CN110672569A

CN110672569A - 一种dna或rna检测体系、检测方法和它们的应用

Info

Publication number: CN110672569A
Application number: CN201910942179.5A
Authority: CN
Inventors: 高婷婷; 赵超; 邢淑; 张晓康
Original assignee: Ningbo Institute of Material Technology and Engineering of CAS; Cixi Institute of Biomedical Engineering CIBE of CAS
Current assignee: Ningbo Institute of Material Technology and Engineering of CAS; Cixi Institute of Biomedical Engineering CIBE of CAS
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2020-01-10

Abstract

本申请公开了一种DNA或RNA检测体系，所述DNA或RNA检测体系为盐溶液体系，包括肽核酸、金纳米颗粒和碳量子点，所述肽核酸能与目标DNA或RNA杂交形成双链。本申请还公开了一种DNA或RNA检测方法以及DNA或RNA检测体系、检测方法的应用。该方法具有快速、经济、简单方便的特点，不需借助大型仪器设备，也不需要精确的温度控制和严格的洗涤步骤。该方法对野生型目标DNA的检测限较低，可应用于细胞裂解液中DNA的检测，并且可以区分单碱基错配。

Description

一种DNA或RNA检测体系、检测方法和它们的应用

技术领域

本申请属于化学和生物传感技术领域，具体涉及一种DNA或RNA检测体系、检测方法和它们的应用，更具体地讲，该DNA或RNA检测体系和检测方法基于肽核酸调控金纳米颗粒/碳量子点荧光能量共振转移来检测DNA或RNA。

背景技术

随着人们对癌症的认识水平逐步深入到基因层面，越来越多的肿瘤相关基因(原癌基因和抑癌基因)被发现。大量临床研究表明，特定基因的扩增、突变和表达状态与肿瘤的发生、发展和转移以及肿瘤治疗药物的有效性密切相关。简单、快速、经济、灵敏的基因检测方法，能及时监测特定基因的扩增、突变和表达情况，对于癌症的早期诊断和治疗具有非常重要的意义。它可以帮助医生为每一位患者制定最适合的治疗方案，从而最大程度地提高治疗的效率，减少药物的毒副作用。

目前癌症基因检测的主要技术是实时荧光定量PCR(RT-PCR)，它具有准确率高、特异性强、灵敏度高、应用范围广等特点，但需要复杂的仪器设备以及存在操作复杂、费用昂贵、假阳性问题突出等不足。为了克服这些缺点，人们开发了多种基于电化学、荧光、比色、光电化学以及电化学发光等方法的DNA检测技术。虽然这些方法在某些方面具有一定的优势，但也存在一定的局限性，如荧光或电化学基团标记，需要昂贵的仪器设备，所用材料毒性较高，以及稳定性差等，这就大大限制了它们在临床上的广泛应用。因此，建立一种简便、灵敏、低毒、快速的荧光检测DNA的方法仍然是十分必要和有意义的。

肽核酸(Peptide Nucleic Acids,PNA)是一类重要的分子诊断试剂，它可以与互补的DNA或RNA形成稳定的双链结构。与DNA相比，它还具有很多的优点：首先，PNA具有抗核酸酶和蛋白酶酶解的特性，这就使得PNA非常适合用于各种生物样本或体内研究；其次，PNA/DNA双链结构的稳定性要比相同序列DNA/DNA双链结构的稳定性高的多；另外，PNA的这种杂交反应具有很高的灵敏度和序列选择性。另一个重要的性质就是单链PNA会吸附到金纳米粒子(AuNPs)的表面，从而诱导AuNPs的聚集，而PNA-DNA双链则可以稳定AuNPs，并且这种稳定作用比DNA单链还要强。PNA和PNA-DNA与AuNPs之间相互作用的差异在生物传感和疾病诊断领域具有重要的应用价值。

碳量子点(Carbon quantum dots，CQDs)是一种潜在的生物传感材料，与传统的量子点和有机染料相比，具有光稳定性高、毒性低、合成简单、水溶性好、原料廉价等优点，已成为荧光能量共振转移(FRET)生物传感器中理想的荧光探针。目前，基于AuNPs/CQDs的FRET效应在免疫分析、核酸检测、小分子和离子检测等领域得到了广泛的应用。

