グループA2a)〜E2a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2a)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
G2a)グループA2a)〜F2a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2a)に属する配列に対する相補的配列、
A2b)配列番号19で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B2b)A2b)に属する配列に由来し、かつ配列番号19で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C2b)配列番号20で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D2b)グループA2b)〜C2b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2b)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E2b)グループA2b)〜D2b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2b)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F2b)グループA2b)〜E2b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2b)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G2b)グループA2b)〜F2b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2b)に属する配列に対する相補的配列、
A2c)配列番号83で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B2c)A2c)に属する配列に由来し、かつ配列番号83で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C2c)配列番号84で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D2c)グループA2c)〜C2c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2c)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E2c)グループA2c)〜D2c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2c)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F2c)グループA2c)〜E2c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2c)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G2c)グループA2c)〜F2c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2c)に属する配列に対する相補的配列、
A2d)配列番号85で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B2d)A2d)に属する配列に由来し、かつ配列番号85で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C2d)配列番号86で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D2d)グループA2d)〜C2d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2d)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E2d)グループA2d)〜D2d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2d)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F2d)グループA2d)〜E2d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2d)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G2d)グループA2d)〜F2d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2d)に属する配列に対する相補的配列、ならびに
A2e)配列番号87で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B2e)A2e)に属する配列に由来し、かつ配列番号87で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C2e)配列番号88で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D2e)グループA2e)〜C2e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2e)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換
を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E2e)グループA2e)〜D2e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2e)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F2e)グループA2e)〜E2e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2e)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G2e)グループA2e)〜F2e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2e)に属する配列に対する相補的配列、
で構成され、かつ
グループ[A3〜G3]は、以下の配列:
A3a)配列番号5で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B3a)A3a)に属する配列に由来し、かつ配列番号5で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C3a)配列番号6で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D3a)グループA3a)〜C3a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3a)に属する配列と少なくとも80%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E3a)グループA3a)〜D3a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3a)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F3a)グループA3a)〜E3a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3a)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
G3a)グループA3a)〜F3a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3a)に属する配列に対する相補的配列、
A3b)配列番号21で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B3b)A3b)に属する配列に由来し、かつ配列番号21で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C3b)配列番号22で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D3b)グループA3b)〜C3b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3b)に属する配列と少なくとも60%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E3b)グループA3b)〜D3b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3b)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F3b)グループA3b)〜E3b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3b)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G3b)グループA3b)〜F3b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3b)に属する配列に対する相補的配列、
A3c)配列番号89で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B3c)A3c)に属する配列に由来し、かつ配列番号89で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C3c)配列番号90で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D3c)グループA3c)〜C3c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3c)に属する配列と少なくとも60%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E3c)グループA3c)〜D3c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3c)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F3c)グループA3c)〜E3c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3c)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G3c)グループA3c)〜F3c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3c)に属する配列に対する相補的配列、ならびに
A3d)配列番号91で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B3d)A3d)に属する配列に由来し、かつ配列番号91で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C3d)配列番号92で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D3d)グループA3d)〜C3d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3d)に属する配列と少なくとも60%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E3d)グループA3d)〜D3d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3d)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F3d)グループA3d)〜E3d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3d)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G3d)グループA3d)〜F3d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3d)に属する配列に対する相補的配列、
で構成される。
「ヌクレオチド同一性」または「アミノ酸同一性」は、ここでは、公知の方法を利用して決定される。一般的には、特別な要件を考慮したアルゴリズムを有する特定のコンピュータープログラムが使用される。同一性を決定するための好ましい方法によれば、さしあたり、比較される配列間の最大の一致が得られる。同一性を決定するためのコンピュータープログラムとしては、GAPが組み込まれたGCGプログラムパッケージ(Deveroy, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), page 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi))、ならびにBLASTP、BLASTN、およびFASTA(Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410)が含まれるが、これらに限定されるものではない。BLASTプログラムは、National Center for Biotechnology Information (NCBI)から、およびさらなる提供元(BLAST handbook, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al., above)から、入手可能である。公知のSmith-Watermanアルゴリズムもまた、ヌクレオチド同一性を決定するために同様に使用可能である。「ヌクレオチド同一性」を決定するための好ましいパラメーターは、BLASTNプログラム(Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410)を使用する場合、以下のとおりである。
期待値閾値:10
ワードサイズ:28
マッチスコア:1
ミスマッチスコア:−2
ギャップコスト:Linear
以上のパラメーターは、ヌクレオチド配列比較でのデフォルトパラメーターである。GAPプログラムも同様に、以上のパラメーターで使用するのに好適である。
「アミノ酸同一性」を決定するための好ましいパラメーターは、BLASTPプログラム(Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410)を使用する場合、以下のとおりである。
期待値閾値:10
ワードサイズ:3
マトリックス:BLOSUM62
ギャップコスト:Existence:11;Extension:1
組成調整:Conditional compositional score matrix adjustment
以上のパラメーターは、アミノ酸配列比較でのデフォルトパラメーターである。GAPプログラムも同様に、以上のパラメーターで使用するのに好適である。
以上のアルゴリズムに基づく60%の同一性は、本発明との関連での60%の同一性を意味する。より高い同一性の場合にも、同じことが言える。
配列の相補鎖に「ハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮して」ハイブリダイズする配列という特性は、好ましくはストリンジェント条件下で参照配列の相補鎖とハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列を意味する。たとえば、ハイブリダイゼーションは、2×SSC中、68℃で、またはBoehringer社(Mannheim)のジゴキシゲニン標識キットのプロトコルに従って、実施可能である。好ましいハイブリダイゼーション条件は、たとえば、7%SDS、1%BSA、1mM EDTA、250mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中、65℃での一晩のインキュベーション、およびそれに続く2×SSC、0.1%SDSを用いた65℃での洗浄である。グループA1)〜E1)、A2)〜E2)、およびA3)〜E3の1つに属する配列の1個以上の塩基の置換、付加、逆位、および/または欠失により代替的F1、F2)、またはF3)に従って取得可能な、本発明に係る単離されたDNAの誘導体としては、特定的には、それらがコードするタンパク質中で保存アミノ酸交換、たとえば、グリシンとアラニンとの交換またはアスパラギン酸とグルタミン酸との交換などをもたらす配列が含まれる。そのような機能的中立突然変異は、センス突然変異として記述され、ポリペプチドの活性の基本的改変をもたらさない。さらに、ポリペプチドのN末端および/またはC末端の変化がその機能を有意に損なわないかまたはこれを安定化することさえも可能であることは、公知であるので、したがって、本発明に係る核酸を含有する配列の3’末端または5’末端に塩基が結合されたDNA配列もまた、本発明に包含される。当業者であれば、これに関する情報は、とくに、Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987))、O’Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), in Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994))、Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988))、ならびに遺伝学および分子生物学の公知の教科書に見いだされる。
本発明に係る核酸は、好ましくは、ベクター、特定的には、発現ベクターまたは遺伝子過剰発現カセットである。好適なベクターは、宿主細胞内へのDNAの組込みに慣用される当業者に公知のすべてのベクターである。これらのベクターは、複製起点(たとえば、2μプラスミドやARS(自己複製配列)のものなど)を有するので自律的複製も可能であるし、染色体(非複製プラスミド)中への組込みも可能である。ベクターはまた、複製起点をまったく有していない線状DNA断片、たとえば、遺伝子挿入カセットまたは遺伝子過剰発現カセットなどをも意味するものとみなされる。遺伝子過剰発現カセットは、慣例的には、マーカー、過剰発現される遺伝子、さらには遺伝子の発現に適合する調節領域、たとえば、プロモーターやターミネーターなどで構成される。好ましいベクターは、プラスミドおよびカセット、たとえば、大腸菌(E. coli)酵母シャトルプラスミドを含む群から選択され、発現ベクター、遺伝子挿入カセットまたは遺伝子過剰発現カセット、特定的には、以下で説明されるベクターの配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号45、および配列番号47は、とくに好ましい。
