CN106687598A

CN106687598A - 检测样品中多种核苷酸的方法

Info

Publication number: CN106687598A
Application number: CN201580008133.6A
Authority: CN
Inventors: 乌利奇·托马斯
Original assignee: Alere Technologies GmbH
Current assignee: Abbott Rapid Diagnostics Jena GmbH
Priority date: 2014-02-21
Filing date: 2015-02-23
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2035-02-23
Also published as: EP3800269A1; WO2015124779A1; US20190376125A1; JP2020114225A; HK1231512A1; CA2937832C; CA2937832A1; US10787700B2; EP3800269B1; US20170081710A1; EP3108008B1; US10246737B2; CN106687598B; GB201403076D0; EP3108008A1; JP2017506914A; JP6727137B2; EP4400600A2

Abstract

本发明涉及测定样品中多种核苷酸的存在和/或存在数量的方法。

Description

检测样品中多种核苷酸的方法

技术领域

本发明涉及样品中多种核苷酸的存在和/或存在数量的测定方法

知识背景

实时PCR可以连续进行PCR产物的产生过程中的标记的监测。目前，可用的方法为利用标记的探针或DNA嵌入染料来监控PCR产物的扩增。为了这个目的，可以利用含有荧光团和例如相距10-30个碱基的淬灭剂的单寡核苷酸探针。由于Taq聚合酶的5'-3'双链特异性核苷酸外切酶活性，这样的TaqMan探针可以在扩增期间被水解，把从所述荧光团从淬灭剂上分离，导致荧光增加。通常使用的实时PCR仪器配备有荧光检测器和软件能够估计循环阈指示值(Ct)，在这个循环中荧光比背景荧光更大的，为阳性反应。

然而，公认的难点在于已公布检测结果的不可重复性，由于PCR热循环性能的多变性，不同DNA聚合酶的低效，个人原因和在样品基质中存在的PCR抑制剂都可以妨碍实验室的实施，特别是那些具有广泛的质量保证程序。缺乏可重复的方法，常常迫使检测实验室花费大量资源适应已公布的测定结果。因此，有必要具有国际认可的，基于公开配方的可获得的PCR方法，其靶基因，运行特性和验证标准都是公知的，而且为了替代微生物方法验证遵循ISO标准。

一些已公布的PCR程序的一个主要缺点是不包含内部扩增对照。对比(外部)阳性对照，内部扩增对照是在非常相同的样品中的不存在靶DNA序列，它可以与靶序列共同扩增。在一个没有内部扩增对照PCR中，阴性反应(无条带或信号)可能意味着在反应中没有靶序列的存在。但是，因为热循环仪故障，不正确的PCR混合物，DNA聚合酶失活，或特别是样品基质中存在抑制物，它也可能意味着该反应被抑制。特别是，提取核苷酸之后，仍可能存在来自临床样品(例如血红蛋白)、环境样品(例如，腐殖酸和富里酸)和核苷酸提取(例如乙醇洗涤剂，或离液剂)期间采用的化学品的抑制剂。当PCR受扩增抑制剂影响时，从假阴性中区分真阴性结果是可以实现的。

通过含有能指示PCR抑制剂的存在和影响的内部核苷酸对照，可以增加诊断测定法的可靠性。内部阳性对照通常与存在的靶序列被同时扩增，其标记的荧光团可以产生与测定靶序列使用的荧光不同波长的荧光，两种不同频道的荧光被实时PCR测定仪检测到。PCR常用的内部对照是质粒，该质粒包含与测定靶标类似的序列，除了探针区域。有限数量的内部阳性对照分子可被加入到单独的靶标测定中并与靶核苷酸共同扩增。因此，内部阳性对照信号是把极少量的靶标核苷酸进行充分扩增到足以产生阳性信号的证据。

但是，一些设备如LightCycler1.2和LightCycler2(罗氏应用科学，印第安纳波利斯，美国)，加固高级病原鉴定设备仪(R.A.P.I.D.)(爱达荷州技术，盐湖城，犹他州，美国)，以及手持式实时PCR仪仅配备了一个光源和相关的排放或者发射通道。

为了克服这一缺陷，P.Jothikumar等(BioTechniques 46：519524(2009))设计创建了一个三重标记探针作为内部阳性对照(IPC)，其采用荧光共振能量转移(FRET)和TaqMan技术的组合。IPC探针，5'端用FAM和Cy5.5荧光标记，在3'端用黑洞猝灭剂(BlackHole Quencher，BHQ)标记，通过来自FAM荧光的能量转移使的Cy5.5发光。第二，在多重通道的靶标特异的TaqMan测定中分别利用5'和3'末端的FAM和BHQ1标记的探针。因此，一个激发源被用来产生两种不同的荧光(FAM和Cy5,5)，可以被实时PCR仪中的两个独立的通道检测到。

