JP6461078B2 - ラムノリピドを生産するための細胞および方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ラムノリピドを生産するための細胞および核酸ならびにそれらの使用、およびラムノリピドを生産するための方法に関する。
界面活性剤は、現在、本質的には石油化学原料を主原料として生産される。再生可能原料系の界面活性剤の使用は、石油化学原料の不足が予見できるためおよび再生可能原料系または生分解性の製品の需要が増大しているため、好適な代替手段である。ラムノリピドは、1個(モノラムノシル脂質)または2個のラムノース基(ジラムノシル脂質)と、1個または2個の3−ヒドロキシ脂肪酸残基とで構成される(Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, pages 3037-51を参照されたい)。それは、界面活性剤として使用するためのあらゆる種類の用途で必要とされる界面活性を有する(Leitermann et al., 2009を参照されたい)。これらの脂質は、現在、さまざまなヒト病原性細菌および動物病原性細菌の野生型単離株、特定的にはシュードモナス属(Pseudomonas)およびバークホルデリア属(Burkholderia)の代表種を用いて、生産される(Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, pages 3037-51を参照されたい)。これらの生産生物が疾患を引き起こし得るという事実により、従来方式で生産されたラムノリピドの顧客満足度は、かなり著しく低減される。さらに、より高い安全性要件も、設備投資の増大および追加の後処理工程の可能性に起因して生産コストに影響を及ぼす。これらの生産生物を利用してある程度高い産物濃度さらには空時収率および/または炭素収率を達成することが可能であるが、これは、単独基質または共基質として植物油の使用を必要とする(Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, pages 3037-51を参照されたい)。しかしながら、植物油は、たとえば、グルコース、スクロース、もしくはポリサッカリド(たとえば、デンプン、セルロース、ヘミセルロースなど)、グリセロール、CO、CO2、またはCH4などの他の炭素源と対比して、比較的高価な原料である。さらに、ラムノリピドは、発酵プロセスで激しい起泡を生じやすいという界面活性剤の特性が顕著である。このことは、とくに、親油性基質が利用される場合にあてはまる。この問題は、たとえば、グルコース、スクロース、ポリサッカリド(デンプン、セルロース、ヘミセルロース)、またはグリセロールなどの水溶性基質の使用では、著しく軽減される。最後に、野生型単離株により生産されるラムノリピドの性質には、限られた範囲内で影響を及ぼし得るにすぎない。現在までのところ、これは、もっぱら、プロセス管理の最適化を介して行われる(pH、酸素供給量、培地組成、供給戦略、窒素供給量、温度、基質の選択など)。しかしながら、用途に適合する産物の性質に調整できるように、たとえば、種々のラムノリピド種の比(ラムノースおよび3−ヒドロキシ脂肪酸基の数)または3−ヒドロキシ脂肪酸基の鎖長および飽和度などの産物の特定の性質に非常に特定的な影響を及ぼすことが望ましいであろう。ラムノリピドは、家庭用途、清浄化用途、化粧用途、食品加工用途、医薬用途、植物保護用途、および他の用途で界面活性剤として広範に利用されることになれば、現在利用されている界面活性剤と競合した状態になるのは避けられない。これらは、非常に低コストで、顧客に対して明らかな健康リスクがなく、かつ明確に規定された調整可能な製品仕様で生産可能な大量化学品である。したがって、ラムノリピドもまた、できるかぎり低コストで、顧客に対して健康リスクがなく、かつできるかぎり詳細に規定された性質をもたせて、生産されなければならない。ラムノリピドは、たとえば、グルコースやグリセロールなどの便利な炭素源に基づいて、GRAS生物(generally regarded as save)ですでに生産されているが、これは、この場合、もっぱら、モノラムノシル脂質である(Ochsner et al. Appl. Environ. Microbiol. 1995. 61(9):3503-3506)。一方、Cha et al. in Bioresour Technol. 2008. 99(7):2192-9には、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)由来の遺伝子rhlAおよびrhlBの導入によるP.プチダ(P. putida)におけるダイズ油からのモノラムノシル脂質の生産が記載されている。
驚くべきことに、以下に説明される細胞およびこの細胞を利用した方法が、明示された本発明の目的の解決に寄与することを見いだした。したがって、本発明は、ラムノリピドを生成可能であり、かつ野生型と比較して遺伝子産物rhlA、rhlB、およびrhlCの相同体の遺伝子産物の少なくとも1つの増大された活性を有する細胞に関する。本発明はさらに、生体触媒としての以上に挙げた細胞と単純な炭素源とを用いたラムノリピドの生産方法に関する。
(式中、
m=2、1、または0、特定的には1または0、
n=1または0、特定的には1、
R1およびR2=互いに独立して2〜24個、好ましくは5〜13個の炭素原子を有する同一または異なる有機基、特定的には、任意選択により分枝状、任意選択により置換型、特定的にはヒドロキシ置換型、任意選択により不飽和、特定的には任意選択によりモノ、ジ、またはトリ不飽和のアルキル基、好ましくは、ペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニル、およびトリデセニル、ならびにo=1〜23、好ましくは4〜12の(CH2)o−CH3からなる群から選択されるもの)
で示される少なくとも1種のラムノリピドまたはその塩を生成可能な細胞、好ましくは単離細胞によりなされ、それは、野生型と比較して、酵素E1、E2、およびE3の少なくともの1つの増大された活性を有するように遺伝子改変されたものであり、ここで、酵素E1は、3−ヒドロキシアルカノイル−ACPから3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカン酸−ACPを経由するヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカン酸への変換を触媒可能であり、酵素E2は、ラムノシルトランスフェラーゼIであり、かつdTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートからα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒可能であり、酵素E3は、ラムノシルトランスフェラーゼIIであり、かつdTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートからα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒可能であり、ここで、これらの酵素E1、E2、およびE3は、好ましくは、
ポリペプチド配列の配列番号2を有する酵素E1a、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号2と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号2を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E1a、ただし、酵素E1aの酵素活性は、好ましくは3−ヒドロキシデカノイル−ACPから3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸−ACPを経由するヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号18を有する酵素E1b、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号18と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号18を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E1b、ただし、酵素E1bの酵素活性は、好ましくは3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸−ACPを経由するヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号78を有する酵素E1c、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号78と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号78を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E1c、ただし、酵素E1cの酵素活性は、好ましくは3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸−ACPを経由するヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号80を有する酵素E1d、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号80と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号80を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E1d、ただし、酵素E1dの酵素活性は、好ましくは3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸−ACPを経由するヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号82を有する酵素E1e、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号82と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号82を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E1e、ただし、酵素E1eの酵素活性は、好ましくは3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸−ACPを経由するヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
から選択される少なくとも1種の酵素E1と、
ポリペプチド配列の配列番号4を有する酵素E2a、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号4と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号4を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E2a、ただし、酵素E2aの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号20を有する酵素E2b、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号20と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号20を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E2b、ただし、酵素E2bの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号84を有する酵素E2c、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号84と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号84を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E2c、ただし、酵素E2cの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号86を有する酵素E2d、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号86と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号86を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E2d、ただし、酵素E2dの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号88を有する酵素E2e、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号88と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号88を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E2e、ただし、酵素E2eの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
から選択されるポリペプチド配列を有する少なくとも1種の酵素E2と、
ポリペプチド配列の配列番号6を有する酵素E3a、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号6と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号6を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E3a、ただし、酵素E3aの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号22を有する酵素E3b、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号22と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号22を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E3b、ただし、酵素E3bの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号90を有する酵素E3c、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号90と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号90を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E3c、ただし、酵素E3cの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号92を有する酵素E3d、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号92と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号92を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には92%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E3d、ただし、酵素E3dの酵素活性は、好ましくはdTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
