ES2837485T3 - Células y procedimiento para la producción de ramnolípidos - Google Patents

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Abstract

Célula seleccionadas a partir de microorganismos que puede formar al menos un ramnolípido de la Fórmula general (I) **(Ver fórmula)** siendo m = 2, 1 o 0, en especial 1 o 0, n = 1 o 0, en especial 1, R1 y R2 = independientemente entre sí, restos orgánicos iguales o diferentes independientemente entre sí, con 2 a 24, preferentemente 5 a 13 átomos de carbono, en especial resto alquilo, en caso dado ramificado, en caso dado sustituido, en especial hidroxisustituido, en caso dado insaturado, en especial, en caso dado, mono-, di- o triinsaturado, caracterizada por que se modificó mediante técnica génica de modo que, en comparación con su tipo salvaje, presenta una actividad acrecentada de al menos una de las enzimas E1, E2 y E3, pudiendo catalizar la enzima E1 la reacción de 3-hidroxialcanoil-ACP a través de ácido-3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico-ACP para dar ácido hidroxialcanoil-3- hidroxialcanoico, siendo la enzima E2 una ramnosiltransferasa I, y pudiendo catalizar esta la reacción de dTDPramnosa y 3-hidroxialcanoato de 3-hidroxialcanoilo para dar 3-hidroxialcanoato de α-L-ramnopiranosil-3- hidroxialcanoilo, y siendo la enzima E3 una ramnosiltransferasa II, y pudiendo catalizar esta la reacción de dTPDramnosa y 3-hidroxialcanoato de α-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoilo para dar 3-hidroxialcanoato de α-L20 ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoilo, y caracterizada por que, en comparación con su tipo salvaje, presenta una actividad acrecentada de al menos una enzima E8, que cataliza la exportación de un ramnolípido de la Fórmula general (I) de la célula al medio circundante, preferente con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta 25 % de los restos aminoácido están modificados frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28 mediante deleción, inserción, sustitución o una combinación de estas, y que aún posee al menos 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28.

Description

DESCRIPCIÓN
Células y procedimiento para la producción de ramnolípidos
Campo de la invención
Son objeto de la invención células y procedimientos para la producción de ramnolípidos.
Estado de la técnica
Actualmente se producen agentes tensioactivos esencialmente en base a materias primas petroquímicas. La utilización de agentes tensioactivos a base de materias primas regenerativas es una alternativa correspondiente debido a la escasez previsible de materias primas petroquímicas y a la demanda creciente de productos que se basan en materias primas regenerativas, o bien son biodegradables.
Los ramnolípidos están constituidos por uno (monorramnosil-lípidos) o dos restos ramnosa (dirramnosil-lípidos), y uno o dos restos ácido 3-hidroxigraso (véase Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, páginas 3037-51). Éstos poseen propiedades tensioactivas, que se requieren para el empleo como agente tensioactivo en las más diversas aplicaciones (véase Leitermann et al., 2009).
Actualmente se producen estos lípidos con productos aislados de tipo salvaje de diversas bacterias patógenas humanas y animales, en especial representantes de las especies Pseudomonas y Burkholderia (véase Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, páginas 3037-51). El hecho de que estos organismos de producción puedan desencadenar enfermedades reduce considerablemente la aceptación del consumidor para ramnolípidos producidos convencionalmente. Además, los elevados requisitos de seguridad debidos a un volumen de inversión incrementado, y en caso dado pasos de elaboración adicionales, influyen también los costes de producción.
Aunque con ayuda de estos organismos de producción se pueden obtener en parte títulos de producto elevados, así como rendimientos espacio-tiempo, o bien de carbono, esto presupone el empleo de aceites vegetales como sustrato único o cosustrato (véase Handbook o f Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, páginas 3037-51). No obstante, en comparación con otras fuentes de carbono, como por ejemplo glucosa, sacarosa, o polisacáridos, como por ejemlo almidón, celulosa y hemicelulosa, glicerina, CO, CO2 o CH4, los aceites vegetales son materias primas relativamente caras. Además, debido a su caracter tensioactivo, los ramnolípidos se distinguen por que tienden a un fuerte espumado en procesos de fermentación. Éste es el caso en especial si se emplean sustratos lipófilos. Esta problemática se reduce claramente en el caso de empleo de sustratos hidrosolubles, como por ejemplo glucosa, sacarosa, polisacáridos (almidón, celulosa, hemicelulosa) o glicerina.
Finalmente, se puede influir sobre las propiedades de los ramnolípidos producidos a partir de los productos aislados de tipo salvaje solo de manera limitada. Hasta la fecha, esto tiene lugar exclusivamente a través de la optimización del control de proceso (valor de pH, abastecimiento de oxígeno, composición del medio, estrategias de alimentación, abastecimiento de nitrógeno, temperatura, selección de sustrato, etc.). No obstante, sería deseable una influencia muy selectiva de determinadas propiedades del producto, como por ejemplo la proporción de diferentes especies de ramnolípidos (número de restos ramnosa y ácido 3-hidroxigraso), o longitud de cadena y grado de saturación de los restos ácido 3-hidroxigraso, para poder modular las propiedades de producto relevantes para la aplicación.
Si se emplean en gran medida como agentes tensioactivos en aplicaciones domésticas, de limpieza, cosméticas, de procesado de productos alimenticios, farmacéuticas, fitosanitarias y otras, los ramnolípidos competirán con los agentes tensioactivos empleados actualmente. Éstos son productos químicos de gran volumen, que se pueden producir con costes muy reducidos, sin riesgos sanitarios evidentes para los consumidores y con especificaciones de producto definidas muy claramente y modulables. Por lo tanto, también los ramnolípidos se pueden producir con costes lo más reducidos posible sin riesgos sanitarios para los consumidores, y con propiedades lo más definidas posible.
Si bien los ramnolípidos se han producido ya en organismos GRAS (generally regarded as save) basados en fuentes de carbono convenientes, como por ejemplo glucosa o glicerina, en este caso se trata exclusivamente de monorramnosil-lípidos (Ochsner et al. Appl. Environ. Microbiol. 1995. 61(9):3503-3506).
Por otra parte, Cha et al. Describen en Bioresour Technol. 2008. 99(7):2192-9 la producción de monorramnosil-lípidos a partir de aceite de soja en P. putida mediante introducción de los genes rhlA y rhlB de Pseudomonas aeruginosa.
El documento WO2004050882 da a conocer un procedimiento para la fitorremediación de un entorno, que está contaminado con al menos un metal pesado o hidrocarburos oleaginosos, comprendiendo el procedimiento: (a) puesta a disposición de una planta transgénica, exprimiendo la planta al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima con actividad de ramnosiltransferasa, (b) siembra o localización de plantas transgénicas en el entorno.
El documento US2007020624 se refiere a ácidos nucleicos y polipeptidos aislados, que son derivados de Pseudomonas aeruginosa, que son útiles para el diagnóstico, la profilaxis y el tratamiento de estado patológicos, así como materiales y procedimientos para el diagnóstico, la prevención y la mitigación de estados patológicos que resultan de infecciones bacterianas.
El documento WO2004083385 da a conocer un procedimiento para la identificación de un modulador de la autoinducción-señalización en bacterias, comprendiendo el procedimiento: puesta a disposición de una célula que comprende un gen controlado por autoinducción, respondiendo la célula a una molécula señal de autoinducción, de modo que se genera una señal detectable: puesta en contacto de la célula con una molécula señal de autoinducción en presencia y ausencia de un compuesto de ensayo; y detección de una modificación en la señal detectable, para identificar de este modo el compuesto de ensayo como un modulador de la señalización de autoinducción en bacterias.
Ochsner et al. "Production of Pseudomonas aeruginosa rhamnolipid biosurfactants in heterologous hosts", Applied and Environmental Micorbiology, vol. 61, n° 9, página 3503, da a conocer la cepa Pseudomonas aeruginosa PG201 con actividad de ramnosiltransferasa elevada.
El informe de proyecto final Bio-Engineering High Performance Microbial Strains for MEOR by Directed Protein Evolution Technology", 2008, Oil & Natural Gas Technology Projects, da a conocer cepas de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens y E. coli que contienen los genes de ramnosiltransferasa rhlAB y presenta tasas de producción de ramnolípidos elevadas.
"Pseudomonas aeruginosa rhamnosyl transferase genes and regulatory protein gene, complete cds", EMBL, Database accession no. L28170, da a conocer las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de proteínas de Pseudomonas aeruginosa indicadas como ramnosiltransferasas.
Por lo tanto, existe una demanda creciente de la producción, economica y segura desde el punto de vista sanitario, de mono- y dirramnosil-lípidos con propiedades definidas, así como modulables. Esta modulación se puede efectuar, a modo de ejemplo, mediante una puesta a disposición equilibrada de las actividades enzimáticas individuales, que reduce la concentración de monorramnosil-lípidos. No obstante, esta modulación se puede efectuar, a modo de ejemplo, mediante el empleo de enzimas con determinadas propiedades, por ejemplo, respecto a especificidad de sustrato y, por consiguiente, eventualmente la longitud de cadena de ácidos hidroxigrasos incorporados en los ramnolípidos.
Por lo tanto, la presente invención tomaba como base la tarea de poner a disposición una posibilidad de producir ramnolípidos con huéspedes de producción seguros a partir de fuentes de carbono convenientemente accesibles.
Descripción de la invención
Sorprendentemente se descubrió que las células descritas a continuación, así como los procedimientos en los que se emplean estas células, contribuyen a solucionar la tarea planteada por la invención.
Por lo tanto, son objeto de la presente invención células que pueden formar ramnolípidos y, en comparación con su tipo salvaje, presentan al menos una actividad acrecentada de un producto génico de homólogos de los productos génicos rhlA, rhlB yrhlC, así como de al menos otra enzima, como se describe en la reivindicación 1. Otro objeto de la invención es un procedimiento para la producción de ramnolípidos bajo empleo de las células citadas anteriormente como biocatalizador y fuentes de carbono simples.
Una ventaja de la presente invención consiste en que se pueden emplear organismos que no son patógenos y son fáciles de cultivar. Otra ventaja consiste en que no es necesario el empleo de aceites como sustrato único o cosustrato. También es una ventaja que se puedan producir ramnolípidos con propiedades definidas, así como modulables, con ayuda de la invención. Otra ventaja de la presente invención consiste en que se pueden sintetizar dirramnosil-lípidos. Una ventaja ulterior consiste en que se pueden producir ramnolípidos con rendimientos espacio-tiempo y carbono más elevados que con células sin intensificación de estas actividades.
Contribuye a la solución de la tarea citada inicialmente una célula seleccionada a partir de microorganismos, preferentemente una célula aislada, que puede formar al menos un ramnolípido de la fórmula general (I) o su sal,
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siendo
m = 2, 1 o 0, en especial 1 o 0,
n = 1 o 0, en especial 1,
R1 y R2 = independientemente entre sí, restos orgánicos iguales o diferentes independientemente entre sí, con 2 a 24, preferentemente 5 a 13 átomos de carbono, en especial resto alquilo, en caso dado ramificado, en caso dado sustituido, en especial hidroxisustituido, en caso dado insaturado, en especial, en caso dado, mono-, di- o triinsaturado, preferentemente aquellos seleccionados a partir del grupo constituido por pentenilo, heptenilo, nonenilo, undecenilo y tridecenilo, y (CH2)o-CH3 con o = 1 a 23, preferentemente 4 a 12, caracterizada por que se modificó mediante técnica génica de modo que, en comparación con su tipo salvaje, presenta una actividad acrecentada de al menos una de las enzimas E1, E2 y E3, pudiendo catalizar la enzima E1 la reacción de 3-hidroxialcanoil-ACP a través de ácido-3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico-ACP para dar ácido hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico, siendo la enzima E2 una ramnosiltransferasa I, y pudiendo catalizar esta la reacción de dTDP-ramnosa y 3-hidroxialcanoato de 3-hidroxialcanoilo para dar 3-hidroxialcanoato de a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoilo, y siendo la enzima E3 una ramnosiltransferasa II, y pudiendo catalizar esta la reacción de dTPD-ramnosa y 3-hidroxialcanoato de a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoilo para dar 3-hidroxialcanoato de a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoilo, y caracterizada por que, en comparación con su tipo salvaje, presenta una actividad acrecentada de al menos una enzima E8, que cataliza la exportación de un ramnolípido de la Fórmula general (I) de la célula al medio circundante, preferente con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta 25 % de los restos aminoácido están modificados frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28 mediante deleción, inserción, sustitución o una combinación de estas, y que aún posee al menos 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28,
seleccionándose estas enzimas E1, E2 y E3 preferentemente a partir del grupo constituido por
una enzima E1 seleccionada a partir de
una enzima E1a con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 2 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 2 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 2, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima Eia la capacidad de transformar preferentemente 3-hidroxidecanoil-ACP a través de ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico-ACP en ácido hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
una enzima E1b con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 18 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 18 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 18, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E1b la capacidad de transformar preferentemente 3-hidroxitetradecanoil-ACP a través de ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico-ACP en ácido hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
una enzima E1c con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 78 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 78 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 78, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E1c la capacidad de transformar preferentemente 3-hidroxitetradecanoil-ACP a través de ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico-ACP en ácido hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
una enzima E1d con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 80 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 80 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 80, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E1d la capacidad de transformar preferentemente 3-hidroxitetradecanoil-ACP a través de ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico-ACP en ácido hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y
una enzima E1e con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 82 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 82 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 82, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E1e la capacidad de transformar preferentemente 3-hidroxitetradecanoil-ACP a través de ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico-ACP en ácido hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
una enzima E2 con la secuencia de polipéptidos seleccionada a partir de
una enzima E2a con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 4 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 4 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 4, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E2a la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
una enzima E2b con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 20 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 20 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 20, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E2b la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
una enzima E2c con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 84 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 84 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 84, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E2c la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
una enzima E2d con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 86 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 86 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 86, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E2d la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y
una enzima E2e con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 88 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 88 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 88, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E2e la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y
una enzima E3 seleccionada a partir de
una enzima E3a con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 6 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 6 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 6, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E3a la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1 -2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
una enzima E3b con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 22 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 22 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 22, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E3b la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1 -2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
una enzima E3c con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 90 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 90 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 90, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E3c la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y
una enzima E3d con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 92 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 92 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que presenta aún al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 92 % de actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 92, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E3d la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1 -2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico.
Para una visión general véase la Figura 1.
Se denomina “tipo salvaje“ de una célula preferentemente una célula cuyo genoma se presenta en un estado como se ha producido naturalmente debido a la evolución. El concepto se emplea tanto para la célula total, como también para algunos genes. Por lo tanto, no corresponden al concepto “tipo salvaje“ en especial aquellas células, o bien aquellos genes cuyas secuencias génicas se han modificado al menos parcialmente por el hombre mediante procedimientos recombinantes. En relación con la presente invención, bajo el concepto “ramnolípido“ se entiende un compuesto de la Fórmula general (I) o su sal. Es evidente que las actividades indicadas concretamente para las enzimas E1a a E3b representan solo una selección ejemplar de un espectro de actividades más amplio de las enzimas citadas anteriormente; la actividad citada en cada caso es aquella que está presente en una enzima dada para un procedimiento de medición fiable. De este modo, es obvio que una enzima que transforma un sustrato con un resto C10-alquilo no ramificado, saturado, transformará igualmente - si bien, en caso dado, con actividad reducida - aquellos sustratos que presentan un resto C6- o C16-alquilo, que también puede ser ramificado o insaturado en caso dado.
El concepto "actividad acrecentada de una enzima" se debe entender preferentemente como actividad intracelular acrecentada. Las siguientes explicaciones sobre el aumento de la actividad enzimática en células se consideran tanto para el aumento de actividad de la enzima E1 a E3 como también para todas enzimas citadas a continuación, cuya actividad se puede aumentar en caso dado. En principio se puede obtener un aumento de la actividad enzimática aumentándose el número de copias de la secuencia génica, o bien de las secuencias génicas que codifican para la enzima, empleándose un promotor fuerte o un punto de unión de ribosomas mejorado, debilitándose una regulación negativa de la expresión génica, a modo de ejemplo mediante reguladores de transcripción, o intensificándose una regulación positiva de la expresión génica, a modo de ejemplo mediante reguladores de transcripción, modificándose la utilización de codón del gen, aumentándose la vida media de mARN o de la enzima de diferentes maneras, modificándose la regulación de la expresión del gen o utilizándose un gen o alelo que codifica para una enzima correspondiente con una actividad elevada, y combina estas medidas en caso dado. Se generan células modificadas mediante técnica génica según la invención, a modo de ejemplo, mediante transformación, transducción, conjugación, o una combinación de estos métodos, con un vector que contiene el gen deseado, un alelo de este gen o partes del mismo, y en caso dado un promotor que posibilita la expresión del gen. La expresión heteróloga se obtiene en especial mediante integración del gen o de los alelos en el cromosoma de la célula o un vector replicante de modo extracromosómico. Ofrece una visión de conjunto sobre las posibilidades para el aumento de la actividad enzimática en células en el ejmplo de piruvato-carboxilasa el documento DE-A-10031 999, que se introduce como referencia en el presente documento, y cuyo contenido divulgativo respecto a las posibilidades para el aumento de la actividad enzimática forma una parte de la divulgación de la presente invención. La expresión de enzimas, o bien genes citados anteriormente y a continuación en su totalidad es identificable con ayuda de separación en gel proteico 1- y 2-dimensional, y subsiguiente identificación óptica de la concentración de proteínas con correspondiente software de valoración en el gel. Si el aumento de una actividad enzimática se basa exclusivamente en un aumento de la expresión del correspondiente gen, la cuantificación del aumento de la actividad enzimática se puede determinar fácilmente mediante una comparación de las separaciones de proteínas 1- y 2-dimensionales entre tipo salvaje y células modificadas mediante técnica génica. Un método común para la preparación de geles proteicos en bacterias corineformes y para la identificación de proteínas es el procedimiento descrito por Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001)). La concentración de proteínas se puede analizar igualmente mediante hibridación Western-Blot con un anticuerpo específico para la proteína a identificar (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) y subsiguiente valoración óptica con correspondiente software para la determinación de la concentración (Lohaus y Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999) Angewandte Chemie 111: 2630-2647). La actividad de proteínas que enlazan ADN se puede medir mediante ensayos de desplazamiento de banda de ADN (también denominado retardo de gel) (Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151 -2155). La acción de proteínas que enlazan ADN sobre la expresión de otros genes se puede identificar mediante diferentes métodos convenientemente descritos del ensayo de gen reportero (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989). Las actividades enzimáticas intracelulares se pueden determinar según diversos métodos descritos (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823). En tanto en las siguientes explicaciones no se indiquen métodos concretos para la determinación de la actividad de una enzima dada, la determinación del aumento de la actividad enzimática, y también la determinación de la reducción de una actividad enzimática, se efectúan preferentemente por medio de métodos descritos en Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) y Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001). Si el aumento de la actividad enzimática se realiza mediante mutación del gen endógeno, tales mutaciones se pueden generar de manera no selectiva según métodos clásicos, como por ejemplo mediante radiación UV o mediante productos químicos mutágenos, o selectivamente por medio de métodos de tecnología génica, como deleción(es), inserción(es) y/o intercambio(s) de nucleótidos. Mediante estas mutaciones se obtienen células modificadas. En especial son mutantes de enzimas especialmente preferentes también aquellas enzimas que ya no inhibibles en retroalimentación, producto o sustrato, o lo son al menos de manera reducida en comparación con la enzima de tipo salvaje. Si el aumento de la actividad enzimática se realiza mediante aumento de la síntesis de una enzima, a modo de ejemplo se aumenta el número de copias de los correspondientes genes, o se muta la región de promotor y regulación, o el punto de enlace ribosómico, que se encuentra en línea de entrada del gen estructural. Del mismo modo actúan cassettes de expresión que se incorporan en línea de entrada del gen estructural. Mediante promotores inducibles es posible adicionalmente aumentar la expresión en cualquier momento arbitrario. No obstante, por lo demás, al gen enzimático se pueden asignar también los denominados “potenciadores“ como secuencias reguladoras, que ocasionan igualmente una expresión génica aumentada a través de una interacción mejorada entre ARN-polimerasa y ADN. Mediante medidas para la prolongación de la vida útil de mARN se mejora igualmente la expresión. Además, mediante inhibición de la degradación de la proteína enzimática se intensifica asimismo la actividad enzimática. Los genes o construcciones genéticas se presentan en este caso en plásmidos con diferente número de copias, o están integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente se puede obtener además una sobreexpresión de los genes respectivos mediante modificación de la composición del medio y el control de cultivo. El especialista encuentra explicaciones a tal efecto, entre otros, en Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), en Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en el documento eP-A-0472 869, en el documento US 4,601,893, en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en el documento WO-A-96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), en JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191 -195 (1998)) y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular. Las medidas descritas anteriormente conducen a células modificadas mediante técnica génica, al igual que las mutaciones. Para el aumento de la expresión de los respectivos genes se emplean, por ejemplo, plásmidos episomales. En principio entran en consideración como plásmidos, o bien vectores, todas las formas de realización disponibles para el especialista con este fin. Tales plásmidos y vectores se pueden extraer, por ejemplo, de las publicaciones de las firmas Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech o Gibco BRL. Otros plásmidos y vectores preferentes se pueden encontrar en: Glover, D. M. (1985) DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. y Denhardt, D. T (eds) (1988) Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990) Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York. El vector plásmido, que contiene el gen a amplificar, se transforma a continuación en la cepa deseada mediante conjugación o transformación. El método de conjugación se describe, a modo de ejemplo, en Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994). Se describen métodos para la transformación, a modo de ejemplo, en Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican y Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) y Tauch et al., fEmS Microbiology Let-ters 123: 343-347 (1994). Tras recombinación homóloga por medio de un resultado "cross-over", la cepa resultante contiene al menos dos copias del gen afectado. Bajo la formulación empleada anteriormente y en las siguientes explicaciones "una actividad de una enzima Ex acrecentada en comparación con su tipo salvaje“, siempre se debe entender preferentemente una actividad de la respectiva enzima Ex acrecentada al menos en el factor 2, de modo especialmente preferente de al menos 10, además preferentemente de al menos 100, además, de modo aún más preferente de al menos 1.000, y del modo más preferente de al menos 10.000. Además, la célula según la invención, que presenta "una actividad de una enzima Ex acrecentada en comparación con su tipo salvaje“, también comprende en especial una célula cuyo tipo salvaje no presenta una actividad enzimática, al menos identificable, de esta enzima Ex, y que muestra una actividad identificable de esta enzima Ex solo tras aumento de la actividad enzimática, a modo de ejemplo mediante sobrexpresión. En este contexto, el concepto "sobreexpresión" o la formulación "aumento de la expresión" empleada en las siguientes explicaciones, comprende también el caso de que una célula de partida, a modo de ejemplo una célula de tipo salvaje, no presente una expresión, o al menos identificable, y se induzca una síntesis identificable de la enzima Ex solo mediante procedimientos recombinantes.