本発明に係るベクターの好ましい実施形態によれば、グループ[A1〜G1]、[A2〜G2]、および[A3〜G3]の配列は、微生物の細胞内、たとえば、細菌、酵母、または菌類の細胞内でのこれらのDNA配列によりコードされるポリペプチドの発現に好適な少なくとも1種の構成的または調節的プロモーターの制御下に存在し、この場合、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アルカリゲネス・ラタス(Alcaligenes latus)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、バークホルデリア・アンドロポゴニス(Burkholderia andropogonis)、B.ブラシレンシス(B. brasilensis)、B.カレドニカ(B. caledonica)、B.カリベンシス(B. caribensis)、B.カリオフィリ(B. caryophylli)、B.フンゴラム(B. fungorum)、B.グラジオリ(B. gladioli)、B.グラセイ(B. glathei)、B.グルマエ(B. glumae)、B.グラミニス(B. graminis)、B.ホスピタ(B. hospita)、B.クルリエンシス(B. kururiensis)、B.フェナジニウム(B. phenazinium)、B.フィマタム(B. phymatum)、B.フィトファーマンス(B. phytofirmans)、B.プランタリイ(B. plantarii)、B.サッカリ(B. sacchari)、B.シンガポレンシス(B. singaporensis)、B.ソルディディコラ(B. sordidicola)、B.テリコラ(B. terricola)、B.トロピカ(B. tropica)、B.ツベラム(B. tuberum)、B.ウボネンシス(B. ubonensis)、B.ウナマエ(B. unamae)、B.ゼノボランス(B. xenovorans)、B.アンチナ(B. anthina)、B.ピロシニア(B. pyrrocinia)、B.タイランデンシス(B. thailandensis)、カンジダ・ブランキイ(Candida blankii)、カンジダ・ルゴサ(Candida rugosa)、コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クルベロマイセス・ラクティス(Kluveromyces lactis)、メチロバクテリウム・エクストルクエンス(Methylobacterium extorquens)、パラコッカス・ベルスタス(Paracoccus versutus)、シュードモナス・アルゼンチネンシス(Pseudomonas argentinensis)、P.ボルボリ(P. borbori)、P.シトロネロリス(P. citronellolis)、P.フラベセンス(P. flavescens)、P.メンドシナ(P. mendocina)、P.ニトロレデュセンス(P. nitroreducens)、P.オレオボランス(P. oleovorans)、P.シュードアルカリゲネス(P. pseudoalcaligenes)、P.レジノボランス(P. resinovorans)、P.ストラミネア(P. straminea)、P.オーランティアカ(P. aurantiaca)、P.オーレオファシエンス(P. aureofaciens)、P.クロロラフィス(P. chlororaphis)、P.フラギ(P. fragi)、P.ルンデンシス(P. lundensis)、P.タエトロレンス(P. taetrolens)、P.アンタークティカ(P. antarctica)、P.アゾトフォルマンス(P. azotoformans)、P.ブラッチフォルダエ(P. blatchfordae)、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)、P.ブレンネリ(P. brenneri)、P.セドリナ(P. cedrina)、P.コルガタ(P. corrugata)、P.フルオレッセンス(P. fluorescens)、P.ゲッサルディイ(P. gessardii)、P.リバネンシス(P. libanensis)、P.マンデリイ(P. mandelii)、P.マルギナリス(P. marginalis)、P.メディテラネア(P. mediterranea)、P.メリディアナ(P. meridiana)、P.ミグラエ(P. migulae)、P.ムシドレンス(P. mucidolens)、P.オリエンタリス(P. orientalis)、P.パナシス(P. panacis)、P.プロテオリティカ(P. proteolytica)、P.ローデシアエ(P. rhodesiae)、P.シンキサンタ(P. synxantha)、P.チベルバレンシス(P. thivervalensis)、P.トラシイ(P. tolaasii)、P.ベロニイ(P. veronii)、P.デニトリフィカンス(P. denitrificans)、P.ペルツシノゲナ(P. pertucinogena)、P.クレモリコロラタ(P. cremoricolorata)、P.フルバ(P. fulva)、P.モンテイリイ(P. monteilii)、P.モッセリイ(P. mosselii)、P.パラフルバ(P. parafulva)、P.プチダ(P. putida)、P.バレアリカ(P. balearica)、P.スツッツェリ(P. stutzeri)、P.アミグダリ(P. amygdali)、P.アベラナエ(P. avellanae)、P.カリカパパヤエ(P. caricapapayae)、P.チコリー(P. cichorii)、P.コロナファシエンス(P. coronafaciens)、P.フィクセレクタエ(P. ficuserectae)、「P.ヘリアンティ(P. helianthi)」、P.メリアエ(P. meliae)、P.サバスタノイ(P. savastanoi)、P.シリンガエ(P. syringae)、P.トマト(P. tomato)、P.ビリディフラバ(P. viridiflava)、P.アビエタニフィラ(P. abietaniphila)、P.アシドフィラ(P. acidophila)、P.アガリシ(P. agarici)、P.アルカリフィラ(P. alcaliphila)、P.アルカノリティカ(P. alkanolytica)、P.アミロデラモサ(P. amyloderamosa)、P.アスプレニイ(P. asplenii)、P.アゾティフィゲンス(P. azotifigens)、P.カナビナ(P. cannabina)、P.コエノビオス(P. coenobios)、P.コンゲランス(P. congelans)、P.コスタンチニイ(P. costantinii)、P.クルシビアエ(P. cruciviae)、P.デルヒエンシス(P. delhiensis)、P.エクスシビス(P. excibis)、P.エクストレモリエンタリス(P. extremorientalis)、P.フレデリクスベルゲンシス(P. frederiksbergensis)、P.フスコバギナエ(P. fuscovaginae)、P.ゲリディコラ(P. gelidicola)、P.グリモンティイ(P. grimontii)、P.インディカ(P. indica)、P.ジェッセニイ(P. jessenii)、P.ジンジュエンシス(P. jinjuensis)、P.キロネンシス(P. kilonensis)、P.クナックムッシイ(P. knackmussii)、P.コーリエンシス(P. koreensis)、P.リニ(P. lini)、P.ルテア(P. lutea)、P.モラビエンシス(P. moraviensis)、P.オティティディス(P. otitidis)、P.パチャストレラエ(P. pachastrellae)、P.パレロニアナ(P. palleroniana)、P.パパベリス(P. papaveris)、P.ペリ(P. peli)、P.ペロレンス(P. perolens)、P.ポアエ(P. poae)、P.ポハンエンシス(P. pohangensis)、P.サイクロフィラ(P. psychrophila)、P.サイクロトレランス(P. psychrotolerans)、P.ラトニス(P. rathonis)、P.レプティリボラ(P. reptilivora)、P.レシニフィラ(P. resiniphila)、P.リゾスファエラエ(P. rhizosphaerae)、P.ルベッセンス(P. rubescens)、P.サロモニイ(P. salomonii)、P.セギティス(P. segitis)、P.セプティカ(P. septica)、P.シミアエ(P. simiae)、P.スイス(P. suis)、P.サーモトレランス(P. thermotolerans)、P.アエルギノサ(P. aeruginosa)、P.トレマエ(P. tremae)、P.トリビアリス(P. trivialis)、P.ツルビネラエ(P. turbinellae)、P.ツティコリネンシス(P. tuticorinensis)、P.ウムソンゲンシス(P. umsongensis)、P.バンコウベレンシス(P. vancouverensis)、P.ブラノベンシス(P. vranovensis)、P.キサントマリナ(P. xanthomarina)、ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)、ロドスピリラム・ルブラム(Rhodospirillum rubrum)、ロドバクター・スファエロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)、特定的には、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、およびバークホルデリア・タイランデンシス(Burkholderia thailandensis)は、とくに好ましい。構成的プロモーターの例は、lac、lacUV5、tac、trc(いずれの場合も本発明に係る細胞内ではLacIリプレッサーの不在下)、Ltet−O1(本発明に係る細胞内ではTetRリプレッサーの不在下)、T5、およびgapである。誘導性プロモーターの例は、lac、lacUV5、tac、trc(いずれの場合も本発明に係る細胞内ではLacIリプレッサーの存在下)、Ltet−O1(本発明に係る細胞内ではTetRリプレッサーの存在下)、T5(本発明に係る細胞内ではlacオペレーターとの併用かつLacIリプレッサーの存在下)、SP6およびT7(それ自体発現が調節されるコグネイトRNAポリメラーゼをコードする遺伝子の存在下)である。本発明に係るベクターは、プロモーターに加えて、好ましくは、リボソーム結合部位さらにはターミネーターを含むことが望ましい。ここでは、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターを含むベクターの発現カセット中に本発明に係る核酸を組み込むことがとくに好ましい。以上に挙げた構造エレメントに加えて、ベクターは、当業者に公知の選択遺伝子を追加的に含み得る。
指定のパーセント(%)はすべて、別に指定がなければ、質量パーセントである。以下に提示される実施例では、例を用いて本発明を説明するが、実施例に挙げた実施形態に本発明を限定しようとするものではなく、本発明の適用範囲は、説明の全体および特許請求の範囲から得られるものである。
脂肪酸の生合成、脂肪酸のβ酸化、ならびにこれらの代謝経路とラムノリピド(酵素E、E、およびE)およびポリヒドロキシアルカノエート(酵素EおよびE10)の生合成との関連性。脂肪酸の生合成、脂肪酸のβ酸化、ラムノリピドの生合成、およびポリヒドロキシアルカノエートの生合成における炭素の流れが示されている。補酵素、レドックス等価体、さらにはヌクレオチドの消費および生成は示されていない。 CMP培地中で48時間、72時間、および96時間培養した後の組換え株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2およびpBBR1MCS−2::ABCさらにはGPp104 pBBR1MCS−2およびpBBR1MCS−2::ABCのジラムノシル脂質生成(mg/l/OD600nm)。ラムノリピド濃度の分析は、HPLCを利用して行った。 CMP培地中で48時間、72時間、および96時間培養した後の組換え株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2、pBBR1MCS−2::AB、およびpBBR1MCS−2::ABM、さらにはGPp104 pBBR1MCS−2、pBBR1MCS−2::AB、およびpBBR1MCS−2::ABMのモノラムノシル脂質生成(ピーク面積/OD600nm)。ラムノリピド濃度の分析は、HPLCを利用して行った。
実施例:
1.シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)1707遺伝子rhlAおよびrhlBの異種発現用のベクターpBBR1MCS−2::ABの構築
シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlAおよびrhlBの異種発現のために、プラスミドpBBR1MCS−2::AB(配列番号38)を構築した。このために、合成オペロンrhlAB(配列番号37)をGeneArt AG社(Regensburg)により合成し、市販のベクターpMA(GeneArt AG)中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707の既知のゲノム配列であった。ベクターpMA::ABから出発して、合成オペロンをBglIIおよびXbaIによりベクターから切断し、続いて、BamHIおよびXbaIで切断された発現ベクターpBBR1MCS−2(配列番号49)中にライゲートした(Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad host range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176に記載されている)。得られるプラスミドpBBR1MCS−2::AB(配列番号38)は、7422塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行った。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックした。ベクターpBBR1MCS−2(配列番号49)およびpBBR1MCS−2::ABを用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440およびGPp104の形質転換は、既報どおり行った(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個のクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABと命名した。
2.シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlB、およびrhlCの異種発現用のベクターpBBR1MCS−2::ABCの構築
シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlB、およびrhlCの異種発現のために、プラスミドpBBR1MCS−2::ABC(配列番号40)を構築した。このために、rhlABC(配列番号39)をGeneArt AG社(Regensburg)により合成し、市販のベクターpMA(GeneArt AG)中にインタークローン化した(intercloned)。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707の既知のゲノム配列であった。ベクターpMA::ABCから出発して、合成オペロンをBglIIおよびXbaIによりベクターから切断し、続いて、BamHIおよびXbaIで切断された発現ベクターpBBR1MCS−2(配列番号49)中にライゲートした(Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad host range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176)。得られるプラスミドpBBR1MCS−2::ABC(配列番号40)は、8409塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行った。インサート(insert)の信頼性は、DNA配列解析によりチェックした。ベクターpBBR1MCS−2::ABCを用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440およびGPp104の形質転換は、既報どおり行った(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABCおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABCと命名した。
3.シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlBおよびpa1131の異種発現用のベクターpBBR1MCS−2::ABMの構築
シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlB、およびpa1131の異種発現のために、プラスミドpBBR1MCS−2::ABM(配列番号42)を構築した。このために、合成オペロンrhlAB−pa1131(配列番号41)をGeneArt AG社(Regensburg)により合成し、市販のベクターpMA(GeneArt AG)中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707の既知のゲノム配列であった。ベクターpMA::ABMから出発して、合成オペロンをBglIIおよびXbaIによりベクターから切断し、続いて、BamHIおよびXbaIで切断された発現ベクターpBBR1MCS−2(配列番号49)中にライゲートした(Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad host range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176)。得られるプラスミドpBBR1MCS−2::ABM(配列番号42)は、8702塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行った。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックした。ベクターpBBR1MCS−2::ABMを用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440およびGPp104の形質転換は、既報どおり行った(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMと命名した。