から選択される少なくとも1種の酵素E3と、
からなる群から選択される。
E1、E2、E3、E1E2、E1E3、E2E3、およびE1E2E3
の増大された活性を有する本発明に係る細胞が好ましく、このうち、組合せ
E2、E2E3、およびE1E2E3、特定的にはE1E2E3
は、とくに好ましい。
http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm、
に列挙された属に属し、本発明に好適な酵母は、
http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm
に列挙された属に属し、本発明に好適な菌類は、
http://www.dsmz.de/species/fungi.htm
に列挙されたものである。
ここで、E9は、ポリヒドロキシアルカン酸シンターゼEC:2.3.1.であり、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号30もしくは配列番号32を有するもの、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号30もしくは配列番号32と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号30もしくは配列番号32を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有するものを表し、ただし、酵素E9の酵素活性は、3−ヒドロキシアルカノイル−補酵素Aからポリ−3−ヒドロキシアルカン酸への変換能力、特定的には、3−ヒドロキシテトラデカノイル−補酵素Aからポリ−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとし、
E10は、3−ヒドロキシアルカノイル−ACP:補酵素A転移酵素、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号34もしくは配列番号36を有するもの、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号34もしくは配列番号36と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号34もしくは配列番号36を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有するものを表し、ただし、酵素E10の酵素活性は、3−ヒドロキシアルカノイル−ACPから3−ヒドロキシアルカナノイル−補酵素Aへの変換能力、特定的には、3−ヒドロキシアルカナノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−補酵素Aへの変換能力を意味するとみなされるものとする。
は、3−ヒドロキシオクタノイル−3−ヒドロキシオクタン酸、3−ヒドロキシオクタノイル−3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシオクタン酸、3−ヒドロキシオクタノイル−3−ヒドロキシデセン酸、3−ヒドロキシデセノイル−3−ヒドロキシオクタン酸、3−ヒドロキシオクタノイル−3−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシドデカノイル−3−ヒドロキシオクタン酸、3−ヒドロキシオクタノイル−3−ヒドロキシドデセン酸、3−ヒドロキシドデセノイル−3−ヒドロキシオクタン酸、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデセン酸、3−ヒドロキシデセノイル−3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシデセノイル−3−ヒドロキシデセン酸、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシドデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシドデセン酸3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシテトラデセン酸、3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシデセン酸、3−ヒドロキシドデセノイル−3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸、3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシテトラデセン酸、3−ヒドロキシテトラデセノイル−3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシドデカノイル−3−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシドデセノイル−3−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシドデカノイル−3−ヒドロキシドデセン酸、3−ヒドロキシドデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸、3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸、3−ヒドロキシヘキサデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸、3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシヘキサデカン酸、または3−ヒドロキシヘキサデカノイル−3−ヒドロキシヘキサデカン酸から誘導されることが好ましい。
少なくとも1種の酵素E4、dTTP:α−D−グルコース−1−リン酸チミジリルトランスフェラーゼ、EC2.7.7.24、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号10を有するもの、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号10と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号10を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有するもの、ただし、酵素E4の酵素活性は、α−D−グルコース−1−リン酸およびdTTPからdTDP−グルコースへの変換能力を意味するとみなされるものとする、
少なくとも1種の酵素E5、dTTP−グルコース−4,6−ヒドロリアーゼ、EC4.2.1.46、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号12を有するもの、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号12と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号12を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有するもの、ただし、酵素E5の酵素活性は、dTDP−グルコースからdTDP−4−デヒドロ−6−デオキシ−D−グルコースへの変換能力を意味するとみなされるものとする、
少なくとも1種の酵素E6、dTDP−4−デヒドロラムノース−3,5−エピメラーゼ、EC5.1.3.13、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号14を有するもの、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号14と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号14を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有するもの、ただし、酵素E6の酵素活性は、dTDP−4−デヒドロ−6−デオキシ−D−グルコースからdTDP−4−デヒドロ−6−デオキシ−L−マンノースへの変換能力を意味するとみなされるものとする、ならびに
少なくとも1種の酵素E7、dTDP−4−デヒドロラムノースレダクターゼ、EC1.1.1.133、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号16を有するもの、またはアミノ酸基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号16と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号16を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは50%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を有するポリペプチド配列を有するもの、ただし、酵素E7の酵素活性は、dTDP−4−デヒドロ−6−デオキシ−L−マンノースからdTDP−6−デオキシ−L−マンノースへの変換能力を意味するとみなされるものとする。
I)本発明に係る細胞を、炭素源を含有する培地と接触させる工程と、
II)細胞による炭素源からのラムノリピドの生成を可能にする条件下で細胞を培養する工程と、
III)任意選択により、生成されたラムノリピドを単離する工程と、
を含む、一般式(I)
(式中、
m=2、1、または0、特定的には1または0、
n=1または0、特定的には1、
R1およびR2=互いに独立して2〜24個、好ましくは5〜13個の炭素原子を有する同一または異なる有機基、特定的には、任意選択により分枝状、任意選択により置換型、特定的にはヒドロキシ置換型、任意選択により不飽和、特定的には任意選択によりモノ、ジ、またはトリ不飽和のアルキル基、好ましくは、ペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニル、およびトリデセニル、ならびにo=1〜23、好ましくは4〜12を有する(CH2)o−CH3からなる群から選択されるもの)
で示されるラムノリピドの生産方法である。
ここで、
グループ[A1〜G1]は、以下の配列:
A1a)配列番号1で表される配列、ただし、この配列は、3−ヒドロキシデカノイル−ACPから3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B1a)A1a)に属する配列に由来し、かつ配列番号1で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C1a)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは3−ヒドロキシデカノイル−ACPから3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D1a)グループA1a)〜C1a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1a)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシデカノイル−ACPから3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E1a)グループA1a)〜D1a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1a)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシデカノイル−ACPから3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F1a)少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは、少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる、グループA1a)〜E1a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1a)に属する配列の誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、3−ヒドロキシデカノイル−ACPから3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
G1a)グループA1a)〜F1a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1a)に属する配列に対する相補的配列、
A1b)配列番号17で表される配列、ただし、この配列は、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B1b)A1b)に属する配列に由来し、かつ配列番号17で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C1b)配列番号18で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D1b)グループA1b)〜C1b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1b)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E1b)グループA1b)〜D1b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1b)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F1b)グループA1b)〜E1b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1b)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G1b)グループA1b)〜F1b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1b)に属する配列に対する相補的配列、ならびに