El especialista conoce modificaciones de los restos aminoácido de una secuencia de polipéptidos dada, que no conducen a modificaciones esenciales de las propiedades y la función del polipéptido dado. A modo de ejemplo, los denominados aminoácidos conservados se pueden intercambiar entre sí; son ejemplos de tales sustituciones de aminoácido apropiadas: Ala por Ser; Arg por Lys; Asn por Gln o His; Asp por Glu; Cys por Ser; Gln por Asn; Glu por Asp; Gly por Pro; His por Asn o Gln; Ile por Leu o Val; Leu por Met o Val; Lys por Arg o Gln o Glu; Met por Leu o Ile; Phe por Met o Leu o Tyr; Ser por Thr; Thr por Ser; Trp por Tyr; Tyr por Trp o Phe; Val por Ile o Leu. Asimismo, es sabido que las modificaciones, especialmente en el extremo N o C de un polipéptido en forma de inserciones o deleciones de aminoácidos, no ejercen frecuentemente una influencia esencial en la función del polipéptido.
La actividad de una enzima se puede determinar disgregándose células que contienen esta actividad de modo conocido por el especialista, a modo de ejemplo con ayuda de un molino de bolas, una prensa francesa o un desintegrador ultrasónico, y separándose a continuación células intactas, fragmentos celulares y adyuvantes de disgregación, como por ejemplo bolas de vidrio, mediante centrifugación de 10 minutos a 13000 rpm y 4°C. Con el extracto crudo exento de células resultante se pueden llevar a cabo entonces el ensayo enzimático con subsiguiente detección de los productos por LC-ESI-MS. Alternativamente, la enzima se puede concentrar, o también purificar hasta homogeneidad de modo conocido por el especialista, mediante métodos cromatográficos (como cromatografía de afinidad de níquel-ácido nitrilotriacético, cromatografía de afinidad de estreptavidina, cromatografía de filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico).
La actividad de la enzima E1 se determina entonces con las muestras obtenidas como se describe anteriormente de la siguiente manera: un ensayo estándar contiene E. coli ACP 100 pM, p-mercaptoetanol 1 mM, malonil-coenzima A 200 pM, octanoil-coenzima A 40 pM (para Eia) o dodecanoil-coenzima A (para Eib), NADPH 100 pM, 2 pg E. coli FabD, 2 pg de Mycobacterium tuberculosis FabH, 1 pg de E. coli FabG, tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,0, y 5 pg de enzima E1 en un volumen final de 120 pL. ACP, p-mercaptoetanol y tampón fosfato sódico se incuban previamente 30 minutos a 37°C para reducir completamente la ACP. La reacción se inicia mediante adición de enzima E1. Las reacciones se detienen con 2 ml de agua, que se ha acidificado con HCl a pH 2,0, y a continuación se extrae dos veces con 2 ml de cloroformo/metanol (2:1 (v:v)). Se efectúa separación de fases mediante centrifugado (16.100 g, 5 min, RT). La fase orgánica inferior se retira, se evapora completamente en la centrífuga de vacío, y el sedimento se absorbe en 50 pl de metanol. Los componentes no disueltos se sedimentan mediante centrifugado (16.100 g, 5 min, RT), y la muestra se analiza por medio de LC-ESI-MS. La identificación de los productos se efectúa mediante análisis de las correspondientes trazas másicas y espectros de MS2.
La actividad de la enzima E2 se determina entonces con las muestras obtenidas como se describe anteriormente de la siguiente manera: un ensayo estándar puede estar constituido por 185 pl de tris-HCl 10 mM (pH 7,5), 10 pl de 125 mM dTDP-ramnosa y 50 pl de extracto de proteína (aproximadamente 1 mg de proteína total), o proteína purificada en disolución (5 pg de proteína purificada). La reacción se inicia mediante la adición de 10 pl de disolución etanólica 10 mM de ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico (para E2a) o ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico (para E2b), y se incuba 1 h a 30°C bajo agitación (600 rpm). A continuación, se mezcla la reacción con 1 ml de acetona. Los componentes insolubles se sedimentan mediante centrifugado (16.100 g, 5 min, RT), y la muestra se analiza por medio de LC-ESI-MS. La identificación de los productos se efectúa mediante análisis de las correspondientes trazas másicas y espectros de MS2.
La actividad de la enzima E3 se determina entonces con las muestras obtenidas como se describe anteriormente de la siguiente manera: un ensayo estándar puede estar constituido por 185 pl de tris-HCl 10 mM (pH 7,5), 10 pl de dTDP-ramnosa 125 mM y 50 pl de extracto crudo de proteína (aproximadamente 1 mg de proteína total), o proteína purificada en disolución (5 pg de proteína purificada). La reacción se inicia mediante la adición de 10 pl de disolución etanólica 10 mM de ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico (para E3a) o ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico (para E3b), y se incuba 1 h a 30°C bajo agitación (600 rpm). A continuación, se mezcla la reacción con 1 ml de acetona. Los componentes insolubles se sedimentan mediante centrifugado (16.100 g, 5 min, RT), y la muestra se analiza por medio de LC-ESI-MS. La identificación de los productos se efectúa mediante análisis de las correspondientes trazas másicas y espectros de MS2.
Según la invención son preferentes células que presentan actividades acrecentadas de las siguientes combinaciones de enzimas:
E1, E2, E3, E1E2, E1E3, E2E3 y E1E2E3,
de las que es especialmente preferente la combinación
E2, E2E3 y E1E2E3, en especial E1E2E3.
En una forma configuración preferente de la célula según la invención, que presenta una actividad acrecentada de la combinación enzimática E1E2E3, n es preferentemente =1.
Las células según la invención son microorganismos, como levaduras, hongos o bacterias, siendo especialmente preferentes los microorganismos, y siendo preferentes en la mayor parte de los casos las bacterias y las levaduras. Como bacterias, levaduras u hongos son apropiadas en especial aquellas bacterias, levaduras u hongos que se depositan en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen y Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Alemania, como cepas de bacterias, levaduras u hongos. Las bacterias apropiadas según la invención pertenecen a las especies que se enumeran en
http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm,
las levaduras apropiadas según la invención pertenecen a aquellas especies que se enumeran en
http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm,
y los hongos apropiados según la invención son aquellos que se enumeran en
ttp://www.dsmz.de/species/fungi.htm.
Células preferentes según la invención son aquellas de las especies Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium y Cupriavidus, siendo especialmente preferentes Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Burkholderia andropogonis, B. brasilensis, B. caledonica, B. caribensis, B. caryophylli, B. fungorum, B. gladioli, B. glathei, B. glumae, B. graminis, B. hospita, B. kururiensis, B. phenazinium, B. phymatum, B. phytofirmans, B. plantarii, B. sacchari, B. singaporensis, B. sordidicola, B. terricola, B. tropica, B. tuberum, B. ubonensis, B. unamae, B. xenovorans, B. anthina, B. pyrrocinia, B. thailandensis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Escherichia coli, Hansenula polymorpha, Kluveromyces lactis, Methylobacterium extorquens, Paracoccus versutus, Pseudomonas argentinensis, P. borbori, P. citronellolis, P. flavescens, P. mendocina, P. nitroreducens, P. oleovorans, P. pseudoalcaligenes, P. resinovorans, P. straminea, P. aurantiaca, P. aureofaciens, P. chlororaphis, P. fragi, P. lundensis, P. taetrolens, P. antarctica, P. azotoformans, 'P. blatchfordae', P. brassicacearum, P. brenneri, P. cedrina, P. corrugata, P. fluorescens, P. gessardii, P. libanensis, P. mandelii, P. marginalis, P. mediterranea, P. meridiana, P. migulae, P. mucidolens, P. orientalis, P. panacis, P. proteolytica, P. rhodesiae, P. synxantha, P. thivervalensis, P. tolaasii, P. veronii, P. denitrificans, P. pertucinogena, P. cremoricolorata, P. fulva, P. monteilii, P. mosselii, P. parafulva, P. putida, P. balearica, P. stutzeri, P. amygdali, P. avellanae, P. caricapapayae, P. cichorii, P. coronafaciens, P. ficuserectae, 'P. helianthi', P. meliae, P. savastanoi, P. syringae, P. tomato, P. viridiflava, P. abietaniphila, P. acidophila, P. agarici, P. alcaliphila, P. alkanolytica, P. amyloderamosa, P. asplenii, P. azotifigens, P. cannabina, P. coenobios, P. congelans, P. costantinii, P. cruciviae, P. delhiensis, P. excibis, P. extremorientalis, P. frederiksbergensis, P. fuscovaginae, P. gelidicola, P. grimontii, P. indica, P. jessenii, P. jinjuensis, P. kilonensis, P. knackmussii, P. koreensis, P. lini, P. lutea, P. moraviensis, P. otitidis, P. pachastrellae, P. palleroniana, P. papaveris, P. peli, P. perolens, P. poae, P. pohangensis, P. psychrophila, P. psychrotolerans, P. rathonis, P. reptilivora, P. resiniphila, P. rhizosphaerae, P. rubescens, P. salomonii, P. segitis, P. septica, P. simiae, P. suis, P. thermotolerans, P. aeruginosa, P. tremae, P. trivialis, P. turbinellae, P. tuticorinensis, P. umsongensis, P. vancouverensis, P. vranovensis, P. xanthomarina, Ralstonia eutropha, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica y Zymomonas mobilis, en especial Pseudomonas putida, Escherichia coli y Burkholderia thailandensis.
Las células preferentes según la invención como tipo salvaje no pueden formar cantidades o cantidades identificables de ramnolípidos, y además no presentan preferentemente una actividad, o una actividad identificable de las enzimas E1,E2 y E3.
Según la invención es ventajoso que la célula según la invención sea una célula que puede formar como tipo salvaje polihidroxialcanoatos con longitudes de cadena de monoalcanoato de C6 a C16. Tales células son, a modo de ejemplo, Burkholderia sp., Burkholderia thailandensis, Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas citronellolis, Pseudomonas resinovorans, Comamonas testosteroni, Aeromonas hydrophila, Cupriavidus necator, Alcaligenes latus y Ralstonia eutropha. En este contexto, las células preferentes según la invención están modificadas mediante técnica génica, de modo que pueden formar menos polihidroxialcanoatos en comparación con su tipo salvaje. Tales células se describen, a modo de ejemplo, en De Eugenio et al., Environ Microbiol. 2010. 12(1 ):207-21 y Rehm et al., Appl Environ Microbiol. 2001.67(7):3102-9. Tal célula, que puede formar menos polihidroxialcanoatos en comparación con su tipo salvaje, está caracterizada especialmente por que, en comparación con su tipo salvaje, presenta una actividad reducida de una enzima Eg o E10,
representando Eg una polihidroxialcanoato-sintasa, EC:2.3.1.-, en especial con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 30 o Seq ID Nr. 32, o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácidos están modificados frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 30 o Seq ID Nr.
32 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 30 o Seq ID Nr. 32, entendiéndose por actividad enzimática de una enzima Eg la capacidad de transformar 3-hidroxialcanoil-coenzima A en ácido poli-3-hidroxialcanoico, en especial 3-hidroxitetradecanoil-coenzima A en ácido poli-3-hidroxitetradecanoico, y
E10 una 3-hidroxialcanoil-ACP:coenzima A-transferasa, en especial con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 34 o Seq ID Nr. 36, o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido están transformados frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 34 o Seq ID Nr. 36 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 34 o Seq ID Nr. 36, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E10 la capacidad de transformar 3-hidroxialcanoil-ACP en 3-hidroxialcanoilcoenzima A, en especial 3-hidroxialcanoil-ACP en 3-hidroxitetradecanoil-coenzima A.
Para una visión general véase la Figura 1.
La actividad de la enzima E9 se determina entonces con las muestras obtenidas como se describe anteriormente para las enzimas E1 a E3, mezclándose en primer lugar 560 pl de Tris/HCl 100 mM, pH 7,5, 20 pl de DTNB 35 mM en DMSO y 20 pl de 3-hidroxidecanoil-coenzima A 41 mM. A continuación, se añaden 5 pg de enzima purificada E9 en 100 pl de tris/HCl, pH 7,5, y a continuación se registra continuamente durante 1 minuto el descenso de extinción a 412 nm en el espectrofotómetro (provocado por adición de 5,5‘-ditiobis(2-hitrobenzoato) (DTNB) en grupos SH libres) a lo largo del tiempo (AE/min).
La actividad de la enzima E10 se determina entonces con las muestras obtenidas como se describe anteriormente para las enzimas E1 a E3. El ensayo estándar contiene MgCl23 mM, hidroxidecanoil-coenzima A 40 pM y E. coli ACP 20 pM en tris-HCl 50 mM, pH 7,5, en un volumen total de 200 pl. La reacción se inicia mediante adición de 5 pg de enzima purificada E10 en 50 pl de Tris/HCl, pH 7,5 y se incuba durante 1 h a 30°C. La reacción se detiene mediante adición de 50 % (w/v) de ácido tricloroacético y 10 mg/ml BSA (30 pl). La coenzima A liberada se determina mediante espectrofotometría, registrándose la extinción a 412 nm, ocasionada mediante adición de 5,5‘-ditiobis(2-nitrobenzoato) (DTNB) en grupos SH libres a lo largo del tiempo.
Por consiguiente, bajo la formulación empleada "actividad reducida de una enzima Ex" se entiende preferentemente una actividad reducida preferentemente en un factor de al menos 0,5, de modo especialmente preferente de al menos 0,1, además preferentemente de al menos 0,01, además de modo aún más preferente de al menos 0,001, y del modo más preferente de al menos 0,0001. La formulación "actividad reducida" incluye también ninguna actividad detectable ("actividad de cero"). La reducción de la actividad de una enzima determinada se puede efectuar, a modo de ejemplo, mediante mutación selectiva u otras medidas para la reducción de la actividad de una enzima determinada conocidas por el especialista. El especialista conoce procedimientos para la reducción de actividades enzimáticas en microorganismos. En este caso se ofrecen en especial técnicas de biología molecular. El especialista encuentra una guía para la modificación y reducción de la expresión de proteínas y, acompañando a ésta, una reducción de la actividad enzimática, especialmente para Pseudomonas y Burkholderia, en especial para la interrupción de genes especiales, a modo de ejemplo, en Dubeau et al. 2009. BMC Microbiology 9:263; Singh & Rohm. Microbiology. 2008.
154:797-809 o Lee et al. FEMS Microbiol Lett. 2009. 297(1):38-48. Las células preferentes según la invención están caracterizadas por que la reducción de la actividad enzimática se consigue mediante una modificación de un gen que comprene una de las citadas secuencias de ácido nucleico, seleccionándose la modificación a partir del grupo constituido preferentemente por inserción de ADN ajeno en el gen, deleción de al menos partes del gen, mutaciones por puntos en la secuencia génica, interferencia de ARN (siRNA), ARN antisentido o modificación (inserción, deleción o mutaciones por puntos) de secuencias reguladoras, como por ejemplo promotores y terminadores, o de puntos de enlace de ribosomas que flanquean el gen. En este contexto, se entiende por ADN ajeno cualquier secuencia de ADN que es “ajena“ al gen (y no al organismo), es decir, también secuencias de ADN endógenas pueden actuar como “ADN ajeno“ en este contexto. En este contexto es especialmente preferente que el gen se interrumpa mediante inserción de un gen marcador de selección, por lo que el ADN ajeno es un gen marcador de selección, efectuándose preferentemente la inserción mediante recombinación homóloga en el locus genético.
En una forma preferente de realización de la célula según la invención, en el caso de la célula se trata de células de Pseudomonas putida, que presentan una síntesis de polihidroxialcanoato reducida en comparación con su tipo salvaje. Tales células se describen, a modo de ejemplo, en Ren et al., Journal Applied Microbiology and Biotechnology 1998 Jun, 49(6):743-50 como GPp121, GPp122, GPp123 y GPp124, en Huisman et al., J Biol Chem. 1991 Feb 5;266(4):2191-8 como GPp104, así como en De Eugenio et al., Environ Microbiol. 2010. 12(1 ):207-21 como KT42C1 y en Ouyang et al. Macromol Biosci. 2007. 7(2):227-33 como KTOY01 y KTOY02.
Para el caso de que la célula según la invención pueda formar un ramnolípido con m=1, es preferente que el resto determinado a través de R1 y R2
Figure imgf000012_0001
se derive de ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3-hidroxidecenoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidodecenoico, ácido 3-hidroxidodecenoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3-hidroxidecenoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidecenoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidodecenoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidodecenoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxitetradecenoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3-hidroxidodecenoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxitetradecanoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxitetradecenoico, ácido 3-hidroxitetradecenoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidodecenoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxidodecenoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxitetradecanoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, ácido 3-hidroxihexadecanoil-3-hidroxitetradecanoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxihexadecanoico o ácido 3-hidroxihexadecanoil-3-hidroxihexadecanoico.
Para el especialista es obvio que una célula según la invención también puede formar mezclas de diferentes ramnolípidos de la Fórmula general (I). En este contexto es preferente que las células según la invención puedan formar mezclas de ramnolípidos de la Fórmula general (I), que están caracterizadas por que en más de un 80 % en peso, preferentemente más de un 90 % en peso, de modo especialmente preferente más de un 95 % en peso de los ramnolípidos formados n es = 1, y el resto determinado a través de R1 y R2 se deriva en menos de un 10 % en peso, preferentemente menos de un 5 % en peso, de modo especialmente preferente menos de un 2 % en peso de los ramnolípidos formados de ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxioctanoico o ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidecanoico, refiriéndose los % en peso indicados a la suma de todos los ramnolípidos de la Fórmula general (I) formados.
Es ventajoso que la celula según la invención se modifique adicionalmente mediante técnica génica en relación con E1 a E3, de modo que presente una actividad acrecentada en comparación con su tipo salvaje, como se especifica respectivamente a continuación, de al menos una de las enzimas seleccionadas a partir del grupo constituido por
al menos una enzima E4, una dTTP:a-D-glucosa-1-fosfato timidililtransferasa, EC 2.7.7.24, en especial una con secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 10 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido están transformados frente a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 10 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 10, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E4 la capacidad de transformar 1 -fosfato de a-D-glucosa y dTTP en dTDP-glucosa,
al menos una enzima E5, una dTTP-glucosa-4,6-hidroliasa, EC 4.2.1.46, en especial una con secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 12 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido están transformados frente a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 12 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 12, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E5 la capacidad de transformar dTDP-glucosa en dTDP-4-dehidro-6-deoxi-D-glucosa,
al menos una enzima E6, una dTDP-4-dehidrorramnosa-3,5-epimerasa, EC 5.1.3.13, en especial una con secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 14 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido están transformados frente a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 14 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 14, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E6 la capacidad de transformar dTDP-4-dehidro-6-deoxi-D-glucosa en dTDP-4-dehidro-6-deoxi-L-manosa y
al menos una enzima E7, una dTDP-4-dehidrorramnosa-reductasa, EC 1.1.1.133, en especial una con secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 16 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido están transformados frente a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 16 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 16, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima E7 la capacidad de transformar dTDP-4-dehidro-6-deoxi-L-manosa en dTDP-6-deoxi-L-manosa.
