CN115290765B - 一种羧酸标记hplc-uv定量检测鼠李糖脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种羧酸标记HPLC‑UV定量检测鼠李糖脂的方法，包括：首先将待测溶液pH调节至酸性，并低温静置，得到酸沉后的待测溶液；再采用有机溶剂进行萃取，取有机相，再去除有机溶剂，得到萃取物；之后将萃取物与对硝基苯乙二胺、TBTU、三乙胺、乙腈混合，并进行衍生化反应，得到衍生化产物混合液；最后采用HPLC‑UV对衍生化产物混合液进行检测，以脂肪酸为外标物，根据外标物标准曲线计算得到待测溶液中鼠李糖脂的浓度。与现有技术相比，本发明具有分析衍生产物稳定、灵敏度高、抗干扰能力强、重现性好等特点，并可有效解决鼠李糖脂原始样品的紫外吸收波长短干扰严重、紫外吸收较弱灵敏度低、难于获得单一纯物质等问题。
Description
技术领域
本发明属于糖脂检测技术领域，涉及一种羧酸标记HPLC-UV定量检测鼠李糖脂的方法。
背景技术
鼠李糖脂是微生物糖脂中最具有代表性的一类生物表面活性剂，具有显著降低表/界面张力、低毒性、可生物降解、环境友好等特性。它们可以将水的表面张力降低至30mN/m以下，并将十六烷-水的界面张力降低至<1mN/m，临界胶束浓度(CMC)为5-200mg/L。从结构上讲，鼠李糖脂属于阴离子生物表面活性剂，每个同源物由1或2个鼠李糖残基和1或2个长度为8-12个碳的脂肪酸组成，最多有一个不饱和键，在发酵液中发现了110多种不同类型的鼠李糖脂。鼠李糖脂在清洁油罐和在石油工业中提高石油采收率(EOR)方面的出色潜力已经得到确证。鼠李糖脂在环境修复方面也得到应用，它可以从土壤和水中去除油、杀虫剂和重金属。此外，由于鼠李糖脂具有很强的发泡性和润湿性。因此，被广泛用于个人护理领域，即洗涤剂和清洁剂。
目前，已有一些关于鼠李糖脂定量的研究，文献报道的鼠李糖脂定量方法有酸沉法、蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法、临界胶束浓度法、油扩散法、HPLC-ELSD法、HPLC-MS/MS法等。其中酸沉法、蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法、临界胶束浓度法、油扩散法测定的鼠李糖脂浓度偏差较大，准确度不高。HPLC-ELSD能够直接检测鼠李糖脂，然而，由于缺乏鼠李糖脂标准进行比较，培养基中存在的每个鼠李糖脂衍生物的结构难以确定。虽然HPLC-MS/MS是目前检测鼠李糖脂最灵敏的方法，但HPLC-MS/MS方法存在的问题是标准物制备困难，仪器成本较高以及运行和维护费用高等问题。因此，建立一种高灵敏度，操作简单的鼠李糖脂定量方法很有必要。
发明内容
本发明的目的就是提供一种羧酸标记HPLC-UV定量检测鼠李糖脂的方法，用于解决高效液相色谱检测鼠李糖脂含量时紫外吸收波长短干扰严重、紫外吸收弱、灵敏度低、无单一标准物质的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种羧酸标记HPLC-UV定量检测鼠李糖脂的方法，包括以下步骤：
1)将待测溶液pH调节至酸性，并低温静置，得到酸沉后的待测溶液；
2)采用有机溶剂进行萃取，取有机相，再去除有机溶剂，并配制成溶液，得到萃取物溶液；
3)将萃取物溶液与对硝基苯乙二胺、TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸)、三乙胺、乙腈混合，并进行衍生化反应，得到衍生化产物混合液；
4)采用HPLC-UV对衍生化产物混合液进行检测，由于目前缺乏鼠李糖脂标准品，因此以脂肪酸为外标物，根据外标物标准曲线计算得到待测溶液中鼠李糖脂的浓度。
进一步地，步骤1)中，pH调节终点为1.5-2.5，静置温度为3-5℃，静置时间为10-16h。
进一步地，所用调节溶液为盐酸，浓度为4-8mol/L。
进一步地，步骤2)中，所用有机溶剂为乙酸乙酯；去除有机溶剂的方法为：将有机相在55-60℃下旋蒸。
