BR112013002124B1 - Células e processo para a produção de ramnolipídeos - Google Patents

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Abstract

CÉLULAS E PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS A presente invenção refere-se a células e ácidos nucleicos, bem como seu uso para a produção de ramnolipídeos, como também a processos para a produção de ramnolipídeos.

Description

Campo da Invenção
[0001] A presente invenção se refere a células e ácidos nucleicos, bem como seu uso para a produção de ramnolipídeos, como também processos para a produção de ramnolipídeos.
Estado da Técnica
[0002] Hoje em dia, os tensoativos são essencialmente produzidos à base de matérias-primas petroquímicas. A utilização de tensoativos à base de recursos renováveis é uma alternativa adequada devido à escassez previsível de matérias-primas petroquímicas e aumento da crescente demanda por produtos, que se baseiam em recursos naturais ou que são biologicamente degradáveis.
[0003] Ramnolipídeos consistem em um radical (monoramnosil- lipídeos) ou em dois radicais ramnose (diramnosil-lipídeos) e em um ou dois radicais de ácido 3-hidroxigraxo (vide Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, páginas 3037-51). Eles possuem propriedades tensoativas, que são necessárias para o uso como tensoativo nas mais variadas aplicações (vide Leitermann e colaboradores, 2009).
[0004] Esses lipídios são produzidos, hoje em dia, com isolados de tipo selvagem de diversas bactérias patogênicas aos humanos e aos animais, especialmente representantes dos gêneros Pseudomonas e Burkholderia (vide Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, páginas 3037-51). O fato, de que esses organismos de produção são capazes de induzir doenças, reduz significativamente a aceitação do cliente para ramnolipídeos produzidos de forma convencional. Além disso, os mais elevados requisitos de segurança devido a um maior volume de investimentos e eventualmente estágios de processamento adicionais, atuam também sobre os custos de produção.
[0005] Embora com auxílio desses organismos de produção é possível obter, em parte, altos títulos de produto, bem como rendimentos de espaço-tempo ou de carbono, isso pressupõe o uso de óleos vegetais como substrato único ou co-substrato (vide Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, páginas 3037-51). No entanto, os óleos vegetais, em comparação com outras fontes de carbono, tais como, por exemplo, glicose, sacarose ou polissacarídeos, tais como, por exemplo, amido, celulose e hemicelulose, glicerina, CO, CO2 ou CH4, são comparativamente matérias-primas caras. Além disso, com base em seu caráter tensoativo, os ramnolipídeos destacam-se pelo fato, de tender a uma forte espumação em processos de fermentação. Esse é especialmente o caso, quando são usados substratos lipofílicos. Esse problema é nitidamente reduzido ao usar substratos hidrossolúveis, tais como, por exemplo, glicose, sacarose, polissacarídeos (amido, celulose, hemicelulose) ou glicerina.
[0006] Finalmente, as propriedades dos ramnolipídeos produzidos pelos isolados de tipo selvagem têm apenas uma influência limitada. Essas se realizam até agora exclusivamente através da otimização de condução do processo (valor de pH, fornecimento de oxigênio, composição do meio, estratégias de alimentação, abastecimento de nitrogênio, temperatura, seleção de substratos e assim por diante). Contudo, uma influência muito visada de certas propriedades de produto, tais como, por exemplo, a relação das diversas espécies de ramnolipídeos (número de radicais de ramnose e ácido 3-hidroxigraxo) ou comprimento de cadeia e grau de saturação dos radicais de ácido 3- hidroxigraxo, seria desejável, para poder modular as propriedades do produto relevantes para a aplicação.
[0007] Ramnolipídeos, caso sejam usados em grande escala como tensoativos em uso doméstico, de limpeza, cosmético, processamento de alimentos, farmacêutico, de proteção de plantas e outras aplicações, devem entrar na concorrência com os tensoativos usados atualmente. Esses são produtos químicos de grande volume, que podem ser produzidos com custos muito baixos, sem riscos de saúde aparentes para o cliente e com especificações claramente definidas e moduláveis do produto. Por conseguinte, os ramnolipídeos devem poder ser produzidos com os mais baixos custos possíveis, sem riscos de saúde para o cliente e com as propriedades mais definidas possíveis.
[0008] De fato, os ramnolipídeos já foram produzidos em organismos GRAS (generally regarded as save) com base em fontes de carbono favoráveis, tais como, por exemplo, glicose ou glicerina, contudo, nesse caso, trata-se exclusivamente de monoramnosil-lipídeos (Ochsner e colaboradores Appl Environ. Microbiol. 1995, 61(9):3503- 3506).
[0009] Cha e colaboradores em Bioresour Technol. 2008, 99(7):2192-9 descrevem, por outro lado, a produção de monoramnosil- lipídeos a partir de óleo de soja em P. putida através da introdução dos genes rhlA e rhlB de Pseudomonas aeruginosa.
[00010] Por conseguinte, há uma crescente necessidade de uma produção mais barata e segura do ponto de vista da saúde de mono- e diramnosil-lipídeos com propriedades definidas bem como moduláveis.
[00011] Essa modulação pode ser efetuada, por exemplo, por uma disponibilização equilibrada de cada uma das atividades enzimáticas, a qual reduz o enriquecimento de monoramnosil-lipídeos. Mas essa modulação também pode ser efetuada, por exemplo, através do uso de enzimas com certas propriedades, por exemplo, com respeito à especificidade do substrato e, dessa maneira, por exemplo, do comprimento de cadeia dos ácidos hidroxigraxos incorporados em ramnolipídeos.
[00012] O objetivo da presente invenção baseou-se, portanto, em disponibilizar uma possibilidade, para produzir ramnolipídeos com hospedeiros de produção seguros a partir de fontes de carbono bem acessíveis.
Descrição da Invenção
[00013] Surpreendentemente verificou-se que as células descritas a seguir, bem como processos nos quais essas células são usadas, contribuem para resolver o objetivo da invenção.
[00014] O objetivo da presente invenção são, portanto, células, que são capazes de formar ramnolipídeos e comparadas com seu tipo selvagem, apresentam pelo menos um aumento da atividade de um produto gênico de homólogos dos produtos gênicos rhlA, rhlB e rhlC. Um outro objetivo da invenção é um processo para a produção de ramnolipídeos usando das células mencionadas acima como biocatalisador e fontes de carbono simples.
[00015] Uma vantagem da presente invenção é que podem ser usados organismos, que não são patogênicos e são facilmente cultivos.
[00016] Uma outra vantagem é que o uso de óleos não é necessário como substrato único ou co-substrato.
[00017] Mais uma vantagem é que com o auxílio da invenção, os ramnolipídeos podem ser produzidos com propriedades definidas, bem como moduláveis.
[00018] Mais uma vantagem da presente invenção é que podem ser produzidos diramnosil-lipídeos.
[00019] Uma outra vantagem é que os ramnolipídeos podem ser produzidos com rendimentos de espaço-tempo e de carbono maiores do que com células sem o aumento dessas atividades.
[00020] Uma célula contribui para a resolução do objetivo mencionado acima, preferivelmente uma célula isolada, que tem são capazes de formar pelo menos um ramnolipídeo da FórmulaFórmula Geral (I) ou seu sal,
Figure img0001
Fórmula (I), em que
[00021] m = 2, 1 ou 0, especialmente 1 ou 2,
[00022] n = 1 ou 0, especialmente 1,
[00023] R1 e R2 independentemente uns dos outros, representam um radical orgânico igual ou diferente com 2 a 24, preferivelmente 5 a 13 átomos de carbono, especialmente, um radical alquila opcionalmente ramificado, opcionalmente substituído, especialmente, substituído por hidroxi, opcionalmente insaturado, especialmente opcionalmente uma, duas ou três vezes insaturado, preferivelmente aquele selecionado do grupo que consiste em pentenila, heptenila, nonenila, undecenila e tridecenila e (CH2)o-CH3 com o sendo 1 a 23, preferivelmente 4 a 12, caracterizada pelo fato de que essa foi geneticamente modificada de modo tal, que, comparada com seu tipo selvagem, ela apresenta uma atividade aumentada de pelo menos uma das enzimas E1, E2 e E3, em que a enzima E1 é capaz de catalisar a reação de 3-hidroxialcanoil-ACP através de ácido 3-hidroxialcanoil-3-hidroxioicoalcanoico-ACP para ácido hidroxialcanoil-3-hidroxioicoalcanoico, a enzima E2 é uma ramnosiltransferase I e é capaz de catalisar a reação de dTDP-ramnose e 3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoato para α-L-ramnopiranosil-3- hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoato e a enzima E3 é uma ramnosiltransferase II e é capaz de catalisar a reação de dTDP-ramnose e α-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoato para α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoil-3- hidroxialcanoato, sendo que essas enzimas E1, E2 e E3 são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste em
[00024] pelo menos uma enzima E1 selecionada de
[00025] uma enzima E1a com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 2 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido, até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 2, são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 2, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E1a é entendida a capacidade, de reagir preferivelmente 3- hidroxidecanoil-ACP através de ácido 3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico-ACP para ácido hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
[00026] uma enzima E1b com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 18 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido, até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 18, são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 18, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E1b é entendida a capacidade, de reagir preferivelmente 3- hidroxitetradecanoil-ACP através de ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico-ACP para ácido hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[00027] uma enzima E1c com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 78 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido, até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 78, são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 78, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E1c é entendida a capacidade, de reagir preferivelmente 3- hidroxitetradecanoil-ACP através de ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico-ACP para ácido hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[00028] uma enzima E1d com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 80 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido, até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 80, são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 80, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E1d é entendida a capacidade, de reagir preferivelmente 3- hidroxitetradecanoil-ACP através de ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico-ACP para ácido hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico e
[00029] uma enzima E1e com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 82 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido, até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 82, são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 82, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E1e é entendida a capacidade, de reagir preferivelmente 3- hidroxitetradecanoil-ACP através de ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico-ACP para ácido hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[00030] pelo menos uma enzima E2 com sequência de polipeptídeo selecionada de
[00031] uma enzima E2a com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 4 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 4, são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 4, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E2a é entendida a capacidade, de reagir preferivelmente dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
[00032] uma enzima E2b com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 20 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 20, são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 20, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E2b é entendida a capacidade, de reagir preferivelmente dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[00033] uma enzima E2c com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 84 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 84, são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 84, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E2c é entendida a capacidade, de reagir preferivelmente dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
[00034] uma enzima E2d com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 86 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 86, são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 86, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E2d é entendida a capacidade, de reagir preferivelmente dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico e
[00035] uma enzima E2e com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 88 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 88, são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 88, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E2e é entendida a capacidade, de reagir preferivelmente dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico e
[00036] pelo menos uma enzima E3 selecionada de
[00037] uma enzima E3a com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 6 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 6, são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 6, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E3a é entendida a capacidade, de reagir preferivelmente dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico,
[00038] uma enzima E3b com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 22 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 22, são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 22, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E3b é entendida a capacidade, de reagir preferivelmente dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-(1-2)-α-L- ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[00039] uma enzima E3c com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 90 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 90, são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 90, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E3c é entendida a capacidade, de reagir preferivelmente dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-(1-2)-α-L- ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico e
[00040] uma enzima E3d com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 92 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 92, são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 92, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E3d é entendida a capacidade, de reagir preferivelmente dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-(1-2)-α-L- ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico.
[00041] Para uma visão geral compare a Figura 1.
[00042] Por "tipo selvagem" de uma célula é designada, aqui, uma célula, cujo genoma está presente em um estado, tal como é naturalmente entendido através da evolução. O termo é usado tanto para toda a célula, quanto também para genes individuais. Portanto, pelo termo "tipo selvagem", não recaem especialmente aquelas células ou aqueles genes, cujas sequências gênicas foram modificadas pelo menos parcialmente pelo homem por meio de processos recombinantes. Pelo termo "ramnolipídeo" no contexto com a presente invenção, é entendido um composto da FórmulaFórmula Geral (I) ou seu sal.
[00043] É evidente, que as atividades concretamente indicadas acima para as enzimas E1a até E3b representam apenas uma seleção modelar especial de um espectro de atividades mais amplo das enzimas mencionadas acima; a respectiva atividade mencionada é aquela, para a qual está presente um processo de medição confiável na enzima dada. Assim, é óbvio, que uma enzima, que vai reagir um substrato com um radical Cio-alquila saturado, não ramificado igualmente - mesmo que também opcionalmente com redução da atividade - aqueles substratos. que apresentam um radical C6- ou C16-alquila, que opcionalmente também pode ser ramificado ou insaturado.
[00044] O termo "atividade aumentada de uma enzima" deve ser entendida preferivelmente como atividade intracelular aumentada.
[00045] As seguintes concretizações para o aumento da atividade enzimática em células se aplicam tanto para o aumento da atividade da enzima E1 até C3, quanto também para todas as enzimas mencionadas a seguir, cuja atividade pode ser opcionalmente aumentada.
[00046] Fundamentalmente, um aumento da atividade enzimática pode ser obtido pelo fato, de aumentar o número de cópias da sequência gênica ou das sequências gênicas, que codificam a enzima, usar um promotor forte ou um melhor ponto de ligação de ribossomos, enfraquecer uma regulação negativa da expressão gênica, por exemplo, através de reguladores de transcrição ou reforçar uma regulação positiva da expressão gênica, por exemplo, através de reguladores de transcrição, modificar a utilização do códon do gene, aumentar de diferente modo e maneira o tempo de semivalor do mRNA ou da enzima, modificar a regulação da expressão do gene ou utilizar um gene ou alelo, que codifica uma enzima correspondente com uma atividade aumentada e opcionalmente combinar essas medidas. Células geneticamente modificadas de acordo com a invenção são produzidas, por exemplo, através de transformação, transdução, conjugação ou por uma combinação dos mesmos métodos com um vetor, que contém o gene desejado, um alelo desse gene ou partes do mesmo e opcionalmente um promotor que possibilita a expressão do gene. A expressão heteróloga é obtida, especialmente, através da integração do gene ou dos alelos no cromossoma das células ou em um vetor que replica de forma extra cromossômica. Uma vista geral sobre as possibilidades para aumentar a atividade da enzima em células no exemplo da piruvato-carboxilase é fornecida pela DE-A 100 31 999 que, por esse meio, é introduzida como referência e cujo teor publicado com respeito às possibilidades para aumentar a atividade da enzima em células forma uma parte da publicação da presente invenção.
[00047] A expressão das enzimas ou genes mencionados acima e todos abaixo pode ser detectada com auxílio de separação com gel de proteína mono- e bidimensional e subsequente identificação ótica da concentração de proteína com correspondente software de avaliação no gel. Quando o aumento de uma atividade enzimática se baseia exclusivamente em um aumento da expressão do correspondente gene, então a quantificação do aumento da atividade enzimática pode ser determinada de maneira simples por uma comparação das separações com gel de proteína mono- ou bidimensionais entre o tipo selvagem e a célula geneticamente modificada. Um método usual para a preparação dos géis de proteína em bactérias corineformes e para a identificação das proteínas é o procedimento descrito por Hermann e colaboradores (Electrophoresis, 22: 1712.23(2001)). A concentração de proteína pode ser analisada do mesmo modo através da hibridização de Western-Blot com um anticorpo específico para a proteína a ser detectada (Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) e subsequente avaliação ótica com software correspondente para a determinação da concentração (Lohaus e Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999) Angewandte Chemie 111: 2630-2647). A atividade de proteínas que se ligam ao DNA pode ser medida por meio do ensaio DNA-Band-Shift (designado também como retardação de gel) (Wilson e colaboradores (2001) Journal of Bacteriology, 183: 21512155). O efeito de proteínas que se ligam ao DNA sobre a expressão de outros genes pode ser detectado por diversos métodos bem descritos do ensaio de gene repórter (Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989). As atividades enzimáticas intracelulares podem ser determinadas por vários métodos descritos (Donahue e colaboradores (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 22772284; Freedberg e colaboradores (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823). Desde que nas seguintes concretizações não sejam indicados quaisquer métodos concretos para a determinação da atividade de uma certa enzima, a determinação do aumento da atividade enzimática e também a determinação da redução de uma atividade enzimática, é preferivelmente efetuada por meio dos métodos descritos em Hermann e colaboradores, Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus e colaboradores, Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) e Wilson e colaboradores, Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001). Se o aumento da atividade enzimática é realizado através da mutação do gene endógeno, então tais mutações podem ser produzidas ou não dirigidas por métodos clássicos, tais como através de irradiação UV ou através de produtos químicos que causam mutação ou direcionado por meio de métodos de engenharia genética tais como deleção(ões), inserção(ões) e/ou troca(s) de nucleotídeos. Através dessas mutações obtêm-se células modificadas. Mutantes de enzimas particularmente preferidos são, especialmente, também aquelas enzimas, que não são mais ou pelo menos em comparação com a enzima do tipo selvagem, pouco inibíveis ao feedback, ao produto ou substrato.
[00048] Se o aumento da atividade enzimática é realizada através do aumento da síntese de uma enzima, então, por exemplo, o número de cópias dos correspondentes genes é aumentado ou a região do promotor e de regulação ou o ponto de ligação do ribossomo, que se localiza a montante do gene estrutural é mutado. Da mesma maneira agem os cassetes de expressão, que são embutidos a montante do gene estrutural. Através de promotores induzíveis é adicionalmente possível aumentar a expressão a cada momento desejado. Além disso, ao gene de enzima também podem ser atribuídos, contudo, os chamados "intensificadores" como sequências reguladoras, que causam igualmente uma expressão aumentada do gene através de uma interação melhorada entre a RNA-polimerase e o DNA. Através de medidas para prolongar a duração de vida dos mRNA, a expressão é igualmente melhorada. Além disso, evitando a degradação da proteína enzimática, a atividade enzimática é igualmente reforçada. Os genes ou estruturas gênicas estão presentes, nesse caso, em plasmídeos com diferente número de cópias ou estão integradas e amplificadas no cromossoma. Alternativamente, além disso, uma superexpressão dos respectivos genes pode ser obtida modificando a composição do meio e a condução da cultura. Instruções para esse fim, o especialista pode encontrar, entre outros, em Martin e colaboradores, (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), em Guerrero e colaboradores (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), em Eikmanns e colaboradores (Gene 102, 93-98 (1991)), na EP-A-0 472 869, na US 4,601,893, em Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 8487 (1991), em Reinscheid e colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), em LaBarre e colaboradores (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in WO-A-96/15246, em Malumbres e colaboradores (Gene 134, 15-24 (1993)), na JP-A-10- 229891, em Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) e em compêndios conhecidos da genética e biologia molecular. As medidas mencionadas acima levam, do mesmo modo como as mutações, a células geneticamente modificadas.
[00049] Para aumentar a expressão dos respectivos genes utilizam- se, por exemplo, plasmídeos epissomais. Como plasmídeos ou vetores incluem-se, em princípio, todas as formas de concretização disponíveis ao especialista para essa finalidade. Tais plasmídeos e vetores podem ser mostrados, por exemplo, nas brochuras das empresas Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech ou Gibco BRL. Outros plasmídeos e vetores preferidos podem ser encontrados em: Glover, D. M. (1985) DNA cloning: a pratical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. e Denhardt, D. T (eds) (1988) Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990) Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. e Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York.
[00050] O vetor do plasmídeo, que contém o gene a ser amplificado, é convertido, em seguida, através de conjugação ou transformação, na cepa desejada. O método da conjugação é descrito, por exemplo, em Schafer e colaboradores, Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994). Métodos para a transformação são descritos, por exemplo, em Thierbach e colaboradores, Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) e Tauch e colaboradores, FEMS Microbiology Let-ters 123: 343-347 (1994). Depois de recombinação homóloga por meio de um episódio "cross-over", a cepa resultante contém pelo menos duas cópias do respectivo gene. Pela formulação usada nas concretizações acima e abaixo, "uma atividade aumentada de uma enzima Ex em comparação com seu tipo selvagem" é entendida preferivelmente sempre uma atividade aumentada da respectiva enzima Ex em um fator de pelo menos 2, de modo particularmente preferido de pelo menos 10, além disso, preferivelmente de pelo menos 100, além disso, ainda mais preferivelmente de pelo menos 1.000 e do modo mais preferido, de pelo menos 10.000. Além disso, a célula de acordo com a invenção, que apresenta "uma atividade aumentada de uma Ex em comparação com seu tipo selvagem", compreende especialmente, também, uma célula, cujo tipo selvagem não apresenta ou pelo menos não apresenta qualquer atividade detectável dessa enzima Ex e que somente depois do aumento da atividade enzimática, por exemplo, através de superexpressão, mostra uma atividade detectável dessa enzima Ex. Nesse contexto, o termo "superexpressão" ou a formulação usada nas concretizações abaixo "aumento da expressão" compreende também o caso, de que uma célula de partida, por exemplo, uma célula de tipo selvagem, não apresenta ou pelo menos nenhuma expressão detectável e uma síntese detectável da enzima Ex é induzida em primeiro lugar por processos recombinantes.