La actividad de la enzima E4 se determina con las muestras obtenidas como se describe anteriormente para las enzimas E1 a E3, incubándose a-D-glucosa-1 -fosfato (1,3 mM) con dTTP (5 mM) y 5 qg de enzima purificada E4 en 50 |ul de tampón fosfato sódico, pH 8,5, y deteniéndose la reacción tras 5, 10 y 20 minutos de incubación a 30°C mediante adición de 20 ql de cloroformo. La mezcla se agita a continuación y se centrifuga 5 minutos a 16.000 g y temperatura ambiente. La fase acuosa se traslada a un nuevo recipiente de reacción y la fase orgánica se extrae de nuevo con 80 |ul de agua. Ambas fases acuosas se reúnen y se analizan por medio de HPLC. En este caso se emplea una columna Phenosphere-ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) o una columna Spheresorb-ODS2(250 x 4,6 mm; Waters, Milford, USA). La elución de los analitos se efectúa con una tasa de flujo de 1 ml min-1 con KH2PO40,5 M (eluyente A) durante 15 minutos, seguido de un gradiente lineal hasta un 80 % de eluyente A y un 20 % de metanol durante un intervalo de tiempo de 14 minutos con una tasa de flujo de 0,7 ml min-1. Los analitos que se eluyen de la columna ODS2 se inyectan entonces en una columna de intercambio iónico Phenosphere-SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) y los analitos se eluyen con una tasa de flujo de 1 ml min-1 y un gradiente lineal de formiato amónico (2 a 600 mM durante 25 min). La cuantificación de dTDP glucosa se efectúa entonces a través de su absorción UV con un detector de ensayo de fotodiodos (DAD). El máximo de absorción de timidina se sitúa en 267 nm. El calibrado se efectúa por medio de azúcar de nucleótido auténtico (Sigma-Aldrich, München, USA).
La actividad de la enzima E5 se determina con las muestras obtenidas como se describe anteriormente para las enzimas E1 bis E3, incubándose dTDP-a-D-glucosa (1,3 mM) con 5 qg de enzima purificada E5 en 50 ql de tampón fosfato sódico, pH 8,5, y deteniéndose la reacción tras 5, 10 y 20 minutos de incubación a 30°C mediante adición de 20 |ul de cloroformo. La mezcla se agita a continuación y se centrifuga 5 minutos a 16.000 g y temperatura ambiente. La fase acuosa se traslada a un nuevo recipiente de reacción y la fase orgánica se extrae de nuevo con 80 ql de agua. Ambas fases acuosas se reúnen y se analizan por medio de HPLC. En este caso se emplea una columna Phenosphere-ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) o una columna Spheresorb-ODS2(250 x 4,6 mm; Waters, Milford, USA). La elución de los analitos se efectúa con una tasa de flujo de 1 ml min-1 con KH2PO40,5 M (eluyente A) durante 15 minutos, seguido de un gradiente lineal hasta un 80 % de eluyente A y un 20 % de metanol durante un intervalo de tiempo de 14 minutos con una tasa de flujo de 0,7 ml min-1. Los analitos que se eluyen de la columna ODS2 se inyectan entonces en una columna de intercambio iónico Phenosphere-SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) y los analitos se eluyen con una tasa de flujo de 1 ml min-1 y un gradiente lineal de formiato amónico (2 a 600 mM durante 25 min). La cuantificación de dTDP-glucosa y dTDP-4-dehidro-6-deoxi-D-glucosa se efectúa entonces a través de su absorción UV con un detector de ensayo de fotodiodos (DAD). El máximo de absorción de timidina se sitúa en 267 nm. El calibrado se efectúa por medio de azúcar de nucleótido auténtico (Sigma-Aldrich, München, USA).
La actividad de la enzima E6 se determina con las muestras obtenidas como se describe anteriormente para las enzimas E1 bis E3, incubándose en primer lugar dTDP-a-D- glucosa (1,3 mM) con 5 qg de enzima purificada E5 en 50 |ul de tampón fosfato sódico, pH 8,5, durante 10 minutos a 30°C. A continuación, se añaden 0,5 qg de enzima purificada E6, y se detiene la reacción tras 5, 10 y 20 minutos de incubación a 30°C mediante adición de 20 ql de cloroformo. La mezcla se agita a continuación y se centrifuga 5 minutos a 16.000 g y temperatura ambiente. La fase acuosa se traslada a un nuevo recipiente de reacción y la fase orgánica se extrae de nuevo con 80 ql de agua. Ambas fases acuosas se reúnen y se analizan por medio de HPLC. En este caso se emplea una columna Phenosphere-ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) o una columna Spheresorb-ODS2(250 x 4,6 mm; Waters, Milford, USA). La elución de los analitos se efectúa con una tasa de flujo de 1 ml min-1 con KH2PO40,5 M (eluyente A) durante 15 minutos, seguido de un gradiente lineal hasta un 80 % de eluyente A y un 20 % de metanol durante un intervalo de tiempo de 14 minutos con una tasa de flujo de 0,7 ml min-1. Los analitos que se eluyen de la columna ODS2 se inyectan entonces en una columna de intercambio iónico Phenosphere-SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) y los analitos se eluyen con una tasa de flujo de 1 ml min-1 y un gradiente lineal de formiato amónico (2 a 600 mM durante 25 min). La cuantificación de dTDP-glucosa, dTDP-4-dehidro-6-deoxi-D-glucosa y dTDP-6-deoxi-L-manosa se efectúa entonces a través de su absorción UV con un detector de ensayo de fotodiodos (DAD). El máximo de absorción de timidina se sitúa en 267 nm. El calibrado se efectúa por medio de azúcar de nucleótido auténtico (Sigma-Aldrich, München, USA).
La actividad de la enzima E7 se determina con las muestras obtenidas como se describe anteriormente para las enzimas Ei bis E3, incubándose en primer lugar dTDP-a-D-glucosa (1,3 mM) con 5 gg de enzima purificada E5 en 50 gl de tampón fosfato sódico, pH 8,5, durante 10 minutos a 30°C. A continuación, se añaden 5 gg de enzima purificada E6 y un 0,5 gg de enzima purificada E7, así como NADPH (10 mM), y se detiene la reacción tras 5, 10 y 20 minutos de incubación a 30°C mediante adición de 20 gl de cloroformo. La mezcla se agita a continuación y se centrifuga 5 minutos a 16.000 g y temperatura ambiente. La fase acuosa se traslada a un nuevo recipiente de reacción y la fase orgánica se extrae de nuevo con 80 gl de agua. Ambas fases acuosas se reúnen y se analizan por medio de HPLC. En este caso se emplea una columna Phenosphere-ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) o una columna Spheresorb-ODS2(250 x 4,6 mm; Waters, Milford, USA). La elución de los analitos se efectúa con una tasa de flujo de 1 ml min-1 con KH2PO40,5 M (eluyente A) durante 15 minutos, seguido de un gradiente lineal hasta un 80 % de eluyente A y un 20 % de metanol durante un intervalo de tiempo de 14 minutos a una tasa de flujo de 0,7 ml min-1. Los analitos que se eluyen de la columna ODS2 se inyectan entonces en una columna de intercambio iónico Phenosphere-SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) y los analitos se eluyen con una tasa de flujo de 1 ml min-1 y un gradiente lineal de formiato amónico (2 a 600 mM durante 25 min). La cuantificación de dTDP-glucosa, dTDP-4-dehidro-6-deoxi-D-glucosa, dTDP-6-deoxi-L-manosa y dTDP-4-dehidro-6-deoxi-L-manosa se efectúa entonces mediante su absorción UV con un detector de ensayo de fotodiodos (DAD). El máximo de absorción de timidina se sitúa en 267 nm. El calibrado se efectúa por medio de azúcar de nucleótido auténtico (Sigma-Aldrich, München, USA).
Según la invención son preferentes células que presentan actividades acrecentadas de las siguientes combinaciones de enzimas:
E4E5, E4E6, E4E7, E5E6, E5E7, E6E7, E4E5E6, E4E5E7, E5E6E7, E4E6E7, E4E5E6E7,
siendo especialmente preferente la combinación
E4E5E6E7.
Según la invención puede ser ventajoso que la célula según la invención se modifique mediante técnica génica en la biosíntesis de ácidos grasos, de modo que se intensifiquen las reacciones enzimáticas que conducen a la transformación de acil-ACP y malonil-coenzima A en 3-cetoacil-ACP y/o a la transformación de 3-cetoacil-ACP en (R)-3-hidroxialcanoil-ACP. De manera adicional o alternativa, puede ser ventajoso que la célula según la invención se modifique mediante técnica génica en la biosíntesis de ácidos grasos, de modo que se debiliten las reacciones enzimáticas que conducen a la transformación de (R)-3-hidroxialcanoil-ACP en trans-2-enoil-ACP y/o a transformación de trans-2-enoil-ACP en acil-ACP. Igualmente puede ser ventajoso que la célula según la invención se modifique mediante técnica génica en la p-oxidación de ácidos grasos, de modo que se intensifiquen las reacciones enzimáticas que conducen a la transformación de acil-coenzima A en trans-2-enoil-coenzima A y/o a la transformación de trans-2-enoil-coenzima A en (S)-3-hidroxialcanoil-coenzima A. De manera alternativa o adicional, según la invención puede ser ventajoso que la célula según la invención se modifique mediante técnica génica en la p-oxidación de ácidos grasos, de modo que se debiliten las reacciones enzimáticas que conducen a la transformación de (S)-3-hidroxialcanoil-coenzima A en 3-cetoacil-coenzima A y/o a la transformación de 3-cetoacil-coenzima A en acilcoenzima A y acetil-coenzima A.
Para una visión de conjunto véase la Figura 1.
Ya que las células según la invención se pueden emplear ventajosamente para la producción de ramnolípidos, y ya que estos lípidos se purifican a continuación en caso dado, es ventajoso que las células según la invención presenten una actividad de al menos una enzima E8 aumentada frente a su tipo salvaje, que cataliza la exportación de un ramnolípido de la Fórmula general (I) de la célula al medio circundante.
En este contexto se seleccionan preferentemente proteínas E8 a partir del grupo constituido por
una enzima E8 con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28, o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoácido se han modificado frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que posee aún al menos un 50 %, preferentemente un 65 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial más de un 90 % de la actividad enzimática de la enzima con la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28, entendiéndose por actividad enzimática para una enzima Es la capacidad de exportar un ramnolípido de la Fórmula general (I) de la célula al medio circundante. Otra forma preferente de realización de células según la invención está caracterizada por que presenta al menos uno de los ácidos nucleicos o vectores según la invención citados más abajo.
Las células según la invención se pueden emplear ventajosamente para la producción de ramnolípidos. Por consiguiente, se da a conocer el empleo de células según la invención para la producción de compuestos de la Fórmula general (I).
Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para la producción de ramnolípidos de la fórmula general (I),
siendo
m = 2, 1 o 0, en especial 1 o 0,
n = 1 o 0, en especial 1,
R1 y R2 = independientemente entre sí, restos orgánicos iguales o diferentes independientemente entre sí, con 2 a 24, preferentemente 5 a 13 átomos de carbono, en especial resto alquilo, en caso dado ramificado, en caso dado sustituido, en especial hidroxisustituido, en caso dado insaturado, en especial, en caso dado, mono-, di- o triinsaturado, preferentemente aquellos seleccionados a partir del grupo constituido por pentenilo, heptenilo, nonenilo, undecenilo y tridecenilo, y (CH2)o-CH3 con o = 1 a 23, preferentemente 4 a 12, que comprende los pasos de procedimiento
I) puesta en contacto de la célula según la invención con un medio que contiene una fuente de carbono,
II) cultivo de la célula bajo condiciones que posibilitan a la célula formar ramnolípido a partir de la fuente de carbono, y
III) en caso dado aislamiento de los ramnolípidos formados.
Las células modificadas mediante técnica génica según la invención se pueden poner en contacto y, por consiguiente, cultivar con el medio nutriente continua o discontinuamente en procedimiento por cargas (cultivo discontinuo) o en procedimiento de cargas de alimentación (procedimiento de alimentación), o procedimiento de carga de alimentación reiterada (procedimiento de alimentación repetitiva) para la producción de los productos citados anteriormente. También es concebible un procedimiento semicontinuo, como se describe en el GB-A-1009370. Se describe una sinopsis sobre métodos de cultivo conocidos en el manual de Chmiel ("Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el manual de Storhas ("Bioreaktoren and periphere Einrichtungen", editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994). El medio de cultivo a emplear debe cumplir los requisitos de las respectivas cepas de modo apropiado. Se incluyen descripciones de medios de cultivo de diversas cepas de levadura, a modo de ejemplo, en "Nonconventional yeast in biotechnology" (Ed. Klaus Wolf, editorial Springer Berlin, 1996). Como fuente de carbono se pueden emplear hidratos de carbono, como por ejemplo glucosa, sacarosa, arabinosa, xilosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidón, celulosa y hemicelulosa, aceites y grasas vegetales y animales, como por ejemplo aceite de soja, aceite de cardo, aceite de cacahuete, aceite de cáñamo, aceite de jatropa, grasa de coco, aceite de semillas de calabaza, aceite de linaza, aceite de maíz, aceite de amapola, aceite de onagra, aceite de oliva, aceite de semillas de palmiste, aceite de palma, aceite de colza, aceite de sésamo, aceite de girasol, aceite de semillas de uva, aceite de nuez, aceite de germen de trigo y aceite de coco, ácidos grasos, como por ejemplo ácido caprílico, ácido caprínico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido araquidónico, ácido behénico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido gamma-linolénico, y sus ésteres metílicos o etílicos, así como mezclas de ácidos grasos, mono-, di- y triglicéridos con los ácidos grasos que se acaban de mencionar, alcoholes, como por ejemplo glicerina, etanol y metanol, hidrocarburos, como metano, gases que contienen carbono y mezclas de gases, como CO, CO2, gas de síntesis o de humo, aminoácidos, como L-glutamato o L-valina, o ácidos orgánicos, como por ejemplo ácido acético. Estas sustancias se pueden emplear por separado o como mezcla. Es especialmente preferente el empleo de hidratos de carbono, en especial de monosacáridos, oligosacáridos o polisacáridos, como fuente de carbono, tal como se describe en los documentos US 6,01,494 y US 6,136,576, así como de hidrocarburos, en especial de alcanos, alquenos y alquinos, así como los ácidos monocarboxílicos derivados de los mismos, y los mono-, di- y triglicéridos derivados de estos ácidos monocarboxílicos, así como de glicerina y acetato. Son muy especialmente preferentes mono-, di- y triglicéridos que contienen los productos de esterificación de glicerina con ácido caprílico, ácido caprínico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido araquidónico, ácido behénico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico y/o ácido gamma-linolénico. Una gran ventaja de la presente invención consiste en que las células según la invención pueden formar ramnolípidos de las más simples fuentes de carbono, como por ejemplo glucosa, sacarosa o glicerina, de modo que no es necesaria una puesta a disposición de fuentes de C de cadena más larga en el medio durante el procedimiento según la invención. Por consiguiente, en el caso de disponibilidad escasa es ventajoso que el medio no contenga, o no contenga cantidades identificables de ácidos carboxílicos con una longitud de cadena de más de seis átomos de carbono, o ésteres o glicéridos derivables de éstos, en el paso I) del procedimiento según la invención.
Como fuente de nitrógeno se pueden emplear compuestos orgánicos nitrogenados, como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de remojo de maíz, harina de habas de soja y urea, o compuestos inorgánicos, como sulfato amónico, cloruro amónico, fosfato amónico, carbonato amónico y nitrato amónico, amoniaco, hidróxido amónico o agua amoniacal. Las fuentes de nitrógeno se pueden emplear por separado o como mezcla.
Como fuente de fósforo pueden estar contenidos ácido fosfórico, dihidrogenofosfato potásico o hidrogenofosfato dipotásico, o las correspondientes sales que contienen sodio, en el medio nutriente. El medio de cultivo debe contener además sales de metales, como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarios para el crecimiento. Finalmente se pueden emplear substancias de crecimiento esenciales, como aminoácidos y vitaminas, adicionalmente a las substancias citadas anteriormente. Además, se pueden añadir precursores apropiados al medio de cultivo. Las citadas substancias de empleo se pueden añadir al cultivo en forma de una única carga, o alimentar de modo apropiado durante el cultivo. Para el control de pH del cultivo se emplean compuestos básicos, como hidróxido sódico, hidróxido potásico, amoniaco, o bien agua amoniacal, o compuestos ácidos, como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, de modo apropiado. Para el control del espumado se pueden emplear agentes antiespumantes, como por ejemplo poliglicolésteres de ácidos grasos. Para el mantenimiento de la estabilidad de plásmidos se pueden añadir al medio substancias de acción selectiva apropiadas, como por ejemplo antibióticos. Para mantener condiciones aerobias se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, como por ejemplo aire. La temperatura del cultivo se sitúa normalmente en más de 20°C, preferentemente en más de 25°C, ésta puede ascender también a más de 40°C, no sobrepasándose ventajosamente una temperatura de cultivo de 95°C, de modo especialmente preferente 90°C, y del modo más preferente 80°C. En el paso III) del procedimiento según la invención, los ramnolípidos formados por las células se pueden aislar de las células y/o del medio nutriente en caso dado, entrando en consideración para el aislamiento todos los métodos conocidos por el especialista para el aislamiento de sustancias de bajo peso molecular a partir de composiciones complejas, como por ejemplo filtración, extracción, adsorción (cromatografía) o cristalización. Además, la fase de producto contiene restos de biomasa y diferentes impurezas, como aceites, ácidos grasos y otros componentes de medios nutrientes. La separación de impurezas se efectúa preferentemente en un proceso exento de disolvente. De este modo, por ejemplo, se puede diluir la fase de producto con agua para facilitar el ajuste del valor de pH. A continuación, se pueden homogeneizar la fase de producto y la fase acuosa transformándose los ramnolípidos en una forma hidrosoluble mediante reducción o aumento del valor de pH mediante ácidos o bases. Potencialmente se puede apoyar la solubilización de ramnolípidos en la fase acuosa mediante incubación a temperaturas elevadas, por ejemplo, a 60 hasta 90°C, y mezclado constante. Mediante aumento o reducción subsiguiente del valor de pH mediante bases o ácidos se pueden transformar los ramnolípidos de nuevo en una forma hidrosoluble, de modo que se pueden separar fácilmente de la fase acuosa. La fase de producto se puede lavar entonces una o varias veces con agua para eliminar impurezas hidrosolubles. Los restos de aceite se pueden separar, a modo de ejemplo, mediante extracción por medio de disolventes apropiados, ventajosamente por medio de disolventes orgánicos. Como disolvente se emplea preferentemente un alcano, como por ejemplo n-hexano. La separación del producto de la fase acuosa se puede efectuar, alternativamente al proceso exento de disolvente descrito con anterioridad, con un disolvente apropiado, por ejemplo, un éster, como por ejemplo acetato de etilo o acetato de butilo. Los citados pasos de extracción se pueden llevar a cabo en cualquier orden. En este caso se emplean preferentemente disolventes, en especial disolventes orgánicos. Como disolvente es preferente n-pentanol. Para la eliminación del disolvente se efectúa, a modo de ejemplo, una destilación. A continuación, se puede purificar ulteriormente el producto liofilizado, a modo de ejemplo por medio de métodos cromatográficos. En este punto cítese a modo de ejemplo la precipitación por medio de disolventes apropiados, la extracción por medio de disolventes apropiados, la complejación, a modo de ejemplo por medio de ciclodextrinas o derivados de ciclodextrina, la cristalización, o bien aislamiento por medio de métodos cromatográficas, o la transformación de ramnolípidos en derivados fácilmente separables.
Se dan a conocer los ramnolípidos que se pueden producir con el procedimiento según la invención, en especial también las mezclas de ramnolípidos descritas anteriormente, que se pueden producir con el procedimiento según la invención. Los ramnolípidos y las mezclas que se pueden producir con el procedimiento según la invención se pueden emplear ventajosamente en agentes de limpieza, en formulaciones cosméticas o farmacéuticas, así como en formulaciones fitosanitarias. Por consiguiente, se da a conocer el empleo de los ramnolípidos obtenidos con el procedimiento según la invención para la producción de formulaciones cosméticas, dermatológicas o farmacéuticas, de formulaciones fitosanitarias, así como de agentes de tratamiento y limpieza y concentrados de agentes tensioactivos.
En este caso, bajo el concepto "agente de tratamiento" se entiende una formulación que cumpla el fin de obtener un objeto en su forma original, reducir o evitar los efectos de influencias externas (por ejemplo, tiempo, luz, temperatura, presión, contaminación, reacción química con otros compuestos reactivos que entran en contacto con el objeto), como por ejemplo envejecimiento, contaminación, fatiga de materiales, decoloración, o incluso mejorar las propiedades positivas del objeto deseadas. Como último punto cítese, por ejemplo, una brillo dle cabello mejorado o una mayor elasticidad del objeto considerado. Se entiende por “formulación fitosanitaria“ aquellas formulaciones que se emplean obviamente para la protección fitosanitaria según su tipo de preparación; éste es el caso en especial si en la formulación está contenido al menos un compuesto de las clases de herbicidas, fungicidas, insecticidas, acaricidas, nematicidas, protectores contra picadura de pájaros, nutrientes vegetales y rectificadores de la estructura del suelo. Los ramnolípidos producidos con el procedimiento según la invención se pueden emplear en agentes de tratamiento y limpieza para el sector doméstico, industria, en especial para superficies duras, cuero o materiales textiles.
