MX2011001961A - Produccion de aminoacidos azufrados n-acilados con microorganismos con actividad enzimatica n-aciltransferasa potenciada. - Google Patents

Abstract

La presente invención reivindica un polipéptido aislado con actividad L-aminoácido-N-acil transferasa y un microorganismo modificado en el que esta enzima se sobreexpresa; los sustratos de dicha enzima incluyen principalmente metionina y sus derivados o análogos; la sobreexpresión en microorganismos productores de aminoácidos azufrados permite la producción de mayores cantidades de aminoácidos azufrados n-acilados; también se reivindica el asilamiento de aminoácidos azufrados n-acilados a partir del medio de fermentación.

Description

PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS N-ACILADOS CON MICROORGANISMOS CON ACTIVIDAD ENZIMÁTICA N- ACILTRANSFERASA POTENCIADA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención reivindica un polipéptido aislado con actividad L-aminoácido-N-acil transferasa y un microorganismo modificado en el que esta enzima se sobreexpresa. Los sustratos de dicha enzima incluyen metionina y sus derivados o análogos. La sobreexpresion en microorganismos productores de aminoácidos azufrados permite la producción de mayores cantidades de aminoácidos azufrados n-acilados. También se reivindica el asilamiento de aminoácidos azufrados n-acilados a partir del medio de fermentación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las N-aciltransferasas catalizan la transferencia de un ,grupo acilo, por lo general desde la acil-coenzima A donante de acilo a un grupo amino. Un grupo acilo es un grupo funcional derivado de un ácido carboxílico de forma RC O OH. Tiene la fórmula RC(=O)-, con un doble enlace entre los átomos de carbono y oxígeno (es decir, un grupo carbonilo), y un enlace sencillo entre R y el carbono. Algunos ejemplos de grupos acilo: grupos formilo (CH2=0), acetilo (C2H4=0) propionilo (C3H6=O) y butirilo (C4H8=0).

Las N-aciltransferasas son enzimas importantes en procariotas y eucariotas y están implicados en procesos como los ciclos biológicos (Klein DC, 2007, J Biol Chem, 282(7):4233-7), resistencia a antibióticos (Záhringer y cois., 1993, FEMS Microbiol Lett., 1 10(3), 331-4; Lacalle RA, y cois., 1989, Gene 79(2):375-80) y resistencia a herbicidas. En plantas la acilación de fosfinotricina catalizada por los productos génicos "Bar" y "Pat" supone la resistencia al glufosinato (Tan W. y cois., 2006, Amino Acids, 30(2):195-204).

Algunas N-acil-transferasas catalizan específicamente la transferencia de grupos como formilo o acetilo, y se denominan "N-formil-transferasa" o "N-acetil-transferasa". Otras transferasas tienen una actividad catalítica más general y se denominan simplemente "N-acil-transferasas".

La acetilación del extremo N terminal de la metionina como procedimiento co-traduccional es una de las modificaciones proteicas más comunes en eucariotas. Sin embargo, las acetilasas que reconocen el extremo N terminal de un polipéptido no reconocen la metionina como aminoácido libre (consulte Polevoda y Sherman 2000 JBC 275, 47, págs. 36479-36482). En procariotas, la acetilación de metionina como proceso cotraduccional es poco frecuente (Driessen y cois. 1985, CRC Crit. Rev. Biochem. 18, 281-325).

Se han descrito enzimas N-acilantes, que posiblemente pudieran acilar la metionina como aminoácido libre. Por ejemplo, ArgA codifica una N-acetil-glutamato sintasa en E. coli (Marvil y Leisinger 1977 JBC 252, 10 págs. 3295-3303). Aunque se ha descrito la N-acetilación de los derivados de la metionina como sulfoximina de metionina y sulfona de metionina (Davies y cois., 2007, Biochemistry, 46(7), págs. 1829-39), en la actualidad no se conocen enzimas con una actividad acilante significativa para la metionina libre.

La N-acetil-L-metionina (NAM) es un derivado de la metionina que ha sido acetilado en el grupo amino. Se ha demostrado que NAM tiene el mismo valor de ahorro de metionina que la metionina pura (Baker, 2006, Journal of Nutrition 136, págs. 16705-55). También se ha incluido en pan de soja o leche de soja en el que tiene un mejor resultado que la metionina pura respecto a la detección sensorial (Hippe y Warthesen, 1978, Journal of food science 43(3) págs. 793-6).

La biosíntesis química de N-acetil-metionina produce un racemato de D- y L-estereoisómeros y se sabe que en animales la N-acetil-D-metionina no se incorpora tan bien como su isómero L. Las desracemización es un procedimiento caro que hace que la producción de NAM no sea rentable. Por lo tanto, la producción fermentativa de N-acetil-L-metionina pura para comidas y piensos y para aplicaciones farmacéuticas sería un procedimiento económicamente viable.

Otro derivado importante de metionina es la N-propionil-L-metionina (denominado en lo sucesivo NPM), en el que la metionina ha sido propionilada en el grupo amino.

Se ha demostrado que los productos resultantes de la acilación de la L-metionina tienen ventajas para la producción de lana de oveja (patente de EE.UU. 4,093,740 llamada "Propionyl-methionine: Fodder for ruminants") y para la producción de productos cosméticos (patente de EE.UU. 3,624,114 llamada "Fatty Acid Amido-Methionine Products":).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un polipéptido aislado con actividad enzimática L-aminoácido-N-acil-transferasa, que comprende el SEQ ID NO 1 , un fragmento o una secuencia homologa del mismo. Más específicamente, el polipéptido aislado tiene actividad L-aminoácido-N-acil-transferasa para los sustratos metionina, lisina y glutamato, sus derivados y análogos.