进一步地，步骤3)中，所述的萃取物溶液的浓度为0.1mg/L～2g/L，或者将萃取物稀释1-2倍；
所述的萃取物溶液、对硝基苯乙二胺、TBTU、三乙胺、乙腈的用量比为0.5mL:(5-20)mg:(5-20)mg:0.5mL:(1.5-2.0)mL。
进一步地，所述的衍生化反应中，反应温度为30-75℃，反应时间为15-180min。
进一步地，步骤4)中，所述的外标物包括壬酸，所述的外标物标准曲线的绘制方法包括以下步骤：
M1：将不同量的壬酸，与对硝基苯乙二胺、TBTU、三乙胺、乙腈混合，并进行衍生化反应，得到不同壬酸浓度的外标样品溶液；
M2：采用HPLC-UV对不同壬酸浓度的外标样品溶液进行检测，以壬酸浓度为横坐标，以壬酸相应出峰时间(次色谱条件下为8.0-8.5min)的峰面积为纵坐标作图，即得到外标物标准曲线。
进一步地，步骤M1中，所述的对硝基苯乙二胺、TBTU、三乙胺、乙腈的用量比为(5-20)mg:(5-20)mg:0.5mL:1.5mL；
所述的外标样品溶液中，壬酸浓度为0-5×10-4mol/L。
进一步地，步骤4)中，根据外标物标准曲线计算得到待测溶液中鼠李糖脂的浓度，具体为：对于鼠李糖脂，因为标记后每个分子含有一个吸收基团，其摩尔吸收系数与普通脂肪酸相同，单位摩尔浓度在HPLC上具有相同的响应。将得到的各种鼠李糖脂峰面积代入壬酸标准曲线计算出相应的摩尔浓度，通过乘以相对应的鼠李糖脂相对分子质量求出其质量浓度。
进一步地，步骤4)中，HPLC-UV检测中，紫外检测波长为386nm。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1)本发明提供了一种基于衍生化反应的鼠李糖脂外标检测法，以壬酸作为外标物质，通过衍生化解决了高效液相色谱法直接测定鼠李糖脂原始样品吸收波长短(小于210nm)干扰严重，吸收弱灵敏度低、达不到检测限的问题；
2)本发明中的衍生化反应在70℃下经过60min即可完成，具有反应快速完全，检测效率高等优点；
3)本发明使用紫外检测器对衍生化产物进行检测，最大吸收波长达到386nm，属于较高波长段，不易被溶剂或相关杂质影响，抗干扰性强；
4)鼠李糖脂RhaC10C10和RhaRhaC10C10的检出限分别达到0.018mg/L和0.014mg/L，相较于检出限为50mg/L的直接测量表面张力、检出限为20mg/L的蒽酮硫酸法、检出限为10mg/L的C13标记，LC-MS检测、0.7mg/L的HPLC-CAD直接检测等方法，灵敏度明显提高；
5)本发明对衍生化方法进行重复性和稳定性检测，5次重复实验中鼠李糖脂RhaC10C10和RhaRhaC10C10的RSD低于1％，衍生产物在24h内具有良好的稳定性。
附图说明
图1为实施例2中对照样品溶液的总离子流图；
图2为实施例2中对照样品溶液中各个单鼠李糖脂、双鼠李糖脂的质谱图；
图3为实施例2中鼠李糖脂标记前后高效液相色谱(HPLC)色谱图对比，(A)原始样品色谱图(B)标记样品色谱图；
图4为实施例2中空白溶剂的液相色谱图；
图5为实施例2中样品溶液的液相色谱图；
图6为实施例2中不同外标样品溶液的液相色谱图；
图7为实施例3中衍生化检测稳定性测试结果图；
图8为实施例5中壬酸、鼠李糖脂RhaC10C10和RhaRhaC10C10衍生化检测标准曲线；
图9为实施例6中不同方法定量发酵液中鼠李糖脂含量的对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中，所用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa.LJ-8)菌株于2022年1月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.24279，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
实施例1：
一种从铜绿假单胞菌中提取鼠李糖脂的方法，包括以下步骤：
S1：在超净台里，将斜面上保存的Pseudomonas aeruginosa LJ-8菌株用接种环接种到LB液体培养基中，之后在37℃、180rpm下振荡培养20h，得到种子液；
