CN103038357B - 用于生产鼠李糖脂的细胞和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产鼠李糖脂的细胞和核酸及其用途，并且还涉及用于生产鼠李糖脂的方法。

Description

用于生产鼠李糖脂的细胞和方法
发明领域
本发明涉及用于生产鼠李糖脂的细胞和核酸以及其用途，并且还涉及用于生产鼠李糖脂的方法。
现有技术
表面活性剂目前基本上以石油化学原料为基础生产。由于可预见的石油化学原料的短缺以及对基于可再生原料或生物可降解的产品增加的需求，使用基于可再生原料的表面活性剂是合适的替代选择。
鼠李糖脂由一个(单鼠李糖脂)或两个鼠李糖基(双鼠李糖脂)以及一个或两个3-羟基脂肪酸残基组成(参见，Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology,2010,第3037-51页)。它们具有表面活性的性能，这在各种各样的作为表面活性剂的应用中是必需的(参见Leitermann et al.,2009)。
目前，这些脂类利用不同的人-和动物-致病菌的野生型分离菌，特别是假单胞菌属(Pseudomonas)和伯克氏菌属(Burkholderia)的代表菌来产生(参见，Handbook ofHydrocarbon and Lipid Microbiology,2010,第3037-51页)。这些生产生物体能够导致疾病的事实大大降低了客户对常规生产的鼠李糖脂的接受度。而且，由于增加的资本支出和可能的额外工作步骤，更高的安全要求也对生产成本产生了影响。
尽管，借助这些生产生物体在一定程度上可以实现高产物滴定度以及高时空和/或碳收率，但这需要使用植物油作为唯一的或共同的底物(参见，Handbook ofHydrocarbon and Lipid Microbiology,2010,第3037-51页)。然而，与其他碳源相比，植物油是相对昂贵的原料，所述其他碳源诸如例如葡萄糖、蔗糖或多糖诸如例如淀粉、纤维素和半纤维素，甘油，CO，CO2或CH4。而且，鼠李糖脂由于它们的表面活性剂特性区分它们自身，因为它们对发酵过程中的大量泡沫是敏感的。如果应用亲脂性底物，特别会这样。该问题在使用水溶性底物诸如例如葡萄糖、蔗糖、多糖(粉、纤维素和半纤维素)或甘油时会被显著缓解。最后，由野生型分离菌产生的鼠李糖脂的性能仅在有限程度上被影响。到目前为止，这仅通过优化工艺管理(pH、氧供给、介质组成、给料策略、氮气供给、温度、底物的选择等)发生。然而，对某些产物特性诸如例如不同鼠李糖脂种类的比例(鼠李糖和3-羟基脂肪酸基的数目)或3-羟基脂肪酸基的链长度和饱和度的非常具体的影响会是可取的，以便能够调节与应用有关的产物性能。
如果鼠李糖脂在家用、清洁、美容、食品加工、药物、植物保护和其他应用中被大范围地用作表面活性剂，鼠李糖脂必须看起来能与目前应用的表面活性剂竞争。这些是高容量化学品，其能够以非常低的成本生产，对客户没有明显的健康风险，并且具有清楚定义的和可调节的产品规格。因此鼠李糖脂也必须能够以尽可能低的成本生产，对客户没有健康风险并且具有尽可能明确的性能。
尽管鼠李糖脂已经基于方便的碳源诸如例如葡萄糖或甘油在GRAS生物体(一般被视为安全的)中被产生，但在这种情况下这些仅仅是单鼠李糖脂(Ochsner etal.Appl.Environ.Microbiol.1995.61(9):3503-3506)。
另一方面，Cha et al.in Bioresour Technol.2008.99(7):2192-9描述了通过导入来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的rhlA和rhlB基因，在恶臭假单胞菌(P.putida)中生产来自大豆油的单鼠李糖脂。
因此，对廉价以及安全(从健康的角度)地生产具有明确的和可调节性能的单-和双鼠李糖脂存在日益增加的需求。例如通过减少单鼠李糖脂富集的单独酶活性的平衡供给，可以实现这种调节。然而，该调节还可以通过例如利用具有某些性能的酶来实现，所述性能例如与底物特异性相关的性能，并因此例如与并入鼠李糖脂的羟基脂肪酸的链长度相关。
因此，本发明的目的是提供利用安全的生产宿主从易获得的碳源生产鼠李糖脂的可能性。
发明内容
出人意料地，已经发现，下文描述的细胞和其中应用这些细胞的方法有助于解决本发明阐述的目的。
因此，本发明涉及能够形成鼠李糖脂的细胞，其与它们的野生型相比，具有基因产物rhlA,rhlB和rhlC同源物的基因产物至少一种增加的活性。
本发明还涉及利用作为生物催化剂的前述细胞和简单的碳源生产鼠李糖脂的方法。
本发明的优势在于能够应用非致病性并且培养简单的生物体。
另外的优势在于作为唯一的或共同底物的油的使用不是必需的。
另一优势在于借助于本发明，可以生产具有明确的和可调节性能的鼠李糖脂。
本发明的另一优势在于可以生产双鼠李糖脂。
另外的优势在于与这些活性没有增强的细胞相比，可以生产更高时空和碳收率的鼠李糖脂。
细胞，优选分离的细胞对实现开始时提及的目的作出了贡献，所述细胞能够形成至少一种通式(I)的鼠李糖脂或其盐，
式(I)
其中
m=2、1或0，特别为1或0，
n=1或0，特别为1，
R1和R2=彼此独立地为具有2-24个、优选5-13个碳原子的相同或不同的有机基团，特别任选地分支的，任选地取代的、特别是羟基取代的，任选地不饱和的，特别任选地单-、双-或三-不饱和的烃基，优选地选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一碳烯基和十三碳烯基以及(CH2)o-CH3的烃基，其中o=1-23，优选为4-12；
其特征在于它已被进行遗传学修饰，从而使得与其野生型相比，所述细胞中的酶E1、E2和E3中的至少一种的活性是增加的，其中酶E1能够催化3-羟基链烷酰-ACP经由3-羟基链烷酰-3-羟基链烷酸-ACP转化为羟基链烷酰-3-羟基链烷酸；酶E2是鼠李糖基转移酶I，并能够催化dTDP-鼠李糖和3-羟基链烷酰-3-羟基链烷酸酯转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基链烷酰-3-羟基链烷酸酯；以及酶E3是鼠李糖基转移酶II，并能够催化dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基链烷酰-3-羟基链烷酸酯转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基链烷酰-3-羟基链烷酸酯，其中这些酶E1、E2和E3优选选自以下一组：
至少一种酶E1，其选自：
酶E1a，其具有多肽序列Seq ID No.2或具有与参照序列Seq ID No.2相比其中高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.2的酶的酶活性，其中酶E1a的酶活性被理解为意指优选将3-羟基癸酰基-ACP经由3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸-ACP转化为羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力，
酶E1b，其具有多肽序列Seq ID No.18或具有与参照序列Seq ID No.18相比其中高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.18的酶的酶活性，其中酶E1b的酶活性被理解为意指优选将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸-ACP转化为羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸的能力，
酶E1c，其具有多肽序列Seq ID No.78或具有与参照序列Seq ID No.78相比其中高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.78的酶的酶活性，其中酶E1c的酶活性被理解为意指优选将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸-ACP转化为羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸的能力，
酶E1d，其具有多肽序列Seq ID No.80，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo.80相比其中高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.80的酶的酶活性，其中酶E1d的酶活性被理解为意指优选将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸-ACP转化为羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸的能力，以及
酶E1e，其具有多肽序列Seq ID No.82，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo.82相比其中高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.82的酶的酶活性，其中E1e的酶活性被理解为意指优选将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸-ACP转化为羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸的能力；
至少一种酶E2，其具有选自以下的多肽序列：
酶E2a，其具有多肽序列Seq ID No.4，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo.4相比其中高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.4的酶的酶活性，其中E2a的酶活性被理解为意指优选将dTDP-鼠李糖和3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力，
酶E2b，其具有多肽序列Seq ID No.20，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo.20相比其中高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.20的酶的酶活性，其中E2b的酶活性被理解为意指优选将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸的能力，
酶E2c，其具有多肽序列Seq ID No.84，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo.84相比其中高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.84的酶的酶活性，其中E2c的酶活性被理解为意指优选将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸的能力，
酶E2d，其具有多肽序列Seq ID No.86，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo.86相比其中高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.86的酶的酶活性，其中E2d的酶活性被理解为意指优选将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸的能力，以及
酶E2e，其具有多肽序列Seq ID No.88，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo.88相比其中高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.88的酶的酶活性，其中E2e的酶活性被理解为意指优选将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸的能力；以及，
至少一种酶E3，其选自：
酶E3a，其具有多肽序列Seq ID No.6，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo.6相比其中高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.6的酶的酶活性，其中E3a的酶活性被理解为意指优选将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力，
酶E3b，其具有多肽序列Seq ID No.22，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo.22相比其中高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.22的酶的酶活性，其中E3b的酶活性被理解为意指优选将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸的能力，
酶E3c，其具有多肽序列Seq ID No.90，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo.90相比其中高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.90的酶的酶活性，其中E3c的酶活性被理解为意指优选将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸的能力，以及
酶E3d，其具有多肽序列Seq ID No.92，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo.92相比其中高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过92%的具有参照序列Seq ID No.92的酶的酶活性，其中E3d的酶活性被理解为意指优选将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸的能力。
对于一般概况，对照图1。
本文的细胞“野生型”指其基因组以通过进化天然形成的状态存在的细胞。该术语用于完整细胞以及单独的基因。因此，术语“野生型”特别不包括其基因序列已通过重组方法被人为地至少部分修饰的那些细胞或那些基因。
结合本发明，术语“鼠李糖脂”被理解为意指通式(I)的化合物或其盐。
显而易见地，上文实际指出的酶E1a至E3b的活性仅是从上述酶的宽广活性谱中的具体的示例性选择；对提及的相应的酶活性，在给定酶的情况下，都有可利用的可靠的测量方法。因此，显而易见的是，底物具有无支链、饱和C10-烃基的酶同样(即便任选地具有降低的活性)会转化那些含有C6-或C16-烃基的底物，其任选地还可以是分支的或不饱和的。
术语“增加的酶活性”优选被理解为意指增加的细胞内活性。
下文增加细胞中的酶活性的实施方案适用于酶E1至E3的活性增加，以及适用于其活性可以任选地被增加的所有随后提及的酶。
原则上，可以通过以下实现酶活性的增加：增加编码酶的一个基因序列或多个基因序列的拷贝数，利用强启动子或改良的核糖体结合位点，例如通过转录调节子消弱基因表达的负性调节，或者放大基因表达的正性调节，修饰基因的密码子使用，以多种方式增加mRNA或酶的半衰期，修饰基因表达的调节或者利用编码具有增加的活性的合适酶的基因或等位基因，以及任选地合用这些措施。按照本发明，利用含有所需的基因、该基因的等位基因或其部分以及任选地含有使基因的表达成为可能的启动子的载体，例如通过转化、转导、接合或这些方法的组合来产生遗传学修饰的细胞。特别通过将基因或等位基因整合在细胞的染色体或染色体外复制的载体中实现异源表达。
DE-A-100 31 999给出了增加细胞中酶活性可能性的一般概况，如通过丙酮酸羧化酶所示例的，其并入本文作为参考，以及其与增加细胞中酶活性可能性有关的公开内容组成了本发明公开内容的一部分。
借助1-维和2-维蛋白凝胶分离以及利用合适的分析软件对凝胶中蛋白浓度的随后光学鉴定，上文和所有随后提及的酶或基因的表达是可检测的。如果酶活性的增加仅基于对应基因表达的增加，酶活性增加的量可以通过比较野生型和遗传学修饰的细胞间的1-维或2-维蛋白分离以简单的方法来确定。用于制备棒状杆菌情况下的蛋白凝胶以及用于鉴定蛋白的常规方法是Hermann等描述的操作方法(Electrophoresis,22:1712.23(2001))。蛋白浓度同样可以通过利用待检测蛋白的特异性抗体的蛋白免疫印迹杂交(Sambrook etal.,Molecular Cloning:a laboratory manual,2nd Ed.Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.USA,1989)以及随后利用用于浓度测定的合适软件的光学分析(Lohaus and Meyer(1989)Biospektrum,5:32-39;Lottspeich(1999)Angewandte Chemie111:2630-2647)来分析。DNA-结合蛋白的活性可以通过DNA条带位移分析(也称为凝胶阻滞)(Wilson et al.(2001)Journal of Bacteriology,183:2151-2155)来测量。DNA-结合蛋白对其他基因表达的作用可以通过多种已充分描述的报告基因分析方法(Sambrook et al.,Molecular Cloning:a laboratory manual,2nd Ed.Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.USA,1989)来检测。可以按照多种描述的方法(Donahue et al.(2000)Journal of Bacteriology 182(19):5624-5627;Ray etal.(2000)Journal of Bacteriology182(8):2277-2284;Freedberg et al.(1973)Journal of Bacteriology115(3):816-823)来确定细胞内的酶活性。如果在下文的实施方案中，没有指明测定某种酶活性的实践方法，优选通过在Hermann et al.,Electophoresis,22:1712-23(2001),Lohaus et al.,Biospektrum5:32-39(1998),Lottspeich,Angewandte Chemie111:2630-2647(1999)和Wilson et al.,Journal ofBacteriology183:2151-2155(2001)中描述的方法进行酶活性增加的测定以及酶活性降低的测定。
如果酶活性的增加是通过内源性基因的突变实现的，这种突变可以是通过诸如例如UV照射或诱变化学品的常规方法随机产生的，或者是通过诸如缺失、插入和/或核苷酸交换的基因工程选择性产生的。修饰的细胞通过这些突变获得。特别优选的酶突变体还特别是那些不再被反馈-、产物-或底物抑制的酶，或者至少与野生型酶相比被抑制的程度降低的酶。
如果酶活性的增加是通过酶合成增加实现的，相应基因的拷贝数是增加的，或者位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点被突变。并入结构基因上游的表达盒以相同的方式发挥作用。另外地，通过诱导型启动子，在任何所需位置适时增加表达是可能的。然而，此外，“增强子”也可以被指定到酶基因作为调节序列，其通过RNA聚合酶和DNA间的改善的相互作用同样引起基因表达的增加。作为延长mRNA生命期的措施的结果，表达同样被改善。而且，通过阻止酶蛋白的降解，酶活性同样被增加。基因或基因构建体在本文呈现为具有不同拷贝数的质粒或者被整合在染色体中并扩增。可选地，所关注基因的过表达还可以通过改变培养基组成和培养管理来实现。对此，本领域的技术人员可以找到指南，特别是在Martin et al.(Bio/Technology5,137-146(1987))、在Guerrero et al.(Genes138,35-41(1994))、Tsuchiya and Morinaga(Bio/Technology6,428-430(1988))、在Eikmanns et al.(Genes102,93-98(1991))、在EP-A-0472869、在US4,601,893、在Schwarzer and Pühler(Bio/Technology9,84-87(1991))、在Reinscheid et al.(Appliedand Environmental Microbiology60,126-132(1994))、在LaBarre et al.(Journal ofBacteriology175,1001-1007(1993))、在WO-A-96/15246、在Malumbres et al.(Genes134,15-24(1993))、在JP-A-10-229891、在Jensen and Hammer(Biotechnology andBioengineering58,191-195(1998))以及在众所周知的遗传学和分子生物学教科书中找到。上文描述的措施如同突变那样也会导致遗传学修饰的细胞。