Contribuye a la solución de la tarea una célula según la invención que contiene un ácido nucleico aislado, que presenta al menos, en cada caso, una secuencia seleccionada a partir de los tres grupos [A1 a G1], [A2 a G2] y [A3 a G3], estando constituido el grupo [A1 a G1] por las siguientes secuencias:
A1a) una secuencia según Seq ID Nr. 1, codificando esta secuencia para una proteína que puede transformar 3-hidroxidecanoil-ACP a través de 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoil-ACP en ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
B1 a) una secuencia exenta de intrón, que es derivada de una secuencia según A1 a) y codifica la misma proteína o el mismo péptido que la secuencia según Seq ID Nr. 1,
C1a) una secuencia que codifica una proteína o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos según Seq ID Nr. 2, y que puede transformar preferentemente 3-hidroxidecanoil-ACP a través de 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoil-ACP en ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
D1a) una secuencia que es idéntica a una secuencia según uno de los grupos A1a) a C1a), de modo especialmente preferente según el grupo A1a), en al menos un 70 %, de modo especialmente preferente en al menos un 90 %, además preferentemente en al menos un 95 %, y del modo más preferente en al menos un 99 %, codificando esta secuencia preferentemente para una proteína o un péptido que puede transformar 3-hidroxidecanoil-ACP a través de 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoil-ACP en ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
E1 a) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia según uno de los grupos A1 a) a D1 a), de modo especialmente preferente según el grupo A1 a), o hibridaría bajo consideración de la degeneración del código genético, pudiendo codificar esta secuencia para una proteína o un péptido que puede transformar 3-hidroxidecanoil-ACP a través de 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoil-ACP en ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
F1a) un derivado, obtenido mediante sustitución, adición, inversión y/o deleción de al menos una base, preferentemente de al menos 2 bases, además preferentemente de al menos 5 bases, y del modo más preferente al menos 10 bases, pero no más de 100 bases, de modo especialmente preferente no más de 50 bases, y del modo más preferente no más de 25 bases, de una secuencia según uno de los grupos A1a) a E1a), de modo especialmente preferente según el grupo A1a), codificando este derivado preferentemente para una proteína o péptido, que puede transformar 3-hidroxidecanoil-ACP a través de 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoil-ACP en ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
G1a) una secuencia complementaria a una secuencia según uno de los grupos A1a) a F1a), de modo especialmente preferente según el grupo A1a),
A1b) una secuencia según Seq ID Nr. 17, codificando esta secuencia para una proteína que puede transformar 3-hidroxitetradecanoil-ACP a través de 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP en ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
B1 b) una secuencia exenta de intrón, que es derivada de una secuencia según A1 b) y codifica la misma proteína o el mismo péptido que la secuencia según Seq ID Nr. 17,
C1b) una secuencia que codifica una proteína o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos según Seq ID Nr. 18, y que puede transformar preferentemente 3-hidroxitetradecanoil-ACP a través de 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP en ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
D1b) una secuencia que es idéntica a una secuencia según uno de los grupos A1b) a C1b), de modo especialmente preferente según el grupo A1b), en al menos un 70 %, de modo especialmente preferente en al menos un 90 %, además preferentemente en al menos un 95 %, y del modo más preferente en al menos un 99 %, codificando esta secuencia preferentemente para una proteína o un péptido que puede transformar 3-hidroxitetradecanoil-ACP a través de 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP en ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
E1 b) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia según uno de los grupos A1 b) a D1 b), de modo especialmente preferente según el grupo A1 b), o hibridaría bajo consideración de la degeneración del código genético, pudiendo codificar esta secuencia para una proteína o un péptido que puede transformar 3-hidroxitetradecanoil-ACP a través de 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP en ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
F1b) un derivado, obtenido mediante sustitución, adición, inversión y/o deleción de al menos una base, preferentemente de al menos 2 bases, además preferentemente de al menos 5 bases, y del modo más preferente al menos 10 bases, pero no más de 100 bases, de modo especialmente preferente no más de 50 bases, y del modo más preferente no más de 25 bases, de una secuencia según uno de los grupos A1b) a E1b), de modo especialmente preferente según el grupo A1b), codificando este derivado preferentemente para una proteína o péptido, que puede transformar 3-hidroxitetradecanoil-ACP a través de 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP en ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y
G1b) una secuencia complementaria a una secuencia según uno de los grupos A1b) a F1b), de modo especialmente preferente según el grupo A1b), y
estando constituido el grupo [A2 a G2] por las siguientes secuencias:
A2a) una secuencia según Seq ID Nr. 3, codificando esta secuencia para una proteína que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
B2a) una secuencia exenta de intrón, que es derivada de una secuencia según A2a) y codifica la misma proteína o el mismo péptido que la secuencia según Seq ID Nr. 3,
C2a) una secuencia que codifica una proteína o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos según Seq ID Nr. 4, y que puede transformar preferentemente dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
D2a) una secuencia que es idéntica a una secuencia según uno de los grupos A2a) a C2a), de modo especialmente preferente según el grupo A2a), en al menos un 80 %, de modo especialmente preferente en al menos un 90 %, además preferentemente en al menos un 95 %, y del modo más preferente en al menos un 99 %, codificando esta secuencia preferentemente para una proteína o un péptido que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
E2a) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia según uno de los grupos A2a) a D2a), de modo especialmente preferente según el grupo A2a), o hibridaría bajo consideración de la degeneración del código genético, pudiendo codificar esta secuencia para una proteína o un péptido que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
F2a) un derivado, obtenido mediante sustitución, adición, inversión y/o deleción de al menos una base, preferentemente de al menos 2 bases, además preferentemente de al menos 5 bases, y del modo más preferente al menos 10 bases, pero no más de 100 bases, de modo especialmente preferente no más de 50 bases, y del modo más preferente no más de 25 bases, de una secuencia según uno de los grupos A2a) a E2a), de modo especialmente preferente según el grupo A2a), codificando este derivado preferentemente para una proteína o péptido, que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
G2a) una secuencia complementaria a una secuencia según uno de los grupos A2a) a F2a), de modo especialmente preferente según el grupo A2a),
A2b) una secuencia según Seq ID Nr. 19, codificando esta secuencia para una proteína que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
B2b) una secuencia exenta de intrón, que es derivada de una secuencia según A2b) y codifica la misma proteína o el mismo péptido que la secuencia según Seq ID Nr. 19,
C2b) una secuencia que codifica una proteína o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos según Seq ID Nr. 20, y que puede transformar preferentemente dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
D2b) una secuencia que es idéntica a una secuencia según uno de los grupos A2b) a C2b), de modo especialmente preferente según el grupo A2b), en al menos un 70 %, de modo especialmente preferente en al menos un 90 %, además preferentemente en al menos un 95 %, y del modo más preferente en al menos un 99 %, codificando esta secuencia preferentemente para una proteína o un péptido que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
E2b) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia según uno de los grupos A2b) a D2b), de modo especialmente preferente según el grupo A2b), o hibridaría bajo consideración de la degeneración del código genético, pudiendo codificar esta secuencia para una proteína o un péptido que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
F2b) un derivado, obtenido mediante sustitución, adición, inversión y/o deleción de al menos una base, preferentemente de al menos 2 bases, además preferentemente de al menos 5 bases, y del modo más preferente al menos 10 bases, pero no más de 100 bases, de modo especialmente preferente no más de 50 bases, y del modo más preferente no más de 25 bases, de una secuencia según uno de los grupos A2b) a E2b), de modo especialmente preferente según el grupo A2b), codificando este derivado preferentemente para una proteína o péptido, que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y
G2b) una secuencia complementaria a una secuencia según uno de los grupos A2b) a F2b), de modo especialmente preferente según el grupo A2b),
y estando constituido el grupo [A3 a G3] por las siguientes secuencias:
A3a) una secuencia según Seq ID Nr. 5, codificando esta secuencia para una proteína que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
B3a) una secuencia exenta de intrón, que es derivada de una secuencia según A3a) y codifica la misma proteína o el mismo péptido que la secuencia según Seq ID Nr. 5,
C3a) una secuencia que codifica una proteína o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos según Seq ID Nr. 6, y que puede transformar preferentemente dTDP-ramnosa y ácido-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1 -2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
D3a) una secuencia que es idéntica a una secuencia según uno de los grupos A3a) a C3a), de modo especialmente preferente según el grupo A3a), en al menos un 80 %, de modo especialmente preferente en al menos un 90 %, además preferentemente en al menos un 95 %, y del modo más preferente en al menos un 99 %, codificando esta secuencia preferentemente para una proteína o un péptido que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
E3a) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia según uno de los grupos A3a) a D3a), de modo especialmente preferente según el grupo A3a), o hibridaría bajo consideración de la degeneración del código genético, pudiendo codificar esta secuencia para una proteína o un péptido que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
F3a) un derivado, obtenido mediante sustitución, adición, inversión y/o deleción de al menos una base, preferentemente de al menos 2 bases, además preferentemente de al menos 5 bases, y del modo más preferente al menos 10 bases, pero no más de 100 bases, de modo especialmente preferente no más de 50 bases, y del modo más preferente no más de 25 bases, de una secuencia según uno de los grupos A3a) a E3a), de modo especialmente preferente según el grupo A3a), codificando este derivado preferentemente para una proteína o péptido que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
G3a) una secuencia complementaria a una secuencia según uno de los grupos A3a) a F3a), de modo especialmente preferente según el grupo A3a),
A3b) una secuencia según Seq ID Nr. 21, codificando esta secuencia para una proteína que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
B3b) una secuencia exenta de intrón, que es derivada de una secuencia según A3b) y codifica la misma proteína o el mismo péptido que la secuencia según Seq ID Nr. 21,
C3b) una secuencia que codifica una proteína o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos según Seq ID Nr. 22, y que puede transformar preferentemente dTDP-ramnosa y ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1 -2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
D3b) una secuencia que es idéntica a una secuencia según uno de los grupos A3b) a C3b), de modo especialmente preferente según el grupo A3b), en al menos un 60 %, de modo especialmente preferente en al menos un 90 %, además preferentemente en al menos un 95 %, y del modo más preferente en al menos un 99 %, codificando esta secuencia preferentemente para una proteína o un péptido que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1 -2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
E3b) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia según uno de los grupos A3b) a D3b), de modo especialmente preferente según el grupo A3b), o hibridaría bajo consideración de la degeneración del código genético, pudiendo codificar esta secuencia para una proteína o un péptido que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
F3b) un derivado, obtenido mediante sustitución, adición, inversión y/o deleción de al menos una base, preferentemente de al menos 2 bases, además preferentemente de al menos 5 bases, y del modo más preferente al menos 10 bases, pero no más de 100 bases, de modo especialmente preferente no más de 50 bases, y del modo más preferente no más de 25 bases, de una secuencia según uno de los grupos A3b) a E3b), de modo especialmente preferente según el grupo A3b), codificando este derivado preferentemente para una proteína o péptido que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y
G3b) una secuencia complementaria a una secuencia según uno de los grupos A3b) a F3b), de modo especialmente preferente según el grupo A3b).
La "identidad de nucleótido'' o la "identidad de aminoácido" se determina con ayuda de procedimientos conocidos en este caso. En general se emplean programas informáticos especiales con algoritmos, bajo consideración de requisitos especiales. Los procedimientos preferentes para la determinación de la identidad generan en primer lugar la mayor coincidencia entre las secuencias a comparar. Los programas informáticos para la determinación de la identidad comprenden el paquete de programas GCG, incluyendo GAP, pero no están limitados al mismo (Deveroy, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), página 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi), y BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), páginas 403-410. El programa BLAST se puede conseguir en el National Center For Biotechnology Information (NCBI) y a partir de otras fuentes (BLAST Handbuch, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al., véase más arriba). El conocido algoritmo de Smith-Waterman se puede emplear igualmente para la determinación de la identidad de nucleótido.
En el caso de empleo del programa BLASTN (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), páginas 403­ 410, los parámetros preferentes para la determinación de la "identidad de nucleótido" son:
Figure imgf000020_0001
Los anteriores parámetros son los parámetros estándar en comparación con la secuencia de nucleótidos. El programa GAP es igualmente apropiado para empleo con los anteriores parámetros.
En el caso de empleo del programa BLASTP (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), páginas 403­ 410, los parámetros preferentes para la determinación de la "identidad de aminoácido" son:
Figure imgf000021_0001
Los anteriores parámetros son los parámetros estándar en comparación con la secuencia de aminoácidos. El programa GAP es igualmente apropiado para empleo con los anteriores parámetros.
Una identidad de un 60 % según el anterior algoritmo significa un 60 % de identidad en el contexto de la presente invención. Se considera lo mismo para identidades superiores.
La característica "secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia, o hibridaría bajo consideración de la degeneración del código genético" indica una secuencia que hibrida, bajo condiciones preferentemente restrictivas, con la contrahebra de una secuencia de referencia, o hibridaría bajo consideración de la degeneración del código genético. A modo de ejemplo, las hibridaciones se pueden llevar a cabo a 682C en 2 x SSC o según el protocolo del kit de marcaje de digoxigenina de la firma Boehringer (Mannheim). Las condiciones de hibridación preferentes son, por ejemplo, incubación a 65°C durante la noche en 7 % de SDS, 1 % de BSA, EDTA 1 mM, tampón fosfato sódico 250 mM (pH 7,2) y subsiguiente lavado a 65°C con 2 x SSC; 0,1 % SDS. A los derivados de ADN aislado según la invención, que se pueden obtener según alternativas F1), F2) o F3) mediante sustitución, adición, inversión y/o deleción de una o varias bases de una secuencia según uno de los grupos A1) a E1), A2) a E2) y A3) a E3), pertenecen en especial aquellas secuencias que conducen a intercambios de aminoácido conservadores, como por ejemplo el intercambio de glicina por alanina o de ácido aspártico por ácido glutámico en la proteína que codifican. Tales mutaciones neutras en función se denominan mutaciones sin cambio de sentido (sense mutations), y no conducen a una modificación básica de la actividad del polipéptido. Además, es sabido que la presente invención comprende modificaciones en el extremo N y/o C de un polipéptido no influyen esencialmente en su función, o incluso pueden estabilizar ésta, de modo que también se añaden correspondientemente secuencias de ADN en las que se añaden bases en el extremo 3‘ o en el extremo 5‘ de la secuencia con los ácidos nucleicos según la invención. El especialista encuentra datos a tal efecto, entre otros, en Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), en O'Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), en Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), en Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321 -1325 (1988)) y en libros de texto de genética y biología molecular conocidos.
El ácido nucleico contenido según la invención es preferentemente un vector, en especial un vector de expresión o un cassette de sobreexpresión génica. Como vectores entran en consideración todos los vectores conocidos por el especialista, que se emplean habitualmente para la inclusión de ADN en una célula huésped. Estos vectores se pueden replicar tanto de manera autónoma, ya que poseen orígenes de replicación, como por ejemplo los del plásmido 2p o ARS (secuencias replicativas de manera autónoma), o se integran en los cromosomas (plásmidos no replicativos). También se entiende por vectores fragmentos de ADN lineales que no poseen ningún tipo de orígenes de replicación, como por ejemplo cassettes de inserción génica o de sobreexpresión génica. Los cassettes de sobreexpresión génica están constituidos habitualmente por un marcador, los genes a sobreexprimir, así como zonas reguladoras relevantes para la expresión de los genes, como por ejemplo promotores y terminadores. Los vectores preferentes se seleccionan a partir del grupo que comprende plásmidos y cassettes, como por ejemplo plásmidos transportadores de levadura de E. Coli, siendo especialmente preferentes vectores de expresión, cassettes de inserción génica o sobreexpresión génica, en especial los vectores descritos más abajo Seq iD Nr. 38, Seq ID Nr. 40, Seq ID Nr. 42, Seq ID Nr. 45 y Seq ID Nr. 47.
Según una forma preferente de realización del vector contenido según la invención, las secuencias de los grupos [A1 a G1], [A2 a G2] y [A3 a G3] están bajo el control de al menos un promotor constitutivo o regulable, que es apropiado para la expresión del polipéptido codificado por estas secuencias de ADN en la célula de un microorganismo, preferentemente una célula bacteriana, de levadura o fúngica, siendo especialmente preferentes Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Burkholderia andropogonis, B. brasilensis, B. caledonica, B. caribensis, B. caryophylli, B. fungorum, B. gladioli, B. glathei, B. glumae, B. graminis, B. hospita, B. kururiensis, B. phenazinium, B. phymatum, B. phytofirmans, B. plantarii, B. sacchari, B. singaporensis, B. sordidicola, B. terricola, B. tropica, B. tuberum, B. ubonensis, B. unamae, B. xenovorans, B. anthina, B. pyrrocinia, B. thailandensis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Escherichia coli, Hansenula polymorpha, Kluveromyces lactis, Methylobacterium extorquens, Paracoccus versutus, Pseudomonas argentinensis, P. borbori, P. citronellolis, P. flavescens, P. mendocina, P. nitroreducens, P. oleovorans, P. pseudoalcaligenes, P. resinovorans, P. straminea, P. aurantiaca, P. aureofaciens, P. chlororaphis, P. fragi, P. lundensis, P. taetrolens, P. antarctica, P. azotoformans, 'P. blatchfordae', P. brassicacearum, P. brenneri, P. cedrina, P. corrugata, P. fluorescens, P. gessardii, P. libanensis, P. mandelii, P. marginalis, P. mediterranea, P. meridiana, P. migulae, P. mucidolens, P. orientalis, P. panacis, P.
proteolytica, P. rhodesiae, P. synxantha, P. thivervalensis, P. tolaasii, P. veronii, P. denitríficans, P. pertucinogena, P. cremoricolorata, P. fulva, P. monteilii, P. mosselii, P. parafulva, P. putida, P. balearica, P. stutzeri, P. amygdali, P. avellanae, P. caricapapayae, P. cichorii, P. coronafaciens, P. ficuserectae, 'P. helianthi', P. meliae, P. savastanoi, P. syringae, P. tomato, P. viridiflava, P. abietaniphila, P. acidophila, P. agarici, P. alcaliphila, P. alkanolytica, P. amyloderamosa, P. asplenii, P. azotifigens, P. cannabina, P. coenobios, P. congelans, P. costantinii, P. cruciviae, P. delhiensis, P. excibis, P. extremorientalis, P. frederiksbergensis, P. fuscovaginae, P. gelidicola, P. grimontii, P. indica, P. jessenii, P. jinjuensis, P. kilonensis, P. knackmussii, P. koreensis, P. lini, P. lutea, P. moraviensis, P. otitidis, P. pachastrellae, P. palleroniana, P. papaveris, P. peli, P. perolens, P. poae, P. pohangensis, P. psychrophila, P. psychrotolerans, P. rathonis, P. reptilivora, P. resiniphila, P. rhizosphaerae, P. rubescens, P. salomonii, P. segitis, P. septica, P. simiae, P. suis, P. thermotolerans, P. aeruginosa, P. tremae, P. trivialis, P. turbinellae, P. tuticorinensis, P. umsongensis, P. vancouverensis, P. vranovensis, P. xanthomarina, Ralstonia eutropha, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Zymomonas mobilis, en especial Pseudomonas putida, Escherichia coli y Burkholderia thailandensis. Son ejemplos de promotores constitutivos lac, lacUV5, tac, trc (respectivamente en ausencia del represor LacI en las células según la invención), Ltet-O1 (en ausencia del represor TetR en las células según la invención), T5 y gap. Son ejemplos de promotores inducibles lac, lacUV5, tac, trc (respectivamente en presencia del represor Lacl en las células según la invención) Ltet-O1 (en presencia del represor TetR en las células según la invención), T5 (en combinación con un operador lac y en presencia del represor Lacl en las células según la invención), SP6 y T7 (en presencia del gen que codifica la ARN-polimerasa cognada, cuya expresión es regulable por su parte). El vector contenido según la invención debía comprender preferentemente un punto de enlace ribosómico, así como un terminador, además de un promotor. En este caso es especialmente preferente que el ácido nucleico contenido según la invención esté incorporado en un cassette de expresión del vector que comprende el promotor, el punto de enlace ribosómico y el terminador. Por lo demás, además de los elementos estructurales citados anteriormente, el vector puede comprender genes de selección conocidos por el especialista.
Si no se indica lo contrario, todos los porcentajes indicados ( %) son porcentaje en masa. En los ejemplos enumerados a continuación se describe la presente invención de manera ejemplar, sin que la invención, cuyo espectro de aplicación resulta de la descripción total y las reivindicaciones, se deba limitar a las formas de realización citadas en los ejemplos.
Breve descripción de las figuras:
Figura 1: biosíntesis de ácidos grasos, p-oxidación de ácidos grasos y enlace de estas vías metabólicas con la biosíntesis de ramnolípidos (enzimas E1, E2 y E3) y polihidroxialcanoatos (enzimas E9 y E10). Se representan flujos de carbono en biosíntesis de ácidos grasos, p-oxidación de ácidos grasos, biosíntesis de ramnolípidos y biosíntesis de polihidroxialcanoato. No se muestran consumo y formación de coenzimas, equivalentes redox, así como nucleótidos.
Figura 2: formación de dirramnosil-lípidos (mg/l/OD 600 nm) de las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2 y pBBR1MCS-2::ABC, así como GPp104 pBBR1 MCS-2 y pBBR1MCS-2::ABC tras 48 h, 72 h y 96 h de cultivo en medio CMP. El análisis de la concentración de ramnolípidos se efectuó por medio de HPLC.