4.組換えP.プチダ(P. putida)株によるラムノリピド生産の定量
組換え株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABM、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABCおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMを、LB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養した。
ラムノリピドを生産するために、以下でCMP培地と記される培地を使用した。これは、2%(w/v)グルコース、0.007%(w/v)KHPO、0.11%NaHPO・2HO、0.2%(w/v)NaNO、0.04%(w/v)MgSO・HO、0.01%(w/v)CaCl・2HO、および0.2%(v/v)の微量元素溶液で構成される。これは、0.2%(w/v)FeSO・7HO、0.15%(w/v)MnSO・HO、および0.06%(w/v)(NH)MO24・4HOで構成される。培地のpHをNaOHで6.7に調整し、続いて、培地をオートクレーブにより滅菌した(121℃、20分)。培養中のpHの調整は必要なかった。
シェーカーフラスコ中でのラムノリピド生産を調べるために、最初に前培養物を調製した。このために、LB寒天プレート上に新たに画線した株の接種ループを使用し、10mlのLB培地を100mlエルレンマイヤーフラスコ中に接種した。組換えP.プチダ(P. putida)株はすべて、50μg/mlのカナマイシンが添加されたLB培地中に存在した。株の培養を30℃および200rpmで一晩行った。前培養物を用いて250mlエルレンマイヤーフラスコ中の50mlのCMP培地に接種した(開始時OD600 0.1)。培養物を200rpmおよび30℃で多くとも120時間培養した。24時間間隔で、1mlのブロスのサンプルを培養フラスコから取り出した。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプルの調製を次のように行った。
置換ピペット(Combitip)を用いて、1mlのアセトンを2ml反応容器中に導入し、蒸発を最小限に抑えるために、反応容器をただちに閉めた。続いて1mlのブロスを添加した。ブロス/アセトン混合物を撹拌した後、これを13,000rpmで3分間遠心分離し、800μLの上清をHPLC容器に移した。
ラムノリピドの検出および定量のために、蒸発光散乱検出器(Sedex LT-ELSD Model 85LT)を使用した。実際の測定は、Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, California)およびZorbax SB-C8迅速分離カラム(4.6×150mm、3.5μm、Agilent)により行った。注入量は5μlであり、方法の実行時間は20分であった。移動相として0.1%水性TFA(トリフルオロ酢酸、溶液A)およびメタノール(溶液B)を使用した。カラム温度は40℃であった。ELSD(検出器温度60℃)およびDAD(ダイオードアレイ、210nm)を検出器として機能させた。この方法で使用したグラジエントは、以下のとおりであった。
P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2およびGPp104 pBBR1MCS−2は、ラムノリピドを生産しなかったが、組換え株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABM、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMでは、異なるラムノリピド種の生成が検出可能であった(図2および3)。
P.プチダ(P. putida)中へのpBBR1MCS−2::ABおよびpBBR1MCS−2::ABMの組込みにより、モノラムノシル脂質の生成が可能であった(図3)。モノラムノシル脂質に対する基準物質が存在しなかったので、LC−MSにおける対応する質量トレースおよびMS2スペクトルを解析することにより、産物の同定を行った。rhlC(pBBR1MCS−2::ABC)を追加的に株に組み込んだ場合、モノおよびジラムノシル脂質が生産された(図2)。
P.プチダ(P. putida)pBBR1MCS−2::ABおよびP.プチダ(P. putida)pBBR1MCS−2::ABMによるラムノリピド生成の直接比較により、P.アエルギノサ(P. aeruginosa)p3111とP.アエルギノサ(P. aeruginosa)rhlABとの共発現がラムノリピド生合成の改良をもたらすことが示される(図3)。株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABおよび株P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABは、120時間後、約39ピーク面積/OD600nm(P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB)および23ピーク面積/OD600nmのラムノリピド(P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::AB)を生産したが、株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMおよび株P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMは、120時間後、約50ピーク面積/OD600nm(P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABM)および62ピーク面積/OD600nmのラムノリピド(P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABM)を生成した。
株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMおよび株P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMのモノラムノシル脂質合成を比較した場合、PHA陰性突然変異型P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMでは62ピーク面積/OD600nm(120時間培養)およびP.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMでは50面積/OD600nmのモノラムノシル脂質を検出することが可能であった(図3)。
株P.プチダ(P. putida)KT2440およびGPp104中でのジラムノシル脂質生成(mg/l/OD600nm)の比較分析により、同様に、P.プチダ(P. putida)GPp104のPHA陰性株バックグラウンドではジラムノシル脂質のより多量の生成が示された。P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABCは、平均で113mg/l/OD600nmのジラムノシル脂質を生成したが(96時間)、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABCでは、96時間後、55mg/l/OD600nmのジラムノシル脂質を検出可能であるにすぎなかった(図2)。したがって、PHA合成に関して低減された株バックグラウンドの使用により、ラムノリピド生合成の改良がもたらされることを示すことが可能であった。
5.シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlB、pa1131、およびrhlCの異種発現用のベクターpBBR1MCS−2::ABMCの構築
シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlB、pa1131、およびrhlCの異種発現のために、プラスミドpBBR1MCS−2::ABMC(配列番号51)を構築した。このために、合成オペロンrhlAB−pa1131−rhlC(配列番号50)をGeneArt AG社(Regensburg)により合成し、市販のベクターpMA(GeneArt AG)中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707の既知のゲノム配列であった。ベクターpMA::ABMCから出発して、合成オペロンをBglIIおよびXbaIによりベクターから切断し、続いて、BamHIおよびXbaIで切断された発現ベクターpBBR1MCS−2(配列番号49)中にライゲートした(Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176)。得られるプラスミドpBBR1MCS−2::ABMC(配列番号51)は、9663塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行った。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックした。ベクターpBBR1MCS−2::ABMCを用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440およびGPp104の形質転換は、既報どおり行った(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMCおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMCと命名した。
6.組換えP.プチダ(P. putida)株およびP.アエルギノサ(P. aeruginosa)株によるラムノリピド生産の定性的比較
組換え株P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMCおよびP.アエルギノサ(P. aeruginosa)DSM19880を、LB寒天カナマイシンプレート上(50μg/ml、P.プチダ(P. putida))およびLB寒天プレート上(P.アエルギノサ(P. aeruginosa))で培養した。
ラムノリピドを生産するために、以下でCMP培地と記される培地を使用した。これは、2%(w/v)グルコース、0.007%(w/v)KHPO、0.11%NaHPO・2HO、0.2%(w/v)NaNO、0.04%(w/v)MgSO・HO、0.01%(w/v)CaCl・2HO、および0.2%(v/v)の微量元素溶液で構成される。これは、0.2%(w/v)FeSO・7HO、0.15%(w/v)MnSO・HO、および0.06%(w/v)(NH)MO24・4HOで構成される。NaOHを用いて培地のpHを6.7に調整し、続いて、オートクレーブにより培地を滅菌した(121℃、20分)。培養中のpHの調整は必要なかった。
このために、LB寒天プレート上に新たに画線した株の接種ループを使用し、10mlのLB培地を100mlエルレンマイヤーフラスコ中に接種した。組換えP.プチダ(P. putida)株は、50μg/mlのカナマイシンが添加されたLB培地中に存在した。P.アエルギノサ(P. aeruginosa)をLB培地中で培養した。株の培養を30℃および200rpmで一晩行った。前培養物を用いて250mlエルレンマイヤーフラスコ中の50mlのCMP培地に接種した(開始時OD600 0.1)。培養物を200rpmおよび30℃で多くとも120時間培養した。24時間間隔で、1mlのブロスのサンプルを培養フラスコから取り出した。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプルの調製を次のように行った。
置換ピペット(Combitip)を用いて、1mlのアセトンを2ml反応容器中に導入し、蒸発を最小限に抑えるために、反応容器をただちに閉めた。続いて1mlのブロスを添加した。ブロス/アセトン混合物を撹拌した後、これを13,000rpmで3分間遠心分離し、800μLの上清をHPLC容器に移した。
生成された産物の同定のために、5μlをAccela UPLCユニット(Thermo Scientific, Dreieich)に注入した。準UPLCカラム”Pursuit XRs ULTRA(C8、2.8μm、2.1×100mm)(Varian, Darmstadt)を用いて、研究対象物質を分析した。40℃で0.3ml/分の流量を用いて、移動相A1(HO、0.1%(v/v)TFA)および移動相B1(メタノール、0.1%(v/v)TFA)で構成されるグラジエントにより、25分間以内で分離を行った。グラジエントの時間経過は、以下のとおりであった。
走査範囲m/e100〜1000で高分解能FT−ICR LTQ−FT質量分析計(Thermo Scientific, Dreieich)を用いて、波長領域200〜600nmで質量選択的にDAD検出器により検出を行った。ESI(エレクトロスプレーイオン化)によりイオン化を行った。R=100000の分解能および≦2ppmの質量確度を用いて、FT−ICR質量分析計により、精密質量および実験化学式を決定した。対応する質量トレースおよびMS2スペクトルを解析することにより産物の同定を行う。株を比較できるように、対応する物質のピーク面積を対比した。図4に示されるように、株P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2は、ラムノリピドをまったく生成しなかった。P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMCおよびP.アエルギノサ(P. aeruginosa)DSM19880は、ラムノリピドを生成したが、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMCで生成されたジおよびモノラムノシル脂質の比は、たとえば4:1であり、P.アエルギノサ(P. aeruginosa)DSM19880では、たとえば2:1であった。さらに、株P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMCは、P.アエルギノサ(P. aeruginosa)DSM19880とは対照的に、3−ヒドロキシオクタノイル−3−ヒドロキシデカン酸または3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシオクタン酸に由来するRおよびRにより決定される基を有するラムノリピドを生成しなかったか、またはごくわずか生成したにすぎなかった。
7.シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)中での異種発現用のベクターpBBR1MCS−2::rfbBDACおよびpBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACの構築
Trenzyme GmbH社(Konstanz)において、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440の染色体DNAから出発してラムノース生合成オペロンrfbBDACを増幅した。このために、以下のプライマーを使用した。
RL1:5’−TATATATAGAATTCGCGTCATCTGTCTACGACAACAC−3’(配列番号48)
RL2:5’−TATATATAGAATTCGGCTGCGCTACCGCAGCCCTTC−3’(配列番号43)
得られたPCR産物をTrenzyme社のalligatorクローニングシステムでインタークローン化し、大腸菌(E. coli)DH5α(New England Biolabs; Frankfurt)中に導入して形質転換させた。さまざまな候補ベクターを分析し、配列決定した。誤差のないDNA配列決定に成功した後、EcoRIによりベクターを切断し、標的断片rfbBDACを単離した。さらなるインタークローニングのために、ベクターpBBR1MCS−2(Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176)を同様に切断した。切断された標的断片(rfbBDAC)および切断されたベクター(pBBR1MCS−2)を従来のライゲーションにより合体した。得られたベクターpBBR1MCS−2::rfbBDAC(配列番号45)を同様に大腸菌(E. coli)DH5α(New England Biolabs; Frankfurt)中に導入して形質転換させた。プラスミドの取込みの成功に関して、形質転換体のいくつかの候補を調べた。ベクターpBBR1MCS−2::rfbBDACをPCR用のマトリックスとして機能させた。以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
RL_XbaI−fw:5’−TATATATATCTAGAATTAATGCAGCTGGCACGAC−3’(配列番号44)
RL_Xba_rev:5’−GGCCGCTCTAGAACTAGTGGA−3’(配列番号46)
New England Biolabs (Frankfurt)のPhusionTM High-Fidelity Master Mixポリメラーゼを用いて、PCRを行った。当業者に公知の方法で行った。標的配列(lacプロモーターおよびrfbBDAC)をTrenzyme alligatorクローニングシステムでインタークローン化した。大腸菌(E. coli)DH5α(New England Biolabs; Frankfurt)形質転換体を選択し、さまざまな候補プラスミドDNAを単離し、配列決定した。配列をチェックし、妥当性を調べた後、XbaIを用いてベクターを切断した。従来のライゲーション法により、標的断片をXbaI(上記参照)で同様に切断されたpBBR1MCS−2::ABC中にライゲートした。得られた標的ベクターpBBR1MCS−2::ABC_rfbBDAC(配列番号47)は、12249塩基対のサイズを有する。ベクターのインサートを配列決定した。PCRの実施、アガロースゲル電気泳動によるPCR増幅の成功のチェック、DNAのエチジウムブロミド染色、PCR断片サイズの決定、PCR産物の精製、およびDNA濃度の決定は、当業者に公知の方法で行った。ベクターpBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACを用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440およびGPp104の形質転換は、既報どおり行った(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACと命名した。
