TW202014522A - 用於偵測不穩定之細胞游離dna的方法及其偵測裝置 - Google Patents
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Abstract
在一實施例中,本發明係關於一種技術,其中在不進行PCR之情況下以超高靈敏度偵測諸如尿液、腦脊髓液、血漿、血液、肋膜積液(pleural fluid)或體液之液體樣品中的小型cfDNA,濃縮且分離,且隨後分析基因突變。特定而言,在使用帶正電奈米結構之情況下,可提高捕獲及偵測速率。根據本發明之一實施例的偵測方法不需要PCR擴增反應,其極大地縮短獲得結果所花費的時間。另外,由於可以進行直接現場分析而不需要特定設備,因此預期本發明可以能夠在短時段內同時搜尋多個基因之照護點測試(POCT)形式使用。
Description
發明領域
本發明係關於用於在不進行基因擴增方法之情況下偵測具有不穩定雙螺旋結構之細胞游離DNA的方法及裝置。
發明背景
最近,癌症疾病之早期診斷的重要性已在全世界突出增長。因此,關於癌症早期診斷之方法的研究逐漸增加。然而,迄今為止,用於癌症診斷之方法利用諸如收集組織樣品及內視鏡檢之侵入性方法來進行。特定而言,組織學檢查以使得疑似疾病位點處之部分經提取且在顯微鏡下觀測之方式來進行。因此,由於必須切開人體以便使用針頭、衝頭、內視鏡或腹腔鏡收集組織樣品,因此不僅患者感覺相當大的不適,而且留下瘢痕且其恢復花費長時間。
使用液態切片之分子診斷方法作為侵入性診斷及檢查方法之替代方案引起了關注。由於液態切片使用非侵入性方法,因此有可能快速鑑別其結果。此外,不同於能夠僅對疾病一部分進行分析之組織樣品,液態切片能夠對疾病進行多邊分析。特定而言,預期液態切片在癌症診斷中發揮極佳功效。特定而言,預計僅檢查諸如血液及尿液之體液使得有可能分析存在於血液中之各別身體部分的癌細胞源性DNA,使得可得到對癌症發展及轉移及其類似過程的詳細觀測結果。
分子診斷方法係活體外診斷之代表性技術,其經由數值或影像偵測及診斷來自含有遺傳資訊之樣品,諸如血液及尿液之DNA或RNA的變化。歸因於其高準確度及不需要組織學檢查之優點,已基於其節省成本之優點以及基因組分析技術之快速發展,嘗試將分子診斷方法應用於癌症診斷技術。
另一方面,細胞游離DNA (下文中稱作cfDNA)係指存在於血漿中且來源於細胞之DNA。cfDNA通常具有雙螺旋結構。另外,存在cfDNA具有捲曲螺旋結構之許多情況。cfDNA可來源於腫瘤細胞。另外,來源於腫瘤細胞之cfDNA可見於獲自癌症患者之生物樣品,諸如血液、血漿或尿液中。
見於癌症患者中之cfDNA可來源於壞死細胞、正常細胞及/或癌細胞。此類cfDNA經由各種過程釋放至尿液、血液或類似物中。因此,用於分離及偵測生物樣品,諸如血液、血漿或尿液中之cfDNA之技術的發展使液態切片成為用於監測具有癌症風險之患者之更有效且可靠的工具。特定而言,由於尿液、血漿、血液或體液係可容易獲得的樣品,因此有可能以非侵入方式收集大量樣本。
然而,考慮到目前技術位準,用於癌症早期診斷之方法,包括分析諸如血液及尿液之液體樣品中的cfDNA及找出基因中存在的突變存在許多困難。因此,需要開發一種用於容易地偵測cfDNA之方法,以及用於改良偵測靈敏度及用於癌症之準確早期診斷的技術。
同時,韓國專利第10-1751962號揭示一種能夠藉由使用引子進行聚合酶鏈反應(PCR)定量cfDNA之技術,從而偵測到cfDNA。然而,仍存在需要單獨聚合酶及實驗設備來進行聚合酶鏈反應之問題;且存在擴增需要準確引子產生及現場診斷不容易進行之問題。
另外,韓國專利第10-1701618號揭示一種奈米結構,其表面特性可經由電場之變化而變化,以便有效地分離cfDNA。奈米結構可經由電場之變化結合或解離cfDNA,且因此可容易地自樣品分離cfDNA。然而,仍存在應使用聚合酶鏈反應以鑑別存在哪一cfDNA的限制。
為了藉由進行聚合酶鏈反應擴增cfDNA,需要各種類型之引子組,且進行複雜步驟亦花費大量時間。因此,不斷地進行研究以克服必須進行PCR之限制,且開發用於以高準確度分析cfDNA之方法。
發明概要技術問題
習知地,為了偵測cfDNA,進行使cfDNA變性且用與cfDNA互補之引子擴增的方法係必需的。然而,諸位發明人已鑑別血液中存在不穩定cfDNA。另外,諸位發明人已鑑別不同於穩定cfDNA,不穩定cfDNA展示與單股探針之不常見反應。特定而言,諸位發明人已鑑別此類不穩定cfDNA來源於患有癌症或感染性疾病之個體的細胞。基於此等研究結果,諸位發明人完成本發明。
因此,本發明之一目標係提供一種用於鑑別是否存在不穩定cfDNA之方法,及提供一種用於藉由鑑別此類不穩定cfDNA為癌症或各種疾病之診斷提供資訊的方法。問題之解決方案
為了達成以上目標,提供一種用於在不擴增之情況下自樣品偵測不穩定cfDNA之方法。另外,提供一種用於藉由在不擴增之情況下自樣品偵測不穩定cfDNA,為癌症及感染性疾病之診斷或預測提供資訊之方法。另外,提供一種用於在不擴增之情況下自樣品偵測不穩定cfDNA之裝置。發明之有利效應
當使用根據一實施例之用於偵測不穩定cfDNA的方法時,不僅無需擴增不穩定cfDNA之方法,而且有可能縮短分析cfDNA之時間。特定而言,有可能有效地偵測含有基因突變部分之不穩定雙股cfDNA,藉此有效地診斷或預測癌症或與基因突變相關之疾病。另外,當使用根據本發明之一實施例的方法時,有可能以快速且準確的方式自少量生物樣品,諸如尿液、腦脊髓液、肋膜積液(pleural fluid)、腹水、血漿、血液或體液鑑別具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA是否存在。另外,由於已證實由此偵測到之不穩定cfDNA與各種癌症或疾病相關,因此根據本發明之一實施例的方法可有用地用於癌症診斷或用於治療後預後之鑑別。
較佳實施例之詳細說明> 術語定義 >
如本文所用,術語「細胞游離DNA」亦稱為cfDNA。另外,cfDNA亦可為循環腫瘤DNA (ctDNA),其為可見於來源於癌症患者之生物樣品,諸如尿液、腦脊髓液、血漿、血液或體液中的癌細胞源性DNA。另外,cfDNA可存在於生物樣品,諸如尿液、腦脊髓液、肋膜積液、腹水、血漿、血液、唾液、痰液或體液中。此處,cfDNA之大小可為80 bp至10 kbp、100 bp至1 kbp或120 bp至500 bp。另外,cfDNA之大小可為150 bp至200 bp,且大小通常可為165 bp至170 bp。
如本文所用,術語「不穩定cfDNA」係指與「穩定cfDNA」相比,在熱力學上不穩定的cfDNA。換言之,相比於穩定cfDNA變性之條件,不穩定cfDNA可在較不惡劣之條件下變性。產生不穩定cfDNA之原因係不穩定cfDNA具有不穩定雙螺旋結構。
如本文所用,術語「具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA」之特徵在於與具有穩定雙螺旋結構之cfDNA相比,具有較低Tm值,或在具有穩定雙螺旋結構之cfDNA不變性的條件下變性。Tm係指雙股DNA之50%轉變成單股DNA之熔融溫度。Tm值與DNA之長度成比例,且可隨核苷酸序列變化。由於基因組DNA中大量核苷酸以氫鍵彼此鍵結,因此基因組DNA必須在92℃至95℃下加熱5分鐘或更長,或在98℃下加熱2分鐘或更長。另外,基因組DNA不容易經歷變性溫度低於90℃。由於具有穩定雙螺旋結構之cfDNA具有平均170 bp核苷酸,且因此可具有類似於基因組DNA之Tm值。
然而,與具有穩定雙螺旋結構之cfDNA相比,「具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA」具有較低Tm值。因此,當具有穩定雙螺旋結構之cfDNA經歷選自由以下組成之群的任一條件下的變性:i)允許在室溫下靜置1至120分鐘之條件;ii)在90℃至95℃下加熱1秒至3分鐘之條件;iii)在75℃至90℃下加熱1秒至5分鐘之條件;iv)在60℃至75℃下加熱30秒至60分鐘之條件;v)在25℃至40℃下加熱10至120分鐘之條件;vi)用蛋白酶處理10秒至30分鐘之條件;及vii)用去氧核糖核酸酶處理10秒至30分鐘之條件,且隨後經歷與15聚體至30聚體探針之結合反應時,具有穩定雙螺旋結構之cfDNA不結合至探針。此處,「室溫」係指環境溫度且可為18℃至25℃。此外,除以上條件以外,可進一步包括在40℃至65℃下加熱5至80分鐘之條件。
然而,已證實當具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA經歷上文所提及之i)至vii)之任一條件下的處理,且隨後經歷與15聚體至30聚體探針之結合反應時,具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA結合至探針。此處,探針可為15聚體至30聚體,或20聚體至25聚體,且可為21聚體、22聚體、23聚體或24聚體探針。
此處,具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA可為循環腫瘤DNA (下文中稱作ctDNA)。另外,具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA可為來源於不存在於正常細胞中之受損核酸序列的cfDNA。此處,不存在於正常細胞中之受損核酸序列可含有由基因之一部分之缺失、重複、反轉或易位引起的結構異常。另外,受損核酸序列可含有由核酸之一部分之錯配引起的結構異常,且可為由核酸之部分序列之突變引起的單核苷酸變異(SNV)。受損核酸序列可具有選自由以下組成之群之至少一基因的突變序列:EGFR、KRAS、BRAF、TP53、PIK3CA、ROS1、RET、c-Met、PTEN、RB1、AR、BRCA、KIT、FGFR、IDH、ESR1、HER2、ALK-EML4及TMPRSS2-ERG。