Figura 3: formación de monorramnosil-lípidos (superficie de pico/OD 600 nm) de las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2, pBBR1MCS-2::AB y pBBR1MCS-2::ABM, así como GPp104 pBBR1 MCS-2, pBBR1 MCS-2::AB y pBBR1MCS-2::ABM tras 48 h, 72 h y 96 h de cultivo en medio CMP. El análisis de la concentración de ramnolípidos se efectuó por medio de HPLC.
Ejemplos
1. Construcción de un vectorpBBR1MCS-2::AB para la expresión heteróloga de genes de Pseudomonas aeruginosa 1707 rhlA y rhlB en Pseudomonas putida
Para la expresión heteróloga de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA y rhlB se construyó el plásmido pBBR1 MCS-2::AB (Seq ID Nr. 38). A tal efecto se sintetizó el operón sintético rhlAB (Seq ID Nr. 37) de la firma GeneArt AG (Regensburg) y se interclonó en el vector comercial pMA (GeneArt AG). La base para la síntesis era la secuencia genómica ya conocida de Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partiendo del vector pMA::AB se cortó el operón sintético por medio de BglII y XbaI a partir del vector, y a continuación se unió al vector de expresión, cortado con BamHI y XbaI, pBBR1 MCS-2 (Seq ID Nr. 49) (descrito en Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-hostrange cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176). El plásmido resultante pBBR1MCS-2::AB (Seq ID Nr. 38) tiene un tamaño de 7422 pares de bases. La unión, así como la transformación de células de E. coli DH5a químicamente competentes (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectuó de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verificó mediante análisis secuencial de ADN. La transformación de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con los vectores pBBR1MCS-2 (Seq ID Nr. 49) y pBBR1MCS-2::AB se efectuó como se describe anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994.
58(5):851-854). Se aisló y analizó el ADN plasmídico de 10 clones. Las cepas obtenidas, portadoras de plásmido, se llamaron P. putida KT2440 pBBR1MCS-2, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2, P. putida KT2440 pBBRI MCS-2::AB, o bien P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB.
2. Construcción de un vector pBBR1MCS-2::ABC para la expresión heteróloga de genes de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB y rhlC en Pseudomonas putida
Para la expresión heteróloga de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB y rhlC se construyó el plásmido pBBR1 MCS-2::ABC (Seq ID Nr. 40). A tal efecto se sintetizó el operón sintético rhlABC (Seq ID Nr. 39) de la firma GeneArt AG (Regensburg) y se interclonó en el vector comercial pMA (GeneArt AG). La base para la síntesis era la secuencia genómica ya conocida de Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partiendo del vector pMA::ABC se cortó el operón sintético por medio de BglII y XbaI a partir del vector, y a continuación se unió al vector de expresión, cortado con BamHI y XbaI, pBBR1 MCS-2 (Seq ID Nr. 49) (Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broadhost-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176). El plásmido resultante pBBR1 MCS-2::ABC (Seq ID Nr. 40) tiene un tamaño de 8409 pares de bases. La unión, así como la transformación de células de E. coli DH5a competentes químicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectuó de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verificó mediante análisis secuencial de ADN. La transformación de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con el vector pBBR1MCS-2::ABC se efectuó como se describe anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). Se aisló y se analizó el ADN plasmídico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plásmido, se llamaron P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC, o bien P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC.
3. Construcción de un vectorpBBR1MCS-2::ABMpara la expresión heteróloga de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB y pa1131 en Pseudomonas putida
Para la expresión heteróloga de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB y pa1131 se construyó el plásmido pBBR1MCS-2::ABM (Seq ID Nr. 42). A tal efecto se sintetizó el operón sintético rhlAB-pa1131 (Seq iD Nr.
41) de la firma GeneArt AG (Regensburg) y se interclonó en el vector comercial pMA (GeneArt AG). La base para la síntesis era la ya conocida secuencia genómica de Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partiendo del vector pMA::ABM se cortó el operón sintético por medio de Bg/II y Xba la partir del vector, y a continuación se unió al vector de expresión, cortado con BamHI y XbaI, pBBR1 MCS-2 (Seq ID Nr. 49) (Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1 MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176). El plásmido resultante pBBR1MCS-2::ABM (Seq ID Nr. 42) tiene un tamaño de 8702 pares de bases. La unión, así como la transformación de células de E. coli DH5a competentes químicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectuó de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verificó mediante análisis secuencial de ADN. La transformación de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con el vector pBBR1 MCS-2::ABM se efectuó como se ha descrito anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). Se aisló y se analizó el ADN plasmídico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plásmido, se llamaron P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABM, o bien P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABM.
4. Cuantificación de la producción de ramnolípidos mediante cepas recombinantes de P. Putida
Se cultivaron las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2; P. putida KT2440 pBBRIMCS-2::AB; P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC; P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABM; P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2; P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABM sobre placas de LB-agar-canamicina (50 pg/ml).
Para la producción de ramnolípidos se empleó el medio denominado medio CMP a continuación. Éste está constituido por un 2 % (w/v) de glucosa, un 0,007 % (w/v) de KH2PO4, 0,11 % de Na2HPÜ4 x 2 H2O, un 0,2 % (w/v) de NaNÜ3, un 0,04 % (w/v) de MgSO4 x H2O, un 0,01 % (w/v) de CaCl2 x 2 H2O y un 0,2 % (v/v) de una disolución de oligoelementos. Ésta está constituida por un 0,2 % (w/v) de FeSO4 x 7 H2O, un 0,15 % (w/v) de MnSO4 x H2O y un 0,06 % (w/v) de (NH4)MO7O24 x 4 H2O. Se ajustó el valor de pH del medio a 6,7 con NaOH, y se esterilizó el medio por medio de autoclave de modo subsiguiente (121 °C, 20 min). No era necesario un ajuste del valor de pH durante el cultivo.
Para la investigación de la producción de ramnolípidos en el matraz de agitación se elaboró un cultivo previo en primer lugar. A tal efecto se empleó un asa bacteriológica de una cepa recién extendida sobre placas de LB-agar, y se inocularon 10 ml de medio LB en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Todas las cepas de P. putida recombinantes se cultivaron en medio LB, al que se añadieron 50 pg/ml de canamicina. El cultivo de las cepas se efectuó a 30°C y 200 rpm durante la noche.
Los cultivos previos se emplearon para inocular 50 ml de medio CMP en matraces Erlenmeyer de 250 ml (OD600 inicial 0,1). Los cultivos se cultivaron a 200 rpm y 30°C durante un máximo de 120 h. A intervalos de 24 h se extrajo una muestra de 1 ml de caldo del matraz de cultivo. La preparación de muestras para los siguientes análisis cromatográficos se efectuó de la siguiente manera:
con una pipeta de expulsión (Combitip) se dispuso 1 ml de acetona en un recipiente de reacción de 2 ml, y se cerró inmediatamente el recipiente de reacción para minimizar la evaporación. Siguió la adición de 1 ml de caldo. Tras agitación de la mezcla de caldo/acetona se centrifugó ésta durante 3 minutos a 13000 rpm, y se trasladaron 800 pl del sobrenadante a un recipiente de HPLC.
Para la identificación y para la cuantificación de ramnolípidos se utilizó un Evaporative Light Scattering Detektor (Sedex LT-ELSD Model 85LT). La verdadera medida se llevó a cabo por medio de Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, California) y de la columna Zorbax SB-C8 Rapid Resolution (4,6 x 150 mm, 3,5 pm, Agilent). El volumen de inyección ascendía a 5 pl, y la duración del método se situaba en 20 minutos. Como fase móvil se empleó TFA acuoso al 0,1 % (ácido trifluoracético, disolución A), y metanol (disolución B). La temperatura de la columna ascendía a 40°C. Como detectores sirvieron el ELSD (temperatura de detector 60 °C) y el DAD (ensayo de diodos, 210 nm). El gradiente empleado en el método era:
Figure imgf000024_0001
Mientras que P. putida KT2440 pBBR1MCS-2 y GPp104 pBBR1MCS-2 no produjeron ramnolípidos, en las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::AB, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABM, P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::AB, P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABM era identificable la formación de diversas especies de ramnolípidos (Fig. 2 y 3).
Mediante la introducción de pBBR1MCS-2::AB, o bien pBBR1MCS-2::ABM en P. putida se pudieron generar monorramnosil-lípidos (Fig. 3). Ya que no estaba presente ningún material de referencia para monorramnosil-lípidos, la identificación de los productos se efectuó mediante análisis de las correspondientes trazas másicas y los espectros de MS2 en LC-MS.
Si adicionalmente se introdujo rhlC (pBBR1 MCS-2::ABC) en las cepas, se produjeron mono- y dirramnosil-lípidos (Fig. 2).
La comparación directa de la formación de la formación de ramnolípidos a través de P. putida pBBR1MCS-2::AB, o bien P. putida pBBR1MCS-2::ABM, muestra que la coexpresión de P. aeruginosa p3111 con P. aeruginosa rhlAB conduce a una mejora de la biosíntesis de ramnolípidos (Fig. 3). Mientras que las cepas P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::AB y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB habían producido aproximadamente 39 (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB), o bien 23 superficies de pico de ramnolípidos/OD 600 nm (P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB) después de 120 h, las cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABM formaban aproximadamente 50 (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM), o bien 62 superficies de pico de ramnolípidos/OD 600 nm (P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABM) después de 120 h.
Si se compararon la síntesis de monorramnosil-lípidos de las cepas P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABM y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABM, en los mutantes PHA-negativos P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABM se pudieron detectar 62 superficies de pico/OD 600 nm (cultivo de 120 h), y con P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABM 50 área/OD 600 nm de monorramnosil-lípidos (Fig. 3). Un análisis comparativo de la formación de dirramnosil-lípidos (mg/l/OD 600 nm) en las cepas P. putida KT2440 y GPp104 mostraba igualmente una mayor formación de dirramnosil-lípidos en el fondo de cepa PHA negativo de P. putida GPp104. P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC formaba un promedio de 113 mg/l/OD 600 nm de dirramnosil-lípidos (96 h), mientras que con P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC se pudieron identificar solo 55 mg/l/OD 600 nm de dirramnosil-lípidos después de 96 h (Figur 2). Por consiguiente, se pudo mostrar que el empleo de un fondo de cepa debilitado respecto a la síntesis de PHA conducía a una mejora de la biosíntesis de ramnolípidos.
5. Construcción de un vector pBBR1MCS-2::ABMC para la expresión heteróloga de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB, pa1131 y rhlC en Pseudomonas putida
Para la expresión heteróloga de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB, pa1131 y rhlC se construyó el plásmido pBBR1 MCS-2::ABMC (Seq ID Nr. 51). A tal efecto se sintetizó el operón sintético rhlAB-pa1131-rhlC (Seq ID Nr. 50) de la firma GeneArt AG (Regensburg) y se interclonó en el vector comercial pMA (GeneArt AG). La base para la síntesis era la ya conocida secuencia genómica de Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partiendo del vector pMA::ABMC se cortó el operón sintético por medio de Bg/II y Xba la partir del vector, y a continuación se unió al vector de expresión, cortado con BamHI y XbaI, pBBR1 MCS-2 (Seq ID Nr. 49) (Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRI MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176). El plásmido resultante pBBR1MCS-2::ABMC (Seq ID Nr. 51) tiene un tamaño de 9663 pares de bases. La unión, así como la transformación de células de E. coli DH5a competentes químicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectuó de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verificó mediante análisis secuencial de ADN. La transformación de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con el vector pBBR1MCS-2::ABMC se efectuó como se ha descrito anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). Se aisló y se analizó el ADN plasmídico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plásmido, se llamaron P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABMC, o bien P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABMC.
6. Comparación cualitativa de la producción de ramnolípidos mediante cepas recombinantes de P. Putida y P. aeruginosa
Se cultivaron las cepas recombinantes P. putida GPp104 pBBR1MCS-2 y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABMC, así como P. aeruginosa DSM 19880, en placas de LB-agar-canamicina (50 gg/ml; P. putida)-, o bien LB-agar (P. aeruginosa).
Para la producción de ramnolípidos se empleó el medio denominado medio CMP a continuación. Este está constituido por un 2 % (w/v) de glucosa, un 0,007 % de KH2PO4, un 0,11 % de Na2HPÜ4 x 2 H2O, un 0,2 % (w/v) de NaNÜ3, un 0,04 % (w/v) de MgSO4 x H2O, 0,01 % (w/v) de CaCl2 x 2 H2O y un 0,2 % (v/v) de una disolución de oligoelementos. Ésta está constituida por un 0,2 % (w/v) de FeSO4 x 7 H2O, un 0,15 % (w/v) de MnSO4 x H2O y un 0,06 % (w/v) de (NH4)MO7O24 x 4 H2O. Se ajustó el valor de pH del medio a 6,7 con NaOH, y se esterilizó el medio por medio de autoclave (121 °C, 20 min) de modo subsiguiente. No era necesario un ajuste del valor de pH durante el cultivo.
Para la investigación de la producción de ramnolípidos en el matraz de agitación se elaboró un cultivo previo en primer lugar. A tal efecto se empleó un asa bacteriológica de una cepa recién extendida sobre placas de LB-agar, y se inocularon 10 ml de medio LB en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Las cepas de P. putida recombinantes se cultivaron en medio LB, al que se añadieron 50 gg/ml de canamicina. Se cultivó P. aeruginosa en el medio de cultivo LB. El cultivo de las cepas se efectuó a 30°C y 200 rpm durante la noche.
Los cultivos previos se emplearon para inocular 50 ml de medio CMP en matraces Erlenmeyer de 250 ml (OD600 inicial 0,1). Los cultivos se cultivaron a 200 rpm y 30°C durante un máximo de 120 h. A intervalos de 24 h se extrajo una muestra de 1 ml de caldo del matraz de cultivo. La preparación de muestras para los siguientes análisis cromatográficos se efectuó de la siguiente manera:
con una pipeta de expulsión (Combitip) se dispuso 1 ml de acetona en un recipiente de reacción de 2 ml, y se cerró inmediatamente el recipiente de reacción para minimizar la evaporación. Siguió la adición de 1 ml de caldo. Tras agitación de la mezcla de caldo/acetona se centrifugó ésta durante 3 minutos a 13000 rpm, y se trasladaron 800 gl del sobrenadante a un recipiente de HPLC.
Para la identificación de productos formados se inyectaron 5 gl en una instalación UPLC Accela (Thermo Scientific, Dreieich). Las sustancias a investigar se analizaron con una columna semi UPLC "PursuitXRs ULTRA (C8, 2,8 gm, 2,1 x 100 mm) (Varian, Darmstadt). La separación se efectuó en el intervalo de 25 minutos por medio de un gradiente constituido por la fase móvil A1 (H2O, 0,1 % (v/v) TFA) y la fase móvil B1 (metanol, 0,1 % (v/v) TFA) con una tasa de flujo de 0,3 ml/minutos a 40 °C. El desarrollo temporal del gradiente era el siguiente:
Figure imgf000025_0001
La detección se efectuó por medio del detector DAD en el intervalo de longitud de onda de 200 - 600 nm, así como selectivamente respecto a la masa con un espectrómetro de masas FT-ICR LTQ-FT (Thermo Scientific, Dreieich) en el intervalo de escaneo m/z 100 - 1000. La ionización se efectuó por medio de ESI (electrospray ionization). Se determinaron masas exactas y fórmulas moleculares químicas con ayuda del analizador másico FT-ICR, con una resolución de R = 100000 y una precisión másica de < 2 ppm. La identificación de los productos se efectuó mediante análisis de las correspondientes trazas másicas y los espectros de MS2. Para poder comparar las cepas se confrontaron las superficies de pico de las correspondientes sustancias. Como se representa en la Figura 4, la cepa P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2 no formaba ningún tipo de ramnolípido. P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::a Bm C, así como P. aeruginosa DSM 19880, formaban ramnolípidos, situándose la proporción entre di- y monorramnosil-lípidos formados en el caso de P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABMC aproximadamente en 4:1, en el caso de P. aeruginosa DSM 19880 aproximadamente en 2:1. Además, la cepa P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABMC, en contrapartida a P. aeruginosa DSM 19880, no formaba, o formaba muy poco ramnolípidos con un resto determinado a través de R1 y R2, derivado de ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidecanoico o ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxioctanoico.
7. Construcción de un vector pBBR1MCS-2::rfbBDAC y pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC para la expresión heteróloga en Pseudomonas putida
En la firma Firma Trenzyme GmbH (Konstanz), partiendo de ADN cromosómico de Pseudomonas putida KT2440 se amplificó el operón de biosíntesis de ramnosa rfbBDAC. A tal efecto se empleó el siguiente cebador:
RL1: 5'-TATATATAGAATTCGCGTCATCTGTCTACGACAACAC-3' (Seq ID Nr. 48)
RL2: 5'-TATATATAGAATTCGGCTGCGCTACCGCAGCCCTTC-3' (Seq ID Nr. 43)
El producto de PCR obtenido se interclonó en el sistema Trenzyme's Alligator Cloning y se transformó en E. coli DH5a (New England Biolabs; Frankfurt). Se analizaron y se secuenciaron vectores de diferentes candidatos. Una vez efectuada una secuenciación de ADN exitosa y exenta de errores se cortó el vector por medio de EcoRI y se aisló el fragmento objetivo rfbBDAC. Para una interclonación ulterior se cortó el vector pBBR1MCS-2 (Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176) del mismo modo. El fragmento objetivo cortado (rfbBDAC) y el vector cortado (pBBR1MCS-2) se reunieron mediante unión convencional. El vector producido pBBR1MCS-2::rfbBDAC (Seq ID Nr.
45) se transformó igualmente en E. coli DH5a (New England Biolabs; Frankfurt). Se analizaron algunos candidatos de transformandos respecto a la absorción exitosa de plásmido. El vector pBBR1MCS-2::rfbBDAC sirvió como matriz para una PCR. Se emplearon los siguientes oligonucleótidos:
RL_XbaI-fw: 5'-TATATATATCTAGAATTAATGCAGCTGGCACGAC-3' (Seq ID Nr. 44)
RL_Xba_rev: 5'-GGCCGCTCTAGAACTAGTGGA-3' (Seq ID Nr. 46)
La PCR se llevó a cabo con la Phusion™ High-Fidelity Master Mix de New England Biolabs (Frankfurt) polimerasa. Ésta se efectuó de modo conocido por el especialista. La secuencia objetivo (/ac-promotor y rfbBDAC) se interclonó en el sistema Trenzyme Alligator Cloning System. Se seleccionaron transformandos de E. coli DH5a (New England Biolabs; Frankfurt) y se aisló y secuenció el ADN plasmídico de diversos candidatos. Después de haber verificado la secuencia y analizado la exactitud de la misma, se cortó el vector con XbaI. El fragmento objetivo se unió al pBBR1 MCS-2::ABC, igualmente cortado con XbaI (véase más arriba) por medio de métodos de unión convencionales. El vector objetivo obtenido pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC (Seq ID Nr. 47) tiene un tamaño de 12249 pares de bases. Se secuenció el inserto del vector. La puesta en práctica de la PCR, la verificación de la amplificación exitosa de PCR por medio de electroforésis en egel de agarosa, el teñido con bromuro de etidio de ADN, la determinación del tamaño de fragmento por PCR, la purificación de los productos de PCR y la determinación de la concentración de ADN se efectuaron de modo conocido por el especialista. La transformación de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con el vector pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC se efectuó como se ha descrito anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). Se aisló y se analizó el ADN plasmídico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plásmido, se llaman P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC.
8. Cuantificación de la producción de ramnolípidos mediante cepas recombinantes de P. Putida con y sin sobreexpresión del operón rfbBDAC
Las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2; P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC se cultivan en placas de LB-agar-canamidna (50 pg/ml). Para la producción de ramnolípidos se emplea el medio denominado medio CMP a continuación. Éste está constituido por un 2 % (w/v) de glucosa, 0,007 % (w/v) de KH2PO4, 0,11 % Na2HPÜ4 x 2 H2O, 0,2 % (w/v) de NaNÜ3, 0,04 % (w/v) de MgSO4 x H2O, 0,01 % (w/v) de CaCl2 x 2 H2O y un 0,2 % (v/v) de una disolución de oligoelementos. Ésta está constituida por un 0,2 % (w/v) de FeSO4 x 7 H2O, 0,15 % (w/v) de MnSO4 x H2O y un 0,06 % (w/v) de (NH4)MOzO24 x 4 H2O. El valor de pH del medio se ajusta a 6,7 con NaOH, y a continuación se esteriliza el medio por medio de autoclave (121 °C, 20 min). No es necesario un ajuste del valor de pH durante el cultivo.
Para la investigación de la producción de ramnolípidos en el matraz de agitación se elabora un cultivo previo en primer lugar. A tal efecto se emplea un asa bacteriológica de una cepa recién extendida sobre placas de LB-agar, y se inoculan 10 ml de medio LB en un matraz Erlenm eyer de 100 ml. T o d a s las cep a s recom binantes de P. putida recom binantes se cultivan en medio LB, al que se añadien 50 pg/ml de canam icina. El cultivo de las ce p a s de P. putida se efectúa a 302C y 200 rpm durante la noche. Los cultivos previos se em plean para inocular 50 ml de medio C M P en el matraz Erlenm eyer de 250 ml (O D 6 00 inicial 0 ,1). Los cultivos se cultivan a 200 rpm y 30 °C durante un m áximo de 120 h. A intervalos de 24 h se extrae una muestra de 1 ml de caldo del matraz de cultivo.