[00051] Modificações de resíduos de aminoácidos de uma sequência de polipeptídeo dada, que não levam a quaisquer modificações substanciais das propriedades e função do polipeptídeo dado, são conhecidas pelo especialista. Assim, por exemplo, os chamados aminoácidos conservados podem ser trocados uns pelos outros; exemplos de tais substituições de aminoácidos adequados são: Ala por Ser; Arg por Lys; Asn por Gln ou His; Asp por Glu; Cys por Ser; Gln por Asn; Glu por Asp; Gly por Pro; His por Asn ou Gln; Ile por Leu ou Val; Leu por Met ou Val; Lys por Arg ou Gln ou Glu; Met por Leu ou Ile; Phe por Met ou Leu ou Tyr; Ser por Thr; Thr por Ser; Trp por Tyr; Tyr por Trp ou Phe; Val por Ile ou Leu. Do mesmo modo, sabe-se que modificações, particularmente no terminal N ou C de um polipeptídeo na forma de, por exemplo, inserções ou deleções de aminoácidos, muitas vezes não exercem qualquer influência substancial sobre a função do polipeptídeo.
[00052] A atividade de uma enzima pode ser determinada em que células, que contêm essa atividade, são desdobradas de modo e maneira conhecidos pelo especialista, por exemplo, com auxílio de um moinho de bolas, uma prensa French ou um desintegrador de ultrassom e, em seguida, as células intactas, pedaços de células e agentes auxiliares de desdobramento, tais como esferas de vidro, são separadas por meio de centrifugação durante 10 minutos a 13.000 rpm e 4oC. Com o extrato bruto livre de células resultante, podem ser efetuados, então, os ensaios enzimáticos com subsequente detecção LC-ESI-MS dos produtos. Alternativamente, a enzima pode ser enriquecida de modo e maneira conhecidos pelo especialista por meio de métodos cromatográficos (tais como cromatografia de afinidade de níquel-ácido nitrilotriacético, cromatografia de afinidade de estreptavidina, cromatografia de filtração de gel ou cromatografia de troca de íons) ou também pode ser purificada até a homogeneidade.
[00053] A atividade da enzima E1 é determinada, então, com as amostras obtidas tal como descrito acima, da seguinte maneira: um ensaio padrão contém 100 μM de E. coli ACP, 1 mM de β- mercaptoetanol, 200 μM de malonil-coenzima A, 40 μM de octanoil- coenzima A (para E1a) ou dodecanoil-coenzima A (para E1b), 100 μM de NADPH, 2 μg de E. coli FabD, 2 μg de Mycobacterium tuberculosis FabH, 1 μg de E. coli FabG, 0,1 M de tampão de fosfato de sódio, pH 7,0 e 5 μg de enzima E1 em um volume final de 120 μL. ACP, β- mercaptoetanol e tampão de fosfato de sódio são pré-incubados a 37oC durante 30 minutos, para reduzir completamente o ACP. A reação é iniciada por meio da adição de enzima E1. As reações são interrompidas com 2 mL de água, a qual foi acidificada para pH 2,0 com HCl e, em seguida, é extraída duas vezes com 2 mL de clorofórmio/metanol (2:1 (v:v)). É efetuada uma separação de fases através de centrifugação (16.100 g, 5 min, temperatura ambiente). A fase orgânica inferior é removida, completamente evaporada na centrífuga a vácuo e o sedimento é recuperado em 50 μL de metanol. Os componentes não dissolvidos são sedimentados através de centrifugação (16.000 g, 5 minutos, temperatura ambiente) e a amostra é analisada por meio de LC-ESI-MS. A identificação dos produtos é efetuada através da análise dos respectivos vestígios de massa e dos espectros MS2.
[00054] A atividade da enzima E2 é determinada, então, com as amostras obtidas tal como descrito acima, da seguinte maneira: um ensaio padrão pode consistir em 185 μL 10 mM de tris-HCL (pH 7,5), 10 μL 125 mM de dTDP-ramnose e 50 μL de extrato bruto de proteína (cerca de 1 mg de proteína total) ou de proteína purificada em solução (5 μg de proteína purificada). A reação é iniciada por meio da adição de 10 μL 10 mM de solução etanólica de ácido 3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico (para E2a) ou ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico (para E2b) e incubada durante 1 hora a 30oC sob agitação (600 rpm). Em seguida, a reação é adicionada a 1 mL de acetona. Os componentes não dissolvidos são sedimentados através de centrifugação (16.100 g, 5 minutos, temperatura ambiente) e a amostra é analisada por meio de LS-ESI-MS. A identificação dos produtos é efetuada através da análise dos respectivos vestígios de massa e dos espectros MS2.
[00055] A atividade da enzima E3 é determinada, então, com as amostras obtidas tal como descrito acima, da seguinte maneira: um ensaio padrão pode consistir em 185 μL 10 mM de tris-HCL (pH 7,5), 10 μL 125 mM de dTDP-ramnose e 50 μL de extrato bruto de proteína (cerca de 1 mg de proteína total) ou de proteína purificada em solução (5 μg de proteína purificada). A reação é iniciada por meio da adição de 10 μL 10 mM de solução etanólica de ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico (para E3a) ou ácido α-L- ramnopiranosil-33-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico (para E3b) e incubada durante 1 hora a 30oC sob agitação (600 rpm). Em seguida, a reação é adicionada a 1 mL de acetona. Os componentes não dissolvidos são sedimentados através de centrifugação (16.100 g, 5 minutos, temperatura ambiente) e a amostra é analisada por meio de LS-ESI-MS. A identificação dos produtos é efetuada através da análise dos respectivos vestígios de massa e dos espectros MS2.
[00056] De acordo com a invenção, são preferidas células, que apresentam atividades aumentadas das seguintes combinações de enzimas:
[00057] E1, E2, E3, E1E2, E1E3, E2E3 e E1E2E3,
[00058] das quais a combinação
[00059] E2, E2E3 e E1E2E3, especialmente, E1E2E3
[00060] é particularmente preferida.
[00061] Em uma forma de concretização preferida da célula de acordo com a invenção, que apresenta uma atividade aumentada da combinação de enzimas E1E2E3, n é preferivelmente = 1.
[00062] As células de acordo com a invenção podem ser procariontes ou eucariontes. Nesse caso, pode se tratar de células de mamíferos (tal como células do ser humano), de células vegetais ou de micro-organismos, tais como leveduras, fungos ou bactérias, sendo que os micro-organismos são particularmente preferidos e as bactérias e leveduras são as mais preferidas.
[00063] Como bactérias, leveduras ou fungos são adequadas, especialmente, aquelas bactérias, leveduras ou fungos, que são depositadas na Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Alemanha, como cepas de bactérias, leveduras ou fungos. Bactérias adequadas de acordo com a invenção pertencem aos gêneros, que são listadas sob
[00064] http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm,
[00065] leveduras adequadas de acordo com a invenção pertencem àqueles grupos, que são listados sob
[00066] http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm
[00067] e fungos adequados de acordo com a invenção são aqueles, que são listados sob
[00068] http://www.dsmz.de/species/fungi.htm.
[00069] Células preferidas de acordo com a invenção são aquelas dos gêneros Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium und Cupriavidus, sendo que Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Burkholderia andropogonis, B. brasilensis, B. caledonica, B. caribensis, B. caryophylli, B. fungorum, B. gladioli, B. glathei, B. glumae, B. graminis, B. hospita, B. kururiensis, B. phenazinium, B. phymatum, B. phytofirmans, B. plantarii, B. sacchari, B. singaporensis, B. sordidicola, B. terricola, B. tropica, B. tuberum, B. ubonensis, B. unamae, B. xenovorans, B. anthina, B. pyrrocinia, B. thailandensis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Escherichia coli, Hansenula polymorpha, Kluveromyces lactis, Methylobacterium extorquens, Paracoccus versutus, Pseudomonas argentinensis, P. borbori, P. citronellolis, P. flavescens, P. mendocina, P. nitroreducens, P. oleovorans, P. pseudoalcaligenes, P. resinovorans, P. straminea, P. aurantiaca, P. aureofaciens, P. chlororaphis, P. fragi, P. lundensis, P. taetrolens, P. antarctica, P. azotoformans, 'P. blatchfordae', P. brassicacearum, P. brenneri, P. cedrina, P. corrugata, P. fluorescens, P. gessardii, P. libanensis, P. mandelii, P. marginalis, P. mediterranea, P. meridiana, P. migulae, P. mucidolens, P. orientalis, P. panacis, P. proteolytica, P. rhodesiae, P. synxantha, P. thivervalensis, P. tolaasii, P. veronii, P. denitrificans, P. pertucinogena, P. cremoricolorata, P. fulva, P. monteilii, P. mosselii, P. parafulva, P. putida, P. balearica, P. stutzeri, P. amygdali, P. avellanae, P. caricapapayae, P. cichorii, P. coronafaciens, P. ficuserectae, 'P. helianthi', P. meliae, P. savastanoi, P. syringae, P. tomato, P. viridiflava, P. abietaniphila, P. acidophila, P. ágarici, P. alcaliphila, P. alkanolytica, P. amyloderamosa, P. asplenii, P. azotifigens, P. cannabina, P. coenobios, P. congelans, P. costantinii, P. cruciviae, P. delhiensis, P. excibis, P. extremorientalis, P. frederiksbergensis, P. fuscovaginae, P. gelidicola, P. grimontii, P. indica, P. jessenii, P. jinjuensis, P. kilonensis, P. knackmussii, P. koreensis, P. lini, P. lutea, P. moraviensis, P. otitidis, P. pachastrellae, P. palleroniana, P. papaveris, P. peli, P. perolens, P. poae, P. pohangensis, P. psychrophila, P. psychrotolerans, P. rathonis, P. reptilivora, P. resiniphila, P. rhizosphaerae, P. rubescens, P. salomonii, P. segitis, P. septica, P. simiae, P. suis, P. thermotolerans, P. aeruginosa, P. tremae, P. trivialis, P. turbinellae, P. tuticorinensis, P. umsongensis, P. vancouverensis, P. vranovensis, P. xanthomarina, Ralstonia eutropha, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica und Zymomonas mobilis,
[00070] especialmente Pseudomonas putida, Escherichia coli e Burkholderia thailandensis são particularmente preferidas.
[00071] Células preferidas de acordo com a invenção como tipo selvagem, não são capazes de formar quaisquer ou quais quantidades detectáveis de ramnolipídeos e, além disso, como tipo selvagem, não apresentam preferivelmente qualquer ou qualquer atividade detectável das enzimas E1, E2 e E3.
[00072] De acordo com a invenção é vantajoso, se a célula de acordo com a invenção é uma célula que, como tipo selvagem, são capazes de formar poli-hidroxialcanoatos com comprimentos de cadeia do mono- alcanoato de C6 a C16. Tais células são, por exemplo, Burkholderia sp., Burkholderia thailandensis, Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas citronellolis, Pseudomonas resinovorans, Comamonas testosteroni, Aeromonas hydrophila, Cupriavidus necator, Alcaligenes latus e Ralstonia eutropha. Neste contexto, as células preferidas de acordo com a invenção são geneticamente modificadas de modo tal, que elas são capazes de formar menos poli-hidroxialcanoatos comparadas com seu tipo selvagem.
[00073] Tais células são descritas, por exemplo, em De Eugenio e colaboradores, Environ Microbiol. 2010. 12(1):207-21 e Rehm e colaboradores, Appl Environ Microbiol. 2001. 67(7):3102-9.
[00074] Uma tal célula, comparada com seu tipo selvagem, que é capaz de formar menos poli-hidroxialcanoatos, é especialmente caracterizada pelo fato de que, comparada com seu tipo selvagem, apresenta uma atividade reduzida de pelo menos uma enzima E9 ou E10,
[00075] em que E9 representa uma poli-hidroxialcanoato sintase, EC:2.3.1.-, especialmente com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 32 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido, até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à respectiva sequência de referência SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 32, são modificados através de deleção, inserção, substituição ou uma combinação das mesmas e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido 80%, especialmente mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a respectiva sequência de referência SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 32, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E9 é entendida a capacidade, de reagir 3-hidroxialcanoil- coenzima A para ácido poli-3-hidroxioicoalcanoico, especialmente 3- hidroxitetradecanoil-coenzima A para ácido poli-3-hidroxitetradecanoico e
[00076] E10 representa uma 3-hdiroxialcanoil-ACP:coenzima A transferase, especialmente com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 36 ou com uma sequência de polipeptídeo em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido, até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à respectiva sequência de referência SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 36, são modificados através de deleção, inserção, substituição ou uma combinação das mesmas e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido 80%, especialmente mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a respectiva sequência de referência SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 36, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E10 é entendida a capacidade, de reagir 3-hidroxialcanoil- ACP para 3-hidroxialcanoil-coenzima A, especialmente 3- hidroxialcanoil-ACP para 3-hidroxitetradecanoil-coenzima A.
[00077] Para uma visão geral compare a Figura 1.
[00078] A atividade da enzima E9 é determinada, então, com as amostras obtidas descritas tal como acima para as enzimas E1 até E3, em que inicialmente 560 μL de 100 mM de tris/HCl, pH 7,5, 20 μL de 35 mM de DTNB em DMSO e 20 μL de 41 mM de 3-hidroxidecanoil- coenzima A são misturados. Em seguida, 5 μg de enzima E9 em 100 μL de tris/HCl, pH 7,5 são acrescentados e em seguida, o aumento da extinção é continuamente recuperado durante 1 minuto no espectrofotômetro em 412 nm (provocado pela adição de 5,5'-ditiobis(2- nitrobenzoato) (DTNB) em grupos SH livres) durante o tempo (ΔE/min).
[00079] A atividade da enzima E10 é determinada, então, com as amostras obtidas descritas tal como acima para as enzimas E1 até E3. O ensaio padrão contém 3 mM de MgCh, 40 μM de hidroxidecanoil- coenzima A e 20 μM de E. coli ACP em 50 mM de tris-HCl, pH 7,5, em um volume total de 2000 μL. A reação é iniciada por meio da adição de 5 μg de enzima E10 purificada em 50 μL de tris/HCl, pH 7,5 e incubada a 30oC durante 1 hora. A reação é interrompida por meio da adição de 50% de ácido tricloracético e 10 mg/mL de BSA (30 μL). A coenzima A liberada é determinada espectrometricamente, em que o aumento da extinção em 412 nm, provocada pela adição de 5,5'-ditiobis(2- nitrobenzoato) (DTNB) em grupos SH livres) é recuperada durante o tempo (ΔE/min).
[00080] Na formulação usada, entende-se por "atividade reduzida de uma enzima Ex", consequentemente, preferivelmente uma atividade reduzida em pelo menos 0,1, além disso, preferivelmente de pelo menos 0,01, além disso, ainda mais preferivelmente de pelo menos 0,001 e do mais preferido, de pelo menos 0,0001. A formulação "atividade reduzida" não contém também qualquer atividade detectável ("atividade de zero"). A redução da atividade de uma determinada enzima pode ser efetuada, por exemplo, através de mutação específica ou por outras medidas conhecidas pelo especialista para reduzir a atividade de uma determinada enzima. Processos para reduzir as atividades enzimáticas em micro-organismos são conhecidos pelo especialista.
[00081] Aqui são oferecidas especialmente tecnologias de biologia molecular. Instrução para a modificação e redução de expressões de proteína e reduções da atividade enzimática associadas especialmente para Pseudomonas e Burkholderia, especialmente para interromper genes especiais, o especialista encontra, por exemplo, em Dubeau e colaboradores, 2009. BMC Microbiology 9:263; Singh & Rohm. Microbiology. 2008. 154:797-809 ou Lee e colaboradores FEMS Microbiol Lett. 2009. 297(1):38-48.
[00082] Células preferidas de acordo com a invenção são caracterizadas pelo fato, de que a redução da atividade enzimática é obtida através da modificação de um gene compreendendo uma das sequências de ácido nucleico mencionadas, em que a modificação é selecionada do grupo compreendendo, preferivelmente consistindo em inserção de DNA exógeno no gene, deleção de pelo menos partes do gene, mutações pontuais na sequência gênica, interferência de RNA (siRNA), RNA antissenso ou modificação (inserção, deleção ou mutações pontuais) de sequências reguladoras, tais como promotores e terminadores ou de pontos de ligação do ribossomo, que flanqueiam o gene.
[00083] Por DNA exógeno neste contexto, deve ser entendida aquela sequência de DNA, que é "exógena" ao gene (e não ao organismo), isto é, também sequências de DNA endógenas podem agir neste contexto como "DNA exógeno".
[00084] Neste contexto é especialmente preferível, que o gene seja interrompido pela inserção de um gene marcador de seleção, portanto, o DNA exógeno é um gene marcador de seleção, em que preferivelmente a inserção foi efetuada através de recombinação homóloga no sítio do gene.
[00085] Em uma forma de concretização preferida da célula de acordo com a invenção, no caso da célula trata-se de células de Pseudomonas putida, que apresentam uma síntese de poli- hidroxialcanoato reduzida comparada com seu tipo selvagem. Tais células são descritas, por exemplo, em Ren e colaboradores, Journal Applied Microbiology and Biotechnology 1998 Jun, 49(6):743-50 como GPp121, GPp122, GPp123 e GPp124, in Huisman e colaboradores, J Biol Chem. 1991 Feb 5;266(4):2191-8 como GPp104, bem como em De Eugenio e colaboradores, Environ Microbiol. 2010. 12(1):207-21 como KT42C1 e em Ouyang e colaboradores Macromol Biosci. 2007. 7(2):227-33 como KTOY01 e KTOY02 e representam células preferidas de acordo com a invenção.
[00086] No caso da célula de acordo com a invenção ser capaz de formar um ramnolipídeo com m=1, é preferível que o radical determinado por R1 e R2
Figure img0002
[00087] seja derivado de ácido hidroxioctanoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3- hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3- hidroxidecenoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxioctanoil-3- hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidodecenoico, ácido 3- hidroxidodecenoil-3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3- hidroxidecenoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecenoil-3- hidroxidecenoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3- hidroxidodecenoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxitetradecenoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecenoico, ácido 3- hidroxidodecenoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3- hidroxitetradecanoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxitetradecenoico, ácido 3- hidroxitetradecenoil-3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3- hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidodecenoil-3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxidodecenoico, ácido 3- hidroxidodecanoil-3-hidroxitetradecanoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil- 3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico, ácido 3-hidroxi-hexadecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[00088] ácido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxi-hexadecanoico ou ácido 3-hidroxi-hexadecanoil-3-hidroxi-hexadecanoico.
[00089] Ao especialista é evidente, que uma célula de acordo com a invenção também é capaz de formar misturas de diversos ramnolipídeos da FórmulaFórmula Geral (I). Neste contexto pse refere, que as células de acordo com a invenção sejam capazes de formar misturas de ramnolipídeos da FórmulaFórmula Geral (I), que são caracterizadas pelo fato de que em mais de 80% em peso, preferivelmente em mais de 90% em peso, de modo particularmente preferido, mais de 95% em peso, dos ramnolipídeos formados, n seja 1 e o radical determinado por R1 e R2 com menos de 10% em peso, preferivelmente menos de 5% em peso, de modo particularmente preferido menos de 2% em peso, dos ramnolipídeos formados seja derivado de ácido 3-hidroxidecanoil-3- hidroxioctanoico ou ácido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidecanoico, sendo que os % em peso, indicados se referem à soma de todos os ramnolipídeos formados da FórmulaFórmula Geral (I).
[00090] É vantajoso, se a célula de acordo com a invenção foi adicionalmente geneticamente modificada em relação a E1 até E3 de modo tal, que, comparada com seu tipo selvagem, essa apresenta uma atividade aumentada, tal como especificado a seguir, de pelo menos uma das enzimas selecionadas do grupo consistindo em
[00091] pelo menos uma enzima E4, uma dTTP:α-glicose-1-fosfato timidililtransferase, EC 2.7.7.24, especialmente uma com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 10 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 10 são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 10, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E4 é entendida a capacidade, de reagir α- D-glicose-1-fosfato e dTTP para dTDP-glicose,
[00092] pelo menos uma enzima E5, uma dTTP-glicose-4,6- hidrolase, EC 4.2.1.46, especialmente uma com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 12 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 12 são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 12, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E5 é entendida a capacidade, de reagir dTDP-glicose para dTDP-4-de-hidro-6-desoxi-D-glicose,
[00093] pelo menos uma enzima E6, uma dTDP-4-de-hidroramnose- 3,5-epimerase, EC 5.1.3.13, especialmente uma com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 14 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 14 são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 14, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E6 é entendida a capacidade, de reagir dTDP-4-de-hidro-6-deoxi-D-glicose para dTDP-4-de-hidro-6--desoxi-L- manose e
[00094] pelo menos uma enzima E7, uma dTDP-4-de-hidroramnose- redutase, EC 1.1.1.133, especialmente uma com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 16 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 20%, de modo particularmente preferido até 15%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à sequência de referência SEQ ID NO: 16 são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação dos mesmos e que apresenta ainda pelo menos 10%, preferivelmente 50%, de modo particularmente preferido, 80%, especialmente, mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a sequência de referência SEQ ID NO: 16, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E7 é entendida a capacidade, de reagir dTDP-4-de-hidro-6-desoxi-L-manose para dTDP-6-desoxi-L-manose.