8.rfbBDACオペロンの過剰発現を用いたときと用いなかったときの組換えP.プチダ(P. putida)によるラムノリピド生産の定量
組換え株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACを、LB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するために、以下でCMP培地と記される培地を使用する。これは、2%(w/v)グルコース、0.007%(w/v)KHPO、0.11%NaHPO・2HO、0.2%(w/v)NaNO、0.04%(w/v)MgSO・HO、0.01%(w/v)CaCl・2HO、および0.2%(v/v)の微量元素溶液で構成される。これは、0.2%(w/v)FeSO・7HO、0.15%(w/v)MnSO・HO、および0.06%(w/v)(NH)MO24・4HOで構成される。NaOHを用いて培地のpHを6.7に調整し、続いて、オートクレーブにより培地を滅菌する(121℃、20分)。培養中のpHの調整は必要ない。
シェーカーフラスコ中でのラムノリピド生産を調べるために、最初に前培養物を調製する。このために、LB寒天プレート上に新たに画線した株の接種ループを使用し、10mlのLB培地を100mlエルレンマイヤーフラスコ中に接種する。組換えP.プチダ(P. putida)株はすべて、50μg/mlのカナマイシンが添加されたLB培地中で培養する。P.プチダ(P. putida)株の培養を30℃および200rpmで一晩行った。前培養物を用いて250mlエルレンマイヤーフラスコ中の50mlのCMP培地に接種する(開始時OD600 0.1)。培養物を200rpmおよび30℃で多くとも120時間培養する。24時間間隔で、1mlのブロスのサンプルを培養フラスコから取り出す。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプルの調製を次のように行う。
置換ピペット(Combitip)を用いて、1mlのアセトンを2ml反応容器中に導入し、蒸発を最小限に抑えるために、反応容器をただちに閉める。続いて1mlのブロスを添加する。ブロス/アセトン混合物を撹拌した後、これを13,000rpmで3分間遠心分離し、800μLの上清をHPLC容器に移す。ラムノリピドの検出および定量のために、蒸発光散乱検出器(Sedex LT-ELSD Model 85LT)を使用する。実際の測定は、Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, California)およびZorbax SB-C8迅速分離カラム(4.6×150mm、3.5μm、Agilent)により行う。注入量は5μlであり、方法の実行時間は20分である。移動相として0.1%水性TFA(トリフルオロ酢酸、溶液A)およびメタノール(溶液B)を使用する。カラム温度は40℃である。ELSD(検出器温度60℃)およびDAD(ダイオードアレイ、210nm)を検出器として機能させる。この方法で使用したグラジエントは、以下のとおりである。
P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2およびGPp104 pBBR1MCS−2は、ラムノリピドを生産しないが、組換え株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACでは、ラムノリピドの生成を検出可能である。
P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACは、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABCと比較して、ジおよびモノラムノシル脂質の増大された生成を示し、また、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACは、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABCと比較して、ジおよびモノラムノシル脂質の増大された生成を示す。このことから、モノおよびジラムノシル脂質の生成に及ぼすrfbBDACの発現の増幅のプラスの影響が明確に示される。
株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACのモノ−およびジラムノシル脂質生合成を比較した場合、PHA陰性突然変異型P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACでは、増大されたモノおよびジラムノシル脂質合成が検出される。以上にすでに説明したように、ラムノリピド生合成は、PHA合成が不活性化された株バックグラウンドを用いると増大される。
9.組換え大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCおよび大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACの生成
大腸菌(E. coli)W3110の形質転換は、電気穿孔により既報どおり行った(Miller JH. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Plainview, NY: Cold Spring HarborLab. Press; 1992)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACおよび大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACと命名した。
10.rfbBDACオペロンの過剰発現を用いたときと用いなかったときの組換え大腸菌(E. coli)株によるラムノリピド生産の定量
組換え株大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC、および大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACは、LB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するために、以下でCMP培地と記される培地を使用する。これは、2%(w/v)グルコース、0.007%(w/v)KHPO、0.11%NaHPO・2HO、0.2%(w/v)NaNO、0.04%(w/v)MgSO・HO、0.01%(w/v)CaCl・2HO、および0.2%(v/v)の微量元素溶液で構成される。これは、0.2%(w/v)FeSO・7HO、0.15%(w/v)MnSO・HO、および0.06%(w/v)(NH)MO24・4HOで構成される。NaOHを用いて培地のpHを6.7に調整し、続いて、オートクレーブにより培地を滅菌する(121℃、20分)。培養中のpHの調整は必要ない。
シェーカーフラスコ中でのラムノリピド生産を調べるために、最初に前培養物を調製する。このために、LB寒天プレート上に新たに画線した株の接種ループを使用し、10mlのLB培地を100mlエルレンマイヤーフラスコ中に接種する。組換え大腸菌(E. coli)株はすべて、50μg/mlのカナマイシンが添加されたLB培地中で培養する。大腸菌(E. coli)株の培養を37℃および200rpmで一晩行った。前培養物を用いて250mlエルレンマイヤーフラスコ中の50mlのCMP培地に接種する(開始時OD600 0.1)。培養物を200rpmおよび30℃で多くとも120時間培養する。24時間間隔で、1mlのブロスのサンプルを培養フラスコから取り出す。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプルの調製を次のように行う。
置換ピペット(Combitip)を用いて、1mlのアセトンを2ml反応容器中に導入し、蒸発を最小限に抑えるために、反応容器をただちに閉める。続いて1mlのブロスを添加する。ブロス/アセトン混合物を撹拌した後、これを13,000rpmで3分間遠心分離し、800μLの上清をHPLC容器に移す。ラムノリピドの検出および定量のために、蒸発光散乱検出器(Sedex LT-ELSD Model 85LT)を使用する。実際の測定は、Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, California)およびZorbax SB-C8迅速分離カラム(4.6×150mm、3.5μm、Agilent)により行う。注入量は5μlであり、方法の実行時間は20分である。水性0.1%のTFA(トリフルオロ酢酸、溶液A)およびメタノール(溶液B)を移動相として使用する。カラム温度は40℃である。ELSD(検出器温度60℃)およびDAD(ダイオードアレイ、210nm)を検出器として機能させる。この方法で使用したグラジエントは、以下のとおりである。
大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2は、ラムノリピドを生産しないが、組換え株大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCおよび大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACでは、モノおよびジラムノシル脂質の生成を検出可能であり、この場合、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACは、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCよりも有意に多量のモノおよびジラムノシル脂質を生成する。このことから、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707のrhlABCの異種発現により大腸菌(E. coli)中でのモノおよびジラムノシル脂質の生成がもたらされることが示される。さらに、このことから、モノおよびジラムノシル脂質の生成に及ぼすrfbBDACの発現の増強のプラスの影響が示される。
11.シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlB、およびrhlCならびにバークホルデリア・タイランデンシス(Burkholderia thailandensis)E264遺伝子BTH_II1077、BT_II1080、およびBT_II1081の異種発現用のベクターpBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081の構築
シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlB、およびrhlCならびにB.タイランデンシス(B. thailandensis)E264遺伝子BTH_II1077、BT_II1080、およびBT_II1081の異種発現のために、プラスミドpBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077− II1080−II1081(配列番号69)を構築する。このために、合成オペロンBTH_II1077、BT_II1080、およびBT_II1081(配列番号70)を、DNA 2.0社(Menlo Park, CA, USA)により合成し、市販のベクターpJ294(DNA 2.0; Menlo Park, CA, USA)中にインタークローン化する。合成のベースは、株B.タイランデンシス(B. thailandensis)E264のゲノム配列である。ベクターpJ294−BTH_II1077−II1080−II1081から出発して、合成オペロンをXbaIによりこのベクターから切断し、続いて、XbaIを用いて同様に切断されたベクターpBBR1MCS−2::ABC(配列番号40)中にライゲートする。得られた標的ベクターpBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077− II1080−II1081(配列番号69)は、13768塩基対のサイズを有する。ベクターのインサートを配列決定する。PCRの実施、アガロースゲル電気泳動によるPCR増幅の成功のチェック、DNAのエチジウムブロミド染色、PCR断片サイズの決定、PCR産物の精製、およびDNA濃度の決定は、当業者に公知の方法で行う。ベクターpBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081(配列番号69)を用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440およびGPp104の形質転換は、既報どおり行う(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析する。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077− II1080−II1081およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077− II1080−II1081と命名する。
12.B.タイランデンシス(B. thailandensis)E264遺伝子BTH_II1077、BT_II1080およびBT_II1081の過剰発現を用いたときと用いなかったときの組換えP.プチダ(P. putida)株によるラムノリピド生産の定量
実施例1、2、および11で生成した組換え株P.プチダ(P. putida)の株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB−BTH_II1077−II1080−II1081、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::AB−BTH_II1077−II1080−II1081、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081 P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081を、LB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するために、以下でM9培地と記される培地を使用する。この培地は、2%(w/v)グルコース、0.3%(w/v)KHPO、0.679%NaHPO、0.05%(w/v)NaCl、0.2%(w/v)NHCl、0.049%(w/v)MgSO・7HO、および0.1%(v/v)の微量元素溶液で構成される。これは、1.78%(w/v)FeSO・7HO、0.191%(w/v)MnCl・7HO、3.65%(w/v)HCl、0.187%(w/v)ZnSO・7HO、0.084%(v/v)NaEDTA・2HO、0.03%(v/v)HBO、0.025%(w/v)NaMoO・2HO、および0.47%(w/v)CaCl・2HOで構成される。NHOHを用いて培地のpHを7.4に調整し、続いて、オートクレーブにより培地を滅菌する(121℃、20分)。培養中のpHの調整は必要ない。シェーカーフラスコ中でのラムノリピド生産を調べるために、最初に前培養物を調製する。このために、LB寒天プレート上に新たに画線した株の接種ループを使用し、10mlのLB培地を100mlエルレンマイヤーフラスコ中に接種する。組換えP.プチダ(P. putida)株はすべて、50μg/mlのカナマイシンが添加されたLB培地中で培養した。P.プチダ(P. putida)株の培養を37℃および200rpmで一晩行う。前培養物を用いて250mlエルレンマイヤーフラスコ中の50mlのM9培地(+50μg/mlのカナマイシン)に接種する(開始時OD600 0.1)。培養物を200rpmおよび30℃で培養する。24時間間隔で、1mlのブロスのサンプルを培養フラスコから取り出す。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例4で説明したように行う。組換え株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB−BTH_II1077−II1080−II1081およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::AB−BTH_II1077−II1080−II1081は、株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABよりも有意に多量のモノラムノシル脂質を生成することが示される。このことから、B.タイランデンシス(B. thailandensis)E264由来のBTH_II1077−II1080−II1081の増幅により、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlABを含有するP.プチダ(P. putida)株中でのモノラムノシル脂質の生成が増大されることが実証される。さらに、組換え株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081は、株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABCおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABCよりも有意に多量のモノおよびジラムノシル脂質を生成することが示される。このことから、B.タイランデンシス(B. thailandensis)E264由来のBTH_II1077−I1080−II1081の増幅により、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlABCを含有するP.プチダ(P. putida)株中でのモノおよびジラムノシル脂質の生成が増大されることが証明される。最後に、株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB−BTH_II1077−II1080−II1081、およびP.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081が、対応する対照株P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::AB−BTH_II1077−II1080−II1081、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081よりも有意に少量のモノ−およびモノおよびジラムノシル脂質を生成し得るので、株P.プチダ(P. putida)KT2440と比較して株バックグラウンドP.プチダ(P. putida)GPp104中でのポリヒドロキシブチレート生成を低減することにより、増大されたラムノリピド生成がもたらされることが示される。
13.シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlB、pa1131、およびrhlCの異種発現用のベクターpBBR1MCS−2::ABCMの構築
シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlB、pa1131、およびrhlCの異種発現のために、プラスミドpBBR1MCS−2::ABCM(配列番号58)を構築した。このために、オリゴヌクレオチド
MFS2.0_xbaI_fw:5’−AGGAAATCTAGATGAGAGGCCGGCAAGGATAC−3’(配列番号60)
MFS2.0_XbaI_rev:5’−CCAGGTTCTAGACGCCAGGATTGAACAGTACC−3’(配列番号61)
を含有する株シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PAO1(DSM1707)のゲノムDNAから出発して、遺伝子pa1131(配列番号59)を増幅した。
New England Biolabs (Frankfurt)製のPhusionTM High-Fidelity Master Mixポリメラーゼを用いて、PCR産物(1483塩基対)の増幅を行った。XbaIを用いてPCR産物を切断し、Fast Link Ligation Kit (Epicentre Technologies; Madison, WI, USA)により、XbaIを用いて同様に切断されたベクターpBBR1MCS−2::ABC(配列番号40)中にライゲートした。得られた標的ベクターpBBR1MCS−2::ABCM(配列番号58)は、9892塩基対のサイズを有する。ベクターのインサートを配列決定した。製造業者の説明書に従ってDNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen; Hilden)により、染色体DNAを単離した。PCRの実施、アガロースゲル電気泳動によるPCR増幅の成功のチェック、DNAのエチジウムブロミド染色、PCR断片サイズの決定、PCR産物の精製、およびDNA濃度の決定は、当業者に公知の方法で行った。ベクターpBBR1MCS−2::ABCMを用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440およびGPp104の形質転換は、既報どおり行った(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABCMおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABCMと命名した。
14.シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707 pa1131遺伝子の過剰発現を用いたときと用いなかったときの組換えP.プチダ(P. putida)株によるラムノリピド生産の定量
実施例2および13で生成した組換え株P.プチダ(P. putida)の株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABCM、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABCMを、LB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養した。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例12で説明したように行った。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例4で説明したように行った。結果を以下の表に示す。
結果から、両方の株バックグラウンド(KT2440:野生型および不活性化されたポリヒドロキシブチレート生成を有するGPp104)でP.アエルギノサ(P. aeruginosa)遺伝子pa1131の過剰発現によりジおよびモノラムノシル脂質の増大された生成がもたらされることが示される。さらに、結果から、GPp104でのポリヒドロキシブチレート生成の低減により一般的にラムノシル脂質の増大された生成がもたらされることが示される。
15.コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707由来の遺伝子rhlAおよびrhlBの異種発現用のベクターpEC−XT99A::ABの構築
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707由来の遺伝子rhlAおよびrhlBの異種発現のために、プラスミドpEC−XT99A::AB(配列番号52)を構築する。このために、合成オペロンrhlAB(配列番号37)をGeneArt AG社(Regensburg)により合成し、市販のベクターpMA(GeneArt AG)中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707の既知のゲノム配列であった。ベクターpMA::ABから出発して、BamHIおよびXbaIを用いて合成オペロンをベクターから切断し、BglIIおよびXbaIを用いて切断された発現ベクターpEC−XT99A(米国特許第7118904号)中にライゲートする。得られるプラスミドpEC−XT99A::AB(配列番号52)は、9793塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックする。ベクターpEC−XT99A::ABを用いたC.グルタミカム(C. glutamicum)ATCC13032の形質転換は、既報どおり行う(Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989))。形質転換体の選択は、LBHIS寒天プレート(18.5g/lのブレインハートインフュージョンブロス、0.5Mソルビトール、5g/lのBactoトリプトン、2.5g/lのBacto酵母エキス、5g/lのNaCl、および18g/lのBacto寒天(5mg/lのテトラサイクリンが追加されたもの))上で行う。プレートを33℃で2日間培養した。プラスミドを有する得られた株をC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABと命名する。
16.コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707由来の遺伝子rhlA、rhlB、およびrhlCの異種発現用のベクターpEC−XT99A::ABCの構築
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707由来の遺伝子rhlA、rhlBおよびrhlCの異種発現のために、プラスミドpEC−XT99A::ABC(配列番号53)を構築する。このために、rhlABC(配列番号39)をGeneArt AG社(Regensburg)により合成し、市販のベクターpMA(GeneArt AG)中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707の既知のゲノム配列であった。ベクターpMA::ABCから出発して、BamHIおよびXbaIを用いて合成オペロンをベクターから切断し、BglIIおよびXbaIを用いて切断された発現ベクターpEC−XT99A(米国特許第7118904号)中にライゲートする。得られるプラスミドpEC−XT99A::ABC(配列番号53)は、10780塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックする。ベクターpEC−XT99A::ABCを用いたC.グルタミカム(C. glutamicum)ATCC13032の形質転換は、既報どおり行う(Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989))。形質転換体の選択は、LBHIS寒天プレート(18.5g/lのブレインハートインフュージョンブロス、0.5Mソルビトール、5g/lのBactoトリプトン、2.5g/lのBacto酵母エキス、5g/lのNaCl、および18g/lのBacto寒天(5mg/lのテトラサイクリンを用いて追加が行われたもの))上で行う。プレートを33℃で2日間培養した。プラスミドを有する得られた菌株をC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCと命名する。
17.コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707由来の遺伝子rhlA、rhlB、およびpa1131の異種発現用のベクターpEC−XT99A::ABMの構築
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707由来の遺伝子rhlA、rhlBおよびpa1131の異種発現のために、プラスミドpEC−XT99A::ABM(配列番号54)を構築する。このために、合成オペロンrhlABM(配列番号41)をGeneArt AG社(Regensburg)により合成し、市販のベクターpMA(GeneArt AG)中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707の既知のゲノム配列であった。ベクターpMA::ABMから出発して、BamHIおよびXbaIを用いて合成オペロンをベクターから切断し、BglIIおよびXbaIを用いて切断された発現ベクターpEC−XT99A(米国特許第7118904号)中にライゲートする。得られるプラスミドpEC−XT99A::ABM(配列番号54)は、11073塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックする。ベクターpEC−XT99A::ABMを用いたC.グルタミカム(C. glutamicum)ATCC13032の形質転換は、既報どおり行う(Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989))。形質転換体の選択は、LBHIS寒天プレート(18.5g/lのブレインハートインフュージョンブロス、0.5Mソルビトール、5g/lのBactoトリプトン、2.5g/lのBacto酵母エキス、5g/lのNaCl、および18g/lのBacto寒天(5mg/lのテトラサイクリンが追加されたもの))上で行う。プレートを33℃で2日間培養した。プラスミドを有する得られた菌株をC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABMと命名する。
18.コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707由来の遺伝子rhlA、rhlB、pa1131、およびrhlCの異種発現用のベクターpEC−XT99A::ABCMの構築
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707由来の遺伝子rhlA、rhlB、pa1131、およびrhlCの異種発現のために、プラスミドpEC−XT99A::ABCM(配列番号55)を構築する。このために、オリゴヌクレオチド
MFS2.0_xbaI_fw:5’−AGGAAATCTAGATGAGAGGCCGGCAAGGATAC−3’(配列番号60)
MFS2.0_XbaI_rev:5’−CCAGGTTCTAGACGCCAGGATTGAACAGTACC−3’(配列番号61)
を用いて株シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PAO1(DSM1707)のゲノムDNAから出発して、遺伝子pa1131(配列番号59)を増幅した。
New England Biolabs (Frankfurt)製のPhusionTM High-Fidelity Master Mixポリメラーゼを用いて、PCR産物(1483塩基対)の増幅を行った。XbaIを用いてPCR産物を切断し、Fast Link Ligation Kit (Epicentre Technologies; Madison, WI, USA)により、XbaIを用いて同様に切断されたベクターpBBR1MCS−2::ABC(配列番号40)中にライゲートした。得られた標的ベクターpEC−XT99A::ABCM(配列番号55)は、12263塩基対のサイズを有する。ベクターのインサートを配列決定した。製造業者の説明書に従ってDNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen; Hilden)により、染色体DNAを単離した。PCRの実施、アガロースゲル電気泳動によるPCR増幅の成功のチェック、DNAのエチジウムブロミド染色、PCR断片サイズの決定、PCR産物の精製、およびDNA濃度の決定は、当業者に公知の方法で行った。ベクターpEC−XT99A::ABCMを用いたC.グルタミカム(C. glutamicum)ATCC13032の形質転換は、既報どおり行う(Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989))。形質転換体の選択は、LBHIS寒天プレート(18.5g/lのブレインハートインフュージョンブロス、0.5Mソルビトール、5g/lのBactoトリプトン、2.5g/lのBacto酵母エキス、5g/lのNaCl、および18g/lのBacto寒天(5mg/lのテトラサイクリンが追加されたもの))上で行う。プレートを33℃で2日間インキュベートした。プラスミドを有する得られた株をC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCMと命名する。
19.C.グルタミカム(C. glutamicum)中での異種発現用のベクターpVWEX1::rfbBDACの構築
C.グルタミカム(C. glutamicum)中でのlacプロモーターの制御下のP.プチダ(P. putida)由来の遺伝子rfbBDACの異種発現のために、ベクターpVWEX1::rfbBDAC(配列番号57)を構築する。このために、XbaIを用いてベクターpBBR1MCS−2::rfbBDAC(配列番号45)を消化し、P.プチダ(P. putida)KT2440由来の遺伝子rfbBDACとlacプロモーターとを含有する断片(3840bp)を、XbaIで消化されたベクターpVWEX1(配列番号56)中にライゲートする。得られるプラスミドpVWEX1::rfbBDAC(配列番号57)は、12311塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックする。ベクターpVWEX1::rfbBDACを用いたC.グルタミカム(C. glutamicum)ATCC13032 pEC−XT99A、ATCC13032 pEC−XT99A::AB、ATCC13032 pEC−XT99A::ABM、ATCC13032 pEC−XT99A::ABC、およびATCC13032 pEC−XT99A::ABCMの形質転換は、既報どおり行う(Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989))。形質転換体の選択は、LBHIS寒天プレート(18.5g/lのブレインハートインフュージョンブロス、0.5Mソルビトール、5g/lのBactoトリプトン、2.5g/lのBacto酵母エキス、5g/lのNaCl、および18g/lのBacto寒天(5mg/lのテトラサイクリンおよび25mg/lのカナマイシンが追加されたもの))上で行う。プレートを33℃で2日間培養した。プラスミドを有する得られた株を、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A pVWEX1::rfbBDAC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDAC、およびC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCM pVWEX1::rfbBDACと命名する。
20.組換えC.グルタミカム(C. glutamicum)株によるラムノリピド生産の定量
実施例15〜19で生成したC.グルタミカム(C. glutamicum)株である組換え株C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::AB、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABM、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCM、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A pVWEX1::rfbBDAC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDAC、およびC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCM pVWEX1::rfbBDACを、5mg/lのテトラサイクリンおよび5mg/lのテトラサイクリンおよび25mg/lのカナマイシンを用いてLBHIS寒天プレート上で培養する。シェーカーフラスコ中でのラムノリピド生産を調べるために、最初に前培養物を調製する。このために、LBHIS寒天プレート上に新たに画線された株の接種ループを使用し、10mlのLBHIS培地(18.5g/lのブレインハートインフュージョンブロス、0.5Mソルビトール、5g/lのBactoトリプトン、2.5g/lのBacto酵母エキス、および5g/lのNaCl、これに5mg/lのテトラサイクリンまたは5mg/lのテトラサイクリンおよび25mg/lのカナマイシンが追加されている)を100mlエルレンマイヤーフラスコ中に接種する。株の培養を33℃および200rpmで一晩行う。翌朝、50mlのCGXII培地(5mg/lのテトラサイクリンまたは5mg/lのテトラサイクリンおよび25mg/lのカナマイシンを含有する)を1mlの前培養物と共に、バッフルを含有する500mlエルレンマイヤーフラスコ中に接種する(開始時OD600 0.1)。
CGXII培地:
・20g/lの(NHSO(Merck)
・5g/lの尿素(Merck)
・1g/lのKHPO(Merck)
・1g/lのKHPO(Merck)
・0.25g/lのMgSO・7HO(Merck)
・10mg/lのCaCl(Merck)
・42g/lのMOPS(Roth)
・0.2mg/lのビオチン(Merck)
・1ml/lの微量塩溶液
・NaOHを用いたpH7に調整する
・オートクレーブ処理後、1ml/lのプロトカテク酸(30g/l、希NaOH中溶解、滅菌濾過)および40g/lのグルコース(Merck)を添加する
微量塩溶液:
・10g/lのFeSO・7HO(Merck)
・10g/lのMnSO・HO(Merck)
・1g/lのZnSO・7HO(Merck)
・0.2g/lのCuSO・5HO(Merck)
・20mg/lのNiCl・6HO(Merck)
・溶解するために、HClを用いてpH1に酸性化する
