CN110564731B - 用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体及检测试剂盒，该核酸适配体包括核酸适配体H1，核酸适配体H1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的DNA片段。检测试剂盒为包括用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体的试剂盒。本发明的核酸适配体和试剂盒可灵敏、简便、高效、特异性地识别和检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM，核酸适配体具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点。该核酸适配体还为耐药细胞耐药相关物质的发现、癌症的临床诊断与分型、耐药机制研究以及逆转耐药性提供了全新的思路和方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种核酸适配体及检测试剂盒，尤其涉及一种用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体及检测试剂盒。
背景技术
核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)筛选得到的，能特异结合靶物质的单链寡聚核苷酸(单链DNA或RNA)。核酸适体具有与抗体相媲美的亲和力与特异性，而且与抗体相比具有更多的优势，如分子量小，无免疫原性；容易化学合成，成本低；易修饰，且可以对不同部位进行修饰和取代；性质稳定，易于保存等优点。核酸适体的靶分子更为广泛，包括金属离子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质，并从单一靶标扩展至完整的病毒颗粒及细胞等复合物靶标。因此，核酸适体具有广泛的应用前景。
临床上化疗是中晚期肝癌综合性治疗的主要手段，但是肝癌细胞的耐药性严重阻碍了化疗的效果。及早的发现肝癌耐药细胞，研究引起肝癌耐药的相关分子及作用机制并逆转耐药，可以有效的降低耐药性，提高患者的治愈率。因此，开发一种能更加灵敏、简便、高效和特异性识别耐药肝癌细胞的核酸适配体，为耐药细胞耐药相关物质的发现、癌症的临床诊断与分型、耐药机制研究以及逆转耐药性提供一个全新的思路和方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体及检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。
一种用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体，所述核酸适配体包括核酸适配体H1，所述核酸适配体H1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的DNA片段。
核酸适配体H1的核苷酸序列为：
5’-AGCAGTCCAAGTCCCAGTCAGTTTACCGTGTAGGCATCCCAGTGTCCGCGAAACCT GTACCTCAGCATCTTGGACTGGGACTGACTGACT-3’
上述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体中，优选的，所述核酸适配体还包括在所述核酸适配体H1的核苷酸序列上结合生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记的核酸适配体(甚至连接上放射性和治疗性物质等)。
上述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体中，优选的，所述荧光物质为FAM荧光基团或Cy5荧光基团；所述纳米发光材料为量子点或上转换纳米颗粒；所述酶标记为辣根过氧化物酶或蔗糖酶。
上述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体中，优选的，所述核酸适配体还包括在所述核酸适配体H1保持整体结构不变的前提下，核酸适配体H1的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化的核酸适配体。
上述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体中，优选的，所述氨基化为在所述核酸适配体H1核苷酸序列的5’端标记氨基基团-NH2。
上述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体中，优选的，所述巯基化为在所述核酸适配体H1核苷酸序列的5’端标记巯基基团-SH。
上述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体中，优选的，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种：
(1)与所述核酸适配体H1的核苷酸序列的同源性在60％以上且具有检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的功能(例如可将上述核酸适配体序列部分删除或增加互补的核苷酸)；
(2)与所述核酸适配体H1的核苷酸序列进行杂交的序列；
(3)所述核酸适配体H1的核苷酸序列转录的RNA序列。
上述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体中，优选的，还包括所述核酸适配体H1的衍生物，所述衍生物为由所述核酸适配体H1的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。