其中，LB液体培养基包括以下组分及质量浓度：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L(OXOIDLP0042)，酵母粉5g/L，pH 7.0；
S2：在超净台里，将种子液以3％的接种量接种到发酵培养基中，之后在37℃、180rpm下振荡培养108h，得到发酵液；
其中，发酵培养基包括以下组分及质量浓度：甘油50g/L，酵母粉3.0g/L，NaNO33.0g/L，K2HPO4 8.4g/L，KH2PO4 5.6g/L，MgSO4 0.3g/L，KCl 1.0g/L，NaCl1.0g/L，CaCl20.2g/L；
S3：采用1mol/L NaOH调节液将发酵液pH调节到7.0以上，随后将发酵液在4℃、10000rmp下离心10min，除去菌体得发酵上清液，将上清液用6mol/L HCl调至pH在2.0左右，并在4℃下静置12h，得到粗糖脂沉淀；
S4：在酸沉后、含有粗糖脂沉淀的发酵液中，加入等体积的乙酸乙酯进行振荡萃取，取上层有机相，重复操作三次，并采用旋转蒸发仪在55℃下旋蒸去除萃取剂，得到鼠李糖脂。
实验表明上述方法所制备的鼠李糖脂包括4种单鼠李糖脂(RhaC10、RhaC10C10、RhaC8C10、RhaC10C12)和6种双鼠李糖脂(RhaRhaC10、RhaRhaC10C10、RhaRhaC8C10、RhaRhaC10C12:1、RhaRhaC10C12、RhaRhaC12C12)。
实施例2：
一种基于衍生化法的羧酸标记HPLC-UV定量检测鼠李糖脂的方法，包括以下步骤：
S1：制备空白溶剂：精密称取15.0mg对硝基苯乙二胺、15.0mg TBTU、0.5mL三乙胺和2.0mL乙腈依次加入密封的玻璃管中，摇匀，再置于70℃水浴中加热60min，反应结束后，将玻璃管中的溶液转移至7mL EP管中待用；
S2：精密称取鼠李糖脂样品200.0mg，置于100.0mL容量瓶中，用适量乙腈作溶剂超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为样品储备液；其中鼠李糖脂样品采用同实施例1的方法制备得到；
制备对照样品溶液：精密量取样品储备液0.5mL、15.0mg对硝基苯乙二胺、15.0mgTBTU、0.5mL三乙胺和1.5mL乙腈在密封的玻璃管中，摇匀，再置于70℃水浴中加热60min，取出冷却并转移至7mL EP管中待用；
S3：精密称取辛酸、壬酸、癸酸、十二酸、十四酸、十六酸、十七酸样品各200.0mg，置于100.0mL容量瓶中，用适量乙腈作溶剂超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为外标样品储备液；
外标样品溶液：精密量取外标样品储备液0.5mL、15.0mg对硝基苯乙二胺、15.0mgTBTU、0.5mL三乙胺和1.5mL乙腈在密封的玻璃管中，摇匀，置70℃水浴中加热60min，取出冷却并转移至7mL EP管中待用；
S4：色谱分析：对照样品溶液使用LC-MS进行检测，并确定各个色谱峰的组成，样品储备液也经LC-MS进行检测，LC-MS使用超高压C18反相柱，流动相为(乙腈+0.1％甲酸V/V)和(水+0.1％甲酸V/V)，流速0.3mL/min，乙腈梯度：0-2min，0％-60％；2-45min，60％-98％，45-75min，保持在98％。柱温为30℃，质谱检测器为ESI正离子模式，Q-Exactive检测器，记录色谱图，所得衍生后鼠李糖脂总离子流图(TIC)如图1所示，图1中各标注峰对应的质谱图(ESI)如图2所示，鼠李糖脂标记前后LC-MS色谱图对比如图3所示。
通过LC-MS分析可知，衍生后鼠李糖脂包括4种单鼠李糖脂(RhaC10、RhaC10C10、RhaC8C10、RhaC10C12)衍生物和6种双鼠李糖脂(RhaRhaC10、RhaRhaC10C10、RhaRhaC8C10、RhaRhaC10C12:1、RhaRhaC10C12、RhaRhaC12C12)衍生物。
