KR20110042383A

KR20110042383A - Ｎ―아실트랜스퍼라제 효소적 활성이 증진된 미생물을 사용한 ｎ―아실화된 황―함유 아미노산의 생산

Info

Publication number: KR20110042383A
Application number: KR1020117006416A
Authority: KR
Inventors: 라이너 피게; 귈롬 바르비에; 그웨나엘르 베스텔-코레
Original assignee: 메타볼릭 익스플로러
Priority date: 2008-08-22
Filing date: 2009-08-21
Publication date: 2011-04-26
Also published as: US20100047880A1; RU2011108706A; US8143031B2; AR073112A1; JP2012500623A; WO2010020289A1; WO2010020682A1; MX2011001961A; CN102131923A

Abstract

본 발명은 L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 효소적 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드, 및 상기 효소가 과다발현되는 변형된 미생물을 주장한다. 상기 효소의 기질로는 주로 메티오닌 및 그의 유도체 또는 유사체를 포함한다. 황-함유 아미노산을 생산하는 미생물에서 과다발현되면 다량의 N-아실화된 황-함유 아미노산이 생산될 수 있다. 발효 배지로부터 N-아실화된 황-함유 아미노산을 단리시키는 것 또한 주장한다.

Description

Ｎ―아실트랜스퍼라제 효소적 활성이 증진된 미생물을 사용한 Ｎ―아실화된 황―함유 아미노산의 생산{PRODUCTION OF N-ACYLATED SULPHUR-CONTAINING AMINO ACIDS WITH MICROORGANISMS HAVING ENHANCED N-ACYLTRANSFERASE ENZYMATIC ACTIVITY}

본 발명은 L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 효소적 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드, 및 상기 효소가 과다발현되는 변형된 미생물을 주장한다. 상기 효소의 기질로는 메티오닌 및 그의 유도체 또는 유사체를 포함한다. 황-함유 아미노산을 생산하는 미생물에서 과다발현되면 다량의 N-아실화된 황-함유 아미노산이 생산될 수 있다. 발효 배지로부터 N-아실화된 황-함유 아미노산을 단리시키는 것 또한 주장한다.

N-아실 트랜스퍼라제는 일반적으로 아실 공여체인 아실-보조효소 A로부터 아미노기로의, 아실기의 전이를 촉매화한다. 아실기는 RC O OH형의 카르복실산으로부터 유도된 관능기이다. 아실기는 탄소와 산소 원자 사이에 이중 결합 (즉, 카르보닐기), 및 R과 탄소 사이에 단일 결합을 갖는 화학식 RC(=O)-를 갖는다. 아실기의 예로는 포르밀 (CH2=O), 아세틸 (C2H4=O), 프로피오닐 (C3H6=O) 및 부티릴 (C4H8=O) 기가 있다.

N-아실 트랜스퍼라제는 원핵 생물 및 진핵 생물에서 중요한 효소이며, 이는 예컨대, 생물학적 타이밍 (문헌 [Klein DC, 2007, J Biol Chem, 282(7):4233-7]), 항생제 내성 (문헌 ([Zaehringer et al, 1993, FEMS Microbiol Lett., 110(3), 331-4]; [Lacalle RA, et al., 1989, Gene 79(2):375-80])) 및 제초제에 대한 내성과 같은 과정에 관여한다. 식물에서, 유전자 생성물 'Bar' 및 'Pat'에 의해 촉매화되는 포스피노트리신의 아실화를 통해 글루포시네이트는 내성을 얻게 된다 (문헌 [Tan W. et al., 2006, Amino Acids, 30(2): 195-204]).

몇몇 N-아실-트랜스퍼라제는 예컨대, 포르밀 또는 아세틸과 같은 기의 전이를 특이적으로 촉매화시키며, 이는 소위 "N-포르밀-트랜스퍼라제" 또는 "N-아세틸-트랜스퍼라제"로 명명된다. 다른 트랜스퍼라제는 더 많은 일반적인 촉매 활성을 가지며, 이는 간단하게 "N-아실-트랜스퍼라제"로 명명된다.

공-번역 과정으로서 메티오닌의 N-말단 아세틸화는 진핵 생물에 있어서 가장 보편적인 단백질 변형 중 하나이다. 그러나, 폴리펩티드의 N-말단을 인식하는 아세틸라제는 유리 아미노산으로서 메티오닌은 인식하지 못한다 (리뷰를 위해 문헌 [Polevoda & Sherman 2000 JBC 275, 47, pp 36479-36482] 참조). 원핵 생물에서는 공-번역 과정으로서 메티오닌의 아세틸화는 드물게 일어나는 과정이다 (문헌 [Driessen et al. 1985, CRC Crit. Rev. Biochem. 18, 281-325]).

N-아실화 효소는 가능하게는 유리 아미노산으로서 메티오닌을 아실화시킬 수 있는 것으로 기술되어 있다. 예를 들면, ArgA는 이. 콜라이(E. coli)에서 N-아세틸-글루타메이트 신타제를 코딩한다 (문헌 [Marvil & Leisinger 1977 JBC 252, 10 pp. 3295-3303]). 메티오닌 유도체, 예컨대, 메티오닌 술폭시민 및 메티오닌 술폰의 N-아세틸화에 대해서는 기술되어 있는 반면 (문헌 [Davies et al, 2007, Biochemistry, 46(7), pp 1829-39]), 유리 메티오닌에 대하여 유의적인 아실화 활성을 갖는 효소에 대해서는 현재 알려진 바가 없다.

N-아세틸-L-메티오닌 (NAM)은 아미노기 상에서 아세틸화된 메티오닌의 유도체이다. NAM은 순수한 메티오닌과 동일한 메티오닌-절약값을 갖는 것으로 나타났다 (문헌 [Baker, 2006, Journal of Nutrition 136, pp. 16705-55]). 이는 또한 대두빵 또는 대두유 내에도 포함되어 있으며, 이는 감각성 검출과 관련하여 순수한 메티오닌보다 더 우수한 성능을 갖는다 (문헌 [Hippe & Warthesen, 1978, Journal of food science 43(3) pp 793-6]).