La preparación de m uestras para los subsiguientes a ná lis is crom atográficos se efectúa de la siguiente m anera:
con una pipeta de expulsión (Combitip) se dispone 1 ml de acetona en un recipiente de reacción de 2 ml, y se cierra el recipiente de reacción inm ediatam ente para m inim izar la evaporación. S ig u e la adición de 1 ml de caldo. T ra s agitación de la m ezcla de caldo/acetona se centrifuga la m ism a durante 3 minutos a 13000 rpm, y se trasladan 800 pl del sobrenadante a un recipiente de H P L C .
P ara la identificación y para la cuantificación de ram nolípidos se utiliza un Evaporative Light Scattering Detektor (Sedex L T -E L S D Model 85LT). La verdadera m edida se lleva a cabo por medio de Agilent Techno lo gies 1200 S e rie s (Santa C lara, California) y la colum na Zorbax S B -C 8 Rapid Resolution (4,6 x 150 mm, 3 ,5 pm, Agilent). El volum en de inyección asciend e a 5 pl y la duración del método es 20 minutos. Com o fase móvil se em plea T F A acuoso al 0,1 % (ácido trifluoracético, disolución A) y metanol (disolución B). La temperatura de colum na asciende a 40 °C . Com o detectores sirven el E L S D (temperatura de detector 60 °C ) y el D AD (ensayo de diodos, 210 nm). El gradiente em pleado en el método es:
Figure imgf000027_0001
Mientras que P. putida K T2440 p B B R 1M C S -2 y G P p 104 p B B R 1M C S -2 no producen ram nolípidos, la formación de ram nolípidos e s verificable en las ce p a s recom binantes P. putida K T2440 p B B R 1M C S -2 ::A B C , P. putida K T2440 p B B R 1 M C S -2 ::A B C _ rfb B D A C ; P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC y P. putida G P p 104 p B B R 1 M C S -2 ::A B C _ rfb B D A C .
P. putida K T2440 p B B R 1 M C S -2 ::A B C _ rfb B D A C en com paración con P. putida K T2440 p B B R 1 M C S -2 ::A B C y P. putida G P p 104 p B B R 1M C S -2 ::A B C _ rfb B D A C en com paración con P. putida G P p 104 p B B R 1M C S -2 ::A B C m uestra una formación intensificada de di- y m onorram nosil-lípidos. Esto m uestra claram ente la influencia positiva de la intensificación de la expresión de rfbBDAC sobre la formación de mono- y dirram nosil-líp idos.
S i se com para la b iosíntesis de m ono- y dirram nosil-líp idos de las ce p a s P. putida K T2440 p B B R 1M C S -2 ::A B C _ rfb B D A C y P. putida G P p 104 p B B R 1 M C S -2 ::A B C _ fb B D A C , en el mutante PH A-negativo P. putida G P p 104 p B B R 1M C S -2 ::A B C _ rfb B D A C se detecta una síntesis de mono- y dirram nosil-líp idos intensificada. Com o ya se ha descrito anteriormente, en el caso de em pleo de un fondo de cep a desactivado en la s ín tesis de PH A se intensifica la b iosíntesis de ram nolípidos.
9. Generación de E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC recombinante
La transform ación de E. coli W 3110 se efectuó como se ha descrito anteriormente (Miller JH . A Short C o u rse in Bacterial G enetics: A Laboratory M anual and Handbook for Escherich ia coli and Related Bacteria. Plainview, N Y: Cold Spring Harbor Lab. P ress; 1992) por medio de electroporación. S e aisló y se analizó el A DN plasm ídico de 10 clones respectivam ente. La s cep as obtenidas, portadoras de plásm ido, se llamaron E. coli W 3110 p B B R 1M C S -2 ::A B C _ rfb B D A C y E. co liW 3110 p B B R 1 M C S -2 ::A B C _ rfb B D A C .
10. Cuantificación de la producción de ramnolípidos mediante cepas de E. coli recombinantes con y sin sobreexpresión del operón rfbBDAC
La s cep as recom binantes E. coli W 3110 p B B R 1M C S -2 ; E. coli W 3110 p B B R 1M C S -2 ::A B C y E. coli W 3110 p B B R 1M C S -2 ::A B C _ rfb B D A C se cultivan en p lacas de LB -a g a r-ca n a m icin a (50 pg/ml). Para la producción de ram nolípidos se em plea el medio denom inado medio C M P a continuación. Éste está constituido por un 2 % (w/v) de glucosa, 0,007 % (w/v) de KH 2 P O 4 , 0 ,11 % Na2HPO4 x 2 H 2 O, 0,2 % (w/v) de NaNO3, 0 , 0 4 % (w/v) de MgSO4 x H 2 O, 0,01 % (w/v) de C a C l2 x 2 H 2 O y un 0,2 % (v/v) de una disolución de oligoelem entos. Ésta está constituida por un 0,2 % (w/v) de FeSO 4 x 7 H 2 O, 0 ,15 % (w/v) de MnSO4 x H 2 O y un 0,06 % (w/v) de (NH4)MO7O24 x 4 H2 O. El valor de pH del medio se ajusta a 6,7 con NaOH, y a continuación se esteriliza el medio por medio de autoclave (121 °C, 20 min). No es necesario un ajuste del valor de pH durante el cultivo.
Para la investigación de la producción de ramnolípidos en el matraz de agitación se elaboró un cultivo previo en primer lugar. A tal efecto se emplea un asa bacteriológica de una cepa recién extendida sobre placas de LB-agar, y se inoculan 10 ml de medio LB en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Todas las cepas recombinantes de E. c o lise cultivan en medio LB, al que se añaden 50 pg/ml de canamicina. El cultivo de las cepas de E. coli se efectúa a 37 °C y 200 rpm durante la noche. Los cultivos previos se emplean para inocular 50 ml de medio CMP en el matraz Erlenmeyer de 250 ml (OÜ6 00 inicial 0,1). Los cultivos se cultivan a 200 rpm y 30°C durante un máximo de 120 h. A intervalos de 24 h se extrae una muestra de 1 ml de caldo del matraz de cultivo. La preparación de muestras para los subsiguientes análisis cromatográficos se efectúa de la siguiente manera:
con una pipeta de expulsión (Combitip) se dispone 1 ml de acetona en un recipiente de reacción de 2 ml, y se cierra el recipiente de reacción inmediatamente para minimizar la evaporación. Sigue la adición de 1 ml de caldo. Tras agitación de la mezcla de caldo/acetona se centrifuga la misma durante 3 minutos a 13000 rpm, y se trasladan 800 pl del sobrenadante a un recipiente de HPLC. Para la identificación y para la cuantificación de ramnolípidos se utiliza un Evaporative Light Scattering Detektor (Sedex LT-ELSD Model 85LT). La verdadera medida se lleva a cabo por medio de Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, California) y la columna Zorbax SB-C8 Rapid Resolution (4,6 x 150 mm, 3,5 pm, Agilent). El volumen de inyección asciende a 5 pl y la duración del método es 20 minutos. Como fase móvil se emplea TFA acuoso al 0,1 % (ácido trifluoracético, disolución A) y metanol (disolución B). La temperatura de columna asciende a 40 °C. Como detectores sirven el ELSD (temperatura de detector 60°C) y el DAD (ensayo de diodos, 210 nm). El gradiente empleado en el método es:
Figure imgf000028_0001
Mientras que E. coli W3110 pBBR1 MCS-2 no produce ramnolípidos, la formación de mono- y dirramnosil-lípidos es verificable en las cepas recombinantes E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC, formando E. co liW3110 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC significativamente más mono- y dirramnosillípidos que E. co liW3110 pBBR1 MCS-2::ABC. Esto muestra que la expresión heteróloga de rhlABCde Pseudomonas aeruginosa DSM1707 conduce a la formación de mono- y dirramnosil-lípidos en E. coli. Esto muestra además la influencia positiva de la intensificación de la expresión de rfbBDAC sobre la formación de mono- y dirramnosil-lípidos.
11. Construcción de un vectorpBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081 para la expresión heteróloga de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB y rhlC, así como de genes de Burkholderia thailandensis E264 BTH_111077, BT_111080 y BT_II1081 en Pseudomonas putida
Para la expresión heteróloga de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB y rhlC, así como de genes de B. thailandensis E264 BTH_II1077, BT_II1080 y BT_II1081 en Pseudomonas putida, se construye el plásmido pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081 (Seq ID Nr. 69). A tal efecto se sintetiza el operón sintético BTH_II1077, BT_II1080 y BT_II1081 (Seq ID Nr. 70) de la firma DNA 2.0 (Menlo Park, CA, USA) y se interclona en el vector comercial pJ294 (DNA 2.0; Menlo Park, CA, USA). La base para la síntesis es la secuencia genómica de la cepa B. thailandensis E264. Partiendo del vector pJ294-BTH_II1077- II080-II081 se corta el operón sintético por medio de Xbal a partir de este vector y a continuación se une al el vector, igualmente cortado con XbaI, pBBR1 MCS-2::ABC (Seq ID Nr. 40). El vector objetivo obtenido pBBR1 MCS-2: :ABC-Bt H_I I1077-II1080-IM 081 (Seq ID Nr. 69) tiene un tamaño de 13768 pares de bases. Se secuencia el inserto del vector. La puesta en práctica de la PCR, la verificación de la amplificación exitosa de la PCR por medio de electroforesis en gel de agarosa, el teñido con bromuro de etidio de ADN, la determinación del tamaño de fragmento por PCR, la purificación de los productos de PCR y la determinación de la concentración de ADN se efectuan de modo conocido por el especialista. La transformación de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con el vector pBBR1 MCS-2::ABC-BTH_II1077- 111080-II1081 (Seq ID Nr. 69) se efectúa como se describe anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994.
58(5):851-854). Se aísla y se analiza el ADN plasmídico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plásmidos, se llaman P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081, o bien P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081.
12. Cuantificación de la producción de ramnolípidos mediante cepas de P. putida recombinantes con y sin sobreexpresión de los genes B. thailandensis E264 BTH_II1077, BT_II1080 y BT_II1081
Las cepas de P. putida recombinantes generadas en los Ejemplos 1, 2 y 11 P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::AB-BTH_II1077- M1080-M1081, P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::AB, P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::AB-BTH_II1077- M1080-M1081, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC-BTH_II1077- M1080-M1081 P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC y P. putida GPp104pBBR1 MCS-2::ABC-BTH_N1077-N1080-N1081 se cultivan en placas de LB-agar-canamicina (50 pg/ml).
Para la producción de ramnolípidos se emplea el medio denominado medio M9 a continuación. Este medio está constituido por un 2 % (w/v) de glucosa, un 0,3 % (w/v) de KH2 PO4 , un 0,679 % Na2HPÜ4, un 0,05 % (w/v) de NaCl, un 0,2 % (w/v) NH4Cl, un 0,049 % (w/v) de MgSO4 x 7 H2 O y un 0,1 % (v/v) de una disolución de oligoelementos. Ésta está constituida por un 1,78 % (w/v) de FeSO4 x 7 H2 O, un 0,191 % (w/v) de MnCl2 x 7 H2 O, un 3,65 % (w/v) de HCl, un 0,187 % (w/v) de ZnSO4 x 7 H2 O, un 0,084 % (v/v) de Na-EDTA x 2 H2 O, un 0,03 % (v/v) de H3 BO3 , un 0,025 % (w/v) de Na2MoO4 x 2 H2 O y un 0,47 % (w/v) de CaCl2 x 2 H2 O. El valor de pH del medio se ajusta a 7,4 con NH4 OH y el medio se esteriliza a continuación por medio de autoclave (121 °C, 20 minutos). No es necesario un ajuste del valor de pH durante el cultivo. Para la investigación de la producción de ramnolípidos en el matraz de agitación se elaboró un cultivo previo en primer lugar. A tal efecto se emplea un asa bacteriológica de una cepa recién extendida sobre placas de LB-agar, y se inoculan 10 ml de medio LB en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Todas las cepas recombinantes de P. putida se cultivan en medio LB, la que se añadieron 50 pg/ml. El cultivo de las cepas de P. putida se efectúa a 37 °C y 200 rpm durante la noche. Los cultivos previos se emplean para inocular 50 ml de medio M9 (+ 50 pg/ml de canamicina) en el matraz Erlenmeyer de 250 ml (OD6 00 inicial 0,1). Los cultivos se cultivan a 200 rpm y 30°C. A intervalos de 24 h se extrae una muestra de 1 ml de caldo del matraz de cultivo. La preparación de muestras para los subsiguientes análisis cromatográficos en sí mismos se efectúan como se describe en el Ejemplo 4. Se muestra que las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077- II1080-II1081 y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077- II1080-111081 forman sensiblemente más monorramnosil-lípidos que las cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB. Esto demuestra que la intensificación de BTH_II1077-II1080-II1081 de B. thailandensis E264 intensifica la formación de monorramnosillípidos en cepas de P. Putida con los genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlAB. Además se muestra que las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-I11081 y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC-BTHJI1077-M1080-M1081 forman sensiblemente más mono- y dirramnosil-lípidos que las cepas P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC. Esto demuestra que la intensificación de BTH_II1077- II1080-II1081 de B. thailandensis E264 intensifica la formación de mono- y dirramnosil-lípidos en cepas de P. Putida con los genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlABC. Finalmente se muestra que el debilitamiento de la formación de polihidroxibutirato en el fondo de cepa P. putida GPp104 conduce a una formación de ramnolípidos acrecentada frente a la cepa P. putida KT2440, ya que las cepas P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::AB, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077- M1080-M1081 y P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081 pueden formar sensiblemente menos mono- (), o bien menos mono-, o bien mono- y dirramnosil-lípidos () que las correspondientes cepas de control P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::AB, P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB-BTH-II1077- N1080-M1081 y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- M1080-M1081.
13. Construcción de un vector pBBR1MCS-2::ABCM para la expresión heteróloga de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB, pa1131 y rhlC en Pseudomonas putida
Para la expresión heteróloga de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB, pa1131 y rhlC se construyó el plásmido pBBR1 MCS-2::ABCM (Seq ID Nr. 58). A tal efecto se amplificó el gen pa1131 (Seq iD Nr. 59), partiendo de ADN genómico de la cepa Pseudomonas aeruginosa PAO1 (DSM 1707), con los oligonucleótidos
MFS2.0_xbaI_fw: 5'-AGGAAATCTAGATGAGAGGCCGGCAAGGATAC-3' (Seq ID Nr. 60)
MFS2.0_XbaI_rev:5'-CCAGGTTCTAGACGCCAGGATTGAACAGTACC-3' (Seq ID Nr. 61).
La amplificación del producto de PCR (1483 pares de bases) se llevó a cabo con la Phusion™ High-Fidelity Master Mix de New England Biolabs (Frankfurt) polimerasa. El producto de PCR se cortó con Xbal y se unió al vector, igualmente cortado con Xbal, pBBR1MCS-2::ABC (Seq ID Nr. 40) por medio del Fast Link Ligation Kit (Epicentre Technologies; Madison, WI, USA). El vector objetivo obtenido pBBR1 MCS-2::ABCM (Seq ID Nr. 58) tiene un tamaño de 9892 pares de bases. Se secuenció el inserto del vector. El ADN cromosómico se aisló por medio de DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen; Hilden) según datos del fabricante. La puesta en práctica de la PCR, la verificación de la amplificación exitosa de la PCR por medio de electroforesis en gel de agarosa, el teñido con bromuro de etidio de ADN, la determinación del tamaño de fragmento por PCR, la purificación de los productos de PCR y la determinación de la concentración de ADN se efectuaron de modo conocido por el especialista. La transformación de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con el vector pBBR1MCS-2::ABCM se efectuó como se ha descrito anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). Se aisló y se analizó el ADN plasmídico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plásmido, se llamaron P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABCM, o bien P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABCM.
14. Cuantificación de la producción de ramnolípidos mediante cepas recombinantes de P. putida con y sin sobreexpresión del gen de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 pal 131
Las cepas recombinantes generadas en los Ejemplos 2 y 13 P. putida P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABCM, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABCM se cultivaron en placas de LB-agar-canamicina (50 pg/ml). El subsiguiente cultivo para la producción de los ramnolípidos se efectuó como se describe en el Ejemplo 12. La preparación de muestras para los subsiguientes análisis cromatográficos y los análisis cromatográficos en sí mismos se efectuaron como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados se representan en la siguiente tabla.
Formación de di- y monorramnosil-lípidos mediante cepas de P. putida con y sin sobreexpresión del gen de P. aeruginosa pa1131 tras 48 h de incubación
Figure imgf000030_0001
Los resultados muestran que la sobreexpresión del gen de P. aeruginosapa1131 en ambos fondos de cepa (KT2440: tipo salvaje, o bien GPp104 con formación de polihidroxibutirato desactivada), conduce a una formación elevada de di- y monorramnosil-lípidos. Los resultados muestran además que el debilitamiento de la formación de polihidroxibutirato en GPp104 conduce generalmente a una formación intensificada de ramnosil-lípidos.
15. Construcción de un vectorpEC-XT99A::AB para la expresión heteróloga de los genes rhlA y rhlB de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum
Para la expresión heteróloga de los genes rhlA y rhlB de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum se construye el plásmido pEC-XT99A::AB (Seq ID Nr. 52). A tal efecto se sintetizó el operón sintético rhlAB (Seq ID Nr. 37) de la firma GeneArt AG (Regensburg) y se interclonó en el vector comercial pMA (GeneArt AG) zwischenkloniert. La base para la síntesis era la ya conocida secuencia genómica de Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partiendo del vector pMA::AB se corta el operón sintético por medio de BglII y Xbal a partir del vector, y a continuación se une al vector de expresión, cortado con BamHI y XbaI, pEC-XT99A (Patente US 7118904). El plásmido resultante pEC-XT99A::AB (Seq ID Nr. 52) tiene un tamaño de 9793 pares de bases. La unión, así como la transformación de células de E. coli DH5a competentes químicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectúa de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifica mediante análisis secuencial de ADN. La transformación de C. glutamicum ATCC13032 con el vector pEC-XT99A::AB se efectúa como se describe anteriormente (Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). La selección de los transformandos se efectúa en placas de LBHIS-agar (18,5 g/l de infusión de cerebro-corazón Boullion, sorbitol 0,5 M, 5 g/l de bacto-triptona, 2,5 g/l de extracto de bacto-levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l de bacto-agar, complementada con 5 mg/l de tetraciclina). Las placas se incubaron dos días a 33°C. La cepa obtenida, portadora de plásmido, se llama C. glutamicum pEC-XT99A::AB.
16. Construcción de un vector pEC-XT99A::ABC para la expresión heteróloga de los genes rhlA, rhlB y rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum
Para la expresión heteróloga de los genes rhlA, rhlB y rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum se construye el plásmido pEC-XT99A::ABC (Seq ID Nr. 53). A tal efecto se sintetizó el operón sintético rhlABC (Seq ID Nr. 39) de la firma GeneArt AG (Regensburg) y se interclonó en el vector comercial pMA (GeneArt AG). La base para la síntesis era la ya conocida secuencia genómica de Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partiendo del vector pMA::ABC se corta el operón sintético por medio de Bg/II y XbaI a partir del vector, y a continuación se une al vector de expresión, cortado con BamHI y XbaI, pEC-XT99A (Patente US 7118904). El plásmido resultante pEC-XT99A::ABC (Seq ID Nr. 53) tiene un tamaño de 10780 pares de bases. La unión, así como la transformación de células de E. coli DH5a competentes químicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe), se efectúa de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifica mediante análisis secuencial de ADN. La transformación de C. glutamicum ATCC13032 con el vector pEC-XT99A::ABC se efectúa como se describe anteriormente (Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). La selección de los transformandos se efectúa en placas de LBHIS-agar (18,5 g/l de infusión de cerebro-corazón Boullion, sorbitol 0,5 M, 5 g/l de bacto-triptona, 2,5 g/l de extracto de bacto-levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l de bacto-agar, complementada con 5 g/l de tetraciclina). Las placas se incubaron dos días a 33°C. La cepa obtenida, portadora de plásmido, se llama C. glutamicum pEC-XT99A::ABC.
17. Construcción de un vector pEC-XT99A::ABM para la expresión heteróloga de los genes rhlA, rhlB y pal 131 de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum
Para la expresión heteróloga de los genes rhlA, rhlB y pa1131 de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum se construye el plásmido pEC-XT99A::ABM (Seq ID Nr. 54). A tal efecto se sintetizó el operón sintético rhlABM (Seq ID Nr. 41) de la firma GeneArt AG (Regensburg) y se interclonó en el vector comercial pMA (GeneArt AG). La base para la síntesis era la ya conocida secuencia genómica de Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partiendo del vector pMA::ABM se corta el operón sintético por medio de Bg/II y XbaI a partir del vector, y a continuación se une al vector de expresión, cortado con BamHI y XbaI, pEC-XT99A (Patente US 7118904). El plásmido resultante pEC-XT99A::ABM (Seq ID Nr. 54) tiene un tamaño de 11073 pares de bases. La unión, así como la transformación de células de E. coli DH5a competentes químicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe), se efectúa de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifica mediante análisis secuencial de ADN. La transformación de C. glutamicum ATCC13032 con el vector pEC-XT99A::ABM se efectúa como se describe anteriormente (Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). La selección de los transformandos se efectúa en placas de LBHIS-agar (18,5 g/l de infusión de cerebro-corazón Boullion, sorbitol 0,5 M, 5 g/l de bacto-triptona, 2,5 g/l de extracto de bacto-levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l de bacto-agar, complementada con 5 mg/l de tetraciclina). Las placas se incubaron dos días a 33°C. La cepa obtenida, portadora de plásmido, se llama C. glutamicum pEC-XT99A::ABM.