上述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体中，优选的，还包括所述核酸适配体H1的衍生物，所述衍生物为由所述核酸适配体H1改造而成的相应肽核酸。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的检测试剂盒，该检测试剂盒包括上述的核酸适配体。即，上述的核酸适配体在识别人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM或者制备检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的试剂盒中的应用。
本发明提供了一种核酸适配体，其序列为H1所示的DNA片段，本发明的核酸适配体还可以是各种同源性较高的类似序列或由本发明序列得到的衍生物。该核酸适配体的筛选方法是先合成随机单链DNA文库和引物，再Cell-SELEX筛选，PCR扩增文库，制备DNA单链文库，最后经重复筛选、阴性筛选和多轮筛选得到核酸适配体。本发明的核酸适配体及其衍生物可在识别人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM或者制备检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的试剂盒中应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体，该核酸适配体与蛋白抗体相比具有更好的亲和力与特异性，免疫原性小，能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且化学性质稳定，易于保存，便于标记。该核酸适配体能特异性识别和标记人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM，期望为耐药细胞耐药相关物质的发现、癌症的临床诊断与分型、耐药机制研究以及逆转耐药性提供一个全新的思路和方法。
(2)本发明提供了一种含有用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体的检测试剂盒，由于核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好，采用本发明的核酸适配体进行人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的检测时，操作更为简单、迅速。本发明的可识别人临床耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体结合能力强，解离常数均在纳摩尔范围以内。利用本发明的核酸适配体对其结合的靶分子进行钓取，可得到其肿瘤耐药标志物，这对于耐药细胞耐药相关物质的发现、癌症的临床诊断与分型、耐药机制研究以及逆转耐药性具有重要意义，在耐药肝癌的诊断方面有良好的应用前景。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中利用Mfold服务对核酸适配体H1序列进行二级结构模拟所得的结构示意图。
图2为本发明实施例1中核酸适配体Cy5-H1和Cy5-Random对人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM结合效果的流式表征图。
图3为本发明实施例1中流式细胞术测定核酸适配体Cy5-H1与人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的解离常数绘制曲线。
图4为本发明实施例1中的核酸适配体Cy5-H1对人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM结合情况的激光共聚焦表征图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1
一种用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体，该核酸适配体为核酸适配体H1，核酸适配体H1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的DNA片段，具体如下：
5’-AGCAGTCCAAGTCCCAGTCAGTTTACCGTGTAGGCATCCCAGTGTCCGCGAAACCT GTACCTCAGCATCTTGGACTGGGACTGACTGACT-3’
上述核酸适配体H1主要采用以下筛选方法得到：
(1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物。
随机文库Lib：
5’-AGCAGTCCAAGTCCCAGTCA(RY)3N3(RY)4N4(RY)4N3(RY)4N4(RY)3TGGACTGGGACTGACTGACT-3’(其中R为碱基A和G中的一种，Y为碱基C和T中的一种，N为四种碱基中的一种)；
5’引物：5’-Cy5-AGCAGTCCAAGTCCCAGTCA-3’；
3’引物：5’-Biotin-TGGACTGGGACTGACTGACT-3’。
(2)通过SELEX技术筛选人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体。
2.1.细胞预处理：选取生长状态良好，在细胞瓶底部覆盖率达90％的HepG2/ADM细胞，去除培养基后用5mL洗涤缓冲液(1.2370g葡萄糖，0.2540g MgCl2·6H2O，溶解于250mLPBS缓冲液中)洗涤3次，取1mL含有5μL、50μM无关序列的结合缓冲液(1.2370g葡萄糖，0.2540g MgCl2·6H2O，25mg酵母tRNA，0.2500g BSA，溶解于250mL PBS缓冲液中)与靶细胞HepG2/ADM预孵育5min，去除孵育后的溶液，并用3mL洗涤缓冲液洗涤三次。