N-아세틸메티오닌을 화학적으로 생합성하면 D- 및 L-입체이성체의 라세메이트가 생산되고, 그의 L-이성체 뿐만 아니라, N-아세틸-D-메티오닌도 역시 동물에 의해 혼입되지 않는다는 것은 알려져 있다. 탈라세미화는 NAM의 생산을 무익하게 만드는, 고비용의 공정 과정이다. 그러므로, 식품/사료 및 제약학적 용도로 사용하기 위한 순수한 N-아세틸-L-메티오닌을 발효 방법으로 생산하는 것이 경제적으로 실현 가능성이 있는 공정 과정이 될 것이다.

메티오닌의 또 다른 중요한 유도체는, 메티오닌이 아미노산 상에서 프로피오닐화된 것인 N-프로피오닐-L-메티오닌 (이하, NPM)이다.

L-메티오닌의 아실화를 통해 얻은 생성물은 양의 울 생산 (발명의 명칭이 "Propionyl-methionine: Fodder for ruminants"인 US 4,093,740), 및 화장품 생산 (발명의 명칭이 "Fatty Acid Amido-Methionine Products"인 미국 특허 3,624,114)에도 유익한 것으로 나타났다.

발명의 간단한 설명

본 발명은 서열 1의 서열, 그의 단편 또는 상동성 서열을 포함하는, L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 효소적 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 더욱 특히, 단리된 폴리펩티드는 기질인 메티오닌, 리신 및 글루타메이트, 그의 유도체 및 유사체에 대하여 L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 활성을 갖는다.

본 발명은 또한 L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 활성이 변형된, 특히, 증진된 변형된 미생물에 관한 것이다. 상기 미생물은 비변형된 미생물에서 관찰되는 생산량과 비교하여 증가된 N-아실화된 아미노산 생산량을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 서열 1의 서열, 그의 단편 또는 상동성 서열을 포함하는, L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 효소적 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다.

단리된 폴리펩티드는 기질인 메티오닌, 리신, 글루타메이트, 그의 유도체 및 유사체에 대하여 L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 활성을 보이는 것으로 나타났다.

본원에서 사용되는 바, 하기 용어는 특허청구범위 및 명세서를 설명하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따라, "폴리펩티드"라는 용어는 펩티드 결합으로 연결된 2개 이상의 아미노산의 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질을 의미한다.

"단리된"이라는 용어는 천연적으로 결합하고 있는 적어도 하나의 성분으로부터 제거된 단백질 또는 DNA 서열을 의미한다.

"효소 활성" 및 "효소적 활성"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 이는 특이적인 화학 반응, 예를 들면, 메티오닌 N-아세틸 트랜스퍼라제 효소 활성에 대한 메티오닌에서 NAM으로의 전환을 촉매화시킬 수 있는 효소의 능력을 의미한다.

'L-아미노산 N-트랜스아실라제 효소적 활성 또는 L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 활성'이라는 용어는 아실기를 기질의 아미노기에 첨가하는 것, 예컨대, 아실기를 아미노산 메티오닌의 아미노기에 첨가하는 것을 의미한다 (도 1 참조). 바람직하게는, 아실기는 부티릴이고, 보다 바람직하게는, 프로피오닐이며, 보다 더 구체적인 실시양태에서는 아세틸기이다.

메티오닌, 리신, 또는 글루타메이트의 유도체 또는 유사체는 메티오닌 술폭시민, 호모시스테인, 메티오닌 술폰, 메티오닌 술폭시민글루타민 또는 포스피노트리신 (글루포세이트)으로서 정의된다.

본 발명의 단리된 폴리펩티드는 예를 들면, 하기 실시예에 기술되어 있는 정제 방법을 사용함으로써 메티오닌 N-아실 트랜스퍼라제 활성을 갖는 미생물로부터 수득할 수 있다. 폴리펩티드를 단리시키는 데 사용될 수 있는 미생물로는 이. 콜라이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"서열 1의 서열을 포함하는"이라는 용어는, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열 1로만 엄격하게 제한되는 것이 아니라, 추가의 아미노산도 포함할 수 있다는 것을 의미한다. "서열 1의 단편"이라는 용어는, 폴리펩티드의 서열이 서열 1보다는 적은 갯수의 아미노산을 포함하지만, 여전히 L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 활성을 부여하는데 충분한 아미노산을 포함한다는 것을 의미한다. 폴리펩티드는 그의 효소적 활성은 유지하면서, 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실, 및/또는 부가에 의해 변형될 수 있다는 것이 당업계에 주지되어 있다. 예를 들면, 주어진 위치에 있는 하나의 아미노산을, 단백질의 기능적 특성에 영향을 주지 않는 화학적으로 등가인 아미노산으로 치환하는 것이 일반적이다. 본 발명의 목적을 위해, 치환이란 하기 기들 중 하나 내에서 이루어지는 교환으로서 정의된다:

■ 작은 지방족, 비극성 또는 약간의 극성을 띠는 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly

■ 극성, 음으로 하전된 잔기 및 그의 아미드: Asp, Asn, Glu, Gln

■ 극성, 양으로 하전된 잔기: His, Arg, Lys

■ 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val, Cys

■ 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr, Trp.

따라서, 음으로 하전된 하나의 잔기를 또 다른 것으로 치환 (예컨대, 아스파르트산을 글루탐산으로 치환), 또는 양으로 하전된 하나의 잔기를 또 다른 것으로 치환 (예컨대, 아르기닌을 리신으로 치환)시키는 변형을 통해 기능적으로 등가인 생성물이 생산된다고 기대할 수 있다. 아미노산이 변형되는 위치, 및 아미노산 서열 중 변형시키고자 하는 아미노산의 갯수는 특별히 제한되지 않는다. 단백질의 활성에 영향을 미치지 않으면서 도입될 수 있는 변형에 대해서 당업자는 알 수 있다. 예를 들면, 특정 환경하에서는 단백질의 N- 또는 C-말단부에서의 변형이 단백질의 활성을 변경시키지 않는다고 기대할 수 있다.

"상동성"이라는 용어는 원래의 효소적 활성은 계속하여 유지하면서, 예컨대, 상기와 같이 변형이 이루어진 폴리펩티드를 의미한다.

본 발명에 따라, L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 효소적 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열 1에 제시된 서열과 적어도 70%의 동일성, 바람직하게는, 적어도 80%의 동일성, 및 보다 바람직하게는, 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.

