CN109307667A - 一种黄曲霉毒素b1的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄曲霉毒素AFB1的快速检测方法，本发明以简单绿色的合成方式制备了DNA‑CDS复合物，基于腐植酸与DNA‑CDS之间的π‑π堆积作用，构建了一种低成本新型黄曲霉毒素荧光检测体系，以DNA‑CDs为荧光探针，直接利用AFB1的荧光，实现了黄曲霉毒素的高效、灵敏检测。这是首次使用方便易得的腐植酸作为荧光猝灭材料进行毒素检测。检测方法操作简便、靶向性强，灵敏度高，成本低。

Description

一种黄曲霉毒素B1的快速检测方法

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种黄曲霉毒素B1的快速检测方法。

背景技术

黄曲霉毒素是一类由黄曲霉和寄生曲霉产生的二氢呋喃香豆素的衍生物，是一种常见的真菌毒素，具有致畸、致突变、致癌作用，被世界卫生组织划定为I类致癌物。黄曲霉毒素主要包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)和黄曲霉毒素G2(AFG2)，其中，AFB1污染广泛、毒性最强，严重危害人们的身体健康和食品安全。因此开发高灵敏的AFB1检测方法已成为国际关注的重点。

目前AFB1的检测方法主要有：色谱法、酶联免疫吸附测定、电感耦合等离子体质谱和毛细管电泳等；其中，色谱法是用于定性/定量检测食品化学污染物黄曲霉毒素AFB1最常规的分析技术，包括高效液相色谱/质谱、液相色谱/质谱、反相高效液相色谱、薄层色谱和气相色谱与质谱联用等，但繁琐的样品预处理程序和昂贵的仪器是色谱法存在的主要问题。酶联免疫吸附测定、电感耦合等离子体质谱和毛细管电泳等方法又存在操作复杂、检测耗时的问题。荧光法用于检测食品化学污染物，具有操作简便，快速自动检测等优点，近年来荧光生物传感器开始应用于黄曲霉毒素检测，该法虽然表现出了较高的灵敏性，但仍然存在猝灭剂剥离困难，单层纳米材料难制备，量子产率低等问题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种黄曲霉毒素B1的快速检测方法，实现了黄曲霉毒素B1的高效、灵敏检测，该检测方法的操作简便、靶向性强、灵敏度高、成本低。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供腐植酸作为荧光淬灭材料在黄曲霉毒素检测中的应用。

腐植酸(Humic acid)是一种既可以通过提纯的手段从自然界中获得，也可以通过堆肥等过程得到的高分子聚合物。本发明研究发现，由于腐植酸存在大量的醌类单元、芳香环和糖基等活性结构，可以强烈地吸附核酸适配体(单链DNA)，尤其醌式结构，能够基于荧光共振能量转移猝灭其吸附的适配体修饰的荧光基团；当适配体与目标物(黄曲霉毒素)结合之后，又会从腐植酸的表面解吸附，体系的荧光即可恢复。由此，腐植酸可以作为荧光淬灭材料用于黄曲霉毒素的检测。

本发明的第二方面，提供一种检测黄曲霉毒素的试剂盒，包括：DNA-CDs复合物和腐植酸；

所述DNA-CDs复合物是由碳点(Cdots，CDs)与氨基功能化的适配体DNA交联得到；

所述适配体DNA是能够与黄曲霉毒素特异结合的单链核酸分子。

黄曲霉毒素主要包括AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，在进行相应种类黄曲霉毒素检测时，从寡聚核苷酸文库中筛选得到可以与目标分子(黄曲霉毒素)特异结合的单链核酸分子，将其作为适配体DNA。

作为一种优选的方案，本发明提供一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，包括：DNA-CDs复合物和腐植酸；