18. Construcción de un vectorpEC-XT99A::ABCMpara la expresión heteróloga de los genes rhlA, rhlB, pa1131 y rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707en Corynebacterium glutamicum
Para la expresión heteróloga de los genes rhlA, rhlB, pa1131 y rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum se construye el plásmido pEC-XT99A::ABCM (Seq ID Nr. 55). A tal efecto se amplificó el gen pa1131 (Seq ID Nr. 59) partiendo del ADN genómico de la cepa Pseudomonas aeruginosa PAO1 (DSM 1707) con los oligonucleótidos
MFS2.0_xbaI_fw: 5'-AGGAAATCTAGATGAGAGGCCGGCAAGGATAC-3' (Seq ID Nr. 60)
MFS2.0_XbaI_rev:5'-CCAGGTTCTAGACGCCAGGATTGAACAGTACC-3' (Seq ID Nr. 61).
La amplificación del producto de PCR (1483 pares de bases) se llevó a cabo con la Phusion™ High-Fidelity Master Mix de New England Biolabs (Frankfurt) polimerasa. El producto de PCR se cortó con XbaI y se unió al vector, igualmente cortado con XbaI, pBBR1MCS-2::ABC (Seq ID Nr. 40) por medio del Fast Link Ligation Kit (Epicentre Technologies; Madison, WI, USA). El vector objetivo obtenido pEC-XT99A::ABCM (Seq ID Nr. 55) tiene un tamaño de 12263 pares de bases. Se secuenció el inserto del vector. El ADN cromosómico se aisló por medio del DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen; Hilden) según datos del fabricante. La puesta en práctica de la PCR, la verificación de la amplificación exitosa de la PCR por medio de electroforesis en gel de agarosa, el teñido con bromuro de etidio de ADN, la determinación del tamaño de fragmento por PCR, la purificación de los productos de PCR y la determinación de la concentración de ADN se efectuaron de modo conocido por el especialista. La transformación de C. glutamicum ATCC13032 con el vector pEC-XT99A::ABCM se efectúa como se describe anteriormente (Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). La selección de los transformandos se efectúa en placas de LBHIS-agar (18,5 g/l de infusión de cerebro-corazón Boullion, sorbitol 0,5 M, 5 g/l de bacto-triptona, 2,5 g/l de extracto de bacto-levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l de bacto-agar, complementada con 5 mg/l de tetraciclina). Las placas se incubaron dos días a 33°C. La cepa obtenida, portadora de plásmido, se llama C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM.
19. Construcción de un vectorpVWEX1::rfbBDAC para la expresión heteróloga en C. glutamicum
Para la expresión heteróloga de los genes rfbBDAC de P. putida bajo control del promotor de lac en C. glutamicum se construye el vector pVWEX1 ::rfbBDAC (Seq ID Nr. 57). A tal efecto se digiere el vector pBBR1 MCS-2::rfbBDAC (Seq ID Nr. 45) con Xbal y se unen el fragmento que contiene los genes rfbBDAC de P. putida KT2440 y el promotor de lac (3840 bp) en el vector digerido con Xbal pvWEX1 (Seq ID Nr. 56). El plásmido resultante pVWEX1 ::rfbBDAC (Seq ID Nr. 57) tiene un tamaño de 12311 pares de bases. La unión, así como la transformación de células de E. coli DH5a competentes químicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectúa de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifica mediante análisis secuencial de ADN. La transformación de C. glutamicum ATCC13032 pEC-XT99A, ATCC13032 pEC-XT99A::AB, ATCC13032 pEC-XT99A::ABM, ATCC13032 pEC-XT99A::ABC y ATCC13032 pEC-XT99A::ABCM con el vector pVWEX1::rfbBDAC se efectúa como se describe anteriormente (Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). La selección de los transformandos se efectúa en placas de LBHIS-agar (18,5 g/l de infusión de cerebro-corazón Boullion, sorbitol 0,5 M, 5 g/l de bacto-triptona, 2,5 g/l de extracto de bacto-levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l de bacto-agar, complementada con 5 mg/l de tetraciclina y 25 mg/l de canamicina). Las placas se incubaron dos días a 33°C. Las cepas obtenidas, portadoras de plásmidos, se llaman C. glutamicum pEC-XT99A pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDAC y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pVWEXI ::rfbBDAC.
20. Cuantificación de la producción de ramnolípidos mediante cepas recombinantes de C. glutamicum
Las cepas recombinantes de C. glutamicum generadas en los Ejemplos 15 a 19 C. glutamicum pEC-XT99A, C. glutamicum pEC-XT99A::AB, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM, C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM, C. glutamicum pEC-XT99A pVWEX1 ::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::AB pVWEX1 ::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDAC y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pVWEX1 ::rfbBDAC se cultivan en placas de LBHIS-agar con 5 mg/l de tetraciclina, o bien 5 mg/l de tetraciclina y 25 mg/l de canamicina. Para la investigación de la producción de ramnolípidos en el matraz de agitación se elaboran cultivos previos en primer lugar. A tal efecto se emplea un asa bacteriológica de una cepa recién extendida sobre placas de LBHIS-agar, y se inoculan 10 ml de medio LBHIS (18,5 g/l de infusión de cerebrocorazón Boullion, sorbitol 0,5 M, 5 g/l de bacto-triptona, 2,5 g/l de extracto de bacto-levadura y 5 g/l de NaCl, complementada con 5 mg/l de tetraciclina, o bien 5 mg/l de tetraciclina y 25 mg/l de canamicina) en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. El cultivo de las cepas se efectúa a 33 °C y 200 rpm durante la noche. A la mañana siguiente se inoculan 50 ml de medio CGXII (con 5 mg/l de tetraciclina, o bien 5 mg/l de tetraciclina y 25 mg/l de canamicina) en un matraz Erlenmeyer de 500 ml con deflectores con 1 ml de cultivo previo (OD600 inicial 0,1).
Medio CGXII:
• 20 g/l de (NH4)2SO4 (Merck)
• 5 g/l de urea (Merck)
• 1 g/l de KH2PO4 (Merck)
• 1 g/l de K2HPO4 (Merck)
• 0,25 g/l de MgSO4 • 7H2O (Merck)
• 10 mg/l de CaCl2 (Merck)
• 42 g/l de MOPS (Roth)
• 0,2 mg/l de biotina (Merck)
• 1 ml/l de disolución salina en trazas
• ajuste de pH 7 con NaOH
• tras el tratamiento en autoclave se añaden 1 ml/l de ácido protocatéquico (30 g/l disueltos en NaOH diluido, filtrado en medio estéril) y 40 g/l de glucosa (Merck)
Disolución salina en trazas:
• 10 g/l de FeSO4 • 7H2O (Merck)
• 10 g/l de MnSO4 • H2O (Merck)
• 1 g/l de ZnSO4 • 7H2O (Merck)
• 0,2 g/l de CuSO4 • 5 H2O (Merck)
• 20 mg/l de NiCl2 • 6 H2O (Merck)
• para disolución se acidifica a pH 1 con HCl
Los cultivos se cultivan a 200 rpm y 33°C hasta una densidad óptica (600 nm) de 0,4 - 0,6. Los cultivos se inducen a esta densidad óptica mediante la adición de IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranósido; concentración final 1 mM). La expresión subsiguiente se efectúa igualmente a 33°C y 200 rpm durante 72 h. A intervalos de 24 h se extrae una muestra de 1 ml de caldo del matraz de cultivo. La preparación de muestras para los subsiguientes análisis cromatográficos en sí mismos se efectúan como se describe en el Ejemplo 4.
Mientras que C. glutamicum pEC-XT99A no produce ramnolípidos, la formación de ramnolípidos es identificable en las cepas recombinantes C. glutamicum pEC-XT99A::AB, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM. Por medio de materiales de referencia se muestra que C. glutamicum pEC-XT99A::AB y C. glutamicum pEC-XT99A::ABM forman únicamente monorramnosil-lípidos, mientras que C. glutamicum pEC-XT99A::ABC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pueden formar dirramnosil-lípidos y monorramnosil-lípidos. Además se muestra que C. glutamicum pEC-XT99A::ABM y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pueden formar más monorramnosil-lípidos, o bien dirramnosil-lípidos y monorramnosil-lípidos que las respectivas cepas de referencia C. glutamicum pEC-XT99A::AB y C. glutamicum pEC-XT99A::ABC sin intensificación del gen pa1131 de Pseudomonas aeruginosa.
Además se muestra que las cepas C. glutamicum pEC-XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC pVwEX1::rfbBDAC y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pVWEX1::rfbBDAC forman sensiblemente más mono- (C. glutamicum pEC-XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC y C. glutamicum pEC-XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC), o bien mono- y dirramnosil-lípidos (C.
glutamicum pEC-XT99A::ABC pVWEXI ::rfbBDAC y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pVWEXI ::rfbBDAC) que las cepas C. glutamicum pEC-XT99A::ABM, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM sin intensificación de los genes rfbBDA de P. putida.
21. Construcción de cepas de Pseudomonas que portan los plásmidos pBBR1MCS-2, pBBR1MCS-2::AB, pBBR1 MCS-2::ABC, pBBR 1 MCS-2::ABMy pBBR 1 MCS-2::ABCM
Los plásmidos pBBR1 MCS-2, pBBR1 MCS-2::AB, pBBR1 MCS-2::ABC, pBBR1 MCS-2::ABM y pBBR1 MCS-2::ABCM se introducen en Pseudomonas fluorescens DSM 50090, Pseudomonas fluorescens DSM 9958, Pseudomonas putida DSM 6899, Pseudomonas putida DSM 50204, Pseudomonas putida 50194, P. brassicacearum Ds M 13227, P. stutzeri DSM 10701, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 y Pseudomonas fulva DSM 17717 por electroporación. La transformación de cepas de Pseudomonas se efectúa como se describe anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). La selección de los transformandos se efectúa sobre placas de nutriente-agar (5 g/l de peptona; 3 g/l de extracto de carne; 15 g/l de agar; pH 7; complementado con 50 mg/l de canamicina). Las placas se incuban dos días a 30°C, o bien 28°C. Las cepas obtenidas, portadoras de plásmidos, se llaman Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1 MCS-2, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1 MCS-2, Pseudomonas putida 50194 pBBR1 MCS-2, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fulva Ds M 17717 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::AB, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::AB, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1 MCS-2::AB, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1 MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida 50194 pBBR1 MCS-2::ABC, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1 MCS-2::ABC, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1 MCS-2::ABC, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens Ds M 9958 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABCM, P. brassicacearum d Sm 13227 pBBR1MCs-2::ABCM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1 MCS-2::ABCM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1 MCS-2::ABCM, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABM y Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABM.
22. Cuantificación de la producción de ramnolípidos mediante cepas recombinantes de Pseudomonas
Las cepas recombinantes de Pseudomonas generadas en el Ejemplo 21 Pseudomonas fluorescens DSM 50090, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::AB, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::AB, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1 MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1 Mc S-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1 MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1 MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1McS-2::ABC, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABC, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABC, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1McS-2::ABC, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABCM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1 MCS-2::ABCM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1 MCS-2::Ab Cm , Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1 MCS-2::ABM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1 MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1 MCS-2::ABM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1 MCS-2::ABM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1 MCS-2::ABM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1 MCS-2::ABM y Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1 MCS-2::ABM se cultivan en placas de LB-agar-canamicina (50 pg/ml). El subsiguiente cultivo para la producción de ramnolípidos se efectúa como se describe en el Ejemplo 12. La preparación de muestras para los subsiguientes análisis cromatográficos en sí mismos se efectúan como se describe en el Ejemplo 4.
Mientras que las cepas de Pseudomonas Pseudomonas fluorescens DSM 50090, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2 no producen ramnolípidos, la formación de monorramnosil-lípidos es verificable en las cepas recombinantes Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::AB, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::AB, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABM y Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1 MCS-2::ABM, y la formación de mono- y dirramnosil-lípidos es determinable en las cepas Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABC, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABC, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1 MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1 MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABCM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABCM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABCM y Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABCM.
Además, mediante las cepas recombinantes de Pseudomonas Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABM Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABM, se forman menos monorramnosil-lípidos, o bien mediante las cepas recombinantes de Pseudomonas Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1 MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1 MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1 MCS-2::ABCM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1 MCS-2::ABCM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1 MCS-2::ABCM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABCM y Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABCM se forman menos mono- y dirramnosil-lípidos que mediante las respectivas cepas de referencia sin el gen de P. aeruginosa pa1131 Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1 MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::AB, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::AB, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::AB y Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::AB, o bien Pseudomonas fluorescens Ds M 50090 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABC, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCs-2::ABC, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABC y Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABC sin intensificación del gen pa1131 de Pseudomonas aeruginosa.
23. Construcción de los vectores pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 y pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264 para la expresión heteróloga de genes alternativos rhlA, rhlB y rhlC de Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas aeruginosa PA7, Pseudomonas aeruginosa 1 y Burkholderia thailandensis E264 en P. putida
Para la expresión heteróloga de los genes rhlA, rhlB y rhlC de Pseudomonas aeruginosa PAO1, o bien Pseudomonas aeruginosa PA7, en primer lugar se construyen los plásmidos pBBR1 MCS-2::ABPAO1 (Seq ID Nr. 62) y pBBR1 MCS-2::ABPA7 (Seq ID Nr. 63). A tal efecto se sintetizan los operones sintéticos rhlABPAO1 (Seq ID Nr.64) y rhlABPA7 (Seq ID Nr. 65) de la firma DNA 2.0 (Menlo Park, CA, U.S.A) y se interclonan en el vector comercial pJ294 (DNA 2.0). La base para la síntesis es la ya conocida secuencia genómica de las cepas Pseudomonas aeruginosa PAO1 y Pseudomonas aeruginosa PA7. Partiendo de los vectores pJ294::ABPAO1 y pJ294::ABPA7 se cortan los operones sintéticos por medio de KpnI y XbaI a partir de los vectores, y a continuación se unen al vector de expresión, cortado con KpnI y XbaI, pBBR1MCS-2 (Seq ID Nr. 49) (Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176). Los plásmidos resultantes pBBR1MCS-2::ABPAO1 (Seq ID Nr. 62) y pBBR1MCS-2::ABPA7 (Seq ID Nr. 63) tienen un tamaño de 7332, o bien 7354 pares de bases. La unión, así como la transformación de células de E. coli DH5a competentes químicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectúa de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifica mediante análisis secuencial de ADN. En el segundo paso se generan los plásmidos pBBR1 MCS-2::ABPAO1-C1 (Seq ID Nr. 66) y pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264 (Seq ID Nr. 67). A tal efecto se sintetizan los genes rhlC de Pseudomonas aeruginosa 1 (Seq ID Nr. 68) y Burkholderia thailandensis E264 (Seq ID Nr. 76) de la firma DNA 2.0 (Menlo Park, CA, U.S.A) y se interclonan en el vector comercial pJ294 (DNA 2.0). La base para la síntesis es la ya conocida secuencia genómica de las cepas Pseudomonas aeruginosa 1 y Burkholderia thailandensis E264. Partiendo de los vectores pJ294::C1 y pJ294::CE264 se cortan los genes rhlC por medio de Xba y SacI a partir de los vectores, y a continuación se unen a los vectores, igualmente cortados con Xba y Sacl, pBBR1MCS-2::ABPAO1 (Seq ID Nr.
62), o bien pBBR1MCS-2::ABPA7 (Seq ID Nr. 63). Los plásmidos resultantes pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 (Seq ID Nr.
66) y pBBR1 MCS-2::ABPA7-CE264 (Seq ID Nr. 67) tienen un tamaño de 8325, o bien 8335 pares de bases. La unión, así como la transformación de células de E. coli DH5a competentes químicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectúa de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifica mediante análisis secuencial de ADN. La transformación de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con los vectores pBBR1MCS-2, pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 y pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264 se efectúa como se describe anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). Se aísla y se analiza el ADN plasmídico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plásmidos, se llaman P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABPAO1 -C1, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABPA7-CE264, P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABPA7-CE264.
24. Cuantificación de la producción de ramnolípidos mediante cepas recombinantes de P. putida con genes alternativos rhlA, rhlB y rhlC de Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas aeruginosa PA7, Pseudomonas aeruginosa 1 y Burkholderia thailandensis E264
Las cepas recombinantes generadas en el Ejemplo 23 P. Putida se cultivan en placas de LB-agar-canamicina (50 pg/ml). El subsiguiente cultivo para la producción de ramnolípidos se efectúa como se describe en el Ejemplo 12. La preparación de muestras para los subsiguientes análisis cromatográficos en sí mismos se efectúan como se describe en el Ejemplo 4.
Mientras las cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2 y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2 no pueden formar mono- y dirramnosil-lípidos, las cepas P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABPAO1 -C1, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABPA7-CE264, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABPA7-CE264 forman tanto mono- como también dirramnosil-lípidos. Se muestra que las cepas con debilitamiento de la formación de polihidroxibutirato (P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABPA7-CE264) pueden producir más mono- o dirramnosil-lípidos que las cepas sin debilitamiento de la formación de polihidroxibutirato (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 y P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABPA7-CE264).
25. Construcción de los vectores pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC y pBBRIMCS-2::ABMC_rfbBDAC para la sobreexpresión del operón de P. putida rfbBDAC en P. putida y E. coli
Para la construcción de los vectores pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC y pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC para la sobreexpresion del operón de P. putida rfbBDAC en P. putida y E. coli, en primer lugar se amplificó el operón de P. putida rfbBDAC por Pc R. El vector pBBR1MCS-2::rfbBDAC (Seq ID Nr. 45) sirvió como matriz para una PCR. Se emplearon los siguientes oligonucleótidos:
RL_Agel-fw: 5'-TATATATAACCGGTATTAATGCAGCTGGCACGAC-3' (Seq ID Nr. 71)
RL_Agel_rev: 5'-GGCCGACCGGTACTAGTGGA-3' (Seq ID Nr. 72)
La PCR se llevó a cabo con la Phusion™ High-Fidelity Master Mix de New England Biolabs (Frankfurt) polimerasa. Ésta se efectuó de modo conocido por el especialista. La secuencia objetivo (promotor de lac y rfbBDAC) se interclonó en el sistema Trenzyme Alligator Cloning System. Se seleccionaron transformandos de E. coli DH5a (New England Biolabs; Frankfurt) y se aisló y se secuenció el ADN plasmídico de diversos candidatos. Después de haber verificado la secuencia y analizado la exactitud de la misma, se cortó el vector con AgeI. El fragmento objetivo se unió a los vectores, igualmente cortados con AgeI, pBBR1MCS-2::AB (Seq ID Nr. 38), pBBR1MCS-2::ABM (Seq ID Nr. 42) y pBBR1MCS-2::ABMC (Seq ID Nr. 51) por medio de métodos de unión convencionales. Los vectores resultantes pBBR1 MCS-2::AB_rfbBDAC (Seq ID Nr. 73), pBBR1 MCS-2::ABM_rfbBDAC (Seq ID Nr. 74) y pBBR1 MCS-2::ABMC_rfbBDAC (Seq ID Nr. 75) tienen tamaños de 11960, 13289, o bien 14250 pares de bases. Se secuenciaron los insertos de los vectores. La puesta en práctica de la PCR, la verificación de la amplificación exitosa de la PCR por medio de electroforesis en gel de agarosa, el teñido con bromuro de etidio de ADN, la determinación del tamaño de fragmento por PCR, la purificación de los productos de PCR y la determinación de la concentración de ADN se efectuaron de modo conocido por el especialista. La transformación de Pseudomonas putida KT2440 con los vectores pBBR1 MCS-2::AB_rfbBDAC, pBBR1 MCS-2::ABM_rfbBDAC y pBBR1 MCS-2::ABMC_rfbBDAC se efectuó como se ha descrito anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). Se aisló y se analizó el ADN plasmídico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plásmidos, se llaman P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::AB_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABM_rfbBDAC y P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABMC rfbBDAC.
26. Cuantificación de la producción de ramnolípidos mediante P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR 1 MCS-2::ABM_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR 1 MCS-2::ABC_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR 1 MCS-2::-ABMC_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR 1 MCS-2::AB, P. putida KT2440 pBBR 1 MCS-2::ABM, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC y P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC recombinante
Las cepas recombinantes de P. putida generadas en los Ejemplos 2, 7 y 25 se cultivan en placas de LB-agarcanamicina (50 pg/ml). El subsiguiente cultivo para la producción de ramnolípidos se efectúa como se describe en el Ejemplo 12. La preparación de muestras para los subsiguientes análisis cromatográficos en sí mismos se efectúan como se describe en el Ejemplo 4.