A1c)配列番号77で表される配列、ただし、この配列は、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B1c)A1c)に属する配列に由来し、かつ配列番号77で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C1c)配列番号78で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D1c)グループA1c)〜C1c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1c)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E1c)グループA1c)〜D1c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1c)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F1c)グループA1c)〜E1c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1c)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G1c)グループA1c)〜F1c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1c)に属する配列に対する相補的配列、ならびに
A1d)配列番号79で表される配列、ただし、この配列は、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B1d)A1d)に属する配列に由来し、かつ配列番号79で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C1d)配列番号80で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D1d)グループA1d)〜C1d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1d)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E1d)グループA1d)〜D1d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1d)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F1d)グループA1d)〜E1d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1d)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G1d)グループA1d)〜F1d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1d)に属する配列に対する相補的配列、ならびに
A1e)配列番号81で表される配列、ただし、この配列は、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B1e)A1e)に属する配列に由来し、かつ配列番号81で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C1e)配列番号82で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D1e)グループA1e)〜C1e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1e)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E1e)グループA1e)〜D1e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1e)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F1e)グループA1e)〜E1e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1e)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPから3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G1e)グループA1e)〜F1e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA1e)に属する配列に対する相補的配列、
で構成され、かつ
グループ[A2〜G2]は、以下の配列:
A2a)配列番号3で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B2a)A2a)に属する配列に由来し、かつ配列番号3で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C2a)配列番号4で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D2a)グループA2a)〜C2a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2a)に属する配列と少なくとも80%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E2a)グループA2a)〜D2a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2a)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F2a)グループA2a)〜E2a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2a)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
G2a)グループA2a)〜F2a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2a)に属する配列に対する相補的配列、
A2b)配列番号19で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B2b)A2b)に属する配列に由来し、かつ配列番号19で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C2b)配列番号20で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D2b)グループA2b)〜C2b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2b)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E2b)グループA2b)〜D2b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2b)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F2b)グループA2b)〜E2b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2b)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G2b)グループA2b)〜F2b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2b)に属する配列に対する相補的配列、
A2c)配列番号83で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B2c)A2c)に属する配列に由来し、かつ配列番号83で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C2c)配列番号84で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D2c)グループA2c)〜C2c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2c)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E2c)グループA2c)〜D2c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2c)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F2c)グループA2c)〜E2c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2c)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G2c)グループA2c)〜F2c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2c)に属する配列に対する相補的配列、
A2d)配列番号85で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B2d)A2d)に属する配列に由来し、かつ配列番号85で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C2d)配列番号86で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D2d)グループA2d)〜C2d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2d)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E2d)グループA2d)〜D2d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2d)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F2d)グループA2d)〜E2d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2d)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G2d)グループA2d)〜F2d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2d)に属する配列に対する相補的配列、ならびに
A2e)配列番号87で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B2e)A2e)に属する配列に由来し、かつ配列番号87で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C2e)配列番号88で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D2e)グループA2e)〜C2e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2e)に属する配列と少なくとも70%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換
を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E2e)グループA2e)〜D2e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2e)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F2e)グループA2e)〜E2e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2e)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G2e)グループA2e)〜F2e)の1つに属する、とくに好ましくはグループA2e)に属する配列に対する相補的配列、
で構成され、かつ
グループ[A3〜G3]は、以下の配列:
A3a)配列番号5で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B3a)A3a)に属する配列に由来し、かつ配列番号5で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C3a)配列番号6で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D3a)グループA3a)〜C3a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3a)に属する配列と少なくとも80%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E3a)グループA3a)〜D3a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3a)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F3a)グループA3a)〜E3a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3a)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
G3a)グループA3a)〜F3a)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3a)に属する配列に対する相補的配列、
