CN111321205A

CN111321205A - 一种miRNA的检测方法

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Publication number: CN111321205A
Application number: CN202010164650.5A
Authority: CN
Inventors: 高婷婷; 裴和中; 张国亮; 杨秀华
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2020-03-11
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2020-06-23

Abstract

本发明公开一种miRNA的检测方法，属于化学和生物检测技术领域。本发明所述方法为：肽核酸先与荧光染料标记的DNA（FAM‑DNA）杂交形成双链，当目标miRNA出现时，由于链置换反应将FAM‑DNA置换下来，与PNA形成双链结构，此过程荧光染料的荧光强度会发生变化，从而检测出miRNA的含量。本发明所述方法具有快速、经济、简单方便的特点，不需借助大型仪器设备，也不需要精确的温度控制和严格的洗涤步骤。该方法对目标miRNA的检测限较低，可应用于肿瘤细胞裂解液中miRNA的检测与肿瘤细胞总RNA提取后含量检测，并且该检测体系具有良好的特异性。

Description

一种miRNA的检测方法

技术领域

本发明涉及一种miRNA的检测方法，属于化学和生物检测技术领域。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在真核基因表达调控中有着广泛的作用，miRNA不仅在基因位置上保守，序列上也呈现出高度的同源性，其调节着人类三分之一的基因，miRNA参与生命过程中一系列的重要进程，它是肿瘤细胞主动分泌的，随着肿瘤细胞的生成、凋零，miRNA的表达量一直在变化，所以每种miRNA的表达量代表了在某一刻人类体内健康或者疾病的信息，这使miRNA成为肿瘤标志物之一。因此对miRNA的检测不仅使我们了解其在生命过程中的调节作用还可以实现对疾病的早期诊断。

miRNA传统的检测方法主要有逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、miRNA测序法、原位杂交法等，以上方法存在检测耗时长，需要昂贵的检测设备以及专业的检测人员等缺点，因此开发快速，灵敏度高，特异性强，操作简单方便的miRNA检测方法具有重要意义，近年来，开发了许多新的miRNA分析方法，这些方法引入了分子信标，生物发光，酶分析，桥联链式反应但依然存在特异性较低，检测成本高、需要复杂的固定/分离步骤，限制了其应用。

肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，通过计算机设计构建并最终人工合成的反义试剂，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA/RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高。miRNA在细胞内低表达，所以对其检测的灵敏度具有更高的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种miRNA的检测方法，本发明所述方法是基于目标miRNA引发链置换反应，阻断CQDs-PNA/FAM-DNA之间的荧光能量共振转移，实现miRNA含量的检测，具体包括以下步骤：

（1）使肽核酸与碳量子点通过酰胺化学键共价偶联，得到CQDs-PNA；采用FAM标记DNA，得到FAM-DNA。

（2）将CQDs-PNA和FAM-DNA加入到盐溶液体系中进行杂交，杂交得到混合溶液I，I混合溶液中CQDs-PNA生物探针浓度为3~4μg/mL，FAM-DNA的浓度为180~200nmol/L。