例如，附加体质粒(episomal plasmid)被用来增加相应的基因的表达。对本领域技术人员而言，合适的质粒或载体原则上是可用于该目的的所有实施方案。例如，这种质粒和载体可以从Novagen,Promega,New England Biolabs,Clontech或Gibco BRL公司的手册中获取。此外优选的质粒和载体可以在Glover,D.M.(1985)DNA cloning:a practicalapproach,Vol.I-III,IRL Press Ltd.,Oxford;Rodriguez,R.L.and Denhardt,D.T(eds)(1988)Vectors:a survey of molecular cloning vectors and their uses,179-204,Butterworth,Stoneham;Goeddel,D.V.(1990)Systems for heterologous geneexpression,Methods Enzymol.185,3-7;Sambrook,J.;Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York中找到。
然后通过接合或转化，将含待扩增的基因的质粒载体转化为所需的菌株。接合的方法在例如 et al.,Applied and Environmental Microbiology 60:756-759(1994)中有描述。转化的方法在例如Thierbach et al.,Applied Microbiology andBiotechnology29:356-362(1988),Dunican and Shivnan,Bio/Technology7:1067-1070(1989)和Tauch et al.,FEMS Microbiology Let-ters123:343-347(1994)中有描述。通过“交叉(cross-over)”事件的同源重组后，产生的菌株包含至少两个拷贝的所关注的基因。
在上文使用的表述的情况下以及在下文实施方案中，“相比其野生型增加的酶Ex活性”优选一直被理解为意指相应的酶Ex活性增加的系数至少为2，特别优选至少为10，更优选至少为100，仍更优选为至少1,000，以及最优选为至少10,000。此外，具有“相比其野生型增加的酶Ex活性”的本发明的细胞还特别包括以下细胞：其野生型不含有该酶Ex活性或者至少没有可检测的该酶Ex活性，并且其仅在例如通过过表达增加了酶活性后，才显示可检测的该酶Ex活性。在这种情况下，术语“过表达”或下文实施方案中使用的表述“增加表达”还包括以下情形：其中起始细胞例如野生型细胞不表达酶Ex或者至少没有可检测的酶Ex表达，酶Ex可检测的的合成只有通过重组方法才被诱导。
不导致给定多肽特性和功能明显变化的给定多肽序列的氨基酸基变化对本领域技术人员是已知的。因此，例如，“保守性氨基酸”可以互换；这种合适的氨基酸取代的实例有：丙氨酸取代丝氨酸；精氨酸取代赖氨酸；天冬酰胺取代谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸取代谷氨酸；半胱氨酸取代丝氨酸；谷氨酰胺取代天冬酰胺；谷氨酸取代天冬氨酸；甘氨酸取代脯氨酸；组氨酸取代天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸取代亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸取代甲硫氨酸或缬氨酸；赖氨酸取代精氨酸或谷氨酰胺或谷氨酸；甲硫氨酸取代亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸取代甲硫氨酸或亮氨酸或酪氨酸；丝氨酸取代苏氨酸；苏氨酸取代丝氨酸；色氨酸取代酪氨酸；酪氨酸取代色氨酸或苯丙氨酸；缬氨酸取代异亮氨酸或亮氨酸。同样已知的是，例如以氨基酸插入或缺失的形式的变化，特别在多肽的N-或C-末端的变化往往不会对多肽的功能有明显影响。
可以通过破坏含酶活性的细胞来确定酶的活性，破坏的方式是本领域技术人员已知的，例如借助球磨机、弗氏压碎器或借助超声波粉碎器，以及随后通过在13,000rpm和4°C下离心10分钟分离细胞、细胞碎片和破坏助剂诸如例如玻璃珠。利用产生的无细胞的粗提取物，然后进行酶测定和随后的LC-ESI-MS产物检测。可选地，可以以本领域技术人员已知的方式通过色谱分析法(诸如镍-氮三乙酸亲和色谱分析、链霉亲和素亲和色谱分析、凝胶过滤色谱分析或离子交换色谱分析)对酶进行富集或另外纯化至同质性。
然后利用如上文所述获得的样品以下述方式确定酶E1的活性：标准测定含100μM大肠杆菌(E.coli)ACP、1mMβ-巯基乙醇、200μM丙二酰-辅酶A、40μM辛酰基-辅酶A(对于E1a)或十二酰基-辅酶A(对于E1b)、100μM NADPH、2μg大肠杆菌FabD、2μg结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)FabH、1μg大肠杆菌FabG、0.1M磷酸钠缓冲液,pH7.0和5μg的酶E1，终体积为120μL。ACP、β-巯基乙醇和磷酸钠缓冲液在37°C下预孵育30分钟以完全还原ACP。通过添加酶E1启动反应。2ml已被用HCl酸化至pH为2.0的水用来终止反应，并随后用2ml氯仿/甲醇(2:1(v:v))萃取两次。通过离心(16,100g,5min,RT)产生分相。取出底层的有机相，在真空离心机中完全脱水，并将沉淀物溶解到50μl的甲醇中。未溶解的成分通过离心(16,100g,5min,RT)沉淀，并且通过LC-ESI-MS分析样品。通过相应的质量示踪(masstraces)和二级质谱(MS2spectra)的分析进行产物的鉴定。
然后利用如上文所述获得的样品如下确定酶E2的活性：标准测定可以由185μl10mM tris-HCl(pH7.5)、10μl125mM dTDP-鼠李糖和50μl蛋白粗提取物(约1mg总蛋白)或在溶液中的纯化的蛋白(5μg纯化的蛋白)组成。通过添加10μl10mM的3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸(对于E2a)或3-羟基-十四烷酰-3-羟基十四烷酸(对于E2b)的乙醇溶液启动反应，并在30°C下摇动(600rpm)孵育1小时。随后，反应用1ml丙酮进行处理。未溶解的成分通过离心(16,100g,5min,RT)沉淀，并且通过LC-ESI-MS分析样品。通过相应的质量示踪和二级质谱的分析进行产物的鉴定。
然后利用如上文所述获得的样品如下确定酶E3的活性：标准测定可以由185μl10mM tris-HCl(pH7.5)、10μl125mM dTDP-鼠李糖和50μl蛋白粗提取物(约1mg总蛋白)或在溶液中的纯化的蛋白(5μg纯化的蛋白)组成。通过添加10μl10mM的α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸(对于E3a)或α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸(对于E3b)的乙醇溶液启动反应，并在30°C下摇动(600rpm)孵育1小时。随后，反应用1ml丙酮进行处理。未溶解的成分通过离心(16,100g,5min,RT)沉淀，并且通过LC-ESI-MS分析样品。通过相应的质量示踪和二级质谱的分析进行产物的鉴定。
本发明的细胞优选是具有增加的下述酶组合活性的那些：
E1、E2、E3、E1E2、E1E3、E2E3和E1E2E3，
在组合中，E2、E2E3和E1E2E3，特别是E1E2E3是特别优选的。
在具有增加的酶组合E1E2E3活性的本发明的细胞的优选实施方案中，n优选=1。
本发明的细胞可以是原核细胞或真核细胞。这些可以是哺乳动物细胞(诸如例如来自人的细胞)、植物细胞或微生物诸如酵母、真菌或细菌，其中微生物是特别优选的，并且细菌和酵母是最优选的。
合适的细菌、酵母或真菌特别是那些作为细菌、酵母或真菌株保藏在DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures))GmbH(DSMZ),Brunswick,Germany的细菌、酵母或真菌。按照本发明合适的细菌属于http://www.dsmz.de/species/ bacteria.htm列出的属，按照本发明合适的酵母属于http://www.dsmz.de/species/ yeasts.htm列出的那些属，以及按照本发明合适的真菌是http://www.dsmz.de/species/ fungi.htm列出的那些。
按照本发明优选的细胞是以下属的那些：曲霉属(Aspergillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、乳杆菌属(Lactobacillus)、副球菌属(Paracoccus)、乳球菌属(Lactococcus)、念珠菌属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、单胞发酵菌属(Zymomonas)、耶罗威亚酵母属(Yarrowia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、青枯菌属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红杆菌属(Rhodobacter)、伯克氏菌属(Burkholderia)、梭菌属(Clostridium)和贪铜菌属(Cupriavidus)，其中构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、协腹产碱杆菌(Alcaligenes latus)、巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、须芒草伯克氏菌(Burkholderia andropogonis)、巴西伯克氏菌(B.brasilensis)、克里多尼亚伯克氏菌(B.caledonica)、卡瑞苯西思伯克氏菌(B.caribensis)、石竹伯克氏菌(B.caryophylli)、内生霉菌伯克氏菌(B.fungorum)、唐菖蒲伯克氏菌(B.gladioli)、格氏伯克氏菌(B.glathei)、荚壳伯克氏菌(B.glumae)、草伯克氏菌(B.graminis)、医院伯克氏菌(B.hospita)、B.kururiensis、吩嗪伯克氏菌(B.phenazinium)、瘤状伯克氏菌(B.phymatum)、植物令伯克氏菌(B.phytofirmans)、植物伯克氏菌(B.plantarii)、甘蔗伯克氏菌(B.sacchari)、新加坡伯克氏菌(B.singaporensis)、水下伯克氏菌(B.sordidicolai)、栖土伯克氏菌(B.terricola)、热带伯克氏菌(B.tropica)、肿块伯克氏菌(B.tuberum)、乌汶伯克氏菌(B.ubonensis)、乌拉姆伯克氏菌(B.unamae)、B.xenovorans、洋葱伯克氏菌(B.anthina)、吡咯伯克氏菌(B.pyrrocinia)、泰国伯克氏菌(B.thailandensis)、布兰克念珠菌(Candida blankii)、皱褶念珠菌(Candida rugosa)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、高效棒状杆菌(Corynebacteriumefficiens)、大肠杆菌(Escherichia coli)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、善变副球菌(Paracoccus versutus)、阿根廷假单胞菌(Pseudomonas argentinensis)、淤泥假单胞菌(P.borbori)、香茅醇假单胞菌(P.citronellolis)、淡黄假单胞菌(P.flavescens)、门多萨假单胞菌(P.mendocina)、硝基还原假单胞菌(P.nitroreducens)、食油假单胞菌(P.oleovorans)、类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)、食树脂假单孢菌(P.resinovorans)、稻草假单胞菌(P.straminea)、桔黄假单胞菌(P.aurantiaca)、致金假单胞菌(P.aureofaciens)、绿针假单胞菌(P.chlororaphis)、草莓假单胞菌(P.fragi)、隆德假单胞菌(P.lundensis)、腐臭假单胞菌(P.taetrolens)、南极假单胞菌(P.antarctica)、产氮假单胞菌(P.azotoformans)、福德假单胞菌('P.blatchfordae')、油菜假单胞菌(P.brassicacearum)、布氏假单胞菌(P.brenneri)、雪松素假单胞菌(P.cedrina)、皱褶假单胞皱褶假单胞(P.corrugata)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、杰萨假单胞菌(P.gessardii)、黎巴嫩假单胞菌(P.libanensis)、孟氏假单胞菌(P.mandelii)、边缘假单胞菌(P.marginalis)、地中海假单胞菌(P.mediterranea)、南方假单胞菌(P.meridiana)、米氏假单胞菌(P.migulae)、霉味假单胞菌(P.mucidolens)、东方假单胞菌(P.orientalis)、西洋参假单胞菌(P.panacis)、溶解蛋白假单胞菌(P.proteolytica)、罗得西亚假单胞菌(P.rhodesiae)、类黄假单胞菌(P.synxantha)、赛维瓦尔假单胞菌(P.thivervalensis)、托拉氏假单胞菌(P.tolaasii)、韦龙氏假单胞菌(P.veronii)、脱氮假单胞菌(P.denitrificans)、百日咳假单胞菌(P.pertucinogena)、P.cremoricolorata、黄褐假单胞菌(P.fulva)、蒙氏假单胞菌(P.monteilii)、摩氏假单胞菌(P.mosselii)、副黄假单胞菌(P.parafulva)、恶臭假单胞菌、巴利阿里假单胞菌(P.balearica)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)、扁桃假单胞菌(P.amygdali)、洋榛假单胞菌(P.avellanae)、番木瓜假单胞菌(P.caricapapayae)、菊苣假单胞菌(P.cichorii)、晕斑假单胞菌(P.coronafaciens)、天仙果假单胞菌(P.ficuserectae)、向日葵假单胞菌('P.helianthi')、苦楝假单胞菌(P.meliae)、萨氏假单胞菌(P.savastanoi)、丁香假单胞菌(P.syringae)、番茄假单胞菌(P.tomato)、绿黄假单胞菌(P.viridiflava)、松香假单胞菌(P.abietaniphila)、嗜酸红假单胞菌(P.acidophila)、伞菌假单胞菌(P.agarici)、嗜碱性假单胞菌(P.alcaliphila)、解碱假单胞菌(P.alkanolytica)、淀粉假单胞菌(P.amyloderamosa)、铁角蕨假单胞菌(P.asplenii)、固氮假单胞菌(P.azotifigens)、大麻假单胞菌(P.cannabina)、隐居假单胞菌(P.coenobios)、结冰假单胞菌(P.congelans)、贡斯坦蒂尼假单胞菌(P.costantinii)、克罗斯韦假单胞菌(P.cruciviae)、德里假单胞菌(P.delhiensis)、外囊假单胞菌(P.excibis)、极端假单胞菌(P.extremorientalis)、弗雷德里克斯堡假单胞菌(P.frederiksbergensis)、褐鞘假单胞菌(P.fuscovaginae)、石花菜假单胞菌(P.gelidicola)、格氏假单胞菌(P.grimontii),籼稻假单胞菌(P.indica)、杰氏假单胞菌(P.jessenii)、晋州假单胞菌(P.jinjuensis)、基尔假单胞菌(P.kilonensis)、P.knackmussii、韩国丛毛假单胞菌(P.koreensis)、林氏假单胞菌(P.lini)、藤黄假单胞菌(P.lutea)、摩拉维亚假单胞菌(P.moraviensis)、耳炎假单胞菌(P.otitidis)、海绵假单胞菌(P.pachastrellae)、P.palleroniana、罂粟茎黑条斑病假单胞菌(P.papaveris)、烂泥假单胞菌(P.peli)、腐卵假单胞菌(P.perolens)、梨孢假单胞菌(P.poae)、浦项假单胞菌(P.pohangensis)、嗜冷假单胞菌(P.psychrophila)、耐冷假单胞菌(P.psychrotolerans)、P.rathonis、爬虫假单胞菌(P.reptilivora)、树脂假单胞菌(P.resiniphila)、根际假单胞菌(P.rhizosphaerae)、浅红假单胞菌(P.rubescens)、P.salomonii、P.segitis、败血症假单胞菌(P.septica)、猿猴假单胞菌(P.simiae)、猪假单胞菌(P.suis)、耐热假单胞菌(P.thermotolerans)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、山黄麻假单胞菌(P.tremae)、平凡假单胞菌(P.trivialis)、P.turbinellae、P.tuticorinensis、阴城假单胞菌(P.umsongensis)、温哥华假单胞菌(P.vancouverensis)、P.vranovensis、黄色海假单胞菌(P.xanthomarina)、真养雷氏菌(Ralstonia eutropha)、深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、类球红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)和运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)，特别是恶臭假单胞菌、大肠杆菌和泰国伯克氏菌是特别优选的。
按照本发明的优选细胞能够如同野生型不形成鼠李糖脂或不形成可检测量的鼠李糖脂，以及如同野生型还优选没有酶E1、E2和E3的活性或者没有可检测的E1、E2和E3的活性。
如果本发明的细胞是能够如同野生型形成具有C6-C16的单-链烷酸酯链长度的聚羟基链烷酸酯的细胞，本发明是有利的。这类细胞例如是伯克氏菌属，泰国伯克氏菌(Burkholderia thailandensis);假单胞菌属，恶臭假单胞菌、绿脓假单胞菌、食油假单胞菌、斯氏假单胞菌、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、香茅醇假单胞菌、食树脂假单孢菌(Pseudomonas resinovorans)、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosterone)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、协腹产碱杆菌和真养雷氏菌。在这种情况下，按照本发明优选的细胞是遗传学修饰的，从而使得与其野生型相比，它们能够形成较少的聚羟基链烷酸酯。.