[00095] A atividade da enzima E4 é determinada com as amostras obtidas tal como descrito acima para as enzimas E1 até E3, em que α- D-glicose-1-fosfato (1,3 mM) é incubado com dTTP (5 mM) e 5 mg de enzima E4 purificada em 50 μL de tampão de fosfato de sódio, pH 8,5 e depois da incubação de 5, 10 e 20 minutos a 30oC, a reação é interrompida por meio da adição de 20 μL de clorofórmio. A mistura é, então, turbilhonada e centrifugada durante 5 minutos com 16.000 g e temperatura ambiente. A fase aquosa é transferida para um novo recipiente de reação e a fase orgânica é novamente extraída com 80 μL de água. As duas fases aquosas são combinadas e analisadas por meio de HPLC. Nesse caso, é usada uma coluna Phenosphere-ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) ou uma coluna Spheresorb- ODS2 (250 x 4,6 mm; Waters, Milford, EUA). A eluição das substâncias a analisar é efetuada com um caudal de 1 mL min-1 com 0,5 M de KH2PO4 (eluente A) durante 15 minutos, seguida de um gradiente linear de até 80% de eluente A e 20% de metanol durante um período de 14 minutos com um caudal de 0,7 mL min-1. Substâncias a analisar, as quais eluem das colunas ODS2, são injetadas, então, em uma coluna trocadora de íons Phenosphere-SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) e as substâncias a analisar são eluídas com um caudal de 1 mL min-1 e com um gradiente linear de formiato de amônio (2 a 600 mM durante 25 minutos). A quantificação da dTDP-glicose é efetuada, então, através de sua absorção UV com um detector de arranjo de diodos (DAD). A absorção máxima de timidina encontra-se em 267 nm. A calibração é efetuada por meio de açúcar de nucleotídeo autêntico (Sigma-Aldrich, Munique, EUA).
[00096] A atividade da enzima E5 é determinada, então, com as amostras obtidas tal como descrito acima para as enzimas E1 até E3, em que dTDP-α-D-glicose (1,3 mM) é incubada com 5 μg de enzima E5 purificada em 50 μL de tampão de fosfato de sódio, pH 8,5 e depois da incubação de 5, 10 e 20 minutos a 30oC a reação é interrompida por meio da adição de 20 μL de clorofórmio. A mistura é, então, turbilhonada e centrifugada durante 5 minutos com 16.000 g e temperatura ambiente. A fase aquosa é transferida para um novo recipiente de reação e a fase orgânica é novamente extraída com 80 μL de água. As duas fases aquosas são combinadas e analisadas por meio de HPLC. Nesse caso, é usada uma coluna Phenosphere-ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) ou uma coluna Spheresorb-ODS2 (250 x 4,6 mm; Waters, Milford, EUA). A eluição das substâncias a analisar é efetuada com um caudal de 1 mL min-1 com 0,5 M de KH2PO4 (eluente A) durante 15 minutos, seguida de um gradiente linear de até 80% de eluente A e 20% de metanol durante um período de 14 minutos com um caudal de 0,7 mL min-1. As substâncias a analisar, as quais eluem das colunas ODS2, são injetadas, então em uma coluna trocadora de íons Phenosphere-SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) e as substâncias a analisar são eluídas com um caudal de 1 mL min-1 e com um gradiente linear de formiato de amônio (2 a 600 mM durante 25 minutos). A quantificação da dTDP-glicose e dTDP-4-de-hidro-6-desoxi- D-glicose é efetuada, então, através de sua absorção UV com um detector de arranjo de diodos (DAD). A absorção máxima de timidina encontra-se em 267 nm. A calibração é efetuada por meio de açúcar de nucleotídeo autêntico (Sigma-Aldrich, Munique, EUA).
[00097] A atividade da enzima E6 é determinada, então, com as amostras obtidas tal como descrito acima para as enzimas E1 até E3, em que inicialmente dTDP-α-D-glicose (1,3 mM) é incubada com 5 μg de enzima E5 purificada em 50 μL de tampão de fosfato de sódio, pH 8,5, durante 10 minutos a 30oC. Em seguida, acrescenta-se 0,5 μg de enzima E6 purificada e depois da incubação de 5, 10 e 20 minutos a 30oC, a reação é interrompida por meio da adição de 20 μL de clorofórmio. A mistura é, então, turbilhonada e centrifugada durante 5 minutos com 16.000 g e temperatura ambiente. A fase aquosa é transferida para um novo recipiente de reação e a fase orgânica é novamente extraída com 80 μL de água. As duas fases aquosas são combinadas e analisadas por meio de HPLC. Nesse caso, é usada uma coluna Phenosphere-ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) ou uma coluna Spheresorb-ODS2 (250 x 4,6 mm; Waters, Milford, EUA). A eluição das substâncias a analisar é efetuada com um caudal de 1 mL min-1 com 0,5 M de KH2PO4 (eluente A) durante 15 minutos, seguida de um gradiente linear de até 80% de eluente A e 20% de metanol durante um período de 14 minutos com um caudal de 0,7 mL min-1. As substâncias a analisar, as quais eluem das colunas ODS2, são injetadas, então em uma coluna trocadora de íons Phenosphere-SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) e as substâncias a analisar são eluídas com um caudal de 1 mL min-1 e com um gradiente linear de formiato de amônio (2 a 600 mM durante 25 minutos). A quantificação da dTDP-glicose, dTDP-4-de-hidro-6-desoxi-D-glicose e dTDP-6-desoxi-L-manose é efetuada, então, através de sua absorção UV com um detector de arranjo de diodos (DAD). A absorção máxima de timidina encontra-se em 267 nm. A calibração é efetuada por meio de açúcar de nucleotídeo autêntico (Sigma-Aldrich, Munique, EUA).
[00098] A atividade da enzima E7 é determinada, então, com as amostras obtidas tal como descrito para as enzimas E1 até E3, em que inicialmente dTDP-α-D-glicose (1,3 mM) é incubada com 5 μg de enzima E5 purificada em 50 μL de tampão de fosfato de sódio, pH 8,5, durante 10 minutos a 30oC. Em seguida, 5 μg de enzima E6 purificada e 0,5 μg de enzima E7 purificada, bem como NADPH (10 mM) são acrescentados e depois da incubação de 5, 10 e 20 minutos a 30oC, a reação é interrompida por meio da adição de 20 μL de clorofórmio. A mistura é, então, turbilhonada e centrifugada durante 5 minutos com 16.000 g e temperatura ambiente. A fase aquosa é transferida para um novo recipiente de reação e a fase orgânica é novamente extraída com 80 μL de água. As duas fases aquosas são combinadas e analisadas por meio de HPLC. Nesse caso, é usada uma coluna Phenosphere-ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) ou uma coluna Spheresorb- ODS2 (250 x 4,6 mm; Waters, Milford, EUA). A eluição das substâncias a analisar é efetuada com um caudal de 1 mL min-1 com 0,5 M de KH2PO4 (eluente A) durante 15 minutos, seguida de um gradiente linear de até 80% de eluente A e 20% de metanol durante um período de 14 minutos com um caudal de 0,7 mL min-1. As substâncias a analisar, as quais eluem das colunas ODS2, são injetadas, então em uma coluna trocadora de íons Phenosphere-SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, EUA) e as substâncias a analisar são eluídas com um caudal de 1 mL min-1 e com um gradiente linear de formiato de amônio (2 a 600 mM durante 25 minutos). A quantificação da dTDP-glicose, dTDP-4-de- hidro-6-desoxi-D-glicose, dTDP-6-desoxi-L-manose e dTDP-4-de-hidro- 6-desoxi-L-manose é efetuada, então, através de sua absorção UV com um detector de arranjo de diodos (DAD). A absorção máxima de timidina encontra-se em 267 nm. A calibração é efetuada por meio de açúcar de nucleotídeo autêntico (Sigma-Aldrich, Munique, EUA).
[00099] De acordo com a invenção, são preferidas células, que apresentam atividades aumentadas das seguintes combinações de enzimas:
[000100] E4E5, E4E6, E4E7, E5E6, E5E7, E6E7, E4E5E6, E4E5E7, E5E6E7, E4E6E7, E4E5E6E7,
[000101] das quais a combinação
[000102] E4E5E6E7
[000103] é particularmente preferida.
[000104] De acordo com a invenção pode ser vantajoso, se a célula de acordo com a invenção na biossíntese do ácido graxo foi geneticamente modificada de modo tal, que as reações enzimáticas, que levam à reação de acil-ACP e malonil-coenzima A para 3-cetoacil- ACP, são reforçadas. Adicionalmente ou alternativamente, pode ser vantajoso de acordo com a invenção, se a célula de acordo com a invenção na biossíntese do ácido graxo foi geneticamente modificada de modo tal, que as reações enzimáticas, que levam à reação de (R)-3- hidroxialcanoil-ACP para trans-2-enoil-ACP e/ou à reação de trans-2- enoil-ACP para acil-ACP, são enfraquecidas.
[000105] Do mesmo modo pode ser vantajoso, se a célula de acordo com a invenção na e-oxidação de ácidos graxos foi geneticamente modificada de modo tal, que as reações enzimáticas, que levam à reação de acil-coenzima A para trans-2-enoil-coenzima A e/ou à reação de trans-2-enoil-coenzima A para (S)-3-hidroxialcanoil-coenzima A, são reforçadas. Adicionalmente ou alternativamente, pode ser vantajoso de acordo com a invenção, se a célula de acordo com a invenção na β- oxidação de ácidos graxos foi geneticamente modificada de modo tal, que as reações enzimáticas, que levam à reação de (S)-3- hidroxialcanoil-coenzima A para 3-cetoacil-coenzima A e/ou à reação de 3-cetoacil-coenzima A para acil-coenzima A e acetil-coenzima A, são enfraquecidas.
[000106] Para uma visão geral compare a Figura 1.
[000107] Visto que as células de acordo com a invenção podem ser usadas de forma vantajosa para a produção de ramnolipídeos e visto que esses lipídeos, em seguida, são opcionalmente purificados, é vantajoso, se as células de acordo com a invenção apresentam uma atividade aumentada de pelo menos uma enzima E8 em relação ao seu tipo selvagem, que catalisa a exportação de um ramnolipídeo da FórmulaFórmula Geral (I) da célula para o meio ambiente.
[000108] Neste contexto são preferidas proteínas E8 selecionadas do grupo que consiste em
[000109] uma enzima E8 com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 28 ou com uma sequência de polipeptídeo, em que até 25%, preferivelmente até 30%, de modo particularmente preferido até 25%, especialmente até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% dos resíduos de aminoácidos em relação à respectiva sequência de referência SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 28 são modificados por deleção, inserção, substituição ou por uma combinação das mesmas e que apresenta ainda pelo menos 50%, preferivelmente 65%, de modo particularmente preferido 80%, especialmente mais de 90% da atividade enzimática da enzima com a respectiva sequência de referência SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 28, sendo que por atividade enzimática para uma enzima E8 é entendida a capacidade, de exportar um ramnolipídeo da FórmulaFórmula Geral (I) da célula para o meio ambiente.
[000110] Uma outra forma de concretização preferida das células de acordo com a invenção é caracterizada pelo fato, de que ela apresenta pelo menos um dos ácidos nucleicos ou vetores de acordo com a invenção mencionados abaixo.
[000111] Células de acordo com a invenção podem ser usadas de forma vantajosa para a produção de ramnolipídeos.
[000112] Assim, um outro objetivo da invenção é o uso das células de acordo com a invenção para a produção de compostos da FórmulaFórmula Geral (I).
[000113] Um outro objetivo da presente invenção é um processo para a produção de ramnolipídeos da FórmulaFórmula Geral (I), em que
[000114] m = 2, 1 ou 0, especialmente 1 ou 0,
[000115] n = 1 ou 2, especialmente 1,
[000116] R1 e R2 = independentemente uns dos outros, um radical orgânico igual ou diferente com 2 a 24, preferivelmente 5 a 13 átomos de carbono, especialmente um radical alquila especialmente opcionalmente ramificado, opcionalmente substituído, especialmente substituído por hidroxi, opcionalmente insaturado, especialmente opcionalmente uma, duas ou três vezes insaturado, preferivelmente aquele selecionado do grupo que consiste em pentila, heptenila, nonenila, undecenila e tridecenila e (CH2)o-CH3 com o sendo 1 a 23, preferivelmente 4 a 12, compreendendo os estágios do processo
[000117] pôr em contato as células de acordo com a invenção com um meio contendo uma fonte de carbono
[000118] cultivar as células em condições, que permitam à célula formar ramnolipídeo a partir da fonte de carbono e
[000119] opcionalmente o isolamento dos ramnolipídeos formados.
[000120] As células geneticamente modificadas de acordo com a invenção, podem ser postas em contato continuamente ou descontinuamente no processo à bateladas (cultivo em lote) ou no processo de batelada alimentada (fed-batch) ou no processo de batelada alimentada repetitivo (repeated-fed-batch) a fim de produzir os produtos mencionados acima com o meio nutritivo e, assim, serem cultivadas. É concebível, também, um processo semi-contínuo, tal como é descrito na GB-A-1009370. Um resumo de métodos de cultivo conhecidos são descritos no manual de Chmiel ("Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no manual de Storhas ("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
[000121] O meio de cultura a ser usado deve satisfazer, de maneira adequada, às reivindicações das respectivas cepas. Descrições de meios de cultura de diversas cepas de levedura estão contidas, por exemplo, em "Nonconventional yeast in biotechnology" (editor Klaus Wolf, Springer-Verlag, Berlin, 1996).
[000122] Como fonte de carbono podem ser usados carboidratos, tais como, por exemplo, glicose, sacarose, arabinose, xilose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido, celulose e hemicelulose, óleos e graxas vegetais e animais, tais como, por exemplo, óleo de soja, óleo de cardo, óleo de amendoim, óleo de cânhamo, óleo de jatrofa, gordura de noz de coco, óleo de semente de abóbora, óleo de linhaça, óleo de milho, óleo de papoula, óleo de prímula, óleo de oliva, óleo de palmiste, óleo de palma, óleo de colza, óleo de sésamo, óleo de girassol, óleo de caroço de uva, óleo de nozes, óleo de gemem de trigo e gordura de coco, ácidos graxos, tais como, por exemplo, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido araquidônico, ácido behênico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido gama-linolênico e seus ésteres metílico ou etílico, bem como misturas de ácidos graxos, mono, di- e triglicérides com os ácidos graxos já mencionados, álcoois, tais como, por exemplo, glicerina, etanol e metanol, hidrocarbonetos, tais como metanol, gases contendo carbono e misturas gasosas, tais como CO, CO2, gás de síntese e de combustão, aminoácidos, tais como L- glutamato ou L-valina ou ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acético. Essas substâncias podem ser usadas individualmente ou como mistura. Particularmente preferido é o uso de carboidratos, especialmente de monossacarídeos, oligossacarídeos ou polissacarídeos, como fonte de carbono, tal como descrito na US 601.494 e US 6.136.576, bem como de hidrocarbonetos, especialmente de alcanos, alquenos e alquinas, bem como de ácidos monocarboxílicos derivados desses e dos mono-, di- e triglicérides derivados desses ácidos monocarboxílicos, bem como de glicerina e acetato. Os mono-, di- e triglicerídeos, contendo os produtos de esterificação de glicina com ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido estéarico, ácido araquidônico, ácido be-hênico, ácido oleico, ácido linólico, ácido linolênico e/ou ácido gama- linolênico são muito particularmente preferidos.
[000123] Uma grande vantagem da presente invenção é que as células de acordo com a invenção são capazes de formar ramnolipídeos das mais simples fontes de carbono, tal como, por exemplo, glicose, sacarose ou glicerina, de modo que não é necessário o fornecimento de fontes de carbono de cadeia longa no meio durante o processo de acordo com a invenção. Assim, no caso da disponibilização deficiente, é vantajoso que o meio no estágio I) do processo de acordo com a invenção não contém quaisquer ou quaisquer quantidades detectáveis de ácidos carboxílicos com um comprimento de cadeia maior do que seis átomos de carbono ou ésteres ou glicerídeos que podem ser derivados desses.
[000124] Como fonte de nitrogênio, podem ser usados compostos nitrogenados orgânicos, tais como peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, milhocina, farinha de soja e ureia ou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio, amoníaco, hidróxido de amônio ou água amoniacal. As fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou como mistura.
[000125] Como fonte de fósforo podem ser usados o ácido fosfórico, di-hidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato dipotássico ou os respectivos sais contendo sódio. O meio de cultura deve conter, além disso, sais de metais, tais como, por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para o crescimento. Finalmente, substâncias de crescimento essenciais, tais como aminoácidos e vitaminas, podem ser adicionalmente usadas às substâncias mencionadas acima. Ao meio de cultura podem ser acrescentados, além disso, precursores adequados. As matérias-primas mencionadas podem ser acrescentadas à cultura na forma de uma preparação única ou alimentadas durante o cultivo de maneira adequada. Para controlar o pH da cultura, utilizam-se compostos básicos, tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amoníaco ou água amoniacal ou compostos ácidos, tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico de maneira adequada. Para controlar o desenvolvimento de espuma, podem ser usados antiespumantes, tais como, por exemplo, ésteres poliglicólicos de ácido graxo. Para manter a estabilidade de plasmídeos, podem ser acrescentadas ao meio substâncias de ação seletiva, tais como, por exemplo, antibióticos. Para manter as condições aeróbicas, introduzem-se oxigênio ou misturas gasosas oxigenadas, tal como, por exemplo, ar, na cultura.
[000126] A temperatura da cultura encontra-se normalmente em mais de 20oC, preferivelmente em mais de 25oC, ela pode importar também em mais de 40oC, sendo que vantajosamente não é ultrapassada uma temperatura de cultivo de 95oC, de modo particularmente preferido 90oC e mais preferivelmente de 80oC.
[000127] No estágio III) do processo de acordo com a invenção, os ramnolipídeos formados pelas células podem ser opcionalmente isolados das células e/ou do meio nutritivo, sendo que para o isolamento são incluídos todos os métodos conhecidos pelo especialista para o isolamento de substâncias de baixo peso molecular de composições complexas, tais como, por exemplo, filtração, extração, adsorção (cromatografia) ou cristalização. Além disso, a fase do produto contém radicais de biomassa e diversas impurezas, tais como óleos, ácidos graxos e outros componentes do meio nutritivo. A separação das impurezas é preferivelmente efetuada em um processo livre de solventes. Assim, por exemplo, a fase do produto pode ser diluída com água, para facilitar o ajuste do valor de pH. Depois, a fase aquosa e do produto podem homogeneizadas, em que os ramnolipídeos são convertidos em uma forma hidrossolúvel diminuindo ou aumentando o valor de pH por meio de ácidos ou lixívias. Potencialmente, a solubilização dos ramnolipídeos na fase aquosa pode ser suportada por incubação a temperaturas mais elevadas, por exemplo, a 60 a 90oC e constante mistura. Através de subsequente aumento ou diminuição do valor do pH por meio de lixívias ou ácidos, os ramnolipídeos podem ser novamente convertidos, depois, em uma forma insolúvel em água, de modo que eles podem ser facilmente separados da fase aquosa. Depois, a fase do produto pode ser lavada ainda uma ou mais vezes com água, para remover as impurezas hidrossolúveis.
[000128] Restos de óleo, por exemplo, podem ser separados através de extração por meio de solventes adequados, de forma vantajosa por meio de solventes orgânicos. Como solvente pse refere um alcano, tal como, por exemplo, n-hexano.
[000129] A separação do produto da fase aquosa pode ser efetuada alternativamente ao processo livre de solventes descrito acima, com um solvente adequado, por exemplo, com um éster, tal como, por exemplo, com acetato de etila ou acetato de butila. Os estágios de extração mencionados podem ser efetuados na ordem desejada. Aqui, utilizam- se preferivelmente solventes, especialmente solventes orgânicos. Como solvente pse refere o n-pentanol. Para remover o solvente, efetua-se, por exemplo, uma destilação. Em seguida, o produto liofilizado, por exemplo, por meio de métodos cromatográficos, pode ser ulteriormente purificado. Nesse ponto, sejam exemplificados a precipitação por meio de solventes adequados, a extração por meio de solventes adequados, a complexação, por exemplo, por meio de ciclodextrinas ou derivados de ciclodextrina, a cristalização, a purificação ou o isolamento por meio de métodos cromatográficos ou a conversão dos ramnolipídeos em derivados levemente separáveis.
[000130] Os ramnolipídeos que podem ser produzidos com o processo de acordo com a invenção, são igualmente objetivo da presente invenção, especialmente também as misturas de ramnolipídeos descritas acima, que podem ser produzidas com o processo de acordo com a invenção.
[000131] Os ramnolipídeos e misturas podem ser produzidos com o processo de acordo com a invenção, podem ser usados de forma vantajosa em agentes de limpeza, em formulações cosméticas ou farmacêuticas bem como em formulações de proteção de plantas.
[000132] Assim, um outro objetivo da presente invenção é o uso dos ramnolipídeos obtidos com o processo de acordo com a invenção, para a preparação de formulações cosméticas, dermatológicas ou farmacêuticas, de formulações de proteção de plantas, bem como de produtos de tratamento e de limpeza e concentrados tensoativos.
[000133] Pelo termo "produtos de tratamento" é entendida, aqui, uma formulação, que serve ao propósito de conter um artigo na sua forma original, de atenuar ou evitar os efeitos de fatores externos (por exemplo, tempo, luz, temperatura, pressão, contaminação, reação química com outros compostos reativos que entram em contato com o artigo), tais como, por exemplo, envelhecimento, contaminação, fadiga do material, alvejamento ou mesmo melhorar as propriedades positivas desejadas do artigo. Para o último ponto, seja mencionado, por exemplo, um melhor brilho do cabelo ou uma maior elasticidade do artigo considerado.
[000134] Por "formulações de proteção de plantas" são entendidas aquelas formulações, que de acordo com o tipo de sua preparação, são evidentemente usadas para a proteção de plantas; esse é especialmente, então, o caso, se na formulação estiver contido pelo menos um composto das classes dos herbicidas, fungicidas, inseticidas, acaricidas, nematicidas, substâncias protetoras contra a devoração por pássaros, substâncias nutritivas vegetais e agentes aperfeiçoadores da estrutura do solo. Ramnolipídeos produzidos com o processo de acordo com a invenção são usados preferivelmente de acordo com a invenção, e produtos de tratamento e limpeza para o uso doméstico, indústria, especialmente para superfícies duras, couro ou têxteis.