具體而言,不存在於正常細胞中之受損核酸序列可由以下中之任一者引起:1)單股之裂解,2)雙股之裂解,3)停頓之複製叉,4)錯配核酸,5)染色體畸變,6)股內交聯,7)股間交聯,8)外源基因之插入,9)基因之一部分的缺失,10)核酸之一部分的取代,11)核酸之反轉,12)胸苷二聚體形成,13)去胺基作用,14)基因重複,15)染色體易位,或16)鹼基缺乏(AP位點)。特定而言,在腫瘤細胞中,雙股DNA (dsDNA)通常受損,且受損dsDNA可含有見於腫瘤細胞中之特定結構。特定而言,歸因於核酸錯配,受損核酸序列可具有搖擺(wobble)鹼基對。
如本文所用,術語「探針」係指用於偵測目標cfDNA之DNA或RNA。探針可具有設計成能夠互補結合至不穩定cfDNA之序列。如本文所用,術語「具有與cfDNA互補之序列的探針」係指具有能夠特異性結合至具有目標雙螺旋結構,且存在於血漿中之待偵測cfDNA之核酸序列的探針。
此處,探針可以二種方式產生。一種為設計成能夠結合至出現損傷之基因之一部分的第一探針(下文中稱作CP),且另一種為設計成能夠結合至受損部分周邊的第二探針(下文中稱作DP)。DP可設計成特異性結合至位於離目標DNA序列或出現損傷之區10 bp至100 bp,或20 bp至50 bp之位置處的序列。
在本說明書中,已鑑別不僅在第一探針及第二探針同時使用時可有效偵測受損cfDNA,而且在第一探針或第二探針分別使用時亦可有效偵測受損cfDNA。另外,探針可呈結合至諸如生物素之物質的形式,以便結合標記物。可替代地,探針可直接或經連接子結合至標記物。此處,標記物可為奈米粒子、螢光染料、螢光蛋白或酶。另外,探針及標記物可同時添加,或可以依序方式添加。
在本發明之一實施例中,能夠互補結合至目標cfDNA之探針可特異性結合至含有對以下癌細胞之每一類型具有特異性之序列的區。舉例而言,對卵巢癌或乳癌具有特異性之序列可為存在於BRCA1外顯子7、BRCA1外顯子10、BRCA1外顯子11或BRCA1外顯子15中之SNP。另外,對胃癌具有特異性之序列可為存在於TP53之SNP,且對結腸直腸癌具有特異性之序列可為存在於MSH2中之SNP。對肺癌具有特異性之序列可為存在於EGFR中之SNP。另外,對肝癌具有特異性之序列可選自存在於FGFR3中之SNP。
[表1]
如本文所用,術語「經分離生物樣品」係指已自人體分離之尿液、唾液、腦脊髓液、肋膜積液、腹水、血漿、血液、痰液或體液的樣品。經分離生物樣品可為自人體分離之液體樣品。此處,血漿可獲自血液。
如本文所用,術語「帶正電物質」係指可以奈米粒子、奈米線、網狀結構或過濾器形式使用之物質。然而,帶正電物質之形狀不限於此。「帶正電物質」之一實施例可為帶正電奈米線或帶正電膜。奈米線可使用導電聚合物產生。導電聚合物可為選自由以下組成之群的任一者:聚(乙炔)、聚(吡咯)、聚(噻吩)、聚(對伸苯)、聚(3,4-伸乙二氧基噻吩)、聚(苯硫醚)、聚(對伸苯伸乙烯)及聚苯胺。視產生方法而定,奈米線之長度及直徑可適當調節。在一實施例中,奈米線之直徑可為200 nm且長度可為18 μm。另外,奈米線可在產生期間製成含有生物素。
奈米線之表面可經陽離子聚合物修飾。陽離子聚合物之類型不受限制。陽離子聚合物之一實施例可為聚乙亞胺(PEI)或聚離胺酸(PLL)。另外,陽離子聚合物可為陽離子分支鏈聚合物聚乙亞胺。經此類陽離子聚合物修飾之奈米線可具有帶正電表面。
在一實施例中,帶正電奈米線即使在低濃度下亦可成功且有效地捕獲cfDNA。特定而言,帶正電奈米線歸因於其諸如用於結合至包括DNA之目標分子的大表面積,及用於促進與DNA相互作用之改良移動性的特徵,可有效捕獲cfDNA。
如本文所用,術語「標記物」係指用於有效偵測具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA的物質,且具體而言可包括量子點、降解某一受質且引起顯色反應之物質,及當經特定波長之光輻射時產生螢光之物質。具體而言,標記物為螢光蛋白,且可為綠色螢光蛋白(GFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、紅色螢光蛋白(RFP)或青色螢光蛋白(CFP)。可替代地,標記物可為能夠將選自由ABTS、OPD、AmplexRed、DAB、AEC、TMB、高香草酸及魯米諾(luminol)組成之群的任一受質轉化成著色物質的物質,諸如辣根過氧化酶(HRP)。
標記物可進一步含有能夠結合至探針之物質。具體而言,當生物素結合至探針時,標記物可進一步含有選自由以下組成之群的任一者:抗生素蛋白(avidin)、鏈黴抗生物素蛋白或其組合。在一實施例中,此類標記物可以結合至鏈黴抗生物素蛋白及HRP之奈米粒子形式使用,奈米粒子由導電聚合物及玻尿酸構成。此處,導電聚合物如上文所描述,且可較佳為聚吡咯。在另一實施例中,標記物可以結合至鏈黴抗生物素蛋白及螢光蛋白之奈米粒子形式使用,奈米粒子由導電聚合物及玻尿酸構成。> 用於 偵測不穩定 cfDNA 之方法 >
在本發明之一態樣中,提供一種用於在不擴增之情況下自樣品偵測不穩定細胞游離DNA之方法,該方法包含將不穩定cfDNA與結合至標記物之探針混合的步驟。
此類不穩定cfDNA可為來源於腫瘤之循環腫瘤DNA (ctDNA)。此處,ctDNA可具有如上文所描述之受損基因序列。另外,ctDNA可自表現高度活躍之基因分離。此處,樣品可為生物樣品,且可為自人體分離之樣品。具體而言,樣品可為尿液、腦脊髓液、血漿、血液、肋膜積液、腹水、唾液、痰液或體液。
因此,可經由使樣品經歷以下條件中之任一者下之處理的步驟,根據與探針之反應性將不穩定cfDNA與穩定cfDNA區分開。具體而言,處理可在選自以下之任一條件下進行:i)允許在室溫下靜置1至120分鐘之條件;ii)在90℃至95℃下加熱1秒至3分鐘之條件;iii)在75℃至90℃下加熱1秒至5分鐘之條件;iv)在60℃至75℃下加熱30秒至30分鐘之條件;v)在25℃至40℃下加熱10分鐘至120分鐘之條件;vi)用蛋白酶處理1至30分鐘之條件;及vii)用去氧核糖核酸酶處理1至30分鐘之條件。探針可含有15聚體至30聚體核苷酸,或20聚體至25聚體核苷酸。此處,探針可設計成能夠互補結合至不穩定cfDNA之基因序列。
當穩定cfDNA經歷以上條件中之任一者下的處理時,穩定cfDNA不經歷變性,且歸因於其中形成之強雙股不互補結合至探針。然而,不穩定cfDNA在經歷以上條件中之任一者下之處理的情況下可結合至探針。此類不穩定性係由於cfDNA中之一些核苷酸未能形成互補結合,且因此cfDNA具有經改變之雙螺旋結構。
在本發明之另一態樣中,提供一種用於在不擴增之情況下自樣品偵測具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA的方法。此處,該方法包含a)將含有cfDNA之樣品與帶正電物質混合之步驟;b)分離結合至cfDNA之帶正電物質之步驟;c)將混合物與探針及標記物混合之步驟;d)移除不結合至cfDNA之探針及標記物;及e)偵測標記物。
具體而言,該方法可包含將含有cfDNA之樣品與帶正電物質混合之步驟。
樣品可為如上文所描述之生物樣品。其一實施例可為血漿或尿液。在血漿或尿液中,具有正常雙螺旋結構之cfDNA及具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA可共同存在。另外,帶正電物質具體而言可為帶正電奈米線。帶正電奈米線如上文所描述。
以上步驟具體而言可按以下次序且在以下條件下進行。首先,在接收患者之血漿、尿液、唾液、痰液或類似物後,立即在4℃下以3,000×g進行離心,持續10分鐘。其後,將患者之血漿、尿液、唾液、痰液或類似物以某一比率稀釋於DPBS中。隨後,在血漿之情況下,將30 μl血漿與120 μl蒸餾水(DW)混合,且置於核酸純化管柱(spin column) (G型或Q型)中。向其中添加表面經聚乙亞胺修飾之聚吡咯(PEI/Ppy)奈米線(20 μl),且在室溫下使用恆溫混勻儀以1,200 rpm之速度進行混合,持續20分鐘。
接下來,該方法可包含分離結合至cfDNA之帶正電物質的步驟。
分離帶正電物質之方法可藉由離心或施加負壓(諸如真空)來進行。cfDNA結合至帶正電物質。因此,當將與帶正電物質混合之樣品置於核酸純化管柱或真空管柱中,且進行離心或施加負壓時,諸如奈米線之帶正電物質不通過管柱中之過濾器,而生物樣品中之其他成分通過過濾器。因此,結合至cfDNA之帶正電物質可經由諸如離心或真空之方法分離。另外,為了自由此分離之奈米線去除雜質,可另外進行洗滌步驟一至三次。對於洗滌,可適當使用習知方法。
以上步驟具體而言可按以下次序且在以下條件下進行。將核酸純化管柱安裝於用於施加真空之裝置上,且隨後以550毫巴進行抽吸。對於洗滌,向其中添加400 μl 1×DPBS,且再次進行抽吸。可再一次重複同一過程。
在一實施例中,當進行溫度處理時,可將已完成抽吸之核酸純化管柱置於預加熱至95℃之加熱塊(heat block)中,在95℃下培育1分鐘,且隨後立即自其中取出。在不需要溫度變性步驟之條件下的樣品可不經歷此過程。
接下來,該方法可包含將混合物與探針及標記物混合之步驟。
如上文所描述,探針可由15聚體至30聚體核苷酸,或20聚體至25聚體核苷酸構成。探針之序列可設計成能夠互補結合至具有不穩定雙螺旋結構之待偵測cfDNA。特定而言,具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA可為腫瘤源性ctDNA。另外,具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA可設計成能夠互補結合至被稱為癌症生物標記物之基因。
另外,標記物可為可在特定條件下偵測到之物質,諸如螢光蛋白或HRP。此處,標記物可含有能夠結合至探針之物質。具體而言,當生物素結合至標記物時,抗生素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白可結合至標記物。在一實施例中,為了提高偵測靈敏度,標記物可具有奈米粒子形式,奈米粒子中聚集數個HRP分子及數個鏈黴抗生物素蛋白分子。
以上步驟具體而言可按以下次序且在以下條件下進行。將適於每一實驗之探針(200 μl)及HRP/STR奈米粒子之溶液(200 μl)分別置於核酸純化管柱中。在室溫下以850 rpm至1,000 rpm之速度進行混合,持續30分鐘。
接下來,該方法可包含移除不結合至cfDNA之探針及標記物的步驟。