发明内容

本发明基于PNA调控碳量子点(CQDs)和金纳米粒子(AuNPs)之间的荧光能量共振转移(FRET)，开发了一种用于DNA检测的灵敏、特异的荧光检测方法。在本发明的整体构思中，发明人首先获得一条12个碱基长的PNA探针，用以选择性识别目标DNA。当不存在目标DNA时，单链PNA将会诱导AuNPs的聚集，AuNPs对CQDs的荧光猝灭效率降低，检测体系保持较高的荧光发射强度。当存在目标DNA时，PNA结合DNA形成双链，AuNPs得以稳定，CQDs的荧光被有效猝灭，检测体系的荧光强度大大降低。因此，通过评价荧光发射强度的变化，就可以定量地确定目标DNA的存在。

本发明的一方面提供了一种DNA或RNA检测体系，所述DNA或RNA检测体系为盐溶液体系，包括肽核酸、金纳米颗粒和碳量子点；所述肽核酸能与待检测目标DNA或RNA杂交形成双链。

在优选的实施方式中，所述肽核酸在所述溶液体系中浓度为0.4～1.2μM，所述金纳米颗粒在所述溶液体系中浓度为3～7nM，所述碳量子点在所述溶盐液体系中浓度为2～10μg/mL。

在优选的实施方式中，在存在待检测目标DNA和/或RNA时，所述DNA和/或RNA检测体系发出DNA或RNA检测信号。

在优选的实施方式中，所述DNA或RNA检测信号包括荧光光谱、颜色、UV-vis吸收光谱中的至少一种。

在优选的实施方式中，可以采用透射电子显微镜(TEM)、UV-vis吸收光谱和荧光光谱对AuNPs和CQDs进行表征。

在优选的实施方式中，所述荧光光谱的荧光强度、颜色的深度与所述待测样品中的野生型目标DNA或RNA的浓度成反比，所述紫外吸收峰随DNA或RNA浓度增加发生蓝移。

在优选的实施方式中，所述盐溶液体系为NaCl的溶液体系，NaCl的浓度为1～6mM；优选地，所述盐溶液体系的pH为6.9～7.4。

在优选的实施方式中，所述碳量子点尺寸为2～4nm。

在优选的实施方式中，所述碳量子点为尺寸约为3.5nm的球形颗粒，在254nm紫外光照射下发蓝光。

在优选的实施方式中，所述金纳米颗粒的粒径为11～14nm。

在优选的实施方式中，所述金纳米粒径约为13nm，紫外-可见吸收光谱在520nm处有最大吸收峰。

本发明的另一方面提供了一种DNA或RNA检测方法，所述检测方法至少包括以下步骤：

(1)使肽核酸与目标DNA或RNA杂交得到混合溶液I；

(2)向所述混合溶液中加入金纳米颗粒和碳量子点，得到混合溶液II；

(3)测量混合溶液II的荧光强度，并与建立的标准曲线进行比较，测定目标DNA或RNA的浓度，当所测浓度为0时，代表不存在目标DNA或RNA。

在优选的实施方式中，采用已知浓度的目标DNA或RNA为样品，测定检测体系的荧光强度，建立标准曲线。

在优选的实施方式中，所述目标DNA或RNA包括野生型目标DNA或RNA和突变型目标DNA或RNA。

在优选的实施方式中，所述野生型目标DNA为人类肿瘤抑制基因TP53，与之杂交的PNA链的长度至少为12个碱基。

在优选的实施方式中，所述PNA链的碱基序列为：TCC ACG CAC AAA。

本发明的又一方面提供了上述DNA或RNA检测体系以及上述DNA或RNA检测方法在基因检测、基因诊断、基因治疗中的至少一种应用。

在本发明的一个具体实施例中，采用基于肽核酸调控金纳米颗粒/碳量子点荧光能量共振转移来检测DNA，该方法包括以下步骤：

1)进行肽核酸(PNA)、金纳米颗粒(AuNPs)和碳量子点(CQDs)的合成与表征；

2)对PNA、AuNPs和盐浓度优化；

3)将PNA与不同浓度的目标DNA杂交得到均一的溶液；

4)向步骤3)中分别加入一定量的AuNPs和CQDs溶液；

5)测量不同浓度目标DNA存在下的荧光强度并建立标准曲线。

在本实施例中，制备得到的CQDs的尺寸约为3.5nm，在254nm紫外光照射下发蓝光。AuNPs粒径约为13nm，紫外-可见(UV-vis)吸收光谱在520nm处有最大吸收峰，两者均为均匀分散的球形颗粒。所述野生型目标DNA为人类肿瘤抑制基因TP53，PNA链的长度至少为12个碱基：TCC ACG CAC AAA。区分单碱基错配实验中，待测目标DNA包括3种单碱基错配序列。