A3b)配列番号21で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B3b)A3b)に属する配列に由来し、かつ配列番号21で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C3b)配列番号22で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D3b)グループA3b)〜C3b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3b)に属する配列と少なくとも60%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E3b)グループA3b)〜D3b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3b)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F3b)グループA3b)〜E3b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3b)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G3b)グループA3b)〜F3b)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3b)に属する配列に対する相補的配列、
A3c)配列番号89で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B3c)A3c)に属する配列に由来し、かつ配列番号89で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C3c)配列番号90で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D3c)グループA3c)〜C3c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3c)に属する配列と少なくとも60%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E3c)グループA3c)〜D3c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3c)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F3c)グループA3c)〜E3c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3c)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G3c)グループA3c)〜F3c)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3c)に属する配列に対する相補的配列、ならびに
A3d)配列番号91で表される配列、ただし、この配列は、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
B3d)A3d)に属する配列に由来し、かつ配列番号91で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
C3d)配列番号92で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D3d)グループA3d)〜C3d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3d)に属する配列と少なくとも60%まで、とくに好ましくは少なくとも90%まで、さらに好ましくは少なくとも95%まで、最も好ましくは少なくとも99%まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
E3d)グループA3d)〜D3d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3d)に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
F3d)グループA3d)〜E3d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3d)に属する配列の少なくとも1個の塩基、好ましくは少なくとも2個の塩基、さらに好ましくは少なくとも5個の塩基、最も好ましくは少なくとも10個の塩基の、ただし、好ましくは100個以下の塩基、とくに好ましくは50個以下の塩基、最も好ましくは25個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および/または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシテトラデカノイル−3−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
G3d)グループA3d)〜F3d)の1つに属する、とくに好ましくはグループA3d)に属する配列に対する相補的配列、
で構成される。
期待値閾値:10
ワードサイズ:28
マッチスコア:1
ミスマッチスコア:−2
ギャップコスト:Linear
以上のパラメーターは、ヌクレオチド配列比較でのデフォルトパラメーターである。GAPプログラムも同様に、以上のパラメーターで使用するのに好適である。
期待値閾値:10
ワードサイズ:3
マトリックス:BLOSUM62
ギャップコスト:Existence:11;Extension:1
組成調整:Conditional compositional score matrix adjustment
1.シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)1707遺伝子rhlAおよびrhlBの異種発現用のベクターpBBR1MCS−2::ABの構築
シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlAおよびrhlBの異種発現のために、プラスミドpBBR1MCS−2::AB(配列番号38)を構築した。このために、合成オペロンrhlAB(配列番号37)をGeneArt AG社(Regensburg)により合成し、市販のベクターpMA(GeneArt AG)中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707の既知のゲノム配列であった。ベクターpMA::ABから出発して、合成オペロンをBglIIおよびXbaIによりベクターから切断し、続いて、BamHIおよびXbaIで切断された発現ベクターpBBR1MCS−2(配列番号49)中にライゲートした(Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad host range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176に記載されている)。得られるプラスミドpBBR1MCS−2::AB(配列番号38)は、7422塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行った。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックした。ベクターpBBR1MCS−2(配列番号49)およびpBBR1MCS−2::ABを用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440およびGPp104の形質転換は、既報どおり行った(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個のクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABと命名した。
シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlB、およびrhlCの異種発現のために、プラスミドpBBR1MCS−2::ABC(配列番号40)を構築した。このために、rhlABC(配列番号39)をGeneArt AG社(Regensburg)により合成し、市販のベクターpMA(GeneArt AG)中にインタークローン化した(intercloned)。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707の既知のゲノム配列であった。ベクターpMA::ABCから出発して、合成オペロンをBglIIおよびXbaIによりベクターから切断し、続いて、BamHIおよびXbaIで切断された発現ベクターpBBR1MCS−2(配列番号49)中にライゲートした(Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad host range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176)。得られるプラスミドpBBR1MCS−2::ABC(配列番号40)は、8409塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行った。インサート(insert)の信頼性は、DNA配列解析によりチェックした。ベクターpBBR1MCS−2::ABCを用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440およびGPp104の形質転換は、既報どおり行った(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABCおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABCと命名した。
シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlB、およびpa1131の異種発現のために、プラスミドpBBR1MCS−2::ABM(配列番号42)を構築した。このために、合成オペロンrhlAB−pa1131(配列番号41)をGeneArt AG社(Regensburg)により合成し、市販のベクターpMA(GeneArt AG)中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707の既知のゲノム配列であった。ベクターpMA::ABMから出発して、合成オペロンをBglIIおよびXbaIによりベクターから切断し、続いて、BamHIおよびXbaIで切断された発現ベクターpBBR1MCS−2(配列番号49)中にライゲートした(Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad host range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176)。得られるプラスミドpBBR1MCS−2::ABM(配列番号42)は、8702塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行った。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックした。ベクターpBBR1MCS−2::ABMを用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440およびGPp104の形質転換は、既報どおり行った(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMと命名した。
組換え株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABM、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABCおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMを、LB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養した。
シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlB、pa1131、およびrhlCの異種発現のために、プラスミドpBBR1MCS−2::ABMC(配列番号51)を構築した。このために、合成オペロンrhlAB−pa1131−rhlC(配列番号50)をGeneArt AG社(Regensburg)により合成し、市販のベクターpMA(GeneArt AG)中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707の既知のゲノム配列であった。ベクターpMA::ABMCから出発して、合成オペロンをBglIIおよびXbaIによりベクターから切断し、続いて、BamHIおよびXbaIで切断された発現ベクターpBBR1MCS−2(配列番号49)中にライゲートした(Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176)。得られるプラスミドpBBR1MCS−2::ABMC(配列番号51)は、9663塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行った。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックした。ベクターpBBR1MCS−2::ABMCを用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440およびGPp104の形質転換は、既報どおり行った(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABMCおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMCと命名した。
組換え株P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABMCおよびP.アエルギノサ(P. aeruginosa)DSM19880を、LB寒天カナマイシンプレート上(50μg/ml、P.プチダ(P. putida))およびLB寒天プレート上(P.アエルギノサ(P. aeruginosa))で培養した。
Trenzyme GmbH社(Konstanz)において、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440の染色体DNAから出発してラムノース生合成オペロンrfbBDACを増幅した。このために、以下のプライマーを使用した。
RL1:5’−TATATATAGAATTCGCGTCATCTGTCTACGACAACAC−3’(配列番号48)
RL2:5’−TATATATAGAATTCGGCTGCGCTACCGCAGCCCTTC−3’(配列番号43)
RL_XbaI−fw:5’−TATATATATCTAGAATTAATGCAGCTGGCACGAC−3’(配列番号44)
RL_Xba_rev:5’−GGCCGCTCTAGAACTAGTGGA−3’(配列番号46)