2개의 단백질 서열 사이의 동일성(%)을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 서열을 정렬한 후, 웹사이트 상에 명시되어 있는 디폴드 파라미터를 사용하고 웹사이트 http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 상에서 이용가능한 소프트웨어 CLUSTALW를 이용함으로써 동일성(%)을 측정할 수 있다. 정렬로부터 총 갯수의 잔기와 비교하여 동일 위치에 동일한 잔기가 있는 것의 갯수를 기록함으로써 동일성(%)을 쉽게 계산할 수 있다. 별법으로, 웹사이트 상에 명시되어 있는 디폴드 파라미터를 사용하고, 예를 들면, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 상에서 이용가능한 BLAST 프로그램을 이용함으로써 자동적으로 계산할 수 있다.

본 발명에 따라, 아미노산 N-아실 트랜스퍼라제 효소적 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열 1의 서열로부터 적어도 100개의 인접한 아미노산, 바람직하게는, 서열 1에 제시된 서열 중 적어도 120개, 적어도 140개, 적어도 160개 또는 그 초과, 보다 바람직하게는, 적어도 172개의 인접한 아미노산을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, L-아미노산 N-아실 트랜스퍼라제 효소적 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열 1의 서열과 엄격하게 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명자들은 기질인 메티오닌, 리신, 글루타메이트, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 술폰, 메티오닌 술폭시민, 아스파르테이트 및 아스파라긴에 대하여 L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 이. 콜라이로부터 동정했음을 보고하였다. 상기 유전자는 앞서 이. 콜라이에서 yncA로서 알려졌는데, 이는 이. 콜라이의 완전한 게놈 분석시에 동정된 것이다. 상기 유전자는 이미 추정 아실트랜스퍼라제로서 보고된 바 있지만, 그의 구체적인 기능에 대해서는 아직 입증된 바 없다 (http://ecogene.org/). 이는 또한 다중약물 내성에 관여하는, Mar-조절형 유전자의 발현을 조정하는 화합물을 확인하는 방법에서 Mar-조절형 유전자로서도 보고되었다 (WO 01/70776).

"폴리뉴클레오티드"라는 용어는, 임의로는 합성, 비천연, 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 함유하는 싱글 또는 더블 스트랜드의, 리보뉴클레오티드 (또는 RNA)의 중합체, 또는 데옥시리보뉴클레오티드 (또는 DNA)의 중합체를 의미하는 것이다. DNA 형태의 단리된 폴리뉴클레오티드는 합성 DNA, 게놈 DNA 또는 cDNA의 하나 이상의 세그먼트를 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드의 기원이 반드시 효소적 활성이 원래 측정돠는 유기체일 필요는 없다. 당업자는 상이한 엄격한 조건하에서의 서열 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브와의 하이브리드화를 사용하여 상기 폴리뉴클레오티드에 대한 유전자 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 하이브리드화에 대한 상세한 프로토콜은 문헌 [Sambrook et al. (1989)]에 개시되어 있다.

상기 폴리뉴클레오티드의 서열은, 예를 들면, 상기 정의된 바와 같은 BLAST 프로그램을 사용하고, 서열 2의 뉴클레오티드 서열과의 상동성에 대해서 조사하거나, 또는 서열 1의 폴리펩티드 서열과의 것을 조사하고 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 검색함으로써 데이터베이스로부터 추출해 낼 수 있다.

본 발명의 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명의 보다 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명의 보다 바람직한 뉴클레오티드는 서열 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명의 보다 더 바람직한 뉴클레오티드는 서열 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드이다.

특히, 서열 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 포함된다.

"코딩하는"(encoding" 또는 "coding")이라는 용어는 전사 및 번역이라는 기전을 통해 폴리뉴클레오티드가 아미노산 서열을 생산하는 과정을 의미한다. 이러한 과정은, DNA의 염기 서열과 단백질의 아미노산 서열 사이의 관계인 유전자 코드에 의해 이루어질 수 있다. 유전자 코드의 한가지 중요한 특징은 축퇴성인데, 이는 하나의 아미노산이 1 초과의, 3개로 이루어진 염기 (3개로 이루어진 염기가 하나의 "코돈"이 된다)에 의해 코딩될 수 있다는 것을 의미한다. 상기에 대한 직접적인 결과는 동일한 아미노산 서열이 상이한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다는 점이다. 일례로, 유전자 코드의 축퇴성에 의해서 서열 2로부터 유도된 폴리뉴클레오티드 서열 또한 서열 1의 폴리펩티드 서열을 코딩할 수 있으며, 따라서, 이는 본 발명으로서 주시된다. 다른 유기체에서는 다른 코돈을 사용할 수 있다는 것이 당업자에게는 주지되고 있다. 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 중, 몇몇은 주어진 미생물에 의해 우선적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 유기체에서 상응하는 단백질의 발현을 최적화시키기 위해 특정 미생물의 코돈 사용 빈도에 적합화된 폴리뉴클레오티드를 디자인하는 것이 관심의 대상이 될 수 있다.

본 발명은 또한 숙주 미생물 중에서 기능성인 조절 요소의 제어하에 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.

"발현"이라는 용어는 유전자 서열을 전사 및 번역시켜 상응하는 단백질, 유전자 생성물을 생성하는 것을 의미한다.

"발현 카세트"라는 것은 바람직하게는, 적합한 숙주 유기체 내부에서 폴리뉴클레오티드 중에 포함되어 있는 유전자가 발현될 수 있도록 하는 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 인핸서, 리보좀 결합 부위, 또는 종결인자에 연결되어 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기와 같은 조절 요소는 유전자 자신의 조절 요소일 수 있고, 또한 유전자가 더욱 강한 발현을 할 수 있도록 하는 변형된 요소 또는 합성 요소일 수도 있다. 예를 들면, 유전자의 천연 프로모터를 보다 강한 프로모터로 대체함으로써 더욱 강한 발현을 할 수 있게 만들 수 있다. 이. 콜라이의 경우, 이러한 프로모터로는 예를 들면: lac 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터 및 람다 cI 프로모터가 있다. 다른 유기체의 경우, 당업자는 가장 적절한 것을 선택할 수 있다.