[000135] Uma contribuição para a solução da tarefa é prestada por um ácido nucleico isolado, o qual apresenta em cada caso uma sequência selecionada dos três grupos [A1 até G1], A2 até G2] e [A3 até G3], em que
[000136] o grupo [A1 até G1] consiste nas seguintes sequências:
[000137] A1a) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de
[000138] reagir 3-hidroxidecanoil-ACP através de 3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoil-ACP para ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
[000139] B1a) uma sequência livre de íntrons, que é derivada de uma sequência de acordo com A1a) e que codifica a mesma proteína ou peptídeo como a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 1,
[000140] C1a) uma sequência, que codifica uma proteína ou peptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2 e que é preferivelmente capaz de
[000141] reagir 3-hidroxidecanoil-ACP através de 3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoil-ACP para ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
[000142] D1a) uma sequência, que é idêntica com uma sequência de acordo com um dos grupos A1a) até C1a), de modo particularmente preferido, de acordo com o grupo A1a), em pelo menos 70%, de modo particularmente preferido em pelo menos 90%, além disso, preferivelmente em pelo menos 95% e do modo mais preferido, em pelo menos 99%, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000143] reagir 3-hidroxidecanoil-ACP através de 3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoil-ACP para ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
[000144] E1a) uma sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência de acordo com um dos grupos A1a) até D1a), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1a) ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000145] reagir 3-hidroxidecanoil-ACP através de 3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoil-ACP para ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
[000146] F1a) um derivado, obtido através de substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, preferivelmente de pelo menos 2 bases, além disso, preferivelmente de pelo menos 5 bases e do modo mais preferido, de pelo menos 10 bases, contudo, preferivelmente de não mais de 100 bases, de modo particularmente preferido de não mais de 50 bases e do modo mais preferido, de não mais de 25 bases, de uma sequência de acordo com um dos grupos A1a) até E1a), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1a), sendo que esse derivado codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000147] reagir 3-hidroxidecanoil-ACP através de 3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoil-ACP para ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
[000148] G1a) uma sequência complementar a uma sequência de acordo com um dos grupos A1a) até F1a), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1a),
[000149] A1b) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 17, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de
[000150] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000151] B1b) uma sequência livre de íntrons, que é derivada de uma sequência de acordo com A1b) e que codifica a mesma proteína ou peptídeo como a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 17,
[000152] C1b) uma sequência, que codifica uma proteína ou peptídeo, que compreende a sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 18 e que é preferivelmente capaz de
[000153] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000154] D1b) uma sequência, que é idêntica com uma sequência de acordo com um dos grupos A1b) até C1b), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1b), em pelo menos 70%, de modo particularmente preferido em pelo menos 90%, além disso, preferivelmente em pelo menos 95% e do modo mais preferido, em pelo menos 99%, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000155] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000156] E1b) uma sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência de acordo com um dos grupos A1b) até D1b), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1b) ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000157] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000158] F1b) um derivado, obtido através de substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, preferivelmente de pelo menos 2 bases, além disso, preferivelmente de pelo menos 5 bases e do modo mais preferido, de pelo menos 10 bases, contudo, preferivelmente de não mais de 100 bases, de modo particularmente preferido de não mais de 50 bases e do modo mais preferido, de não mais de 25 bases, de uma sequência de acordo com um dos grupos A1b) até E1b), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1b), sendo que esse derivado codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000159] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000160] G1b) uma sequência complementar a uma sequência de acordo com um dos grupos A1b) até F1b), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1b) e
[000161] A1c) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 77, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de
[000162] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000163] B1c) uma sequência livre de íntrons, que é derivada de uma sequência de acordo com A1c) e que codifica a mesma proteína ou peptídeo como a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 77,
[000164] C1c) uma sequência, que codifica uma proteína ou peptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 78 e que é preferivelmente capaz de
[000165] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000166] D1c) uma sequência, que é idêntica com uma sequência de acordo com um dos grupos A1c) até C1c), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1c), em pelo menos 70%, de modo particularmente preferido em pelo menos 90%, além disso, preferivelmente em pelo menos 95% e do modo mais preferido, em pelo menos 99%, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000167] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000168] E1c) uma sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência de acordo com um dos grupos A1c) até D1c), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1c) ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000169] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000170] F1c) um derivado, obtido através de substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, preferivelmente de pelo menos 2 bases, além disso, preferivelmente de pelo menos 5 bases e do modo mais preferido, de pelo menos 10 bases, contudo, preferivelmente de não mais de 100 bases, de modo particularmente preferido de não mais de 50 bases e do modo mais preferido, de não mais de 25 bases, de uma sequência de acordo com um dos grupos A1c) até E1c), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1c), sendo que esse derivado codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000171] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000172] G1c) uma sequência complementar a uma sequência de acordo com um dos grupos A1c) até F1c), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1c) e
[000173] A1d) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 79, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de
[000174] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000175] B1d) uma sequência livre de íntrons, que é derivada de uma sequência de acordo com A1d) e que codifica a mesma proteína ou peptídeo como a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 79,
[000176] C1d) uma sequência, que codifica uma proteína ou peptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 80 e que é preferivelmente capaz de
[000177] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000178] D1d) uma sequência, que é idêntica com uma sequência de acordo com um dos grupos A1d) até C1d), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1d), em pelo menos 70%, de modo particularmente preferido em pelo menos 90%, além disso, preferivelmente em pelo menos 95% e do modo mais preferido, em pelo menos 99%, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000179] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000180] E1d) uma sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência de acordo com um dos grupos A1d) até D1d), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1d) ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000181] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000182] F1d) um derivado, obtido através de substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, preferivelmente de pelo menos 2 bases, além disso, preferivelmente de pelo menos 5 bases e do modo mais preferido, de pelo menos 10 bases, contudo, preferivelmente de não mais de 100 bases, de modo particularmente preferido de não mais de 50 bases e do modo mais preferido, de não mais de 25 bases, de uma sequência de acordo com um dos grupos A1d) até E1d), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1d), sendo que esse derivado codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000183] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000184] G1d) uma sequência complementar a uma sequência de acordo com um dos grupos A1d) até F1d), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1d) e
[000185] A1e) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 81, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de
[000186] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000187] B1e) uma sequência livre de íntrons, que é derivada de uma sequência de acordo com A1e) e que codifica a mesma proteína ou peptídeo como a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 81,
[000188] C1e) uma sequência, que codifica uma proteína ou peptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 82 e que é preferivelmente capaz de
[000189] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000190] D1e) uma sequência, que é idêntica com uma sequência de acordo com um dos grupos A1e) até C1e), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1e), em pelo menos 70%, de modo particularmente preferido em pelo menos 90%, além disso, preferivelmente em pelo menos 95% e do modo mais preferido, em pelo menos 99%, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000191] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000192] E1e) uma sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência de acordo com um dos grupos A1e) até D1e), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1e) ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000193] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000194] F1e) um derivado, obtido através de substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, preferivelmente de pelo menos 2 bases, além disso, preferivelmente de pelo menos 5 bases e do modo mais preferido, de pelo menos 10 bases, contudo, preferivelmente de não mais de 100 bases, de modo particularmente preferido de não mais de 50 bases e do modo mais preferido, de não mais de 25 bases, de uma sequência de acordo com um dos grupos A1e) até E1e), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1e), sendo que esse derivado codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000195] reagir 3-hidroxitetradecanoil-ACP através de 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000196] G1e) uma sequência complementar a uma sequência de acordo com um dos grupos A1e) até F1e), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A1e) e
[000197] o grupo {A2 até G2] consiste nas seguintes sequências:
[000198] A2a) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 3, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de
[000199] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico,
[000200] B2a) uma sequência livre de íntrons, que é derivada de uma sequência de acordo com A2a) e que codifica a mesma proteína ou peptídeo como a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 3,
[000201] C2a) uma sequência, que codifica uma proteína ou peptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 4 e que é preferivelmente capaz de
[000202] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico,
[000203] D2a) uma sequência, que é idêntica com uma sequência de acordo com um dos grupos A2a) até C2a), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2a), em pelo menos 80%, de modo particularmente preferido em pelo menos 90%, além disso, preferivelmente em pelo menos 95% e do modo mais preferido, em pelo menos 99%, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000204] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico,
[000205] E2a) uma sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência de acordo com um dos grupos A2a) até D2a), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2a) ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000206] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico,
[000207] F2a) um derivado, obtido através de substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, preferivelmente de pelo menos 2 bases, além disso, preferivelmente de pelo menos 5 bases e do modo mais preferido, de pelo menos 10 bases, contudo, preferivelmente de não mais de 100 bases, de modo particularmente preferido de não mais de 50 bases e do modo mais preferido, de não mais de 25 bases, de uma sequência de acordo com um dos grupos A2a) até E2a), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2a), sendo que esse derivado codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000208] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico,
[000209] G2a) uma sequência complementar a uma sequência de acordo com um dos grupos A2a) até F2a), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2a),
[000210] A2b) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 19, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de
[000211] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxiteradecanoico,
[000212] B2b) uma sequência livre de íntrons, que é derivada de uma sequência de acordo com A2b) e que codifica a mesma proteína ou peptídeo como a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 19,
[000213] C2b) uma sequência, que codifica uma proteína ou peptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 20 e que é preferivelmente capaz de
[000214] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000215] D2b) uma sequência, que é idêntica com uma sequência de acordo com um dos grupos A2b) até C2b), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2b), em pelo menos 70%, de modo particularmente preferido em pelo menos 90%, além disso, preferivelmente em pelo menos 95% e do modo mais preferido, em pelo menos 99%, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000216] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000217] E2b) uma sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência de acordo com um dos grupos A2b) até D2b), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2b) ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000218] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecanoico,
[000219] F2b) um derivado, obtido através de substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, preferivelmente de pelo menos 2 bases, além disso, preferivelmente de pelo menos 5 bases e do modo mais preferido, de pelo menos 10 bases, contudo, preferivelmente de não mais de 100 bases, de modo particularmente preferido de não mais de 50 bases e do modo mais preferido, de não mais de 25 bases, de uma sequência de acordo com um dos grupos A2b) até E2b), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2b), sendo que esse derivado codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000220] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000221] G2b) uma sequência complementar a uma sequência de acordo com um dos grupos A2b) até F2b), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2b),
[000222] A2c) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 83, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de
[000223] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000224] B2c) uma sequência livre de íntrons, que é derivada de uma sequência de acordo com A2c) e que codifica a mesma proteína ou peptídeo como a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 83,
[000225] C2c) uma sequência, que codifica uma proteína ou peptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 84 e que é preferivelmente capaz de
[000226] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000227] D2c) uma sequência, que é idêntica com uma sequência de acordo com um dos grupos A2c) até C2c), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2c), em pelo menos 70%, de modo particularmente preferido em pelo menos 90%, além disso, preferivelmente em pelo menos 95% e do modo mais preferido, em pelo menos 99%, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000228] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000229] E2c) uma sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência de acordo com um dos grupos A2c) até D2c), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2c) ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000230] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecanoico,
[000231] F2c) um derivado, obtido através de substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, preferivelmente de pelo menos 2 bases, além disso, preferivelmente de pelo menos 5 bases e do modo mais preferido, de pelo menos 10 bases, contudo, preferivelmente de não mais de 100 bases, de modo particularmente preferido de não mais de 50 bases e do modo mais preferido, de não mais de 25 bases, de uma sequência de acordo com um dos grupos A2c) até E2c), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2c), sendo que esse derivado codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000232] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000233] G2c) uma sequência complementar a uma sequência de acordo com um dos grupos A2c) até F2c), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2c),
[000234] A2d) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 85, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de
[000235] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000236] B2d) uma sequência livre de íntrons, que é derivada de uma sequência de acordo com A2d) e que codifica a mesma proteína ou peptídeo como a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 85,
[000237] C2d) uma sequência, que codifica uma proteína ou peptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 86 e que é preferivelmente capaz de
[000238] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000239] D2d) uma sequência, que é idêntica com uma sequência de acordo com um dos grupos A2d) até C2d), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2d), em pelo menos 70%, de modo particularmente preferido em pelo menos 90%, além disso, preferivelmente em pelo menos 95% e do modo mais preferido, em pelo menos 99%, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000240] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000241] E2d) uma sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência de acordo com um dos grupos A2d) até D2d), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2d) ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000242] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecanoico,
[000243] F2d) um derivado, obtido através de substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, preferivelmente de pelo menos 2 bases, além disso, preferivelmente de pelo menos 5 bases e do modo mais preferido, de pelo menos 10 bases, contudo, preferivelmente de não mais de 100 bases, de modo particularmente preferido de não mais de 50 bases e do modo mais preferido, de não mais de 25 bases, de uma sequência de acordo com um dos grupos A2d) até E2d), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2d), sendo que esse derivado codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000244] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000245] G2d) uma sequência complementar a uma sequência de acordo com um dos grupos A2d) até F2d), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2d) e
[000246] A2e) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 87, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de
[000247] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000248] B2e) uma sequência livre de íntrons, que é derivada de uma sequência de acordo com A2e) e que codifica a mesma proteína ou peptídeo como a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 87,
[000249] C2e) uma sequência, que codifica uma proteína ou peptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 88 e que é preferivelmente capaz de
[000250] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000251] D2e) uma sequência, que é idêntica com uma sequência de acordo com um dos grupos A2e) até C2d), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2e), em pelo menos 70%, de modo particularmente preferido em pelo menos 90%, além disso, preferivelmente em pelo menos 95% e do modo mais preferido, em pelo menos 99%, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000252] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000253] E2e) uma sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência de acordo com um dos grupos A2e) até D2e), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2e) ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000254] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecanoico,
[000255] F2e) um derivado, obtido através de substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, preferivelmente de pelo menos 2 bases, além disso, preferivelmente de pelo menos 5 bases e do modo mais preferido, de pelo menos 10 bases, contudo, preferivelmente de não mais de 100 bases, de modo particularmente preferido de não mais de 50 bases e do modo mais preferido, de não mais de 25 bases, de uma sequência de acordo com um dos grupos A2e) até E2e), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2e), sendo que esse derivado codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000256] reagir dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,
[000257] G2e) uma sequência complementar a uma sequência de acordo com um dos grupos A2e) até F2e), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A2e) e
[000258] o grupo [A3 até G3] consiste nas seguintes sequências:
[000259] A3a) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 5, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de
[000260] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-(1-2)- α-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
[000261] B3a) uma sequência livre de íntrons, que é derivada de uma sequência de acordo com A3a) e que codifica a mesma proteína ou peptídeo como a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 5,
[000262] C3a) uma sequência, que codifica uma proteína ou peptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 6 e que é preferivelmente capaz de
[000263] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-(1-2)- α-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
[000264] D3a) uma sequência, que é idêntica com uma sequência de acordo com um dos grupos A3a) até C3a), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3a), em pelo menos 80%, de modo particularmente preferido em pelo menos 90%, além disso, preferivelmente em pelo menos 95% e do modo mais preferido, em pelo menos 99%, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000265] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-(1-2)- α-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
[000266] E3a) uma sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência de acordo com um dos grupos A3a) até D3a), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3a) ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000267] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-(1-2)- α-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
[000268] F3a) um derivado, obtido através de substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, preferivelmente de pelo menos 2 bases, além disso, preferivelmente de pelo menos 5 bases e do modo mais preferido, de pelo menos 10 bases, contudo, preferivelmente de não mais de 100 bases, de modo particularmente preferido de não mais de 50 bases e do modo mais preferido, de não mais de 25 bases, de uma sequência de acordo com um dos grupos A3a) até E3a), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3a), sendo que esse derivado codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000269] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-(1-2)- α-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,
[000270] G3a) uma sequência complementar a uma sequência de acordo com um dos grupos A3a) até F3a), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3a),
[000271] A3b) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 21, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de
[000272] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[000273] B3b) uma sequência livre de íntrons, que é derivada de uma sequência de acordo com A3b) e que codifica a mesma proteína ou peptídeo como a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 21,
[000274] C3b) uma sequência, que codifica uma proteína ou peptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 22 e que é preferivelmente capaz de
[000275] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[000276] D3b) uma sequência, que é idêntica com uma sequência de acordo com um dos grupos A3b) até C3b), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3b), em pelo menos 60%, de modo particularmente preferido em pelo menos 90%, além disso, preferivelmente em pelo menos 95% e do modo mais preferido, em pelo menos 99%, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000277] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[000278] E3b) uma sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência de acordo com um dos grupos A3b) até D3b), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3b) ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000279] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[000280] F3b) um derivado, obtido através de substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, preferivelmente de pelo menos 2 bases, além disso, preferivelmente de pelo menos 5 bases e do modo mais preferido, de pelo menos 10 bases, contudo, preferivelmente de não mais de 100 bases, de modo particularmente preferido de não mais de 50 bases e do modo mais preferido, de não mais de 25 bases, de uma sequência de acordo com um dos grupos A3b) até E3b), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3b), sendo que esse derivado codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000281] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico e
[000282] G3b) uma sequência complementar a uma sequência de acordo com um dos grupos A3b) até F3b), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3b),
[000283] A3c) uma sequência de acordo com uma SEQ ID NO: 89, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de
[000284] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[000285] B3c) uma sequência livre de íntrons, que é derivada de uma sequência de acordo com A3c) e que codifica a mesma proteína ou peptídeo como a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 89,
[000286] C3c) uma sequência, que codifica uma proteína ou peptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 90 e que é preferivelmente capaz de
[000287] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[000288] D3c) uma sequência, que é idêntica com uma sequência de acordo com um dos grupos A3c) até C3c), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3c), em pelo menos 60%, de modo particularmente preferido em pelo menos 90%, além disso, preferivelmente em pelo menos 95% e do modo mais preferido, em pelo menos 99%, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000289] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[000290] E3c) uma sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência de acordo com um dos grupos A3c) até D3c), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3c) ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000291] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[000292] F3c) um derivado, obtido através de substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, preferivelmente de pelo menos 2 bases, além disso, preferivelmente de pelo menos 5 bases e do modo mais preferido, de pelo menos 10 bases, contudo, preferivelmente de não mais de 100 bases, de modo particularmente preferido de não mais de 50 bases e do modo mais preferido, de não mais de 25 bases, de uma sequência de acordo com um dos grupos A3c) até E3c), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3c), sendo que esse derivado codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000293] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico e
[000294] G3c) uma sequência complementar a uma sequência de acordo com um dos grupos A3c) até F3c), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3c) e
[000295] A3d) uma sequência de acordo com uma SEQ ID NO: 91, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de
[000296] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[000297] B3d) uma sequência livre de íntrons, que é derivada de uma sequência de acordo com A3d) e que codifica a mesma proteína ou peptídeo como a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 91,
[000298] C3d) uma sequência, que codifica uma proteína ou peptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 92 e que é preferivelmente capaz de
[000299] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[000300] D3d) uma sequência, que é idêntica com uma sequência de acordo com um dos grupos A3d) até C3d), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3d), em pelo menos 60%, de modo particularmente preferido em pelo menos 90%, além disso, preferivelmente em pelo menos 95% e do modo mais preferido, em pelo menos 99%, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000301] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[000302] E3d) uma sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência de acordo com um dos grupos A3d) até D3d), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3d) ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético, sendo que essa sequência codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000303] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico,
[000304] F3d) um derivado, obtido através de substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, preferivelmente de pelo menos 2 bases, além disso, preferivelmente de pelo menos 5 bases e do modo mais preferido, de pelo menos 10 bases, contudo, preferivelmente de não mais de 100 bases, de modo particularmente preferido de não mais de 50 bases e do modo mais preferido, de não mais de 25 bases, de uma sequência de acordo com um dos grupos A3d) até E3d), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3d), sendo que esse derivado codifica preferivelmente uma proteína ou peptídeo, que é capaz de
[000305] reagir dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico e
[000306] G3d) uma sequência complementar a uma sequência de acordo com um dos grupos A3d) até F3d), de modo particularmente preferido de acordo com o grupo A3d).
[000307] A "identidade do nucleotídeo" ou "identidade do aminoácido" é determinada, aqui, com auxílio de processos conhecidos. Em geral, são usados programas de computador particulares com algoritmos considerando necessidades especiais.
[000308] Processos preferidos para a determinação da identidade produzem inicialmente a maior concordância entre as sequências a serem comparadas. Programas de computador para a determinação da identidade compreendem, contudo, não são restritos à, o pacote de programa GCG, inclusive
[000309] GAP (Deveroy, J. e colaboradores, Nucleic Acid Research 12 (1984), página 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi), e BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. e colaboradores, Journal of Molecular Biology 215 (1990), páginas 403-410. O programa BLAST pode ser obtido do National Center For Biotechnology Information (NCBI) e de outras fontes (BLAST Handbuch, Altschul S. e colaboradores, NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894, Altschul S. e colaboradores, acima).
[000310] O algoritmo de Smith-Waterman conhecido pode ser igualmente usado para a determinação da identidade do nucleotídeo.