使用HPLC-UV分别对空白溶剂、对照样品溶液，色谱参数见下表1，记录色谱图，结果见附图4-5。以下实施例中，HPLC-UV中的上述单鼠李糖脂衍生物与双鼠李糖脂衍生物的出峰位置根据LC-MS色谱图(图3)确定，即以图3中2个最高的衍生物峰e(RhaRhaC10C10)、f(RhaC10C10)作为特征峰，分别对应于HPLC-UV色谱图(图5)中的10.83min、13.93min处的出峰，其余单鼠李糖脂与双鼠李糖脂则根据相对于这两个特征峰的出峰时间确定。
表1液相色谱参数
实施例3：
本实施例用于对实施例2中外标物质的确定进行考察：
具体实验步骤如下：
1)制备外标样品溶液：参照实施例2中的步骤S3；
2)色谱分析：将获得的外标样品溶液进样HPLC-UV检测(仪器与条件参照表1)，记录色谱图，如附图6所示，脂肪酸的标记产物色谱图6(a)-6(g)分别对应辛酸、壬酸、癸酸、十二酸、十四酸、十六酸、十七酸的出峰时间，从图中可以看出脂肪酸的出峰时间与鼠李糖脂的标记产物(图5)出峰时间相比有的发生重叠，只有壬酸的标记产物的出峰时间与之没有任何重叠。而且脂肪酸和鼠李糖脂样品在结构上都只含有一个羧基，因此与对硝基苯乙二胺的反应都是1:1，在转化率上接近(近乎完全转化)，所以用脂肪酸做为外标物质来检测鼠李糖脂的浓度是可行的，又通过对比鼠李糖脂的出峰时间与多种脂肪酸的出峰时间发现，可以选择壬酸作为鼠李糖脂的外标物质进行后续的定量分析。
实施例4：
本实施例用于对实施例2中基于衍生化方法所得鼠李糖脂标记样品溶液，即对照样品溶液的稳定性进行考察：
具体实施步骤如下：
1)制备对照样品溶液：参照实施例2中的步骤S2；
2)色谱分析：将对照样品溶液分别放置0-24小时，每隔3个小时，将上述对照样品溶液进样HPLC-UV检测(仪器与条件参照表1)，记录色谱图，以放置时间为横坐标，出峰时间为13-14min鼠李糖脂RhaC10C10和出峰时间为10-11min鼠李糖脂RhaRhaC10C10的峰面积为纵坐标作图，如附图7所示，可见，鼠李糖脂衍生化产物在24h内具有良好的稳定性。
实施例5：
本实施例用于对实施例2中的检测方法重复性进行考察：
具体实验步骤如下：
1)对同一浓度的鼠李糖脂样品溶液平行衍生化反应5次；
2)色谱分析：将上述5份对照样品溶液进样HPLC-UV检测(仪器与条件参照表1)，记录色谱图，统计色谱图中RhaC10C10、RhaRhaC10C10的峰面积信息于表2。
表2对硝基苯乙二胺衍生化反应鼠李糖脂
五个平行样的RhaC10C10、RhaRhaC10C10峰面积相对标准偏差都在1％以内，表明本衍生化方法具有良好的重现性。
实施例6：
本实施例用于对实施例2中的检测方法的线性及检出限进行考察：
1)制备空白试剂、鼠李糖脂浓度分别为0.8、0.5、0.25、0.2、0.125、0.1g/L的对照样品溶液、不同壬酸浓度的外标样品溶液：同实施例2；
2)色谱分析：对硝基苯乙二胺标记不同浓度的外标样品壬酸和不同浓度的对照样品鼠李糖脂样品，以壬酸浓度为横坐标及出峰时间8.0-8.5min处的峰面积为纵坐标，绘制外标样品的标准曲线，因为标记后的每个鼠李糖脂样品中含有一个吸收基团，其摩尔吸收系数与普通脂肪酸(壬酸)相同，单位摩尔浓度在HPLC上具有相同的响应。将得到的各种鼠李糖脂峰面积代入壬酸标准曲线计算出相应的摩尔浓度，通过此方法计算出对照样品的标准曲线。具体为：分别自动进样上述不同浓度对照样品溶液、空白试剂、不同浓度外标样品溶液各25μL进行HPLC-UV检测(仪器与条件参照表1)，记录色谱图，结果见表3及附图8。
表3不同浓度标记RhaC10C10、RhaRhaC10C10和壬酸峰面积关系
以壬酸浓度、鼠李糖脂RhaRhaC10C10浓度及鼠李糖脂RhaC10C10浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，作X-Y散点图并拟合趋势线，如附图7所示，衍生后的壬酸浓度在0-3.16×10-4mol/L范围内和峰面积呈线性相关，标曲为y＝3×107x(mol/L)图8中的a，因为标记后的每个鼠李糖脂样品中含有一个吸收基团，其摩尔吸收系数与普通脂肪酸相同，单位摩尔浓度在HPLC上具有相同的响应。将得到的各种鼠李糖脂峰面积代入壬酸标准曲线计算出相应的摩尔浓度，通过此方法计算出两种鼠李糖脂化合物衍生后的标准曲线分别为y＝59409m(g/L)图8中的b和y＝46082m(g/L)图8中的c。