La presente invención también se refiere a microorganismos modificados con actividad L-aminoácido-N-acil-transferasa modificada, en particular, potenciada. Dichos microorganismos presentan un aumento de la producción de aminoácidos N-acilados en comparación con la producción observada en un microorganismo no modificado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un polipéptido aislado con actividad enzimática L-aminoácido-N-acil-transferasa, que comprende el SEQ ID NO 1 , un fragmento o una secuencia homologa del mismo.

Se ha demostrado que el polipéptido aislado tiene actividad L-aminoácido-N-acil-transferasa para los sustratos metionina, lisina, glutamato, sus derivados y análogos.

Como se usan en este documento, los siguientes términos se pueden utilizar para la interpretación de las reivindicaciones y la memoria descriptiva.

Según la invención, el término "polipéptido" se refiere a un péptido o proteína que comprende una secuencia de dos o más aminoácidos unidos por puentes peptídicos.

El término "aislado" se refiere a una proteína o secuencia de ADN que se separa de al menos un componente con el que está asociada de forma natural.

Los términos "actividad de una enzima" y "actividad enzimática" se usan indistintamente y se refieren a la capacidad de una enzima de catalizar una reacción química específica, por ejemplo, la conversión de metionina en NAM mediante la actividad de una enzima metionina N-acetil-transferasa.

El término "actividad L-aminoácido N-transacilasa o actividad L-aminoácido-N-acil transferasa" designa la adición de un grupo acilo de un sustrato, p. ej., la adición de un grupo acilo al grupo amino del aminoácido metionina (véase fig. 1). Preferentemente, el grupo acilo es un grupo butiril, más preferentemente un grupo propionil y en una modalidad más específica aún, un grupo acetilo.

Los derivados o análogos de metionina, Nsina o glutamato, se definen como sulfoximina de metionina, homocisteína, sulfona de metionina, sulfoximina de metionina, glutamina o fosfinotricina (glufosato).

El polipéptido aislado de la presente invención se puede obtener a partir de microorganismos con actividad metionina N-acil-transferasa, por ejemplo, usando el procedimiento de purificación descrito en los siguientes ejemplos. Los microorganismos que se pueden utilizar para aislar el polipéptido, incluyen, pero sin limitarse, a E. coli.

El término "que comprende la secuencia del SEQ ID NO 1" significa que la secuencia aminoacídica del polipéptido puede no estar estrictamente limitada al SEQ ID NO 1 , sino que puede contener aminoácidos adicionales. El término "un fragmento del SEQ ID NO 1" significa que la secuencia del polipéptido puede incluir menos aminoácidos que el SEQ ID NO 1 pero aún con suficientes aminoácidos como para conferir actividad L-aminoácido-N-acil-transferasa. Es muy conocido en la técnica que un polipéptido puede modificarse por sustitución, inserción, deleción y/o adición de uno o más aminoácidos conservando aún su actividad enzimática. Por ejemplo, es común la sustitución de un aminoácido en una posición dada, por un aminoácido químicamente equivalente que no afecte a las propiedades funcionales de una proteína. Para el propósito de la presente invención, las sustituciones se definen como intercambios dentro de unos de los siguientes grupos: ¦ residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly ¦ residuos polares cargados negativamente y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln ¦ residuos polares cargados positivamente: His, Arg, Lys ¦ residuos alifáticos grandes no polares: Met, Leu, lie, Val, Cys ¦ residuos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp.

De este modo, cabe esperar que cambios que resultan de la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro (como ácido glutámico por ácido aspártico) o un residuo cargador positivamente por otro (como por ejemplo lisina por arginina) produzcan un producto funcionalmente equivalente.

Las posiciones en las que se modificaron los aminoácidos y el número de aminoácidos sujetos a modificación en la secuencia aminoacídica no están particularmente limitados. Los expertos en la materia serán capaces de reconocer las modificaciones que se pueden introducir sin afectar la actividad de la proteína. Por ejemplo, se espera que las modificaciones en el extremo amino o carboxi terminal (N o C) de una proteína no alteren la actividad de una proteína bajo determinadas circunstancias.

El término "homólogo" se refiere a polipéptidos sometidos a modificaciones como se define anteriormente que conservan la actividad enzimática original.

Según la invención, el polipéptido con actividad enzimática L-aminoácido-N-acil-transferasa puede comprender una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO 1 , preferentemente al menos un 80% de identidad y más preferentemente al menos un 90% de identidad.

Los procedimientos para la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias de proteína son conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede hacer después de un alineamiento de las secuencias usando el software CLUSTALW disponible en la página Web http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ con los parámetros predeterminados indicados en la página Web. A partir del alineamiento, el cálculo del porcentaje de identidad se puede realizar fácilmente registrando el número de residuos idénticos en la misma posición en comparación con el número total de residuos. Alternativamente, se puede realizar un cálculo automático usando por ejemplo, los programas BLAST disponibles en la página Web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ con los parámetros predeterminados indicados en la página Web.