[000311] Parâmetros preferidos para a determinação da "identidade do nucleotídeo" quando é usado o programa BLASTN (Altschul, S. e colaboradores, Journal of Molecular Biology 215 (1990), páginas 403- 410 são: expect threshold: 10 word size: 28 match score: 1 mismatch score: -2 gap costs: linear
[000312] Os parâmetros acima são os parâmetros ausentes na comparação da sequência de nucleotídeos. O programa GAP é igualmente adequado para ser usado com os parâmetros acima.
[000313] Parâmetros preferidos para a determinação da "identidade de aminoácidos" quando é usado o programa BLASTP (Altschul, S. e colaboradores, Journal of Molecular Biology 215 (1990), páginas 403- 410 são: expect threshold: 10 word size: 3 matrix: BLOSUM62 gap costs: existence: 11; extension: 1 compositional adjustments: conditional compositional score matrix adjustment.
[000314] Os parâmetros acima são os parâmetros ausentes na comparação da sequência de aminoácidos. O programa GAP é igualmente adequado para ser usado com os parâmetros acima.
[000315] Uma identidade de 60% de acordo com o algoritmo acima no contexto com a presente invenção, significa 60% de identidade. O mesmo se aplica para identidades mais elevadas.
[000316] A característica "sequência, que hibridiza com o filamento oposto de uma sequência ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético" aponta para uma sequência, que hibridiza em condições rigorosas com o filamento oposto de uma sequência de referência ou hibridizaria considerando a degeneração do código genético. Por exemplo, as hibridizações podem ser efetuadas a 68oC em 2 x SSC ou conforme o protocolo do kit com a marca digoxigenina da empresa Boehringer (Mannheim). Condições de hibridização preferidas são, por exemplo, a incubação a 65oC durante a noite em 7% de SDS, 1% de BSA, 1 mM de EDTA, 250 mM de tampão de fosfato de sódio (pH 7,2) e subsequente lavagem a 65oC com 2 x SSC; 0,1% de SDS.
[000317] Aos derivados dos DNA isolados de acordo com a invenção, que podem ser obtidos de acordo com a alternativa F1, F2) ou F3) através de substituição, adição, inversão e/o deleção de uma ou mais bases de uma sequência de acordo com um dos grupos A1) até E1, A2) até E2) e A2) até E3), pertencem especialmente aquelas sequências, as quais na proteína, que elas codificam, levam às trocas de aminoácidos conservadores, tais como, por exemplo, à troca de glicina por alanina ou de ácido asparagínico por ácido glutâmico. Tais mutações de função neutra são designadas como mutações de sentido (sense mutations) e não levam a nenhuma mudança fundamental da atividade do polipeptídeo. Além disso, sabe-se que mudanças no N e/ou C-terminal de um polipeptídeo não prejudicam substancialmente sua função ou até podem estabilizá-la, de modo que em consequência disto, sequências de DNA, nas quais na extremidade 3' ou na extremidade 5' da sequência com os ácidos nucleicos de acordo com a invenção, são acrescentadas bases, são compreendidas pela presente invenção. O especialista encontra dados para essa finalidade, entre outros, em Ben- Bassat e colaboradores (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), em O'Regan e colaboradores (Gene 77:237-251 (1989)), em Sahin-Toth e colaboradores (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), em Hochuli e colaboradores (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)) e em compêndios conhecidos da genética e biologia molecular.
[000318] O ácido nucleico de acordo com a invenção é preferivelmente um vetor, especialmente um vetor de expressão ou um cassete de superexpressão de gene. Como vetores incluem-se todos os vetores conhecidos pelo especialista, que são convencionalmente usados para inserir DNA em uma célula hospedeira. Esses vetores podem replicar tanto de forma autônoma, visto que eles possuem as origens de replicação, como aqueles do 2μ-plasmideo ou ARS (sequências que replicam de forma autônoma) ou integram nos cromossomas (plasmídeos não replicativos). Por vetores são entendidos também fragmentos de DNA lineares, que não possuem quaisquer origens de replicação, tais como cassetes de inserção de gene ou de superexpressão de gene. Os cassetes de superexpressão de genes consistem convencionalmente em um marcador, nos genes a serem superexprimidos, bem como faixas reguladoras relevantes para a expressão dos genes, tais como promotores e terminadores. Vetores preferidos são selecionados do grupo compreendendo plasmídeos e cassetes, tais como plasmídeos integrativos de levedura de E. coli, particularmente preferidos são vetores de expressão, cassetes de inserção de gene ou de superexpressão de gene, especialmente os vetores SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 47 descritos abaixo.
[000319] De acordo com uma forma de concretização preferida do vetor de acordo com a invenção, as sequências dos grupos [A1 até G1], [A2 até G2] e [A3 até G3] estão sob o controle de pelo menos um promotor constitutivo ou regulável, que é adequado para a expressão do polipeptídeo codificado por esses sequências de DNA na célula de um micro-organismo, preferivelmente de uma célula de bactéria, levedura ou fungo, em que Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Burkholderia andropogonis, B. brasilensis, B. caledonica, B. caribensis, B. caryophylli, B. fungorum, B. gladioli, B. glathei, B. glumae, B. graminis, B. hospita, B. kururiensis, B. phenazinium, B. phymatum, B. phytofirmans, B. plantarii, B. sacchari, B. singaporensis, B. sordidicola, B. terricola, B. tropica, B. tuberum, B. ubonensis, B. unamae, B. xenovorans, B. anthina, B. pyrrocinia, B. thailandensis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Escherichia coli, Hansenula polymorpha, Kluveromyces lactis, Methylobacterium extorquens, Paracoccus versutus, Pseudomonas argentinensis, P. borbori, P. citronellolis, P. flavescens, P. mendocina, P. nitroreducens, P. oleovorans, P. pseudoalcaligenes, P. resinovorans, P. straminea, P. aurantiaca, P. aureofaciens, P. chlororaphis, P. fragi, P. lundensis, P. taetrolens, P. antarctica, P. azotoformans, 'P. blatchfordae', P. brassicacearum, P. brenneri, P. cedrina, P. corrugata, P. fluorescens, P. gessardii, P. libanensis, P. mandelii, P. marginalis, P. mediterranea, P. meridiana, P. migulae, P. mucidolens, P. orientalis, P. panacis, P. proteolytica, P. rhodesiae, P. synxantha, P. thivervalensis, P. tolaasii, P. veronii, P. denitrificans, P. pertucinogena, P. cremoricolorata, P. fulva, P. monteilii, P. mosselii, P. parafulva, P. putida, P. balearica, P. stutzeri, P. amygdali, P. avellanae, P. caricapapayae, P. cichorii, P. coronafaciens, P. ficuserectae, 'P. helianthi', P. meliae, P. savastanoi, P. syringae, P. tomato, P. viridiflava, P. abietaniphila, P. acidophila, P. ágarici, P. alcaliphila, P. alkanolytica, P. amyloderamosa, P. asplenii, P. azotifigens, P. cannabina, P. coenobios, P. congelans, P. costantinii, P. cruciviae, P. delhiensis, P. excibis, P. extremorientalis, P. frederiksbergensis, P. fuscovaginae, P. gelidicola, P. grimontii, P. indica, P. jessenii, P. jinjuensis, P. kilonensis, P. knackmussii, P. koreensis, P. lini, P. lutea, P. moraviensis, P. otitidis, P. pachastrellae, P. palleroniana, P. papaveris, P. peli, P. perolens, P. poae, P. pohangensis, P. psychrophila, P. psychrotolerans, P. rathonis, P. reptilivora, P. resiniphila, P. rhizosphaerae, P. rubescens, P. salomonii, P. segitis, P. septica, P. simiae, P. suis, P. thermotolerans, P. aeruginosa, P. tremae, P. trivialis, P. turbinellae, P. tuticorinensis, P. umsongensis, P. vancouverensis, P. vranovensis, P. xanthomarina, Ralstonia eutropha, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Zymomonas mobilis, especialmente Pseudomonas putida, Escherichia coli e Burkholderia thailandensis são particularmente preferidos. Exemplos de promotores constitutivos são lac, lacUV5, tac, trc (em cada caso, na ausência do repressor Lacl nas células de acordo com a invenção), Ltet-O1 (na ausência do repressor TetR nas células de acordo com a invenção), T5 e gap. Exemplos de promotores que podem ser induzidos são lac, lacUV5, tac, trc (em cada caso, na presença do repressor Lacl nas células de acordo com a invenção), Ltet-O1 (na presença do repressor TetR nas células de acordo com a invenção), T5 (em combinação com um operador lac e na presença do repressor Lacl nas células de acordo com a invenção), SP6 e T7 (na presença do gene que codifica a polimerase RNA cognata, cuja expressão, por seu lado, é regulada). O vetor de acordo com a invenção deveria compreender, além de um promotor, preferivelmente um ponto de ligação do ribossomo, bem como um terminador. Nesse caso, é particularmente preferido, que o ácido nucleico de acordo com a invenção seja incorporado em um cassete de expressão do vetor compreendendo o promotor, o ponto de ligação do ribossomo e o terminador. Além dos elementos estruturais mencionados acima, o vetor pode compreender, além disso, genes de seleção conhecidos pelo especialista.
[000320] Todas as porcentagens (%) indicadas, quando não indicado de outro modo, são por cento em massa. Nos exemplos listados a seguir, a presente invenção é descrita por meio de exemplos, sem que a invenção, cuja extensão de aplicação resulta de todo o relatório descritivo e das reivindicações, seja restrita às formas de concretização mencionadas nos exemplos. Breve Descrição das Figuras:
[000321] Figura 1: biossíntese do ácido graxo, e-oxidação de ácidos graxos e ligação dessas vias de metabolismo com a biossíntese de ramnolipídeos (enzimas E1, E2 e E3) e poli-hidroxialcanoatos (enzimas E9 e E10). São mostrados os fluxos de carbono na biossíntese do ácido graxo, e-oxidação de ácidos graxos, biossíntese de ramnolipídeo e biossíntese de poli-hidroxialcanoato. Consumo e formação de coenzimas, equivalentes redox e nucleotídeos não são mostrados.
[000322] Figura 2: formação de diramnosil-lipídeo (mg/L OD 600 nm) das cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2 e pBBR1MCS-2::ABC bem como GPp104 pBBR1MCS-2 epBBR1MCS- 2::ABC depois de 48 horas, 72 horas e 96 horas de cultivo em meio CMP. A analise da concentração de ramnolipídeo foi efetuada por meio de HPLC.
[000323] Figura 3: formação de monoramnosil-lipídeo (superfície de pico/OD 600 nm) das cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2, pBBR1MCS2::AB e pBBR1MCS2::ABM bem como GPp104 pBBR1MCS-2, pBBR1MCS-2::AB e pBBR1MCS-2::ABM depois de 48 horas, 72 horas e 96 horas de cultivo em meio CMP. A análise da concentração de ramnolipídeo foi efetuada por meio de HPLC. Exemplos: Construção de um vetor pBBR1MCS-2::AB para a expressão heteróloga do gene rhlA e rhlB de Pseudomonas aeruginosa 1707 em Pseudomonas putida
[000324] Para a expressão heteróloga dos genes rhlA e rhlB de Pseudomonas aeruginosa DSM1707, construiu-se o plasmídeo pBBR1MCS-2::AB (SEQ ID NO: 38). Para isso, o operon rhlAB (SEQ ID NO: 37) sintético da empresa GeneArt AG (Regensburg) foi sintetizado e clonado intermediariamente no vetor comercial pMA (GeneArt AG). A base para a síntese foi a sequência genômica já conhecida da Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partindo do vetor pMA::AB, o operon sintético foi cortado do vetor por meio de Bg/II e Xbal e, em seguida, ligado no vetor de expressão pBBR1MCS-2 (SEQ ID NO: 49) cortado com BamHl e Xbal (descrito por Kovach e colaboradores, 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176). O plasmídeo pBBR1MCS-2::AB (SEQ ID NO: 38) resultante tem um tamanho de 7422 pares de bases. A ligação, bem como a transformação de células de E. coli DH5α (Gibco-BRL, Karlsruhe) quimicamente competentes foi efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista. A autenticidade da inserção foi verificada por meio de análise de sequência de DNA.
[000325] A transformação de Pseudomonas putida KT2440 e GPp104 com os vetores pBBR1MCS-2 (SEQ ID NO: 49) e pBBR1MCS-2::AB foi efetuada tal como descrito acima (Iwasaki e colaboradores Biosci. Biotech. Biochem. 1994 58(5):851-854). O DNA de plasmídeos de 10 clones foi isolado e analisado. As cepas obtidas, portando plasmídeos foram mencionadas de P. putida KT2440 pBBR1MCS-2, P. putida GPp104pBBR1MCS-2, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB ou P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB. 2. Construção de um vetor pBBR1MCS-2::AB para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB e rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 em Pseudomonas putida
[000326] Para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB e rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707, construiu-se o plasmídeo pBBR1MCS-2::AB (SEQ ID NO: 40). Para isso, o operon sintético rhlABC SEQ ID NO: 39) da empresa GeneArt AG (Regensburg) foi sintetizado e clonado intermediariamente no vetor comercial pMA (GeneArt AG). A base para a síntese foi a sequência genômica já conhecida da Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partindo do vetor pMA::ABC, o operon sintético foi cortado do vetor por meio de Bg/II e Xbal e, em seguida, ligado no vetor de expressão pBBR1MCS-2 (SEQ ID NO: 49) cortado com BamHl e Xbal (Kovach e colaboradores, 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176). O plasmídeo pBBR1MCS-2::ABC (SEQ ID NO: 40) resultante tem um tamanho de 8409 pares de bases. A ligação, bem como a transformação de células de E. coli quimicamente competentes (Gibco-BRL, Karlsruhe) foi efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista. A autenticidade da inserção foi verificada por meio de análise de sequência de DNA.
[000327] A transformação de Pseudomonas putida KT2440 e GPp104 com o vetor pBBR1MCS-2::ABC foi efetuada tal como descrito acima (Iwasaki e colaboradores Biosci. Biotech. Biochem. 1994.58(5):851- 854). O DNA de plasmídeos de cada 10 clones foi isolado e analisado. As cepas obtidas, portando plasmídeos foram mencionadas de P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC ou P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC. 3. Construção de um vetor pBBR1MCS-2::ABM para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB e pa1131 de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 em Pseudomonas putida
[000328] Para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB e pa1131 de Pseudomonas aeruginosa DSM1707, construiu-se o plasmídeo pBBR1MCS-2::ABM (SEQ ID NO: 42). Para isso, o operon sintético rhlAB-pa1131 SEQ ID NO: 41) da empresa GeneArt AG (Regensburg) foi sintetizado e clonado intermediariamente no vetor comercial pMA (GeneArt AG). A base para a síntese foi a sequência genômica já conhecida da Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partindo do vetor pMA::ABM, o operon sintético foi cortado do vetor por meio de Bg/II e Xbal e, em seguida, ligado no vetor de expressão pBBR1MCS-2 (SEQ ID NO: 49) cortado com BamHl e Xbal (Kovach e colaboradores, 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176). O plasmídeo pBBR1MCS-2::ABC (SEQ ID NO: 40) resultante tem um tamanho de 8702 pares de bases. A ligação, bem como a transformação de células de E. coli DH5α quimicamente competentes (Gibco-BRL, Karlsruhe) foi efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista. A autenticidade da inserção foi verificada por meio de análise de sequência de DNA.
[000329] A transformação de Pseudomonas putida KT2440 e GPp104 com o vetor pBBR1MCS-2::ABM foi efetuada tal como descrito acima (Iwasaki e colaboradores Biosci. Biotech. Biochem. 1994.58(5):851- 854). O DNA de plasmídeos de cada 10 clones foi isolado e analisado. As cepas obtidas, portando plasmídeos foram mencionadas de P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM ou P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABM. 4. Quantificação da produção de ramnolipídeos através de cepas de P. putida recombinante
[000330] As cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2; P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB; P. putida KT2440 pBBR1MCS- 2::ABC; P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM; P. putida GPp104 pBBR1MCS-2; P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB, P. putida GPp104pBBR1MCS-2::ABC e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABM foram cultivadas em placas LB-ágar-kanamicina (50 μg/mL).
[000331] Para a produção dos ramnolipídeos, foi usado o meio designado a seguir como meio CMP. Esse consiste em 2% (p/v) de glicose, 0,007% (p/v) de KH2PO4, 0,11% de Na2HPO4 x 2 H2O, 0,2% (p/v) de NaNO3, 0,04% (p/v) de MgSO4 x H2O, 0,01% (p/v) de CaCl2 x 2 H2O e 0,2% (v/v) de uma solução de oligoelementos. Essa consiste em 0,2% (p/v) de FeSO4 x 7 H2O, 0,15% (p/v) de MnSO4 x H2O e 0,06% (p/v) de (NH4)MO7O24 x 4 H2O. O valor de pH do meio teve o pH ajustado para 6,7 com NaOH e o meio foi esterilizado, a seguir, por meio de autoclave (121oC, 20 minutos). Não foi necessário um ajuste do valor de pH durante o cultivo.
[000332] Para pesquisar a produção de ramnolipídeos no balão agitador, preparou-se inicialmente uma pré-cultura. Para essa finalidade, foi usada uma alça de inoculação de uma cepa recentemente riscada na placa de ágar LB e 10 mL de meio LB foram inoculados em um balão Erlenmeyer de 100 mL. Todas as cepas de P. putida recombinantes foram cultivadas no meio LB, ao qual foram acrescentados 50 μg/mL de kanamicina. O cultivo das cepas foi efetuado a 30oC e 200 rpm durante a noite.
[000333] As pré-culturas foram usadas, para inocular 50 mL de meio CMP no balão Erlenmeyer de 250 mL (OD600 inicial de 0,1). As culturas foram cultivadas com 200 rpm e 30oC por no máximo 120 horas. No intervalo de 24 horas, uma amostra de 1 mL de caldo foi retirada do balão de cultura. A preparação da amostra para as próximas análises cromatográficas foi efetuada da seguinte maneira:
[000334] Com uma pipeta de deslocamento (Combitip), 1 mL de acetona foi previamente introduzido em um recipiente de reação de 2 mL e o recipiente de reação foi imediatamente fechado para minimizar a evaporação. Seguiu-se a adição de 1 mL de caldo. Depois do turbilhonamento do caldo/mistura de acetona, essa foi centrifugada durante 3 minutos com 13.000 rpm e 800 μL do sobrenadante foram transferidos para um recipiente HPLC.
[000335] Para a detecção e a quantificação de ramnolipídeos, foi utilizado um detector Evaporative Light Scattering Detektor (Sedex LT-ELSD modelo 85LT). A própria medição foi efetuada por meio da Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, Califórnia) e com a coluna Zorbax SB-C8 Rapid Resolution (4,6 x 150 mm, 3,5 μm, Agilent). O volume de injeção importou em 5 μL e a duração do método era de 20 minutos. Como fase móvel foi usado 0,1% de TFA (ácido trifluoracético, solução A) e metanol (solução B). A temperatura da coluna importou em 40oC. Como detectores serviram o ELSD (temperatura do detector 60oC) e o DAD (detector de arranjo de diodos, 210 nm). O gradiente usado no método era:
Figure img0003
Figure img0004
[000336] Enquanto P. putida KT2440 pBBR1MCS-2 e GPp104 pBBR1MCS-2 não produzem ramnolipídeos, nas cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB, P. putida KT2440 pBBR1MCS- 2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABM foi possível verificar a formação de diversas espécies de ramnolipídeos (Figura 2 e 3).
[000337] Através da introdução da pBBR1MCS-2::AB ou pBBR1MCS- 2::ABM in P. putida, puderam ser gerados monoramnosil-lipídeos (Figura 3). Visto que não havia qualquer material de referência para os monoramnosil-lipídeos, a identificação dos produtos foi efetuada através da análise dos correspondentes vestígios de massa e dos espectros MS2 em LC-MS.
[000338] Caso adicionalmente rhlC (pBBR1MCS-2::ABC) foi introduzido nas cepas, então produziram-se mono- e diramnosil-lipídeos (Figura 2).
[000339] A comparação direta da formação de ramnolipídeos por P. putida pBBR1MCS-2::AB ou P. putida pBBR1MCS-2::ABM mostra, que a coexpressão de P. aeruginosa p3111 com P. aeruginosa rhlAB leva a uma melhora da biossíntese de ramnolipídeos (Figura 3). Enquanto as cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB tinham produzido cerca de 39 (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB) ou 23 áreas de pico de ramnolipídeos/OD 600 nm (P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB) depois de 120 horas, as cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM e P. putida GPp104 pBBR1MCS- 2::ABM formaram cerca de 50 (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM) ou 62 áreas de pico de ramnolipídeos/OD 600 nm (P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABM) depois de 120 horas.
[000340] Caso a síntese de monoramnosil-lipídeo das cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABM foi comparada, então no mutante PHA-negativo P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABM puderam ser detectadas 62 áreas de pico/OD 600 nm (120 horas de cultivo) e com P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM 50 áreas/OD 600 nm de monoramnosil-lipídeos (Figura 3).
[000341] Uma análise comparativa da formação de diramnosil-lipídeos (mg/L/OD 600 nm) nas cepas P. putida KT2440 e GPp104 mostrou igualmente uma formação mais forte dos diramnosil-lipídeos na cultura de fundo PHA-negativa da P. putida GPp104. A P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC formou em média 113 mg/L/OD 600 nm de diramnosil-lipídeos (95 horas), ao passo que com P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC foram detectados somente 55 mg/L/OD 600 nm de diramnosil-lipídeos depois de 96 horas (Figura 2).