"숙주 미생물"라는 용어는, 외부 또는 이종성 유전자, 또는 그 자신 유전자의 추가 카피를 받을 수 있고, 상기 유전자를 발현시킴으로써 활성을 띠는 단백질 생성물을 생산해 낼 수 있는 미생물을 의미한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 발현 카세트, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환 벡터에 관한 것이다.

"형질전환"이라는 용어는 DNA, 예컨대, 새 유전자, 또는 현존하는 유전자의 추가 카피를 숙주 유기체 내로 도입하는 것을 의미한다. 획득한 유전자를 염색체 DNA 내로 혼입시킬 수 있거나, 염색체외 요소로서 도입할 수 있다. 일례로, 이. 콜라이에서 DNA를 숙주 유기체 내로 전이시키는 방법은 전기천공이다.

"형질전환 벡터"라는 용어는 폴리뉴클레오티드를 숙주 유기체 내로 도입시키는 데 사용되는 임의의 비히클을 의미한다. 그러한 비히클은 예를 들면, 플라스미드, 파지, 또는 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 것으로서, 사용되는 유기체 따라 다른 다른 요소일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 발현 카세트 이외에도, 형질전환 벡터는 일반적으로 특정 숙주 세포의 형질전환을 촉진시켜 주는 다른 요소를 포함한다. 발현 벡터는 발현 카세트가 수용하고 있는 유전자가 적합하게 발현될 수 있도록 하는 발현 카세트 및 숙주 유기체에서 벡터가 복제될 수 있도록 하는 추가의 요소를 포함한다. 발현 벡터는 숙주 유기체 중에 단일 카피로 또는 다중 카피로 존재할 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서는, 본 발명에 따른 카세트 또는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 통합될 수 있도록 허용하는 것인 벡터 또는 단리된 DNA 단편을 미생물 내로 도입한다. 당업자는 유전자를 염색체에 통합시키는 데 유용한 각종의 상이한 벡터에 대해서 알고 있을 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른, L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드의 활성이 증진된 것인, 조절된 L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 효소적 활성을 갖는 변형된 미생물을 제공한다.

"변형된 미생물"이라는 용어는 발효 브로쓰에 축적되는 N-아실화된 생성물의 양을 증가시키기 위한 목적하에 유전적으로 변형된 미생물을 의미한다. 당업자는 특정 유전자의 발현을 조정하는 방법에 대해서 알고 있을 것이다. 일반적인 변형으로는 미생물을 유전자 요소로 형질전환시키는 것을 포함하며, 이는 유전자 결실, 유전자 치환, 프로모터의 변형, 및 이종성 유전자의 발현을 위한 벡터의 도입을 포함한다.

"폴리펩티드의 활성"이라는 용어는 측정가능하고, 본 반응을 촉매화하는 L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제의 활성과 직접적인 상관관계가 있는 최종 생성물로 기질을 형질변환시키는 것을 특징으로 하는 효소적 활성을 의미한다.

본 발명의 N-아실 트랜스퍼라제 폴리펩티드의 경우 "활성 증진"이라는 용어는 변형시키기 이전의 동일 미생물과 비교하였을 때, 형질전환된 미생물을 사용하여 N-아실화된 생성물, 특히 황-함유 아미노산을 생산할 경우, 그 생산량이 증가된 것을 의미한다.

예를 들면, 활성이 증가된 변이체를 제조하고, 그를 발현시키거나, 더욱 특히, N-아실 트랜스퍼라제 폴리펩티드를 과다발현시킴으로써 본 발명의 N-아실 트랜스퍼라제 폴리펩티드에 대한 활성을 증진시킬 수 있다. 예컨대, 존재할 경우, 본 폴리펩티드를 코딩하는 천연 유전자의 발현에 영향을 주는 인자의 발현을 조정하는 것과 같이, 당업계에 공지된 상이한 수단에 의해 과다발현시킬 수 있다. 또한, 존재할 경우, 예컨대, 인핸서와 같이, 당업계에 공지된 것으로서 유전자 생성물이 보다 강력하게 발현될 수 있도록 하는 조절 요소를 사용하여 상기의 천연 유전자 프로모터를 변형시키거나, 또는 결국은 공지되어 있는 강력한 프로모터를 사용함으로써 과다발현시킬 수 있다. 또한, 강력한 프로모터의 제어하에 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 새로운 유전자를 도입함으로써, 결국에는 상기 유전자의 다중 카피를 사용하여 과다발현시킬 수 있다.

미생물을 형질전환시키는 모든 기법, 및 본 발명의 단백질의 생산량을 증진시키는 데 사용되는 조절 요소는 당업계에 주지되어 있으며, WO 2008/052973, WO 2008/052595, WO 2008/040387, WO 2007/144346, WO 2007/141316, WO 2007/077041, WO 2007/017710, WO 2006/082254, WO 2006/082252, WO 2005/111202, WO 2005/073364, WO 2005/047498, WO 2004/076659 (본 문헌의 내용은 본원에서 참고로 인용된다)을 포함하는, 다양한 미생물에서의 생합성 경로 변형에 관한 본 출원인의 특허 출원을 비롯한 문헌에서 이용가능하다.

더욱 특히, N-아실화된 생성물의 증진된 생산량 수준은 배양 배지에서 측정될 수 있다.

배지 중 N-아실화된 생성물의 생산량/축적량 수준을 분석한다. N-아실화된 생성물의 축적량은 비변형된 유기체를 사용한 동일한 과정에서의 축적량의 적어도 20% 만큼, 바람직하게는, 50% 만큼, 보다 바람직하게는, 75% 만큼, 및 보다 더 바람직하게는, 95% 만큼 증가되어 있다.