培養物を200rpmおよび33℃で0.4〜0.6の光学濃度(600nm)まで培養する。この光学濃度で、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド;最終濃度1mM)の添加により、培養物を誘導する。後続発現を同様に33℃および200rpmで72時間行う。24時間間隔で、1mlのブロスのサンプルを培養フラスコから取り出す。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例4で説明したように行う。
C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99Aは、ラムノリピドを生産しないが、組換え株C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::AB、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABM、およびC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCMでは、ラムノリピドの生成を検出可能である。基準物質を利用して、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABおよびC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABMは、モノラムノシル脂質を生成するにすぎないが、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABM、およびC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCMは、ジラムノシル脂質およびモノラムノシル脂質を形成可能であることが示される。さらに、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABMおよびC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCMは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)由来のpa1131遺伝子の増幅を用いないそれぞれの基準株C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABおよびC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCよりも多量のモノラムノシル脂質またはジラムノシル脂質およびモノラムノシル脂質を生成可能であることが示される。さらに、株C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDAC、およびC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCM pVWEX1::rfbBDACは、P.プチダ(P. putida)由来のrfbBDA遺伝子の増幅をを用いない株C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABM、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABC、およびC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCMよりも有意に多量の、モノラムノシル脂質(C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::AB pVWEX1::rfbBDACおよびC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC)またはよりモノおよびジラムノシル脂質(C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDACおよびC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCM pVWEX1::rfbBDAC)を生成することが示される。
21.プラスミドpBBR1MCS−2、pBBR1MCS−2::AB、pBBR1MCS−2::ABC、pBBR1MCS−2::ABM、およびpBBR1MCS−2::ABCMを有するシュードモナス属(Pseudomonas)株の構築
プラスミドpBBR1MCS−2、pBBR1MCS−2::AB、pBBR1MCS−2::ABC、pBBR1MCS−2::ABM、およびpBBR1MCS−2::ABCMを、電気穿孔により、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166、およびシュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717中に組み込む。シュードモナス属(Pseudomonas)株の形質転換は、既報どおり行う(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。形質転換体の選択は、栄養寒天プレート(5g/lのペプトン、3g/lの肉抽出物、15g/lの寒天、pH7、これに50mg/lのカナマイシンが追加されている)上で行う。30℃、より正確には28℃で、プレートを2日間培養する。プラスミドを有する得られた株を、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::AB、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::AB、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABC、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABC、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABCM、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABCM、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABM、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABM、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABM、およびシュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABMと命名する。
22.組換えシュードモナス属(Pseudomonas)株によるラムノリピド生産の定量
実施例21で生成した組換え株シュードモナス属(Pseudomonas)株のシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::AB 50090、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::AB、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::AB、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABC、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABC、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABCM、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABCM、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABM、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABM、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABM、およびシュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABMを、LB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例12で説明したように行う。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例4で説明したように行う。
シュードモナス属(Pseudomonas)株シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2は、ラムノリピドを生産しないが、組換え株シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABおよびシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::AB、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::AB、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABM、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABM、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABMおよびシュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABMでは、モノラムノシル脂質の生成を検出可能であり、株シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABC、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABC、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABCM、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABCM、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABCMおよびシュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABCMでは、モノおよびジラムノシル脂質の生成を検出可能である。
さらに、より少量のモノラムノシル脂質が、組換えシュードモナス属(Pseudomonas)株シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABM、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABM、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABMシュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM、17717 pBBR1MCS−2::ABMにより、ならびに組換えシュードモナス属(Pseudomonas)株シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABCM、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABCM、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABCM、およびシュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABCMにより、生成され、P.アエルギノサ(P. aeruginosa)遺伝子pa1131を用いないそれぞれの基準株シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::AB、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::AB、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABおよびシュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::AB、ならびにシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)由来のpa1131遺伝子の増幅を用いないシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABC、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABC、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABC、およびシュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABCによるよりも少量のモノおよびジラムノシル脂質が生成される。
23.P.プチダ(P. putida)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PAO1、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PA7、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)1、およびバークホルデリア・タイランデンシス(Burkholderia thailandensis)E264由来の代替的rhlA、rhlB、およびrhlC遺伝子の異種発現用のベクターpBBR1MCS−2::ABPAO1−C1およびpBBR1MCS−2::ABPA7−CE264の構築
シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PAO1およびシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PA7由来の遺伝子rhlA、rhlB、およびrhlCの異種発現のために、プラスミドpBBR1MCS−2::ABPAO1(配列番号62)およびpBBR1MCS−2::ABPA7(配列番号63)を最初に構築する。このために、合成オペロンrhlABPAO1(配列番号64)およびrhlABPA7(配列番号65)をDNA 2.0社(Menlo Park, CA, U.S.A)により合成し、市販のベクターpJ294(DNA 2.0)中でインタークローン化する。合成のベースは、株シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PAO1およびシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PA7の既知のゲノム配列である。ベクターpJ294::ABPAO1およびpJ294::ABPA7から出発して、合成オペロンをKpnIおよびXbaIによりベクターから切断し、続いて、KpnIおよびXbaIを用いて切断された発現ベクターpBBR1MCS−2(配列番号49)(Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176)中にライゲートする。得られるプラスミドpBBR1MCS−2::ABPAO1(配列番号62)およびpBBR1MCS−2::ABPA7(配列番号63)は、7332および7354塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックする。第2の工程で、プラスミドpBBR1MCS−2::ABPAO1−C1(配列番号66)およびpBBR1MCS−2::ABPA7−CE264(配列番号67)を生産する。このために、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)1(配列番号68)およびバークホルデリア・タイランデンシス(Burkholderia thailandensis)E264(配列番号76)由来のrhlC遺伝子をDNA 2.0社(Menlo Park, CA, U.S.A)により合成し、市販のベクターpJ294(DNA 2.0)中にインタークローン化する。合成のベースは、株シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)1およびバークホルデリア・タイランデンシス(Burkholderia thailandensis)E264の既知のゲノム配列である。ベクターpJ294::C1およびpJ294::CE264から出発して、rhlC遺伝子をXbaおよびSacIによりベクターから切断し、続いて、XbaおよびSacIを用いて同様に切断されたベクターpBBR1MCS−2::ABPAO1(配列番号62)およびpBBR1MCS−2::ABPA7(配列番号63)中にライゲートする。得られるプラスミドpBBR1MCS−2::ABPAO1−C1(配列番号66)およびpBBR1MCS−2::ABPA7−CE264(配列番号67)は、8325および8335塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックする。ベクターpBBR1MCS−2、pBBR1MCS−2::ABPAO1−C1およびpBBR1MCS−2::ABPA7−CE264を用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440およびGPp104の形質転換は、既報どおり行う(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABPAO1−C1、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABPA7−CE264、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABPAO1−C1、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABPA7−CE264と命名する。
24.シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PAO1、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PA7、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)1、およびバークホルデリア・タイランデンシス(Burkholderia thailandensis)E264由来の代替的rhlA、rhlB、およびrhlC遺伝子を有する組換えP.プチダ(P. putida)株によるラムノリピド生産の定量