此為移除不結合至cfDNA之探針的步驟。15聚體至30聚體探針亦帶負電且可結合至帶正電奈米線。因此,混合反應完成後,應自反應溶液移除殘餘探針及標記物。此處,可藉由離心或使用負壓移除探針及標記物。此處,與短股探針相比,cfDNA強有力地結合至帶正電物質,具體而言帶正電奈米線。在移除探針及標記物之步驟中,cfDNA結合至帶正電物質,且因此未被移除。
以上步驟之一實施例具體而言可按以下次序進行。在進行以上步驟之後,將負壓施加至核酸純化管柱,且進行抽吸。隨後,向其中添加400 μl 1×DPBS,且再次進行抽吸。可再一次重複同一過程。
最後,該方法可包含偵測標記物之步驟。
視所使用之標記物而定,可以不同方式進行偵測標記物之方法。標記物之偵測可藉由顏色變化、UV吸光度變化、螢光反應變化或電化學變化來量測。舉例而言,當HRP用作標記物時,可藉由觀測顯色反應偵測標記物。另外,當標記物為諸如GFP之螢光蛋白時,可藉由用具有特定波長之光輻射標記物,且隨後觀測所偵測到之光來偵測是否存在標記物。
以上步驟之一實施例具體而言可按以下次序進行。向核酸純化管柱中依序添加200 μl乙酸鈉緩衝液(0.2 M,pH 7.0)、50 μl TMB (10 mM)及50 μl H2O2 (0.1 M)。隨後,進行培育,持續3分鐘。其後,以3,500 rpm至5,000 rpm之速度進行離心,持續30秒。將收集於收集管中之溶液以每孔200 μl轉移至96孔,且隨後使用UV/VIS分光光度計來量測500 nm至850 nm波長範圍下之吸光度。
此外,該方法可另外包含額外處理過程,以便增大具有正常雙螺旋結構之cfDNA及具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA與探針之反應性的差異。額外處理過程可在獲得樣品之後或在分離cfDNA之後進行。
另外,在步驟c)之前,該方法可進一步包含使樣品或結合至帶正電物質之cfDNA經歷選自由以下組成之群之任一條件下之變性的步驟:i)允許在室溫下靜置1至10分鐘之條件;ii)在90℃至95℃下加熱1秒至1分鐘之條件;iii)在75℃至90℃下加熱10秒至3分鐘之條件;iv)在60℃至75℃下加熱1至30分鐘之條件;v)在25℃至40℃下加熱5至60分鐘之條件;vi)用蛋白酶處理1至10分鐘之條件;及vii)用去氧核糖核酸酶I處理1至10分鐘之條件。此類變性過程不引起穩定cfDNA經歷變性,且引起不穩定cfDNA較不穩定地變性,使得不穩定cfDNA可更易於結合至探針。在以上條件下之變性可在獲得樣品之後進行。另外,變性可在獲得結合至帶正電物質之cfDNA之後進行。另外,可適當調節用於用去氧核糖核酸酶進行之處理的溫度、蛋白酶及時間,只要穩定cfDNA不變性即可。
在本發明之一實施例中,已鑑別待偵測之具有不穩定雙螺旋結構的cfDNA可在不進行單獨變性步驟之情況下使用目標探針偵測到(圖31)。此外,已鑑別即使當此類cfDNA經歷溫度處理過程時,具有穩定雙螺旋結構之cfDNA及具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA仍展示對相同探針的不同結合反應(圖32及圖33)。> 用於經由偵測不穩定 cfDNA 為診斷提供資訊之方法 >
在本發明之另一態樣中,提供一種用於藉由在不擴增之情況下自樣品偵測具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA,為癌症及感染性疾病之診斷或預測提供資訊的方法。此處,該方法包含a)將含有cfDNA之樣品與帶正電物質混合;b)分離結合至cfDNA之帶正電物質;c)將混合物與探針及標記物混合;d)移除不結合至cfDNA之探針及標記物;e)偵測標記物;及f)當偵測到標記物時,確定存在與對應於具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA之基因相關的癌症或感染性疾病的步驟。具體而言,用於偵測不穩定cfDNA之方法如上文所描述。
本說明書中所用之癌症之一實施例可為選自由以下組成之群的任何一種:膀胱癌、骨癌、血癌、乳癌、黑素瘤、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、骨髓癌、直腸癌、咽喉癌、喉癌、肺癌、食道癌、胰臟癌、結腸直腸癌、胃癌、舌癌、皮膚癌、腦瘤、子宮癌、頭頸癌、膽囊癌、口腔癌、結腸癌、肛周癌、中樞神經系統腫瘤、肝癌及結腸直腸癌。特定而言,癌症可為胃癌、結腸直腸癌、肝癌、肺癌或乳癌。
在一實施例中,特定存在於以上癌細胞中之序列可為存在於癌細胞中之SNP。在胃癌之情況下,特定存在於癌症中之序列之一實施例可為被稱為腫瘤抑制基因之p53及PTEN中的突變。另外,在結腸直腸癌之情況下,其一實施例可為APC及MSH2基因中之突變。另外,在肝癌之情況下,由於其主要原因為經B型肝炎病毒(HBV)或C型肝炎病毒(HCV)感染,因此HBV或HCV核酸可為目標。另外,在肺癌之情況下,表皮生長因子受體(EGFR)基因中之突變可為目標;且在乳癌之情況下,BRCA1/2基因中之突變可為主要目標。另外,在子宮頸癌之情況下,來源於人類乳頭狀瘤病毒DNA (HPV DNA)之cfDNA可為目標。
不穩定dsDNA之另一實施例可為選自由以下組成之群的至少一基因突變:EGFR、KRAS、BRAF、TP53、PIK3CA、ROS1、RET、c-Met、PTEN、RB1、AR、BRCA、KIT、FGFR、IDH、ESR1、HER2、ALK-EML4及TMPRSS2-ERG。> 用於偵測不穩定 cfDNA 之裝置 >
在本發明之又另一態樣中,提供一種用於偵測具有在室溫下不穩定之雙螺旋結構之cfDNA的裝置,該裝置包含a)用於將含有cfDNA之樣品與帶正電奈米線混合之混合區段;b)用於移除除結合至cfDNA之奈米線外之樣品的獲得區段;c)用於向結合至cfDNA之奈米線添加結合至能夠互補結合至cfDNA之生物素的探針,及包含鏈黴抗生物素蛋白及標記物之奈米粒子的反應區段;d)用於偵測標記物之偵測區段;及e)用於根據標記物之偵測,確定樣品含有具有與偵測探針互補之序列且具有在室溫下不穩定之雙螺旋結構之cfDNA的資訊加工區段。> 使用不穩定 cfDNA 之偵測的診斷裝置 >
在本發明之又另一態樣中,提供一種用於藉由在不擴增之情況下自樣品偵測具有不穩定雙螺旋結構之細胞游離DNA,為癌症或感染性疾病之診斷或預測提供資訊的裝置。此處,裝置包含a)用於將含有cfDNA之樣品與帶正電奈米線混合之混合區段;b)用於移除除結合至cfDNA之奈米線外之樣品的獲得區段;c)用於向結合至cfDNA之奈米線添加結合至能夠互補結合至cfDNA之生物素的探針,及包含鏈黴抗生物素蛋白及標記物之奈米粒子的反應區段;d)用於偵測標記物之偵測區段;及e)用於根據標記物之偵測,確定樣品含有具有與偵測探針互補之序列且具有在室溫下不穩定之雙螺旋結構之cfDNA的資訊加工區段。
本發明係基於穩定cfDNA及不穩定cfDNA歸因於其熱力學穩定性之差異,與探針之反應性的差異。此處,帶正電奈米線可結合至基因組DNA及cfDNA。然而,基因組DNA歸因於其結合力及大小差異,在洗滌後與帶正電奈米線分離。另外,在一實施例中,當奈米線經修飾時,奈米線可製成含有生物素。然而,在用作為陽離子聚合物之聚乙亞胺修飾奈米線表面的過程中,含於奈米線中及暴露於奈米線表面之生物素結合至陽離子聚合物。另外,奈米線經陽離子聚合物塗佈,且因此含有鏈黴抗生物素蛋白之標記物不結合至奈米線。另外,由於探針亦帶負電,因此其可結合至帶正電之奈米線。然而,已發現探針歸因於比cfDNA弱的結合力,在洗滌過程期間被移除。
另外,穩定cfDNA及不穩定cfDNA經能夠特異性結合至含有受損DNA序列之區的探針(CP)及能夠特異性結合至不含受損DNA序列之周邊區的探針(DP)處理。因此,有可能鑑別具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA與具有穩定雙螺旋結構之cfDNA之間與探針的不同結合反應。根據此等結果,已發現具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA不僅可結合至對受損DNA序列具有特異性之探針,而且可結合至能夠特異性結合至其周邊DNA序列之探針。另外,已證實可僅用探針中之一種偵測不穩定cfDNA。
在下文中,將藉助於以下實例更詳細地描述本發明。然而,以下實例僅意欲說明本發明,且本發明之範圍不僅限於此。I . 實驗方法 , 及奈米線、標記物及探針之產生 實驗方法1 . 用於偵測不穩定cfDNA 之方法 步驟1 : 樣品之製備及奈米線之添加
在接收患者之血漿、尿液、唾液、痰液或類似物後,立即在4℃下以3,000×g進行離心,持續10分鐘。將患者之血漿、尿液、唾液、痰液或類似物以某一比率稀釋於DPBS中。在血漿之情況下,將30 μl血漿與120 μl DW混合,且置於核酸純化管柱(G型或Q型)中。向其中添加PEI/Ppy奈米線(20 μl),且在室溫下使用恆溫混勻儀以1,200 rpm之速度進行混合,持續20分鐘。步驟 2 :真空 / 洗滌 / 溫度變性
將核酸純化管柱安裝於真空抽吸裝置上,且隨後以550毫巴進行抽吸。向其中添加400 μl 1×DPBS,且再次進行抽吸。再一次重複相同過程。僅有經由2步過程獲取之奈米線-DNA複合物截留於核酸純化管柱中。若需要溫度變性,則將已完成抽吸之核酸純化管柱置於預加熱至95℃之加熱塊中,在95℃下培育1分鐘,且隨後立即自其中取出。不需要溫度變性步驟之樣品不經歷此過程。步驟 3 :探針及HRP /STR NP 之 添加
將適於每一實驗之探針(200 μl)及HRP/STR NP之溶液(200 μl)分別置於核酸純化管柱中。在室溫下使用恆溫混勻儀以850 rpm至1,000 rpm之速度進行混合,持續30分鐘。將核酸純化管柱安裝於真空裝置上,且隨後進行抽吸。向其中添加400 μl 1×DPBS且再次進行抽吸。再一次重複相同過程。步驟 4 :用於偵測基因突變之 TMB 反應