組換え株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDAC、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACを、LB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するために、以下でCMP培地と記される培地を使用する。これは、2%(w/v)グルコース、0.007%(w/v)KH2PO4、0.11%Na2HPO4・2H2O、0.2%(w/v)NaNO3、0.04%(w/v)MgSO4・H2O、0.01%(w/v)CaCl2・2H2O、および0.2%(v/v)の微量元素溶液で構成される。これは、0.2%(w/v)FeSO4・7H2O、0.15%(w/v)MnSO4・H2O、および0.06%(w/v)(NH4)MO7O24・4H2Oで構成される。NaOHを用いて培地のpHを6.7に調整し、続いて、オートクレーブにより培地を滅菌する(121℃、20分)。培養中のpHの調整は必要ない。
大腸菌(E. coli)W3110の形質転換は、電気穿孔により既報どおり行った(Miller JH. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Plainview, NY: Cold Spring HarborLab. Press; 1992)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACおよび大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACと命名した。
組換え株大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC、および大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDACは、LB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するために、以下でCMP培地と記される培地を使用する。これは、2%(w/v)グルコース、0.007%(w/v)KH2PO4、0.11%Na2HPO4・2H2O、0.2%(w/v)NaNO3、0.04%(w/v)MgSO4・H2O、0.01%(w/v)CaCl2・2H2O、および0.2%(v/v)の微量元素溶液で構成される。これは、0.2%(w/v)FeSO4・7H2O、0.15%(w/v)MnSO4・H2O、および0.06%(w/v)(NH4)MO7O24・4H2Oで構成される。NaOHを用いて培地のpHを6.7に調整し、続いて、オートクレーブにより培地を滅菌する(121℃、20分)。培養中のpHの調整は必要ない。
シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlB、およびrhlCならびにB.タイランデンシス(B. thailandensis)E264遺伝子BTH_II1077、BT_II1080、およびBT_II1081の異種発現のために、プラスミドpBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077− II1080−II1081(配列番号69)を構築する。このために、合成オペロンBTH_II1077、BT_II1080、およびBT_II1081(配列番号70)を、DNA 2.0社(Menlo Park, CA, USA)により合成し、市販のベクターpJ294(DNA 2.0; Menlo Park, CA, USA)中にインタークローン化する。合成のベースは、株B.タイランデンシス(B. thailandensis)E264のゲノム配列である。ベクターpJ294−BTH_II1077−II1080−II1081から出発して、合成オペロンをXbaIによりこのベクターから切断し、続いて、XbaIを用いて同様に切断されたベクターpBBR1MCS−2::ABC(配列番号40)中にライゲートする。得られた標的ベクターpBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077− II1080−II1081(配列番号69)は、13768塩基対のサイズを有する。ベクターのインサートを配列決定する。PCRの実施、アガロースゲル電気泳動によるPCR増幅の成功のチェック、DNAのエチジウムブロミド染色、PCR断片サイズの決定、PCR産物の精製、およびDNA濃度の決定は、当業者に公知の方法で行う。ベクターpBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081(配列番号69)を用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440およびGPp104の形質転換は、既報どおり行う(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析する。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077− II1080−II1081およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077− II1080−II1081と命名する。
実施例1、2、および11で生成した組換え株P.プチダ(P. putida)の株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB−BTH_II1077−II1080−II1081、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::AB−BTH_II1077−II1080−II1081、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081 P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081を、LB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するために、以下でM9培地と記される培地を使用する。この培地は、2%(w/v)グルコース、0.3%(w/v)KH2PO4、0.679%Na2HPO4、0.05%(w/v)NaCl、0.2%(w/v)NH4Cl、0.049%(w/v)MgSO4・7H2O、および0.1%(v/v)の微量元素溶液で構成される。これは、1.78%(w/v)FeSO4・7H2O、0.191%(w/v)MnCl2・7H2O、3.65%(w/v)HCl、0.187%(w/v)ZnSO4・7H2O、0.084%(v/v)NaEDTA・2H2O、0.03%(v/v)H3BO3、0.025%(w/v)Na2MoO4・2H2O、および0.47%(w/v)CaCl2・2H2Oで構成される。NH4OHを用いて培地のpHを7.4に調整し、続いて、オートクレーブにより培地を滅菌する(121℃、20分)。培養中のpHの調整は必要ない。シェーカーフラスコ中でのラムノリピド生産を調べるために、最初に前培養物を調製する。このために、LB寒天プレート上に新たに画線した株の接種ループを使用し、10mlのLB培地を100mlエルレンマイヤーフラスコ中に接種する。組換えP.プチダ(P. putida)株はすべて、50μg/mlのカナマイシンが添加されたLB培地中で培養した。P.プチダ(P. putida)株の培養を37℃および200rpmで一晩行う。前培養物を用いて250mlエルレンマイヤーフラスコ中の50mlのM9培地(+50μg/mlのカナマイシン)に接種する(開始時OD600 0.1)。培養物を200rpmおよび30℃で培養する。24時間間隔で、1mlのブロスのサンプルを培養フラスコから取り出す。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例4で説明したように行う。組換え株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB−BTH_II1077−II1080−II1081およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::AB−BTH_II1077−II1080−II1081は、株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABよりも有意に多量のモノラムノシル脂質を生成することが示される。このことから、B.タイランデンシス(B. thailandensis)E264由来のBTH_II1077−II1080−II1081の増幅により、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlABを含有するP.プチダ(P. putida)株中でのモノラムノシル脂質の生成が増大されることが実証される。さらに、組換え株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081は、株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABCおよびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABCよりも有意に多量のモノおよびジラムノシル脂質を生成することが示される。このことから、B.タイランデンシス(B. thailandensis)E264由来のBTH_II1077−I1080−II1081の増幅により、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlABCを含有するP.プチダ(P. putida)株中でのモノおよびジラムノシル脂質の生成が増大されることが証明される。最後に、株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::AB−BTH_II1077−II1080−II1081、およびP.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081が、対応する対照株P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::AB、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::AB−BTH_II1077−II1080−II1081、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABC−BTH_II1077−II1080−II1081よりも有意に少量のモノ−およびモノおよびジラムノシル脂質を生成し得るので、株P.プチダ(P. putida)KT2440と比較して株バックグラウンドP.プチダ(P. putida)GPp104中でのポリヒドロキシブチレート生成を低減することにより、増大されたラムノリピド生成がもたらされることが示される。
シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707遺伝子rhlA、rhlB、pa1131、およびrhlCの異種発現のために、プラスミドpBBR1MCS−2::ABCM(配列番号58)を構築した。このために、オリゴヌクレオチド
MFS2.0_xbaI_fw:5’−AGGAAATCTAGATGAGAGGCCGGCAAGGATAC−3’(配列番号60)
MFS2.0_XbaI_rev:5’−CCAGGTTCTAGACGCCAGGATTGAACAGTACC−3’(配列番号61)
を含有する株シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PAO1(DSM1707)のゲノムDNAから出発して、遺伝子pa1131(配列番号59)を増幅した。
実施例2および13で生成した組換え株P.プチダ(P. putida)の株P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABCM、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABC、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABCMを、LB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養した。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例12で説明したように行った。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例4で説明したように行った。結果を以下の表に示す。
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707由来の遺伝子rhlAおよびrhlBの異種発現のために、プラスミドpEC−XT99A::AB(配列番号52)を構築する。このために、合成オペロンrhlAB(配列番号37)をGeneArt AG社(Regensburg)により合成し、市販のベクターpMA(GeneArt AG)中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707の既知のゲノム配列であった。ベクターpMA::ABから出発して、BamHIおよびXbaIを用いて合成オペロンをベクターから切断し、BglIIおよびXbaIを用いて切断された発現ベクターpEC−XT99A(米国特許第7118904号)中にライゲートする。得られるプラスミドpEC−XT99A::AB(配列番号52)は、9793塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックする。ベクターpEC−XT99A::ABを用いたC.グルタミカム(C. glutamicum)ATCC13032の形質転換は、既報どおり行う(Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989))。形質転換体の選択は、LBHIS寒天プレート(18.5g/lのブレインハートインフュージョンブロス、0.5Mソルビトール、5g/lのBactoトリプトン、2.5g/lのBacto酵母エキス、5g/lのNaCl、および18g/lのBacto寒天(5mg/lのテトラサイクリンが追加されたもの))上で行う。プレートを33℃で2日間培養した。プラスミドを有する得られた株をC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABと命名する。