这种细胞在例如De Eugenio et al.,Environ Microbiol.2010.12(1):207-21和Rehm et al.,Appl Environ Microbiol.2001.67(7):3102-9中有描述。
这种与其野生型相比能够形成较少聚羟基链烷酸酯的细胞的特征特别在于：与其野生型相比，它具有降低的酶E9或E10至少一种的活性。
其中E9代表聚羟基链烷酸酯合成酶，EC:2.3.1.-，特别具有多肽序列Seq IDNo.30或Seq ID No.32，或者其具有的多肽序列与相应的参照序列Seq ID No.30或Seq IDNo.32相比其中有高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且其仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有相应的参照序列Seq ID No.30或Seq ID No.32的酶的酶活性，其中酶E9的酶活性被理解为意指优选将3-羟基链烷酰-辅酶A转化为聚-3-羟基链烷酸，特别是将3-羟基十四烷酰基-辅酶A转化为聚-3-羟基十四烷酸的能力，以及
E10代表3-羟基链烷酰-ACP:辅酶A转移酶，特别具有多肽序列Seq ID No.34或SeqID No.36，或者其具有的多肽序列与相应的参照序列Seq ID No.34或Seq ID No.36相比其中有高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且其仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有相应的参照序列Seq ID No.34或SeqID No.36的酶的酶活性，其中酶E10的酶活性被理解为意指将3-羟基链烷酰-ACP转化为3-羟基链烷酰-辅酶A，特别是将3-羟基链烷酰-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-辅酶A的能力。
对于一般概况，对照图1。
然后通过首先将560μl的100mM tris/HCl,pH7.5、20μl的35mM在DMSO中的DTNB以及20μl的41mM3-羟基癸酰基-辅酶A混合，利用如上文所述对于酶E1-E3获得的样品来确定酶E9的活性。随后，加入在100μl tris/HCl,pH7.5中的5μg纯化的酶E9，以及随后在分光光度计中连续记录412nm处(通过将5,5’-二硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)添加到游离SH基团导致的)消光随着时间的增加(ΔE/min)，记录1分钟。
然后利用如上文所述对于酶E1-E3获得的样品来确定酶E10的活性。标准测定含3mMMgCl2、40μM羟基癸酰基-辅酶A和在50mM tris-HCl,pH7.5中的20μM大肠杆菌ACP，总体积为200μl。通过添加在50μl tris/HCl,pH7.5中的5μg纯化的酶启动反应，并在30°C下孵育1小时。通过添加50%(w/v)的三氯乙酸和10mg/ml的BSA(30μl)终止反应。通过记录在412nm处的消光随着时间的增加通过分光光度法确定释放的辅酶A，该消光的增加是通过将5,5’-二硫基双(2-硝基苯甲酸)添加至游离SH基团导致的。
因此，使用的表述“降低的酶Ex活性”优选被理解为意指活性降低的系数为至少0.5，特别优选至少0.1，更优选至少0.01，甚至更优选至少0.001以及最优选至少0.0001。表述“降低的活性”还包括没有可检测的活性(“零活性”)。例如可以通过选择性突变或者通过本领域技术人员已知的降低某一酶活性的其他措施实现某一酶活性的降低。
用于降低微生物中酶活性的方法是本领域技术人员已知的。
特别地，本文提供了分子生物学技术。本领域技术人员在例如Dubeau etal.2009.BMC Microbiology9:263;Singh&Microbiology.2008.154:797-809或Leeet al.FEMS Microbiol Lett.2009.297(1):38-48中找到了修饰和降低蛋白表达以及伴随的特别针对假单胞菌和伯克氏菌的酶活性降低，特别是中断特定基因的指南。
按照本发明优选的细胞的特征在于通过修饰包含所述核酸序列之一的基因实现酶活性的降低，其中所述修饰选自包含以下、优选由以下组成的组：基因中外源DNA的插入、至少部分基因的缺失、基因序列中的点突变、RNA干扰(siRNA)、反义RNA或调节序列诸如例如启动子和终止子以及在基因侧翼的核糖体结合位点的修饰(插入、缺失或点突变)。
在这种情况下，外源DNA被理解为意指对于基因(不是对于生物体)是“外源”的任何DNA序列，即内源性DNA序列也能够在这种情况下作为“外源DNA”。
在这种情况下，特异优选的是，基因被选择性标志基因的插入中断，因此外源性DNA是选择性标志基因，其中优选地，插入通过基因座位的同源重组来实现。
在本发明的细胞的优选实施方案中，所关注的细胞是恶臭假单胞菌细胞，其与野生型相比具有降低的聚羟基链烷酸酯合成。这种细胞例如在Ren et al., JournalApplied Microbiology and Biotechnology 1998 Jun, 49(6):743-50中被描述为GPp121、GPp122、GPp123和GPp124，在Huisman et al., J Biol Chem. 1991 Feb 5;266(4):2191-8中被描述为GPp104，以及在De Eugenio et al., Environ Microbiol. 2010.12(1):207-21中被描述为KT42C1，以及在Ouyang et al. Macromol Biosci. 2007. 7(2):227-33中被描述为KTOY01和KTOY02，并且是按照本发明优选的细胞。
在本发明的细胞能够形成m=1的鼠李糖脂的情形下，优选的是由R1和R2限定的以下基团
来自3-羟基辛酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基癸烯酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十二酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基十二碳烯酸、3-羟基十二酰基-3-羟基辛酸、3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基癸烯酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸烯酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十二酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十二碳烯酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十四碳烯酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基十二酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十四烷酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十四碳烯酸、3-羟基十四烯酰基-3-羟基癸酸、3-羟基十二酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十二酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十二酰基-3-羟基十二碳烯酸、3-羟基十二酰基-3-羟基十四烷酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酰基-3-羟基十四烷酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基十六烷酸或3-羟基十六烷酰基-3-羟基十六烷酸。
对本领域技术人员显而易见的是，本发明的细胞还能够形成具有通式(I)的不同鼠李糖脂的混合物。
在这种情况下，优选的是，本发明的细胞能够形成具有通式(I)的鼠李糖脂的混合物，其特征在于在形成的鼠李糖脂超过80%的重量、优选超过90%重量、特别优选超过90%重量、特别优选超过95%重量中，n=1，以及通过R1和R2限定的基团在低于形成的鼠李糖脂10%的重量、优选低于5%的重量、特别优选低于2%的重量中来自3-羟基癸酰基-3-羟基辛酸或3-羟基辛酰基-3-羟基癸酸，
其中指出的重量百分比涉及形成的所有具有通式(I)的鼠李糖脂之和。
如果本发明的细胞关于E1至E3另外地被遗传学修饰是有利的，从而使得它与其野生型相比，具有增加的至少一种酶活性，如在下文指定的每一种情形中，所述酶选自：
至少一种酶E4，即dTTP:α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶，EC2.7.7.24，特别是具有多肽序列Seq ID No.10的酶，或者该酶具有的多肽序列与参照序列Seq ID No.10相比其中有高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且其仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.10的酶的酶活性，其中酶E4的酶活性被理解为意指将α-D-葡萄糖-1-磷酸和dTTP转化为dTDP-葡萄糖的能力，
至少一种酶E5，即dTTP-葡萄糖-4,6-水解酶，EC4.2.1.46，特别是具有多肽序列Seq ID No.12的酶，或者该酶具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo.12相比其中有高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且其仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.12的酶的酶活性，其中酶E5的酶活性被理解为意指将dTDP-葡萄糖转化为dTDP-4-脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖的能力，
至少一种酶E6，即dTDP-4-脱氢鼠李糖-3,5-差向异构酶，EC5.1.3.13，特别是具有多肽序列Seq ID No.14的酶，或者该酶具有的多肽序列与参照序列Seq ID No.14相比其中有高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且其仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.14的酶的酶活性，其中酶E6的酶活性被理解为意指将dTDP-4-脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖转化为dTDP-4-脱氢-6-脱氧-L-甘露糖的能力，以及
至少一种酶E7，即dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶,EC1.1.1.133，特别是具有多肽序列Seq ID No.16的酶，或者该酶具有的多肽序列与参照序列Seq ID No.16相比其中有高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且其仍具有至少10%、优选50%、特别优选80%、特别是超过90%的具有参照序列Seq ID No.16的酶的酶活性，其中酶E7的酶活性被理解为意指将dTDP-4-脱氢-6-脱氧-L-甘露糖转化为dTDP-6-脱氧-L-甘露糖的能力。
通过孵育α-D-葡萄糖-1-磷酸(1.3mM)与dTTP(5mM)和在50μl磷酸钠缓冲液、pH8.5中的5μg纯化的酶E4，以及在30°C下孵育5、10和20分钟后通过添加20μl氯仿终止反应，利用如上文所获得的对于酶E1至E3的样品确定酶E4的活性。然后将混合物涡旋并以16,000g在室温下离心5分钟。将水相转移至新的反应容器，并用80μl的水再次萃取有机相。合并两水相，并通过HPLC进行分析。此处使用Phenosphere ODS2柱(250x4.6mm;Phenomenex,Torrance,USA)或Spheresorb ODS2柱(250x4.6mm;Waters,Milford,USA)。利用0.5M KH2PO4(洗脱液A)，以1ml min–1的流速进行分析物的洗脱15分钟，随后以0.7ml min–1的流速，用高达80%的洗脱液A和20%甲醇线性梯度洗脱14分钟的时段。然后将从ODS2柱洗脱下的分析物注射入Phenosphere SAX离子交换柱(250x4.6mm;Phenomenex,Torrance,USA)，并且利用1ml min–1的流速和线性甲酸铵梯度(在25分钟2至600mM)洗脱分析物。然后利用光电二极管阵列检测器(DAD)通过其UV吸收进行dTDP-葡萄糖的定量。胸苷的吸收最大值在267nm处。通过确证的核苷酸糖(Sigma-Aldrich,Munich,USA)进行校准。
通过孵育dTDP-α-D-葡萄糖(1.3mM)与在50μl磷酸钠缓冲液、pH8.5中的5μg纯化的酶E5，以及在30°C下孵育5、10和20分钟后通过添加20μl氯仿终止反应，利用如上文所获得的对于酶E1至E3的样品确定酶E5的活性。然后将混合物涡旋并在室温下以16,000g离心5分钟。将水相转移至新的反应容器，并用80μl的水再次萃取有机相。合并两水相，并通过HPLC进行分析。此处使用Phenosphere ODS2柱(250x4.6mm;Phenomenex,Torrance,USA)或Spheresorb ODS2柱(250x4.6mm;Waters,Milford,USA)。利用0.5M KH2PO4(洗脱液A)，以1mlmin–1的流速进行分析物的洗脱15分钟，随后以0.7ml min–1的流速，用高达80%的洗脱液A和20%甲醇的线性梯度洗脱14分钟的时段。然后将从ODS2柱洗脱下的分析物注射入Phenosphere SAX离子交换柱(250x4.6mm;Phenomenex,Torrance,USA)，并且利用1ml min–1的流速和线性甲酸铵梯度(在25分钟，2至600mM)洗脱分析物。然后利用光电二极管阵列检测器(DAD)通过其UV吸收进行dTDP-葡萄糖和dTDP-4-脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖的定量。胸苷的吸收最大值在267nm处。通过确证的核苷酸糖(Sigma-Aldrich,Munich,USA)进行校准。
通过首先在30°C下孵育dTDP-α-D-葡萄糖(1.3mM)与在50μl磷酸钠缓冲液、pH8.5中的5μg纯化的酶E510分钟，利用如上文获得的对于酶E1至E3的样品确定酶E6的活性。随后，添加0.5μg纯化的酶E6，在30°C下孵育5、10和20分钟后，通过添加20μl氯仿终止反应。然后涡旋混合物并在室温下以16,000g离心5分钟。将水相转移至新的反应容器，并用80μl的水再次萃取有机相。合并两水相，并通过HPLC进行分析。此处使用Phenosphere ODS2柱(250x4.6mm;Phenomenex,Torrance,USA)或Spheresorb ODS2柱(250x4.6mm;Waters,Milford,USA)。利用0.5M KH2PO4(洗脱液A)，以1ml min–1的流速进行分析物的洗脱15分钟，随后以0.7ml min–1的流速，用高达80%的洗脱液A和20%甲醇的线性梯度洗脱14分钟的时段。然后将从ODS2柱洗脱下的分析物注射入Phenosphere SAX离子交换柱(250x4.6mm;Phenomenex,Torrance,USA)，并且利用1ml min–1的流速和线性甲酸铵梯度(在25分钟，2至600mM)洗脱分析物。然后利用光电二极管阵列检测器(DAD)通过其UV吸收进行dTDP-葡萄糖、dTDP-4-脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖和dTDP-6-脱氧-L-甘露糖的定量。胸苷的吸收最大值在267nm处。通过确证的核苷酸糖(Sigma-Aldrich,Munich,USA)进行校准。
通过首先在30°C下孵育dTDP-α-D-葡萄糖(1.3mM)与在50μl磷酸钠缓冲液、pH8.5中的5μg纯化的酶E510分钟，利用如上文所述获得的对于酶E1至E3的样品确定酶E7的活性。随后，添加5μg纯化的酶E6和0.5μg纯化的酶E7以及NADPH(10mM)，在30°C下孵育5、10和20分钟后，通过添加20μl氯仿终止反应。然后涡旋混合物并在室温下以16,000g离心5分钟。将水相转移至新的反应容器，并用80μl的水再次萃取有机相。合并两水相，并通过HPLC进行分析。此处使用Phenosphere ODS2柱(250x4.6mm;Phenomenex,Torrance,USA)或SpheresorbODS2柱(250x4.6mm;Waters,Milford,USA)。利用0.5M KH2PO4(洗脱液A)，以1ml min–1的流速进行分析物的洗脱15分钟，随后以0.7ml min–1的流速，用高达80%的洗脱液A和20%甲醇的线性梯度洗脱14分钟的时段。然后将从ODS2柱洗脱下的分析物注射入Phenosphere SAX离子交换柱(250x4.6mm;Phenomenex,Torrance,USA)，并且利用1ml min–1的流速和线性甲酸铵梯度(在25分钟，2至600mM)洗脱分析物。然后利用光电二极管阵列检测器(DAD)通过其UV吸收进行dTDP-葡萄糖、dTDP-4-脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖、dTDP-6-脱氧-L-甘露糖和dTDP-4-脱氢-6-脱氧-L-甘露糖的定量。胸苷的吸收最大值在267nm处。通过确证的核苷酸糖(Sigma-Aldrich,Munich,USA)进行校准。
按照本发明的细胞是优选的，其具有增加的下述酶组合的活性：
E4E5,E4E6,E4E7,E5E6,E5E7,E6E7,E4E5E6,E4E5E7,E5E6E7,E4E6E7,E4E5E6E7，其中组合E4E5E6E7是特别优选的。
如果本发明的细胞在脂肪酸生物合成中被遗传学修饰从而使得导致脂酰-ACP和丙二酰-辅酶A转化为3-酮脂酰-ACP和/或3-酮脂酰-ACP转化为(R)-3-羟基链烷酰-ACP的酶反应增加，按照本发明可以是有利的。另外地或可选地，按照本发明可以是有利的，如果本发明的细胞在脂肪酸生物合成中被遗传学修饰从而使得导致(R)-3-羟基链烷酰-ACP转化为反式-2-烯酰-ACP和/或反式-2-烯酰-ACP转化为脂酰-ACP的酶反应减弱。
如果本发明的细胞在脂肪酸β-氧化中被遗传学修饰，从而使得导致脂酰-辅酶A转化为反式-2-烯酰-辅酶A和/或反式-2-烯酰-辅酶A转化为(S)-3-羟基链烷酰-辅酶A的酶反应增加可以是正好一样有利的。另外地或可选地，按照本发明可以是有利的，如果本发明的细胞在脂肪酸β-氧化中被遗传学修饰，从而使得导致(S)-3-羟基链烷酰-辅酶A转化为3-酮脂酰-辅酶A和/或3-酮脂酰-辅酶A转化为脂酰-辅酶A和乙酰-辅酶A的酶反应被消弱。
对于一般概况，对照图1。
因为本发明的细胞可以有利地用于生产鼠李糖脂，以及因为这些脂类随后任选地被纯化，如果本发明的细胞相比其野生型具有增加的至少酶E8的活性是有利的，所述酶E8催化通式(I)的鼠李糖脂从细胞输送至周围介质中。
优选地，在这种情况下，蛋白E8选自：
酶E8，其具有肽序列Seq ID No.8、Seq ID No.24、Seq ID No.26或Seq ID No.28，或者其具有的多肽序列与相应的参照序列Seq ID No.8、Seq ID No.24、Seq ID No.26或Seq ID No.28相比其中有高达25%、优选高达20%、特别优选高达15%、特别是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且其仍具有至少50%、优选65%、特别优选80%、特别是超过90%的具有相应的参照序列Seq ID No.8、Seq IDNo.24、Seq ID No.26或Seq ID No.28的酶的酶活性，其中酶E8的酶活性被理解为意指将通式(I)的鼠李糖脂从细胞输送至周围介质中的能力。
本发明的细胞的进一步优选的实施方案的特征在于它含有至少一种下述本发明的核酸或载体。
本发明的细胞可以有利地用于生产鼠李糖脂。因此本发明的另一主题是本发明的细胞用于生产具有通式(I)的化合物的用途。
本发明的另一主题是用于生产具有通式(I)的鼠李糖脂的方法，其中
m=2、1或0，特别为1或0，
n=1或0，特别为1，
R1和R2=彼此独立地为具有2-24、优选5-13个碳原子的相同或不同的有机基团，特别任选地分支的，任选地取代的、特别是羟基取代的，任选地不饱和的、特别任选地单-、双-或三-不饱和的烃基，优选地选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一碳烯基和十三碳烯基以及(CH2)o-CH3的烃基，其中o=1-23，优选为4-12；
所述方法包括以下处理步骤：
I)使本发明的细胞与含碳源的介质接触
II)在使细胞从碳源形成鼠李糖脂成为可能的条件下培养细胞以及
III)任选地分离形成的鼠李糖脂。
为了生产上述产物的目的，可以将本发明的遗传学修饰的细胞在分批工艺(分批培养)或在分批补料工艺(补料工艺)或重复的分批补料工艺(重复的补料工艺)中与营养介质连续或间断接触，并由此培养。半连续工艺也是可能的，如在GB-A-1009370中描述的。已知培养方法的概述描述于Chmiel(“Bioprozesstechnik1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik”[Bioprocess Technology1.Introduction to the BioprocessTechnique](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))教科书中或Storhas(“Bioreaktoren und periphere Einrichtungen”[Bioreactors and PeripheralDevices],Vieweg Verlag,Brunswick/Wiesbaden,1994)教科书中。
使用的培养基必需以合适的方式满足相应的菌株的需求。例如，对不同酵母株的培养基的描述包含在“Nonconventional yeast in biotechnology”(Ed.Klaus Wolf,Springer-Verlag Berlin,1996)中。
使用的碳源可以是碳水化合物，诸如例如葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素和半纤维素，植物和动物油和脂，诸如例如大豆油、红花油、花生油、大麻籽油、麻风树油、椰子脂、葫芦油、亚麻籽油、玉米油、婴粟油、月见草油、橄榄油、棕榈仁油、棕榈油、油菜籽油、芝麻油、向日葵油、葡萄籽油、胡桃油、麦胚油和椰子油，脂肪酸，诸如例如辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、花生四烯酸、二十二酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、γ-亚麻酸和其甲酯或乙酯以及脂肪酸混合物，含有上述脂肪酸的单-、双-和三甘油酯，醇类，诸如例如甘油、乙醇和甲醇，烃类，诸如甲烷，含碳的气体和气体混合物，诸如CO、CO2、合成气或烟道气，氨基酸类诸如L-谷氨酸或L-缬氨酸，或者有机酸诸如例如乙酸。这些物质可以单独地被利用或以混合物被利用。利用碳水化合物特别是单糖、寡糖或多糖作为碳源在US6,01,494和US6,136,576中有描述，以及利用烃类特别是烷烃、烯烃和炔烃以及衍生于其的一元羧酸和衍生于这些一元羧酸的单-、双-和三甘油酯，以及利用甘油和乙酸是特别优选的。含甘油与辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、花生四烯酸、二十二酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和/或γ-亚麻酸的酯化产物的单-、双-和三甘油酯是尤其特别优选的。
本发明很大的一个优势在于本发明的细胞能够从最简单的碳源诸如葡糖糖、蔗糖或甘油形成鼠李糖脂，从而使得在本发明的方法中在介质中供应较长链的碳源不是必需的。因此在本发明的方法的步骤I)中介质不含有或者不含有可检测量的链长度大于6个碳原子的羧酸或者从其衍生的酯或甘油酯，即缺乏可用性的情况下，它是有利的。
使用的氮源可以是含有机氮的化合物诸如蛋白胨、酵母膏、肉膏、麦芽膏、玉米浸渍水、大豆粉和尿素或者无机化合物诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵、氨、氢氧化铵或氨水。氮源可以单独被利用或作为混合物被利用。
使用的磷源可以是磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或者对应的含钠盐。培养基还必须含有金属盐，诸如例如硫酸镁或硫酸铁，其对于生长是必须的。最后，必需的生长促进剂诸如氨基酸和维生素可以另外地应用到上述物质中。而且，合适的前体可以添加至培养基中。所述原料可以在培养期间以合适的方式以单一批次或进料的形式添加到培养物中。
诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水的碱性化合物或者诸如磷酸或硫酸的酸性化合物适合用于控制培养物的pH。消泡剂诸如例如脂肪酸聚乙二醇酯可以用于控制泡沫产生。合适的选择性作用物质诸如例如抗生素可以添加至介质用于维持质粒的稳定性。为了维持有氧条件，氧气或者含氧气的气体混合物诸如例如空气被掺入培养中。
培养温度通常超过20°C、优选超过25°C，它还可以超过40°C，其中有利地，培养温度不超过95°C、特别优选不超过90°C以及最优选不超过80°C。
在本发明的方法的步骤III)中，由细胞形成的鼠李糖脂可以任选地从细胞和/或营养介质中分离，其中对于分离，本领域技术人员已知的所有用于从复杂组分中分离低分子量物质的方法都是可以的，诸如例如过滤、萃取、吸附(色谱分析)或者结晶。
而且，产物相含有生物质残留物和多种杂质，诸如油、脂肪酸和其他营养介质成分。优选在无溶剂工艺中进行杂质的分离。因此，例如，产物相可以用水稀释以便于pH的调整。然后可以通过利用酸或碱降低或升高pH将鼠李糖脂转化为水溶形式，使产物和水相均质化。潜在地，通过在较高温度例如在60-90°C下孵育以及不停的混合可以辅助鼠李糖脂在水相中的溶解。通过随后利用碱或酸升高或降低pH，可以将鼠李糖脂再次转化为非水溶形式，从而使得它们能够容易地从水相中分离。然后用水洗涤产物相一次或几次以去除水溶性杂质。
例如，可以通过借助合适溶剂、有利地借助有机溶剂的萃取将油残留物分离出去。烷烃诸如例如正己烷优选用作溶剂。
作为上述无溶剂工艺的替代，利用合适的溶剂例如酯诸如例如乙酸乙酯或乙酸丁酯可以实现产物从水相的分离。所述的萃取步骤可以以任何所需的顺序进行。
在这种情况下，优选应用溶剂，特别是有机溶剂。优选将正戊醇作为溶剂。例如进行蒸馏以去除溶剂。随后，冻干的产物可以进一步被纯化，例如借助色谱分析法。作为举例，在这一点可以提到借助合适溶剂的沉淀、借助合适溶剂的萃取、例如借助环糊精或环糊精衍生物的络合、结晶、借助于色谱分析法的纯化或分离、或者将鼠李糖脂转化为易于分离的衍生物。