[000342] Assim, foi possível mostrar que o uso de uma cultura de fundo enfraquecida com respeito à síntese PHA, leva a uma melhora da biossíntese de ramnolipídeos. 5. Construção de um vetor pBBR1MCS-2::ABMC para a expressão heteróloga dos genes rhlaA, rhlB, pa1131 e rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 em Pseudomonas putida
[000343] Para a expressão heteróloga dos genes rhlaA, rhlB, pa1131 e rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707, construiu-se o plasmídeo pBBR1MCS-2::ABMC (SEQ ID NO: 51). Para isso, o operon sintético rhlAB-pa1131-rhlC (SEQ ID NO: 50) da empresa GeneArt AG (Regensburg) foi sintetizado e clonado intermediariamente no vetor comercial pMA (GeneArt AG). A base para a síntese era a sequência genômica já conhecida da Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partindo do vetor pMA::ABMC, o operon sintético foi cortado do vetor por meio de Bg/II e Xbal e, em seguida, ligado no vetor de expressão pBBR1MCS-2 (SEQ ID NO: 49 cortado com BamHI e Xbal (Kovach e colaboradores, 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176). O plasmídeo pBBR1MCS-2::ABMC (SEQ ID NO: 51) resultante tem um tamanho de 9663 pares de bases. A ligação, bem como a transformação de células de E. coli DH5α quimicamente competentes (Gibco-BRL, Karlsruhe) foi efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista. A autenticidade da inserção foi verificada através da análise de sequência de DNA.
[000344] A transformação de Pseudomonas putida KT2440 e GPp104 com o vetor pBBR1MCS-2::ABMC foi efetuada tal como descrito acima (Iwasaki e colaboradores Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851- 854). O DNA de plasmídeos de cada 10 clones foi isolado e analisado. As cepas obtidas, portando plasmídeos foram mencionadas de P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC ou P. putida GPp104 pBBR1MCS- 2::ABMC. 6. Comparação qualitativa da produção de ramnolipídeos através de cepas de P. putida recombinantes e cepas de P. aeruginosa
[000345] As cepas recombinantes P. putida GPp104 pBBR1MCS-2 e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABMC bem como P. aeruginosa DSM 19880 foram cultivadas em placas de ágar-LB-kanamicina (50 μg/mL; P. putida) ou de ágar-LB (P. aeruginosa).
[000346] Para a produção dos ramnolipídeos utilizou-se o meio designado a seguir como meio CMP. Este consistiu em 2% (p/v) de glicose, 0,007% (p/v) de KH2PO4, 0,11% de Na2HPO4 x 2 H2O, 0,2% (p/v) de NaNO3, 0,04% (p/v) de MgSO4 x H2O, 0,01% (p/v) de CaCl2 x 2 H2O e 0,2% (v/v) de uma solução de oligoelementos. Essa consiste em 0,2% (p/v) de FeSO4 x 7 H2O, 0,15% (p/v) de MnSO4 x H2O e 0,06% (p/v) de(NH4)MO7O24 x 4 H2O. O meio teve o valor de pH ajustado para 6,7 com NaOH e o meio foi esterilizado, a seguir, por meio de uma autoclave (121oC, 20 minutos). Não foi necessário um ajuste do valor de pH durante o cultivo.
[000347] Para pesquisar a produção de ramnolipídeos no balão agitador, preparou-se inicialmente uma pré-cultura. Para essa finalidade, foi usada uma alça de inoculação de uma cepa recentemente riscada na placa de ágar LB e 10 mL de meio LB foram inoculados em um balão Erlenmeyer de 100 mL. As cepas de P. putida recombinantes foram cultivadas no meio LB, ao qual foram acrescentados 50 μg/mL de kanamicina. P. aeruginosa foi cultivada no meio LB. O cultivo das cepas foi efetuado a 30oC e 200 rpm durante a noite.
[000348] As pré-culturas foram usadas, para inocular 50 mL de meio CMP no balão Erlenmeyer de 250 mL (OD600 inicial de 0,1). As culturas foram cultivadas com 200 rpm e 30oC por no máximo 120 horas. No intervalo de 24 horas, uma amostra de 1 mL de caldo foi retirada do balão de cultura. A preparação da amostra para as próximas análises cromatográficas foi efetuada da seguinte maneira:
[000349] Com uma pipeta de deslocamento (Combitip), 1 mL de acetona foi previamente introduzido em um recipiente de reação de 2 mL e o recipiente de reação foi imediatamente fechado para minimizar a evaporação. Seguiu-se a adição de 1 mL de caldo. Depois do turbilhonamento do caldo/mistura de acetona, essa foi centrifugada durante 3 minutos com 13.000 rpm e 800 μL do sobrenadante foram transferidos para um recipiente HPLC.
[000350] Para a identificação dos produtos resultantes, pipetaram- se 5 μL de em uma instalação UPLC Accela (Thermo Scientific, Dreieich). As substâncias a serem investigadas foram analisadas com uma coluna semi UPLC "Pursuit XRs ULTRA (C8, 2,8 μm, 2,1 x 100 mm) Varian, Darmstadt). A separação foi efetuada dentro de 25 minutos por meio de um gradiente consistindo na fase móvel A1 (H2O, 0,1% (v/v) de TFA) e na fase móvel B1 (metanol, 0,1% (v/v) de TFA) com uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min a 40oC. O decurso temporal do gradiente era o seguinte: tempo [minutos] fase móvel A1 [%] fase móvel B1 [%]
Figure img0005
[000351] A detecção foi efetuada por meio do detector DAD na faixa de comprimento de onda de 200 - 600 nm, bem como de forma seletiva em massa com um espectrômetro de massa FT-ICR de alta resolução LTQ-FT (Thermo Scientific, Dreieich) na faixa de scan m/z de 100 - 1000. A ionização foi efetuada por meio de ESI (ionização de eletrospray). As massas exatas e Fórmulas químicas empíricas foram determinadas com auxílio do analisador de massa FT-ICR, com uma resolução de R = 10000 e uma precisão de medição de < 2 ppm. A identificação dos produtos foi efetuada através da análise dos correspondentes vestígios de massa e dos espectros MS2. Para poder comparar as cepas, as áreas de pico das substâncias correspondentes foram confrontadas. Tal como mostra a Figura 4, a cepa P. putida GPp104 pBBR1MCS-2 não formou quaisquer ramnolipídeos. P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABMC bem como P. aeruginosa DSM 19880 formaram ramnolipídeos, sendo que a proporção entre os di- e monoramnosil-lipídeos formados na P. putida GPp104 pBBR1MCS- 2::ABMC era de aproximadamente 4:1, na P. aeruginosa DSM 19880, de aproximadamente 2:1. Além disso, a cepa P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABMC, ao contrário de P. aeruginosa DSM 19880, não formou quaisquer ou somente muito poucos ramnolipídeos com um radical determinado por R1 e R2 derivado de ácido 3-hidroxioctanoil-3- hidroxidecanoico ou ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxioctanoico. 7. Construção de um vetor pBBR1MCS-2::rfbBDAC e pBBR1MCS- 2::ABCrfbBDAC para a expressão heteróloga em Pseudomonas putida
[000352] Na empresa Trenzyme GmbH (Konstanz), o operon da biossíntese de ramnose rfbBDAC foi amplificado partindo do DNA cromossômica de Pseudomonas putida KT2440. Para isso, foram usados os seguintes iniciadores:
[000353] RL1: 5'- TATATATAGAATTCGCGTCATCTGTCTACGACAACAC -3' (SEQ ID NO: 48)
[000354] RL2: 5'- TATATATAGAATTCGGCTGCGCTACCGCAGCCCTTC -3' (SEQ ID NO: 43)
[000355] O produto PCR obtido foi clonado intermediariamente no sistema Trenzyme's Alligator Cloning e transformado em E. coli DH5 α (New England Biolabs; Frankfurt). Vetores de diversos candidatos foram analisados e sequenciados. Após o sequenciamento bem-sucedido e sem falhas, o vetor foi cortado por meio de EcoRl e o fragmento alvo rfbBDAC foi isolado. Para uma outra clonagem intermediária, o vetor pBBR1MCS-2 (Kovach e colaboradores, 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176) foi cortado do mesmo modo e maneira. O fragmento alvo cortado (rfbBDAC) e o vetor cortado (pBBR1MCS-2) foram juntados através de ligação convencional. O vetor pBBR1MCS-2::rfbBDAC (SEQ ID NO: 45) resultante foi igualmente transformado em E. coli DH5α (New England Biolabs, Frankfurt). Alguns candidatos dos transformantes foram pesquisados com respeito à absorção eficiente do plasmídeo.
[000356] O vetor pBBR1MCS-2::rfbBDAC serviu como matriz para um PCR. Foram usados os seguintes oligonucleotídeos:
[000357] RL_XbaI-fw: 5'- TATATATATCTAGAATTAATGCAGCTGGCACGAC -3' (SEQ ID NO: 44)
[000358] RL_Xba_rev: 5'-GGCCGCTCTAGAACTAGTGGA -3' (SEQ ID NO: 46)
[000359] O PCR foi efetuado com a polimerase PhusionTM High- Fidelity Master Mix da New England Biolabs (Frankfurt). Ele foi efetuado de modo e maneira conhecidos pelo especialista. A sequência alvo (promotor Iac e rfbBDAC) foi clonada intermediariamente no sistema Trenzyme Alligator Cloning. Os transformantes E. coli DH5α New England Biolabs (Frankfurt) foram selecionados e o DNA do plasmídeo de diversos candidatos foi isolado e sequenciado. Depois que a sequência foi verificada e pesquisada com respeito à exatidão, o vetor foi cortado com Xbal. O fragmento alvo foi ligado com pBBR1MCS- 2::ABC igualmente cortado com Xbal (vide acima) por meio de métodos de ligação convencionais. O vetor alvo pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC (SEQ ID NO: 47) obtido tinha um tamanho de 12249 pares de bases. A inserção do vetor foi sequenciada. A execução do PCR, a verificação da amplificação bem-sucedida do PCR por meio de eletroforese com gel de agarose, marcação do DNA com brometo de etídio, determinação do tamanho do fragmento de PCR, purificação dos produtos de PCR e determinação da concentração de DNA foi efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista.
[000360] A transformação de Pseudomonas putida KT2440 e GPp104 com o vetor pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC foi efetuada tal como descrito acima (Iwasaki e colaboradores Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). O DNA do plasmídeo de cada 10 clones foi isolado e analisado. As cepas obtidas, portando plasmídeos são mencionadas de P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC. 8. Quantificação da produção de ramnolipídeos através de cepas de P. putida recombinante com e sem superexpressão do operon rfbBDAC
[000361] As cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2; P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1MCS- 2::ABC_rfbBDAC, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC são cultivadas em placas de ágar LB-kanamicina (50 μg/mL).
[000362] Para a produção dos ramnolipídeos, utiliza-se o meio designado a seguir como meio CMP. Este consiste em 2% (p/v) de glicose, 0,007% (p/v) de KH2PO4, 0,11% de Na2HPO4 x 2 H2O, 0,2% (p/v) de NaNO3, 0,04% (p/v) de MgSO4 x H2O, 0,01% (p/v) de CaCl2 x 2 H2O e 0,2% (v/v) de uma solução de oligoelementos. Esta consiste em 0,2% (p/v) de FeSO4 x 7 H2O, 0,15% (p/v) de MnSO4 x H2O e 0,06% (p/v) de (NH4)MO7O24 x 4 H2O. O meio tem o valor de pH ajustado para 6,7 com NaOH e o meio é esterilizado, a seguir, por meio de autoclave (121oC, 20 minutos). Não é necessário um ajuste do valor de pH durante o cultivo.
[000363] Para pesquisar a produção de ramnolipídeos no balão agitador, preparou-se inicialmente uma pré-cultura. Para essa finalidade, foi usada uma alça de inoculação de uma cepa recentemente riscada na placa de ágar LB e 10 mL de meio LB foram inoculados em um balão Erlenmeyer de 100 mL. Todas as cepas de P. putida recombinantes foram cultivadas no meio LB, ao qual foram acrescentados 50 μg/mL de kanamicina. O cultivo de cepas de P. putida foi efetuado a 30oC e 200 rpm durante a noite.
[000364] As pré-culturas são usadas, para inocular 50 mL de meio CMP no balão Erlenmeyer de 250 mL (OD600 inicial de 0,1). As culturas são cultivadas com 200 rpm e 30oC por no máximo 120 horas. No intervalo de 24 horas, uma amostra de 1 mL de caldo foi retirada do balão de cultura. A preparação da amostra para as próximas análises cromatográficas é efetuada da seguinte maneira:
[000365] Com uma pipeta de deslocamento (Combitip), 1 mL de acetona foi previamente introduzido em um recipiente de reação de 2 mL e o recipiente de reação foi imediatamente fechado para minimizar a evaporação. Seguiu-se a adição de 1 mL de caldo. Depois do turbilhonamento do caldo/mistura de acetona, essa foi centrifugada durante 3 minutos com 13.000 rpm e 800 μL do sobrenadante foram transferidos para um recipiente HPLC.
[000366] Para a detecção e para a quantificação de ramnolipídeos, utiliza-se um detector Evaporative Light Scattering (Sedex LT-ELSD modelo 85LT). A própria medição é efetuada por meio da Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, Califórnia) e com a coluna Zorbax SB-C8 Rapid Resolution (4,6 x 150 mm, 3,5 μm, Agilent). O volume de injeção importou em 5 μL e a duração do método é de 20 minutos. Como fase móvel é usado 0,1% de TFA (ácido trifluoracético, solução A) e metanol (solução B). A temperatura da coluna importa em 40oC. Como detectores servem o ELSD (temperatura do detector 60oC) e o DAD (detector de arranjo de diodos, 210 nm). O gradiente usado no método é: t [minutos] % em volume, de solução B fluxo [ml/minutos]
Figure img0006
[000367] Enquanto P. putida KT2440 pBBR1MCS-2 e GPp104 pBBR1MCS-2 não produzem quaisquer ramnolipídeos, nas cepas recombinantes de P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC; P. putida GPp104 pBBR1MCS- 2::ABC e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC pode ser verificada a formação de ramnolipídeos.
[000368] A P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC mostra em comparação com a P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC em comparação com P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC, um maior formação dos di- e monoramnosil-lipídeos. Isso indica nitidamente a influência positiva do aumento da expressão de rfbBDAC sobre a formação de mono- e diramnosil-lipídeos.
[000369] Comparando a biossíntese de mono- e diramnosil-lipídeos das cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC, então no mutante negativo PHA P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC é detectada um aumento da síntese de mono- e diramnosil-lipídeos.
[000370] Tal como já foi descrito acima, ao usar uma cultura de fundo inativada na síntese PHA, a biossíntese de ramnolipídeos aumenta. 9. Geração de E. coli recombinante W3110 pBBR1MCS-2:: ABC e E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCrfbBDAC
[000371] A transformação de E. coli W3110 foi efetuada tal como descrito acima (Miller JH. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Lab. Press; 1992) por meio de eletroporação. O DNA dos plasmídeos de cada 10 clones foi isolado e analisado. As cepas obtidas, portando os plasmídeos foram mencionadas de E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC e E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC. 10. Quantificação da produção de ramnolipídeos através de cepas de E. coli recombinantes com e sem superexpressão do operon rfbBDAC
[000372] As cepas recombinantes E. coli W3110 pBBR1MCS-2; E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC e E. coli W3110 pBBR1MCS- 2::ABC_rfbBDAC são cultivadas em placas de ágar LB-kanamicina (50 μg/mL).
[000373] Para a produção dos ramnolipídeos, utiliza-se o meio designado a seguir como meio CMP. Este consiste em 2% (p/v) de glicose, 0,007% (p/v) de KH2PO4, 0,11% de Na2HPO4 x 2 H2O, 0,2% (p/v) de NaNO3, 0,04% (p/v) de MgSO4 x H2O, 0,01% (p/v) de CaCl2 x 2 H2O e 0,2% (v/v) de uma solução de oligoelementos. Esta consiste em 0,2% (p/v) de FeSO4 x 7 H2O, 0,15% (p/v) de MnSO4 x H2O e 0,06% (p/v) de (NH4)MO7O24 x 4 H2O. O meio tem o valor de pH ajustado para 6,7 com NaOH e o meio é esterilizado, a seguir, por meio de autoclave (121oC, 20 minutos). Não é necessário um ajuste do valor de pH durante o cultivo.
[000374] Para pesquisar a produção de ramnolipídeos no balão agitador, preparou-se inicialmente uma pré-cultura. Para essa finalidade, foi usada uma alça de inoculação de uma cepa recentemente riscada na placa de ágar LB e 10 mL de meio LB foram inoculados em um balão Erlenmeyer de 100 mL. Todas as cepas de E coli recombinantes são cultivadas no meio LB, ao qual foram acrescentados 50 μg/mL de kanamicina. O cultivo de cepas de E. coli foi efetuado a 37oC e 200 rpm durante a noite. As pré-culturas foram usadas, para inocular 50 mL de meio CMP no balão Erlenmeyer de 250 mL (OD600 inicial de 0,1). As culturas são cultivadas com 200 rpm e 30oC por no máximo 120 horas. No intervalo de 24 horas, uma amostra de 1 mL de caldo foi retirada do balão de cultura. A preparação da amostra para as próximas análises cromatográficas foi efetuada da seguinte maneira:
[000375] Com uma pipeta de deslocamento (Combitip), 1 mL de acetona foi previamente introduzido em um recipiente de reação de 2 mL e o recipiente de reação foi imediatamente fechado para minimizar a evaporação. Seguiu-se a adição de 1 mL de caldo. Depois do turbilhonamento do caldo/mistura de acetona, essa foi centrifugada durante 3 minutos com 13.000 rpm e 800 μL do sobrenadante foram transferidos para um recipiente HPLC.
[000376] Para a detecção e a quantificação de ramnolipídeos, foi utilizado um detector Evaporative Light Scattering Detektor (Sedex LT- ELSD modelo 85LT). A própria medição foi efetuada por meio da Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, Califórnia) e com a coluna Zorbax SB-C8 Rapid Resolution (4,6 x 150 mm, 3,5 μm, Agilent). O volume de injeção importa em 5 μL e a duração do método é de 20 minutos. Como fase móvel foi usado 0,1% de TFA (ácido trifluoracético, solução A) e metanol (solução B). A temperatura da coluna importa em 40oC. Como detectores servem o ELSD (temperatura do detector 60oC) e o DAD (detector de arranjo de diodos, 210 nm). O gradiente usado no método é: t [min] % em volume, de solução B fluxo [mL/min]
Figure img0007
[000377] Enquanto a E. coli W3110 pBBR1MCS-2 não produz quaisquer ramnolipídeos, nas cepas recombinantes de E. coli pBBR1MCS-2::ABC e E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC pode ser verificada a formação de mono- e diramnosil-lipídeos, sendo que a E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC forma significativamente mais mono- e diramnosil-lipídeos do que a E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC. Isso mostra, que a expressão heteróloga de rhlABC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 leva à formação de mono- e diramnosil-lipídeos na E. coli. Isso mostra, além disso, a influência positiva do aumento da expressão de rfbBDAC sobre a formação de mono- e diramnosil-lipídeos. 11. Construção de um vetor pBBR1MCS-2::ABC-BTHII1077- II1080II1081 para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB e rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707, bem como dos genes BTHII1077, BTII1080 eBTII1081 de Burkholderia thailandensis E264 em Pseudomonas putida
[000378] Para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB e rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707, bem como dos genes BTH_II1077, BT_II1080 eBT_II1081 de Burkholderia thailandensis E264 em Pseudomonas putida, constroi-se o plasmídeo pBBR1MCS-2::ABC- BTH_II1077- II1080-II1081 (SEQ ID NO: 69). Para isso, o operon sintético BTH_II1077, BT_II1080 e BT_II1081 (SEQ ID NO: 70) da empresa DNA 2.0 (Menlo Park, CA, EUA) é sintetizado e clonado intermediariamente no vetor comercial pJ294 (DNA 2,0; Menlo Park, Califórnia). A base para a síntese é a sequência genômica da cepa B. thailandensis E264. Partindo do vetor pJ294-BTH II1074-II1080-II1081, o operon sintético é cortado deste vetor por meio de Xbal e, a seguir, ligado no vetor pBBR1MCS-2::ABC (SEQ ID NO: 40) igualmente cortado com Xbal. O vetor alvo pBBR1MCS-2::ABC-BHT_II1077-II1080- II1081 (SEQ ID NO: 40) obtido tem um tamanho de 13768 pares de bases. A inserção do vetor é sequenciada. A execução do PCR, a verificação da amplificação bem-sucedida do PCR por meio de eletroforese com gel de agarose, marcação do DNA com brometo de etídio, determinação do tamanho do fragmento PCR, purificação dos produtos PCR e determinação da concentração de DNA é efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista.
[000379] A transformação de Pseudomonas putida KT2440 e GPp104 com o vetor pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081 (SEQ ID NO: 69) é efetuada tal como descrito acima (Iwasaki e colaboradores Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). O DNA de plasmídeos de cada 10 clones é isolado e analisado. As cepas obtidas, portando os plasmídeos, são mencionadas de P. putida KT2440 pBBR1MCS- 2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081 ou P. putida GPp104 pBBR1MCS- 2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081. 12. Quantificação da produção de ramnolipídeos através de cepas de P. putida recombinantes com e sem superexpressão dos genes BTHII1077, BTII1080 e BT II1081 da B. thailandensis E264
[000380] As cepas P. putida recombinantes geradas nos exemplos 1, 2 e 11 - cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077- II1080-II1081, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077- II1080-II1081, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081 P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC und P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC- BTH_II1077- II1080-II1081 são cultivadas em placas de ágar LB- kanamicina (50 μg/mL).