（3）向所述混合溶液I中加入目标miRNA，室温孵育20~30min，得到混合溶液II。

（4）采用已知浓度的待检测目标miRNA为样品，测定检测体系的荧光强度，建立标准曲线，所述标准曲线为y=－0.062x+0.95。

（5）测量混合溶液II的荧光强度，并与建立的标准曲线进行比较，测定待检测目标miRNA的浓度，当所测浓度为0时，代表不存在待检测目标miRNA。

优选的，本发明所述盐溶液体系为100mM Tris-HCl溶液体系，所述盐溶液体系的pH为6.9~7.4。

优选的，本发明所述碳量子点尺寸为2~4 nm的球形颗粒在254 nm 紫外光照射下发蓝光。

本发明的原理：根据需要检测的miRNA，首先合成PNA探针与miR-21链互补配对，其末端具有氨基官能团，一方面用以共价偶联表面羧基修饰的CQDs，另一方面识别目标miRNA；当不存在目标miRNA时，CQDs-PNA/FAM-DNA形成双链体，CQDs与FAM发生荧光能量共振转移，FAM的荧光强度显著增强；当存在目标miRNA时，将与CQDs-PNA的粘性末端结合，通过链置换反应，将FAM-DNA置换下来，由于CQDs-PNA与FAM-DNA之间距离的增加，荧光能量共振转移显著减弱；因此，通过评价荧光发射强度的变化，就可以定量地确定目标miRNA的存在。

本发明所述方法可以采用透射电子显微镜（TEM）、UV-vis吸收光谱和荧光光谱对CQDs进行表征。

本发明所述碳量子点为市售碳量子点，或者实验室按常规方法制备得到。

本发明的有益效果：

（1）本发明设计并合成PNA探针与miR-21链互补配对，相比于DNA探针具有很高的杂交稳定性与优良的特异序列识别能力，更加适用于具有的低表达量、高同源性的miRNA检测分析，此外，PNA与DNA/RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度的影响，不被核酸酶和蛋白酶水解等优点；该方法具有快速、经济、简单方便的特点，不需借助大型仪器设备，也不需要精确的温度控制和严格的洗涤步骤。

（2）本发明通过监测体系荧光强度的变化来定量检测目标miRNA，无需复杂的仪器设备。

（3）本发明的方法对目标miRNA的检测限较低，可应用于细胞裂解液中miRNA的检测，肿瘤细胞总RNA提取后含量的测定，并且具有良好的特异性。

附图说明

图1是miRNA检测方法的原理图。

图2为CQDs的TEM图像。

图3为CQDs的荧光光谱和吸收光谱。

图4为CQDs、PNA、CQDs-PNA、CQDs/PNA的吸收光谱。

图5为不同浓度目标miRNA存在时的荧光猝灭效率变化图。

图6为相同浓度下不同类型miRNA的荧光猝灭效率图。

图7为不同细胞数目Hela细胞总RNA提取后的荧光猝灭效率图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

如无特别说明，本发明实施例中的原料均通过商业途径购买，其中DNA序列购自杰李生物（上海）股份有限公司。

本发明实施例中使用的所有的玻璃仪器都用碱缸浸泡24 h，并用双蒸水清洗，晾干备用；实验中使用的水均为18.2 MΩ的Milli-Q超纯水。

实施例1

本发明实施例所述待检测目标miRNA为miR-21，与之杂交的PNA链的长度为22个碱基；所述PNA链的碱基序列为：TCAACATCAGTCTGATAAGCTA。

一种miRNA的检测方法，具体包括以下步骤：

（1）碳量子点（CQDs）合成：称取2.4g柠檬酸(CA)，量取750μL乙二胺(EDA)，将两者混入盛有30mL的超纯水的烧杯中，溶解均匀后加入到50mL反应釜的衬中，在160℃保温3h，自然冷却至室温，倒出深棕色溶液离心(5000rpm，10min)取上清液并透析24h，将透析袋内的液体冷冻干燥得固体粉末。

（2）肽核酸（PNA）的合成：肽核酸用固相肽合成法进行合成；在多肽合成管中裂解得到PNA粗品，然后用无水乙醚清洗三次，分别离心弃上清，用氮气将样品吹干后用超纯水溶解；样品在HPLC上纯化，流动相分别为90%的乙腈水溶液和0.05%三氟乙酸水溶液，取目标峰进行质谱鉴定，多次纯化收集目标峰产物并将产物冻干后用超纯水溶解，合成的PNA纯度大于99%，PNA的浓度通过测定260nm处的吸光度，根据最近临值计算消光系数；实验过程中所有的基因序列列于表1。