所述DNA-CDs复合物是由CDs与氨基功能化的适配体DNA交联得到；

所述适配体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选，所述CDs由如下方法制备而成：

将柠檬酸和乙二胺溶于去离子水中，搅拌20-40分钟；然后在180-220℃下加热4-6h，冷却后通过透析膜纯化，冷冻干燥，得到干燥的CDs。

作为优选，所述DNA-CDs复合物是由CDs与氨基功能化的适配体DNA通过EDC/NHS交联制备得到。

本发明的第三方面，提供一种黄曲霉毒素B1的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)将DNA-CDs复合物溶于氯化钠溶液中，使DNA-CDs复合物的浓度为0.06-0.08mM，调节pH至5-8，孵育，测定荧光强度；加入腐植酸，使腐植酸的浓度为0.04-0.16mg/ml，反应2-3min，测定荧光强度；

(2)反应后再加入待测样品，测定荧光强度，从而实现对待测样品中黄曲霉毒素B1的检测。

作为优选，步骤(1)中，所述氯化钠溶液中氯化钠的浓度为150mM-250mM。

作为优选，步骤(1)中，采用磷酸盐缓冲液调节pH至5-8。

作为优选，步骤(1)中，孵育时间为30min。

作为优选，步骤(1)和步骤(2)中，在360nm激发光下测定荧光强度。

作为优选，步骤(2)中，所述对待测样品中黄曲霉毒素B1的检测为定量检测或定性检测；

当为定量检测时，按照如下确定所述待测样品中黄曲霉毒素B1的含量：根据所测定荧光强度值计算荧光淬灭率，代入线性方程，从而计算所述待测样品中黄曲霉毒素B1的含量。

进一步的，所述线性方程按照如下获得：

用系列已知浓度的黄曲霉毒素B1标准品代替所述待测样品进行步骤(1)-(2)，测得各浓度的黄曲霉毒素B1标准品对应的荧光强度，计算荧光淬灭率，从而获得荧光淬灭率与黄曲霉毒素B1的浓度之间的线性方程。

当为定性检测时，按照如下确定所述待测样品中是否含有黄曲霉毒素B1：

若加入待测样品后所测定的荧光强度值高于对照值，则所述待测样品中含有或候选含有黄曲霉毒素B1；若加入待测样品后所测定的荧光强度值低于或等于对照值，则所述待测样品中不含黄曲霉毒素B1；

所述对照值是用不含黄曲霉毒素B1的溶液代替所述待测样品进行步骤(1)-(2)所测得的荧光强度值。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次使用方便易得的腐植酸作为荧光猝灭材料进行黄曲霉毒素检测，首次完成了DNA-CDs荧光探针绿色制备。解决了色谱法存在的样品预处理程序繁琐和仪器昂贵，酶联免疫吸附测定、电感耦合等离子体质谱和毛细管电泳等方法存在的操作复杂、检测耗时，荧光生物传感器存在的猝灭剂剥离困难，单层纳米材料难制备，量子产率低等问题，与现有的基于适体的AFB1测定相比，该检测方法简便、快速、灵敏、靶向性强、成本低。

(2)本发明的测定方法可迅速检测到试样中是否含有AFB1，检测限为0.07ng.ml^-1(S/N＝3)，低于欧盟AFB1的最大耐受水平(2ng·g^-1，～5.9)nM)。可以准确用于食品中黄曲霉毒素B1的检测，适于推广应用。

附图说明

图1：本发明的黄曲霉毒素B1检测的原理图。

图2：腐植酸荧光淬灭反应时间。

图3：A：不同浓度AFB1荧光光谱，其中，曲线a-h代表的AFB1浓度分别为0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.3ng/ml、0.4ng/ml、0.5ng/ml、0.6ng/ml、0.7ng/ml和0.8ng/ml；B：荧光变化率与AFB1浓度之间的线性关系。

图4：本发明构建的黄曲霉毒素B1荧光检测体系对AFB1的靶向性。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，现有技术中AFB1的检测方法存在一定的不足，基于此，本发明构建了一种快速检测AFB1的方法。