NAM의 축적량은 표준으로서 NAM (시그마(Sigma), Ref 01310)을 사용하고, 굴절계 HPLC를 사용함으로써 발효 브로쓰에서 측정한다. N-프로피오닐-메티오닌의 양은 표준으로서 NAM (시그마, Ref 01310)을 사용하고, GC-MS를 사용함으로써 발효 브로쓰에서 측정한다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 1종 이상의 다른 아실트랜스퍼라제의 발현이 본 발명의 변형된 미생물에서 증가된다. ArgA (N-아세틸글루타메이트 신타제), YjdJ, YfaP, YedL, YjhQ를 비롯한, 상기 효소, 및 그의 코딩 서열은 당업계에 공지되어 있다. 적어도, 이들 유전자들 중 하나의 발현이 증가되는데, 이는 상기 유전자들의 조합들의 증가 또한 본 발명의 미생물에서 주시된다는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아실화된 아미노산의 탈아실화를 촉매화시키는 유전자의 활성은 감쇠된다. 바람직하게는, 당업계에 공지된 상기 유전자의 발현을 감쇠시킴으로써 그의 활성을 감쇠시킬 수 있다. 특히, NAM 탈아세틸화를 촉매화시키는 효소를 코딩하는 것인 argE 유전자의 발현을 감쇠시킨다.

본 발명의 또 다른 특정 실시양태에서, 메티오닌 생합성에 관여하는 1종 이상의 유전자의 발현이 증가된다. 메티오닌 생합성에 관여하는 유전자는 예컨대, WO 2007/077041 및 WO 2005/108561 (본원에서 참고로 인용된다)과 같은 특허 출원에 상세히 기술되어 있다.

바람직하게는, 본 발명의 미생물은 세균, 효모 또는 진균으로 구성된 군 중에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 세균은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae)로 구성된 군 중에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 미생물은 에스케리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 살모넬라(Salmonella), 바실러스(Bacillus) 또는 코리네박테륨(Corynebacterium)의 종들이다. 보다 더 바람직하게는, 세균은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로 구성된 종 중에서 선택된다.

본 발명은 또한 아실-보조효소 A의 존재하에서 상기 및 하기에 개시된 바와 같은 L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 효소적 활성을 갖는 폴리펩티드와 아미노산을 접촉시키는 단계, 및 N-아실화된 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 배지 중에서 N-아실화된 아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 배지는 그 안에서 효소적 활성이 일어날 수 있는 임의의 배지로서 정의된다. 일반적으로는 효소의 최적의 활성을 위한 pH로 적합화된 수용액으로 구성된다.

당업자는 이러한 촉매적 형질변환이 일어날 수 있도록 하는 데 가장 적절한 조건을 선택할 수 있다.

본 발명은 또한 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 중에서 본 발명에 따른 미생물을 배양하고, 상기 배양 배지로부터 N-아실화된 황-함유 아미노산을 회수함으로써, N-아실 황-함유 아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 생산된 N-아실화된 황-함유 아미노산은 N-아세틸-메티오닌이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 생산된 N-아실화된 아미노산은 N-프로피오닐-메티오닌이다.

'적절한 배양 배지'는 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는, 본 미생물의 배양 및 성장에 적절한 배지이다. 그러한 배지는 미생물 발효 분야의 당업자에게 주지되어 있고, 배양되는 미생물에 따라 달라진다.

본 발명에 따른 '탄소 공급원'이라는 용어는 헥소스 (예컨대, 글루코스, 갈락토스 또는 락토스), 펜토스, 단당류, 이당류 (예컨대, 수크로스, 셀로비스 또는 말토스), 올리고당, 당밀, 전분 또는 그의 유도체, 헤미셀룰로스, 글리세롤 및 그의 조합일 수 있는, 미생물의 정상적인 성장을 지지하기 위하여 당업자가 사용할 수 있는 임의의 탄소의 공급원을 의미한다. 특히 바람직한 단순 탄소 공급원은 글루코스이다. 또 다른 바람직한 단순 탄소 공급원은 수크로스이다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 탄소 공급원은 재생가능한 공급 원료로부터 유도된다. 재생가능한 공급 원료란 그가 원하는 생성물로 형질변환될 수 있도록 허용하는 충분한 양으로 단시간의 지체 시간 이내에 재생될 수 있는, 특정 산업 공정에 필요한 원료로서 정의된다.

특히, 질소 공급원은 암모늄 염 또는 암모니아 기체이다. 질소 공급원은 암모늄 또는 암모니아 형태로 공급될 수 있다.

발효에 의한 L-메티오닌, 그의 전구체, 또는 그의 유도된 화합물의 생산에 사용되는 황 공급원은 하기: 술페이트, 티오술페이트, 황화수소, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트, 메틸메르캅탄, 디메틸디술피드 또는 그의 조합 중 임의의 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 황 공급원은 술페이트 및/또는 티오술페이트이다.

발효는 일반적으로 사용되는 미생물에 대하여 적합화된 적절한 배양 배지를 포함하며, 적어도 하나의 단순 탄소 공급원과, 필요한 경우, 대사 산물의 생산에 필요한 공-기질도 포함하는 발효기에서 수행된다.

이. 콜라이용으로서 공지되어 있는 배양 배지의 일례로서, 배양 배지는 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 32:120-128]), M63 배지 (문헌 [Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]) 또는 문헌 [Schaefer et al. (1999, Anal . Biochem. 270: 88-96)]에 기재되어 있는 것과 같은 배지와 동일하거나 유사한 조성을 가진 것일 수 있다.

C. 글루타미쿰(C. glutamicum)용으로서 공지되어 있는 배양 배지의 일례로서, 배양 배지는 BMCG 배지 (문헌 [Liebl et al., 1989, Appl . Microbiol . Biotechnol. 32: 205-210]), 또는 예컨대, 문헌 [Riedel et al. (2001, J. Mol . Microbiol. Biotechnol . 3: 573-583])에 기재되어 있는 것과 같은 배지와 동일하거나 유사한 조성을 가진 것일 수 있다.

당업자는 본 발명에 따른 미생물을 위한 배양 조건을 한정할 수 있다. 특히, 세균을 20℃ 내지 55℃ 사이, 바람직하게는, 25℃ 내지 40℃ 사이, 더욱 특히, C. 글루타미쿰의 경우에는 약 30℃, 및 이. 콜라이의 경우에는 약 37℃의 온도에서 발효시킨다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 본 방법은 반응 배지, 발효 브로쓰의 구성 성분으로부터, 및/또는 임의로는 최종 생성물 일부 또는 전체량 (0-100%) 중에 남아있는 바이오매스로부터 원하는 N-아실화된 아미노산을 단리시키는 단계를 추가 단계로서 포함한다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 본 방법은 포스페이트 및/또는 칼륨에 대해서 미생물을 제한하거나 그에 대한 기아성을 갖도록 만드는 것을 포함한다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 회수된 아실화된 아미노산은 N-아세틸-메티오닌 및 N-프로피오닐-메티오닌 중에서 선택된다.