以峰面积统计衍生方法的检出限，分别记录了在RT 10-12min和RT 13-15min五个空白样品的基线噪音。保留时间在10-12min内的噪音平均面积为0.44mAU·s，标准差为0.073，保留时间在13-15min内噪音平均面积为0.54mAU·s，标准差为0.17，检出限计算如下：
式中，D为检出限；为空白噪音面积平均数；3为信噪比(S/N)；sb为空白噪音面积标准偏差；k为标曲斜率。
根据峰面积计算得到RhaC10C10的检出限为0.018mg/L，RhaRhaC10C10的检出限为0.014mg/L。
实施例7：
本实施例采用实施例2中的检测方法、蒽酮硫酸法以及溶剂萃取法对Pseudomonasaeruginosa.LJ-8发酵液中的鼠李糖脂含量进行考察。
具体实施步骤如下：
1)在超净台里，将斜面上保存的Pseudomonas aeruginosa.LJ-8菌株用接种环接种到LB液体培养基中，之后在37℃、180rpm下振荡培养20h，得到种子液；
其中，LB液体培养基包括以下组分及质量浓度：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L(OXOIDLP0042)，酵母粉5g/L，pH 7.0；
2)在超净台里，将种子液以3％的接种量接种到发酵培养基中，之后在37℃、180rpm的恒温振荡摇床中培养156h；
其中，发酵培养基包括以下组分及质量浓度：甘油50g/L，酵母粉3.0g/L，NaNO33.0g/L，K2HPO4 8.4g/L，KH2PO4 5.6g/L，MgSO4 0.3g/L，KCl 1.0g/L，NaCl1.0g/L，CaCl20.2g/L；
3)分别取发酵时间为6、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、156h时的发酵液20.0mL装于2个50mL锥形瓶中。
10mL发酵液用于蒽酮硫酸法测发酵液中鼠李糖脂总含量；
8mL发酵液用1mol/L NaOH调节液调节pH到7.0以上，随后将发酵液在10000rmp、4℃下离心10min，除去菌体得发酵上清液，将上清液用6mol/L HCl调至pH在2.0左右，并在4℃下静置12h，得到酸沉溶液，并用乙酸乙酯萃取糖脂，将糖脂的乙酸乙酯样品用空气泵吹干，除去有机溶剂然后称重；
2mL的发酵液按同8mL发酵液的操作步骤处理后，加入对硝基苯乙二胺和TBTU各15mg、乙腈2mL及三乙胺0.5mL，放入密封的玻璃试管中在70℃水浴反应1h，然后在386nm波长下用HPLC检测。对比三种方法的差异性，结果见附图9。
实施例8：
本实施例采用实施例2中的检测方法对Pseudomonas aeruginosa.LJ-8发酵液中10种成分在不同培养时间下的浓度进行考察。
具体实施步骤如下：
1)在超净台里，将斜面上保存的Pseudomonas aeruginosa.LJ-8菌株用接种环接种到LB液体培养基中，之后在37℃、180rpm下振荡培养20h，得到种子液；
其中，LB液体培养基包括以下组分及质量浓度：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L(OXOIDLP0042)，酵母粉5g/L，pH 7.0；
2)在超净台里，将种子液以3％的接种量接种到发酵培养基中，之后在37℃、180rpm的恒温振荡摇床中培养156h；
其中，发酵培养基包括以下组分及质量浓度：甘油50g/L，酵母粉3.0g/L，NaNO33.0g/L，K2HPO4 8.4g/L，KH2PO4 5.6g/L，MgSO4 0.3g/L，KCl 1.0g/L，NaCl1.0g/L，CaCl20.2g/L；