可以利用本发明的方法生产的鼠李糖脂同样是本发明的主题，特别还是上述的鼠李糖脂混合物，其可以利用本发明的方法生产。
可以利用本发明的方法生产的鼠李糖脂和混合物可以有利地应用在清洁剂、化妆品或药物制剂以及植物保护制剂中。
因此，本发明的另一主题是利用本发明的方法获得的鼠李糖脂用于生产化妆品、皮肤或药物制剂、用于生产植物保护制剂以及用于生产护理和清洁剂以及表面活性剂浓缩物的用途。
术语“护理剂(care agents)”在此处被理解为意指满足以下目的的制剂：维持物品在其原始形式、减少或避免外部影响力(例如，时间、光照、温度、压力、污染、与其他接触该物品的反应化合物的化学反应)的作用，诸如例如老化、污染、材料疲劳，甚或改善所需的物品积极特性。对于最后一点，例如，可以提到改善的头发光泽或者所考虑物品更大的弹性。
“植物保护制剂”被理解为意指它们的制备性质明显用于植物保护的那些制剂，如果来自由除草剂、杀菌剂、杀虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、抗鸟类破坏的包含物质、植物营养剂和改善土壤结构剂组成的种类的至少一种化合物包含在制剂中，特别如此。
按照本发明，利用本发明的方法生产的鼠李糖脂优选在用于家政、工业、特别用于硬面、皮革或纺织品的护理和清洁剂中使用。
分离的核酸提供了对实现目的的贡献，所述核酸在每种情况下含有选自[A1-G1]、[A2-G2]和[A3-G3]三组的至少一个序列，其中
组[A1-G1]由以下序列组成：
A1a)Seq ID No.1的序列，其中该序列编码蛋白，其能够将3-羟基癸酰基-ACP经由3-羟基癸酰基-3-羟基癸酰基-ACP转化为3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸，
B1a)无内含子的序列，其来源于A1a)的序列，并与Seq ID No.1的序列编码相同的蛋白或肽，
C1a)编码包含Seq ID No.2的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽优选能够将3-羟基癸酰基-ACP经由3-羟基癸酰基-3-羟基癸酰基-ACP转化为3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸，
D1a)与组A1a)-C1a)之一、特别优选组A1a)的序列至少有70%、特别优选至少有90%、更优选至少有95%以及最优选至少有99%相同性的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基癸酰基-ACP经由3-羟基癸酰基-3-羟基癸酰基-ACP转化为3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸，
E1a)与组A1a)-D1a)之一、特别优选组A1a)的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基癸酰基-ACP经由3-羟基癸酰基-3-羟基癸酰基-ACP转化为3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸，
F1a)组A1a)-E1a)之一、特别优选组A1a)的序列的衍生物，其通过至少一个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基，但优选不超过100个碱基、特别优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的，其中该衍生物优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基癸酰基-ACP经由3-羟基癸酰基-3-羟基癸酰基-ACP转化为3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸，
G1a)组A1a)-F1a)之一的序列的互补序列，特别优选组A1a)的序列的互补序列，
A1b)Seq ID No.17的序列，其中该序列编码蛋白，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
B1b)无内含子的序列，其来源于A1b)的序列，并与Seq ID No.17的序列编码相同的蛋白或肽，
C1b)编码包含Seq ID No.18的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，以及所述蛋白或肽优选能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
D1b)与组A1b)-C1b)之一、特别优选组A1b)的序列至少有70%、特别优选至少有90%、更优选至少有95%以及最优选至少有99%相同性的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
E1b)与组A1b)-D1b)之一、特别优选组A1b)的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
F1b)通过组A1b)-E1b)之一、特别优选组A1b)的序列的至少一个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基，但优选不超过100个碱基、特别优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物，其中该衍生物优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，以及
G1b)组A1b)-F1b)之一、特别优选组A1b)的序列的互补序列，以及
A1c)Seq ID No.77的序列，其中该序列编码蛋白，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
B1c)无内含子的序列，其来源于A1c)的序列，并与Seq ID No.77的序列编码相同的蛋白或肽，
C1c)编码包含Seq ID No.78的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，以及所述蛋白或肽优选能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
D1c)与组A1c)-C1c)之一、特别优选组A1c)的序列至少有70%、特别优选至少有90%、更优选至少有95%以及最优选至少有99%相同性的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
E1c)与组A1c)-D1c)之一、特别优选组A1c)的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
F1c)通过组A1c)-E1c)之一、特别优选组A1c)的序列的至少一个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基，但优选不超过100个碱基、特别优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物，其中该衍生物优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，以及
G1c)组A1c)-F1c)之一、特别优选组A1c)的序列的互补序列，以及
A1d)Seq ID No.79序列，其中该序列编码蛋白，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
B1d)无内含子的序列，其来源于A1d)的序列，并与Seq ID No.79的序列编码相同的蛋白或肽，
C1d)编码包含Seq ID No.80的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，以及所述蛋白或肽优选能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
D1d)与组A1d)-C1d)之一、特别优选组A1d)的序列至少有70%、特别优选至少有90%、更优选至少有95%以及最优选至少有99%相同性的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
E1d)与组A1d)-C1d)之一、特别优选组A1d)的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
F1d)通过组A1d)-E1d)之一、特别优选组A1d)的序列的至少一个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基，但优选不超过100个碱基、特别优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物，其中该衍生物优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，以及
G1d)组A1d)-F1d)之一、特别优选组A1d)的序列的互补序列，以及
A1e)Seq ID No.81的序列，其中该序列编码蛋白，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
B1e)无内含子的序列，其来源于A1e)的序列，并与Seq ID No.81的序列编码相同的蛋白或肽，
C1e)编码包含Seq ID No.82的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，以及所述蛋白或肽优选能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
D1e)与组A1e)-C1e)之一、特别优选组A1e)的序列至少有70%、特别优选至少有90%、更优选至少有95%以及最优选至少有99%相同性的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
E1e)与组A1e)-D1e)之一、特别优选组A1e)的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
F1e)通过组A1e)-E1e)之一、特别优选组A1e)的序列的至少一个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基，但优选不超过100个碱基、特别优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物，其中该衍生物优选编码蛋白或肽，其能够将3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，和
G1e)组A1e)-F1e)之一、特别优选组A1e)的序列的互补序列，以及
组[A2-G2]，其由以下序列组成：
A2a)Seq ID No.3的序列，其中该序列编码蛋白，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸,
B2a)无内含子序列，其来源于A2a)的序列，并与Seq ID No.3序列编码相同的蛋白或肽，
C2a)编码包含Seq ID No.4的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，以及所述蛋白或肽优选能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸,
D2a)与组A2a)-C2a)之一、特别优选组A2a)的序列至少有80%、特别优选至少有90%、更优选至少有95%以及最优选至少有99%相同性的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸，
E2a)与组A2a)-D2a)之一、特别优选组A2a)的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸，
F2a)通过组A2a)-E2a)之一、特别优选组A2a)的序列的至少一个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基，但优选不超过100个碱基、特别优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物，其中该衍生物优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸，
G2a)组A2a)-F2a)之一、特别优选组A2a)的序列的互补序列，
A2b)Seq ID No.19的序列，其中该序列编码蛋白，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
B2b)无内含子的序列，其来源于A2b)的序列，并与Seq ID No.19的序列编码相同的蛋白或肽，
C2b)编码包含Seq ID No.20的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽优选能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
D2b)与组A2b)-C2b)之一、特别优选组A2b)的序列有至少70%、特别优选至少90%、更优选至少95%以及最优选至少99%相同性的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
E2b)与组A2b)-D2b)之一、特别优选组A2b)的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸,
F2b)通过组A2b)-E2b)之一、特别优选组A2b)的序列的至少一个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基，但优选不超过100个碱基、特别优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物，其中该衍生物优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，和
G2b)组A2b)-F2b)之一、特别优选组A2b)的序列的互补序列，
A2c)Seq ID No.83的序列，其中该序列编码蛋白，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
B2c)无内含子的序列，其来源于A2c)的序列，并与Seq ID No.83的序列编码相同的蛋白或肽，
C2c)编码包含Seq ID No.84的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽优选能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
D2c)与组A2c)-C2c)之一、特别优选组A2c)的序列有至少70%、特别优选至少90%、更优选至少95%以及最优选至少99%相同性的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
E2c)与组A2c)-D2c)之一、特别优选组A2c)的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
F2c)通过组A2c)-E2c)之一、特别优选组A2c)的序列的至少一个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基，但优选不超过100个碱基、特别优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物，其中该衍生物优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，和
G2c)组A2c)-F2c)之一、特别优选组A2c)的序列的互补序列，
A2d)Seq ID No.85的序列，其中该序列编码蛋白，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
B2d)无内含子的序列，其来源于A2d)的序列，并与Seq ID No.85的序列编码相同的蛋白或肽，
C2d)编码包含Seq ID No.86的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽优选能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
D2d)与组A2d)-C2d))之一、特别优选组A2d)的序列有至少70%、特别优选至少90%、更优选至少95%以及最优选至少99%相同性的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
E2d)与组A2d)-D2d)之一、特别优选组A2d)的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸,
F2d)通过组A2d)-E2d)之一、特别优选组A2d)的序列的至少一个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基，但优选不超过100个碱基、特别优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物，其中该衍生物优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，和
G2d)组A2d)-F2d)之一、特别优选组A2d)的序列的互补序列，以及
A2e)Seq ID No.87的序列，其中该序列编码蛋白，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
B2e)无内含子的序列，其来源于A2e)的序列，并与Seq ID No.87的序列编码相同的蛋白或肽，
C2e)编码包含Seq ID No.88的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽优选能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
D2e)与组A2e)-C2e)之一、特别优选组A2e)的序列有至少70%、特别优选至少90%、更优选至少95%以及最优选至少99%相同性的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
E2e)与组A2e)-D2e)之一、特别优选组A2e)的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，
F2e)通过组A2e)-E2e)之一、特别优选组A2e)的序列的至少一个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基，但优选不超过100个碱基、特别优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物，其中该衍生物优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸，和
G2e)组A2e)-F2e)之一、特别优选组A2e)的序列的互补序列，以及
组[A3-G3]，其由下述序列组成：
A3a)Seq ID No.5的序列，其中该序列编码蛋白，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基-癸酸，
B3a)无内含子的序列，其来源于A3a)的序列，并与Seq ID No.5的序列编码相同的蛋白或肽，
C3a)编码包含Seq ID No.6的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽优选能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基-癸酸，
D3a)与组A3a)-C3a)之一、特别优选组A3a)的序列有至少80%、特别优选至少90%、更优选至少95%以及最优选至少99%相同性的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸，
E3a)与组A3a)-D3a)之一、特别优选组A3a)的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基-癸酸，
F3a)通过组A3a)-E3a)之一、特别优选组A3a)的序列的至少一个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基，但优选不超过100个碱基、特别优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物，其中该衍生物优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基-癸酸，
G3a)组A3a)-F3a)之一、特别优选组A3a)的序列的互补序列，
A3b)Seq ID No.21的序列，其中该序列编码蛋白，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，
B3b)无内含子的序列，其来源于A3b)的序列，并与Seq ID No.21的序列编码相同的蛋白或肽，
C3b)编码包含Seq ID No.22的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽优选能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，
D3b)与组A3b)-C3b)之一、特别优选组A3b)的序列有至少60%、特别优选至少90%、更优选至少95%以及最优选至少99%相同性的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，
E3b)与组A3b)-D3b)之一、特别优选组A3b)的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，
F3b)通过组A3b)-E3b)之一、特别优选组A3b)的序列的至少一个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基，但优选不超过100个碱基、特别优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物，其中该衍生物优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，以及
G3b)组A3b)-F3b)之一、特别优选组A3b)的序列的互补序列，
A3c)Seq ID No.89的序列，其中该序列编码蛋白，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，
B3c)无内含子的序列，其来源于A3c)的序列，并与Seq ID No.89的序列编码相同的蛋白或肽，
C3c)编码包含Seq ID No.90的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽优选能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，
D3c)与组A3c)-C3c)之一、特别优选组A3c)的序列有至少60%、特别优选至少90%、更优选至少95%以及最优选至少99%相同性的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，
E3c)与组A3c)-D3c)之一、特别优选组A3c)的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，
F3c)通过组A3c)-E3c)之一、特别优选组A3c)的序列的至少一个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基，但优选不超过100个碱基、特别优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物，其中该衍生物优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，和
G3c)组A3c)-F3c)之一、特别优选组A3c)的序列的互补序列，以及
A3d)Seq ID No.91的序列，其中该序列编码蛋白，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，
B3d)无内含子的序列，其来源于A3d)的序列，并与Seq ID No.91的序列编码相同的蛋白或肽，
C3d)编码包含Seq ID No.92的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽优选能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，
D3d)与组A3d)-C3d)之一、特别优选组A3d)的序列有至少60%、特别优选至少90%、更优选至少95%以及最优选至少99%相同性的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，
E3d)与组A3d)-D3d)之一、特别优选组A3d)的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列，其中该序列优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，
F3d)通过组A3d)-E3d)之一、特别优选组A3d)的序列的至少一个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基，但优选不超过100个碱基、特别优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物，其中该衍生物优选编码蛋白或肽，其能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基-十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，和
G3d)组A3d)-F3d)之一、特别优选组A3d)的序列的互补序列。
本文借助已知的方法确定“核苷酸相同性”或“氨基酸相同性”。一般地，考虑到特殊需求，使用特定的带算法的计算机程序。
目前用于确定相同性的优选方法产生待比较序列间的最大相同性。用于确定相同性的计算机程序包括但不限于GCG程序包，包括：GAP(Deveroy,J.et al.,Nucleic AcidResearch12(1984),第387页,Genetics Computer Group University of Wisconsin,Medicine(Wi))以及BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.et al.,Journal of MolecularBiology215(1990),第403-410页)。BLAST程序可以从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得，以及从另外的来源(BLAST handbook,Altschul S.et al.,NCBI NLM NIH BethesdaND22894;Altschul S.et al.,上述)获得。
已知的Smith-Waterman算法也可以用于确定核苷酸相同性。