在上述步骤3)中，将不同浓度的目标DNA(0,5,10,20,30,40,60,80,100,150,600,800nM)分别与0.8μM PNA室温混合10min。

在上述步骤4)中，加入终浓度为5nM的AuNPs和40μg/mL CQDs，4℃孵育1h。

本申请能产生的有益效果包括但不限于：

(1)本发明所提供的方法具有快速、经济、简单方便的特点，不需借助大型仪器设备，也不需要精确的温度控制和严格的洗涤步骤。

(2)本发明通过监测体系荧光强度的变化来定量检测目标DNA，不需要对核酸探针进行任何修饰。另外，也可通过比色法检测溶液颜色的变化定量目标DNA，无需复杂的仪器设备。

(3)本发明的方法对野生型目标DNA的检测限较低，可应用于细胞裂解液中DNA的检测，并且可以区分单碱基错配。

附图说明

图1是基于PNA调控AuNPs/CQDs荧光能量共振转移检测DNA的原理图。

图2(A)为CQDs的HR-TEM图像，图2(B)为FT-IR光谱。

图3为CQDs的荧光光谱和吸收光谱图。

图4(A)为AuNPs的TEM图像，图4(B)为UV-vis的吸收光谱。

图5(A)和图5(B)分别为CQDs、CQDs+AuNPs、CQDs+AuNPs+PNA、CQDs+AuNPs+PNA+完全互补DNA、CQDs+AuNPs+PNA+对照DNA的荧光光谱和紫外光谱；图5(C)为PNA存在下使AuNPs聚集的TEM图像。

图6是示出不同浓度目标DNA存在时的荧光强度变化图。

图7(A)和图7(B)分别为在完全互补的野生型DNA或单碱基突变DNA存在时，检测体系的荧光强度和颜色变化。

图8为向10％的Hela细胞裂解液中加入不同浓度的目标DNA(0,0.2,0.4,0.6,0.8μM)时检测体系荧光强度的变化图。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买，其中DNA序列购自杰李生物(上海)股份有限公司。

本发明实施例中使用的所有的玻璃仪器都用碱缸浸泡24h，并用双蒸水清洗，晾干备用。实验中使用的水均为18.2MΩ的Milli-Q超纯水。

实施例1碳量子点与金纳米颗粒的合成

(1)碳量子点(CQDs)合成：将终浓度为10mM苹果酸(1390.9mg)和10mM脲(600.6mg)均匀混合在10mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后将混合溶液倒入100mL高压反应釜并置于200℃的烘箱中反应15小时。将反应所得深棕色溶液在10000rpm下离心10分钟，上清液于透析袋(截留分子量＝1000Da)中对ddH₂O透析一周，随后进行冷冻干燥得到CQDs固体粉末。

(2)金纳米颗粒(AuNPs)的合成：AuNPs利用文献报道的方法制备得到，具体制备方法如下：

1、按照HCl:HNO₃＝3：1在烧杯中制备王水。

2、取100mL三颈圆底烧瓶，将磁力搅拌子装入烧瓶，加满王水浸泡15min，冷凝管用王水冲洗5次，然后用大量超纯水冲洗，80℃真空干燥。

3、配制50mL 1mM HAuCl₄：在三口烧瓶中加入49mL ddH₂O和1mL 50mM HAuCl₄。

4、在三口瓶的三个口上分别接上冷凝管和塞子，油浴加热，搅拌，此时应确保冷凝管中已通入流动水。

5、当观察到反应液充分沸腾，冷凝管中的冷凝水开始回流时(1滴/s，沸腾约10min)，取出塞子，快速加入5mL 38.8mM柠檬酸钠，并重新塞上塞子。这时溶液的颜色会发生快速的变化，其顺序为：淡黄色→无色→黑色→紫色→深红色。继续加热回流15min。

6、停止加热，持续搅拌，使反应系统自然冷却至室温(23～25℃)。在可选的不同实施例中，此过程持续2～4h不等。

7、将冷凝好的溶液用孔径0.45μm的醋酸滤膜过滤。

8、测定最大吸收峰：以ddH₂O作为空白，将500μl的AuNPs溶液稀释至1mL，测定其在520nm处的吸光度。粒径13nm AuNPs溶液在519nm左右有最大等离子吸收峰并且峰宽50nm。