実施例23で生成した組換え株P.プチダ(P. putida)株をLB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例12で説明したように行う。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例4で説明したように行う。
株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2は、モノおよびジラムノシル脂質を生産できないが、株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABPAO1−C1、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABPA7−CE264、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABPAO1−C1、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABPA7−CE264は、モノさらにはジラムノシル脂質の両方を生成する。株は、ポリヒドロキシブチレート生成の低減により(P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABPAO1−C1およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABPA7−CE264)、ポリヒドロキシブチレート生成の低減がなされていない株(P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABPAO1−C1およびP.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABPA7−CE264)よりも多量のモノおよびジラムノシル脂質を生産可能であることが示される。
25.P.プチダ(P. putida)および大腸菌(E. coli)中でのP.プチダ(P. putida)rfbBDACオペロンの過剰発現用のベクターpBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC、およびpBBR1MCS−2::ABMC_rfbBDACの構築
P.プチダ(P. putida)および大腸菌(E. coli)中でのP.プチダ(P. putida)rfbBDACオペロンの過剰発現用のベクターpBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC、およびpBBR1MCS−2::ABMC_rfbBDACを構築するために、、P.プチダ(P. putida)rfbBDACオペロンをPCRにより最初に増幅した。ベクターpBBR1MCS−2::rfbBDAC(配列番号45)をPCR用のマトリックスとして機能させた。以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
RL_AgeI−fw:5’−TATATATAACCGGTATTAATGCAGCTGGCACGAC−3’(配列番号71)
RL_AgeI_rev:5’−GGCCGACCGGTACTAGTGGA−3’(配列番号72)
New England Biolabs (Frankfurt)のPhusionTM High-Fidelity Master Mixポリメラーゼを用いて、PCRを行った。当業者に公知の方法で行った。標的配列(lacプロモーターおよびrfbBDAC)をTrenzyme alligatorクローニングシステムでインタークローン化した。大腸菌(E. coli)DH5α(New England Biolabs; Frankfurt)形質転換体を選択し、さまざまな候補プラスミドDNAを単離し、配列決定した。配列をチェックし、妥当性を調べた後、AgeIを用いてベクターを切断した。標的断片を、従来のライゲーション方法により、AgeIを用いて同様に切断されたベクターpBBR1MCS−2::AB(配列番号38)、pBBR1MCS−2::ABM(配列番号42)、およびpBBR1MCS−2::ABMC(配列番号51)中にライゲートした。得られるベクターpBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC(配列番号73)、pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC(配列番号74)、およびpBBR1MCS−2::ABMC_rfbBDAC(配列番号75)は、11960、13289、および14250塩基対のサイズを有する。ベクターのインサートを配列決定した。PCRの実施、アガロースゲル電気泳動によるPCR増幅の成功のチェック、DNAのエチジウムブロミド染色、PCR断片サイズの決定、PCR産物の精製、およびDNA濃度の決定は、当業者に公知の方法で行った。ベクターpBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC、およびpBBR1MCS−2::ABMC_rfbBDACを用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440の形質転換は、既報どおり行った(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC、およびP.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMC_rfbBDACと命名する。
26.組換えP.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMC_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABM、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、およびP.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMCによるラムノリピド生産の定量
実施例2、7、および25で生成した組換え株のP.プチダ(P. putida)株をLB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例12で説明したように行う。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例4で説明したように行う。
P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB、およびP.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMは、モノラムノシル脂質を生成可能であるが、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMC_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、およびP.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMCは、モノおよびジラムノシル脂質を生成可能であることが示される。さらに、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABM、KT2440 pBBR1MCS−2::ABMC_rfbBDAC、およびKT2440 pBBR1MCS−2::ABMCは、、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)遺伝子pa1131の増幅を用いない対応する対照株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB、KT2440 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDAC、およびKT2440 pBBR1MCS−2::ABCよりも多量のモノおよびジラムノシル脂質を生成可能であることが示される。最後に、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMC_rfbBDACは、P.プチダ(P. putida)遺伝子rfbBDACの増幅を用いないそれぞれの対照株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABM、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMCよりも多量のモノラムノシル脂質(P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDACおよびP.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC)ならびにモノおよびジラムノシル脂質(P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACおよびP.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMC_rfbBDAC)を生成可能であることが示される。
27.組換え大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCM、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDAC、および大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCM_rfbBDACの生成
大腸菌(E. coli)W3110の形質転換は、電気穿孔により既報どおり行った(Miller JH. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Plainview, NY: Cold Spring HarborLab. Press; 1992)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して解析した。プラスミドを有する得られた株を、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCM、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDAC、および大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCM_rfbBDACと命名した。
28.組換え大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCM、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDAC、および大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCM_rfbBDACによるラムノリピド生産の定量
実施例27で生成した組換え大腸菌(E. coli)株をLB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例10で説明したように行う。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例4で説明したように行う。
大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、および大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDACは、モノラムノシル脂質を生成可能であるが、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCM、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDAC、および大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCM_rfbBDACは、モノおよびジラムノシル脂質を生成可能であることが示される。さらに、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABMおよび大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDACは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)遺伝子pa1131の増幅を用いない大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB、および大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDACよりも多量のモノラムノシル脂質を生成することが示される。さらに、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCMおよび大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCM_rfbBDACは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)遺伝子pa1131の増幅を用いない大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCおよび大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACよりも多量のモノおよびジラムノシル脂質を生成することが示される。さらに、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABMおよび大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDACは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)遺伝子pa1131の増幅を用いない大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABおよび大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDACよりも多量のモノラムノシル脂質を生成することが示される。最後に、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACおよび大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCM_rfbBDACは、P.プチダ(P. putida)遺伝子rfbBDACの増幅を用いないそれぞれの対照株大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC、および大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCMよりも多量のモノラムノシル脂質(大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC)ならびにモノおよびジラムノシル脂質(大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACおよび大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCM_rfbBDAC)を生成することが示される。

Claims (16)

  1. 一般式(I)

    (式中、
    m=2、1、または0、
    n=1または0、
    およびR=互いに独立して2〜24個の炭素原子を有する同一または異なる有機基)
    で示される少なくとも1種のラムノリピドを生成可能な細胞であって、
    野生型と比較して、酵素E、E、およびEの少なくともの1つの増大された活性を有するように遺伝子改変されたものであり、かつ、
    野生型と比較して、酵素Eの増大された活性を有することを特徴とし、
    前記酵素Eが、3−ヒドロキシアルカノイル−ACPから3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカン酸−ACPを経由するヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカン酸への変換を触媒可能であり、
    前記酵素Eが、ラムノシルトランスフェラーゼIであり、かつdTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートからα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒可能であり、
    前記酵素Eが、ラムノシルトランスフェラーゼIIであり、かつdTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートからα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒可能であり、
    前記酵素Eが、細胞から周囲培地中への一般式(I)で示されるラムノリピドの輸送を触媒する、配列番号8のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号8と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号8を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチドであることを特徴とする、細胞。
  2. 前記酵素Eが、
    ポリペプチド配列の配列番号2を有する酵素E1a、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号2と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号2を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E1a
    ポリペプチド配列の配列番号18を有する酵素E1b、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号18と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号18を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E1b
    ポリペプチド配列の配列番号78を有する酵素E1c、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号78と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号78を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E1c