2.2.文库预处理：将随机文库Lib于12000rmp下离心5min，然后加入100μL超纯水，于95℃加热10min破坏随机文库Lib的二级结构后，转移至冰上，然后加入预冷的结合缓冲液使总体积为100μL得到预处理的文库溶液。
2.3.正筛选：将HepG2/ADM细胞培养液倾倒干净，用预冷的洗涤缓冲液洗涤三次，每次3mL，加入准备好的单链DNA文库溶液，置于4℃、80r/min的恒温震荡摇床内孵育，每隔10min拿出手动摇晃一次，使之充分孵育；60min后，弃上清，加入5mL洗涤缓冲液洗涤3次，每次30s，使非特异性结合和结合能力较弱的ssDNA洗脱下来。
2.4.反筛选：从第五轮筛选开始，增加反筛选，将上一轮得到的DNA文库先与反筛细胞HepG2细胞孵育30min，然后收集未结合的DNA文库即上清液加入靶细胞HepG2/ADM中进行正筛。
2.5.刮离细胞：准备好实验所需的干净的刮刀，并用酒精浸泡后放在紫外灯下照射。加入200μL无菌水，用刮刀轻轻刮离细胞，吸取混合液于EP管中，置于冰上。随后再重复操作两次，分别加入200μL和100μL无菌水，刮离细胞和冲洗瓶子及刮刀，液体均转至上述EP管中，最终液体体积约为500-600μl。
2.6.孵育后的文库收集：将EP管置于95℃水浴(内置30rm转子)加热10min后，迅速移至冰上冷却5min，使细胞破裂，蛋白质变性，释放出结合在细胞上的ssDNA；之后将细胞裂解液4℃，10000rmp离心5min，收集上清，即含有目的序列。
2.7.PCR扩增：取100μL 2.5中所收集的文库进行PCR扩增得到扩增产物。扩增条件为：94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，经过合适的循环轮数(根据琼脂糖电泳优化可得)，72℃3min。
2.8.制备单链DNA：将扩增产物与琼脂糖微球在室温下孵育30min，借助生物素与链霉亲和素之间的特异性结合能力将标记有生物素的扩增产物双链DNA被捕获到链霉亲和素修饰的琼脂糖微球表面，得到修饰有扩增产物的琼脂糖微球。随后将修饰有扩增产物的琼脂糖微球于5000rpm离心弃上清，用PBS溶液离心洗涤两次。于洗涤后的沉淀中加入500μL浓度为200mM的NaOH溶液，室温下反应15min。将修饰有扩增产物的琼脂糖微球于5000rpm离心5min，收集上清至EP管中。脱盐柱用10mL ddH2O洗涤后，加入EP管中的上清液，待上清液自然滴完后，再往脱盐柱中加入1mL ddH2O，收集此时滴下的液体，此中即含有ssDNA。使用紫外分光光度计测量ssDNA水溶液的紫外吸收曲线，根据其在260nm处的吸收值来定量ssDNA。然后将单链DNA文库置于冷冻浓缩离心干燥机中，温度为70℃，干燥2.5小时。最后将ssDNA粉末置于-20℃冰箱冷冻保存，用作下一轮筛选文库。
2.9.循环筛选：重复上述筛选步骤(从第五轮筛选开始之后的每一轮筛选都是先反筛选再正筛选)，进行多轮循环筛选，直到所得DNA文库与HepG2/ADM细胞的结合力达到饱和值，即可终止筛选。不同筛选轮数中投入不用的筛选压力，其目的是增加筛选序列的特异性和亲和力。将所得文库经测序分析，最终得到可用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体H1，核酸适配体H1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的DNA片段。在核酸适配体H1的5’端标记Cy5，记为核酸适配体Cy5-H1，其DNA片段为：
5’-Cy5-AGCAGTCCAAGTCCCAGTCAGTTTACCGTGTAGGCATCCCAGTGTCCGCGAAAC CT GTACCTCAGCATCTTGGACTGGGACTGACTGACT-3’。
本发明中，核酸适配体H1的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记，均能达到与实施例1相同或相似的技术效果。
对比例1
阴性探针，其核苷酸序列为：
Cy5-Random：
5’-Cy5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
N代表A、T、G、C中任一碱基。
考察1：用Mfold服务对本实施例核酸适配体序列进行二级结构模拟。
用Mfold服务对本实施例核酸适配体序列进行二级结构模拟后的结构示意图如图1所示，H1序列结构主要包括五个颈部、两个大环及三个小环区域。
考察2：流式细胞术检测核酸适配体Cy5-H1和Cy5-Random对耐药肝癌细胞HepG2/ADM的结合效果。
将合成好的Cy5-H1和随机序列Cy5-Random，12000rmp的转速下离心5min，并加入无菌水配成浓度为10μM的溶液。取2μL、10μM DNA序列于98μL的结合缓冲液中，并加入配制好的HepG2/ADM细胞悬液(100μL、1×107个/mL)使其终体积为200μL，置于冰上孵育30min。孵育完成后，将细胞悬液在4℃，2000rmp的转速下离心5min，并弃去上清，用500μL洗涤缓冲液洗涤细胞后再离心弃上清，最后加入200μL的结合缓冲液，轻轻的吹打细胞使之重悬，并用流式细胞仪检测分析序列与细胞的结合情况。
从图2的检测结果表明：核酸适配体Cy5-H1能与耐药肝癌细胞HepG2/ADM结合，其结合强度明显高于Cy5-Random与耐药肝癌细胞HepG2/ADM的结合强度。
考察3：流式细胞术测定核酸适配体Cy5-H1与耐药肝癌细胞HepG2/ADM的解离常数。