도면의 간단한 설명

도 1은 보조인자로서 아세틸-보조효소 A를 사용하고 효소 YncA에 의해 촉매화됨에 따른 L-메티오닌의 N-아세틸-L-메티오닌으로의 N-아세틸화를 나타낸다.

실시예

실시예 1: MNAT (메티오닌 N-아실 트랜스퍼라제 ) 활성 정제

시험관내 MNAT 활성 시험

DTNB를 포함하는 HS-CoA의 형성을 모니터링함으로써 마이크로타이터 플레이트에서 메티오닌 L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 활성에 대해 조사하였다. 200 mM 트리스-HCl (pH 9.0), 100 μM DTNB, 3 mM 아세틸-coA 및 20 mM 메티오닌을 함유하는 반응 용액에 본 샘플을 첨가하였다. μ콴트(μQuant) 마이크로타이터 플레이트 판독기 (미국 바이오테크 인스트루멘츠 인코포레이티드(BioTek Instruments, Inc.))를 사용하여 408 nm에서 DTNB-CoA 복합체의 형성에 대하여 모니터링하였다.

MNAT 정제

건식 중량이 약 3 g인 세포를 추출용 완충액 (EB) (50 mM 포스페이트 (pH 7.0), 50 μM PLP, 500 μM DTT)을 사용하여 3회에 걸쳐 세정하고, 70 mL EB 중에 현탁시켰다. UW2070 프로브 및 SH70G 팁 (6 버스트, 30 s, 100% 효율, 75 W)이 장착된 반델린 소노플러스(Bandelin Sonoplus) 초음파 균질기 (독일에 소재하는 반델린 일렉트로닉(Bandelin Electronic))로 로젯트(Rosett) 세포를 초음파 처리함으로써 세포를 분해하였다. 조 추출물을 원심분리하고 (30 분, 12,000 g, 4℃), 고체 황산암모늄을 상등액에 첨가하여 최종 농도가 2.3 M이 되도록 하고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 용액을 원심분리하고 (15 분, 15,000 g, 4℃), 펠릿을 40 mL 포스페이트 완충액 (50 mM 포스페이트 (pH 7.0)) 중에 현탁시켰다. 고체 황산암모늄을 첨가하여 최종 농도가 1.5 M이 되도록 하고, 용액을 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시킨 후, 원심분리하였다 (15 분, 15,000 g, 4℃). AKTA 정제 장치 유니트 (미국에 소재하는 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences)) 및 그의 소프트웨어 (유니콘 소프트웨어(Unicorn software); 미국에 소재하는 아머샴 바이오사이언시즈)를 사용하여 상등액을 추가로 처리하였다. 이어서, 앞서 10 충진 부피의 포스페이트 완충액으로 평형화된 페닐-HP(Phenyl-HP) 칼럼 (스웨덴에 소재하는 GE 헬쓰케어 바이오사이언시즈 AB(GE Healthcare Bio-Sciences AB))에 상기 용액을 가하였다. 1 mL/분 유속으로 포스페이트 완충액 중에서 1.5 내지 0 mM 황산암모늄 구배로 단백질을 용리시켰다. 약 0.5 mM 황산암모늄에서 가장 큰 활성을 띠는 분획을 수득하였고, 이를 4℃에서 밤새도록 20 mM 트리스 (pH 7.0) 완충액에 대하여 투석하였다. 이어서, 10 충진 부피의 20 mM 트리스 (pH 7.0)로 평형화된 리소스Q(ResourceQ) 칼럼 (스웨덴에 소재하는 GE 헬쓰케어 바이오사이언시즈 AB)을 사용하여 음이온 크로마토그래피시키고, 2 mL/분 유속으로 0 내지 0.5 M NaCl 범위의 20 mM 트리스 (pH 7.0) NaCl 구배 완충액을 사용하여 용리시켰다. NaCl 농도 약 0.25 M에서 가장 큰 활성을 띠는 분획이 용리되었다. 겔 여과 단계를 수행하기 전에, 아미콘 울트라 15(Amicon ultra 15) 필터 (미국에 소재하는 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation))를 단백질 용액을 농축시켰다. 2 충진 부피의 20 mM 트리스, 150 mM NaCl 완충액으로 평형화된 수퍼덱스(Superdex) 200 칼럼 (스웨덴에 소재하는 GE 헬쓰케어 바이오사이언시즈 AB)을 통해 농축된 추출물을 통과시켰다. 가장 큰 MNAT 활성을 갖는 분획을 용리 부피 약 15.3 mL에서 수득하였는데, 이는 분자량 36 kDa에 상응하는 것이었다. 마지막으로, 앞서 제조사의 설명서에 따라 평형화된 바이오-스케일(Bio-scale) 세라믹 하이드록실아파타이트 칼럼 (미국에 소재하는 바이오래드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories)) 상에 단백질 용액을 가하고, 2 mL/분 유속으로 10 내지 500 mM 포스페이트 완충액 구배 (pH 6.8)를 사용하여 용리시켰다. 가장 큰 활성을 갖는 분획을 용리 농도 약 130 mM의 포스페이트에서 수득하였다. 상기 분획들을 변성 SDS 겔 전기천공시킨 결과, 정제하는 동안 약 17 kDa 밴드가 강화된 것으로 나타났다.

밴드 분석

SDS 겔 전기천공 후, 17 kDa 부위의 밴드를 잘라내어 트립신으로 분해하였다. 분해된 단백질을 CapLC-Q-TOF2 (미국에 소재하는 워터스 코포레이션(Waters Corporation)) 상에서 나노LC-MS/MS에 의해 분석하고, 그 결과를 프로테인링스 글로벌 서버(ProteinLynx Global Server) (미국에 소재하는 워터스 코포레이션) 및 마스코트(Mascot) (매트릭스 사이언스((Matrix Science))를 사용하여 프로세싱하였다. 정제된 단백질은 YncA로서 GCN5 관련 아실 트랜스퍼라제인 것으로 확인되었다. 서열은 서열 1에 제시되어 있다. YncA는 N-아세틸-메티오닌 술폭시민트랜스퍼라제인, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosas)로부터 유래된 PA4688과 63%의 동일성을 가졌다. 슈도모나스 PA4866 단백질은 L-메티오닌을 아세틸화시키지 않았다는 것으로 밝혀져 있다 (문헌 [Davies et al., Biochemistry, 2007]).