在將收集管用新收集管置換之後,使用注射泵將200 μl乙酸鈉緩衝液(0.2 M,pH 7.0)及50 μl H2O2 (0.1 M)依序添加至核酸純化管柱中。隨後,進行培育,持續3分鐘。在培育結束時,將核酸純化管柱以3,500 rpm至5,000 rpm之速度離心,持續30秒。將收集於該收集管中之溶液以每孔200 μl轉移至96孔,且隨後使用UV/VIS分光光度計來量測500 nm至850 nm波長範圍下之吸光度。產生實例 1 . 帶正電奈米線之產生
如圖1中所示出,產生具有其上結合呈陽離子聚合物形式之聚乙亞胺(PEI)之表面的奈米線。使用Q150T模組化塗佈系統(Quorum Technologies, UK),在5×10-3
毫巴及50 mA下用金(Au)層(厚度為約150 nm)塗佈陽極氧化鋁(AAO)之一側,持續600秒。在所有電化學實驗中,使用配備有鉑絲相對電極及Ag/AgCl (3.0 M NaCl型)參考電極之恆電位器/恆電流儀(BioLogic SP-150),用塗佈金(Au)之AAO模板進行量測。
為了產生表面經陽離子聚合物處理之奈米線(PEI/Ppy NW),藉由與含有0.01 M聚(4-苯乙烯磺酸)及1 mg/ml生物素之0.01 M吡咯溶液一起,向AAO模板之孔隙施加1.0 V (相對於Ag/AgCl)下之時間電流滴定法(chronoamperometry)持續7分鐘,進行電化學沈積。
將所得AAO模板用蒸餾水洗滌數次,浸沒於2 M氫氧化鈉(NaOH)溶液中持續3小時,且隨後置於Bioruptor UCD-200 (Diagenode)中以便進行音波處理,使得獲得摻雜有生物素分子之獨立Ppy NW。隨後,向所得奈米線添加30 mM N-(3-二甲胺基丙基)-N-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及6 mM N-羥基丁二醯亞胺(NHS),使得羧酸(-COOH)基經活化。隨後,在添加PEI溶液之後,使反應在室溫下進行1小時,且用水進行洗滌。具有其上結合聚乙亞胺之表面的奈米結構(PEI/Ppy NW)分散於去離子水中,且保持在室溫下直至使用。
在此產生方法之情況下,在選擇性溶解AAO模板之後,每一聚吡咯(Ppy)奈米線自AAO模板釋放,且陽離子分支鏈聚乙亞胺(PEI) (25 kDa)經由生物素-鏈黴抗生物素蛋白相互作用另外與奈米線結合。產生實例2 . 表面經陽離子聚合物處理之奈米粒子 (PEI /Ppy NP ) 的產生
為了產生具有其上結合聚乙亞胺之表面的奈米粒子(PEI/Ppy NP),將0.2 g聚乙烯吡咯啶酮(PVP)添加至12.5 ml三重蒸餾水中且攪拌30分鐘。隨後,向其中添加65 μl吡咯,且隨後將所得物再攪拌10分鐘。隨後,向其中添加0.5 ml濃度為0.75 g/ml之FeCl3
溶液,且使反應進行10分鐘。其後,向其中添加20 ml玻尿酸水溶液(400 mg/20 ml),且將所得物攪拌3小時。
使用具有50,000 MWCO孔隙尺寸之膜相對於三重蒸餾水進行透析,持續2天。以1,200 rpm進行離心,持續3分鐘,以移除大型粒子聚集體,且隨後將所得物凍乾。將200 μg Ppy-HA-NP添加至1 ml三重蒸餾水中。隨後,向其中添加100 mM EDC/50 mM NHS溶液,且使反應進行45分鐘,使得玻尿酸之羧基經活化。以15,000 rpm進行離心,持續10分鐘,以移除上清液,在離心期間進行二次洗滌。
隨後,向其中添加100 mg/ml PEI溶液(溶劑:0.2 M碳酸氫鈉),且使反應在4℃下進行隔夜。隨後,以15,000 rpm進行離心,持續10分鐘,以移除上清液,且隨後將所得物保持在三重蒸餾水中。使用掃描電子顯微鏡觀測具有其上結合聚乙亞胺之表面之奈米粒子(PEI/Ppy NP)的形狀。如圖6A中所示出,用掃描電子顯微鏡影像(200 μm比例尺)檢查結合至PEI之平均50 nm之奈米粒子(NP)的形狀。產生實例 3 . 經 HRP 及鏈黴抗生物素蛋白標記之聚吡咯奈米粒子的產生
為了產生含有HRP及鏈黴抗生物素蛋白之奈米粒子,將0.5 g聚乙烯吡咯啶酮(PVP)添加至12.5 ml三重蒸餾水中且攪拌30分鐘。隨後,向其中添加65 μl吡咯,且將所得物再攪拌10分鐘。其後,向其中添加0.5 ml濃度為0.75 g/ml之FeCl3
溶液,且使反應進行3小時。隨後,向其中添加20 ml玻尿酸水溶液(400 mg/20 ml),且將所得物攪拌3小時。
使用具有50,000 MWCO孔隙尺寸之膜相對於三重蒸餾水進行透析,持續2天。以1,200 rpm進行離心,持續3分鐘,以移除大型粒子聚集體,且隨後將所得物凍乾。將200 μg含有聚吡咯及玻尿酸之Ppy-HA-NP添加至1 ml三重蒸餾水中。隨後,向其中添加100 mM EDC/50 mM NHS溶液,且使反應進行45分鐘,使得玻尿酸之羧基經活化。以15,000 rpm進行離心,持續10分鐘,以移除上清液,在離心期間進行二次洗滌。將1 mg HRP及1 mg鏈黴抗生物素蛋白添加至Ppy-HA-NP中,且在4℃之溫度下混合。隨後,以15,000 rpm進行離心,持續10分鐘,以移除上清液,且隨後將所得物保持在三重蒸餾水中。使用掃描電子顯微鏡觀測具有其上結合HRP及鏈黴抗生物素蛋白之表面之奈米粒子(HRP/st標記NP)的形狀(圖4)。產生實例 4 . 探針之產生
產生探針以偵測具有不穩定雙螺旋結構之cfDNA。視待偵測之cfDNA而定,以不同方式產生探針。此處,產生呈生物素與其結合之形式的探針。按二種類型產生探針,亦即,互補結合至含有引起不穩定雙螺旋結構之受損DNA之區的第一探針(下文中稱作CP),及互補結合至受損DNA之周邊區的第二探針(下文中稱作DP)。II . 使用二種探針偵測 cfDNA 實例 1 . 對存在於尿液中之 HPV 源性 cfDNA 之分析
為了自尿液樣品分離細胞游離HPV DNA,將實例1中所產生之10 μg/ml表面經陽離子聚合物處理之奈米線(PEI/Ppy NW)添加至來自HPV陽性患者之200 μl尿液中,且在室溫下進行混合,持續30分鐘。將經分離cfDNA在95℃下變性1分鐘。隨後,向其中以1 pM添加端部結合生物素之第一探針(CP)及第二探針(DP),且使反應在37℃下進行1小時。隨後,將經辣根過氧化酶(HRP)及鏈黴抗生物素蛋白標記之聚吡咯奈米粒子(下文中稱作HRP/st標記NP)添加至樣品中,且在37℃下進行培育,持續30分鐘。
隨後,向HPV源性cfDNA中添加25 μl 10 mM 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)、25 μl 0.1 M H2O2及200 μl 0.2 M三水合乙酸鈉緩衝液(pH 5.0)。使得與DNA樣品在室溫下在暗處一起反應3分鐘。為了鑑別HPV DNA濃度與吸光度之間的相關度,使用DU 730 UV-Vis分光光度計(Beckman Coulter, USA)在652 nm之波長下進行UV-Vis偵測。
另外,進行無PCR比色檢定,以評估HPV陽性子宮頸癌患者(HPV16(+)及HPV18(+))及HPV陰性健康對照(HPV-)之尿液樣品。使用PBS作為陰性對照。因此,如圖12中所示出,將使用奈米線分離之目標HPV DNA與CP及DP混合,且向其中添加HRP/st標記NP。隨後,觀測顏色變化。在95℃下進行變性,持續1分鐘,以便分析經分離cfDNA。
收集且測試總共24個HPV陽性及HPV陰性尿液樣品。因此,鑑別出自HPV陽性子宮頸癌患者(HPV16(+)及HPV18(+))及HPV陰性健康對照(HPV-)之尿液分離的cfDNA不同吸光度值(圖13)。此處,使用特異性結合至HPV16或HPV18之探針,且在95℃下進行變性,持續1分鐘,以便分析經分離cfDNA。
另外,當使用諸如EGFR 19及EGFR 21之非HPV探針時,未觀測到反應;且發現顏色變化及UV吸光度變化作為目標HPV與其互補探針之間類型特異性結合的結果出現(圖14)。此處,在95℃下進行變性,持續1分鐘,以便分析經分離cfDNA。實例2 . 經由對肺癌細胞株之DNA 分析鑑別EGFR 基因之突變 實例 2 . 1 . 鑑別可經奈米線獲得之 cfDNA 的大小
將低範圍(10 bp至100 bp)、中等範圍(100 bp至2 kb)及高範圍(3.5 kb至21 kb)之DNA梯狀條帶添加至正常個體之血漿中,且隨後使用奈米線(PEI/Ppy NW)檢查捕獲效率。鑑別出奈米結構高效捕獲小型DNA (圖15)。
使用奈米線,自H1975 (具有EGFR外顯子20 T790M、21 L858R基因突變之細胞株)、HCC2279 (具有EGFR外顯子19缺失基因突變之細胞株)及A549細胞株(不具有EGFR外顯子基因突變之細胞株)獲得基因。隨後,使用未經歷音波處理之基因組DNA (gDNA)及已經歷音波處理之片段化DNA (fDNA)來比較由奈米結構捕獲之效率。因此,鑑別出當使用奈米結構時,與gDNA相比,針對fDNA觀測到較高捕獲效率(圖16及圖17)。實例 2 . 2 . 經由對不穩定 cfDNA 之分析偵測 EGFR 突變
進行無比色檢定PCR,以使用奈米結構自EGFR外顯子20、21陽性H1975細胞株,EGFR外顯子19陽性HCC2279細胞株及不具有EGFR基因突變之A549細胞株分離gDNA及fDNA。其後,向其中添加針對EGFR外顯子19、20及21之探針,且進行混合。隨後,向其中添加HRP/st標記NP,且觀測顏色變化。因此,有可能鑑別出與gDNA相比,奈米結構捕獲小型DNA,亦即,fDNA有效得多,且存在清楚的顏色變化及UV-Vis光譜變化(圖18及圖19)。實例 2 . 3 . 使用螢光染料偵測 cfFNA
為了鑑別是否可使用目標探針自肺癌患者之血漿樣品偵測到基因突變,藉由使用螢光染料檢查此類可能性。使H1975 (具有EGFR外顯子20 T790M、21 L858R基因突變之細胞株)、HCC2279 (具有EGFR外顯子19缺失基因突變之細胞株)及A549細胞株(不具有EGFR外顯子基因突變之細胞株)經歷音波處理,且隨後經奈米線捕獲所獲取之DNA (fDNA)。隨後,將fDNA在95℃下變性1分鐘,且隨後與對EGFR19、20及21具有特異性之探針混合。使用結合至探針之螢光染料(Alexa488)檢查細胞株之基因突變。