平行配置不同浓度(0-500nM)的核酸适配体Cy5-H1的探针溶液。将生长状态良好的HepG2/ADM细胞消化下来制成细胞悬浮液，分别取不同浓度的ssDNA溶液与HepG2/ADM细胞在室温下孵育30min，之后用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。加200μL结合缓冲液重悬后用流式细胞仪收集信号。实验中每种浓度均设置了三个平行样，收集FL6通道的信号。利用sigma plot软件，把核酸适配体浓度和净荧光强度的数值代入单点吸附模型由Y＝Bmax×X/(Kd+X)即可模拟核酸适配体的解离常数Kd值。解离常数的曲线图如图3所示，y＝11.9759x/(2.9849+x)，由此可得到解离平衡常数Kd如下表1所示。
表1解离常数结果
| 序列名 | Kd(nM) |
| H1 | 2.9849±1.4061 |
图3及表1的检测结果表明：本实施例的核酸适配体H1对HepG2/ADM细胞的结合能力很强，解离常数在纳摩尔级别。
考察4：激光共聚焦扫描显微镜检测核酸适配体Cy5-H1对人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的结合情况和特异性。
选取处于指数生长期的HepG2/ADM和HepG2细胞，用胰酶消化后，吸入细胞悬液培养在激光共聚焦皿内，并设置重复样，于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养24h。然后向皿内加入2mL PBS洗涤细胞并弃上清，重复洗涤3次，随后加入400μL、500nM的DNA链，冰上孵育30min，孵育过程中注意避光，孵育结束后再用2mL PBS洗涤细胞3次。最后加入400μL结合缓冲液于激光共聚焦皿中，选用633nM激光器发射激发光，收集660nM以上的Cy5荧光，用于激光共聚焦显微镜成像。检测结果如图4所示(图中的两组图片，一组是Cy5荧光通道的成像，一组是Cy5荧光通道与明场的叠加成像，是同一个照片不同通道的信息)。同时按照同样的方法将核酸适配体Cy5-H1于正常肝癌细胞HepG2进行孵育，作为对照。
从图4的检测结果表明：本实施例的核酸适配体Cy5-H1能识别HepG2/ADM细胞，而且不识别正常肝癌细胞HepG2。
本实施例的核酸适配体H1可应用于制备检测试剂盒，得到含有核酸适配体H1的检测试剂盒。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体及检测试剂盒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(90)
<223> 根据实验要求而设计，以作为用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体H1
<400> 1
agcagtccaa gtcccagtca gtttaccgtg taggcatccc agtgtccgcg aaacctgtac 60
ctcagcatct tggactggga ctgactgact 90
Claims (9)
1. 一种用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体包括核酸适配体H1，所述核酸适配体H1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体还包括在所述核酸适配体H1的核苷酸序列上结合生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记的核酸适配体。
3.根据权利要求2所述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体，其特征在于，所述荧光物质为FAM荧光基团或Cy5荧光基团；所述纳米发光材料为量子点或上转换纳米颗粒；所述酶标记为辣根过氧化物酶或蔗糖酶。
4.根据权利要求1所述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体还包括在所述核酸适配体H1保持整体结构不变的前提下，核酸适配体H1的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化的核酸适配体。
5.根据权利要求4所述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体，其特征在于，所述氨基化为在所述核酸适配体H1核苷酸序列的5’端标记氨基基团-NH2。
6.根据权利要求4所述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体，其特征在于，所述巯基化为在所述核酸适配体H1核苷酸序列的5’端标记巯基基团-SH。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体，其特征在于，还包括所述核酸适配体H1的衍生物，所述衍生物为由所述核酸适配体H1的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。
8.根据权利要求1～6中任一项所述的用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体，其特征在于，还包括所述核酸适配体H1的衍生物，所述衍生物为由所述核酸适配体H1改造而成的相应肽核酸。
9.一种用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～8中任一项所述的核酸适配体。
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