当使用BLASTN程序(Altschul,S.et al.,Journal of Molecular Biology215(1990),第403-410页)时，用于确定“核苷酸相同性”的优选参数为：
期望阈值: 10
字长: 28
匹配分值: 1
错配分值: -2
空位罚分: 线性罚分
上述参数在核苷酸序列比较中是缺省参数。
GAP程序也适合使用上述参数。
当使用BLASTP程序(Altschul,S.et al.,Journal of Molecular Biology215(1990),第403-410页)时，用于确定“氨基酸相同性”的优选参数为：
期望阈值: 10
字长: 3
矩阵: BLOSUM62
空位罚分: 存在罚分:11;延伸罚分:1
组成性调整(Compositional adjustments):条件组成性分数矩阵调整(Conditional compositional score matrix adjustment)
上述参数在氨基酸序列比较中是缺省参数。
GAP程序也适合使用上述参数。
按照上述算法的60%相同性意味着与本发明有关的60%相同性。这适用于更高的相同性。
特征“与序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列”指在优选严格的条件下，与参照序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与其杂交的序列。例如，按照Boehringer公司(Mannheim)的地高辛标记试剂盒的操作方案，可以在2xSSC中于68°C下进行杂交。例如，优选的杂交条件是在7%SDS、1%BSA、1mM EDTA、250mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中于65°C下孵育过夜，然后在65°C下用2x SSC、0.1%SDS洗涤。
按照本发明分离的DNA的衍生物，其按照替代选择F1)、F2)或F3)可以通过按照组A1)-E1)、A2)-E2)和A3)-E3)之一的序列的一个或多个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失来获得，特别包括在它们编码的蛋白中导致保守性氨基酸交换的那些序列，诸如例如导致甘氨酸交换为丙氨酸或者天冬氨酸交换为谷氨酸。这种功能中立的突变被描述为有义突变，并不导致多肽活性的根本改变。此外，已知多肽N-和/或C-末端的变化不显著消弱其功能或者甚至可以稳定该功能，因此其中碱基连接在含本发明的核酸的序列3’-端或5’-端的DNA序列也相应地包括在本发明中。本领域的技术人员特别在Ben-Bassat et al.(Journal ofBacteriology169:751-757(1987))、O'Regan et al.(Gene77:237-251(1989))、Sahin-Toth et al.(Protein Sciences3:240-247(1994))、Hochuli et al.(Bio/Technology6:1321-1325(1988))和已知的遗传和分子生物学教科书中找到这方面的信息。
本发明的核酸优选是载体，特别是表达载体或基因过表达盒。合适的载体是本领域技术人员已知的所有载体，其通常应用于将DNA包含入宿主细胞中。这些载体既可以自主复制，因为它们具有复制起始点，诸如例如2μ质粒或ARS(自主复制序列)的那些，或者整合入染色体(非复制质粒)中。载体还可以被理解为意指根本没有复制起始点的线性DNA片段，诸如例如基因插入物或基因过表达盒。基因过表达盒通常由标志物、欲过表达的基因以及与基因表达相关的调节区诸如例如启动子和终止子组成。优选的载体选自质粒和表达盒，诸如例如大肠杆菌酵母穿梭质粒；表达载体、基因插入物或基因过表达盒是特别优选的，特别是下述的载体Seq ID No.38,Seq ID No.40,Seq ID No.42,Seq ID No.45和Seq IDNo.47。
按照本发明的载体的优选实施方案，组[A1-G1]、[A2-G2]和[A3-G3]的序列在至少一个组成型或可调节的启动子控制下，所述启动子适用于这些DNA序列编码的多肽在微生物的细胞中表达，优选细菌、酵母或真菌细胞，其中构巢曲霉、黑曲霉、协腹产碱杆菌、巨大芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、须芒草伯克氏菌、巴西伯克氏菌、克里多尼亚伯克氏菌、卡瑞苯西思伯克氏菌、石竹伯克氏菌、内生霉菌伯克氏菌、唐菖蒲伯克氏菌、格氏伯克氏菌、荚壳伯克氏菌、草伯克氏菌、医院伯克氏菌、B.kururiensis、吩嗪伯克氏菌、瘤状伯克氏菌、植物令伯克氏菌、植物伯克氏菌、甘蔗伯克氏菌、新加坡伯克氏菌、水下伯克氏菌、栖土伯克氏菌、热带伯克氏菌、肿块伯克氏菌、乌汶伯克氏菌、乌拉姆伯克氏菌、B.xenovorans、洋葱伯克氏菌、吡咯伯克氏菌、泰国伯克氏菌、布兰克念珠菌、皱褶念珠菌、谷氨酸棒杆菌、高效棒状杆菌、大肠杆菌、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、扭脱甲基杆菌、善变副球菌、阿根廷假单胞菌、淤泥假单胞菌、香茅醇假单胞菌、淡黄假单胞菌、门多萨假单胞菌、硝基还原假单胞菌、食油假单胞菌、类产碱假单胞菌、食树脂假单孢菌、稻草假单胞菌、桔黄假单胞菌、致金假单胞菌、绿针假单胞菌、草莓假单胞菌、隆德假单胞菌、腐臭假单胞菌、南极假单胞菌、产氮假单胞菌、福德假单胞菌、油菜假单胞菌、布氏假单胞菌、雪松素假单胞菌、皱褶假单胞皱褶假单胞、荧光假单胞菌、杰萨假单胞菌、黎巴嫩假单胞菌、孟氏假单胞菌、边缘假单胞菌、地中海假单胞菌、南方假单胞菌、米氏假单胞菌、霉味假单胞菌、东方假单胞菌、西洋参假单胞菌、溶解蛋白假单胞菌、罗得西亚假单胞菌、类黄假单胞菌、赛维瓦尔假单胞菌、托拉氏假单胞菌、韦龙氏假单胞菌、脱氮假单胞菌、百日咳假单胞菌、P.cremoricolorata、黄褐假单胞菌、蒙氏假单胞菌、摩氏假单胞菌、副黄假单胞菌、恶臭假单胞菌、巴利阿里假单胞菌、斯氏假单胞菌、扁桃假单胞菌、洋榛假单胞菌、番木瓜假单胞菌、菊苣假单胞菌、晕斑假单胞菌、天仙果假单胞菌、向日葵假单胞菌、苦楝假单胞菌、萨氏假单胞菌、丁香假单胞菌、番茄假单胞菌、绿黄假单胞菌、松香假单胞菌、嗜酸红假单胞菌、伞菌假单胞菌、嗜碱性假单胞菌、解碱假单胞菌、淀粉假单胞菌、铁角蕨假单胞菌、固氮假单胞菌、大麻假单胞菌、隐居假单胞菌、结冰假单胞菌、贡斯坦蒂尼假单胞菌、克罗斯韦假单胞菌、德里假单胞菌、外囊假单胞菌、极端假单胞菌、弗雷德里克斯堡假单胞菌、褐鞘假单胞菌、石花菜假单胞菌、格氏假单胞菌,籼稻假单胞菌、杰氏假单胞菌、晋州假单胞菌、基尔假单胞菌、P.knackmussii、韩国丛毛假单胞菌、林氏假单胞菌、藤黄假单胞菌、摩拉维亚假单胞菌、耳炎假单胞菌、海绵假单胞菌、P.palleroniana、罂粟茎黑条斑病假单胞菌、烂泥假单胞菌、腐卵假单胞菌、梨孢假单胞菌、浦项假单胞菌、嗜冷假单胞菌、耐冷假单胞菌、P.rathonis、爬虫假单胞菌、树脂假单胞菌、根际假单胞菌、浅红假单胞菌、P.salomonii、P.segitis、败血症假单胞菌、猿猴假单胞菌、猪假单胞菌、耐热假单胞菌、铜绿假单胞菌、山黄麻假单胞菌、平凡假单胞菌、P.turbinellae、P.tuticorinensis、阴城假单胞菌、温哥华假单胞菌、P.vranovensis、黄色海假单胞菌、真养雷氏菌、深红红螺菌、类球红杆菌、酿酒酵母、解脂耶罗维亚酵母、运动发酵单胞菌，特别是恶臭假单胞菌、大肠杆菌和泰国伯克氏菌是特别优选的。组成型启动子的实例有lac,lacUV5,tac,trc(在每个例子中，在本发明的细胞中缺乏LacI阻遏子)、Ltet-O1(在本发明的细胞中缺乏TetR阻遏子)、T5和gap。诱导型启动子的实例有lac,lacUV5,tac,trc(在每个例子中，在本发明的细胞中存在LacI阻遏子)、Ltet-O1(在本发明的细胞中存在TetR阻遏子)、T5(联合lac操纵子，和在本发明的细胞中存在LacI阻遏子)、SP6和T7(存在编码同源RNA聚合酶的基因，其表达本身受调节)。除了启动子外，本发明的载体还应该优选包含核糖体结合位点以及终止子。此处特别优选的是，本发明的核酸被并入包含启动子、核糖体结合位点和终止子的载体的表达盒中。除了上述的结构元件外，载体另外可以包含本领域技术人员已知的选择基因。
所有指出的百分比(%)是质量百分比，如果没有另外指明的话。
在下文呈现的实施例中，通过举例的方式描述了本发明，而不是意欲将本发明限制在实施例中提及的实施方案中，本发明的应用范围源于整个说明书和权利要求书。
附图简述
图1：脂肪酸生物合成、脂肪酸β-氧化以及这些代谢途径与鼠李糖脂(酶E1、E2和E3)和聚羟基链烷酸酯(酶E9和E10)生物合成的联系。显示了脂肪酸生物合成、脂肪酸β-氧化、鼠李糖脂生物合成和聚羟基链烷酸酯生物合成中的碳流向。没有显示辅酶的消耗和形成、氧化还原当量以及核苷酸。
图2：在CMP培养基中培养48h、72h和96h后，重组菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2和pBBR1MCS-2::ABC以及GPp104pBBR1MCS-2和pBBR1MCS-2::ABC的双鼠李糖脂形成(mg/l/OD600nm)。通过HPLC对鼠李糖脂浓度进行分析。
图3:在CMP培养基中培养48h、72h和96h后，重组菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2,pBBR1MCS-2::AB和pBBR1MCS-2::ABM以及GPp104pBBR1MCS-2,pBBR1MCS-2::AB和pBBR1MCS-2::ABM的单鼠李糖脂形成(峰面积/OD600nm)。通过HPLC对鼠李糖脂浓度进行分析。
实施例
1.用于在恶臭假单胞菌中异源表达绿脓假单胞菌1707基因rhlA和rhlB的载体pBBR1MCS-2::AB的构建
为了异源表达绿脓假单胞菌DSM1707基因rhlA和rhlB，构建了质粒pBBR1MCS-2::AB(Seq ID No.38)。为此，通过GeneArt AG公司(Regensburg)合成了合成性操纵子rhlAB(Seq ID No.37)，并间克隆(intercloned)在商品化载体pMA(GeneArt AG)中。合成的基础是已知的绿脓假单胞菌DSM1707的基因组序列。从载体pMA::AB开始，通过BglII和XbaI从载体切割下合成性操纵子，并随后连接在用BamHI和XbaI切割的表达载体pBBR1MCS-2(Seq IDNo.49)中(描述在Kovach et al.,1995:Four new derivatives of the broad hostrange cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistancecassettes.Gene,166:175-176中)。产生的质粒pBBR1MCS-2::AB(Seq ID No.38)大小为7422个碱基对。以本领域技术人员已知的方式进行化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(Gibco-BRL,Karlsruhe)的连接和转化。通过DNA序列分析来检验插入物的确实性。
如以前所述(Iwasaki et al.Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)，利用载体pBBR1MCS-2(Seq ID No.49)和pBBR1MCS-2::AB进行恶臭假单胞菌KT2440和GPp104的转化。分离并分析了10个克隆的质粒DNA。获得的携带质粒的菌株被命名为恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::AB。
2.用于在恶臭假单胞菌中异源表达绿脓假单胞菌DSM1707基因rhlA、rhlB和rhlC的载体pBBR1MCS-2::ABC的构建
为了异源表达绿脓假单胞菌DSM1707基因rhlA、rhlB和rhlC，构建了质粒pBBR1MCS-2::ABC(Seq ID No.40)。为此，通过GeneArt AG公司(Regensburg)合成了合成性操纵子rhlABC(Seq ID No.39)，并间克隆在商品化载体pMA(GeneArt AG)中。合成的基础是已知的绿脓假单胞菌DSM1707的基因组序列。从载体pMA::ABC开始，通过BglII和XbaI从载体切割下合成性操纵子，并随后连接在用BamHI和XbaI切割的表达载体pBBR1MCS-2(Seq IDNo.49)中(Kovach et al.,1995:Four new derivatives of the broad host rangecloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistancecassettes.Gene,166:175-176。产生的质粒pBBR1MCS-2::ABC(Seq ID No.40)的大小为8409个碱基对。以本领域技术人员已知的方式进行化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(Gibco-BRL,Karlsruhe)的连接和转化。通过DNA序列分析来检验插入物的确实性。
如以前所述的(Iwasaki et al.Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)，利用载体pBBR1MCS-2::ABC进行恶臭假单胞菌KT2440和GPp104的转化。分离并分析每10个克隆的质粒DNA。获得的携带质粒的菌株被命名为恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC。
3.用于在恶臭假单胞菌中异源表达绿脓假单胞菌DSM1707基因rhlA、rhlB和pa1131的载体pBBR1MCS-2::ABM的构建
为了异源表达绿脓假单胞菌DSM1707基因rhlA,rhlB和pa1131，构建了质粒pBBR1MCS-2::ABM(Seq ID No.42)。为此，通过GeneArt AG公司(Regensburg)合成了合成性操纵子rhlAB-pa1131(Seq ID No.41)，并间克隆在商品化载体pMA(GeneArt AG)中。合成的基础是已知的绿脓假单胞菌DSM1707的基因组序列。从载体pMA::ABM开始，通过BglII和XbaI从载体切割下合成性操纵子，并随后连接在用BamHI和XbaI切割的表达载体pBBR1MCS-2(Seq ID No.49)中(Kovach et al.,1995:Four new derivatives of the broad hostrange cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistancecassettes.Gene,166:175-176)。产生的质粒pBBR1MCS-2::ABM(Seq ID No.42)的大小为8702个碱基对。以本领域技术人员已知的方式进行化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(Gibco-BRL,Karlsruhe)的连接和转化。通过DNA序列分析来检验插入物的确实性。
如以前所述的(Iwasaki et al.Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)，利用载体pBBR1MCS-2::ABM进行恶臭假单胞菌KT2440和GPp104的转化。分离并分析每10个克隆的质粒DNA。获得的携带质粒的菌株被命名为恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABM和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABM。
4.通过重组恶臭假单胞菌菌株产生的鼠李糖脂的定量
将重组菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABM培养在LB琼脂卡那霉素(50μg/ml)平板上。
对于鼠李糖脂的产生，使用下文指定为CMP培养基的培养基。该培养基由2%(w/v)葡萄糖、0.007%(w/v)KH2PO4、0.11%Na2HPO4x2H2O、0.2%(w/v)NaNO3、0.04%(w/v)MgSO4x H2O、0.01%(w/v)CaCl2x2H2O和0.2%(v/v)微量元素溶液组成。微量元素溶液由0.2%(w/v)FeSO4x7H2O、0.15%(w/v)MnSO4x H2O和0.06%(w/v)(NH4)MO7O24x4H2O组成。用NaOH将培养基的pH调整到6.7，并随后通过高压灭菌器(121°C,20min)对培养基进行灭菌。在培养期间不需要调整pH。
为了研究鼠李糖脂在摇动瓶中的产生，首先准备预培养物。为此，使用在LB琼脂平板上新划线的菌株的接种环，并将10ml LB培养基接种在100ml锥形烧瓶中。所有重组的恶臭假单胞菌菌株在LB培养基中，将50μg/ml卡那霉素添加在LB培养基中。在30°C和200rpm下，培养菌株过夜。
预培养物用于接种在250ml的锥形烧瓶中的50ml CMP培养基(起始OD6000.1)。在200rpm和30°C下，培养培养物至多120h。在24h的间隔，从培养瓶中移出1ml肉汤样品。如下进行用于下述色谱分析的样品制备：
利用移液管(Combitip)，将1ml丙酮加入2ml反应容器中，然后立即封闭反应容器以使蒸发最小化。随后加入1ml肉汤。将肉汤/丙酮混合物涡旋后，在13,000rpm下离心3min，然后将800μl的上清转移至HPLC容器中。
为了检测和定量鼠李糖脂，使用蒸发光散射检测器(Sedex LT-ELSD Model85LT)。通过Agilent Technologies1200系列(Santa Clara,California)和Zorbax SB-C8快速分辨柱(4.6x150mm,3.5μm,Agilent)进行实际的测量。注射体积为5μl，以及该方法的运行时间为20min。作为流动相，使用水性0.1%TFA(三氟乙酸，溶液A)和甲醇(溶液B)。柱温度为40°C。ELSD(检测器温度为60°C)和DAD(二极管阵列,210nm)作为检测器。该方法中使用梯度为：
t[min] 溶液B vol.% 流速[ml/min]
0.00 70% 1.00
15.00 100% 1.00
15.01 70% 1.00
20.00 70% 1.00
尽管恶臭假单胞菌KT2440 pBBR1MCS-2和GPp104 pBBR1MCS-2没有产生鼠李糖脂，在重组菌株恶臭假单胞菌KT2440 pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌KT2440 pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌KT2440 pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌GPp104 pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌GPp104 pBBR1MCS-2::ABC和恶臭假单胞菌GPp104 pBBR1MCS-2::ABM中，可检测到不同鼠李糖脂种类的形成(图2和3)。
通过将pBBR1MCS-2::AB和pBBR1MCS-2::ABM合并入恶臭假单胞菌，可能生成单鼠李糖脂(图3)。因为不存在单鼠李糖脂的参考资料，所以通过相应的质量示踪和LC-MS中的二级质谱的分析进行产物的鉴定。
如果rhlC(pBBR1MCS-2::ABC)被另外地合并入菌株中，产生单-和双鼠李糖脂(图2)。
对通过恶臭假单胞菌pBBR1MCS-2::AB和恶臭假单胞菌pBBR1MCS-2::ABM形成的鼠李糖脂的直接比较显示，铜绿假单胞菌p3111与铜绿假单胞菌rhlAB的共表达导致鼠李糖脂生物合成的改善(图3)。尽管菌株恶臭假单胞菌KT2440 pBBR1MCS-2::AB和恶臭假单胞菌GPp104 pBBR1MCS-2::AB在120小时后产生了约39个(恶臭假单胞菌KT2440 pBBR1MCS-2::AB)和23个(恶臭假单胞菌GPp104 pBBR1MCS-2::AB)峰面积鼠李糖脂/OD 600nm，菌株恶臭假单胞菌KT2440 pBBR1MCS-2::ABM和恶臭假单胞菌GPp104 pBBR1MCS-2::ABM在120小时后形成了约50个(恶臭假单胞菌KT2440 pBBR1MCS-2::ABM)以及62个(恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABM)峰面积鼠李糖脂/OD 600nm。
如果比较菌株恶臭假单胞菌KT2440 pBBR1MCS-2::ABM和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABM的单鼠李糖脂合成，可能在PHA-阴性的突变恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABM中检测到62个峰面积/OD 600nm(120h培养)，以及用恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABM，检测到50个面积/OD 600nm的单鼠李糖脂(图3)。
对在菌株恶臭假单胞菌KT2440和GPp104中的双鼠李糖脂形成的比较分析也表明，在恶臭假单胞菌GPp104的PHA-阴性菌株背景中有更多的双鼠李糖脂形成。恶臭假单胞菌GPp104 pBBR1MCS-2::ABC形成了平均113mg/l/OD600nm的双鼠李糖脂(96h)，而用恶臭假单胞菌KT2440 pBBR1MCS-2::ABC，在96h后，仅能够检测到55mg/l/OD 600nm的双鼠李糖脂(图2)。
因此可能表明，利用PHA合成减弱的菌株背景导致鼠李糖脂生物合成的改善。
5.用于在恶臭假单胞菌中异源表达绿脓假单胞菌DSM1707基因rhlA、rhlB、pa1131和rhlC的载体pBBR1MCS-2::ABMC的构建
为了异源表达绿脓假单胞菌DSM1707基因rhlA、rhlB、pa1131和rhlC，构建了质粒pBBR1MCS-2::ABMC(Seq ID No.51)。为此，通过GeneArt AG公司(Regensburg)合成了合成性操纵子rhlAB-pa1131-rhlC(Seq ID No.50)，并间克隆在商品化载体pMA(GeneArt AG)中。合成的基础是已知的绿脓假单胞菌DSM1707的基因组序列。从载体pMA::ABMC开始，通过BglII和XbaI从载体切割下合成性操纵子，并随后连接在用BamHI和XbaI切割的表达载体pBBR1MCS-2(Seq ID No.49)中(Kovach et al.,1995:Four new derivatives of thebroad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene,166:175-176)。产生的质粒pBBR1MCS-2::ABMC(Seq IDNo.51)的大小为9663个碱基对。以本领域技术人员已知的方式进行化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(Gibco-BRL,Karlsruhe)的连接和转化。通过DNA序列分析来检验插入物的确实性。
如以前所述的(Iwasaki et al.Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)，利用载体pBBR1MCS-2::ABMC进行恶臭假单胞菌KT2440和GPp104的转化。分离并分析每10个克隆的质粒DNA。获得的携带质粒的菌株被命名为恶臭假单胞菌KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC和恶臭假单胞菌GPp104 pBBR1MCS-2::ABMC。
6.通过重组恶臭假单胞菌株和铜绿假单胞菌株产生的鼠李糖脂的定量比较
将重组菌株恶臭假单胞菌GPp104 pBBR1MCS-2和恶臭假单胞菌GPp104 pBBR1MCS-2::ABMC以及铜绿假单胞菌DSM19880培养在LB琼脂卡那霉素(50μg/ml;恶臭假单胞菌)和LB琼脂(铜绿假单胞菌)平板上。
为了产生鼠李糖脂，使用下文被指定为CMP培养基的培养基。该培养基由2%(w/v)葡萄糖、0.007%(w/v)KH2PO4、0.11%Na2HPO4x2H2O、0.2%(w/v)NaNO3、0.04%(w/v)MgSO4x H2O、0.01%(w/v)CaCl2x2H2O和0.2%(v/v)的微量元素溶液组成。微量元素溶液由0.2%(w/v)FeSO4x7H2O、0.15%(w/v)MnSO4x H2O和0.06%(w/v)(NH4)MO7O24x4H2O组成。利用NaOH将培养基的pH调整至6.7，并随后通过高压灭菌器(121°C,20min)对培养基进行灭菌。在培养期间不需要调整pH。
为了研究鼠李糖脂在摇动瓶中的产生，首先准备预培养物。为此，使用在LB琼脂平板上新划线的菌株的接种环，并将10ml LB培养基接种在100ml锥形烧瓶中。将重组的恶臭假单胞菌菌株培养在LB培养基中，将50μg/ml卡那霉素添加在LB培养基中。将铜绿假单胞菌培养在LB培养基中。在30°C和200rpm下，培养菌株过夜。
预培养物用于接种在250ml锥形烧瓶中的50ml CMP培养基(起始OD6000.1)。在200rpm和30°C下，培养培养物至多120h。在24h的间隔，从培养瓶中移出1ml肉汤样品。如下进行用于下述色谱分析的样品制备：
利用移液管(Combitip)，将1ml丙酮加入2ml反应容器中，然后立即封闭反应容器以使蒸发最小化。随后加入1ml肉汤。将肉汤/丙酮混合物涡旋后，在13,000rpm下离心3min，然后将800μl的上清转移至HPLC容器。
为了检测形成的产物，将5μl注射入Accela UPLC单元(Thermo Scientific,Dreieich)。利用半UPLC柱“Pursuit XRs ULTRA(C8,2.8μm,2.1x100mm)(Varian,Darmstadt)分析待研究的物质。在40°C下，通过由流动相A1(H2O,0.1%(v/v)TFA)和流动相B1(methanol,0.1%(v/v)TFA)组成的梯度，利用0.3ml/min的流速，在25分钟内进行分离。梯度的时间进程如下：
时间[min] 流动相A1[%] 流动相B1[%]
0 30 70
15 0 100
25 0 100
25.01 30 70
32 30 70
通过波长范围为200-600nm的DAD检测器和质量进行检测，选择性利用高分辨率FT-ICR LTQ-FT FT-ICR LTQ-FT质谱仪(Thermo Scientific,Dreieich)，扫描范围为m/e100-1000。通过ESI(电喷雾电离)进行电离。借助FT-ICR质量分析仪，利用分辨率R=100000以及质量精确度≤2ppm，确定准确的质量和经验化学式。通过分析相应的质量示踪和二级质谱进行产物的鉴定。为了能够比较菌株，对比了相应物质的峰面积。
如图4所示的，菌株恶臭假单胞菌GPp104 pBBR1MCS-2根本没有形成鼠李糖脂。恶臭假单胞菌BR1MCS-2::ABMC和铜绿假单胞菌DSM 19880形成了鼠李糖脂，其中恶臭假单胞菌GPp104 pBBR1MCS-2::ABMC形成的双-和单鼠李糖脂的比例例如为4:1，用铜绿假单胞菌DSM 19880形成的双-和单鼠李糖脂的比例例如为2:1。而且，相比铜绿假单胞菌DSM 19880，菌株恶臭假单胞菌GPp104 pBBR1MCS-2::ABMC没有形成或者仅形成极少的具有以下基团的鼠李糖脂：通过R1和R2确定的来自3-羟基辛酰基-3-羟基癸酸或3-羟基癸酰基-3-羟基-辛酸的基团。