因此,在A549細胞株中,當與針對EGFR 19及21之探針反應時,未偵測到螢光。然而,有可能在H1975及HCC2279中偵測關於針對EGFR 19及20之探針的螢光(圖20)。實例2 .4 . 經由對cfDNA 之活體外分析鑑別EGFR 基因突變之偵測極限 (LOD )
使H1975 (具有EGFR外顯子20 T790M、21 L858R基因突變之細胞株)及HCC2279 (具有EGFR外顯子19缺失基因突變之細胞株)經歷音波處理,且隨後將各種濃度之所獲取之片段化DNA (fDNA;1 ag ml-1至100 ng ml-1)添加至健康人類之血漿(200 μl)中。隨後,經奈米線捕獲fDNA。其後,在95℃下進行變性,持續1分鐘,且隨後使用對EGFR外顯子19 Del及EGFR外顯子20 T790M具有特異性之探針,及HRP/st標記NP檢查偵測極限(LOD)。因此,鑑別出當應用3倍信雜比時,HCC2279細胞株之fDNA直至10 ag ml-1可偵測,且H1975細胞株之fDNA直至100 ag ml-1可偵測(圖21及圖22)。實例3 . 經由對存在於血漿或腦脊髓液樣品中之cfDNA 之分析鑑別EGFR 、KRAS 及ALK -EML4 基因的突變 : 肺癌患者 實例 3 . 1 . 經由對不穩定 cfDNA 之分析鑑別 EGFR 基因中之突變
在一實施例中,需要總共60分鐘以使用奈米結構自癌症患者之體液樣品分離cfDNA,且經由雜交至探針及後續結合至HRP/st標記奈米粒子偵測基因突變(圖6)。
為了自血漿或腦脊髓液樣品分離cfDNA,將200 μl EGFR陽性患者之血漿與5 μg/ml PEI/Ppy NW在室溫下混合30分鐘,以自患者之血漿提取cfDNA。藉由生物分析儀分析使用PEI/Ppy NW自200 μl肺癌患者之血漿提取之cfDNA的大小(圖23)。一般而言,類似於已知癌症相關cfDNA之平均大小為166 bp的事實,鑑別出作為本生物分析儀實驗中使用PEI/Ppy NW自肺癌患者之血漿提取cfDNA的結果,在169 bp處觀測到峰。
隨後,將奈米結構中所捕獲之DNA在95℃下變性1分鐘,向其中以1 pM添加結合生物素之CP及結合生物素之DP,且使反應在37℃下進行1小時。隨後,將經HRP及鏈黴抗生物素蛋白標記之聚吡咯奈米粒子(HRP/st標記NP)添加至樣品中,且使反應在37℃下進行30分鐘。
其後,向反應溶液中添加25 μl 10 mM TMB、25 μl 0.1 M H2O2及200 μl 0.2 M三水合乙酸鈉緩衝液(pH 5.0)。隨後,阻斷光且使反應在室溫下進行3分鐘。其後,使用DU 730 UV-Vis分光光度計(Beckman Coulter, USA)在652 nm之波長下進行UV-Vis偵測。
在此實驗中,除非另外說明,否則EGFR外顯子19缺失-探針1 (目標特異性)、EGFR外顯子20 T790M-探針2 (目標特異性)及EGFR外顯子21 L858R-探針2 (目標特異性)用作CP及DP。因此,鑑別出視偵測探針而定,特異性偵測到經分離EGFR突變cfDNA (圖24及圖25)。鑑別出當將自具有EGFR外顯子19缺失、20 T790M或21 L858R基因突變之肺癌患者之血漿捕獲的cfDNA分別與靶向EGFR外顯子19缺失、20 T790M或21 L858R之探針,及結合HRP/鏈黴抗生物素蛋白之奈米粒子(NP)反應時,在使用靶向與患者之組織中相同之基因突變的探針時,展現顏色變化及UV-Vis光譜變化(圖24)。
另外,使自具有另一EGFR突變之肺癌患者捕獲的cfDNA與靶向EGFR 19、20及21之相同探針反應。因此,鑑別出在使用靶向與患者之組織中相同之基因突變的探針時,展現顏色變化及UV-Vis光譜變化(圖25)。實例3 .2 . 經由對cfDNA 之分析鑑別KRAS 及ALK -EML4 基因中之突變
此外,類似於EGFR,為了分析KRAS及ALK-EML4基因中之突變,自血漿或腦脊髓液樣品分離cfDNA,且隨後將所捕獲之DNA在95℃下變性1分鐘。向其中以1 pM添加結合生物素之CP及結合生物素之DP,且使反應在37℃下進行1小時。隨後,將經HRP及鏈黴抗生物素蛋白標記之聚吡咯奈米粒子添加至樣品中,且使反應在37℃下進行30分鐘。
因此,有可能鑑別出自具有KRAS外顯子2基因突變及ALK-EML4融合基因突變之肺癌患者之血漿分離的cfDNA對針對KRAS外顯子2之探針及針對ALK-EML4探針起反應,且因此展示匹配患者之組織的顏色變化及UV吸光度(圖26至圖28)。用於偵測具有KRAS外顯子2突變(圖26及圖27)及ALK-EML4變異體1及3 (圖28)之cfDNA之探針(CP及DP)的序列展示於以下表4中。
[表4] 實例 3 . 3 . 藉由溫度變性鑑別非特異性反應
將表3中三種類型之探針中之每一者(亦即,包括目標特異性或目標非特異性探針)添加至具有EGFR外顯子19缺失及20 T790M基因突變之肺癌患者的血漿中,且進行混合。因此,在95℃+下DNA變性1分鐘之後,類似於組織,所使用之所有探針(亦即,無論探針係目標特異性或目標非特異性)僅針對EGFR外顯子19缺失及20 T790M展示顏色及UV吸光度之變化,其使得有可能鑑別特定基因突變(圖29)。然而,針對EGFR外顯子21,無關於探針之類型未觀測到顏色及UV吸光度的變化。此表明不穩定cfDNA對對EGFR外顯子19及EGFR外顯子20中之突變具有特異性之探針起反應,且此允許對基因突變進行分析。
另外,自不具有EGFR基因中之突變之肺癌患者的血漿獲得cfDNA。在95℃下分別變性1分鐘及10分鐘之後,檢查對EGFR 19、20及21中之突變具有特異性之探針與不穩定cfDNA之間的結合。因此,在95℃下變性1分鐘之情況下,針對不具有EGFR基因中之突變的肺癌患者,未觀測到顏色變化及UV吸光度變化。然而,在95℃下變性10分鐘之情況下,在針對EGFR外顯子19、20及21之所有探針中均可觀測到經由非特異性雜交引起之顏色變化及UV吸光度變化(圖30)。
另外,經奈米線自具有EGFR 19缺失及20 T790M基因突變之其他肺癌患者及正常個體的血漿捕獲cfDNA。隨後,經由在95℃下分別變性0、1及10分鐘,檢查其與針對EGFR 19、20及21之探針的雜交反應性。因此,如圖31至圖33中所示出,在不具有EGFR基因中之突變之正常個體的情況下,在95℃下分別變性0分鐘(圖31)及1分鐘(圖32)之情況下未觀測到顏色變化及UV吸光度變化。然而,經由在95℃下變性10分鐘(圖33),在針對EGFR外顯子19、20及21之所有探針中均觀測到經由非特異性雜交引起之顏色變化及UV吸光度變化。因此,鑑別出cfDNA中之基因突變可在不變性之情況下分析。實例4 . 用於經由對肺癌患者之樣品的分析偵測不穩定cfDNA 之方法之準確度的鑑別
在本發明之一實施例中,鑑別出藉由分析對獲自151名肺癌患者之血漿之cfDNA中之基因突變的特異性及靈敏度而獲得的結果匹配患者之癌症組織中之基因突變結果(圖34)。將對EGFR外顯子19 Del具有特異性之探針添加至不具有EGFR中之突變之肺癌患者(EGFR野生型)、具有EGFR外顯子19缺失(Del)之肺癌患者及具有EGFR外顯子21 L858R之肺癌患者的cfDNA中,且經由對UV光譜之吸光度值(ΔOD,500 nm至650 nm)之分析,檢查所產生之基因突變。因此,鑑別出所獲得之結果展示對患者之癌症組織中之基因突變之結果的98.4%匹配(圖35及圖36)。
另外,將針對EGFR外顯子21 L858R之探針添加至不具有EGFR中之突變之肺癌患者、具有EGFR外顯子19缺失(Del)之肺癌患者及具有EGFR外顯子21 L858R之肺癌患者的cfDNA中,且經由對UV光譜之吸光度值(ΔOD,500 nm至650 nm)之分析,檢查所產生之基因突變。因此,鑑別出所獲得之結果展示對患者之癌症組織中之基因突變之結果的98.0%匹配(圖37及圖38)。實例 5 . 使用帶正電奈米粒子偵測 cfDNA
類似於上述EGFR實驗,為了自具有EGFR 19缺失(Del)基因突變之肺癌患者的血漿樣品分離cfDNA,將產生實例中所產生之結合PEI的奈米粒子(PEI-Ppy NP,5 μg/ml)添加至200 μl EGFR陽性患者之血漿中,且在室溫下混合30分鐘。其後,所捕獲之DNA不變性或在95℃下變性1分鐘。隨後,向其中以1 pM添加結合生物素之CP及結合至生物素之DP,且在37℃下進行培育,持續30分鐘。其後,將HRP/st標記NP添加至樣品中,且使反應在37℃下進行15分鐘。鑑別出僅在對EGFR 19具有特異性之探針中觀測到經由TMB之氧化反應引起之UV-Vis光譜中的吸光度變化(圖39)。實例6 . 經由對存在於血漿中之cfDNA 的分析鑑別EGFR 基因中之突變
使用H1975細胞株(具有EGFR外顯子20 T790M及21 L858R基因突變),藉由音波處理製備fDNA。其後,向其中添加藉由產生實例中之方法產生的具有其上結合聚離胺酸之表面的奈米結構(PLL/Ppy NW),且隨後進行無PCR比色檢定(圖40)。使用奈米線分離EGFR外顯子20、21陽性H1975細胞株之fDNA。隨後,向其中添加針對EGFR外顯子19、20及21之探針,且使反應進行。其後,向其中添加HRP/st標記NP,且隨後觀測顏色變化。如圖40中所示出,僅在EGFR 20及EGFR 21中有可能鑑別清楚的顏色變化及UV-Vis光譜變化。III . 使用單一探針偵測不穩定 cfDNA 實例 7 . 僅使用僅能夠結合至受損部分之探針偵測不穩定 cfDNA
自肺癌患者之血漿樣品分離cfDNA。隨後,為了偵測基因突變,摻合使用二種類型之探針,亦即,CP及DP。如圖41至圖43中所示出,為了偵測EGFR外顯子19缺失、外顯子20 T790M及外顯子21 L858R基因突變,將作為對含有以上區之cfDNA具有特異性之探針的CP_1 (EGFR外顯子19缺失)、CP2 (EGFR外顯子20 T790M)及CP2 (EGFR外顯子21 L858R)與DP摻合使用。