本发明检测AFB1的原理图见图1。腐植酸通过π-π堆积吸附适配体DNA后，此时碳点和腐植酸之间的距离很近，可以形成荧光共振能量转移，导致DNA-CDs的荧光猝灭。当有AFB1存在时，AFB1对适配体DNA的亲和力大于腐植酸，适配体DNA又从腐植酸表面解吸下来，此时DNA处于团聚包围着AFB1状态，荧光恢复。据此达到快速检测AFB1的目的。

本发明利用碳量子点所具有的光致发光和荧光猝灭双重性能，和核酸适配体连接，制备了能够利用荧光共振能量转移、特异性识别360nm左右的荧光材料。实现黄曲霉毒素B1高特异性、高灵敏度检测。材料的合成通过材料表面本身具有的功能基团的特异性连接更简便更绿色。

本发明首次使用方便易得的腐植酸作为荧光淬灭材料进行黄曲霉毒素的检测，本发明以简单绿色的合成方式制备了DNA-CDs复合物，基于腐植酸与DNA-CDs复合物的π-π堆积作用，以及碳量子点所具有的光致发光和荧光淬灭双重性能，构建了一种低成本新型黄曲霉毒素荧光检测体系，实现了黄曲霉毒素的高效、灵敏检测。

在本发明的检测方法中，荧光淬灭材料的种类及浓度、淬灭时间、DNA--CDs复合物的浓度、体系pH、盐浓度等都会影响荧光淬灭效果以及加入AFB1后的荧光恢复性。其中：

荧光淬灭材料种类的选择非常关键，本发明首先比较了腐植酸与其他常见的荧光猝灭剂(如氧化石墨烯)的淬灭效率，发现腐植酸的猝灭效率是氧化石墨烯的2.85倍；本发明还比较了腐植酸、腐植酸钠、硼氢化钠还原的腐植酸及硼氢化钠还原的腐植酸钠红外光谱图，发现腐植酸的有机质成分主要为芳香烃，脂类。比较腐植酸、腐植酸钠X射线光电能谱图，发现腐植酸钠中碳的含量较多，腐植酸中氧的含量较多。与腐植酸钠相比，腐植酸中醌式碳结构较多，比较腐植酸、腐植酸钠、硼氢化钠还原的腐植酸及硼氢化钠还原的腐植酸钠的荧光淬灭能力及加入AFB1后的恢复能力，发现腐植酸的猝灭能力更强，加AFB1后恢复性更好；而且我国腐植酸资源非常丰富，广泛存在于土壤、湖泊、河流、海洋以及泥炭又称草炭、褐煤、风化煤中，储量大，品质好，成本低。因此，本发明优选采用腐植酸作为猝灭剂。

本发明采用不同浓度的腐植酸对适配体功能化碳点体系进行猝灭作用，研究淬灭时间对淬灭效果的影响，发现任一浓度组荧光猝灭在3min内都可完成，3分钟后不再随着时间延长而变化(如图2所示)，因此，本发明确定最优淬灭反应时间范围为2-3min。

本发明将最终浓度为(0.04mg·mL^-1，0.08mg·mL^-1，0.12mg·mL^-1，0.16mg·mL^-1，0.20mg·mL^-1)的腐植酸30μL分别加入到1000μLDNA-CDs(DNA-CDs最终浓度为(0.04mM，0.05mM，0.06mM和0.08mM)溶液中，使用荧光分光光度计在激发波长360nm处检测荧光猝灭情况，比较荧光淬灭效果，确定淬灭效果最优时腐植酸浓度范围(0.04-0.16mg/ml)及DNA-CDS的浓度范围(0.06-0.08mM)。

本发明在腐植酸浓度(0.04-0.16mg/ml)DNA-CDs浓度(0.06-0.08mM)下改变溶液的pH值(5、6、7、8、9)比较荧光淬灭效果，确定淬灭效果最优时pH值范围(5-8)。