7.用于恶臭假单胞菌中异源表达的载体pBBR1MCS-2::rfbBDAC和pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC的构建
在Trenzyme GmbH公司(Konstanz)，从臭假单胞菌KT2440的染色体DNA开始扩增鼠李糖生物合成操纵子rfbBDAC。为此，使用以下引物：
RL1:5’-TATATATAGAATTCGCGTCATCTGTCTACGACAACAC-3’(Seq ID No.48)
RL2:5’-TATATATAGAATTCGGCTGCGCTACCGCAGCCCTTC-3’(Seq ID No.43)
将获得的PCR产物间克隆在Trenzyme′s短吻鳄(alligator)克隆系统中并在大肠杆菌DH5α(New England Biolabs;Frankfurt)中转化。分析不同候选物的载体并测序。进行成功和无误的DNA测序后，通过EcoRI切割载体，并分离靶片段rfbBDAC。为了进一步的间克隆(inter-cloning)，以相同的方式切割载体pBBR1MCS-2(Kovach et al.,1995:Four newderivatives of the broad-host-range cloning vecoter pBBR1MCS carryingdifferent antibiotic-resistance cassettes.Gene,166:175-176)。切割的靶片段(rfbBDAC)和切割的载体(pBBR1MCS-2)通过常规的连接法合并。产生的载体pBBR1MCS-2::rfbBDAC(Seq ID No.45)也转化在大肠杆菌DH5α(New England Biolabs;Frankfurt)中。关于质粒的成功摄取，研究一些转化株的候选物。
载体pBBR1MCS-2::rfbBDAC作为PCR的基体。使用了以下寡核苷酸：
RL_XbaI-fw:5’-TATATATATCTAGAATTAATGCAGCTGGCACGAC-3’(Seq ID No.44)
RL_Xba_rev:5’-GGCCGCTCTAGAACTAGTGGA-3’(Seq ID No.46)
利用New England Biolabs(Frankfurt)聚合酶的PhusionTM高保真预混合物进行PCR。它以本领域技术人员已知的方式进行。将靶序列(lac启动子和rfbBDAC)间克隆在Trenzyme短吻鳄(alligator)克隆系统中。选择大肠杆菌DH5α(New England Biolabs;Frankfurt)转化株，以及分离不同候选物的质粒DNA并测序。检验并研究序列的正确性后，利用XbaI切割载体。通过常规连接方法，将靶片段连接入同样用XbaI切割的pBBR1MCS-2::ABC(见上文)中。获得的靶载体pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC(Seq ID No.47)的大小为12249个碱基对。对载体的插入物进行测序。以本领域技术人员已知的方式实施PCR、通过琼脂糖凝胶电泳校验PCR的成功扩增、进行DNA的溴化乙锭染色、确定PCR片段大小、纯化PCR产物以及确定DNA浓度。
如以前所述的(Iwasaki et al.Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)，利用载体pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC进行恶臭假单胞菌KT2440和GPp104的转化。分离并分析每10个克隆的质粒DNA。获得的携带质粒的菌株被命名为恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC。
8.通过过表达或不过表达rfbBDAC操纵子的重组恶臭假单胞菌菌株产生的鼠李糖脂的定量
将重组菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC、恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC培养在LB琼脂卡那霉素(50μg/ml)平板上。
为了生产鼠李糖脂，使用下文被指定为CMP培养基的培养基。该培养基由2%(w/v)葡萄糖、0.007%(w/v)KH2PO4、0.11%Na2HPO4x2H2O、0.2%(w/v)NaNO3、0.04%(w/v)MgSO4x H2O、0.01%(w/v)CaCl2x2H2O和0.2%(v/v)微量元素溶液组成。微量元素溶液由0.2%(w/v)FeSO4x7H2O、0.15%(w/v)MnSO4x H2O和0.06%(w/v)(NH4)MO7O24x4H2O组成。利用NaOH将培养基的pH调整为6.7，并随后通过高压灭菌器(121°C,20min)对培养基进行灭菌。在培养期间不需要调整pH。
为了研究鼠李糖脂在摇动瓶中的产生，首先准备预培养物。为此，使用在LB琼脂平板上新划线的菌株的接种环，并将10ml LB培养基接种在100ml锥形烧瓶中。所有重组的恶臭假单胞菌菌株都培养在LB培养基中，将50μg/ml卡那霉素添加在LB培养基中。在30°C和200rpm下，培养恶臭假单胞菌菌株过夜。
预培养物用于接种在250ml的锥形烧瓶中的50ml CMP培养基(起始OD600 0.1)。在200rpm和30°C下，将培养物培养至多120h。在24h的间隔，从培养瓶中移出1ml肉汤样品。如下进行用于以下色谱分析的样品制备：
利用移液管(Combitip)，将1ml丙酮加入2ml反应容器中，然后立即封闭反应容器以使蒸发最小化。随后加入1ml肉汤。将肉汤/丙酮混合物涡旋后，在13,000rpm下离心3min，然后将800μl的上清转移至HPLC容器中。
为了检测和定量鼠李糖脂，使用蒸发光散射检测器(Sedex LT-ELSD Model85LT)。通过Agilent Technologies1200系列(Santa Clara,California)和Zorbax SB-C8快速分辨柱(4.6x150mm,3.5μm,Agilent)进行实际的测量。注射体积为5μl，以及该方法的运行时间为20min。作为流动相，使用水性0.1%TFA(三氟乙酸，溶液A)和甲醇(溶液B)。柱温度为40°C。ELSD(检测器温度为60°C)和DAD(二极管阵列,210nm)作为检测器。该方法中使用梯度为：
t[min] 溶液B vol.% 流速[ml/min]
0.00 70% 1.00
15.00 100% 1.00
15.01 70% 1.00
20.00 70% 1.00
尽管恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2和GPp104pBBR1MCS-2不产生鼠李糖脂，在重组菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC、恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC中，可检测到鼠李糖脂的形成。
相比恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC，恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC显示了双-和单鼠李糖脂的形成增加；相比恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC，恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC显示了双-和单鼠李糖脂的形成增加。这清楚地显示了rfbBDAC表达的扩增对单-和双鼠李糖脂形成的积极影响。
如果比较菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC的单-和双鼠李糖脂的生物合成，在PHA-阴性的突变恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC中检测到增加的单-和双鼠李糖脂合成。
如上文已经描述的，使用PHA合成被灭活的菌株背景，鼠李糖脂生物合成增加。
9.重组大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC的产生
如以前所述的(Miller JH.A Short Course in Bacterial Genetics:ALaboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and RelatedBacteria.Plainview,NY:Cold Spring Harbor Lab.Press;1992)，通过电穿孔法进行大肠杆菌W3110的转化。分离并分析每10个克隆的质粒DNA。获得的携带质粒的菌株被命名为大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC。
10.通过过表达和不过表达rfbBDAC操纵子的重组大肠杆菌菌株产生的鼠李糖脂的定量
将重组菌株大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC培养在LB琼脂卡那霉素(50μg/ml)平板上。
为了产生鼠李糖脂，使用下文被指定为CMP培养基的培养基。该培养基由2%(w/v)葡萄糖、0.007%(w/v)KH2PO4、0.11%Na2HPO4x2H2O、0.2%(w/v)NaNO3、0.04%(w/v)MgSO4x H2O、0.01%(w/v)CaCl2x2H2O和0.2%(v/v)的微量元素溶液组成。微量元素溶液由0.2%(w/v)FeSO4x7H2O、0.15%(w/v)MnSO4x H2O和0.06%(w/v)(NH4)MO7O24x4H2O组成。利用NaOH将培养基的pH调整至6.7，并随后通过高压灭菌器(121°C,20min)对培养基进行灭菌。在培养期间不需要调整pH。
为了研究鼠李糖脂在摇动瓶中的产生，首先准备预培养物。为此，使用在LB琼脂平板上新划线的菌株的接种环，并将10ml LB培养基接种在100ml锥形烧瓶中。所有重组的大肠杆菌菌株培养在LB培养基中，将50μg/ml卡那霉素添加在LB培养基中。在37°C和200rpm下，培养大肠杆菌菌株过夜。
预培养物用于接种在250ml的锥形烧瓶中的50ml CMP培养基(起始OD600 0.1)。在200rpm和30°C下，将培养物培养至多120h。在24h的间隔，从培养瓶中移出1ml肉汤样品。如下进行用于以下色谱分析的样品制备：
利用移液管(Combitip)，将1ml丙酮加入2ml反应容器中，然后立即封闭反应容器以使蒸发最小化。随后加入1ml肉汤。将肉汤/丙酮混合物涡旋后，在13,000rpm下离心3min，然后将800μl的上清转移至HPLC容器中。
为了检测和定量鼠李糖脂，使用蒸发光散射检测器(Sedex LT-ELSD Model85LT)。通过Agilent Technologies1200系列(Santa Clara,California)和Zorbax SB-C8快速分辨柱(4.6x150mm,3.5μm,Agilent)进行实际的测量。注射体积为5μl，以及该方法的运行时间为20min。水性0.1%TFA(三氟乙酸，溶液A)和甲醇(溶液B)用作流动相。柱温度为40°C。ELSD(检测器温度为60°C)和DAD(二极管阵列,210nm)作为检测器。该方法中使用梯度为：
t[min] 溶液B vol.% 流速[ml/min]
0.00 70% 1.00
15.00 100% 1.00
15.01 70% 1.00
20.00 70% 1.00
尽管大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2不产生鼠李糖脂，在重组菌株大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC中，可检测到单-和双鼠李糖脂的形成，其中大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC形成的单-和双鼠李糖脂明显多于大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC。这表明，绿脓假单胞菌DSM1707的rhlABC的异源表达导致了单-和双鼠李糖脂在大肠杆菌中的形成。这还表明，rfbBDAC表达的增强对单-和双鼠李糖脂形成的积极影响。11.用于在恶臭假单胞菌中异源表达绿脓假单胞菌DSM1707基因rhlA、rhlB和rhlC以及泰国伯克氏菌E264基因BTH_II1077、BT_II1080和BT_II1081的载体pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081的构建
为了在恶臭假单胞菌中异源表达绿脓假单胞菌DSM1707基因rhlA,rhlB和rhlC以及泰国伯克氏菌E264基因BTHII1077,BT_II1080和BT_II1081，构建了质粒pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081(Seq ID No.69)。为此，通过DNA2.0公司(Menlo Park,CA,USA)合成了合成性操纵子BTH_II1077,BT_II1080和BT_II1081(Seq ID No.70)，并将其间克隆在商品化载体pJ294(DNA2.0;Menlo Park,CA,USA)中。合成的基础是菌株泰国伯克氏菌E264的基因组序列。从载体pJ294-BTH_II1077-II1080-II1081开始，通过XbaI从该载体切割下合成性操纵子，并随后将其连接在同样用XbaI切割的载体pBBR1MCS-2::ABC(Seq IDNo.40)中。获得的靶载体pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081(Seq ID No.69)的大小为13768个碱基对。对载体的插入物进行测序。以本领域技术人员已知的方式实施PCR、通过琼脂糖凝胶电泳校验PCR的成功扩增、进行DNA的溴化乙锭染色、确定PCR片段大小、纯化PCR产物以及确定DNA浓度。
如以前所述的(Iwasaki et al.Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)，利用载体pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081(Seq ID No.69)进行恶臭假单胞菌KT2440和GPp104的转化。分离并分析每10个克隆的质粒DNA。获得的携带质粒的菌株被命名为恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081。
12.通过过表达和不过表达泰国伯克氏菌E264基因BTH_II1077、BT_II1080和BT_II1081的重组恶臭假单胞菌菌株产生的鼠李糖脂的定量
将在实施例1、2和11中产生的重组菌株恶臭假单胞菌菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077-II1080-II1081、恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077-II1080-II1081、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081、恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081培养在LB琼脂卡那霉素(50μg/ml)平板上。
为了产生鼠李糖脂，使用下文被指定为M9培养基的培养基。该培养基由2%(w/v)葡萄糖、0.3%(w/v)KH2PO4、0.679%Na2HPO4、0.05%(w/v)NaCl、0.2%(w/v)NH4Cl、0.049%(w/v)MgSO4x7H2O和0.1%(v/v)微量元素溶液组成。微量元素溶液由1.78%(w/v)FeSO4x7H2O、0.191%(w/v)MnCl2x7H2O、3.65%(w/v)HCl、0.187%(w/v)ZnSO4x7H2O、0.084%(v/v)Na EDTAx2H2O、0.03%(v/v)H3BO3、0.025%(w/v)Na2MoO4x2H2O和0.47%(w/v)CaCl2x2H2O组成。利用NH4OH将培养基的pH调整至7.4，随后通过高压灭菌器(121°C,20min)对培养基进行灭菌。在培养期间不需要调整pH。
为了研究鼠李糖脂在摇动瓶中的产生，首先准备预培养物。为此，使用在LB琼脂平板上新划线的菌株的接种环，并将10ml LB培养基接种在100ml锥形烧瓶中。所有重组的恶臭假单胞菌菌株培养在LB培养基中，将50μg/ml卡那霉素添加在LB培养基中。在37°C和200rpm下，培养恶臭假单胞菌菌株过夜。
预培养物用于接种在250ml的锥形烧瓶中的50ml M9培养基(+50μg/ml卡那霉素)(起始OD600 0.1)。在200rpm和30°C下，培养培养物。在24h的间隔，从培养瓶中移出1ml肉汤样品。如在实施例4中所述，进行用于以下色谱分析的样品制备以及色谱分析本身。
重组菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077-II1080-II1081和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077-II1080-II1081显示比菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::AB形成了明显增多的单鼠李糖脂。这证实了来自泰国伯克氏菌E264的BTH_II1077-II1080-II1081的扩增增加了单鼠李糖脂在含绿脓假单胞菌DSM1707基因rhlAB的恶臭假单胞菌菌株中的形成。
还显示，重组菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081比菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC形成了明显更多的单-和双鼠李糖脂。这证明了来自泰国伯克氏菌E264的BTH_II1077-II1080-II1081的扩增增加了单-和双鼠李糖脂在含绿脓假单胞菌DSM1707基因rhlABC的恶臭假单胞菌菌株中的形成。
最后显示，相比菌株恶臭假单胞菌KT2440，在恶臭假单胞菌GPp104菌株背景中聚羟基丁酸酯形成的减少导致了鼠李糖脂形成的增加，因为菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077-II1080-II1081和恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081能够形成比相应的对照菌株恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC,恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077-II1080-II1081和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081明显减少的单-()和单-和双鼠李糖脂()。
13.用于在恶臭假单胞菌中异源表达绿脓假单胞菌DSM1707基因rhlA、rhlB、pa1131和rhlC的载体pBBR1MCS-2::ABCM的构建
为了异源表达绿脓假单胞菌DSM1707基因rhlA,rhlB,pa1131和rhlC，构建了质粒pBBR1MCS-2::ABCM(Seq ID No.58)。为此，从含有以下寡核苷酸的菌株绿脓假单胞菌PAO1(DSM1707)的基因组DNA开始，扩增基因pa1131(Seq ID No.59)：
MFS2.0_xbaI_fw:5’-AGGAAATCTAGATGAGAGGCCGGCAAGGATAC-3’(Seq ID No.60)
MFS2.0_XbaI_rev:5’-CCAGGTTCTAGACGCCAGGATTGAACAGTACC-3’(Seq ID No.61)。
利用来自New England Biolabs(Frankfurt)聚合酶的PhusionTM高保真预混合物进行PCR产物(1483个碱基对)的扩增。利用XbaI切割PCR产物并通过Fast Link连接试剂盒(Epicentre Technologies;Madison,WI,USA)将其连接在同样用XbaI切割的载体pBBR1MCS-2::ABC(Seq ID No.40)中。获得的靶载体pBBR1MCS-2::ABCM(Seq ID No.58)的大小为9892个碱基对。对载体的插入物进行测序。按照生产商的说明书，通过DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen;Hilden)分离染色体DNA。以本领域技术人员已知的方式实施PCR、通过琼脂糖凝胶电泳校验PCR的成功扩增、进行DNA的溴化乙锭染色、确定PCR片段大小、纯化PCR产物以及确定DNA浓度。
如以前所述的(Iwasaki et al.Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)，利用载体pBBR1MCS-2::ABCM进行恶臭假单胞菌KT2440和GPp104的转化。分离并分析每10个克隆的质粒DNA。获得的携带质粒的菌株被命名为恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABCM和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABCM。
14.通过过表达或不过表达绿脓假单胞菌DSM1707pa1131基因的重组恶臭假单胞菌菌株产生的鼠李糖脂的定量
将在实施例2和13中产生的重组菌株恶臭假单胞菌菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABCM、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABCM培养在LB琼脂卡那霉素(50μg/ml)平板上。随后如实施例12所述的，进行用于生产鼠李糖脂的培养。
如实施例4中所述的，进行用于以下色谱分析的样品制备以及色谱分析本身。
结果显示在下表中。
48小时孵育后，通过过表达或不过表达绿脓假单胞菌基因pa1131的恶臭假单胞菌菌株形成的双-和单鼠李糖脂
结果显示，在两种菌株背景(KT2440:野生型和具有灭活的聚羟基丁酸酯形成的GPp104)中过表达铜绿假单胞菌基因pa1131导致双-和单鼠李糖脂形成增加。结果还显示，聚羟基丁酸酯形成在GPp104中的减少一般导致鼠李糖脂形成增加。
15.用于在谷氨酸棒杆菌中异源表达来自绿脓假单胞菌DSM1707的基因rhlA和rhlB的载体pEC-XT99A::AB的构建
为了在谷氨酸棒杆菌中异源表达来自绿脓假单胞菌DSM1707的基因rhlA和rhlB，构建了质粒pEC-XT99A::AB(Seq ID No.52)。为此，通过GeneArt AG公司(Regensburg)合成了合成性操纵子rhlAB(Seq ID No.37)，并将其间克隆在商品化的载体pMA(GeneArt AG)中。合成的基础是已知的绿脓假单胞菌DSM1707的基因组序列。从载体pMA::AB开始，通过BglII和XbaI从载体切割下合成性操纵子，并随后将其连接入利用BamHI和XbaI切割的表达载体pEC-XT99A(美国专利7118904)中。产生的质粒pEC-XT99A::AB(Seq ID No.52)的大小为9793个碱基对。以本领域技术人员已知的方式进行化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(Gibco-BRL,Karlsruhe)的连接和转化。通过DNA序列分析来检验插入物的确实性。
如以前所述的(Liebl et al.,FEMS Microbiol.Lett.53:299–303(1989))，利用载体pEC-XT99A::AB进行谷氨酸棒杆菌ATCC13032的转化。在LBHIS琼脂平板(18.5g/l的脑心浸出液肉汤、0.5M山梨醇、5g/l的Bacto胰蛋白胨、2.5g/l的Bacto酵母膏、5g/l的NaCl和18g/l的Bacto琼脂，补加有5mg/l的四环素)上进行转化株的选择。将平板在33°C孵育两天。获得的携带质粒的菌株被命名为谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::AB。
16.用于在谷氨酸棒杆菌中异源表达来自绿脓假单胞菌DSM1707的基因rhlA、rhlB和rhlC的载体pEC-XT99A::ABC的构建
为了在谷氨酸棒杆菌中异源表达来自绿脓假单胞菌DSM1707的基因rhlA,rhlB和rhlC，构建了质粒pEC-XT99A::ABC(Seq ID No.53)。为此，通过GeneArt AG公司(Regensburg)合成了合成性操纵子rhlABC(Seq IDNo.39)，并将其间克隆在商品化的载体pMA(GeneArt AG)中。合成的基础是已知的绿脓假单胞菌DSM1707的基因组序列。从载体pMA::ABC开始，通过BglII和XbaI从载体切割下合成性操纵子，并随后将其连接入利用BamHI和XbaI切割的表达载体pEC-XT99A(美国专利7118904)。产生的质粒pEC-XT99A::ABC(Seq ID No.53)的大小为10780个碱基对。以本领域技术人员已知的方式进行化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(Gibco-BRL,Karlsruhe)的连接和转化。通过DNA序列分析来检验插入物的确实性。
如以前所述的(Liebl et al.,FEMS Microbiol.Lett.53:299–303(1989))，利用载体pEC-XT99A::ABC进行谷氨酸棒杆菌ATCC13032的转化。在LBHIS琼脂平板(18.5g/l的脑心浸出液肉汤、0.5M山梨醇、5g/l的Bacto胰蛋白胨、2.5g/l的Bacto酵母膏、5g/l的NaCl和18g/l的Bacto琼脂，补加有5mg/l的四环素)上进行转化株的选择。将平板在33°C孵育两天。获得的携带质粒的菌株被命名为谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABC。
17.用于在谷氨酸棒杆菌中异源表达来自绿脓假单胞菌DSM1707的基因rhlA、rhlB和pa1131的载体pEC-XT99A::ABM的构建
为了在谷氨酸棒杆菌中异源表达来自绿脓假单胞菌DSM1707的基因rhlA,rhlB和pa1131，构建了质粒载体pEC-XT99A::ABM(Seq ID No.54)。为此，通过GeneArt AG公司(Regensburg)合成了合成性操纵子rhlABM(SeqID No.41)，并将其间克隆在商品化的载体pMA(GeneArt AG)中。合成的基础是已知的绿脓假单胞菌DSM1707的基因组序列。从载体pMA::ABM开始，通过BglII和XbaI从载体切割下合成性操纵子，并随后将其连接入利用BamHI和XbaI切割的表达载体pEC-XT99A(美国专利7118904)。产生的质粒pEC-XT99A::ABM(Seq ID No.54)的大小为11073个碱基对。以本领域技术人员已知的方式进行化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(Gibco-BRL,Karlsruhe)的连接和转化。通过DNA序列分析来检验插入物的确实性。