실시예 2: YncA 기질 특이성의 측정

기질 특이성 시험

DTNB에 기초하는 분석법 (상기 참조)을 사용하여 기질 특이성을 시험하였다.

기질 특이성

메티오닌 술폰, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 술폭시민 및 메티오닌, 각각에 대하여 강한 활성이 관찰되었다. 리신, 글루타메이트, 글루타민, 아스파르테이트 및 아스파라긴에 대하여는 약한 활성이 관찰되었다.

기질로서 메티오닌에 대하여 바람직한 아실-공여체는 프로피오닐-CoA였다. 아세틸-CoA 또한 이 조건하에서는 아실 공여체로서 적절하게 작용한 반면, 부티릴-CoA는 기질로서 메티오닌에 대하여 약한 활성을 나타내었다.

실시예 3: yncA 의 과다발현

플라스미드 pSCB - CI857 -P 람다 R- yncA 의 작제

플라스미드 pSCB-CI857-P람다R-yncA는 벡터 pSCB (스트라타진(Stratagene))로부터 유도되었다. pSCB-CI857-P람다R-yncA 벡터를 작제하기 위해, pSCB-CI857-P람다R 및 pSCB-yncA 플라스미드를 먼저 작제하였다. 하기 올리고뉴클레오티드, CI857-P람다R-F 및 CI857-P람다R-R을 사용하여 pFC1 플라스미드 (문헌 [Mermet-Bouvier and Chauvat, 1994])로부터 CI857-P람다R 단편을 PCR 증폭시켰다:

CI857-P람다R-F:

(여기서, - CI857 부위에 상동성을 갖는 부위 (소문자 표시)

- 추가 염기 (대문자 표시)와 함께 ApaI 제한 부위가 추가되는 부위 (굵은체의 대문자로 표시))

CI857-P람다R-R

(여기서, - 추가 염기 (대문자 표시)와 함께 NdeI 제한 부위를 포함하는 P람다R 부위에 상동성을 갖는 부위 (소문자 표시)).

PCR로 증폭된 단편을 pSCB 벡터 (스트라타진) 내로 클로닝하였다. DNA 서열 분석하여 재조합 플라스미드를 확인하고, 그를 통해 pSCB-CI857-P람다R 플라스미드를 수득하였다.

이어서, 하기 올리고뉴클레오티드, YncAF 및 YncAR (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)을 사용하여 콜라이 MG1655의 게놈 DNA로부터 yncA 단편 (서열 2)을 PCR 증폭시켰다:

YncAF:

(여기서, - 1516870 내지 1516850의 yncA 부위에 상동성을 갖는 부위 (소문자 표시)

- yncA 유전자의 ATG (굵은체)와 중복되고, NdeI 제한 부위가 추가되는 부위)

YncAR:

(여기서, - 1516352 내지 1516372의 yncA 부위에 상동성을 갖는 부위 (소문자 표시)

- 추가 염기 (대문자 표시)와 함께 BamHI 제한 부위 (굵은체의 대문자로 표시)).

PCR로 증폭된 단편을 pSCB 벡터 (스트라타진) 내로 클로닝하였다. DNA 서열 분석하여 재조합 플라스미드를 확인하고, 그를 통해 pSCB-yncA 플라스미드를 수득하였다. 제한 효소 NdeI 및 BamHI을 사용하여 pSCB-CI857-P람다R 및 pSCB-yncA 플라스미드를 절단하고, yncA를 포함하는 단편을 pSCB-CI857-P람다R 플라스미드의 NdeI/BamHI 부위 내로 클로닝하여, 플라스미드 pSCB-CI857-P람다R-yncA를 수득하였다.

균주 MG1655 met A *11 Δ met J Ptrc - met H Ptrc36 - ARNmst17 - met F PtrcF - cys PUWAM PtrcF - cys JIH Δ pyk A Δ pyk F Ptrc09 - gcvTHP Δ pur U ( pME101 - thr A *1- cys E -P gap A- met A*11) ( pCC1BAC - ser B - ser A - ser C ) ( pSCB - CI857 -P 람다 R- ync A ) 작제

이미 특허 출원 PCT/EP2007/060433에서 기술된 바 있는 것으로서, 메티오닌을 생산하는 균주인 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11) (pCC1BAC-serB-serA-serC) 균주 내로 플라스미드 pSCB-CI857-P람다R-yncA를 도입하여 균주 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF Δp u rU (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11) (pCC1BAC-serB-serA-serC) (pSCB-CI857-P람다R-yncA)를 수득하였다.

실시예 4: NAM 또는 NPM 의 축적이 증가된 , 메티오닌 생산 균주에 대한 평가

생산 균주를 작은 에를렌마이어 플라스크에서 평가하였다. 5.5 mL의 사전배양물을 혼합 배지 중 30℃에서 성장시키고 (2.5 g.L^-1 글루코스를 포함하는 10% LB 배지 (시그마 25%) 및 90% 최소 배지 PC1의 혼합 배지-WO 2007/077041), 이를 사용하여 37℃에서 배양된 최소 배지 PC1 중에 OD₆₀₀이 0.2가 되도록 50 mL 배양물을 접종하였다. 필요하다면, 카나마이신 및 스펙티노마이신을 50 mg.L^-1의 농도로, 암피실린은 100 mg.L^-1로, 클로람페니콜은 30 mg.L^-1로 첨가하였다. 배양물의 OD₆₀₀이 6 내지 7에 도달하였을 때, OPA/Fmoc 유도체화를 수행한 후, HPLC에 의해 세포외 아미노산을 정량하고, 다른 관련 대사 산물에 대해서는 굴절계 검출과 함께 HPLC (유기산 및 글루코스에 대해), 및 실릴화 후 GC-MS를 사용하여 분석하였다. 본 시험을 3회에 걸쳐 반복하였다.