本发明配制10mL浓度分别是50mM、100mM、150mM、200mM、250mM的氯化钠溶液，常温保存。将DNA-CDs在氯化钠溶液中稀释，使其盐浓度分别为0、50、100、150、200和250mM，腐植酸浓度(0.04-0.16mg/ml)、DNA-CDs浓度(0.06-0.08mM)及pH值范围(5-8)，在360nm光的激发下测其荧光光谱。比较不同盐浓度对腐植酸的荧光淬灭影响效果。确定荧光淬灭效果最优时的氯化钠溶液浓度(150mM-250mM)。

本发明首次使用方便易得的腐植酸作为荧光猝灭材料进行黄曲霉毒素B1检测，建立了DNA-CDs复合物-腐植酸的荧光检测体系，可用于对样品中黄曲霉毒素B1的快速、灵敏检测。本发明的检测方法对于检测样本无特殊要求，样本前处理简单，液体样本可直接检测，固体样本配制成溶液后进行检测，操作简单。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：DNA-CDs复合物的制备

(1)氨基功能化适配体DNA的合成：

采用常规方法合成氨基功能化适配体DNA，其序列为：NH₂-AAA AAA AAG TTG GGCACG TGT TGT CTC TCT GTG TCT CGT GCC CTT CGC TAG GCC CAC AC(SEQ ID NO.1)。

(2)碳点(CDs)制备：

将柠檬酸(1.0507g)和乙二胺(335μL)溶于10mL去离子水中搅拌30分钟，之后将其转移到水热反应釜(23mL)中并在200℃下加热5小时，之后自然冷却，得到棕色溶液。将棕色溶液通过透析膜(1000MWCO)纯化24小时，除去溶液中的小分子物质，冷冻干燥机冻干，得到干燥的碳点CDs。

(3)DNA-CDs复合物制备：

将CDs与氨基功能化的DNA通过EDC/NHS交联(EDC/NHS交联为常规的交联操作，可参照现有方法进行)制备得到DNA-CDs复合物。

实施例2：AFB1检测线性方程的绘制

(1)将DNA-CDs复合物(实施例1制备)溶于氯化钠溶液(200mM)中，使DNA-CDs复合物的浓度为0.07mM，磷酸盐缓冲液调节pH至7，孵育30min，360nm光的激发下测定其荧光强度F₁；加入腐植酸，使腐植酸的浓度为0.16mg/ml，反应3min，360nm光的激发下测定其荧光强度F₀；

(2)反应后再分别加入系列浓度梯度(0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.3ng/ml、0.4ng/ml、0.5ng/ml、0.6ng/ml、0.7ng/ml、0.8ng/ml)的AFB1标准品，360nm光的激发下测定其荧光强度F₂；按下式计算AFB1荧光淬灭率I％：

I％＝(F₂–F₀)/(F₁-F₀)，其中F₀表示加入腐植酸时在360nm激发光下的荧光强度。F₁表示未加入腐植酸时在360nm激发光下的荧光强度，F₂表示加入不同浓度AFB1标准品在360nm激发光下的荧光强度。

绘制荧光变化率与黄曲霉毒素B1浓度线性关系图，并获得线性方程，I％＝50.738c+3.9679，(R2＝0.9906)。

不同浓度AFB1荧光光谱见图3A；荧光变化率与AFB1浓度之间的线性关系见图3B。

实施例3：样品中黄曲霉毒素B1的检测

(1)将DNA-CDs复合物(实施例1制备)溶于氯化钠溶液(200mM)中，使DNA-CDs复合物的浓度为0.07mM，磷酸盐缓冲液调节pH至7，孵育30分钟，360nm光的激发下测定其荧光强度F₁；加入腐植酸，使腐植酸的浓度为0.16mg/ml，反应3min，360nm光的激发下测定其荧光强度F₀；