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707由来の遺伝子rhlA、rhlBおよびrhlCの異種発現のために、プラスミドpEC−XT99A::ABC(配列番号53)を構築する。このために、rhlABC(配列番号39)をGeneArt AG社(Regensburg)により合成し、市販のベクターpMA(GeneArt AG)中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707の既知のゲノム配列であった。ベクターpMA::ABCから出発して、BamHIおよびXbaIを用いて合成オペロンをベクターから切断し、BglIIおよびXbaIを用いて切断された発現ベクターpEC−XT99A(米国特許第7118904号)中にライゲートする。得られるプラスミドpEC−XT99A::ABC(配列番号53)は、10780塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックする。ベクターpEC−XT99A::ABCを用いたC.グルタミカム(C. glutamicum)ATCC13032の形質転換は、既報どおり行う(Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989))。形質転換体の選択は、LBHIS寒天プレート(18.5g/lのブレインハートインフュージョンブロス、0.5Mソルビトール、5g/lのBactoトリプトン、2.5g/lのBacto酵母エキス、5g/lのNaCl、および18g/lのBacto寒天(5mg/lのテトラサイクリンを用いて追加が行われたもの))上で行う。プレートを33℃で2日間培養した。プラスミドを有する得られた菌株をC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCと命名する。
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707由来の遺伝子rhlA、rhlBおよびpa1131の異種発現のために、プラスミドpEC−XT99A::ABM(配列番号54)を構築する。このために、合成オペロンrhlABM(配列番号41)をGeneArt AG社(Regensburg)により合成し、市販のベクターpMA(GeneArt AG)中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707の既知のゲノム配列であった。ベクターpMA::ABMから出発して、BamHIおよびXbaIを用いて合成オペロンをベクターから切断し、BglIIおよびXbaIを用いて切断された発現ベクターpEC−XT99A(米国特許第7118904号)中にライゲートする。得られるプラスミドpEC−XT99A::ABM(配列番号54)は、11073塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックする。ベクターpEC−XT99A::ABMを用いたC.グルタミカム(C. glutamicum)ATCC13032の形質転換は、既報どおり行う(Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989))。形質転換体の選択は、LBHIS寒天プレート(18.5g/lのブレインハートインフュージョンブロス、0.5Mソルビトール、5g/lのBactoトリプトン、2.5g/lのBacto酵母エキス、5g/lのNaCl、および18g/lのBacto寒天(5mg/lのテトラサイクリンが追加されたもの))上で行う。プレートを33℃で2日間培養した。プラスミドを有する得られた菌株をC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABMと命名する。
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)中でのシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)DSM1707由来の遺伝子rhlA、rhlB、pa1131、およびrhlCの異種発現のために、プラスミドpEC−XT99A::ABCM(配列番号55)を構築する。このために、オリゴヌクレオチド
MFS2.0_xbaI_fw:5’−AGGAAATCTAGATGAGAGGCCGGCAAGGATAC−3’(配列番号60)
MFS2.0_XbaI_rev:5’−CCAGGTTCTAGACGCCAGGATTGAACAGTACC−3’(配列番号61)
を用いて株シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PAO1(DSM1707)のゲノムDNAから出発して、遺伝子pa1131(配列番号59)を増幅した。
C.グルタミカム(C. glutamicum)中でのlacプロモーターの制御下のP.プチダ(P. putida)由来の遺伝子rfbBDACの異種発現のために、ベクターpVWEX1::rfbBDAC(配列番号57)を構築する。このために、XbaIを用いてベクターpBBR1MCS−2::rfbBDAC(配列番号45)を消化し、P.プチダ(P. putida)KT2440由来の遺伝子rfbBDACとlacプロモーターとを含有する断片(3840bp)を、XbaIで消化されたベクターpVWEX1(配列番号56)中にライゲートする。得られるプラスミドpVWEX1::rfbBDAC(配列番号57)は、12311塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックする。ベクターpVWEX1::rfbBDACを用いたC.グルタミカム(C. glutamicum)ATCC13032 pEC−XT99A、ATCC13032 pEC−XT99A::AB、ATCC13032 pEC−XT99A::ABM、ATCC13032 pEC−XT99A::ABC、およびATCC13032 pEC−XT99A::ABCMの形質転換は、既報どおり行う(Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989))。形質転換体の選択は、LBHIS寒天プレート(18.5g/lのブレインハートインフュージョンブロス、0.5Mソルビトール、5g/lのBactoトリプトン、2.5g/lのBacto酵母エキス、5g/lのNaCl、および18g/lのBacto寒天(5mg/lのテトラサイクリンおよび25mg/lのカナマイシンが追加されたもの))上で行う。プレートを33℃で2日間培養した。プラスミドを有する得られた株を、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A pVWEX1::rfbBDAC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDAC、およびC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCM pVWEX1::rfbBDACと命名する。
実施例15〜19で生成したC.グルタミカム(C. glutamicum)株である組換え株C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::AB、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABM、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCM、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A pVWEX1::rfbBDAC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC、C.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDAC、およびC.グルタミカム(C. glutamicum)pEC−XT99A::ABCM pVWEX1::rfbBDACを、5mg/lのテトラサイクリンおよび5mg/lのテトラサイクリンおよび25mg/lのカナマイシンを用いてLBHIS寒天プレート上で培養する。シェーカーフラスコ中でのラムノリピド生産を調べるために、最初に前培養物を調製する。このために、LBHIS寒天プレート上に新たに画線された株の接種ループを使用し、10mlのLBHIS培地(18.5g/lのブレインハートインフュージョンブロス、0.5Mソルビトール、5g/lのBactoトリプトン、2.5g/lのBacto酵母エキス、および5g/lのNaCl、これに5mg/lのテトラサイクリンまたは5mg/lのテトラサイクリンおよび25mg/lのカナマイシンが追加されている)を100mlエルレンマイヤーフラスコ中に接種する。株の培養を33℃および200rpmで一晩行う。翌朝、50mlのCGXII培地(5mg/lのテトラサイクリンまたは5mg/lのテトラサイクリンおよび25mg/lのカナマイシンを含有する)を1mlの前培養物と共に、バッフルを含有する500mlエルレンマイヤーフラスコ中に接種する(開始時OD600 0.1)。
・20g/lの(NH4)2SO4(Merck)
・5g/lの尿素(Merck)
・1g/lのKH2PO4(Merck)
・1g/lのK2HPO4(Merck)
・0.25g/lのMgSO4・7H2O(Merck)
・10mg/lのCaCl2(Merck)
・42g/lのMOPS(Roth)
・0.2mg/lのビオチン(Merck)
・1ml/lの微量塩溶液
・NaOHを用いたpH7に調整する
・オートクレーブ処理後、1ml/lのプロトカテク酸(30g/l、希NaOH中溶解、滅菌濾過)および40g/lのグルコース(Merck)を添加する
・10g/lのFeSO4・7H2O(Merck)
・10g/lのMnSO4・H2O(Merck)
・1g/lのZnSO4・7H2O(Merck)
・0.2g/lのCuSO4・5H2O(Merck)
・20mg/lのNiCl2・6H2O(Merck)
・溶解するために、HClを用いてpH1に酸性化する
プラスミドpBBR1MCS−2、pBBR1MCS−2::AB、pBBR1MCS−2::ABC、pBBR1MCS−2::ABM、およびpBBR1MCS−2::ABCMを、電気穿孔により、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166、およびシュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717中に組み込む。シュードモナス属(Pseudomonas)株の形質転換は、既報どおり行う(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。形質転換体の選択は、栄養寒天プレート(5g/lのペプトン、3g/lの肉抽出物、15g/lの寒天、pH7、これに50mg/lのカナマイシンが追加されている)上で行う。30℃、より正確には28℃で、プレートを2日間培養する。プラスミドを有する得られた株を、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::AB、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::AB、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABC、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABC、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABCM、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABCM、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABM、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABM、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABM、およびシュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABMと命名する。
実施例21で生成した組換え株シュードモナス属(Pseudomonas)株のシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::AB 50090、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::AB、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::AB、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::AB、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABC、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABC、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABC、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABCM、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABCM、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABCM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 50090 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)DSM 9958 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 6899 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DSM 50204 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)50194 pBBR1MCS−2::ABM、P.ブラッシカセアラム(P. brassicacearum)DSM 13227 pBBR1MCS−2::ABM、P.スツッツェリ(P. stutzeri)DSM 10701 pBBR1MCS−2::ABM、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)DSM 4166 pBBR1MCS−2::ABM、およびシュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)DSM 17717 pBBR1MCS−2::ABMを、LB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例12で説明したように行う。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例4で説明したように行う。
シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PAO1およびシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PA7由来の遺伝子rhlA、rhlB、およびrhlCの異種発現のために、プラスミドpBBR1MCS−2::ABPAO1(配列番号62)およびpBBR1MCS−2::ABPA7(配列番号63)を最初に構築する。このために、合成オペロンrhlABPAO1(配列番号64)およびrhlABPA7(配列番号65)をDNA 2.0社(Menlo Park, CA, U.S.A)により合成し、市販のベクターpJ294(DNA 2.0)中でインタークローン化する。合成のベースは、株シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PAO1およびシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)PA7の既知のゲノム配列である。ベクターpJ294::ABPAO1およびpJ294::ABPA7から出発して、合成オペロンをKpnIおよびXbaIによりベクターから切断し、続いて、KpnIおよびXbaIを用いて切断された発現ベクターpBBR1MCS−2(配列番号49)(Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176)中にライゲートする。得られるプラスミドpBBR1MCS−2::ABPAO1(配列番号62)およびpBBR1MCS−2::ABPA7(配列番号63)は、7332および7354塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックする。第2の工程で、プラスミドpBBR1MCS−2::ABPAO1−C1(配列番号66)およびpBBR1MCS−2::ABPA7−CE264(配列番号67)を生産する。このために、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)1(配列番号68)およびバークホルデリア・タイランデンシス(Burkholderia thailandensis)E264(配列番号76)由来のrhlC遺伝子をDNA 2.0社(Menlo Park, CA, U.S.A)により合成し、市販のベクターpJ294(DNA 2.0)中にインタークローン化する。合成のベースは、株シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)1およびバークホルデリア・タイランデンシス(Burkholderia thailandensis)E264の既知のゲノム配列である。ベクターpJ294::C1およびpJ294::CE264から出発して、rhlC遺伝子をXbaおよびSacIによりベクターから切断し、続いて、XbaおよびSacIを用いて同様に切断されたベクターpBBR1MCS−2::ABPAO1(配列番号62)およびpBBR1MCS−2::ABPA7(配列番号63)中にライゲートする。得られるプラスミドpBBR1MCS−2::ABPAO1−C1(配列番号66)およびpBBR1MCS−2::ABPA7−CE264(配列番号67)は、8325および8335塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌(E. coli)DH5α細胞(Gibco-BRL, Karlsruhe)の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、DNA配列解析によりチェックする。ベクターpBBR1MCS−2、pBBR1MCS−2::ABPAO1−C1およびpBBR1MCS−2::ABPA7−CE264を用いたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440およびGPp104の形質転換は、既報どおり行う(Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABPAO1−C1、P.プチダ(P. putida)KT2440 pBBR1MCS−2::ABPA7−CE264、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2、P.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABPAO1−C1、およびP.プチダ(P. putida)GPp104 pBBR1MCS−2::ABPA7−CE264と命名する。
実施例23で生成した組換え株P.プチダ(P. putida)株をLB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例12で説明したように行う。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例4で説明したように行う。
P.プチダ(P. putida)および大腸菌(E. coli)中でのP.プチダ(P. putida)rfbBDACオペロンの過剰発現用のベクターpBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC、およびpBBR1MCS−2::ABMC_rfbBDACを構築するために、、P.プチダ(P. putida)rfbBDACオペロンをPCRにより最初に増幅した。ベクターpBBR1MCS−2::rfbBDAC(配列番号45)をPCR用のマトリックスとして機能させた。以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
RL_AgeI−fw:5’−TATATATAACCGGTATTAATGCAGCTGGCACGAC−3’(配列番号71)
RL_AgeI_rev:5’−GGCCGACCGGTACTAGTGGA−3’(配列番号72)
実施例2、7、および25で生成した組換え株のP.プチダ(P. putida)株をLB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例12で説明したように行う。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例4で説明したように行う。
大腸菌(E. coli)W3110の形質転換は、電気穿孔により既報どおり行った(Miller JH. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Plainview, NY: Cold Spring HarborLab. Press; 1992)。10個すべてのクローンのプラスミドDNAを単離して解析した。プラスミドを有する得られた株を、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCM、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::AB_rfbBDAC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABM_rfbBDAC、大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABC_rfbBDAC、および大腸菌(E. coli)W3110 pBBR1MCS−2::ABCM_rfbBDACと命名した。
実施例27で生成した組換え大腸菌(E. coli)株をLB寒天カナマイシン(50μg/ml)プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例10で説明したように行う。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例4で説明したように行う。
Claims (16)
- 一般式(I)
(式中、
m=2、1、または0、
n=1または0、
R1およびR2=互いに独立して2〜24個の炭素原子を有する同一または異なる有機基)
で示される少なくとも1種のラムノリピドを生成可能な細胞であって、
野生型と比較して、酵素E1、E2、およびE3の少なくともの1つの増大された活性を有するように遺伝子改変されたものであり、かつ、
野生型と比較して、酵素E8の増大された活性を有することを特徴とし、
前記酵素E1が、3−ヒドロキシアルカノイル−ACPから3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカン酸−ACPを経由するヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカン酸への変換を触媒可能であり、
前記酵素E2が、ラムノシルトランスフェラーゼIであり、かつdTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートからα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒可能であり、
前記酵素E3が、ラムノシルトランスフェラーゼIIであり、かつdTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートからα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒可能であり、
前記酵素E8が、細胞から周囲培地中への一般式(I)で示されるラムノリピドの輸送を触媒する、配列番号8のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号8と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号8を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチドであることを特徴とする、細胞。 - 前記酵素E1が、
ポリペプチド配列の配列番号2を有する酵素E1a、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号2と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号2を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E1a;
ポリペプチド配列の配列番号18を有する酵素E1b、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号18と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号18を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E1b;
ポリペプチド配列の配列番号78を有する酵素E1c、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号78と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号78を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E1c;
ポリペプチド配列の配列番号80を有する酵素E1d、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号80と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号80を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E1d;および
ポリペプチド配列の配列番号82を有する酵素E1e、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号82と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号82を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E1e;
からなる群から選択される少なくとも1種の酵素であり、
前記酵素E2が:
ポリペプチド配列の配列番号4を有する酵素E2a、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号4と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号4を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E2a;
ポリペプチド配列の配列番号20を有する酵素E2b、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号20と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号20を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E2b;
ポリペプチド配列の配列番号84を有する酵素E2c、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号84と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号84を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E2c;
ポリペプチド配列の配列番号86を有する酵素E2d、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号86と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号86を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E2d;および
ポリペプチド配列の配列番号88を有する酵素E2e、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号88と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号88を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E2e;
からなる群から選択される少なくとも1種の酵素であり、
前記酵素E3が:
ポリペプチド配列の配列番号6を有する酵素E3a、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号6と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号6を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E3a;