然而,如圖44中所示出,即使當添加不含DP之單獨CP時,有可能鑑別出與患者之癌症組織中之結果(EGFR外顯子19缺失)相同的EGFR外顯子19缺失基因突變結果。IV . 視樣品處理方法而定之不穩定 cfDNA 之可偵測性的鑑別 實例 8 . 視用去氧核糖核酸酶或核糖核酸酶進行之處理而定之不穩定 cfDNA 之可偵測性的鑑別
首先將肺癌患者之血漿樣品用去氧核糖核酸酶或核糖核酸酶處理,且隨後使用奈米結構自其分離cfDNA以鑑別基因突變。如圖45中所示出,在將具有EGFR外顯子19缺失基因突變之肺癌患者的血漿使用核糖核酸酶A預處理之後,用奈米線自其獲得cfDNA,且隨後使cfDNA與針對EGFR外顯子19 del之探針反應。因此,鑑別出與患者之癌症組織中之結果相同的EGFR外顯子19缺失基因突變之UV-vis峰,如同對照(對照cfDNA)。然而,有可能鑑別出在用去氧核糖核酸酶I預處理之後,歸因於cfDNA已降解之可能性未觀測到UV吸光度(圖45)。
類似地,如圖46中所示出,在將具有EGFR外顯子20 T790M基因突變之肺癌患者的血漿用核糖核酸酶A預處理之後,用奈米線自其獲得cfDNA,且隨後使cfDNA與針對EGFR外顯子20 T790M之探針反應。因此,鑑別出與患者之癌症組織中之結果相同的EGFR外顯子20 T790M基因突變之UV吸光度。然而,有可能鑑別出在用去氧核糖核酸酶I處理後未觀測到UV吸光度(圖46);且此係歸因於cfDNA已藉由向患者之血漿添加去氧核糖核酸酶I而降解的可能性。V . 視標記物而定之 cfDNA 之可偵測性的鑑別 實例 9 . 使用 HRP / 鏈黴抗生物素蛋白複合物鑑別 cfDNA 之可偵測性
如圖47中所示出,自具有EGFR外顯子19缺失及外顯子20 T790M基因突變之肺癌患者的血漿提取cfDNA,使cfDNA與針對EGFR外顯子19 Del、20 T790M及21 L858R之探針,及HRP/st標記NP反應,且隨後利用UV吸光度及顏色變化,鑑別出與患者之癌症組織中之結果相同的EGFR外顯子19缺失及外顯子20 T790M基因突變結果。
然而,如圖48中所示出,當自相同患者之血漿提取cfDNA,且隨後使cfDNA與針對EGFR外顯子19 Del、20 T790M、21 L858R之探針,及代替HRP/st標記NP之HRP-鏈黴抗生物素蛋白複合物(其中HRP與鏈黴抗生物素蛋白以1:1結合至彼此)反應時,觀測到完全不同於患者之癌症組織中之結果的基因突變結果。發現當使用HRP/鏈黴抗生物素蛋白複合物代替HRP/鏈黴抗生物素蛋白標記奈米粒子(NP)時,觀測到歸因於增加之非特異性結合的不精確基因突變結果。
如圖49中所示出,對藉由自具有EGFR外顯子19缺失及外顯子20 T790M基因突變之5名肺癌患者之血漿提取cfDNA,且隨後使cfDNA與針對EGFR外顯子19 Del、20 T790M及21 L858R之探針,及HRP/st標記NP反應,且與針對EGFR外顯子19 Del、20 T790M及21 L858R之探針,及代替HRP/st標記NP之HRP/鏈黴抗生物素蛋白複合物(其中HRP與鏈黴抗生物素蛋白以1:1結合至彼此)反應而獲得的結果進行分析。因此,鑑別出經奈米線獲得之cfDNA歸因於由探針及HRP/st標記NP與其之結合引起的反應特異性提高,展示匹配癌症組織之UV吸光度。另外,鑑別出即使在具有EGFR外顯子20 T790M及21 L858R基因突變之5名肺癌患者的血漿中,HRP/st標記NP亦在確定基因突變中起重要作用。VI . 使用其中探針與標記物結合至彼此之複合物偵測 cfDNA 實例10 . 使用結合至HRP /st 標記NP 之探針偵測基因突變
如圖50中所示出,將HRP/st標記NP首先結合至對EGFR外顯子19 Del、20 T790M及21 L858R具有特異性之探針,以產生呈探針-HRP標記物形式之結合產物,且使cfDNA與此類結合產物反應,而非使cfDNA與探針及HRP/st標記NP分別依序反應;且因此,鑑別出即使在具有EGFR外顯子20 T790M及21 L858R基因突變之肺癌患者的肋膜積液中,亦偵測到與癌症組織相同的基因型。VII . 視混合順序而定之 cfDNA 的偵測 實例 11 . 經由同時混合探針與標記物鑑別不穩定 cfDNA 之偵測
如圖51中所示出,將cfDNA與探針及HRP/st標記NP全部一次混合,且使反應進行,而非使cfDNA與CP及DP探針及HRP/st標記NP分別依序反應;且因此,鑑別出即使在具有EGFR外顯子20 T790M及21 L858R基因突變之肺癌患者的血漿中,亦偵測到與癌症組織相同的基因型。另外,如圖52中所示出,將cfDNA與CP及DP探針及HRP/st標記NP全部一次混合,且使反應進行;且因此,鑑別出即使在具有ALK-EML4融合及ALK點突變(I1171N/T)基因突變之肺癌患者的血漿中,亦偵測到與癌症組織相同的基因型。VIII . 視樣品變性條件而定之不穩定cfDNA 的偵測 實例12 . 視溫度條件而定之樣品變性後的cfDNA 偵測
進行實驗,以鑑別是否可視樣品變性條件而定,將不穩定cfDNA與穩定cfDNA彼此區分開。具體而言,使用能夠偵測EGFR 19缺失之探針,使自正常個體及肺癌患者(0208-343,20190311_LC#1,來自組織之結果:E19del)收集之血漿經歷各種變性條件,且隨後檢查是否可將不穩定cfDNA與穩定cfDNA彼此區分開。
對於探針而言,使用ggaattaaga gaagcaacat ctcc (SEQ ID NO: 9),其為能夠偵測EGFR外顯子19缺失之探針。此處,使用結合生物素之探針。使用PEI/Ppy奈米線,且其中聚集HRP/鏈黴抗生物素蛋白之奈米粒子用作標記物。
具體而言,在將cfDNA與奈米線分離之前,將樣品在如下之各種條件下處理。將樣品在30℃下分別加熱15分鐘及0分鐘。另外,將樣品在60℃下分別加熱5分鐘及0分鐘。另外,將樣品在95℃下分別加熱1分鐘及0分鐘。其他步驟以如圖8中所示意之方法進行。
因此,在不具有EGFR 19缺失突變之正常個體中,在變性條件中之任一者下未偵測到不穩定cfDNA (圖54)。然而,在E19del患者中,鑑別出在所有不同變性條件下偵測到不穩定cfDNA (圖55)。根據此等結果,經由存在或不存在不穩定cfDNA,有可能提供肺癌患者具有E19del突變之資訊。實例 13 . 視溫度條件而定之細胞株源性不穩定 cfDNA 的偵測
如在獲自人體之樣品中,進行實驗以鑑別細胞株內存在之突變位置。具體而言,fDNA之大小類似於獲自HCC2279 (外顯子19Del)、HCC827 (外顯子19Del)、H1975 (T790M、L858R)及A549 (EGFR野生型)中之每一者的cfDNA。具體而言,藉由實例2中之方法獲得fDNA。
因此,鑑別出在95℃下分別加熱1分鐘及0分鐘之變性條件下,僅不穩定cfDNA特異性結合至探針且被偵測到處於結合至標記物之狀態(圖56)。根據此等結果,證實有可能鑑別出亦可在獲自細胞株之樣品中鑑別是否存在不穩定cfDNA。實例 14 . 視經去氧核糖核酸酶處理而定之不穩定 cfDNA 的偵測
為了鑑別不穩定cfDNA與穩定cfDNA是否不僅視溫度條件而且視DNA降解酶而定而不同,使不穩定cfDNA及穩定cfDNA經歷用去氧核糖核酸酶進行之處理,且隨後檢查其與探針之反應性。此處,樣品不經歷使用高溫之變性。
具體而言,將使用PEI/Ppy奈米線自HCC2279 (外顯子19Del)、HCC827 (外顯子19Del)、H1975 (T790M、L858R)及A549 (EGFR野生型)中之每一者獲得的fDNA懸浮於PBS中,且隨後用1 μl去氧核糖核酸酶處理。作為37℃下處理30分鐘之結果,鑑別出不穩定cfDNA與穩定cfDNA就與探針之反應性而言不同(圖57)。另外,鑑別出即使當用去氧核糖核酸酶進行之處理在37℃下進行60分鐘時,展現相同效果(圖58)。基於此等結果,有可能鑑別出穩定cfDNA不容易由去氧核糖核酸酶降解。
然而,作為在37℃下用1 μl或2 μl去氧核糖核酸酶處理120分鐘之結果,鑑別出當延長用去氧核糖核酸酶進行之處理的時間或使用增加量之去氧核糖核酸酶時,穩定cfDNA亦對探針起反應(圖59)。根據此等結果,有可能鑑別不穩定cfDNA與穩定cfDNA之間穩定性的差異。
另外,為了鑑別不穩定cfDNA與穩定cfDNA之間視去氧核糖核酸酶之活性而定的差異,在圖60中示出藉由在24℃下用1 μl或2 μl去氧核糖核酸酶處理120分鐘所獲得的結果。因此,儘管酶活性在24℃下降低,但鑑別出不穩定cfDNA與穩定cfDNA就與探針之反應性而言不同(圖60)。
另外,為了鑑別不穩定cfDNA與穩定cfDNA之間視去氧核糖核酸酶之活性而定的差異,在圖58中示出藉由在3℃下用1 μl或2 μl去氧核糖核酸酶處理120分鐘所獲得的結果。因此,儘管酶活性在3℃下降低,但鑑別出不穩定cfDNA與穩定cfDNA就與探針之反應性而言不同(圖61)。
圖1示出帶正電奈米線(PEI/Ppy NW)之掃描電子顯微鏡(SEM)影像。
圖2示出帶正電奈米線(PEI/Ppy NW)之穿透電子顯微鏡(TEM)影像。
圖3示出由掃描電子顯微鏡影像表示之奈米結構(PLL/Ppy NW)的表面,其上結合呈陽離子聚合物形式之聚離胺酸(PLL)。
圖4示出結合HRP/鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)之奈米粒子的掃描電子顯微鏡影像。
圖5示出直徑為50 nm之結合PEI之奈米粒子(PEI/Ppy NP)的掃描電子顯微鏡(SEM)影像。
圖6示出一種方法之示意圖,在該方法中,使用表面上結合聚乙亞胺(PEI)之奈米線(PEI/Ppy NW)自患者之體液獲得cfDNA,且隨後經由與探針及HRP/鏈黴抗生物素蛋白標記奈米粒子(HRP/st標記NP)之反應在60分鐘內分析基因突變。
圖7示意地示出一種用於使用奈米線、探針及HRP/鏈黴抗生物素蛋白標記奈米粒子偵測不穩定cfDNA之方法。
圖8在時序流中示出一種用於偵測諸如血液、腦脊髓液或肋膜積液之樣品中之不穩定cfDNA的方法。
圖9在時序流中示出一種用於偵測諸如尿液之樣品中之不穩定cfDNA的方法。
圖10示意地示出視自血液獲取之cfDNA之狀態而定的變性條件之差異。
圖11示意地示出視自尿液、唾液及痰液獲取之cfDNA之狀態而定的變性條件之差異。