Según la invención, el polipéptido con actividad enzimática aminoácido N-acil transferasa puede comprender al menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia del SEQ ID NO 1 , preferentemente al menso 20, al menos 140, al menos 160, o más preferentemente al menos 172 aminoácidos contiguos de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO 1.

En otra modalidad de la invención, el polipéptido con actividad enzimática L-aminoácido N-acil transferasa, tiene una secuencia polipeptídica estrictamente idéntica a la secuencia del SEQ ID NO 1.

La invención también trata de un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica el polipéptido de la invención. Los inventores describen la identificación de un gen de E. coli que codifica una proteína con actividad L-aminoácido-N-acil-transferasa para los sustratos metionina, lisina, glutamato, sulfóxido de metionina, sulfona de metionina, sulfoximina de metionina, aspartamo y asparragina. Este gen previamente se conocía como yncA en E. coli, identificado durante el análisis del genoma completo de E. coli. Este gen ya ha sido descrito como una aciltransferasa putativa, pero aún no se ha demostrado una función específica (http://ecogene.org/). También fue descrito como un gen regulado por Mar en un procedimiento que identifica compuestos que modulan la expresión de genes regulados por Mar, que se sabe que está implicada en resistencias a varios fármacos (WO 01/70776).

El término "polinucleótido" se refiere a un polímero de ribonucleótidos (o ARN) o a un polímero de desoxirribonucleótidos (o ADN), de cadena sencilla o doble con bases nucleotídicas sintéticas, no naturales o alteradas. Un polinucleótido aislado en forma de ADN puede contener uno o más segmentos de ADN sintético, ADN genómico o ADNc.

El origen del polinucleótido no es necesariamente el organismo en el que la actividad enzimática se mide originalmente. La hibridación en diferentes condiciones de restrictividad, con una sonda que comprende la secuencia nucleotídica del SEQ ID NO 2, puede usarse por las personas expertas en la materia para analizar polinucleótidos en una genoteca. Los protocolos detallados para la hibridación aparecen en Sambrook y cois. (1989).

Las secuencias de dichos polinucleótidos se pueden extraer de bases de datos usando por ejemplo los programas BLAST definidos anteriormente y buscar homologías con la secuencia nucleotídica del SEQ ID NO 2, o buscar la secuencia polipeptídica del SEQ ID NO 1 , y recuperar las secuencias polinucleotídicas correspondientes.

Los polinucleótidos preferentes de la presente invención son polinucleótidos que al menos son idénticos en un 60% con la secuencia nucleotídica del SEQ ID NO 2. Los polinucleótidos más preferentes de la invención son polinucleótidos al menos un 80% idénticos a la secuencia nucleotídica del SEQ ID NO 2. Nucleótidos más preferentes son aquellos al menos un 90% idénticos a la secuencia nucleotídica del SEQ ID NO 2. Nucleótidos aún más preferentes son aquéllos al menos un 95% idénticos a la secuencia nucleotídica del SEQ ID NO 2 En particular, en la invención se incluye el polinucleótido que comprende la secuencia nucleotídica del de SEQ ID NO 2.

El término "que codifica" se refiere al proceso por el cual un polinucleótido, mediante los mecanismos de transcripción y traducción, produce una secuencia aminoacídica. Este proceso es permitido por el código genético, que es la relación entre la secuencia de bases del ADN y la secuencia de los aminoácidos de las proteínas. Una característica principal del código genético es el de estar degenerado, lo que quiere decir que un aminoácido se puede codificar mediante más de un triplete de bases (un "codón"). La consecuencia directa es que distintos polinucleótidos pueden codificar la misma secuencia aminoacídica. Como ejemplo, las secuencias polinucleotídicas derivadas del SEQ ID NO 2 por degeneración del código genético también codifican la secuencia polipeptídica del SEQ ID NO 1 y por lo tanto están contempladas por la presente invención. Los expertos en la materia saben que el uso de los codones puede variar según los diferentes organismos. Los codones que codifican el mismo aminoácido pueden ser utilizados preferentemente por un microorganismo en particular. De este modo, es también importante diseñar un polinucleótido adaptado al uso de los codones de un microorganismo particular para optimizar la expresión de la correspondiente proteína en este organismo.

La presente invención también se refiere a un cásete de expresión que comprende el polinucleótido de la invención bajo el control de elementos reguladores funcionales en el microorganismo anfitrión.

El término "expresión" se refiere a la transcripción y traducción de una secuencia de genes que propicia la generación de la correspondiente proteína, producto del gen.

El término "cásete de expresión" se refiere a un polinucleótido preferentemente unido a elementos reguladores, como promotores, potenciadores, sitios de unión a ribosomas o terminadores que permiten la expresión del gen contenido en el polinucleótido en un organismo anfitrión adecuado. Dichos elementos reguladores pueden ser elementos reguladores propios del gen, pero también pueden ser elementos modificados o sintéticos, que permitan una mayor expresión del gen. Por ejemplo, se puede obtener una mayor expresión sustituyendo el promotor nativo del gen por promotores más potentes. Para E. coli estos . promotores por ejemplo son: promotor lac, promotor tac, promotor trc y promotor lambda el. Para otros organismos, los expertos en la materia pueden elegir los más apropiados.

El término "microorganismo anfitrión" se refiere a un microorganismo capaz de recibir genes extraños o heterólogos o copias extras de sus propios genes y de expresar esos genes para producir una proteína activa.