ポリペプチド配列の配列番号22を有する酵素E3b、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号22と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号22を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E3b;
ポリペプチド配列の配列番号90を有する酵素E3c、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号90と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号90を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E3c;および
ポリペプチド配列の配列番号92を有する酵素E3d、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号92と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号92を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチド配列を有する酵素E3d;
からなる群から選択される少なくとも1種の酵素であることを特徴とする、請求項1に記載の細胞。 - m=1または0、
n=1、
R1およびR2は、互いに独立して、同一または異なる、分枝状または直鎖状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の2〜24炭素原子を有するアルキル基
である、請求項1または2に記載の細胞。 - E2、E2E3、およびE1E2E3
から選択される酵素の組合せの増大された活性を有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞。 - 前記酵素の組合せ
E1E2E3
の増大された活性を有し、かつ
nが=1である
ことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞。 - アスペルギルス属(Aspergillus)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、バチルス属(Bacillus)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、パラコッカス属(Paracoccus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、カンジダ属(Candida)、ピキア属(Pichia)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、クルイベロマイセス属(Kluyveromyces)、サッカロマイセス属(Saccharomyces)、エシェリキア属(Escherichia)、ザイモモナス属(Zymomonas)、ヤロウイア属(Yarrowia)、メチロバクテリウム属(Methylobacterium)、ラルストニア属(Ralstonia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、ロドスピリラム属(Rhodospirillum)、ロドバクター属(Rhodobacter)、バークホルデリア属(Burkholderia)、クロストリジウム属(Clostridium)、およびカプリアビ
ダス属(Cupriavidus)からなる群の属から選択されることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の細胞。 - 野生型の細胞が、C6〜C16の鎖長を有するポリヒドロキシアルカノエートを生成可能であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 野生型と比較して、より少量のポリヒドロキシアルカノエートを生成可能であるように遺伝子改変されたものであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、その野生型と比較して、少なくとも1種の酵素E9またはE10の低減された活性を有し、ここで、
E9が、3−ヒドロキシアルカノイル−補酵素Aからポリ−3−ヒドロキシアルカン酸への変換能力を有するポリヒドロキシアルカン酸シンターゼEC:2.3.1.、配列番号30もしくは配列番号32の配列を有するポリペプチド、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号30もしくは配列番号32と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号30もしくは配列番号32を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチドであり、かつ
E10が、3−ヒドロキシアルカノイル−ACPから3−ヒドロキシアルカナノイル−補酵素Aへの変換能力を有する3−ヒドロキシアルカノイル−ACP:補酵素A転移酵素、配列番号34もしくは配列番号36の配列を有するポリペプチド、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号34もしくは配列番号36と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号34もしくは配列番号36を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチドである
ことを特徴とする、請求項7または8に記載の細胞。 - 前記細胞が、P.プチダ(P. putida)GPp121、P.プチダ(P. putida)GPp122、P.プチダ(P. putida)GPp123、P.プチダ(P. putida)GPp124、およびP.プチダ(P. putida)GPp104、P.プチダ(P. putida)KT42C1、P.プチダ(P. putida)KTOY01またはP.プチダ(P. putida)KTOY02からなる群から選択されることを特徴とする、請求項6に記載の細胞。
- 野生型と比較して、酵素E4、E5、E6およびE7の少なくとも1つの増大された活性を有する請求項1〜10のいずれか一項に記載の細胞であって、
前記酵素E4が、dTTP:α−D−グルコース−1−リン酸チミジリルトランスフェラーゼ、EC2.7.7.24、配列番号10の配列を有するポリペプチド、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号10と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号10を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチドであり、
前記酵素E5が、dTTP−グルコース−4,6−ヒドロリアーゼ、EC4.2.1.46、配列番号12の配列を有するポリペプチド、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号12と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号12を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチドであり、
前記酵素E6が、dTDP−4−デヒドロラムノース−3,5−エピメラーゼ、EC5.1.3.13、配列番号14の配列を有するポリペプチド、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号14と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号14を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチドであり、
前記酵素E7が、dTDP−4−デヒドロラムノースレダクターゼ、EC1.1.1.133、配列番号16の配列を有するポリペプチド、またはアミノ酸基の10%までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号16と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号16を有する酵素の酵素活性の少なくとも10%を有するポリペプチドであることを特徴とする、細胞。 - 3つのグループ[A1〜E1]、[A2〜E2]、および[A3〜E3]の少なくともの1つから選択される配列を含有し、かつ、
グループ[A8〜E8]から選択される配列を含有する、単離された核酸であって、
グループ[A1〜E1]が、以下の配列:
A1)配列番号1または17で表される配列であって、3−ヒドロキシデカノイル−ACPから3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカノイル−ACPを経由する3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
B1)配列番号1または17で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、A1)に記載したのと同一の変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
C1)配列番号2または18で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D1)配列番号2または18で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、3−ヒドロキシアルカノイル−ACPから3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカン酸−ACPを経由するヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
E1)グループA1)〜D1)の1つに属する配列に対する相補的配列、
で構成され、
グループ[A2〜E2]が、以下の配列:
A2)配列番号3または19で表される配列であって、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
B2)配列番号3または19で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、A2)に記載したのと同一の変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
C2)配列番号4または20で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D2)配列番号4または20で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、dTDP−ラムノースおよび3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートからα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒可能であるタンパク質またはペプチドをコードする配列、
E2)グループA2)〜D2)の1つに属する配列に対する相補的配列、
で構成され、かつ
グループ[A3〜E3]が、以下の配列:
A3)配列番号5または21で表される配列であって、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸からα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカノイル−3−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
B3)配列番号5または21で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、A3)に記載したのと同一の変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
C3)配列番号6または22で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D3)配列番号6または22で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、dTDP−ラムノースおよびα−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートからα−L−ラムノピラノシル−(1−2)−α−L−ラムノピラノシル−3−ヒドロキシアルカノイル−3−ヒドロキシアルカノエートへの変換を行い得るタンパク質をコードする配列、
E3)グループA3)〜D3)の1つに属する配列に対する相補的配列、
で構成され、
グループ[A8〜E8]が、以下の配列:
A8)配列番号59で表される配列であって、細胞から周囲培地中への一般式(I)で示されるラムノリピドの輸送を触媒するタンパク質またはペプチドをコードする配列、
B8)配列番号59で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、A8)に記載したのと同一の輸送を触媒するタンパク質またはペプチドをコードする配列、
C8)配列番号8で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする配列、
D8)配列番号8で表される配列と少なくとも90%まで同一である配列であって、細胞から周囲培地中への一般式(I)で示されるラムノリピドの輸送を触媒するタンパク質またはペプチドをコードする配列、
E8)グループA8)〜D8)の1つに属する配列に対する相補的配列、
で構成され、
ここで、一般式(I)のラムノリピドが以下の式:
(式中、
m=2、1、または0、
n=1または0、
R1およびR2=互いに独立して2〜24個の炭素原子を有する同一または異なる有機基)
で示される、単離された核酸。 - 配列番号42の核酸配列および請求項12に記載の核酸の配列から選択される少なくとも1種の核酸配列を含む、ベクター、発現ベクターまたは遺伝子過剰発現カセット。
- 請求項12に記載の少なくとも1種の核酸を含有することを特徴とする、請求項1〜11のいずれか一項に記載の細胞。
- 以下の工程:
I)請求項1〜11のいずれか一項に記載の細胞を、炭素源を含有する培地と接触させる工程と、
II)前記細胞による前記炭素源からのラムノリピドの生成を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程と、
III)任意選択により、生成された前記ラムノリピドを単離する工程と、
を含む、一般式(I)で示されるラムノリピドの生産方法。 - 化粧製剤、皮膚製剤、または医薬製剤の生産、植物保護製剤の生産、あるいはケア剤または清浄剤または界面活性剤濃縮物の生産のための、請求項15に記載の方法を用いて得られるラムノリピドの使用。
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