圖12示出藉由自子宮頸癌患者之尿液樣品及正常個體之尿液樣品獲得cfDNA,且隨後使用HPV 18或HPV 16探針偵測cfDNA中是否存在基因突變而獲得的結果。
圖13示出藉由經吸光度鑑別HPV陽性子宮頸癌患者(HPV16 (+)及HPV18 (+))及HPV陰性之健康對照(HPV-)之尿液中存在的cfDNA,與對HPV 18或HPV 16具有特異性之探針之間的結合而獲得的結果。
圖14示出藉由使自子宮頸癌患者之尿液分離之cfDNA經歷與對HPV 16、EGFR19缺失、HPV 18及EGFR 21 L858R具有特異性之探針的依序反應,且隨後鑑別cfDNA與每一探針之間的結合而獲得的結果。
圖15示出藉由向正常個體之血漿中添加低範圍(10 bp至100 bp)、中等範圍(100 bp至2 kb)及高範圍(3.5 kb至21 kb)之DNA梯狀條帶(ladder),且隨後在使用PEI/Ppy NW捕獲DNA梯狀條帶情況下評估捕獲效率而獲得的結果。
圖16示出藉由鑑別藉由在不進行音波處理之情況下降解A549細胞株(泳道1及2)、HCC2279細胞株(泳道3及4)及H1975細胞株(泳道5及6)獲得之細胞株基因組DNA (下文中稱作gDNA)的大小,及藉由對各細胞株之gDNA進行音波處理獲得之片段化DNA (下文中稱作fDNA)的大小而獲得的結果。
圖17示出藉由使用PEI/Ppy NW捕獲在不進行音波處理之情況下獲自A549細胞株、HCC2279細胞株及H1975細胞株之gDNA,及藉由對各別細胞株進行音波處理獲得之fDNA,且隨後評估捕獲效率而獲得的結果。
圖18及圖19示出藉由使用PEI/Ppy NW捕獲在不進行音波處理之情況下獲自A549細胞株、HCC2279細胞株及H1975細胞株之gDNA,及藉由對各別細胞株進行音波處理獲得之fDNA,且隨後藉由添加對EGFR 19 (19Del)、EGFR 20 (T790M)及EGFR 21 (L858R)具有特異性之探針鑑別顏色變化及UV-Vis光譜變化而獲得的結果。已鑑別僅fDNA選擇性結合至目標探針。
圖20示出藉由使用PEI/Ppy NW獲得H1975細胞株、HCC2279細胞株及A549細胞株之fDNA,且隨後使用結合至螢光染料之DNA探針分析基因突變而獲得的結果。
圖21示出藉由利用HCC2279 (EGFR外顯子19缺失基因突變)細胞之fDNA及對EGFR外顯子19缺失具有特異性之探針,且使用UV吸光度分析視fDNA濃度而定之fDNA與探針之結合而獲得的結果。經由此,已鑑別cfDNA之可偵測濃度。
圖22示出藉由利用H1975 (EGFR外顯子20 T790M及外顯子21 L858R基因突變)之fDNA及對EGFR外顯子20 T790M具有特異性之探針,且使用UV吸光度分析視fDNA濃度而定之fDNA與探針之結合而獲得的結果。經由此,已鑑別該cfDNA之可偵測濃度。
圖23示出藉由用生物分析儀分析使用PEI/Ppy NW自肺癌患者之200 μL血漿獲得之cfDNA而獲得的結果。根據文獻,已知癌症相關cfDNA之平均大小為166 bp。如生物分析儀資料中所展現,已鑑別使用PEI/Ppy NW自肺癌患者之血漿獲得之cfDNA展示位於169 bp處之峰。
圖24示出藉由鑑別在自具有EGFR基因突變之肺癌患者之血漿分離的cfDNA與特異性結合至EGFR外顯子19缺失(Del)或EGFR外顯子21 L858R之探針反應之情況下,展現與組織之基因型相同的顏色變化及UV吸光度而獲得的結果。
圖25示出藉由鑑別在自具有EGFR外顯子19缺失(Del)、EGFR外顯子20 T790M及EGFR外顯子21 L858R基因突變之肺癌患者之血漿分離的cfDNA與對EGFR外顯子19Del、EGFR外顯子20 T790M或EGFR外顯子21 L858R具有特異性之探針反應之情況下,展現與組織之基因型相同的顏色變化及UV吸光度而獲得的結果。
圖26及圖27示出藉由鑑別在使用PEI/Ppy NW自具有KRAS外顯子2基因突變之肺癌患者之血漿分離的cfDNA與對KRAS外顯子2具有特異性之探針反應之情況下,展現與組織之基因型相同的顏色變化及UV吸光度而獲得的結果。
圖28示出藉由鑑別在自具有ALK-EML4融合基因突變之肺癌患者之血漿分離的cfDNA與特異性結合至ALK-EML4之探針反應之情況下,展現與組織之基因型相同的顏色變化及UV吸光度而獲得的結果。
圖29示出在自具有EGFR外顯子19缺失及EGFR外顯子20 T790M基因突變之肺癌患者之血漿分離的cfDNA與特異性結合至EGFR外顯子19缺失或EGFR外顯子20 T790M之各種探針反應之情況下,展現匹配組織之顏色變化及UV吸光度。然而,根據結果,已鑑別無關於所使用之三種類型之探針,針對EGFR 21 L858R突變未觀測到顏色變化。因此,可見基因與探針之間的反應不限於特定探針,且任何探針可結合至具有突變之基因,只要該探針特異性結合至該基因即可。
圖30示出藉由使自不具有EGFR基因突變之肺癌患者(野生型,WT)之血漿分離的cfDNA分別經歷95℃下變性1分鐘及10分鐘,且隨後與針對EGFR外顯子19缺失、EGFR外顯子20 T790M或EGFR外顯子21 L858R之探針反應而獲得的結果。已鑑別自EGFR WT患者之血漿提取之cfDNA在95℃下變性1分鐘之情況下不展示與任何探針之反應;且另一方面,在95℃下變性10分鐘之後,cfDNA與所有探針非特異性反應。
圖31、圖32及圖33示出藉由經奈米線自具有EGFR外顯子19缺失及EGFR外顯子20 T790M基因突變之肺癌患者及正常個體的血漿捕獲cfDNA,使cfDNA分別經歷95℃下變性0分鐘(圖31)、1分鐘(圖32)及10分鐘(圖33),且隨後鑑別其與針對EGFR 19缺失、20 T790M或21 L858R之探針之反應而獲得的結果。
圖34示出藉由利用獲自151名肺癌患者之血漿的cfDNA,且分析肺癌患者中之基因突變而獲得的表。
圖35示出藉由自不具有EGFR突變之肺癌患者(野生型)、具有EGFR外顯子19缺失之肺癌患者及具有EGFR外顯子21 L858R之肺癌患者之血漿獲得cfDNA,將cfDNA與對EGFR外顯子19 Del具有特異性之探針混合,且隨後經由對UV光譜吸光度(ΔOD,500 nm至650 nm)值之分析鑑別肺癌患者中之基因突變而獲得的結果。
圖36示出藉由自具有EGFR外顯子19缺失之肺癌患者的血漿獲得cfDNA,將cfDNA與對EGFR外顯子19 Del具有特異性之探針混合,且隨後分析基因突變之特異度及靈敏度而獲得的結果。
圖37示出藉由自不具有EGFR突變之肺癌患者(野生型)、具有EGFR外顯子19缺失之肺癌患者及具有EGFR外顯子21 L858R之肺癌患者的血漿獲得cfDNA,向cfDNA中添加對EGFR外顯子21 L858R具有特異性之探針,且隨後經由對UV光譜吸光度(ΔOD,500 nm至650 nm)值之分析鑑別患者中之基因突變而獲得的結果。
圖38示出藉由自具有EGFR外顯子21 L858R之肺癌患者的血漿獲得cfDNA,向cfDNA中添加對EGFR外顯子21 L858R具有特異性之探針,且隨後分析患者中之基因突變的特異度及靈敏度而獲得的結果。
圖39示出藉由使使用PEI/Ppy NP自具有EGFR外顯子19缺失基因突變之肺癌患者之血漿分離的cfDNA與對EGFR外顯子19 Del (E19)、EGFR外顯子20 T790M (E20)或EGFR外顯子21 L858R (E21)具有特異性之探針反應,且因此鑑別觀測到匹配組織之UV吸光度而獲得的結果。
圖40示出藉由使用經聚離胺酸修飾之PLL/Ppy NW獲得具有EGFR外顯子20 T790M及EGFR外顯子21 L858R基因突變之H1975細胞株的fDNA,使fDNA與對EGFR外顯子19 Del、EGFR外顯子20 T790M或EGFR外顯子21 L858R具有特異性之探針反應,且隨後分析基因突變而獲得的結果。
圖41示出用於EGFR外顯子19缺失之CP及DP的序列。在此研究中,使用CP_1及DP分析肺癌患者中之cfDNA基因突變。此處,CP係指設計成特異性結合至含有突變部分或與突變部分相鄰之序列的探針,且DP係指設計成特異性結合至與突變序列間隔開之部分的探針。
圖42示出用於EGFR外顯子20 T790M之CP及DP的序列。在此研究中,使用CP2及DP分析肺癌患者中之cfDNA基因突變。
圖43示出用於EGFR外顯子21 L858R之CP及DP的序列。在此研究中,使用CP2及DP分析肺癌患者中之cfDNA基因突變。
圖44示出藉由自具有EGFR外顯子19缺失基因突變之肺癌患者的血漿獲得cfDNA,且隨後使用圖41至圖43中之EGFR外顯子19 CP_1、外顯子20 CP2及外顯子21 CP2且不使用DP分析基因突變而獲得的結果。
圖45示出藉由使具有EGFR外顯子19缺失之肺癌患者的血漿經歷用核糖核酸酶(RNase)及去氧核糖核酸酶(DNase)進行之處理,經PEI/Ppy奈米線獲得cfDNA,且使用對EGFR外顯子19缺失具有特異性之探針偵測不穩定cfDNA而獲得的結果。
圖46示出使具有EGFR外顯子20 T790M之肺癌患者的血漿經歷用核糖核酸酶及去氧核糖核酸酶進行之處理,經PEI/Ppy奈米線獲得cfDNA,且使用對EGFR外顯子20 T790M具有特異性之探針偵測不穩定cfDNA而獲得的結果。
圖47示出藉由使獲自具有EGFR外顯子19缺失及EGFR外顯子20 T790M基因突變之肺癌患者之血漿的cfDNA與對EGFR外顯子19缺失(Del19)、EGFR外顯子20 T790M及EGFR外顯子21 L858R具有特異性之探針反應,且隨後向其中添加HRP/鏈黴抗生物素蛋白奈米粒子(含有大量HRP),以用顏色變化及UV吸光度鑑別cfDNA之偵測而獲得的結果。
圖48示出藉由使獲自與圖47中相同之具有EGFR外顯子19缺失及EGFR外顯子20 T790M基因突變之肺癌患者之血漿的cfDNA與對EGFR外顯子19缺失(Del19)、EGFR外顯子20 T790M及EGFR外顯子21 L858R具有特異性之探針反應,且隨後向其中添加HRP/鏈黴抗生物素蛋白複合物(藉由HRP與鏈黴抗生物素蛋白之間以1:1結合而獲得的複合物),以用顏色變化及UV吸光度鑑別cfDNA之偵測而獲得的結果。根據結果,已鑑別與HRP/鏈黴抗生物素蛋白奈米粒子相比,在HRP/鏈黴抗生物素蛋白複合物之情況下產生噪音。