9、用透射电子显微镜(TEM)进一步观察，AuNPs为球形。

实施例2检测用核酸的设计与合成

在本实施例中，野生型目标DNA为人类肿瘤抑制基因TP53。TP53的DNA序列：5’-AGGTGCGTGTTT-3’，含有SNP位点的目标DNA序列分别为：5’-AGGAGCGTGTTT-3’(突变4)，5’-AGGTGCGAGTTT-3’(突变8)，5’-AGGTGCGTGTTA-3’(突变12)，以上序列均无需进一步纯化即可使用；通过固相合成法手动合成12个碱基长度的互补PNA链：TCC ACG CAC AAA，在多肽合成管中裂解得到PNA粗品后用无水乙醚清洗三次，分别离心弃上清，用氮气将样品吹干后用超纯水溶解。样品在HPLC上纯化，取目标峰进行质谱鉴定，多次纯化收集目标峰产物并将产物冻干后用超纯水溶解，用紫外可见吸收光谱仪进行浓度定量。

从图2(A)中可以观察到CQDs为均匀分散的球形颗粒，粒径约为3.5nm。520nm处有最大吸收峰。FT-IR图谱对碳量子点表面含有的官能团类型进行了表征，如图2(B)所示，位于640，1195，1405，1715，3340cm^-1的特征峰分别是由于C-H,C-O,C-N,C＝O,O-H的伸缩振动引起的，以上结果证明了碳量子点表面含有丰富的官能团，包括氨基、羧基和酰胺基团等，这些官能团对碳量子点的水溶性及光学性能有较大影响。

图3中的曲线a显示了分别在280nm和350nm有两个明显的紫外吸收峰，很可能是由于π-π*跃迁和C＝O的n-π*跃迁造成的。CQDs在345nm激发波长(曲线b)下，获得445nm最佳发射波长(曲线c)，在254nm UV光下呈蓝色。

图4(A)显示了AuNPs为均匀分散的球形颗粒，粒径约为13nm。AuNPs的UV-vis吸收光谱在520nm处为最大吸收峰的位置，如图4(B)。根据Lambert-Beer’s公式计算纳米金的浓度为11.3nM。

实施例3

(1)野生型目标DNA的检测：

将特异性PNA探针(0.8μM)与不同浓度的(0,5,10,20,30,40,60,80,100,150,600,800nM)目标DNA在Tris-HCl缓冲液中混合10min，然后加入50μL AuNPs(5μM)和10μL CQDs溶液。将待测液静置1h使其反应充分。测试前将样品逐一涡旋以保证其分散性良好。用荧光分光光度计记录并分析荧光强度的变化，激发波长为345nm。作为荧光猝灭剂的AuNPs可以通过FRET有效地淬灭CQDs的荧光，AuNPs的吸收带与CQDs的荧光光谱有重叠区域,可以发生荧光能量共振转移，量子点的荧光被AuNPs猝灭。当加入PNA后，PNA诱导AuNPs聚集，CQDs的荧光得以恢复，640nm处出现一个新的紫外吸收峰。通过PNA与DNA的杂交来调控AuNPs的聚集和分散，从而CQDs的荧光强度和AuNPs的颜色会有相应的变化，故此传感平台可用于目标核酸的检测。

(2)野生型目标DNA的检测灵敏度：

通过加入一系列不同浓度的目标DNA验证该检测系统(荧光传感)的灵敏度。DNA/PNA形成双链后，AuNPs处于分散状态，CQDs的荧光被猝灭。随着目标DNA浓度的增加，碳量子点的荧光强度逐渐降低。目标DNA在0-100nM的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.993。校准曲线的方程为y＝-1.3x+562.2。基于3σ/斜率(其中σ是标准偏差)的检测极限被计算为0.21nM。这些数据表明该检测系统可用于对目标核酸进行高灵敏度的定量分析。

图5A中的曲线从上到下依次代表CQDs、CQDs+AuNPs、CQDs+AuNPs+PNA、CQDs+AuNPs+PNA+完全互补DNA、CQDs+AuNPs+PNA+对照DNA的荧光光谱，图5B中的曲线从上到下依次代表AuNPs、CQDs+AuNPs、CQDs+AuNPs+PNA、CQDs+AuNPs+PNA+完全互补DNA、CQDs+AuNPs+PNA+对照DNA的紫外光谱。图5C显示了PNA存在下使AuNPs聚集的TEM图像。

图6显示添加不同浓度目标DNA(0,5,10,20,30,40,60,80,100,150,600,800nM)的荧光强度，在0-100nM的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.993。校准曲线的方程为y＝-1.3x+562.2。基于3σ/斜率(其中σ是标准偏差)的检测极限被计算为0.21nM。