如以前所述的(Liebl et al.,FEMS Microbiol.Lett.53:299–303(1989))，利用载体pEC-XT99A::ABM，进行谷氨酸棒杆菌ATCC13032的转化。在LBHIS琼脂平板(18.5g/l的脑心浸出液肉汤、0.5M山梨醇、5g/l的Bacto胰蛋白胨、2.5g/l的Bacto酵母膏、5g/l的NaCl和18g/l的Bacto琼脂，补加有5mg/l的四环素)上进行转化株的选择。将平板在33°C孵育两天。获得的携带质粒的菌株被命名为谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABM。
18.用于在谷氨酸棒杆菌中异源表达来自绿脓假单胞菌DSM1707的基因rhlA、rhlB、pa1131和rhlC的载体pEC-XT99A::ABCM的构建
为了在谷氨酸棒杆菌中异源表达来自绿脓假单胞菌DSM1707的基因rhlA,rhlB,pa1131和rhlC，构建了质粒pEC-XT99A::ABCM(Seq ID No.55)。为此，从菌株绿脓假单胞菌PAO1(DSM1707)的基因组DNA开始，利用以下的寡核苷酸扩增基因pa1131(Seq ID No.59)：
MFS2.0_xbaI_fw:5’-AGGAAATCTAGATGAGAGGCCGGCAAGGATAC-3’(Seq ID No.60)
MFS2.0_XbaI_rev:5’-CCAGGTTCTAGACGCCAGGATTGAACAGTACC-3’(Seq ID No.61)。
利用来自New England Biolabs(Frankfurt)聚合酶的PhusionTM高保真预混合物进行PCR产物(1483个碱基对)的扩增。利用XbaI切割PCR产物并通过Fast Link连接试剂盒(Epicentre Technologies;Madison,WI,USA)将其连接在同样用XbaI切割的载体pBBR1MCS-2::ABC(Seq ID No.40)中。获得的靶载体pEC-XT99A::ABCM(Seq ID No.55)的大小为12263个碱基对。对载体的插入物进行测序。按照生产商的说明书，通过DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen;Hilden)分离染色体DNA。以本领域技术人员已知的方式实施PCR、通过琼脂糖凝胶电泳校验PCR的成功扩增、进行DNA的溴化乙锭染色、确定PCR片段大小、纯化PCR产物以及确定DNA浓度。
如以前所述的(Liebl et al.,FEMS Microbiol.Lett.53:299–303(1989))，利用载体pEC-XT99A::ABCM进行谷氨酸棒杆菌ATCC13032的转化。在LBHIS琼脂平板(18.5g/l的脑心浸出液肉汤、0.5M山梨醇、5g/l的Bacto胰蛋白胨、2.5g/l的Bacto酵母膏、5g/l的NaCl和18g/l的Bacto琼脂，补加有5mg/l的四环素)上进行转化株的选择。将平板在33°C孵育两天。获得的携带质粒的菌株被命名为谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABCM。
19.用于在谷氨酸棒杆菌中异源表达的载体pVWEX1::rfbBDAC的构建
为了在谷氨酸棒杆菌中lac启动子的控制下，异源表达来自恶臭假单胞菌的基因rfbBDAC，构建了载体pVWEX1::rfbBDAC(Seq ID No.57)。为此，利用XbaI消化载体pBBR1MCS-2::rfbBDAC(Seq ID No.45)，并将含有来自恶臭假单胞菌KT2440的基因rfbBDAC和lac启动子的片段(3840bp)连接入用XbaI消化的载体pVWEX1(Seq ID No.56)。产生的质粒pVWEX1::rfbBDAC(Seq ID No.57)的大小为12311个碱基对。以本领域技术人员已知的方式进行化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(Gibco-BRL,Karlsruhe)的连接和转化。通过DNA序列分析来检查插入物的确实性。
如以前所述的(Liebl et al.,FEMS Microbiol.Lett.53:299–303(1989))，利用载体pVWEX1::rfbBDAC进行谷氨酸棒杆菌ATCC13032pEC-XT99A、ATCC13032pEC-XT99A::AB、ATCC13032pEC-XT99A::ABM、ATCC13032pEC-XT99A::ABC和ATCC13032pEC-XT99A::ABCM的转化。在LBHIS琼脂平板(18.5g/l的脑心浸出液肉汤、0.5M山梨醇、5g/l的Bacto胰蛋白胨、2.5g/l的Bacto酵母膏、5g/l的NaCl和18g/l的Bacto琼脂，补加有5mg/l的四环素和25mg/l的卡那霉素)上进行转化株的选择。将平板在33°C孵育两天。获得的携带质粒的菌株被命名为谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A pVWEX1::rfbBDAC、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABCpVWEX1::rfbBDAC和谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABCM pVWEX1::rfbBDAC。
20.通过重组谷氨酸棒杆菌菌株产生的鼠李糖脂的定量
将在实施例15-19中产生的重组菌株谷氨酸棒杆菌菌株：谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::AB、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABC、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABM、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABCM、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A pVWEX1::rfbBDAC、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDAC和谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABCM pVWEX1::rfbBDAC培养在使用了5mg/l四环素以及5mg/l四环素和25mg/l卡那霉素的LBHIS琼脂平板上。为了研究鼠李糖脂在摇动瓶中的产生，首先准备预培养物。为此，使用在LBHIS琼脂平板上新划线的菌株的接种环，并将10ml LBHIS培养基(18.5g/l的脑心浸出液肉汤、0.5M山梨醇、5g/l的Bacto胰蛋白胨、2.5g/l的Bacto酵母膏和5g/l的NaCl，补加有5mg/l四环素或5mg/l四环素和25mg/l卡那霉素)接种在100ml锥形烧瓶中。在33°C和200rpm下，培养菌株过夜。第二天早上，将50ml CGXII培养基(含5mg/l四环素或者5mg/l四环素和25mg/l卡那霉素)接种在含有带1ml预培养物的挡板的500ml锥形烧瓶中(起始OD600 0.1)。
CGXII培养基:
·20g/l的(NH4)2SO4(Merck)
·5g/l的尿素(Merck)
·1g/l的KH2PO4(Merck)
·1g/l的K2HPO4(Merck)
·0.25g/l的MgSO4·7H2O(Merck)
·10mg/l的CaCl2(Merck)
·42g/l的MOPS(Roth)
·0.2mg/l的生物素(Merck)
·1ml/l的微量盐溶液
·利用NaOH调整至pH7
·高压灭菌后，加入1ml/l的原儿茶酸(30g/l，溶解在稀释的NaOH中，灭菌过滤的)和40g/l的葡萄糖(Merck)
微量盐溶液:
·10g/l的FeSO4·7H2O(Merck)
·10g/l的MnSO4·H2O(Merck)
·1g/l的ZnSO4·7H2O(Merck)
·0.2g/l的CuSO4·5H2O(Merck)
·20mg/l的NiCl2·6H2O(Merck)
·利用HCl溶解酸化至pH为1
将培养物在200rpm和33°C下培养直至光密度(600nm)为0.4–0.6。在该光密度，通过添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷;1mM终浓度)诱导培养物。随后的表达同样在33°C和200rpm下进行72h。在24h的间隔，从培养瓶中移出1ml肉汤样品。如实施例4中所述，进行用于以下色谱分析的样品制备和色谱分析本身。
尽管谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A不产生鼠李糖脂，在重组菌株谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::AB、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABC、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABM和谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABCM中，可检测到鼠李糖脂的形成。借助于参考资料，据显示，谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::AB和谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABM仅形成单鼠李糖脂，而谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABC、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABM和谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABCM能够形成双鼠李糖脂和单鼠李糖脂。此外，据显示，谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABM和谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABCM相比相应的没有扩增来自绿脓假单胞菌的pa1131基因的参照菌株谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::AB和谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABC，能够形成更多的单鼠李糖脂或双鼠李糖脂以及单鼠李糖脂。
而且，据显示，菌株谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDAC和谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABCM pVWEX1::rfbBDAC相比没有扩增来自恶臭假单胞菌的rfbBDA基因的菌株谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABM、谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABC和谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABCM，形成明显更多的单-鼠李糖脂(谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABpVWEX1::rfbBDAC和谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC)或者单-和双鼠李糖脂(谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDAC和谷氨酸棒杆菌pEC-XT99A::ABCMpVWEX1::rfbBDAC)。
21.携带质粒pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-2::AB、pBBR1MCS-2::ABC、pBBR1MCS-2::ABM和pBBR1MCS-2::ABCM的假单胞菌菌株的构建
通过电穿孔法，将质粒pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-2::AB、pBBR1MCS-2::ABC、pBBR1MCS-2::ABM和pBBR1MCS-2::ABCM合并入荧光假单胞菌DSM50090、荧光假单胞菌DSM9958、恶臭假单胞菌DSM6899、恶臭假单胞菌DSM50204、恶臭假单胞菌50194、油菜假单胞菌DSM13227、斯氏假单胞菌DSM10701、斯氏假单胞菌DSM4166和黄褐假单胞菌DSM17717中。如以前所述(Iwasaki et al.Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)，进行假单胞菌菌株的转化。在营养琼脂平板(5g/l蛋白胨、3g/l肉膏、15g/l琼脂、pH7，补加有50mg/l卡那霉素)上进行转化株的选择。将平板在30°C，更确切地说在28°C下孵育2天。获得的携带质粒的菌株被命名为荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2、黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2、荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::AB、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::AB、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::AB、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::AB、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::AB、黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::AB、荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::ABC、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::ABC、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::ABC、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::ABC、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::ABC、黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::ABC、荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::ABCM、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::ABCM、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::ABCM、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::ABCM、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::ABCM、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::ABCM、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::ABCM,斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::ABCM、黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::ABCM、荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::ABM、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::ABM、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::ABM、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::ABM、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::ABM和黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::ABM。
22.通过重组假单胞菌菌株产生的鼠李糖脂的定量
将在实施例21中产生的重组菌株假单胞菌菌株荧光假单胞菌DSM50090、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2、黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2、荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::AB、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::AB、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::AB、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::AB、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::AB、黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::AB,荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::ABC、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::ABC、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::ABC、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::ABC、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::ABC、黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::ABC、荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::ABCM、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::ABCM、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::ABCM、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::ABCM、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::ABCM、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::ABCM、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::ABCM、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::ABCM、黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::ABCM、荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::ABM、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::ABM、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::ABM、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::ABM、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::ABM和黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::ABM培养在LB琼脂卡那霉素(50μg/ml)平板上。随后如实施例12所述进行用于产生鼠李糖脂的培养。如实施例4所述进行用于下文的色谱分析的样品制备和色谱分析自身。
尽管假单胞菌菌株荧光假单胞菌DSM50090、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2、黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2没有产生鼠李糖脂，在重组菌株荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::AB、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::AB、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::AB、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::AB、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::AB、黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::AB、荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::ABM、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::ABM、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::ABM、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::ABM、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::ABM和黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::ABM中，可以检测到单鼠李糖脂的形成，以及在菌株荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::ABC、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::ABC、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::ABC、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::ABC、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::ABC、黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::ABC、荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::ABCM、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::ABCM、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::ABCM、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::ABCM、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::ABCM、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::ABCM、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::ABCM、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::ABCM和黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::ABCM中，可以检测到单-和双鼠李糖脂的形成。
而且，相比相应的没有铜绿假单胞菌基因pa1131的参照菌株荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::AB、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::AB、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::AB、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::AB、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::AB和黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::AB以及没有来自绿脓假单胞菌的pa1131基因扩增的荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::ABC、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::ABC、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::ABC、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::ABC、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::ABC和黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::ABC，重组假单胞菌菌株荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::ABM、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::ABM、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::ABM、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::ABM、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::ABM、黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::ABM形成了较少的单鼠李糖脂，以及重组假单胞菌菌株荧光假单胞菌DSM50090pBBR1MCS-2::ABCM、荧光假单胞菌DSM9958pBBR1MCS-2::ABCM、恶臭假单胞菌DSM6899pBBR1MCS-2::ABCM、恶臭假单胞菌DSM50204pBBR1MCS-2::ABCM、恶臭假单胞菌50194pBBR1MCS-2::ABCM、油菜假单胞菌DSM13227pBBR1MCS-2::ABCM、斯氏假单胞菌DSM10701pBBR1MCS-2::ABCM、斯氏假单胞菌DSM4166pBBR1MCS-2::ABCM和黄褐假单胞菌DSM17717pBBR1MCS-2::ABCM形成了较少的单-和双鼠李糖脂。