Rosenstraus等(Rosenstraus et al.,Journal of Clinical Microbiology,36,191-197(1998))描述了用于常规诊断性PCR的内部对照，其中利用单独的，靶子特异的和内部对照特异的寡核苷酸捕捉探针，特定靶标和内部对照在各自的反应中被检测到。

Gruber等(Gruber et al.,Applied and Environmental Microbiology,67,2837-2839(2001))描述了定量病毒DNA的实时PCR方法包括双重扩增，内标，以及双色荧光检测，而不需要产生外部标准化曲线。

然而，在本领域仍旧需要检测多种核苷酸的适当的方法，例如样品中的靶标核苷酸和内部对照核苷酸。

发明内容

本发明涉及一些测定例如样品中多种被分析物的测定。

在一方面，检测样品中核苷酸存在和/或存在的数量的方法包括:

(a)提供

一定数量的第一核苷酸；

一定数量的第二核苷酸；

一定数量FRET化合物，其可以与第一核苷酸形成复合物，其中FRET化合物包括第一核苷酸特异的结合区域，和第一可检测标记，其在未复合的状态时为第一可检测特征，在复合状态时，为不同于第一可检测特征的第二可检测特征；一定数量的报告化合物，可以与第二核苷酸形成复合物，其中每一个报告化合物包括与第二核苷酸特异的结合区域和第二可检测标记；并且能够捕捉报告化合物的结合成员；其中第二核苷酸与报告化合物形成的复合物抑制了结合成员对报告化合物的捕捉；

(b)形成复合物，每一个形成的复合物包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物；

(c)一定数量的报告化合物子集与一个第二核苷酸形成复合物；

(d)捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的报告化合物的子集；

(e)测定被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值；

(f)测定结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值。

该方法进一步包括测定第二核苷酸存在和/或存在数量的指示值，该指示值的测定是基于结合成员上捕捉的报告化合物存在和/或存在数量的指示值。

在一些实施例中，FRET化合物的第一和/或第二可检测标记是荧光标记。特别的，第一可检测标记和第二可检测标记释放的光谱范围都为300nm至850nm，例如450nm至750nm或550nm至650nm。在一个实例中，第一可检测标记和第二可检测标记是完全相同的。

被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值可以用复合状态的FRET化合物被检测到。

另外，第一核苷酸可以是一种被分析物，例如一种第一被分析物。第二核苷酸可以从被分析物的组合中选取，例如第二被分析物，和对照核苷酸。对照核苷酸可以从阳性扩增对照和阴性扩增对照中选择。

在一些实施例中，每个样品中第一核苷酸的存在数量可以少于100个拷贝数。另外或可选择的，每个样品中第二核苷酸的存在数量可以是100个拷贝数或更多。

进一步，以下步骤是可以同时进行的，(i)每一个形成的复合物包括第一核苷酸和FRET化合物，(ii)一定数量的报告化合物子集和至少一定数量的第二核苷酸子集组成复合物，(iii)捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的一定数量的报告化合物的子集。

根据另一实施例，该方法还包括以所述第一和/或第二核苷酸为目标进行扩增。或者，如在以第一和/或第二核苷酸为目标进行循环扩增反应的情况下，核苷酸在一定数量的报告化合物的子集和至少一定数量的第二核苷酸形成复合物的步骤之前，第一和第二核苷酸的扩增被启动。此外，如在第一和/或第二核苷酸进行等温扩增反应的情况下，以下步骤可以同时进行，(i)每一个形成的复合物包括第一核苷酸和FRET化合物，(ⅱ)一定数量的报告化合物的子集和至少一定数量的第二核苷酸形成复合物，(ⅲ)捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸的复合的报告化合物的子集以及(iv)以所述第一和/或第二核苷酸为目标的扩增。

进一步，结合成员可以包括一个或多个不同的报告特异捕捉化合物，这些化合物可以捕捉结合成员上的报告化合物。报告特异捕捉化合物可以是寡核苷酸。特别的，不同的报告特异捕捉化合物，例如寡核苷酸，可以根据结合成员被组合在不同位置。

通过与报告特异捕捉化合物形成复合物，报告化合物可以被捕捉在结合成员上。

根据具体的实施方案中，能与第二核苷酸形成复合物的报告因子的至少部分互作位点，也能与报告特异性捕捉化合物形成复合物。特别的，报告特异性捕捉化合物和所述第二核苷酸竞争地与报告化合物形成复合物。