비특허 문헌

SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER FIGGE, RAINER BARBIER, GUILLAUME BESTEL-CORRE, GWENAELLE <120> PRODUCTION OF N-ACYLATED SULPHUR-CONTAINING AMINO ACIDS WITH MICROORGANISMS HAVING ENHANCED N-ACYLTRANSFERASE ENZYMATIC ACTIVITY <130> D26643 <150> US 12/370,434 <151> 2009-02-12 <150> PCT/EP2008/060999 <151> 2008-08-22 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 172 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ser Ile Arg Phe Ala Arg Lys Ala Asp Cys Ala Ala Ile Ala Glu 1 5 10 15 Ile Tyr Asn His Ala Val Leu Tyr Thr Ala Ala Ile Trp Asn Asp Gln 20 25 30 Thr Val Asp Ala Asp Asn Arg Ile Ala Trp Phe Glu Ala Arg Thr Leu 35 40 45 Ala Gly Tyr Pro Val Leu Val Ser Glu Glu Asn Gly Val Val Thr Gly 50 55 60 Tyr Ala Ser Phe Gly Asp Trp Arg Ser Phe Asp Gly Phe Arg His Thr 65 70 75 80 Val Glu His Ser Val Tyr Val His Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Leu 85 90 95 Gly Arg Lys Leu Leu Ser Arg Leu Ile Asp Glu Ala Arg Asp Cys Gly 100 105 110 Lys His Val Met Val Ala Gly Ile Glu Ser Gln Asn Gln Ala Ser Leu 115 120 125 His Leu His Gln Ser Leu Gly Phe Val Val Thr Ala Gln Met Pro Gln 130 135 140 Val Gly Thr Lys Phe Gly Arg Trp Leu Asp Leu Thr Phe Met Gln Leu 145 150 155 160 Gln Leu Asp Glu Arg Thr Glu Pro Asp Ala Ile Gly 165 170 <210> 2 <211> 519 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atgtccatcc gttttgcccg caaagccgac tgtgctgcca ttgcggaaat ttataaccac 60 gccgtgttgt atacggcggc tatctggaat gaccaaacgg tggatgctga taaccgcatt 120 gcctggtttg aagcgcggac tttagcaggt tatccagtgc tggtgagcga ggaaaacggc 180 gtagtgacgg gatatgcctc gtttggcgac tggcgtagtt tcgatggttt tcgccatacc 240 gtggaacatt cggtttatgt ccatcccgat catcagggca aaggtctggg gcgtaaattg 300 ttaagccgat tgattgatga agcgcgggat tgcgggaagc atgtcatggt cgccgggatc 360 gaatcgcaaa atcaggcctc gctgcatctc caccagtcgc tgggatttgt cgtcaccgcg 420 caaatgccgc aggtaggcac taaatttggt cgttggctgg atctgacatt tatgcagttg 480 caactcgacg agcgcactga accggacgcg attggatga 519 <210> 3 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 accttgccga gggccctaaa aataagagtt accttaaatg gtaactctta ttttttttat 60 cagccaaacg tctcttcagg cc 82 <210> 4 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 gcatttgcca ctgatgtacc gccgaacttc aacactctca tatgacctcc ttagtacatg 60 c 61 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 cgggatcctc atccaatcgc gtccggttc 29 <210> 6 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 tcccccgggg agctgttgac aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc 60 ggataacaat ttcacactaa ggaggtatca tatgtccatc cgttttgccc gc 112

Claims

서열 1의 서열, 그의 단편 또는 상동성 서열을 포함하는, L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 효소적 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드.
제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제1항의 폴리펩티드의 활성이 증진된 것인, 조절된 L-아미노산-N-아실 트랜스퍼라제 효소적 활성을 갖는 변형된 미생물.
제3항에 있어서, 1종 이상의 다른 아실 트랜스퍼라제의 발현이 증가된 것인 미생물.
제4항에 있어서, 상기 다른 아실-트랜스퍼라제가 argA, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ 및 그의 조합으로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 미생물.
제3항에 있어서, 아실화된 아미노산의 탈아실화를 촉매화시키는 유전자의 활성이 감쇠된 것인 미생물.
제6항에 있어서, 아실화된 아미노산의 탈아실화를 촉매화시키는 상기 유전자가 argE인 것인 미생물.
제3항에 있어서, 메티오닌 생합성에 관여하는 1종 이상의 유전자의 발현이 증가된 것인 미생물.
제3항에 있어서, 상기 미생물이 세균, 효모 및 진균으로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 미생물.
제9항에 있어서, 세균이 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae)로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 미생물.
제10항에 있어서, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 미생물.
아실-보조효소 A의 존재하에서 황-함유 아미노산을 제1항의 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및 N-아실화된 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 배지 중에서 N-아실화된 황-함유 아미노산을 생산하는 방법.
탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 중에서 제3항에 따른 미생물을 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 N-아실화된 황-함유 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, N-아실화된 황-함유 아미노산을 생산하는 방법.
탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 중에서 제3항에 따른 미생물을 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 N-프로피오닐화된 황-함유 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, N-프로피오닐화된 아미노산을 생산하는 방법.
탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 중에서 제3항에 따른 미생물을 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 N-아세틸화된 황-함유 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, N-아세틸화된 아미노산을 생산하는 방법.
제13항에 있어서, 황 공급원이 술페이트, 티오술페이트, 황화수소, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트, 메틸메르캅탄, 디메틸디술피드 및 그의 조합으로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 황 공급원이 술페이트 또는 티오술페이트, 및 그의 혼합물인 것인 방법.
제13항에 있어서, 탄소 공급원이 재생가능한 공급 원료로부터 유도된 것인 방법.
제13항에 있어서, 탄소 공급원이 글루코스 또는 수크로스인 방법.
제13항에 있어서, 질소 공급원이 암모늄 또는 암모니아 형태로 공급되는 것인 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 반응 배지, 발효 브로쓰로부터, 및/또는 바이오매스로부터 원하는 아실화된 아미노산을 단리시키는 단계를 추가 단계로서 포함하는 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 회수된 아실화된 아미노산이 N-아세틸-메티오닌 및 N-프로피오닐-메티오닌 중에서 선택되는 것인 방법.