3)取不同培养时间段的发酵液各10mL，分别用1mol/L NaOH调节液调节pH到7.0以上，随后将发酵液在10000rmp、4℃下离心10min，除去菌体得发酵上清液，将上清液用6mol/L HCl调至pH在2.0左右，并在4℃下静置12h，得到酸沉溶液；
4)在酸沉后、含有粗糖脂沉淀的发酵液中，加入等体积的乙酸乙酯进行振荡萃取，取上层有机相，重复操作三次，并采用旋转蒸发仪在55℃下旋蒸去除萃取剂，得到鼠李糖脂样品；
5)制备衍生样品：取上述不同培养时间段的发酵液各10mL所获得的鼠李糖脂样品分别溶解在5.0mL乙腈溶液中，并取0.5mL与15mg对硝基苯乙二胺和15mg TBTU、0.5mL三乙胺及1.5mL乙腈溶液，一同放入密封的玻璃试管中，在70℃水浴反应1h，取出冷却并转移至7mL EP管中待用；
6)色谱分析：自动进样上述衍生样品溶液25μL进行HPLC-UV检测(仪器与条件参照表1)，记录色谱图并采用同实施例5的方法进行处理，结果见表4。
表4鼠李糖脂10种结构在不同培养时间的浓度变化
从表中可以看出，发酵初期单鼠李糖脂的浓度高于双鼠李糖脂。随着发酵时间的不断增加，双鼠李糖脂的产量逐渐高于单鼠李糖脂。基于P.aeruginosa产鼠李糖脂的生物合成途径，RhlB(鼠李糖基转移酶1)首先催化HAA-ACP或HAA-CoA形成单鼠李糖脂。随后，鼠李糖基通过转移酶2(RhlC)催化转移到单鼠李糖脂上，最终生成双鼠李糖脂。这就是发酵液中单鼠李糖脂和双鼠李糖脂浓度发生变化的原因。并且通过这个衍生反应，可以了解发酵液中各个化合物在不同发酵阶段的浓度变化。
实施例9：
本实施例采用实施例2的检测方法对大庆油田产出水样品中鼠李糖脂含量进行考察。
具体实施步骤如下：
1)取100mL大庆油田产出水(南2-10-P240边#)样品于烧杯中，用1mol/LNaOH溶液调节pH为10左右，将调节pH后的溶液用正己烷5％(V/V)进行萃取，分层取水相；
2)将水相用6mol/L HCl溶液调节pH为2.0，并在4℃下静置12h，得到酸沉后的水相；
3)在酸沉后的水相中，加入等体积的乙酸乙酯进行振荡萃取，取上层有机相，重复操作三次，并采用旋转蒸发仪在55℃下旋蒸去除萃取剂，得到萃取物质；
4)制备衍生样品：取上述100mL大庆油田产出水(南2-10-P240边#)获得的萃取物质溶解在2.0mL乙腈溶液中，并取0.5mL与15mg对硝基苯乙二胺和15mg TBTU、0.5mL三乙胺及1.5mL乙腈溶液，一同放入密封的玻璃试管中，在70℃水浴反应1h，取出冷却并转移至7mLEP管中待用；
5)色谱分析：自动进样上述衍生样品溶液25μL进行HPLC-UV检测(仪器与条件参照表1)，记录色谱图，采用同实施例5的方法获得各单鼠李糖脂与双鼠李糖脂的标注曲线，并根据色谱图计算获得鼠李糖脂含量，具体结果见表5。
表5大庆油田产出水样品中鼠李糖脂含量(n＝3)
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种羧酸标记HPLC-UV定量检测鼠李糖脂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)将待测溶液pH调节至酸性，并低温静置，得到酸沉后的待测溶液；
2)采用有机溶剂进行萃取，取有机相，再去除有机溶剂，并配制成溶液，得到萃取物溶液；
3)将萃取物溶液与对硝基苯乙二胺、TBTU、三乙胺、乙腈混合，并进行衍生化反应，得到衍生化产物混合液；其中所述的萃取物溶液、对硝基苯乙二胺、TBTU、三乙胺、乙腈的用量比为0.5mL:(5-20)mg:(5-20)mg:0.5mL:(1.5-2.0)mL，所述的衍生化反应中，反应温度为30-75℃，反应时间为15-180min；
表1液相色谱参数
4)采用HPLC-UV对衍生化产物混合液进行检测，以壬酸为外标物，根据外标物标准曲线计算得到待测溶液中鼠李糖脂的浓度；其中色谱参数见表1。
2.根据权利要求1所述的一种羧酸标记HPLC-UV定量检测鼠李糖脂的方法，其特征在于，步骤1)中，pH调节终点为1.5-2.5，静置温度为3-5℃，静置时间为10-16h。