[000381] Para a produção dos ramnolipídeos se utilizou o meio designado a seguir como meio M9. Esse meio consiste em 2% (p/v) de glicose, 0,3% (p/v) de KH2PO4, 0,679% de Na2HPO4, 0,05% (p/v) de NaCl, 0,2% (p/v) de NH4Cl, 0,049% (p/v) de MgSO4 x 7 H2O e 0,1% (v/v) de uma solução de oligoelementos. Esta consiste em 1,78% (p/v) de FeSO4 x 7 H2O, 0,191% (p/v) de MnSO4 x 7 H2O, 3,65% (p/v) de HCl, 0,187% (p/v) de ZnSO4 x 7 H2O, 0,084% (v/v) de Na-EDTA x 2 H2O, 0,03% (v/v) de H3BO3, 0,025% (p/v) de Na2MoO4 e 0,47% (p/v) de CaCl2 x 2 H2O. O meio tem o valor de pH ajustado para 7,4 com NH4O e o meio é esterilizado, a seguir, por meio de autoclave (121oC, 20 minutos). Não é necessário um ajuste do valor de pH durante o cultivo.
[000382] Para pesquisar a produção de ramnolipídeos no balão agitador, preparou-se inicialmente uma pré-cultura. Para essa finalidade, foi usada uma alça de inoculação de uma cepa recentemente riscada na placa de ágar LB e 10 mL de meio LB foram inoculados em um balão Erlenmeyer de 100 mL. Todas as cepas de P. putida recombinantes são cultivadas no meio LB, ao qual foram acrescentados 50 μg/mL de kanamicina. O cultivo de cepas de P. putida foi efetuado a 37oC e 200 rpm durante a noite.
[000383] As pré-culturas foram usadas, para inocular 50 mL de meio M9 (+ 50 μg/mL de kanamicina) no balão Erlenmeyer de 250 mL (OD600 inicial de 0,1). As culturas são cultivadas com 200 rpm e 30oC. No intervalo de 24 horas, uma amostra de 1 mL de caldo foi retirada do balão de cultura. A preparação da amostra para as próximas análises cromatográficas e a própria análise cromatográfica são efetuadas tal como descrito no exemplo 4.
[000384] Demonstra-se, que as cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077- II1080-II1081 e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077- II1080-II1081 formam substancialmente mais monoramnosil-lipídeos do que as cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB e P. putida GPp104 pBBR1MCS- 2::AB. Isso comprova, que o aumento de BTH_II1077- II1080-II1081 de B. thailandensis E264 aumenta a formação de monoramnosil-lipídeos em cepas de P. putida com os genes rhlAB de Pseudomonas aeruginosa DSM1707.
[000385] Além disso, demonstra-se, que as cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081 e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081 formam substancialmente mais mono- e diramnosil-lipídeos do que as cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC e P. putida GPp104 pBBR1MCS- 2::ABC. Isso comprova, que o aumento de BTH_II1077- II1080-II1081 de B. thailandensis E264 aumenta a formação de mono- e diramnosil- lipídeos em cepas de P. putida com os genes rhlABC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707.
[000386] Finalmente, demonstra-se, que o enfraquecimento da formação de poli-hidroxibutirato na cultura de fundo P. putida GPp104 em relação à cepa P. putida KT2440 leva a um aumento da formação de ramnolipídeos, visto que as cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS- 2::AB, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077- II1080-II1081 e P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081 são capazes de formar substancialmente menos mono-() ou mono- e diramnosil-lipídeos () do que as cepas de controle correspondentes P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077- II1080-II1081 e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081. 13. Construção de um vetor pBBR1MCS-2::ABCM para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB, pa1131 e rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 em Pseudomonas putida
[000387] Para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB, pa1131 e rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707, construiu-se o plasmídeo pBBR1MCS-2::ABCM (SEQ ID NO: 58). Para isso, o gene pa1131 (SEQ ID NO: 59), partindo do DNA genômico da cepa Pseudomonas aeruginosa (PAO1 (DSM 1707) foi amplificado com os oligonucleotídeos
[000388] MFS2.0_xbaI_fw: 5'- AGGAAATCTAGATGAGAGGCCGGCAAGGATAC-3' (SEQ ID NO: 60)
[000389] MFS2.0_XbaI_rev:5'- CCAGGTTCTAGACGCCAGGATTGAACAGTACC-3' (SEQ ID NO: 61).
[000390] A amplificação do produto PCR (1483 pares de bases) foi efetuada com a polimerase PhusionTM High-Fidelity Master Mix da New England Biolabs (Frankfurt). O produto PCR foi cortado com Xbal e o vetor pBBR1MCS-2::ABC (SEQ ID NO: 40) igualmente cortado com Xbal, foi ligado por meio do kit Fast Link Ligation (Epicentre Technologies; Madison, WI, EUA). O vetor alvo pBBR1MCS-2::ABCM (SEQ ID NO: 58) obtido tem um tamanho de 9892 pares de bases. A inserção do vetor foi sequenciada. O DNA cromossômica foi isolado por meio do kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen; Hilden) de acordo com as instruções do fabricante. A execução do PCR, a verificação da amplificação bem-sucedida por meio de eletroforese em gel de agarose, a marcação do DNA com brometo de etídio, a determinação do tamanho do fragmento PCR, purificação dos produtos PCR e a determinação da concentração de DNA foi efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista.
[000391] A transformação de Pseudomonas putida KT2440 e GPp104 com o vetor pBBR1MCS-2::ABCM foi efetuada tal como descrito acima (Iwasaki e colaboradores Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851- 854). O DNA dos plasmídeos de cada 10 clones foi isolado e analisado. As cepas obtidas, portando os plasmídeos, foram mencionadas de P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABCM ou P. putida GPp104 pBBR1MCS- 2::ABCM. 14. Quantificação da produção de ramnolipídeos através de cepas de P. putida recombinantes com e sem superexpressão do gene pa1131 de Pseudomonas aeruginosa DSC 1707
[000392] As cepas recombinantes geradas nos exemplos 2 e 13 - cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABCM, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABCM foram cultivadas em placas de ágar LB-kanamicina (50 μg/mL). O subsequente cultivo para a produção dos ramnolipídeos foi efetuado tal como descrito no exemplo 12.
[000393] A preparação das amostras para as subsequentes análises cromatográficas e as próprias análises cromatográficas foram efetuadas tal como descrito no exemplo 4. Os resultados estão ilustrados na seguinte tabela.
[000394] Ilustração de di- e monoramnosil-lipídeos através de cepas de P. putida com e sem superexpressão do gene pa1131 de P. aeruginosa após a incubação de 48 horas
Figure img0008
Figure img0009
[000395] Os resultados mostram, que a superexpressão do gene pa1131 de P. aeruginosa nas duas culturas de fundo (KT2440: tipo selvagem ou GPp104 com formação de poli-hidroxibutirato inativado) leva a uma formação aumentada de di- e monoramnosil-lipídeos. Os resultados mostram, além disso, que o enfraquecimento da formação de poli-hidroxibutirato em GPp104 leva geralmente a uma formação aumentada de ramnosil-lipídeos. 15. Construção de um vetor pEC-X99A::AB para a expressão heteróloga do gene rhlA e rhlB de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 em Corynebacterium glutamicum
[000396] Para a expressão heteróloga dos genes rhlA e rhlB de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 em Corynebacterium glutamicum, constroi-se o plasmídeo pEC-XT99A::AB (SEQ ID NO: 52). Para isso, o operon rhlAB (SEQ ID NO: 37) sintético da empresa GeneArt AG (Regensburg) foi sintetizado e clonado intermediariamente no vetor comercial pMA (GeneArt AG). A base para a síntese foi a sequência genômica já conhecida da Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partindo do vetor pMA::AB, o operon sintético foi cortado do vetor por meio de Bg/II e Xbal e, em seguida, ligado no vetor de expressão pEC- XT99A (patente norte-americana 7118904) cortado com BamHl e Xbal. O plasmídeo pEC-XT99A::AB (SEQ ID NO: 52) resultante tem um tamanho de 9793 pares de bases. A ligação, bem como a transformação de células de E. coli DH5α (Gibco-BRL, Karlsruhe) quimicamente competentes foi efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista. A autenticidade da inserção foi verificada por meio de análise de sequência de DNA.
[000397] A transformação de C. glutamicum ATCC13032 com o vetor pEC-XT99A::AB é efetuada tal como descrito acima (Liebl e colaboradores, FEMS Microbiol. Lettl 53:299-303 (1989)). A seleção dos transformantes é efetuada em placas de ágar LBHIS (18,5 g/L de infusão de cérebro-coração boullion, 0,5 M de sorbitol, 5 g/L de bacto- tripton, 2,5 g/L de bacto-extrato de levedura, 5 g/L de NaCl e 18 g/L de bacto-ágar, suplementado com 5 mg/L de tetraciclina). As placas foram incubadas durante dois dias a 33oC. A cepa obtida, contendo plasmídeos, é mencionada de C. glutamicum pEC-XT99A::AB. 16. Construção de um vetor pEC-XT99A::ABC para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB e rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 em Corynebacterium glutamicum
[000398] Para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB e rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 em Corynebacterium glutamicum, constroi-se o plasmídeo pEC-XT99A::ABC (SEQ ID NO: 53). Para isso, o operon rhlABC sintético (SEQ ID NO: 39) da empresa GeneArt AG (Regensburg) foi sintetizado e clonado intermediariamente no vetor comercial pMA (GeneArt AG). A base para a síntese foi a sequência genômica já conhecida da Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partindo do vetor pMA::ABC, o operon sintético é cortado do vetor por meio de Bg/II e Xbal e, em seguida, ligado no vetor de expressão pEC- XT99A cortado com BamHl e Xbal (patente norte-americana 7118904). O plasmídeo pEC-XT99A::ABC (SEQ ID NO: 53) resultante tem um tamanho de 10780 pares de bases. A ligação, bem como a transformação de células de E. coli DH5α (Gibco-BRL, Karlsruhe) quimicamente competentes é efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista. A autenticidade da inserção é verificada por meio de análise de sequência de DNA.
[000399] A transformação de C. glutamicum ATCC 13032 com o vetor pEC-XT99A::ABC é efetuada tal como descrito acima (Liebl e colaboradores, FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). A seleção dos transformantes é efetuada em placas de ágar LBHIS (18,5 g/L de infusão de cérebro-coração boullion, 0,5 M de sorbitol, 5 g/L de bacto- tripton, 2,5 g/L de bacto-extrato de levedura, 5 g/L de NaCl e 18 g/L de bacto-ágar, suplementado com 5 mg/L de tetraciclina). As placas foram incubadas durante dois dias a 33oC. A cepa obtida, contendo plasmídeos, é mencionada de C. glutamicum pEC-XT99A::ABC. 17. Construção de um vetor pEC-XT99A::ABM para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB e pa1131 de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 em Corynebacterium glutamicum
[000400] Para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB e pa1131 de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 em Corynebacterium glutamicum, constroi-se o plasmídeo pEC-XT99A::ABM (SEQ ID NO: 54). Para isso, o operon rhlABM sintético (SEQ ID NO: 41) da empresa GeneArt AG (Regensburg) foi sintetizado e clonado intermediariamente no vetor comercial pMA (GeneArt AG). A base para a síntese foi a sequência genômica já conhecida da Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partindo do vetor pMA::ABM, o operon sintético é cortado do vetor por meio de Bg/II e Xbal e, em seguida, ligado no vetor de expressão pEC-XT99A cortado com BamHl e Xbal (patente norte- americana 7118904). O plasmídeo pEC-XT99A::ABM (SEQ ID NO: 54) resultante tem um tamanho de 11073 pares de bases. A ligação, bem como a transformação de células de E. coli DH5α (Gibco-BRL, Karlsruhe) quimicamente competentes é efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista. A autenticidade da inserção é verificada por meio de análise de sequência de DNA.
[000401] A transformação de C. glutamicum ATCC 13032 com o vetor pEC-XT99A::ABM é efetuada tal como descrito acima (Liebl e colaboradores, FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). A seleção dos transformantes é efetuada em placas de ágar LBHIS (18,5 g/L de infusão de cérebro-coração boullion, 0,5 M de sorbitol, 5 g/L de bacto- tripton, 2,5 g/L de bacto-extrato de levedura, 5 g/L de NaCl e 18 g/L de bacto-ágar, suplementado com 5 mg/L de tetraciclina). As placas foram incubadas durante dois dias a 33oC. A cepa obtida, contendo plasmídeos, é mencionada de C. glutamicum pEC-XT99A::ABM. 18. Construção de um vetor pEC-XT99A::ABMC para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB, pa1131 e rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 em Corynebacterium glutamicum
[000402] Para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB, pa1131 e rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 em Corynebacterium glutamicum, constroi-se o plasmídeo pEC-XT99A::ABCM (SEQ ID NO: 55). Para isso, o gene pa1131 (SEQ ID NO: 59) é amplificado partindo de DNA genômicos da cepa Pseudomonas aeruginosa PAO1 (DSM 1707) com os oligonucleotídeos
[000403] MFS2.0_xbaI_fw: 5'- AGGAAATCTAGATGAGAGGCCGGCAAGGATAC-3' (SEQ ID NO: 60)
[000404] MFS2.0_XbaI_rev:5'- CCAGGTTCTAGACGCCAGGATTGAACAGTACC-3' (SEQ ID NO: 61).
[000405] A amplificação do produto PCR (1483 pares de bases) foi efetuada com a polimerase PhusionTM High-Fidelity Master Mix da New England Biolabs (Frankfurt). O produto PCR foi cortado com Xbal e ligado no vetor pBBR1MCS-2::ABC (SEQ ID NO: 40) igualmente cortado com Xbal, por meio do kit de ligação Fast Link Ligation (Epicentre Technologies; Madison, WI, EUA). O vetor alvo pEC- XT99A::ABCM (SEQ ID NO: 55) obtido, tem um tamanho de 12263 pares de bases. A inserção do vetor foi sequenciada. O DNA cromossômica foi isolado por meio do kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen; Hilden) de acordo com as instruções do fabricante. A execução do PCR, a verificação da amplificação bem-sucedida do PCR por meio de eletroforese com gel de agarose, a marcação do DNA com brometo de etídio, a determinação do tamanho do fragmento PCR, a purificação dos produtos PCR e a determinação da concentração de DNA foi efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista.
[000406] A transformação de C. glutamicum ATCC 13032 com o vetor pEC-XT99A::ABCM é efetuada tal como descrito acima (Liebl e colaboradores, FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). A seleção dos transformantes é efetuada em placas de ágar LBHIS (18,5 g/L de infusão de cérebro-coração boullion, 0,5 M de sorbitol, 5 g/L de bacto- tripton, 2,5 g/L de bacto-extrato de levedura, 5 g/L de NaCl e 18 g/L de bacto-ágar, suplementado com 5 mg/L de tetraciclina). As placas foram incubadas durante dois dias a 33oC. A cepa obtida, contendo plasmídeos, é mencionada de C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM. 19. Construção de um vetor pVWEX1::rfbBDAC para a expressão heteróloga em C. glutamicum
[000407] Para a expressão heteróloga do gene rfbBDAC de P. putida sob controle do promotor lac em C. glutamicum, foi construido o vetor pVWEX1::rfbBDAC (SEQ ID NO: 57). Para isso, o vetor pBBR1MCS- 2::rfbBDAC (SEQ ID NO: 45) é digerido com Xbal e o gene rfbBDAC de P. putida KT2440 e o fragmento contendo o promotor lac (3840 pares de bases) são ligados no vetor pVWEX1 (SEQ ID NO: 56) digerido com Xbal. O plasmídeo pVWEX1::rfbBDAC (SEQ ID NO: 57) resultante tem um tamanho de 12311 pares de bases. A ligação, bem como a transformação de células de E. coli DH5α (Gibco-BRL, Karlsruhe) quimicamente competentes é efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista. A autenticidade da inserção é verificada por meio de análise de sequência de DNA.
[000408] A transformação de C. glutamicum ATCC13032 pEC-XT99A, ATCC13032 pEC-XT99A::AB, ATCC13032 pEC-XT99A::ABM, ATCC13032 pEC-XT99A::ABC e ATCC13032 pEC-XT99A::ABCM com o vetor pVWEX1::rfbBDAC é efetuada tal como descrito acima (Liebl e colaboradores, FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). A seleção dos transformantes é efetuada em placas de ágar LBHIS (18,5 g/L de infusão de cérebro-coração boullion, 0,5 M de sorbitol, 5 g/L de bacto- tripton, 2,5 g/L de bacto-extrato de levedura, 5 g/L de NaCl e 18 g/L de bacto-ágar, suplementado com 5 mg/L de kanamicina). As placas foram incubadas durante dois dias a 33oC. As cepas obtidas, contendo plasmídeos, são mencionadas de C. glutamicum pEC-XT99A pVWEX1: :rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::AB pVWEX1: :rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM pVWEX1: :rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC pVWEX1: :rfbBDAC e C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pVWEX1: :rfbBDAC. 20. Quantificação da produção de ramnolipídeos através de cepas de C. glutamicum recombinante
[000409] As cepas C. glutamicum recombinantes geradas nos exemplos 15 a 19 - cepas C. glutamicum pEC-XT99A, C. glutamicum pEC-XT99A::AB, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC, C. glutamicum pEC- XT99A::ABM, C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM, C. glutamicum pEC- XT99A pVWEX1::rfbBDAC, C. pVWEX1::rfbBDAC, são cultivadas em placas mg/L de tetraciclina ou 5 mg/L de tetraciclina e 25 mg/L de kanamicina. Para pesquisar a produção de ramnolipídeos no balão agitador, preparam-se inicialmente pré-culturas. Para isso, utiliza-se uma alça de inoculação de uma cepa recentemente riscada na placa de ágar LBHIS e inoculam-se 10 mL de meio LBHIS (18,5 g/L de infusão de cérebro- coração boullion, 0,5 M de sorbitol, 5 g/L de bacto-triptona, 2,5 g/L de bacto-extrato de levedura e 5 g/L de NaCl, suplementado com 5 mg/L de tetraciclina ou 5 mg/L de tetraciclina e 25 mg/L de kanamicina) em um balão Erlenmeyer de 100 mL. O cultivo das cepas é efetuado a 33oC e 200 rpm durante a noite. Na manhã seguinte, 50 mL de meio CGXII (com 5 mg/L de tetraciclina ou 5 mg/L de tetraciclina e 25 mg/L de kanamicina) em um balão Erlenmeyer de 500 mL com chicanas são inoculados com 1 mL da pré-cultura (OD600 inicial 0,1). Meio CGXII:
[000410] 20 g/L de (NH4)2SO4 (Merck)
[000411] 5 g/L de ureia (Merck)
[000412] 1 g/L de KH2PO4 (Merck)
[000413] 0,25 g/L de MgSO4 . 7 H2O (Merck)
[000414] 10 mg/L de CaCl2 (Merck)
[000415] 42 g/L de MOPS (Roth)
[000416] 0,2 mg/L de biotina (Merck)
[000417] 1 ml/L de traços de solução salina
[000418] ajustar pH 7 com NaOH
[000419] depois de autoclavar, acrescentar 1 ml/L de ácido protocatecuico (30 g/L dissolvidos em NaOH diluído, esterilizado) e 40 g/L de glicose (Merck). Traços de solução salina:
[000420] 10 g/L de FeSO4 • 7 H2O (Merck)
[000421] 10 g/L de MnSO4 • H2O (Merck)
[000422] 1 g/L de ZnSO4 • 7 H2O (Merck)
[000423] 0,2 g/L de CuSO4 • 5 H2O (Merck)
[000424] 20 mg/L de NiCh • 6 H2O (Merck)
[000425] acidificar para dissolver com HCl para pH 1.
[000426] As culturas são cultivadas em 200 rpm e 33oC até uma densidade ótica (600 nm) de 0,4 - 0,6. Nessa densidade ótica as culturas são induzidas por meio da adição de IPTG (isopropil-β- tiogalactopiranosídeo; 1 mM de concentração final). A expressão seguinte é igualmente efetuada a 33oC e 200 rpm durante 72 horas. No intervalo de 24 horas, retira-se uma amostra de 1 mL de caldo do balão de cultura. A preparação da amostra para as análises cromatográficas seguintes e as próprias análises cromatográficas são efetuadas tal como descrito no exemplo 4.
[000427] Enquanto C. glutamicum pEC-XT99A não produz quaisquer ramnolipídeos, nas cepas recombinantes C. glutamicum pEC- XT99A::AB, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC, C. glutamicum pEC- XT99A::ABM e C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pode ser detectada a formação de ramnolipídeos. Com base em materiais de referência, demonstra-se, que C. glutamicum pEC-XT99A::AB e C. glutamicum pEC-XT99A::ABC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM e C. glutamicum pec-XT99A::ABCM são capazes de formar diramnosil-lipídeos e monoramnosil-lipídeos. Além disso, demonstra-se, que C. glutamicum pEC-XT99A::ABM e C. glutamicum pec-XT99A::ABCM são capazes de formar mais monoramnosil-lipídeos ou diramnosil-lipídeos e monoramnosil-lipídeos do que as respectivas cepas de referência, C. glutamicum pEC-XT99A::AB e C. glutamicum pEC-XT99A::ABC sem aumento do gene pa1131 de Pseudomonas aeruginosa.