    ポリペプチド配列の配列番号80を有する酵素E1d、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号80と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号80を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E1d;および
    ポリペプチド配列の配列番号82を有する酵素E1e、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号82と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号82を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E1e
    からなる群から選択される少なくとも1種の酵素であり、
    前記酵素Eが:
    ポリペプチド配列の配列番号4を有する酵素E2a、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号4と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号4を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E2a
    ポリペプチド配列の配列番号20を有する酵素E2b、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号20と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号20を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E2b
    ポリペプチド配列の配列番号84を有する酵素E2c、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号84と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号84を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E2c
    ポリペプチド配列の配列番号86を有する酵素E2d、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号86と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号86を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E2d;および
    ポリペプチド配列の配列番号88を有する酵素E2e、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号88と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号88を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E2e
    からなる群から選択される少なくとも1種の酵素であり、
    前記酵素Eが:
    ポリペプチド配列の配列番号6を有する酵素E3a、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号6と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号6を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E3a
    ポリペプチド配列の配列番号22を有する酵素E3b、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号22と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号22を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E3b
    ポリペプチド配列の配列番号90を有する酵素E3c、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号90と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号90を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E3c;および
    ポリペプチド配列の配列番号92を有する酵素E3d、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号92と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号92を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E3d
    からなる群から選択される少なくとも1種の酵素であることを特徴とする、請求項1に記載の細胞。
  3. m=1または0、
    n=1、
    およびRは、互いに独立して、同一または異なる、分枝状または直鎖状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の2〜24炭素原子を有するアルキル基
    である、請求項1または2に記載の細胞。
  4. 、E、およびE
    から選択される酵素の組合せの増大された活性を有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞。
  5. 前記酵素の組合せ

    の増大された活性を有し、かつ
    nが=1である
    ことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞。
  6. アスペルギルス属(Aspergillus)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、バチルス属(Bacillus)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、パラコッカス属(Paracoccus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、カンジダ属(Candida)、ピキア属(Pichia)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、クルイベロマイセス属(Kluyveromyces)、サッカロマイセス属(Saccharomyces)、エシェリキア属(Escherichia)、ザイモモナス属(Zymomonas)、ヤロウイア属(Yarrowia)、メチロバクテリウム属(Methylobacterium)、ラルストニア属(Ralstonia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、ロドスピリラム属(Rhodospirillum)、ロドバクター属(Rhodobacter)、バークホルデリア属(Burkholderia)、クロストリジウム属(Clostridium)、およびカプリアビ
    ダス属(Cupriavidus)からなる群の属から選択されることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の細胞。
  7. 野生型の細胞が、C〜C16の鎖長を有するポリヒドロキシアルカノエートを生成可能であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
  8. 野生型と比較して、より少量のポリヒドロキシアルカノエートを生成可能であるように遺伝子改変されたものであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
  9. 前記細胞が、その野生型と比較して、少なくとも1種の酵素EまたはE10の低減された活性を有し、ここで、
    が、3−ヒドロキシアルカノイル−補酵素Aからポリ−3−ヒドロキシアルカン酸への変換能力を有するポリヒドロキシアルカン酸シンターゼEC:2.3.1.、配列番号30もしくは配列番号32の配列を有するポリペプチド、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号30もしくは配列番号32と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号30もしくは配列番号32を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチドであり、かつ
    10が、3−ヒドロキシアルカノイル−ACPから3−ヒドロキシアルカナノイル−補酵素Aへの変換能力を有する3−ヒドロキシアルカノイル−ACP:補酵素A転移酵素、配列番号34もしくは配列番号36の配列を有するポリペプチド、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号34もしくは配列番号36と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号34もしくは配列番号36を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチドである
    ことを特徴とする、請求項7または8に記載の細胞。
  10. 前記細胞が、P.プチダ(P. putida)GPp121、P.プチダ(P. putida)GPp122、P.プチダ(P. putida)GPp123、P.プチダ(P. putida)GPp124、およびP.プチダ(P. putida)GPp104、P.プチダ(P. putida)KT42C1、P.プチダ(P. putida)KTOY01またはP.プチダ(P. putida)KTOY02からなる群から選択されることを特徴とする、請求項6に記載の細胞。
  11. 野生型と比較して、酵素E、E、EおよびEの少なくとも1つの増大された活性を有する請求項1〜10のいずれか一項に記載の細胞であって、
    前記酵素Eが、dTTP:α−D−グルコース−1−リン酸チミジリルトランスフェラーゼ、EC2.7.7.24、配列番号10の配列を有するポリペプチド、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号10と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号10を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチドであり、
    前記酵素Eが、dTTP−グルコース−4,6−ヒドロリアーゼ、EC4.2.1.46、配列番号12の配列を有するポリペプチド、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号12と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号12を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチドであり、
    前記酵素Eが、dTDP−4−デヒドロラムノース−3,5−エピメラーゼ、EC5.1.3.13、配列番号14の配列を有するポリペプチド、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号14と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号14を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチドであり、
    前記酵素Eが、dTDP−4−デヒドロラムノースレダクターゼ、EC1.1.1.133、配列番号16の配列を有するポリペプチド、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号16と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号16を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチドであることを特徴とする、細胞。
  12. 3つのグループ[A1〜E1]、[A2〜E2]、および[A3〜E3]の少なくともの1つから選択される配列を含有し、かつ、
    グループ[A8〜E8]から選択される配列を含有する、単離された核酸であって、
    グループ[A1〜E1]が、以下の配列:
    A1)配列番号1または17で表される配列であって、3−ヒドロキシデカノイル−ACPから3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
    B1)配列番号1または17で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、A1)に記載したのと同一の変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
    C1)配列番号2または18で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする配列、
    D1)配列番号2または18で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、3−ヒドロキシアルカノイル−ACPから3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカン酸−ACPを経由するヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列
    1)グループA1)〜1)の1つに属する配列に対する相補的配列、
    で構成され、
    グループ[A2〜2]が、以下の配列:
    A2)配列番号3または19で表される配列であって、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
    B2)配列番号3または19で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、A2)に記載したのと同一の変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
    C2)配列番号4または20で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする配列、
    D2)配列番号4または20で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートからα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒可能であるタンパク質またはペプチドをコードする配列
    2)グループA2)〜2)の1つに属する配列に対する相補的配列、
    で構成され、かつ
    グループ[A3〜3]が、以下の配列:
    A3)配列番号5または21で表される配列であって、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
    B3)配列番号5または21で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、A3)に記載したのと同一の変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
    C3)配列番号6または22で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする配列、
    D3)配列番号6または22で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートからα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートへの変換を行い得るタンパク質をコードする配列
    3)グループA3)〜3)の1つに属する配列に対する相補的配列、
    で構成され、
    グループ[A8〜8]が、以下の配列:
    A8)配列番号59で表される配列であって、細胞から周囲培地中への一般式(I)で示されるラムノリピドの輸送を触媒するタンパク質またはペプチドをコードする配列、
    B8)配列番号59で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、A8)に記載したのと同一の輸送を触媒するタンパク質またはペプチドをコードする配列、
    C8)配列番号8で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする配列、
    D8)配列番号8で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、細胞から周囲培地中への一般式(I)で示されるラムノリピドの輸送を触媒するタンパク質またはペプチドをコードする配列
    8)グループA8)〜8)の1つに属する配列に対する相補的配列、
    で構成され、
    ここで、一般式(I)のラムノリピドが以下の式:

    (式中、
    m=2、1、または0、
    n=1または0、
    およびR=互いに独立して2〜24個の炭素原子を有する同一または異なる有機基)
    で示される、単離された核酸。
  13. 配列番号42の核酸配列および請求項12に記載の核酸の配列から選択される少なくとも1種の核酸配列を含む、ベクター、発現ベクターまたは遺伝子過剰発現カセット。
  14. 請求項12に記載の少なくとも1種の核酸を含有することを特徴とする、請求項1〜11のいずれか一項に記載の細胞。
  15. 以下の工程:
    I)請求項1〜11のいずれか一項に記載の細胞を、炭素源を含有する培地と接触させる工程と、
    II)前記細胞による前記炭素源からのラムノリピドの生成を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程と、
    III)任意選択により、生成された前記ラムノリピドを単離する工程と、
    を含む、一般式(I)で示されるラムノリピドの生産方法。
  16. 化粧製剤、皮膚製剤、または医薬製剤の生産、植物保護製剤の生産、あるいはケア剤または清浄剤または界面活性剤濃縮物の生産のための、請求項15に記載の方法を用いて得られるラムノリピドの使用。
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