(2)反应后加入待测花生油样品，360nm光的激发下测定其荧光强度F₂；按下式计算AFB1荧光淬灭率I％：

I％＝(F₂–F₀)/(F₁-F₀)，其中F₀表示加入腐植酸时在360nm激发光下的荧光强度。F₁表示未加入腐植酸时在360nm激发光下的荧光强度，F₂表示加入花生油样品后，在360nm激发光下的荧光强度。

根据线性方程I％＝50.738c+3.9679，计算得到所测花生油中的AFB1的浓度c为3μg/kg。

实施例4：AFB1检测方法靶向性考察

为了评估本发明AFB1检测方法的靶向性，本发明研究了黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)以及黄曲霉毒素G2(AFG2)对AFB1检测的影响。具体做法是在腐植酸-适配体功能化碳点体系中分别加入50μM AFB1和50μM其他干扰物。结果见图4。结果表明AFB2、AFG1、AFG2的添加不会显著增加荧光强度，但AFB1可以导致荧光强度的显著增强，与单独添加AFB1定量测量的结果完全一致。即当黄曲霉毒素B1与其他黄曲霉毒素共存时，腐植酸-适配体功能化碳点体系依然可以实现对黄曲霉毒素B1的测定精准检测。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种黄曲霉毒素B1的快速检测方法

<130> 2018

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaaaaaagt tgggcacgtg ttgtctctct gtgtctcgtg cccttcgcta ggcccacac 59

Claims (10)

1.腐植酸作为荧光淬灭材料在黄曲霉毒素检测中的应用。

2.一种检测黄曲霉毒素的试剂盒，其特征在于，包括：DNA-CDs复合物和腐植酸；

所述DNA-CDs复合物是由CDs与氨基功能化的适配体DNA交联得到；

所述适配体DNA是能够与黄曲霉毒素特异结合的单链核酸分子。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所检测的黄曲霉毒素为AFB1；所述适配体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述CDs由如下方法制备而成：

将柠檬酸和乙二胺溶于去离子水中，搅拌20-40分钟；然后在180-220℃下加热4-6h，冷却后通过透析膜纯化，冷冻干燥，得到干燥的CDs。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA-CDs复合物是由CDs与氨基功能化的适配体DNA通过EDC/NHS交联制备得到。

6.一种黄曲霉毒素B1的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将DNA-CDs复合物溶于氯化钠溶液中，使DNA-CDs复合物的浓度为0.06-0.08mM，调节pH至5-8，孵育，测定荧光强度；加入腐植酸，使腐植酸的浓度为0.04-0.16mg/ml，反应2-3min，测定荧光强度；

(2)反应后再加入待测样品，测定荧光强度，从而实现对待测样品中黄曲霉毒素B1的检测。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氯化钠溶液中氯化钠的浓度为150mM-250mM。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，在360nm激发光下测定荧光强度。

9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述对待测样品中黄曲霉毒素B1的检测为定量检测或定性检测；

当为定量检测时，按照如下确定所述待测样品中黄曲霉毒素B1的含量：根据所测定荧光强度值计算荧光淬灭率，代入线性方程，从而计算所述待测样品中黄曲霉毒素B1的含量；

当为定性检测时，按照如下确定所述待测样品中是否含有黄曲霉毒素B1：

若加入待测样品后所测定的荧光强度值高于对照值，则所述待测样品中含有或候选含有黄曲霉毒素B1；若加入待测样品后所测定的荧光强度值低于或等于对照值，则所述待测样品中不含黄曲霉毒素B1；

所述对照值是用不含黄曲霉毒素B1的溶液代替所述待测样品进行步骤(1)-(2)所测得的荧光强度值。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述线性方程按照如下步骤获得：

用系列已知浓度的黄曲霉毒素B1标准品代替所述待测样品进行步骤(1)-(2)，测得各浓度的黄曲霉毒素B1标准品对应的荧光强度，计算荧光淬灭率，从而获得荧光淬灭率与黄曲霉毒素B1的浓度之间的线性方程。