La invención también se refiere a un vector de transformación que comprende el cásete de expresión según la invención, o el polinucleótido de la invención.

El término "transformación" se refiere a la introducción de ADN, p. ej., genes nuevos o copias extra de los genes existentes en un organismo anfitrión. Los genes adquiridos se pueden incorporar en el ADN cromósómico o introducidos como elementos extracromosómicos. Como por ejemplo, en E. coli, un procedimiento para la transferencia del ADN a un organismo anfitrión es la electroporación.

El término "vector de transformación" se refiere a cualquier vehículo utilizado para introducir un polinucleótido en un organismo anfitrión. Dicho vehículo puede ser, por ejemplo, un plásmido, un fago u otros elementos conocidos en la técnica según el organismo utilizado. Además del polinucleótido o del cásete de expresión el vector de transformación por lo general contiene otros elementos para facilitar la transformación de una célula anfitrión en particular. Un vector de expresión comprende un cásete de expresión que permite la expresión adecuada del gen que transporta el cásete y los elementos adicionales que permiten la replicación del vector en el organismo anfitrión. Un vector de expresión puede estar presente en una copia única o en múltiples copias en el organismo anfitrión.

En una modalidad específica de la invención, se introduce un vector o un fragmento de ADN aislado en el microorganismo, permitiendo dicho vector o fragmento la integración cromosómica del cásete o el polinucleótido según la invención. Los expertos en la materia conocen diferentes vectores útiles para la integración cromosómica de un gen.

La invención proporciona también un microorganismo modificado con una actividad enzimática L-aminoácido-N-acil-transferasa modulada, en el que la actividad del polipéptido con actividad L-aminoácido-N-acil-transferasa según la invención está potenciada.

El término "microorganismo modificado" indica un microorganismo que ha sido genéticamente modificado con el objetivo de aumentar la acumulación de productos N-acilados en el caldo de fermentación. Los expertos en la materia saben cómo modular la expresión de genes específicos. Las modificaciones habituales incluyen la transformación de microorganismos con elementos genéticos, incluyendo deleción de genes, sustitución de genes, modificación de promotores e introducción de vectores para la expresión de genes heterólogos.

El término "actividad de un polipéptido" se refiere a una actividad enzimática, caracterizada por la transformación de un sustrato en un producto final medible y que se correlacione directamente con la actividad de la L-aminoácido-N-acil-transferasa que cataliza la reacción.

La "actividad potenciada" para el polipéptido N-acil transferasa de la invención, significa que la producción del producto N-acilado, particularmente un aminoácido azufrado, con el microorganismo transformado aumenta en comparación con el mismo microorganismo antes de la modificación.

La actividad potenciada para el polipéptido N-acil transferasa de la invención se puede obtener por cualquier medio, como por ejemplo preparando y expresando una variante que tenga un aumento de la actividad o, más particularmente, sobreexpresando dicho polipéptido. La sobreexpresión se puede obtener por diferentes medios conocidos en la técnica, como por ejemplo modulando la expresión de los factores que afectan a la expresión del gen nativo que codifica dicho polipéptido, si estuviera presente. También se puede obtener modificando el promotor de dicho gen nativo, si tuviera, con elementos reguladores que permitan una mayor expresión del producto génico, como elementos conocidos en la técnica, como potenciadores o finalmente usando promotores potentes conocidos. También se puede lograr una sobreexpresión introduciendo un gen nuevo con una secuencia que codifique el polipéptido de la invención bajo el control de un promotor potente, finalmente con múltiples copias de dicho gen.

Todas las técnicas para transformar microorganismos y sobre los elementos reguladores usados para potenciar la producción de la proteína de la invención, son muy conocidas en la materia y están disponibles en la bibliografía, incluyendo las solicitudes de patentes propiedad del solicitante sobre la modificación de las rutas de biosintesis en varios microorganismos, incluyendo WO2008/052973, WO2008/052595, WO2008/040387, WO2007/144346, WO2007/141316, WO2007/077041 , WO20 7/017710, WO2006/082254, WO2006/082252, WO2005/111202, WO2005/073364, WO2005/047498, WO2004/076659, cuyo contenido se incorpora en este documento a modo de referencia.

Más particularmente, el nivel potenciado de producción del producto N-acilado, se puede medir en el medio de cultivo.

Se analiza el nivel de producción/acumulación de producto N-acilado en el medio. La acumulación del producto N-acilado aumenta al menos un 20%, preferentemente un 50%, más preferentemente un 75% y más preferentemente aún, un 95% de la cantidad acumulada en el mismo procedimiento con un organismo no modificado.

La cantidad de NAM acumulada en el caldo de fermentación se determina usando HPLC refractométrica, usando NAM (Sigma, Ref. 01310) como estándar. La cantidad de N-propionil-metionina acumulada en el caldo de fermentación se determina usando GC-MS, usando NAM (Sigma, Ref. 01310) como estándar.

En una modalidad específica de la invención, se aumenta la expresión de al menos otra aciltransferasa en el microorganismo modificado de la invención. Dichas enzimas y sus secuencias codificadoras con conocidas en la técnica, incluyendo ArgA (N-acetilglutamato sintasa), YjdJ, YfaP, YedL, YjhQ. Al menos aumenta la expresión de uno de estos genes, lo que significa que el aumento de combinaciones de estos genes también está contemplado en el microorganismo de la presente invención.