表1

如图2所示，碳点尺寸约为3.2nm呈球形形态并表现出良好的单分散性；碳点的UV-Vis，FL的激发和发射光谱如图3所示，位于340nm附近的位置存在一个明显的吸收峰是由n-π*跃迁造成的，与CQDs的激发光谱相一致。

PNA探针通过固相肽方法手动合成，所有PNA寡聚体通过HPLC进行纯化，通过PNA探针的化学结构式与分子量测定，测定的结果与所设计的PNA探针分子量相一致。

（3）碳点和肽核酸之间的共价偶联：

根据常用的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)方法，通过碳量子点（CQDs）的羧基与肽核酸（PNA）氨基之间的酰胺缩合进行CQDs与PNA的偶联；称取CQDs(10mg)、EDC(20mg)、NHS(10mg)混合在 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）缓冲液(0.1M，Ph6.0)中搅拌以活化碳量子点CQDs的羧基；在室温反应30min后，将溶液的PH调至7.4；然后将肽核酸PNA(50μM/200μL)加入上述溶液中，并在室温下温浴3小时，用超滤管(10k)于12000rpm下离心10min；收集上部滤液即CQDs-PNA生物探针，并用去离子水作为储备溶液稀释，最后将获得的产物4℃下保存。

CQDs表面丰富的官能团为其表面功能化提供了必要条件，富含大量羧基官能团CQDs与PNA末端的氨基进行缩合反应；为了验证二者成功共价偶联，分别测定了CQDs，PNA以及CQDs-PNA的紫外吸收光谱，如图4所示，PNA标记后的CQDs在260nm处出现了典型的PNA吸收峰。

实施例3

（1）目标miRNA的检测：

将10μL/40ug的CQDs-PNA探针和40μL/500nmol/L的 FAM-DNA加入到0.6mL的EP管中室温孵育10min，先形成CQDs-PNA/FAM-DNA双链体，然后加入10μL不同浓度的miR-21（0nmol/L、 0.1nmol/L、1nmol/L、 1.5nmol/L、 2nmol/L、 2.5 nmol/L）溶液室温孵育20min以保证链置换反应充分进行，然后用缓冲溶液加至100μL；使用FL光谱仪记录在310nm激发下样品FL的发射光谱；为了评估生物探针的特异性，分别选用miR-155，miR-141，Let-7a 不同的miRNA序列添加到生物探针的溶液中测定荧光发射强度。

（2）聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳：

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳与Tm值测定的方法验证链置换反应的发生，在缓冲液中分别配制10μL/5μM的FAM-DNA(泳道1)、miR-21(泳道2)、FAM-DNA/PNA双链体(泳道3)、miRNA-21/PNA双链体(泳道4)、FAM-DNA/PNA+miR-21(泳道5)，上样前加入5μL loading buffer，混匀体系；凝胶电泳使用10%聚丙酰胺溶液，另外加入60μL 10%过硫酸铵(APS)、6μL四甲基乙二胺(TEMED)作为催化剂和加速剂；电泳40min后使用荧光核酸凝胶染色试剂GelRed染色15min。通过凝胶成像系统对凝胶进行成像，以便进一步分析。结果显示泳道5出现了与泳道1相同的FAM-DNA条带，表明miR-21通过粘性末端将FAM-DNA/CQDs-PNA双链中的短链的FAM-DNA置换下来。除此之外，通过Tm值得测定发现FAM-DNA/CQDs-PNA/miR-21体系的Tm值与CQDs-PNA/miR-21相差无几而远大于FAM-DNA/CQDs-PNA双链结构，经过以上验证说明miR-21成功将FAM-DNA/CQDs-PNA双链体中的短链FAM-DNA置换下来，形成相对稳定的miR-21/CQDs-PNA双链体。