圖49示出經由藉由自具有EGFR外顯子19缺失及外顯子20 T790M基因突變之5名肺癌患者的血漿提取cfDNA,且隨後使cfDNA與對EGFR外顯子19 Del、EGFR外顯子20 T790M及EGFR外顯子21 L858R具有特異性之探針及HRP/鏈黴抗生物素蛋白標記奈米粒子(HRP/st標記NP)反應,及與對EGFR外顯子19 Del、EGFR外顯子20 T790M及EGFR外顯子21 L858R具有特異性之探針及HRP/鏈黴抗生物素蛋白複合物(其中HRP與鏈黴抗生物素蛋白以1:1結合至彼此)反應而獲得的二種結果進行分析,藉由鑑別及比較與癌症組織之基因型之匹配而獲得的圖。
圖50示出藉由使獲自具有EGFR外顯子20 T790M及21 L858R基因突變之肺癌患者之肋膜積液的cfDNA與針對EGFR外顯子19缺失(19 Del)、EGFR外顯子20 T790M及EGFR外顯子21 L858R之探針(HRP/st標記NP已結合至該等探針)反應,且隨後用UV吸光度鑑別基因突變之偵測而獲得的結果。
圖51示出藉由將獲自具有EGFR外顯子20 T790M及EGFR外顯子21 L861Q基因突變之肺癌患者之血漿的cfDNA,與對EGFR外顯子19缺失(19 Del)、EGFR外顯子20 T790M、EGFR外顯子21 L858R及EGFR外顯子L861Q具有特異性之探針,及HRP/st標記NP全部一次混合,以便偵測cfDNA中之基因突變,及因此用UV吸光度鑑別出僅在如癌症組織中之EGFR外顯子20 T790M及EGFR外顯子21 L861Q中觀測到基因突變而獲得的結果。
圖52示出藉由將獲自具有ALK-EML4融合及ALK點突變(I1171N/T)基因突變之肺癌患者之血漿的cfDNA,與對ALK-EML4融合及ALK點突變(T1151、L1152P、L1152R、C1156Y、I1171N/T)具有特異性之探針,及HRP/st標記NP全部一次混合,以便偵測cfDNA中之基因突變,及因此鑑別出如在癌症組織中偵測到ALK-EML4融合及ALK點突變(I1171N/T)基因型而獲得的結果。
圖53示出藉由將獲自具有BRAF V600E基因突變之甲狀腺癌患者之血漿的cfDNA,與對BRAF V600E具有特異性之探針及HRP/st標記NP全部一次混合,以便偵測cfDNA中之基因突變,及因此鑑別出偵測到與患者之基因型相同的BRAF V600E基因突變而獲得的結果。
圖54示出藉由使自正常個體之血液收集之樣品經歷各種溫度條件下的變性,且隨後針對各別處理條件偵測不穩定cfDNA而獲得的結果。
圖55示出藉由使自患者血液收集之樣品經歷各種溫度條件下的變性,且隨後針對各別處理條件偵測不穩定cfDNA而獲得的結果。
圖56示出藉由使獲自突變細胞株之fDNA經歷各種溫度條件下的變性,且隨後針對各別處理條件偵測不穩定cfDNA而獲得的結果。
圖57示出藉由使獲自突變細胞株之fDNA經歷37℃下用去氧核糖核酸酶進行之處理30分鐘,且隨後針對處理條件偵測不穩定cfDNA而獲得的結果。
圖58示出藉由使獲自突變細胞株之fDNA經歷37℃下用去氧核糖核酸酶進行之處理60分鐘,且隨後針對處理條件偵測不穩定cfDNA而獲得的結果。
圖59示出藉由使獲自突變細胞株之fDNA經歷37℃下用去氧核糖核酸酶進行之處理120分鐘,且隨後針對處理條件偵測不穩定cfDNA而獲得的結果。
圖60示出藉由使不穩定cfDNA及穩定cfDNA經歷24℃下用1 μl或2 μl去氧核糖核酸酶進行之處理120分鐘,以便鑑別視去氧核糖核酸酶之活性而定之不穩定cfDNA與穩定cfDNA之間的差異而獲得的結果。
圖61示出藉由使不穩定cfDNA及穩定cfDNA經歷3℃下用1 μl或2 μl去氧核糖核酸酶進行之處理120分鐘,以便鑑別視去氧核糖核酸酶之活性而定之不穩定cfDNA與穩定cfDNA之間的差異而獲得的結果。
(無)
Claims (22)
- 一種用於在不擴增之情況下偵測一樣品中之具有一不穩定雙螺旋結構之細胞游離DNA (cfDNA)之方法,該方法包含: a)將含有cfDNA之一樣品與一帶正電物質混合; b)分離結合至該cfDNA之該帶正電物質; c)將混合物與一探針及一標記物混合; d)移除不結合至該cfDNA之該探針及該標記物;及 e)偵測該標記物。
- 如請求項1之方法,其中具有一不穩定雙螺旋結構之該cfDNA的特徵在於: i) Tm值低於具有一穩定雙螺旋結構之cfDNA;或 ii)在具有一穩定雙螺旋結構之cfDNA不變性的條件下變性。
- 如請求項1之方法,其中具有一不穩定雙螺旋結構之該cfDNA能夠在以下條件中之任一條件下結合至一15聚體至30聚體探針,該探針能夠互補結合至該cfDNA: i)允許在室溫下靜置1至120分鐘之條件; ii)在90℃至95℃下加熱1秒至3分鐘之條件; iii)在75℃至90℃下加熱1秒至5分鐘之條件; iv)在60℃至75℃下加熱30秒至30分鐘之條件; v)在25℃至40℃下加熱10至120分鐘之條件; vi)用一蛋白酶處理1至30分鐘之條件;及 vii)用一去氧核糖核酸酶(DNase)處理1至30分鐘之條件。
- 如請求項1之方法,其中具有一不穩定雙螺旋結構之該cfDNA係循環腫瘤DNA。
- 如請求項1之方法,其中具有一不穩定雙螺旋結構之該cfDNA具有不存在於正常細胞中之受損核酸序列。
- 如請求項5之方法,其中不存在於正常細胞中之該受損核酸序列含有選自由以下組成之群的任一結構異常:缺失、重複、反轉、易位、錯配及單核苷酸變異(SNV)。
- 如請求項1之方法,其中在步驟c)之前,該方法進一步包含使該樣品或結合至該帶正電物質之該cfDNA在以下條件中之任一條件下經歷變性: i)允許在室溫下靜置1至10分鐘之條件; ii)在90℃至95℃下加熱1秒至1分鐘之條件; iii)在75℃至90℃下加熱10秒至3分鐘之條件; iv)在60℃至75℃下加熱1至30分鐘之條件; v)在25℃至40℃下加熱5至60分鐘之條件; vi)用一蛋白酶處理1至10分鐘之條件;及 vii)用一去氧核糖核酸酶處理1至10分鐘之條件。
- 如請求項1之方法,其中該探針係由15聚體至30聚體核苷酸構成。
- 如請求項8之方法,其中該探針係呈與生物素結合之形式。
- 如請求項1之方法,其中該標記物包含辣根過氧化酶(HRP)或一螢光蛋白。
- 如請求項10之方法,其中該標記物進一步包含選自由以下組成之群的任一者:抗生素蛋白(avidin)、鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)及其組合。
- 如請求項1之方法,其中該標記物係一奈米粒子,該奈米粒子包含一導電聚合物;玻尿酸;抗生素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白;及辣根過氧化酶(HRP)或一螢光蛋白。
- 如請求項1之方法,其中該帶正電物質係一帶正電奈米線。
- 如請求項13之方法,其中該奈米線包含一導電聚合物。
- 如請求項14之方法,其中該奈米線進一步包含生物素。
- 如請求項14之方法,其中該導電聚合物係選自由以下組成之群的任一者:聚(乙炔)、聚(吡咯)、聚(噻吩)、聚(對伸苯)、聚(3,4-伸乙二氧基噻吩)、聚(苯硫醚)、聚(對伸苯伸乙烯)及聚苯胺。
- 如請求項1之方法,其中該樣品係選自由以下組成之群的任一者:尿液、腦脊髓液、血漿、血液、肋膜積液(pleural fluid)、腹水、唾液、痰液及體液。
- 如請求項5之方法,其中該受損核酸序列係選自由以下組成之群之至少一基因的一突變序列:EGFR、KRAS、BRAF、TP53、PIK3CA、ROS1、RET、c-Met、PTEN、RB1、AR、BRCA、KIT、FGFR、IDH、ESR1、HER2、ALK-EML4及TMPRSS2-ERG。
- 如請求項1之方法,其中在步驟e)中,該標記物係藉由顏色變化、UV吸光度變化、螢光反應變化或電化學變化來偵測。
- 一種用於為癌症或一感染性疾病之診斷或預測提供資訊之方法,其係藉由在不擴增之情況下偵測一樣品中之具有一不穩定雙螺旋結構之cfDNA來進行,該方法包含: a)將含有cfDNA之一樣品與一帶正電物質混合; b)分離結合至該cfDNA之該帶正電物質; c)將混合物與一探針及一標記物混合; d)移除不結合至該cfDNA之該探針及該標記物; e)偵測該標記物;及 f)當偵測到該標記物時,確定存在癌症或一感染性疾病,該癌症或感染性疾病與對應於具有該不穩定雙螺旋結構之該cfDNA之一基因相關。
- 一種用於在不擴增之情況下偵測一樣品是否存在cfDNA之裝置,該cfDNA具有在室溫下不穩定之一雙螺旋結構,該裝置包含: a)一混合區段,用於將含有cfDNA之一樣品與一帶正電奈米線混合; b)一獲得區段,用於移除不包括結合至該cfDNA之該奈米線的該樣品; c)一反應區段,用於向結合至該cfDNA之該奈米線中添加能夠互補結合至該cfDNA之一結合生物素之探針,及包含鏈黴抗生物素蛋白及一標記物之一奈米粒子; d)一偵測區段,用於偵測該標記物;及 e)一資訊加工區段,用於根據該標記物之偵測來確定該樣品含有cfDNA,該cfDNA具有與該探針互補之一序列且具有在室溫下不穩定之一雙螺旋結構。
- 一種用於為癌症或一感染性疾病之診斷或預測提供資訊之裝置,其藉由在不擴增之情況下偵測一樣品中之具有一不穩定雙螺旋結構之cfDNA來進行,該裝置包含: a)一混合區段,用於將含有cfDNA之一樣品與一帶正電奈米線混合; b)一獲得區段,用於移除不包括結合至該cfDNA之該奈米線的該樣品; c)一反應區段,用於向結合至該cfDNA之該奈米線中添加能夠互補結合至該cfDNA之一結合生物素之探針,及包含鏈黴抗生物素蛋白及一標記物之一奈米粒子; d)一偵測區段,用於偵測該標記物;及 e)一資訊加工區段,用於根據該標記物之偵測來確定該樣品含有cfDNA,該cfDNA具有與該探針互補之一序列且具有在室溫下不穩定之一雙螺旋結構。
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