En otra modalidad de la invención, la actividad de los genes que catalizan la desacilación de los aminoácidos adiados está atenuada. La atenuación de la actividad de dichos genes, conocidos en la técnica, se obtiene preferentemente atenuando su expresión. Particularmente, se atenúa la expresión del gen argE, que codifica una enzima que cataliza la desacetilación de NAM.

En otra modalidad específica de la invención, se aumenta la expresión de al menos un gen implicado en la biosíntesis de la metionina. Los genes implicados en la biosíntesis de la metionina han sido ampliamente descritos en solicitudes de patente como WO2007/077041 y WO2005/108561 , incorporadas en la presente memoria descriptiva a modo de referencia.

Preferentemente, el microorganismo de la invención se selecciona entre el grupo formado por bacterias, levaduras y hongos. Más preferentemente, la bacteria se selecciona entre el grupo formado por Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae.

Más preferentemente, el microorganismo es una especie de Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Salmonella, Bacillus o Corynebacterium. Aún más preferentemente, la bacteria se selecciona entre las especies formadas por Escherichia coli y Corynebacterium glutamicum.

La invención también se refiere a un procedimiento para la producción de un aminoácido N-acilado en un medio, que comprende la puesta en contacto de dicho aminoácido con un polipéptido con actividad enzimática L-aminoácido-N-acil-transferasa tal y como se describe anteriormente y a continuación, en presencia de acil-coenzima A y recuperando el aminoácido N-acilado. El medio se define como cualquier medio en el que pueda producirse la actividad enzimática. Generalmente está compuesto por soluciones acuosas con un pH adaptado para una actividad óptima de la enzima.

Los expertos en la materia pueden seleccionar las condiciones más apropiadas para permitir esta transformación catalítica.

La invención también se refiere a un procedimiento para la producción de N-acil-aminoácidos azufrados cultivando un microorganismo según la invención, en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre, y una fuente de nitrógeno, y recuperando el aminoácido azufrado N-acilado a partir del medio de cultivo.

En una modalidad especifica de la invención, el aminoácido azufrado N-acilado es N-acetil-metionina. En otra modalidad de la invención, el aminoácido N-acilado producido es N-propionil-metionina.

Un "medio de cultivo apropiado" es un medio apropiado para el cultivo y crecimiento del microorganismo, comprendiendo dicho medio una fuente de carbono, una fuente de azufre y una fuente de nitrógeno. Dichos medios son muy conocidos por los expertos en la fermentación de microorganismos, dependiendo del microorganismo que se esté cultivando.

El término "fuente de carbono" según la presente invención indica cualquier fuente de carbono que pueden utilizar los expertos en la materia para soportar el crecimiento normal de un microorganismo que pueden ser hexosas (glucosa, galactosa o lactosa), pentosas, monosacáridos, disacáridos (sacarosa, celobiosa o maltosa), oligosacáridos, melaza, almidón o sus derivados, hemicelulosas, glicerol y combinaciones de las mismas. Una fuente de carbono simple especialmente preferente es la glucosa. Otra fuente de carbono simple preferente es la sacarosa.

En una modalidad específica de la invención, la fuente de carbono deriva de un producto base renovable. Se define producto base renovable como una materia prima necesaria para determinados procesos industriales que puede regenerarse en poco tiempo y en suficiente cantidad para permitir su transformación en el producto deseado.

Específicamente, la fuente de nitrógeno es una sal de amonio o un gas amoníaco. La fuente de nitrógeno puede suministrarse en forma de amonio o amoníaco.

La fuente de azufre usada para la producción fermentativa de L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de la misma, puede ser cualquiera de las siguientes: sulfato, tiosulfato, sulfuro de hidrógeno, ditionato, ditionita, sulfito, metilmercaptano, dimetildisulfuro o una combinación de los mismos.

En una modalidad preferida de la invención, la fuente de azufre es sulfato y/o tiosulfato.

La fermentación generalmente se realiza en termentadores con un medio de cultivo apropiado adaptado a los microorganismos que se estén usando, y contienen al menos una fuente de carbono sencilla, y si fuera necesario cosustratos para la producción de metabolitos.

Como ejemplo de medio de cultivo conocido para E. coli puede, el medio de cultivo puede tener una composición idéntica o similar al medio 9 ((Anderson, 1946, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 32:120-128), un medio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escheríchia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) o un medio como el definido por Schaefer y cois. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96).

Un ejemplo de medio de cultivo conocido para C. glutamicum, el medio de cultivo puede tener una composición idéntica o similar al medio BMCG (Liebl y cois., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210) o a un medio como el descrito por Riedel y cois. (2001 , J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583).

Los expertos en la materia pueden definir las condiciones de cultivo para los microorganismos según la invención. En particular, las bacterias se fermentan a una temperatura de entre 20 °C y 55 °C, preferentemente entre 25 °C y 40 °C, y más específicamente aproximadamente 30 °C para C. glutamicum y aproximadamente 37 °C para E. coli.

En una modalidad específica de la invención, el procedimiento comprende una etapa adicional de asilamiento de los aminoácidos N-acilados deseados del medio de reacción, componentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa, quedando opcionalmente en porciones o en la cantidad total (0-100%) del producto final.

En una modalidad específica de la invención, el procedimiento comprende la limitación o la privación de fosfato y/o potasio al organismo.