（3）目标miRNA的检测灵敏度：

考察不同浓度miR-21对体系荧光强度的影响，结果表明miR-21浓度在0.1nmol/L-2.5nmol/L范围内，与体系荧光猝灭程度呈良好的线性关系；如图5所示，在miR-21存在下，FAM的荧光强度逐渐降低并获得了标准拟合曲线，y=－0.062x+0.95，R²=0.99，清晰的揭示了F/F₀比值之间的线性关系（F和F₀代表存在和不存在miR-21时体系的荧光强度）根据标准偏差3σ/斜率（其中σ是标准偏差）计算其检测限为0.032nmol/L；选用miR-141、miR155、let-7a三种miRNA验证传感体系的特异性，实验结果如图6所示，表明该方法具有良好的特异性。

实施例4

（1）制备HeLa细胞裂解液：将装有人宫颈癌细胞Hela从-80℃冰箱中取出，快速于37℃水浴锅中解冻，转移至10mL离心管中，于1500rpm离心5min弃上清，然后加入含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI 1640培养基中，轻轻吹打细胞使细胞均匀分散再转移至培养瓶中，在含5%CO₂的37℃的培养箱中孵育，待细胞覆盖培养瓶底部80%-90%后使用。

（2）HeLa细胞总RNA提取：去除培养瓶中的培养基，加PBS洗三次，用胰蛋白酶消化培养的Hela细胞，收集消化后的细胞离心处理，再用PBS冲洗三次，离心得到的细胞浓度约为1*10⁷/ml，重悬于RIPA细胞裂解液中，在冰上孵育40min，之后再4℃下12000rpm离心15min，收集上清液；一部分储存于-20℃备用，另一部分用作RNA提取，使用OMEGA RNA提取试剂盒根据说明书操作步骤进行总RNA提取，并将产物于-80℃冰箱中保存。

（3）生物样品检测：为了验证该荧光传感器应用于生物样品的可行性，对Hela细胞裂解液样本中的miR-21进行分析；通过向10%的Hela细胞裂解液样本加入不同浓度的miR-21进行测试（1 nmol/L、1.5 nmol/L、2 nmol/L、2.5 nmol/L、3 nmol/L），随着miRNA浓度的增加，荧光强度逐渐降低，在细胞裂解液样本中该生物传感平台也同样具有良好的线性关系，计算出的检测限为0.35nmol/L，表明该生物传感器在真实生物样本中具有检测miRNA的潜力；此外，为了验证靶标的准确性，通过将已知量的目标miRNA-21掺入10%的细胞裂解物中进行回收率测定，表2列出的结果表明回收普率在95.8-103.8%的范围内，相对标准偏差小于9.7%，表明所提出的生物传感器用于测定生物样本中miRNA-21的可靠性。

表2

除此之外，对不同数目的Hela细胞中miR-21的含量进行检测。如图7所示（a,b,c,d分别对应的细胞数为10³，10⁴，10⁵，10⁶）随着Hela细胞数目的增加，荧光强度随之降低；当Hela细胞数目为10⁶时，导致荧光强度显著降低，说明该方法可以用于复杂样品中miRNA的定量分析。

Claims

1.一种miRNA的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）使肽核酸与碳量子点通过酰胺化学键共价偶联，得到CQDs-PNA；采用FAM标记DNA，得到FAM-DNA；

（2）将CQDs-PNA和FAM-DNA加入到盐溶液体系中进行杂交，杂交得到混合溶液I，I混合溶液中CQDs-PNA生物探针浓度为3~4μg/mL，FAM-DNA的浓度为180~200nmol/L；

（3）向所述混合溶液I中加入目标miRNA，室温孵育20~30min，得到混合溶液II；

（4）采用已知浓度的待检测目标miRNA为样品，测定检测体系的荧光强度，建立标准曲线，所述标准曲线为y=－0.062x+0.95；

2.根据权利要求1所述miRNA的检测方法，其特征在于：所述盐溶液体系为100mM Tris-HCl溶液体系，所述盐溶液体系的pH为6.9~7.4。

3.根据权利根据权利要求1所述miRNA的检测方法，其特征在于：所述碳量子点尺寸为2~4 nm的球形颗粒。