23.用于在恶臭假单胞菌中异源表达来自绿脓假单胞菌PAO1、绿脓假单胞菌PA7、绿脓假单胞菌1和泰国伯克氏菌E264的可选rhlA、rhlB和rhlC基因的载体pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1和pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264的构建
为了异源表达来自绿脓假单胞菌PAO1和绿脓假单胞菌PA7的基因rhlA、rhlB和rhlC，首先构建质粒pBBR1MCS-2::ABPAO1(Seq ID No.62)和pBBR1MCS-2::ABPA7(Seq IDNo.63)。为此，通过DNA2.0公司(Menlo Park,CA,U.S.A)(Regensburg)合成了合成性操纵子rhlABPAO1(Seq ID No.64)和rhlABPA7(Seq ID No.65)，并间克隆在商品化载体pJ294(DNA2.0)中。合成的基础是已知的菌株绿脓假单胞菌PAO1和绿脓假单胞菌PA7的基因组序列。从载体pJ294::ABPAO1和pJ294::ABPA7开始，通过KpnI和XbaI从载体切割下合成性操纵子，并随后连接在用KpnI和XbaI切割的表达载体pBBR1MCS-2(Seq ID No.49)(Kovach etal.,1995:Four new derivatives of thebroad-host-range cloning vector pBBR1MCScarrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene,166:175-176)中。产生的质粒pBBR1MCS-2::ABPAO1(Seq ID No.62)和pBBR1MCS-2::ABPA7(Seq ID No.63)的大小为7332和7354个碱基对。以本领域技术人员已知的方式进行化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(Gibco-BRL,Karlsruhe)的连接和转化。通过DNA序列分析来检验插入物的确实性。
在第二步中，产生了质粒pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1(Seq ID No.66)和pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264(Seq ID No.67)。为此，通过DNA2.0公司(Menlo Park,CA,U.S.A)合成了来自绿脓假单胞菌1(Seq ID No.68)和泰国伯克氏菌E264(Seq ID No.76)的rhlC基因，并间克隆在商品化载体pJ294(DNA2.0)中。合成的基础是已知的菌株绿脓假单胞菌1和泰国伯克氏菌E264的基因组序列。从载体pJ294::C1和pJ294::CE264开始，通过Xba和SacI从载体切割下rhlC基因，并随后连接在同样用Xba和SacI切割的载体pBBR1MCS-2::ABPAO1(Seq IDNo.62)和pBBR1MCS-2::ABPA7(Seq ID No.63)中。产生的质粒pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1(SeqID No.66)和pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264(Seq ID No.67)的大小为8325和8335个碱基对。以本领域技术人员已知的方式进行化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(Gibco-BRL,Karlsruhe)的连接和转化。通过DNA序列分析来检验插入物的确实性。通过DNA序列分析来检验插入物的确实性。
如以前所述的(Iwasaki et al.Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)，利用载体pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1和pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264进行恶臭假单胞菌KT2440和GPp104的转化。分离并分析每10个克隆的质粒DNA。获得的携带质粒的菌株被命名为恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264、恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2、恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264。
24.通过具有来自绿脓假单胞菌PAO1、绿脓假单胞菌PA7、绿脓假单胞菌1和泰国伯克氏菌E264的可选rhlA、rhlB和rhlC基因的重组恶臭假单胞菌菌株产生的鼠李糖脂的定量
将实施例23产生的重组菌株恶臭假单胞菌菌株培养在LB琼脂卡那霉素(50μg/ml)平板上。随后如实施例12所述进行用于产生鼠李糖脂的培养。如实施例4所述进行用于下文的色谱分析的样品制备和色谱分析自身。
尽管菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2不能产生单-和双鼠李糖脂，菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264、恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264形成了单鼠李糖脂以及双鼠李糖脂。据显示，聚羟基丁酸酯形成消减的菌株(恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1和恶臭假单胞菌GPp104pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264)比聚羟基丁酸酯形成没有消减的菌株(恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1和恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264)能够产生更多的单-和双鼠李糖脂。
25.用于在恶臭假单胞菌和大肠杆菌中过表达恶臭假单胞菌rfbBDAC操纵子的载体pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC、pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC和pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC的构建
为了构建用于在恶臭假单胞菌和大肠杆菌中过表达恶臭假单胞菌rfbBDAC操纵子的载体pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC、pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC和pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC，首先通过PCR扩增恶臭假单胞菌rfbBDAC操纵子。载体pBBR1MCS-2::rfbBDAC
(Seq ID No.45)作为PCR的基体。使用以下寡核苷酸：
RL_AgeI-fw:5’-TATATATAACCGGTATTAATGCAGCTGGCACGAC-3’
(Seq ID No.71)
RL_AgeI_rev:5’-GGCCGACCGGTACTAGTGGA-3’(Seq ID No.72)
利用New England Biolabs(Frankfurt)聚合酶的PhusionTM高保真预混合物进行PCR。它以本领域技术人员已知的方式进行。将靶序列(lac启动子和rfbBDAC)间克隆在Trenzyme短吻鳄(alligator)克隆系统中。选择大肠杆菌DH5α(New England Biolabs;Frankfurt)转化株，以及分离不同候选物的质粒DNA并对其进行测序。核对并检验序列的正确性后，利用AgeI切割载体。通过常规的连接方法，将靶片段连接入同样用AgeI切割的载体pBBR1MCS-2::AB(Seq ID No.38)、pBBR1MCS-2::ABM(Seq ID No.42)和pBBR1MCS-2::ABMC(Seq ID No.51)中。产生的载体pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC(Seq ID No.73)、pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC(Seq ID No.74)和pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC(Seq ID No.75)的大小为11960、13289和14250个碱基对。对载体的插入物进行测序。以本领域技术人员已知的方式实施PCR、通过琼脂糖凝胶电泳校验PCR的成功扩增、进行DNA的溴化乙锭染色、确定PCR片段大小、纯化PCR产物以及确定DNA浓度。
如以前所述(Iwasaki et al.Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)，利用载体pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC、pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC和pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC进行恶臭假单胞菌KT2440的转化。分离并分析每10个克隆的质粒DNA。获得的携带质粒的菌株被命名为恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC和恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC。
26.通过重组恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC和恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABMC产生的鼠李糖脂的定量
将在实施例2、7和25中产生的重组菌株恶臭假单胞菌菌株培养在LB琼脂-卡那霉素(50μg/ml)平板上。随后如实施例12所述进行用于生产鼠李糖脂的培养。如实施例4所述进行用于下文色谱分析的样品制备和色谱分析本身。
据显示，恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB和恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABM能够形成单鼠李糖脂，而恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC和恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABMC能够形成单-和双鼠李糖脂。
此外，据显示，恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABM、KT2440pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC和KT2440pBBR1MCS-2::ABMC相比对应的没有绿脓假单胞菌基因pa1131扩增的对照菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB、KT2440pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC和KT2440pBBR1MCS-2::ABC能够形成更多的单-和双鼠李糖脂。
最后，据显示，恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC相比相应的没有恶臭假单胞菌基因rfbBDAC扩增的对照菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABM、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC、恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABMC能够形成更多的单鼠李糖脂(恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC和恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC)以及单-和双鼠李糖脂(恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC和恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC)。
27.重组大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABCM、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABCM_rfbBDAC的产生
如以前所述(Miller JH.A Short Course in Bacterial Genetics:ALaboratory Manual and Handbook for Escherichia coil and RelatedBacteria.Plainview,NY:Cold Spring Harbor Lab.Press;1992)，通过电穿孔法进行大肠杆菌W3110的转化。分离并分析每10个克隆的质粒DNA。获得的携带质粒的菌株命名为大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC,大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABCM、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABCM_rfbBDAC。
28.通过重组大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABCM、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABCM_rfbBDAC产生的鼠李糖脂的定量
将实施例27中产生的重组大肠杆菌菌株培养在LB琼脂卡那霉素(50μg/ml)平板上。随后如实施例10所述进行用于生产鼠李糖脂的培养。如实施例4所述进行用于下文色谱分析的样品制备和色谱分析本身。
据显示，大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC能够形成单鼠李糖脂，而大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABCM、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABCM_rfbBDAC能够形成单-和双鼠李糖脂。此外，据显示，大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC相比没有绿脓假单胞菌基因pa1131扩增的大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC形成更多的单鼠李糖脂。
此外，据显示，大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABCM和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABCM_rfbBDAC相比没有绿脓假单胞菌基因pa1131扩增的大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC形成更多的单-和双鼠李糖脂。此外，据显示，大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC相比没有绿脓假单胞菌基因pa1131扩增的大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC形成更多的单鼠李糖脂。
最后，据显示，大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABCM_rfbBDAC相比相应的没有恶臭假单胞菌基因rfbBDAC扩增的对照菌株大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABCM能够形成更多的单鼠李糖脂(大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC、大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC)以及单-和双鼠李糖脂(大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC和大肠杆菌W3110pBBR1MCS-2::ABCM_rfbBDAC)。

Claims (28)

1.细胞，其能够形成至少一种通式(I)的鼠李糖脂，
其中
m＝2、1或0，
n＝1或0，
R1和R2＝彼此独立地为具有2-24个碳原子的相同或不同的有机基团，
其特征在于所述细胞已被遗传学修饰，从而使得与其野生型相比，所述细胞中酶E1、E2和E3中的至少一种的活性是增加的，其中酶E1能够催化3-羟基链烷酰-ACP经由3-羟基链烷酰-3-羟基链烷酸-ACP转化为羟基链烷酰-3-羟基链烷酸；酶E2是鼠李糖基转移酶I，并能够催化dTDP-鼠李糖和3-羟基链烷酰-3-羟基链烷酸酯转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基链烷酰-3-羟基链烷酸酯；而酶E3是鼠李糖基转移酶II，并能够催化dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基链烷酰-3-羟基链烷酸酯转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基链烷酰-3-羟基链烷酸酯；以及
与其野生型相比，所述细胞中选自以下一组中的至少一种酶具有增加的活性：
至少一种酶E4，即dTTP:α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶，EC 2.7.7.24，
至少一种酶E5，即dTTP-葡萄糖-4,6-水解酶，EC 4.2.1.46，
至少一种酶E6，即dTDP-4-脱氢鼠李糖-3,5-差向异构酶，EC 5.1.3.13，
至少一种酶E7，即dTDP-4-脱氢鼠李糖-还原酶，EC 1.1.1.133。
2.权利要求1的细胞，其特征在于m＝1或0。
3.权利要求1的细胞，其特征在于n＝1。
4.权利要求1的细胞，其特征在于R1和R2是分支的、取代的或不饱和的烃基。
5.权利要求4的细胞，其特征在于所述取代的烃基是羟基取代的烃基。
6.权利要求4的细胞，其特征在于所述不饱和的烃基是单-、双-或三-不饱和的烃基。
7.权利要求1的细胞，其特征在于酶E4具有多肽序列Seq ID No.10。
8.权利要求1的细胞，其特征在于酶E5具有多肽序列Seq ID No.12。
9.权利要求1的细胞，其特征在于酶E6具有多肽序列Seq ID No.14。
10.权利要求1的细胞，其特征在于酶E7具有多肽序列Seq ID No.16。
11.权利要求1-10任一项的细胞，其特征在于酶E1、E2和E3选自以下一组：
至少一种酶E1，其选自
酶E1a，其具有多肽序列Seq ID No.2，
酶E1b，其具有多肽序列Seq ID No.18，
酶E1c，其具有多肽序列Seq ID No.78，
酶E1d，其具有多肽序列Seq ID No.80，以及
酶E1e，其具有多肽序列Seq ID No.82，
至少一种酶E2，其选自
酶E2a，其具有多肽序列Seq ID No.4，
酶E2b，其具有多肽序列Seq ID No.20，
酶E2c，其具有多肽序列Seq ID No.84，
酶E2d，其具有多肽序列Seq ID No.86，以及
酶E2e，其具有多肽序列Seq ID No.88，以及
至少一种酶E3，其选自
酶E3a，其具有多肽序列Seq ID No.6，
酶E3b，其具有多肽序列Seq ID No.22，
酶E3c，其具有多肽序列Seq ID No.90，以及
酶E3d，其具有多肽序列Seq ID No.92。
12.权利要求1-10任一项的细胞，其特征在于它具有增加的酶组合的活性，所述酶组合选自E2、E2E3和E1E2E3。
13.权利要求1-10任一项的细胞，其特征在于它具有增加的酶组合E1E2E3的活性，并且n为1。
14.权利要求1-10任一项的细胞，其特征在于它选自以下菌属：曲霉属(Aspergillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、乳杆菌属(Lactobacillus)、副球菌属(Paracoccus)、乳球菌属(Lactococcus)、念珠菌属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、单胞发酵菌属(Zymomonas)、耶罗威亚酵母属(Yarrowia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、青枯菌属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红杆菌属(Rhodobacter)、伯克氏菌属(Burkholderia)、梭菌属(Clostridium)和贪铜菌属(Cupriavidus)。
15.权利要求1-10任一项的细胞，其特征在于它能够如同野生型那样形成具有C6至C16链长度的聚羟基链烷酸酯。
16.权利要求1-10任一项的细胞，其特征在于它已经过遗传学修饰，从而使得与其野生型相比，它能够形成较少的聚羟基链烷酸酯。
17.权利要求15的细胞，其特征在于所述细胞与其野生型相比，具有降低的至少一种酶E9或E10的活性，
其中E9是聚羟基链烷酸酯合成酶，EC:2.3.1.-，其具有将3-羟基链烷酰-辅酶A转化为聚-3-羟基链烷酸的能力，以及
E10是3-羟基链烷酰-ACP:辅酶A转移酶，其具有将3-羟基链烷酰-ACP转化为3-羟基链烷酰-辅酶A的能力。
18.权利要求17的细胞，其特征在于E9具有多肽序列Seq ID No.30或Seq ID No.32。
19.权利要求17的细胞，其特征在于E10具有多肽序列Seq ID No.34或Seq ID No.36。
20.权利要求14的细胞，其特征在于所述细胞选自恶臭假单胞菌(P.putida)GPp121、恶臭假单胞菌GPp122、恶臭假单胞菌GPp123、恶臭假单胞菌GPp124和恶臭假单胞菌GPp104、恶臭假单胞菌KT42C1、恶臭假单胞菌KTOY01或恶臭假单胞菌KTOY02。
21.权利要求1-10任一项的细胞，其特征在于：与其野生型相比，它具有增加的至少酶E8的活性，所述酶E8催化通式(I)的鼠李糖脂从细胞输送至周围介质中。
22.权利要求21的细胞，其特征在于E8具有多肽序列Seq ID No.8、Seq ID No.24、SeqID No.26或Seq ID No.28。
23.分离的核酸，其在每种情况下都含有选自组[A3-D3]中的至少一个序列，其中
组[A3-D3]由以下序列组成：
A3a)Seq ID No.5的序列，其中该序列编码蛋白，所述蛋白能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1–2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸，
B3a)无内含子的序列，其来源于A3a)的序列，并与Seq ID No.5的序列编码相同的蛋白或肽，
C3a)编码包含Seq ID No.6的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，
D3a)组A3a)-C3a)之一的序列的互补序列，
A3b)Seq ID No.21的序列，其中该序列编码蛋白，所述蛋白能够将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸，
B3b)无内含子的序列，其来源于A3b)的序列，并与Seq ID No.21的序列编码相同的蛋白或肽，
C3b)编码包含Seq ID No.22的氨基酸序列的蛋白或肽的序列，和
D3b)组A3b)-C3b)之一的序列的互补序列。
24.载体，其包含选自Seq ID No.38、Seq ID No.40、Seq ID No.42、Seq ID No.45、SeqID No.47和权利要求23所述的核酸中的至少一种核酸序列。
25.权利要求24的载体，其特征在于其是表达载体或基因过表达盒。
26.权利要求1-10任一项的细胞，其特征在于它含有至少一种权利要求23所述的核酸或至少一种权利要求24或25所述的载体。
27.用于生产通式(I)的鼠李糖脂的方法，所述方法包括以下处理步骤：
I)使权利要求1-22和26任一项所述的细胞与含碳源的介质接触，
II)在可以使细胞从所述碳源形成鼠李糖脂的条件下培养细胞，以及
III)任选地分离形成的鼠李糖脂。
28.利用权利要求27所述的方法获得的鼠李糖脂用于生产化妆品、皮肤制剂或药物制剂、用于生产植物保护制剂以及用于生产护理和清洁剂以及表面活性剂浓缩物的用途。
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