En una modalidad particular de la invención, el aminoácido acilado recuperado se selecciona entre N-acetil-metionina y N-propionil-metionina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La fig. 1 representa la N-acetilación de L-metionina hasta N-acetil-L-metionina catalizada por la enzima YncA usando el acetil-CoA como cofactor.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Purificación de la actividad MNAT (metionina N-acil transferasa) Ensayo de la actividad MNAT in vitro La actividad metionina L-aminoácido-N-acil-transferasa se siguió en placas de microtitulación controlando la aparición de HS-CoA con DTNB. La solución de reacción, a la que se añade la muestra, contenia Tris-HCI 200 mM, pH 9.0, DTNB 100 µ?, acetil-coA 3 mM y metionina 20 mM. La formación de complejo DTNB-CoA se controló a 408 nm usando un lector de placas de microtitulación pQuant (BioTek Instruments, Inc., EE.UU.).

Purificación de MNAT Se aclararon unos 3 g en peso seco de células 3 veces con tampón de extracción (EB) (fosfato 50 mM, pH 7.0, PLP 50 µ?, DTT 500 µ?) y se resuspendieron en 70 mi de EB. Las células se rompen con ultrasonidos usando un Rosett cell con un homogenizador ultrasónico Sonoplus de Bandelin (Bandelin Electronic, Alemania), equipado con una sonda UW2070 y un cabezal SH70G (6 roturas, 30 s, 100% de eficiencia, 75 W). El extracto crudo se centrifugó (30 min, 12.000 g, 4 °C) y el sulfato de amonio sólido se añadió al sobrenadante a una concentración final de 2.3 M, y se incubó en hielo durante 30 min. La solución se centrifugó (15 min, 15.000 g, 4 °C) y el sedimento se resuspendió en 40 mi de tampón de fosfato (fosfato 50 mM, pH 7.0). El sulfato de amonio sólido se añadió a una concentración final de 1.5 M, y la solución se incubó en hielo durante 30 min y después se centrifugó (15 min, 15.000 g, 4 °C). El sobrenadante se procesó adicionalmente usando una unidad purificadora AKTA (Amersham Biosciences, EE.UU.) y su software (Unicorn software, Amersham Biosciences, EE.UU.). La solución se sometió después a una columna de fenil-HP GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suecia), previamente equilibrada con 10 volúmenes de lecho de tampón fosfato. La proteína se eluyó con un gradiente de sulfato de amonio 1.5 a 0 mM en tampón fosfato a una velocidad e flujo de 1 ml/min. La fracción con la más actividad se obtuvo aproximadamente con el sulfato de amonio 0.5 mM y dializada toda la noche a 4 °C contra un tampón Tris 20 mM a pH 7.0. Después se sometió a una cromatografía aniónica usando una columna ResourceQ (GE Healthcare Bío-Sciences AB, Suecia) equilibrada con 10 volúmenes de lecho de Tris 20 mM, pH 7.0 y se eluyó con un tampón NaCI en tris 20 mM, pH 7.0, con un gradiente de NaCI de 0 a 0.5 M a una velocidad flujo de 2 ml/min. La fracción con más actividad se eluyó a una concentración de NaCI de unos 0,25 M. Antes de la etapa de filtración en gel, la solución de proteína se concentró usando un filtro Amicon ultra 15 (Millipore Corporation, EE.UU.). El extracto concentrado se pasó a través de una columna Superdex 200 (GE Healthcare Bío-Sciences AB, Suecia) equilibrada con dos volúmenes de lecho de tampón Tris 20 mM, NaCI 150 mM. La fracción que contiene más actividad MNAT se obtuvo con un volumen de elución de unos 15.3 mi, lo que corresponde con un peso molecular de 36 kDa. Finalmente, la solución de proteína se aplicó en una columna de hidroxilapatita cerámica Bio-Scale (Bio-Rad Laboratories, EE.UU.) previamente equilibrada según las instrucciones del fabricante y eluída usando un gradiente de tampón fosfato de 10 a 500 mM (pH 6.8) con una velocidad de flujo de 2 ml/min. La fracción con más actividad se obtuvo con una concentración aproximada de elución de 130 mM de fosfato. La electroforesis en gel con SDS y en condiciones desnaturalizantes de las diferentes fracciones demostró que durante la purificación se enriqueció una banda de unos 17 kDa.

Cuadro 1 Enriquecimiento de metionina N-acil transferasa por purificación. Se indica el aumento de la actividad específica, la actividad purificada total, el rendimiento de purificación y el factor de purificación.

Análisis de las bandas Después de la electroforesis en gel con SDS la banda de la región de 17 kDa se escindió y se sometió a una digestión con tripsina. La proteína digerida se analizó por nanoLC-MS/MS en un CapLC-Q-TOF2 (Waters Corporation, EE.UU.) y los resultados se procesaron con un ProteinLynx Global Server (Waters Corporation, EE.UU.) y Mascot (Matrix Science). La proteína purificada se identificó como YncA, una aciltransferasa relacionada con GCN5. La secuencia se muestra en el SEQ ID NO 1 . YncA tiene un 63% de identidad con PA4688 de Pseudomonas aeruginosas, una sulfoximina de N-acetil-metionina transferasa. Se ha demostrado que la proteína PA4866 de Pseudomonas no acetila la L-metionina (Davies y cois., Biochemistry, 2007).

EJEMPLO 2 Determinación de la especificidad del sustrato YncA Ensayo de especificidad del sustrato La especificidad del sustrato se analizó usando el ensayo basado en DTNB (véase anteriormente).