3.根据权利要求2所述的一种羧酸标记HPLC-UV定量检测鼠李糖脂的方法，其特征在于，所用调节溶液为盐酸，浓度为4-8mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种羧酸标记HPLC-UV定量检测鼠李糖脂的方法，其特征在于，步骤2)中，所用有机溶剂为乙酸乙酯；去除有机溶剂的方法为：将有机相在55-60℃下旋蒸。
5.根据权利要求1所述的一种羧酸标记HPLC-UV定量检测鼠李糖脂的方法，其特征在于，步骤4)中，所述的外标物标准曲线的绘制方法包括以下步骤：
M1：将不同量的壬酸，与对硝基苯乙二胺、TBTU、三乙胺、乙腈混合，并进行衍生化反应，得到不同壬酸浓度的外标样品溶液；
M2：采用HPLC-UV对不同壬酸浓度的外标样品溶液进行检测，以壬酸浓度为横坐标，以出峰时间为8.0-8.5min时的峰面积为纵坐标作图，即得到外标物标准曲线。
6.根据权利要求5所述的一种羧酸标记HPLC-UV定量检测鼠李糖脂的方法，其特征在于，步骤M1中，所述的对硝基苯乙二胺、TBTU、三乙胺、乙腈的用量比为(5-20)mg:(5-20)mg:0.5mL:1.5mL；
所述的外标样品溶液中，壬酸浓度为0-5×10-4mol/L。
7.根据权利要求1所述的一种羧酸标记HPLC-UV定量检测鼠李糖脂的方法，其特征在于，步骤4)中，根据外标物标准曲线计算得到待测溶液中鼠李糖脂的浓度，具体为：
将得到的鼠李糖脂峰面积代入壬酸标准曲线计算出相应的摩尔浓度，再乘以相对应的鼠李糖脂相对分子质量，即可得到质量浓度。
8.根据权利要求1所述的一种羧酸标记HPLC-UV定量检测鼠李糖脂的方法，其特征在于，步骤4)中，HPLC-UV检测中，紫外检测波长为386nm。
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| US20110306569A1 (en) * | 2010-06-11 | 2011-12-15 | Oregon State University | Rhamnolipid biosurfactant from pseudomonas aeruginosa strain ny3 and methods of use |
-
2022
- 2022-04-28 CN CN202210459624.4A patent/CN115290765B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103038357A (zh) * | 2010-07-28 | 2013-04-10 | 赢创高施米特有限公司 | 用于生产鼠李糖脂的细胞和方法 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
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| Markus Michael Müller等.Pseudomonas aeruginosa PAO1 as a model for rhamnolipid production in bioreactor systems.BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTS AND PROCESS ENGINEERING.2010,167–174. * |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 as a model for rhamnolipid production in bioreactor systems;Markus Michael Müller等;BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTS AND PROCESS ENGINEERING;167–174 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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