实施例4

(1)区分单碱基错配：该荧光检测系统具有区分单碱基错配DNA(序列见表1)和互补DNA的潜力。通过肉眼观察，完全互补的DNA和单碱基错配DNA在颜色上有明显区别，如图7(A)所示，并且野生型与突变型DNA存在下，检测体系的荧光强度也有明显差异，如图7(B)所示。

(2)制备HeLa细胞裂解液：将经胰酶消化后的HeLa细胞离心并收集，用0.1M的PBS洗涤。于2400rpm转速下4℃离心5分钟并二次收集。将细胞转移至RIPA细胞裂解液，使其浓度为5.5×10⁶细胞/mL，并且冰浴40分钟，在12000rpm转速下4℃离心30分钟，收集上清液并于-20℃储存。

(3)生物样品检测：为了验证该检测系统用于生物样品检测的可行性，对Hela细胞裂解液中的目标DNA进行分析。通过向10％的Hela细胞裂解液加入不同浓度的目标DNA进行测试(0,0.2,0.4,0.6,0.8μM)，结果如图8所示，不同浓度的目标DNA在缓冲液和细胞裂解液中的趋势大致相同。表明该核酸检测系统同样可用于实际生物样本中目标DNA的检测。

表1

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

序列表

<110> 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所

中国科学院宁波材料技术与工程研究所

<120> 一种DNA或RNA检测体系、检测方法和它们的应用

<130> 20190929

<141> 2019-09-30

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> human

<400> 1

tccacgcaca aa 12

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> human

<400> 2

aggtgcgtgt tt 12

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

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<210> 4

<211> 12

<212> DNA

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<400> 4

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<210> 5

<211> 12

<212> DNA

<213> human

<400> 5

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<210> 6

<211> 12

<212> DNA

<213> human

<400> 6

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Claims

1.一种DNA或RNA检测体系，其特征在于，所述DNA或RNA检测体系为盐溶液体系，包括肽核酸、金纳米颗粒和碳量子点；所述肽核酸能与待检测目标DNA或RNA杂交形成双链。

2.根据权利要求1所述的DNA或RNA检测体系，其特征在于，

所述肽核酸在所述盐溶液体系中浓度为0.4～1.2μM，

所述金纳米颗粒在所述盐溶液体系中浓度为3～7nM，

所述碳量子点在所述溶盐液体系中浓度为2～10μg/mL。

3.根据权利要求1所述的DNA或RNA检测体系，其特征在于，在存在待检测目标DNA或RNA时，所述DNA或RNA检测体系发出DNA或RNA检测信号。

4.根据权利要求3所述的DNA或RNA检测体系，其特征在于，所述DNA或RNA检测信号包括荧光光谱、颜色、UV-vis吸收光谱中的至少一种；

优选地，所述荧光光谱的荧光强度、颜色的深度与所述待测样品中的野生型目标DNA或RNA的浓度成反比，紫外吸收峰随DNA或RNA浓度增加发生蓝移。

5.根据权利要求1所述的DNA或RNA检测体系，其特征在于，所述盐溶液体系为含有NaCl的溶液体系，NaCl的浓度为1～6mM，优选地，所述盐溶液体系的pH为6.9～7.4；

优选地，所述碳量子点尺寸为2～4nm；进一步优选地，所述碳量子点为尺寸约为3.5nm的球形颗粒，在254nm紫外光照射下发蓝光；

优选地，所述金纳米颗粒的粒径为11～14nm；进一步优选地，所述金纳米粒径约为13nm，紫外-可见吸收光谱在520nm处有最大吸收峰。

6.一种DNA或RNA检测方法，其特征在于，所述检测方法至少包括以下步骤：

(1)使肽核酸与待检测目标DNA或RNA杂交得到混合溶液I；

(2)向所述混合溶液I中加入金纳米颗粒和碳量子点，得到混合溶液II；

(3)测量混合溶液II的荧光强度，并与建立的标准曲线进行比较，测定待检测目标DNA或RNA的浓度，当所测浓度为0时，代表不存在待检测目标DNA或RNA。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，采用已知浓度的待检测目标DNA或RNA为样品，测定检测体系的荧光强度，建立标准曲线。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述待检测目标DNA或RNA包括野生型目标DNA或RNA和/或突变型目标DNA或RNA；

优选地，所述野生型目标DNA为人类肿瘤抑制基因TP53，与之杂交的PNA链的长度至少为12个碱基。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述PNA链的碱基序列为：TCC ACGCAC AAA。

10.权利要求1至5中任一项所述的DNA或RNA检测体系以及权利要求6至9中任一项所述的DNA或RNA检测方法在基因检测、基因诊断、基因治疗中的至少一种应用。