Especificidad del sustrato Se observan actividades fuertes con sulfona de metionina, sulfóxido de metionina, sulfoximina de metionina y metionina, respectivamente. Se obtuvieron actividades bajas con lisina, glutamato, glutamina, aspartato y asparragina.

El donante de grupos acilo preferente con metionina como sustrato fue el propionil-Coa. La acetill-CoA también funcionó correctamente como donante de grupos acilo en estas condiciones, mientras que el butiril-CoA supuso bajas actividades con metionina como sustrato.

Sustrato % actividad actividad (mUI) metionina 100 745 lisina 1.6 12 sulfoximina de metionina 166.9 1243 sulfóxido de metionina 147.6 1100 sulfona de metionina 178.8 1332 glutamato 0.6 4 glutamine 1.4 10 aspartato 1 7 asparragina 2.4 18 Cuadro 2 Especificidad de sustrato determinada con el método basado en DTNB usando acetil-CoA como donante de grupos acilo. Se muestran varios sustratos, su actividad correspondiente respecto al sustrato metionina en porcentaje y la actividad específica total en mUI/mg de proteína.

Cuadro 3 Actividad de YncA con varios donantes de grupos acilo. El donante de grupos acilo específico se determinó con el método basado en BTNB usando metionina como sustrato. Se muestran varios cosustratos, la actividad correspondiente de YncA respecto al cosustrato acetil-coA en porcentaje y la actividad específica total en mUI/mg de proteína EJEMPLO 3 Sobreexpresión de vncA Articulo I Construcción del plásmido pSCB-CI857-PlambdaR-yncA El plásmido pSCB-CI857-PlambdaR-yncA deriva del vector pSCB (Stratagene). Para la construcción del vector pSCB-CI857-PlambdaR-yncA, primero se construyeron los plásmidos pSCB-CI857-PlambdaR y pSCB-yncA. El fragmento CI857-PlambdaR se amplifica por PCR a partir del plásmido pFC1 (Mermet-Bouvier y Chauvat, 1994) usando los siguientes oligonucleótidos CI857-PlambdaR-F y CI857-PlambdaR-R: CI857-PlambdaR-F: ACCTTGCCGAGGGCCCTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGT AACTCTTA l l l l l l l l Atcagccaaacgtctcttcaggcc (SEQ ID NO 03) con - una región homologa a la región CI857 (letras minúsculas) - una región para la adición de un sitio de restricción Apal (mayúsculas en negrita) con bases adicionales (letras mayúsculas).

CI857-PlambdaR-R GCATTTGCCACTGATGTACCGCCGAACTTCAACACTCTcatat gacctccttagtacatgc (SEQ ID NO 04) con - una región homologa a la región PlambdaR (letras minúsculas) con un sitio de restricción Ndel con bases adicionales (letras mayúsculas) El fragmento amplificado por PCR se clona en el vector pSCB (Stratagene). Los plásmidos recombinantes se verifican por secuenciación del ADN que resulta en el plásmido pSCB-CI857-PlambdaR.

Después, el fragmento yncA (SEQ ID NO 2) se amplifica por PCR a partir del ADN genómico de E. coli MG1655 usando los siguientes oligonucleótidos YncAF e YncAR (secuencias de referencia en la página Web http://ecogene.org/): YncAF: TCCCCCGGGGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTAT AATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACTAAGGAGGTATCAT atgtccatccgttttgcccgc (SEQ ID NO 05) con - una región (letras minúsculas) homologa a la región yncA de 1516870 a 1516850, - una región para la adición de un sitio de restricción Ndel, que se solape con el ATG del gen yncA (en negrita) YncAR: CGGGATCCtcatccaatcgcgtccggttc (SEQ ID NO 06) con - una región (letras minúsculas) homologa a la región yncA de 1516352 a 1516372, - un sitio de restricción BamHI (mayúsculas en negrita) con bases adicionales (letras mayúsculas).

El fragmento amplificado por PCR se clona en el vector pSCB (Stratagene). Los plásmidos recombinantes se verifican por secuenciación del ADN que resulta en el plásmido pSCB-yncA. Los plásmidos pSCB-CI857-PlambdaR y pSCB-yncA se cortan con las enzimas de restricción Nde\ y Bam \, y el fragmento que contiene yncA se clona en los sitios NdeMBamYW del plásmido pSCB-CI857-PlambdaR, que resulta en el plásmido pSCB-CI857-PlambdaR-yncA.

Construcción de la cepa MG1655 mefA*11 AmefJ Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-/77efF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Apy/fA Ap fF Ptrc09-qcvTHP Ap /U (pME101-f/7rA*1-cysE-PqapA-mefA*H ) (pCC1 BAC-se/B-serA-serC) (pSCB-CI857-PlambdaR-yncA) El plásmido pSCB-CI857-PlambdaR-yncA se introduce en una cepa productora de metionina, la cepa MG1655 mefA*1 1 AmeíJ Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Apy/fA Apy/fF ApurU (pME101-rA7rA*1-cysE-PgfapA-mefA*1 1) (pCC1 BAC-serB-serA-ser ), ya descrita en la solicitud de patente PCT/EP2007/060433, dando lugar a la cepa MG1655 mefA*11 AmefJ Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Apy/ A Apy/ F Apurii (pME 01-f 7rA*1-cysE-PgapA-mefA*11) (pCC1 BAC-serB-serA-serC) (pSCB-CI857-PlambdaR-yncA).