[000428] Além disso, demonstra-se, que as cepas C. glutamicum pEC-XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDAC e C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pVWEX1::rfbBDAC foram substancialmente mais mono- (C. glutamicum pEC-XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC e C. glutamicum pEC-XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC) ou mono- e diramnosil-lipídeos (C. glutamicum pEC-XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDAC e C. glutamicum pEC- XT99A::ABCM pVWEX1::rfbBDAC) do que as cepas C. glutamicum pEC-XT99A::ABM, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC e C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM sem aumento do dos genes rfbBDA de P. putida. 21. Construção de cepas de Pseudomonas, que portam os plasmídeos pBBR1MCS-2, pBBR1MCS-2::AB, pBBR1MCS-2::ABC, pBBR1MCS- 2::ABM e pBBR1MCS-2::ABCM
[000429] Os plasmídeos pBBR1MCS-2, pBBR1MCS-2::AB, pBBR1MCS-2::ABC, pBBR1MCS-2::ABM e pBBR1MCS-2::ABCM são introduzidos por meio de eletroporação em Pseudomonas fluorescens DSM 50090, Pseudomonas fluorescens DSM 9958, Pseudomonas putida DSM 6899, Pseudomonas putida DSM 50204, Pseudomonas putida 50194, P. brassicacearum DSM 13227, P. stutzeri DSM 10701, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 e Pseudomonas fulva DSM 17717. A transformação de cepas de Pseudomonas é efetuada tal como descrito acima (Iwasaki e colaboradores Biosci. Biotech. Biochem. 1994, 58(5):851-854). A seleção dos transformantes é efetuada em placas de ágar com nutriente (5 g/L de peptona; 3 g/L de extrato de carne; 15 g/L de ágar; pH 7; suplementado com 50 mg/L de kanamicina). As placas são incubadas durante dois dias a 30oC, respectivamente, 28oC. As cepas obtidas, portando os plasmídeos, são mencionadas de Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS- 2::AB, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::AB, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::AB, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS- 2::ABC, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABC, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABC, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS- 2::ABC, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS- 2::ABCM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABCM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS- 2::ABM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS- 2::ABM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABM e Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABM. 22. Quantificação da produção de ramnolipídeos através de cepas de Pseudomonas recombinantes
[000430] As cepas de Pseudomonas recombinantes geradas no exemplo 21 - cepas Pseudomonas fluorescens DSM 50090, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS- 2::AB, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::AB, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::AB, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS- 2::AB, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABC, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS- 2::ABC, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS- 2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABCM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABCM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS- 2::ABCM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABM e Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS- 2::ABM são cultivadas em placas de ágar LB-kanamicina (50 μg/mL). O subsequente cultivo para a produção de ramnolipídeos é efetuado tal como descrito no exemplo 12. A preparação das amostras para as análises cromatográficas seguintes e as próprias analises cromatográficas são efetuadas tal como descrito no exemplo 4.
[000431] Enquanto as cepas de Pseudomonas Pseudomonas fluorescens DSM 50090, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2 não produzem quaisquer ramnolipídeos, nas cepas recombinantes Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::AB, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::AB, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS- 2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS- 2::ABM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABM e Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABM pode ser verificada a formação de mono- e diramnosil-lipídeos, bem como nas cepas Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS- 2::ABC, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABC, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABC, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS- 2::ABC, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS- 2::ABCM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABCM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABCM e Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABCM, a formação de mono- e diramnosil-lipídeos.
[000432] Além disso, através das cepas de Pseudomonas recombinantes, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS- 2::ABM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS- 2::ABM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABM e Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABM, são formados menos mono- e diramnosil- lipídeos do que através das respectivas cepas de referência sem o gene pa1131 da P. aeruginosa Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS- 2::AB, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::AB, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::AB, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::AB und Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::AB ou Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS- 2::ABC, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABC, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABC, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS- 2::ABC, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABC e Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABC, sem aumento do gene pa1131 de Pseudomonas aeruginosa. 23. Construção dos vetores pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 e pBBR1MCS- 2::ABPA7-CE264 para a expressão heteróloga de genes rhlA, rhlB e rhlC alternativos de Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas aeruginosa PA7, Pseudomonas aeruginosa 1 e Burkholderia thailandensis E264 em P. putida
[000433] Para a expressão heteróloga dos genes rhlA, rhlB e rhlC alternativos de Pseudomonas aeruginosa PAO1 ou Pseudomonas aeruginosa PA7, constroem-se inicialmente os plasmídeos pBBR1MCS- 2::ABPAO1 (SEQ ID NO: 62) e pBBR1MCS-2::ABPA7 (SEQ ID NO: 63). Para isso, os operons sintéticos rhlABPAO1 (SEQ ID NO: 64) e rhlABPA77 (SEQ ID NO: 65) da empresa DNA 2,0 (Menlo Park, CA, EUA) são sintetizados e clonados intermediariamente no vetor comercial pJ294 (DNA 2,0). A base para a síntese é a sequência genômica já conhecida das cepas Pseudomonas aeruginosa PAO1 e Pseudomonas aeruginosa PA7. Partindo dos vetores pH294::ABPAO1 e pJ294::ABPA7, os operons sintéticos são cortados dos vetores por meio de Kpnl e Xbal e, em seguida, ligados no vetor de expressão pBBR1MCS-2 cortado com Kpnl e Xbal (SEQ ID NO: 49) (Kovach e colaboradores, 1995; Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176). Os plasmídeos pBBR1MCS- 2::ABPAO1 (SEQ ID NO: 62) e pBBR1MCS-2::ABPA7 (SEQ ID NO: 63) resultantes, têm tamanhos de 7332 ou 7354 pares de bases. A ligação, bem como a transformação de células de E. coli DH5α quimicamente competentes (Gibco-BRL, Karlsruhe) é efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista. A autenticidade da inserção é verificada por meio de análise de sequência de DNA.
[000434] No segundo estágio, são produzidos os plasmídeos pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 (SEQ ID NO: 66) e pBBR1MCS-2::ABPA7- CE264 (SEQ ID NO: 67). Para isso, os genes rhlC de Pseudomonas aeruginosa 1 (SEQ ID NO: 68) e Burkholderia thailandensis E264 (SEQ ID NO: 76) da empresa DNA 2,0 (Menlo Park, CA, EUA) são sintetizados e clonados intermediariamente no vetor comercial pH294 (DNA 2,0). A base para a síntese é a sequência genômica já conhecida das cepas Pseudomonas aeruginosa 1 e Burkholderia thailandensis E264. Partindo dos vetores pJ294::C1 e pJ294::CE264, os genes rhlC são cortados dos vetores por meio de Xba e Sacl e, em seguida, ligados com os vetores pBBR1MCS-2::ABPAO1 (SEQ ID NO: 62) ou pBBR1MCS-2::ABPA7 (SEQ ID NO: 63) igualmente cortados com Xba e Sacl. Os plasmídeos pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 (SEQ ID NO: 66) e pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264 (SEQ ID NO: 67) têm os tamanhos de 8325 ou 8335 pares de bases. A ligação, bem como a transformação de células de E. coli DH5α quimicamente competentes (Gibco-BRL, Karlsruhe) é efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista. A autenticidade da inserção é verificada por meio de análise de sequência de DNA.
[000435] A transformação de Pseudomonas putida KT2440 e GPp104 com os vetores pBBR1MCS-2, pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 e pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264 é efetuada tal como descrito acima (Iwasaki e colaboradores Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851- 854). Os DNA de plasmídeos de cada 10 clones são isolados e analisados. As cepas obtidas, portando os plasmídeos são mencionados de P. putida KT2440 pBBR1MCS-2, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABPA7- CE264, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 e P. putida GPp104 pBBR1MCS- 2::ABPA7-CE264. 24. Quantificação da produção de ramnolipídeos através de cepas de P. putida recombinantes com genes rhlA, rhlB e rhlC de Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas aeruginosa PA7, Pseudomonas aeruginosa 1 e aeruginosa PAO1, Pseudomonas aeruginosa PA7, Pseudomonas aeruginosa 1 und Burkholderia thailandensis E264
[000436] As cepas P. putida recombinantes geradas no exemplo 23 são cultivadas em placas de ágar LB-kanamicina (50 μg/mL). O subsequente cultivo para a produção de ramnolipídeos é efetuado tal como descrito no exemplo 12. A preparação das amostras para as análises cromatográficas seguintes e as próprias análises cromatográficas foram efetuadas tal como descrito no exemplo 4.
[000437] Enquanto as cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2 e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2 não são capazes de produzir mono- e diramnosil-lipídeos, as cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS- 2::ABPAO1-C1, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264 formam tanto mono-, quanto também diramnosil-lipídeos. Demonstra-se, que as cepas com enfraquecimento da formação de poli-hidroxibutirato (P. putida GPp104 pBBR1MCS- 2::ABPAO1-C1 e P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264) são capazes de produzir mais mono- e diramnosil-lipídeos, do que as cepas sem enfraquecimento da formação de poli-hidroxibutirato (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 e P. putida KT2440 pBBR1MCS- 2::ABPA7-CE264). 25. Construção dos vetores pBBR1MCS-2::ABrfbBDAC, pBBRIMCS- 2::ABMrfbBDAC e pBBR1MCS-2::ABMCrfbBDAC para a superexpressão da P. putida rfbBDAC-operon em P. putida e E. coli'
[000438] Para a construção dos vetores pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC e pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC para a superexpressão da P. putida rfbBDAC-operon em P. putida e E. coli, a P. putida rfbBDAC-operon foi inicialmente amplificada por meio de PCR. O vetor pBBR1MCS-2::rfbBDAC (SEQ ID NO: 45) serviu como matriz para um PCR. Os seguintes oligonucleotídeos foram usados:
[000439] RL_AgeI-fw: 5'- TATATATAACCGGTATTAATGCAGCTGGCACGAC -3' (SEQ ID NO: 71)
[000440] RL_AgeI_rev: 5'-GGCCGACCGGTACTAGTGGA -3' (SEQ ID NO: 72)
[000441] O PCR foi efetuado com a polimerase PhusionTM High- Fidelity Master Mix da New England Biolabs (Frankfurt). Ele foi efetuado de modo e maneira conhecidos pelo especialista. A sequência alvo (promotor Iac e rfbBDAC) foi clonada intermediariamente no sistema Trenzyme Alligator Cloning. Os transformantes E. coli DH5α (New England Biolabs; Frankfurt) foram selecionados e os DNA dos plasmídeos de vários candidatos foram isolados e sequenciados. Depois que a sequência foi verificada e pesquisada com respeito à exatidão, o vetor foi cortado com Agel. O fragmento alvo foi ligado nos vetores pBBR1MCS-2::AB (SEQ ID NO: 38), pBBR1MCS-2::ABM (SEQ ID NO: 42) e pBBR1MCS-2::ABMC (SEQ ID NO: 51) igualmente cortados com Agel, por meio de métodos de ligação convencionais. Os vetores pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC (SEQ ID NO: 73), pBBR1MCS- 2::ABM_rfbBDAC (SEQ ID NO: 74) e pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC (SEQ ID NO: 75) resultantes têm tamanhos de 11960, 13289 ou 14250 pares de bases. As inserções dos vetores foram sequenciadas. A execução dos PCR, a verificação da amplificação bem-sucedida dos PCR por meio de eletroforese com gel de agarose, a marcação dos DNA com brometo de etídio, a determinação do tamanho dos fragmentos PCR, a purificação dos produtos PCR e a determinação da concentração de DNA foi efetuada de modo e maneira conhecidos pelo especialista.
[000442] A transformação de Pseudomonas putida KT2440 com os vetores pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC e pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC foi efetuada tal como descrito acima (Iwasaki e colaboradores Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851- 854). O DNA de plasmídeos de cada 10 clones foi isolado e analisado. As cepas obtidas, portando os plasmídeos são denominadas de P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC e P. putida KT2440 pBBR1MCS- 2::ABMC_rfbBDAC. 26. Quantificação da produção de ramnolipídeos através de P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABrfbBDAC, P. putida KT2440 pBBRIMCS- 2::ABMrfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABCrfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMCrfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC e P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC recombinantes
[000443] As cepas P. putida recombinantes geradas nos exemplos 2, 7 e 25, são cultivadas em placas de ágar LB-kanamicina (50 μg/mL). O subsequente cultivo para a produção de ramnolipídeos é efetuado tal como descrito no exemplo 12. A preparação de amostras para as análises cromatográficas seguintes e as próprias análises cromatográficas são efetuadas tal como descrito no exemplo 4.
[000444] Demonstra-se, que P. putida KT2440 pBBR1MCS- 2::AB_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB e P. putida KT2440 pBBR1MCS- 2::ABM são capazes de formar monoramnosil-lipídeos, enquanto P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC e P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC são capazes de formar mono- e diramnosil-lipídeos.
[000445] Além disso, demonstra-se, que P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM, KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC e KT2440 pBBR1MCS- 2::ABMC são capazes de formar mais mono- e diramnosil-lipídeos do que as correspondentes cepas de controle P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB, KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC e KT2440 pBBR1MCS-2::ABC sem aumento do gene pa1131 de Pseudomonas aeruginosa.
[000446] Finalmente, demonstra-se, que P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS- 2::ABM_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC são capazes de formar mais mono- (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC e P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC) ou mono- e diramnosil-lipídeos (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC e P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC), do que as respectivas cepas de controle P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC sem aumento do gene rfbBDAC de P. putida. 27. Geração de E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABrfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABMrfbBDAC, E. coli W3110 pBBRIMCS- 2::ABCrfbBDAC e E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM rfbBDAC recombinante
[000447] A transformação de E. coli W3110 foi efetuada tal como descrito acima (Miller JH. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Lab. Press; 1992) por meio de eletroporação. O DNA do plasmídeo de cada 10 clones foi isolado e analisado. As cepas obtidas, portando os plasmídeos foram mencionadas E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1MCS- 2::ABC_rfbBDAC e E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM_rfbBDAC. 28. Quantificação da produção de ramnolipídeos através de E. coli' W3110 pBBR1MCS-2::AB, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM, E. coli' W3110 pBBR1MCS-2::ABC, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB rfbBDAC, E. coli W3110 pBBRIMCS- 2::ABMrfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCrfbBDAC e E. coli' W3110 pBBR1MCS-2::ABCMrfbBDAC recombinantes
[000448] As cepas de E. coli recombinantes geradas no exemplo 27 são cultivadas em placas de ágar LB-kanamicina (50 μg/mL). O subsequente cultivo para a produção dos ramnolipídeos é efetuado tal como descrito no exemplo 10. A preparação das amostras para as análises cromatográficas seguintes e as próprias análises cromatográficas são efetuadas tal com descrito no exemplo 4.
[000449] Demonstra-se, que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM, E. coli W3110 pBBR1MCS- 2::AB_rfbBDAC e E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC são capazes de formar monoramnosil-lipídeos, enquanto E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC e E. coli W3110 pBBR1MCS- 2::ABCM_rfbBDAC são capazes de formar mono- e diramnosil-lipídeos. Além disso, demonstra-se, que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM e E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC formam mais monoramnosil- lipídeos do que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB e E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC sem aumento do gene pa1131 da Pseudomonas aeruginosa.
[000450] Além disso, demonstra-se, que E. coli W3110 pBBR1MCS- 2::ABCM e E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM_rfbBDAC formam mais mono- e diramnosil-lipídeos do que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC e E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC sem aumento do gene pa1131 de Pseudomonas aeruginosa. Além disso, demonstra-se, que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM e E. coli W3110 pBBR1MCS- 2::ABM_rfbBDAC formam mais monoramnosil-lipídeos do que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB e E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC sem aumento do gene pa1131 de Pseudomonas aeruginosa. Finalmente, demonstra-se, que E. coli W3110 pBBR1MCS- 2::AB_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC e E. coli W3110 pBBR1MCS- 2::ABCM_rfbBDAC são capazes de formar mais mono- (E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1MCS- 2::ABM_rfbBDAC) ou mono- e diramnosil-lipídeos (E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC e E. coli W3110 pBBR1MCS- 2::ABCM_rfbBDAC) do que as respectivas cepas de controle E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC e E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM sem aumento do gene rfbBDAC de P. putida.

Claims (9)

1. Célula, selecionada de microrganismos, caracterizada pelo fato de que é capaz de formar um ramnolipídeo da Fórmula Geral (I),
Figure img0010
na qual m = 2, 1 ou 0, especialmente 1 ou 0, n = 1 ou 0, especialmente 1, R1 e R2 independentemente uns dos outros, representam um radical orgânico igual ou diferente com 2 a 24, especialmente um radical alquila opcionalmente ramificado, opcionalmente substituído, especialmente substituído por hidroxi, opcionalmente insaturado, especialmente opcionalmente uma, duas ou três vezes insaturado, sendo que a referida célula foi geneticamente modificada de modo tal, que, comparada com seu tipo selvagem, apresenta uma atividade aumentada das enzimas E1 e E2, sendo que: a enzima E1 é capaz de catalisar a conversão de 3- hidroxialcanoil-ACP a ácido hidroxialcanoil-3-hidroxioicoalcanoico por meio de ácido 3-hidroxialcanoil-3-hidroxioicoalcanoico-ACP, a enzima E2 é uma ramnosiltransferase I e é capaz de catalisar a conversão de dTDP-ramnose e 3-hidroxialcanoil-3- hidroxialcanoato para α-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoil-3- hidroxialcanoato, e sendo que, comparada ao seu tipo selvagem, apresenta uma atividade aumentada das enzimas selecionadas do grupo que consiste em: uma enzima E4, uma dTTP:α-glicose-1-fosfato timidililtransferase, EC 2.7.7.24, uma enzima E5, uma dTTP-glicose-4,6-hidrolase, EC 4.2.1.46, uma enzima E6, uma dTDP-4-de-hidroramnose-3,5 epimerase, EC 5.1.3.13, e uma enzima E7, uma dTDP-4-de-hidroramnose redutase, EC 1.1.1.133, e sendo que: a enzima E1 é selecionada de: uma enzima E1a apresentando uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, uma enzima E1b apresentando uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 18, uma enzima E1c apresentando uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 78, uma enzima E1d apresentando uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 80, e uma enzima E1e apresentando uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 82, a enzima E2 é selecionada de: uma enzima E2a apresentando uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, uma enzima E2b apresentando uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 20, uma enzima E2c apresentando uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 84, uma enzima E2d apresentando uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 86, uma enzima E2e apresentando uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 88, a enzima E4 apresenta uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 10, a enzima E5 apresenta uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 12, a enzima E6 apresenta uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 14, e a enzima E7 apresenta uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 16.
2. Célula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que apresenta ainda uma atividade aumentada da enzima E3, sendo que a enzima E3 é uma ramnosiltransferase II e é capaz de catalisar a conversão de dTDP-ramnose e α-L-ramnopiranosil-3- hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoato para α-L-ramnopiranosil-(1-2)-α-L- ramnopiranosil-3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoato; e sendo que a enzima E3 é selecionada de: uma enzima E3a apresentando uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 6, uma enzima E3b apresentando uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 22, uma enzima de E3c apresentando a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 90, e uma enzima E3d apresentando uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 92.
3. Célula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que apresenta uma atividade aumentada da combinação de enzimas E1E2E3.
4. Célula, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que, com relação à Formula (I), n = 1.
5. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que é selecionada de um gênero do grupo que consiste em Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium e Cupriavidus.
6. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que apresenta uma atividade reduzida de uma enzima E9 ou E10 em comparação com seu tipo selvagem, sendo que E9 apresenta a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 32 e sendo que E10 apresenta uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 36.
7. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que, comparada com seu tipo selvagem, apresenta uma atividade aumentada de uma enzima E8, a qual catalisa a exportação de um ramnolipídeo da Fórmula Geral (I) da célula para o meio circundante, preferivelmente com sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 28.
8. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que contém um ácido nucleico que apresenta as seguintes sequências A1, A2 e A3: o grupo [A1] consiste nas seguintes sequências: (A1a) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de converter 3- hidroxidecanoil-ACP para ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico através de 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoil-ACP, (A1b) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 17, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de converter 3-hidroxitetradecanoil-ACP para ácido 3-hidroxitetradecanoil- 3-hidroxitetradecanoico através de 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoil-ACP, o grupo [A2] consiste nas seguintes sequências: (A2a) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 3, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de converter dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, (A2b) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 19, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de converter dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxiteradecanoico, e o grupo [A3] consiste nas seguintes sequências: (A3a) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 5, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de converter dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3- hidroxidecanoico para ácido α-L-ramnopiranosil-(1-2)-α-L- ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, (A3b) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 21, sendo que essa sequência codifica uma proteína, que é capaz de converter dTDP-ramnose e ácido α-L-ramnopiranosil-3- hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico para ácido α-L- ramnopiranosil-(1-2)-α-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3- hidroxitetradecanoico, ou um vetor, especialmente um vetor de expressão ou um cassete de superexpressão de gene, compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 e de ácidos nucleicos selecionados dos três grupos acima mencionados [A1], [A2] e [A3].
9. Processo para produção de ramnolipídeos da Fórmula Geral (I), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de processo: (I) por em contato uma célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, com um meio contendo uma fonte de carbono, (II) cultivar as células em condições que permitam à célula formar ramnolipídeo a partir da fonte de carbono, e (III) opcionalmente, isolar os ramnolipídeos formados.
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