Se muestra que P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB y P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM pueden formar monorramnosil-lípidos, mientras que P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC y P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC pueden formar mono- y dirramnosillípidos. Además se muestra que P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM, KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC y KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC pueden formar más mono- y dirramnosil-lípidos que las correspondientes cepas de control P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::AB_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::AB, KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC y KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC sin intensificación del gen de Pseudomonas aeruginosa pa1131.
Finalmente se muestra que P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABMC_rfbBDAC pueden formar más mono- (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC y P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC), o bien mono- y dirramnosil-lípidos (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC y P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC) que las respectivas cepas de control P. putida KT2440 pBBR1 Mc S-2::AB, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABM, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABMC sin intensificación de los genes de P. putida rfbBDAC.
27. Generación de E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::AB, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::ABM, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::ABCM, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::AB_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::ABC_rfbBDAC y E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::ABCM_rfbBDAC recombinante
La transformación de E. coli W3110 se efectuó como se ha descrito anteriormente (Miller JH. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Lab. Press; 1992) por medio de electroporación. Se aisló y se analizó el ADN plasmídico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plásmido, se llamaron E. co liW3110 pBBR1 MCS-2::AB, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABM, E. co liW3110 pBBR1 MCS-2::ABC, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABCM, E. c o liW3110 pBBR1 MCS-2::AB_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABM_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC y E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABCM_rfbBDAC.
28. Cuantificación de la producción de ramnolípidos mediante E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::ABM, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::ABC, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::ABCM, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::AB_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::ABM_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM_rfbBDAC recombinante
Las cepas recombinantes de E. coli generadas en el ejemplo 27 se cultivan en placas de LB-agar-canamicina (50 pg/ml). El siguiente cultivo para la producción de ramnolípidos se efectúa como se describe en el Ejemplo 10. La preparación de muestras para los subsiguientes análisis cromatográficos en sí mismos se efectúan como se describe en el Ejemplo 4.
Se muestra que E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::AB, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABM, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::AB_rfbBDAc y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC pueden formar monorramnosil-lípidos, mientras que E. coli W3110pBBR1 MCS-2::ABC, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABCM, E. co liW3110 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC y E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABCM_rfbBDAC pueden formar mono- y dirramnosil-lípidos. Además se muestra que E. co liW3110 pBBR1 MCS-2::ABM y E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABM_rfbBDAC forman más monorramnosil-lípidos que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC sin intensificación del gen de Pseudomonas aeruginosa pa1131. Además se muestra que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM y E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABCM_rfbBDAC forman más mono- y dirramnosil-lípidos que E. c o liW3110 pBBR1 MCS-2::ABC y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC sin intensificación del gen de Pseudomonas aeruginosa pa1131. Además se muestra que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC forman más monorramnosil-lípidos que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC sin intensificación del gen de Pseudomonas aeruginosa pa1131. Finalmente se muestra que E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::AB_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABM_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC y E. coli

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Célula seleccionadas a partir de microorganismos que puede formar al menos un ramnolípido de la Fórmula general (I)
Figure imgf000263_0001
siendo
m = 2 , 1 o 0, en especial 1 o 0,
n = 1 o 0, en especial 1,
R1 y R2 = independientemente entre sí, restos orgánicos iguales o diferentes independientemente entre sí, con 2 a 24, preferentemente 5 a 13 átomos de carbono, en especial resto alquilo, en caso dado ramificado, en caso dado sustituido, en especial hidroxisustituido, en caso dado insaturado, en especial, en caso dado, mono-, di- o triinsaturado, caracterizada por que se modificó mediante técnica génica de modo que, en comparación con su tipo salvaje, presenta una actividad acrecentada de al menos una de las enzimas E1, E2 y E3, pudiendo catalizar la enzima E1 la reacción de 3-hidroxialcanoil-ACP a través de ácido-3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico-ACP para dar ácido hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico, siendo la enzima E2 una ramnosiltransferasa I, y pudiendo catalizar esta la reacción de dTDP-ramnosa y 3-hidroxialcanoato de 3-hidroxialcanoilo para dar 3-hidroxialcanoato de a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoilo, y siendo la enzima E3 una ramnosiltransferasa II, y pudiendo catalizar esta la reacción de dTPD-ramnosa y 3-hidroxialcanoato de a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoilo para dar 3-hidroxialcanoato de a-L-ramnopiranosil-(1 -2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoilo, y
caracterizada por que, en comparación con su tipo salvaje, presenta una actividad acrecentada de al menos una enzima E8, que cataliza la exportación de un ramnolípido de la Fórmula general (I) de la célula al medio circundante, preferente con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta 25 % de los restos aminoácido están modificados frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28 mediante deleción, inserción, sustitución o una combinación de estas, y que aún posee al menos 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28.
2. Célula según la reivindicación 1, caracterizada por que las enzimas E1, E2 y E3 se seleccionan a partir del grupo constituido por
al menos una enzima E1 seleccionada a partir de
una enzim a E ia con la se cu en cia de polipéptidos Seq ID Nr. 2 o con una se cu en cia de polipéptidos en la que hasta un 25 de los restos am inoácido se han modificado respecto a la se cu en cia de referencia Seq ID Nr. 2 mediante deleción, inserción, sustitución, o una com binación de las m ism as, y que aún posee al m enos un 10 % de la actividad enzim ática de la enzim a con la secu en cia de referencia Seq ID Nr. 2, una enzim a E 1b con la secu en cia de polipéptidos Seq ID Nr. 18 o con una secu e n cia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos am inoácido se han modificado respecto a la secu en cia de referencia Seq ID Nr. 18 mediante deleción, inserción, sustitución, o una com binación de las m ism as, y que aún posee al m enos un 10 % de la actividad enzim ática de la enzim a con la se cu en cia de referencia Seq ID Nr. 18,
una enzim a E 1c con la secu en cia de polipéptidos Seq ID Nr. 78 o con una se cu en cia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos am inoácido se han modificado respecto a la secu e n cia de referencia Seq ID Nr. 78 mediante deleción, inserción, sustitución, o una com binación de las m ism as, y que aún posee al m enos un 10 % de la actividad enzim ática de la enzim a con la se cu en cia de referencia Seq ID Nr. 78, una enzim a E 1d con la secu en cia de polipéptidos Seq ID Nr. 80 o con una se cu en cia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos am inoácido se han modificado respecto a la secu en cia de referencia Seq ID Nr. 80 mediante deleción, inserción, sustitución, o una com binación de las m ism as, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzim ática de la enzim a con la se cu en cia de referencia Seq ID Nr. 80, una enzim a E 1e con la secu en cia de polipéptidos Seq ID Nr. 82 o con una se cu en cia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos am inoácido se han modificado respecto a la secu en cia de referencia Seq ID Nr. 82 mediante deleción, inserción, sustitución, o una com binación de las m ism as, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzim ática de la enzim a con la se cu en cia de referencia Seq ID Nr. 82, una enzim a E 2 se leccio nada a partir de
una enzim a E 2 a con la se cu en cia de polipéptidos Seq ID Nr. 4 o con una se cu en cia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos am inoácido se han modificado respecto a la se cu en cia de referencia Seq ID Nr.
4 mediante deleción, inserción, sustitución, o una com binación de las m ism as, y que aún posee al m enos un 10 % de la actividad enzim ática de la enzim a con la secu en cia de referencia Seq ID Nr. 4,
una enzim a E 2 b con la secu en cia de polipéptidos Seq ID Nr. 20 o con una se cu en cia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos am inoácido se han modificado respecto a la secu en cia de referencia Seq ID Nr. 20 mediante deleción, inserción, sustitución, o una com binación de las m ism as, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzim ática de la enzim a con la se cu en cia de referencia Seq ID Nr. 20, una enzim a E 2 c con la secu en cia de polipéptidos Seq ID Nr. 84 o con una se cu en cia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos am inoácido se han modificado respecto a la secu e n cia de referencia Seq ID Nr. 84 mediante deleción, inserción, sustitución, o una com binación de las m ism as, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzim ática de la enzim a con la se cu en cia de referencia Seq ID Nr. 84, una enzim a E 2 d con la secu en cia de polipéptidos Seq ID Nr. 86 o con una se cu en cia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos am inoácido se han modificado respecto a la secu en cia de referencia Seq ID Nr. 86 mediante deleción, inserción, sustitución, o una com binación de las m ism as, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzim ática de la enzim a con la se cu en cia de referencia Seq ID Nr. 86, y una enzim a E 2 e con la secu en cia de polipéptidos Seq ID Nr. 88 o con una se cu en cia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos am inoácido se han modificado respecto a la secu en cia de referencia Seq ID Nr. 88 mediante deleción, inserción, sustitución, o una com binación de las m ism as, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzim ática de la enzim a con la se cu en cia de referencia Seq ID Nr. 88, y una enzim a E 3 se leccio nada a partir de
una enzim a E3a con la se cu en cia de polipéptidos Seq ID Nr. 6 o con una se cu en cia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos am inoácido se han modificado respecto a la se cu en cia de referencia Seq ID Nr.
6 mediante deleción, inserción, sustitución, o una com binación de las m ism as, y que aún posee al m enos un 10 % de la actividad enzim ática de la enzim a con la secu en cia de referencia Seq ID Nr. 6,
una enzim a E3b con la secu en cia de polipéptidos Seq ID Nr. 22 o con una se cu en cia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos am inoácido se han modificado respecto a la secu en cia de referencia Seq ID Nr. 22 mediante deleción, inserción, sustitución, o una com binación de las m ism as, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzim ática de la enzim a con la se cu en cia de referencia Seq ID Nr. 22,
una enzima E3c con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 90 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 90 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 90, y
una enzima E3d con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 92 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 92 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que presenta aún al menos un 10 % de actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 92.
3. Célula según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que presenta actividades acrecentadas de una combinación enzimática seleccionada a partir de
E2, E2E3 y E1E2E3.
4. Célula según al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que presenta una actividad acrecentada de la combinación enzimática E1E2E3, y n es preferentemente = 1.
5. Célula según al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que se selecciona a partir de una especie del grupo constituido por Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium y Cupriavidus.
6. Célula según al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que, como tipo salvaje, puede formar polihidroxialcanoatos con longitudes de cadena de C6 a C16, en especial aquellos que se modificaron mediante técnica génica de modo que su tipo salvaje puede formar menos polihidroxialcanoatos.
7. Célula según la reivindicación 6, caracterizada por que la célula, en comparación con su tipo salvaje, presenta una actividad reducida de al menos una enzima E9 o E10,
representando E9 una polihidroxialcanoato-sintasa, EC:2.3.1.-, con la capacidad de transformar 3-hidroxialcanoilcoenzima A en ácido poli-3-hidroxialcanoico, en especial con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 30 o Seq ID Nr.
32, o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoácidos están modificados frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 30 o Seq ID Nr. 32 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 30 o Seq ID Nr. 32, y
E10 una 3-hidroxialcanoil-ACP:coenzima A-transferasa, con la capacidad de transformar 3-hidroxialcanoil-ACP en 3-hidroxialcanoil-coenzima A, en especial con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 34 o Seq ID Nr. 36, o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoácido están transformados frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 34 o Seq ID Nr. 36 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 34 o Seq ID Nr. 36.
8. Célula según al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que, en comparación con su tipo salvaje, presenta una actividad acrecentada de al menos una de las enzimas seleccionadas a partir del grupo constituido por
al menos una enzima E4, una dTTP:a-D-glucosa-1 -fosfato timidililtransferasa, EC 2.7.7.24, en especial con secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 10 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoácido están transformados frente a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 10 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 10,
al menos una enzima E5, una dTTP-glucosa-4,6-hidroliasa, EC 4.2.1.46, en especial con secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 12 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoácido están transformados frente a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 12 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 12,
al menos una enzima E6, una dTDP-4-dehidrorramnosa-3,5-epimerasa, EC 5.1.3.13, en especial con secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 14 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoácido están transformados frente a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 14 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 14, y
al menos una enzima E7, una dTDP-4-dehidrorramnosa-reductasa, EC 1.1.1.133, en especial con secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 16 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoácido están transformados frente a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 16 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 16.
9. Célula según al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que la enzima E8 presenta una secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta 25 % de los restos aminoácido están modificados frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28 mediante deleción, inserción, sustitución o una combinación de estas, y que aún posee al menos 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28.
10. Célula según al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que presenta al menos un ácido nucleico aislado, que presenta al menos respectivamente una secuencia seleccionada a partir de los tres grupos [A1 a G1], [A2 a G2] y [A3 a G3],
estando constituido el grupo [A1 a G1] por las siguientes secuencias:
A1a) una secuencia según Seq ID Nr. 1, codificando esta secuencia para una proteína que puede transformar 3-hidroxidecanoil-ACP a través de 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoil-ACP en ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
B1 a) una secuencia exenta de intrón, que es derivada de una secuencia según A1 a) y codifica la misma proteína o el mismo péptido que la secuencia según Seq ID Nr. 1,
C1a) una secuencia que codifica una proteína o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos según Seq ID Nr. 2,
D1a) una secuencia que es idéntica a una secuencia según uno de los grupos A1a) a C1a) en al menos un 70 %,
E1 a) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia según uno de los grupos A1 a) a D1 a), o hibridaría bajo consideración de la degeneración del código genético, pudiendo codificar esta secuencia para una proteína o un péptido que puede transformar 3-hidroxidecanoil-ACP a través de 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoil-ACP en ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, y siendo las condiciones de hibridación incubación a 65°C durante la noche en 7 % de SDS, 1 % de BSA, EDTA 1 mM, tampón fosfato sódico 250 mM (pH 7,2) y subsiguiente lavado a 65°C con 2 x SSC; 0,1 % SDS,
F1a) un derivado, obtenido mediante sustitución, adición, inversión y/o deleción de al menos una base, pero no más de 100 bases, según uno de los grupos A1 a) a E1 a),
G1a) una secuencia complementaria a una secuencia según uno de los grupos A1a) a F1a),
A1b) una secuencia según Seq ID Nr. 17, codificando esta secuencia para una proteína que puede transformar 3-hidroxitetradecanoil-ACP a través de 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP en ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
B1 b) una secuencia exenta de intrón, que es derivada de una secuencia según A1 b) y codifica la misma proteína o el mismo péptido que la secuencia según Seq ID Nr. 17,
C1b) una secuencia que codifica una proteína o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos según Seq ID Nr. 18,
D1 b) una secuencia que es idéntica a una secuencia según uno de los grupos A1 b) a C1 b) en al menos un 70 %, E1 b) una secuencia que híbrida con la contrahebra de una secuencia según uno de los grupos A1 b) a D1 b), o hibridaría bajo consideración de la degeneración del código genético, pudiendo codificar esta secuencia para una proteína o un péptido que puede transformar 3-hidroxitetradecanoil-ACP a través de 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP en ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y siendo las condiciones de hibridación incubación a 65°C durante la noche en 7 % de SDS, 1 % de BSA, EDTA 1 mM, tampón fosfato sódico 250 mM (pH 7,2) y subsiguiente lavado a 65°C con 2 x SSC; 0,1 % SDS,
F1b) un derivado, obtenido mediante sustitución, adición, inversión y/o deleción de al menos una base, pero no más de 100 bases, de una secuencia según uno de los grupos A1b) a E1b), y
G1b) una secuencia complementaria a una secuencia según uno de los grupos A1b) a F1b), y
estando constituido el grupo [A2 a G2] por las siguientes secuencias:
A2a) una secuencia según Seq ID Nr. 3, codificando esta secuencia para una proteína que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
B2a) una secuencia exenta de intrón, que es derivada de una secuencia según A2a) y codifica la misma proteína o el mismo péptido que la secuencia según Seq ID Nr. 3,
C2a) una secuencia que codifica una proteína o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos según Seq ID Nr. 4,
D2a) una secuencia que es idéntica a una secuencia según uno de los grupos A2a) a C2a) en al menos un 80 %,
E2a) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia según uno de los grupos A2a) a D2a), o hibridaría bajo consideración de la degeneración del código genético, pudiendo codificar esta secuencia para una proteína o un péptido que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, y siendo las condiciones de hibridación incubación a 65°C durante la noche en 7 % de SDS, 1 % de BSA, EDTA 1 mM, tampón fosfato sódico 250 mM (pH 7,2) y subsiguiente lavado a 65°C con 2 x SSC; 0,1 % SDS,
F2a) un derivado, obtenido mediante sustitución, adición, inversión y/o deleción de al menos una base, pero no más de 100 bases, de una secuencia según uno de los grupos A2a) a E2a),
G2a) una secuencia complementaria a una secuencia según uno de los grupos A2a) a F2a),
A2b) una secuencia según Seq ID Nr. 19, codificando esta secuencia para una proteína que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
B2b) una secuencia exenta de intrón, que es derivada de una secuencia según A2b) y codifica la misma proteína o el mismo péptido que la secuencia según Seq ID Nr. 19,
C2b) una secuencia que codifica una proteína o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos según Seq ID Nr. 20,
D2b) una secuencia que es idéntica a una secuencia según uno de los grupos A2b) a C2b) en al menos un 70 %,
E2b) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia según uno de los grupos A2b) a D2b), o hibridaría bajo consideración de la degeneración del código genético, pudiendo codificar esta secuencia para una proteína o un péptido que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y siendo las condiciones de hibridación incubación a 65°C durante la noche en 7 % de SDS, 1 % de BSA, EDTA 1 mM, tampón fosfato sódico 250 mM (pH 7,2) y subsiguiente lavado a 65°C con 2 x SSC; 0,1 % SDS,
F2b) un derivado, obtenido mediante sustitución, adición, inversión y/o deleción de al menos una base, pero no más de 100 bases, de una secuencia según uno de los grupos A2b) a E2b), y
G2b) una secuencia complementaria a una secuencia según uno de los grupos A2b) a F2b), y
estando constituido el grupo [A3 a G3] por las siguientes secuencias:
A3a) una secuencia según Seq ID Nr. 5, codificando esta secuencia para una proteína que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
B3a) una secuencia exenta de intrón, que es derivada de una secuencia según A3a) y codifica la misma proteína o el mismo péptido que la secuencia según Seq ID Nr. 5,
C3a) una secuencia que codifica una proteína o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos según Seq ID Nr. 6,
D3a) una secuencia que es idéntica a una secuencia según uno de los grupos A3a) a C3a) en al menos un 80 %, E3a) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia según uno de los grupos A3a) a D3a), o hibridaría bajo consideración de la degeneración del código genético, pudiendo codificar esta secuencia para una proteína o un péptido que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, y siendo las condiciones de hibridación incubación a 65°C durante la noche en 7 % de SDS, 1 % de BSA, EDTA 1 mM, tampón fosfato sódico 250 mM (pH 7,2) y subsiguiente lavado a 65°C con 2 x SSC; 0,1 % SDS,
F3a) un derivado, obtenido mediante sustitución, adición, inversión y/o deleción de al menos una base, pero no más de 100 bases, de una secuencia según uno de los grupos A3a) a E3a),
G3a) una secuencia complementaria a una secuencia según uno de los grupos A3a) a F3a),
A3b) una secuencia según Seq ID Nr. 21, codificando esta secuencia para una proteína que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
B3b) una secuencia exenta de intrón, que es derivada de una secuencia según A3b) y codifica la misma proteína o el mismo péptido que la secuencia según Seq ID Nr. 21,
C3b) una secuencia que codifica una proteína o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos según Seq ID Nr. 22,
D3b) una secuencia que es idéntica a una secuencia según uno de los grupos A3b) a C3b) en al menos un 60 %, E3b) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia según uno de los grupos A3b) a D3b), o hibridaría bajo consideración de la degeneración del código genético, pudiendo codificar esta secuencia para una proteína o un péptido que puede transformar dTDP-ramnosa y ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en ácido a-L-ramnopiranosil-(1 -2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y siendo las condiciones de hibridación incubación a 65°C durante la noche en 7 % de SDS, 1 % de BSA, EDTA 1 mM, tampón fosfato sódico 250 mM (pH 7,2) y subsiguiente lavado a 65°C con 2 x SSC; 0,1 % SDS,
F3b) un derivado, obtenido mediante sustitución, adición, inversión y/o deleción de al menos una base, pero no más de 100 bases, de una secuencia según uno de los grupos A3b) a E3b), y
G3b) una secuencia complementaria a una secuencia según uno de los grupos A3b) a F3b),
o al menos un vector, en especial un vector de expresión o un cassette de sobreexpresión génica, que comprende al menos una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada a partir de Seq ID Nr. 38, Seq ID Nr. 40, Seq ID Nr. 42, Seq ID Nr. 45 y Seq ID Nr. 47, y ácidos nucleicos seleccionados a partir de los tres grupos citados anteriormente [A1 a G1], [A2 a G2] y [A3 a G3].
11. Procedimiento para la producción de ramnolípidos de la Fórmula general (I), que comprende los pasos de procedimiento
I) puesta en contacto de una célu la según una de las reivindicaciones 1 a 10 con un medio que contiene una fuente de carbono,
II) cultivo de la célu la bajo condiciones que posibilitan a la célu la formar ramnolípido a partir de la fuente de carbono, y
III) en caso dado aislam iento de los ram nolípidos form ados.
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