EJEMPLO 4 Evaluación de las cepas productoras de metionina con un aumento de acumulación de NAM o NPM.

Las cepas de producción se evalúan en matraces Erlenmeyer pequeños. Se crece un cultivo de 5.5 mi en medio mixto a 30 °C (10% de medio LB, (Sigma 25 %) con 2.5 g.l" de glucosa y 90% de medio mínimo PC1- WO 2007/077041) y se usa para inocular un cultivo de 50 mi a una DO600 de 0,2 en medio mínimo PC1 cultivado a 37 °C. Se añade kanamicina y espectinomicina si fuera necesario a una concentración de 50 mg.l"1, ampicilina a 100 mg G1, cloranfenicol a 30 mg.l"1. Cuando el cultivo haya alcanzado una DO600 de 6 a 7, los aminoácidos extracelulares se cuantifican por HPLC después de derivatización con OPA/Fmoc y se analizan otros metabolitos relevantes usando HPLC con detección refractométrica (ácidos orgánicos y glucosa) y GC-MS después de la sililación. El ensayo se repite tres veces.

Referencias no patentes Klein DC, 2007, J Biol Chem, 282(7):4233-7), - Záhringer y cois., 1993, FEMS Microbiol Lett, 110(3), 331- 4, Lacalle RA, y cois., 1989, Gene 79(2):375-80), Tan W. y cois., 2006, Amino Acids, 30(2): 195-204), Polevoda & Sherman 2000 JBC 275, 47, págs. 36479- 36482), Driessen y cois. 1985, CRC Crit. Rev. Biochem. 18, 281- 325, Marvil & Leisinger 1977 JBC 252, 10 págs. 3295-3303, Davies y cois., 2007, Biochemistry, 46(7), págs. 1829-39, Baker, 2006, Journal of Nutrition 136, págs. 16705-55, Hippe & Warthesen, 1978, Journal of food science 43(3) págs. 793-6, Anderson, 1946, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 32:120-128, Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, New York), Schaefer y cois. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96, Liebl y cois., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205- 210, Riedel y cois. (2001 , J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573- 583, Davies y cois., Biochemistry, 2007.

Claims (22)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. - Un polipéptido aislado con actividad enzimática L-aminoácido-N-acil-transferasa, que comprende la secuencia del SEQ ID NO 1 , un fragmento o una secuencia homologa del mismo.

2. - Un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un polipéptido como el que se reclama en la reivindicación 1.

3. - Un microorganismo modificado con actividad enzimática L-aminoácido-N-acil-transferasa modulada, en el que se potencia la actividad de un polipéptido como el que se reclama en la reivindicación 1.

4. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque se potencia la expresión de al menos otra acil transferasa.

5. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha otra acil transferasa se selecciona entre el grupo formado por argA, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ y combinaciones de los mismos.

6. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la actividad de los genes que catalizan la desacilación de los aminoácidos acilados está atenuada.

7. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho gen que cataliza la desacetilación de los aminoácidos es argE.

8. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque se aumenta la expresión de al menos otro gen implicado en la biosíntesis de la metionina.

9. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho microorganismo se selecciona entre el grupo formado por bacterias, levaduras y hongos.

10. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la bacteria se selecciona del grupo formado por Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae.

11. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque está seleccionado entre el grupo formado por Escherichia coli y Corynebacterium glutamicum.

12. - Un procedimiento para la producción de aminoácidos azufrados N-acilados en un medio, que comprende la puesta en contacto de dicho aminoácido azufrado con un polipéptido como el que se reclama en la reivindicación 1 , en presencia de acil-coenzima A, y la recuperación del aminoácido N-acilado.

13. - Un procedimiento para la producción de aminoácidos azufrados N-acilados, que comprende el cultivo de un microorganismo como el que se reclama en la reivindicación 3, en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre, y una fuente de nitrógeno, y recuperando el aminoácido azufrado N-acilado a partir del medio de cultivo.

14. - Un procedimiento para la producción de aminoácidos N-propionilados, que comprende el cultivo de un microorganismo según la reivindicación 3, en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre, y una fuente de nitrógeno, y recuperando el aminoácido N-propionilado a partir del medio de cultivo.

15. - Un procedimiento para la producción de aminoácidos N-acetilados, que comprende el cultivo de un microorganismo como el que se reclama en la reivindicación 3, en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre, y una fuente de nitrógeno, y recuperando el aminoácido N-acetilado a partir del medio de cultivo.

16. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la fuente de azufre se escoge entre el grupo formado por sulfato, tiosulfato, sulfuro de hidrógeno, ditionato, ditionita, sulfito, metilmercaptano, dimetilsulfuro o una combinación de las diferentes fuentes.

17. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la fuente de azufre es sulfato o tiosulfato, y sus mezclas.

18. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la fuente de carbono deriva de un producto base renovable.

19. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la fuente de carbono es glucosa o sacarosa.

20. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la fuente de nitrógeno se suministra en forma de amonio o amoníaco.

21. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado además porque comprende una etapa adicional para el asilamiento del aminoácido acilado deseado a partir del medio de reacción, el caldo de fermentación y/o a partir de la biomasa.

22. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado además porque el aminoácido acilado recuperado se selecciona entre N-acetil-metionina y N-propionil-metion¡na.