在一些实施方案中，被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示指示值，和/或结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示指示值是在一个反应室中被测定的，该反应室包括结合成员和盖元件。盖元件可以被配置为至少部分可变形的，那样所述反应室的内部体积具有一种松弛状态和一种压缩状态的不同体积。

在一个具体的实施例中，被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值可以在具有松弛状态内部体积的反应室中被测定。另外，表示被结合成员捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值可以在具有压缩状态内部体积的反应室中被测定。例如，表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值是在具有松弛状态内部体积的反应室中被测定的，以及表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值是在具有压缩状态内部体积的反应室中被测定。

另外，表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值和表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值可以被连续的或同时测定。

在另一个实施例中，报告化合物是寡核苷酸。

该方法进一步包括以第一和/或第二核苷酸为目标扩增之前，以其为目标进行逆转录。

在一个具体的实施例中，样品中核苷酸的存在和/或存在数量的测定方法包括：

提供一定数量的第一核苷酸；一定数量的第二核苷酸；能与第一核苷酸形成复合物的一定数量的FRET化合物，其中FRET化合物包括与第一核苷酸特异的结合区域，和第一可检测标记，第一可检测标记具有，一种未复合状态即第一可检测特征，以及复合状态即第二可检测特征，第二可检测特征不同于第一可检测特征；可以与第二核苷酸形成复合物的一定数量的报告化合物，其中每一个报告化合物包括能与第二核苷酸特异的结合区域和第二可检测标记；以及能捕捉报告化合物的结合成员；其中第二核苷酸与报告化合物形成的复合物抑制结合成员对报告化合物的捕捉；以第一和/或第二核苷酸为目标的扩增；每个形成的复合物包括第一核苷酸和FRET化合物；一定数量的报告化合物子集与一个第二核苷酸形成复合物；

捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸的复合的报告化合物的子集；

测定表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值；

测定表示被结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值；

在一些实施例中，扩增包括一个双链核苷酸变性的步骤，其中双链核苷酸包括报告化合物与第二核苷酸形成的复合物，报告化合物与报告特异捕捉化合物形成的复合物，双链报告化合物和双链的第一和/或第二核苷酸。可选择的或另外，扩增可以包括引物化合物退火到第一和/或第二核苷酸上的步骤，其中优选的退火步骤是与一些步骤同时进行的，这些步骤是一定数量报告化合物的子集与至少一定数量的第二核苷酸子集形成复合物和/或捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的报告化合物的子集。

在一个具体的实施例中，扩增是一种等温扩增(isothermal NEAR)方法。例如，该等温扩增方法是一种等温切口酶扩增反应。在这样的实施例中，样品中核苷酸的存在和/或存在数量的测定方法包括：

提供一定数量的第一核苷酸；一定数量的第二核苷酸；一定数量的能与第一核苷酸形成复合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括与第一核苷酸特异的结合区域和第一可检测标记，第一可检测标记具有，一种未复合状态即第一可检测特征，以及复合状态即第二可检测特征，第二可检测特征不同于第一可检测特征；一定数量的报告化合物可以与第二核苷酸形成复合物，其中每一个报告化合物包括能与第二核苷酸特异的结合区域和第二可检测标记；以及能捕捉报告化合物的结合成员；其中第二核苷酸与报告化合物形成的复合物抑制结合成员对报告化合物的捕捉；以第一和/或第二核苷酸为目标的等温扩增，如等温切口酶扩增反应；每一个形成的复合物包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物；一定数量的报告化合物子集与一个第二核苷酸形成复合物；

测定表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值；

其中优选的以下步骤可以同时进行，(i)每一个形成的复合物包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物，(ⅱ)一定数量的报告化合物的子集和至少一定数量的第二核苷酸子集形成复合物，(ⅲ)捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸的复合的报告化合物的子集，以及(iv)以所述第一和/或第二核苷酸为目标扩增。

在其他实施例中，扩增是一个循环扩增，其中优选的循环扩增是PCR，其中优选的进行PCR包括使用具有核酸外切酶活性的聚合酶。例如，表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值是在循环扩增进行至少一个循环后被测定，优选的在循环扩增进行每一个循环后被测定。然后在每次测定表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值之后，表示第一和/或第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值可以被测定。

在这样的实施例中，测定样品中核苷酸存在和/或存在数量的方法包括：

提供一定数量的第一核苷酸；一定数量的第二核苷酸；一定数量的能与第一核苷酸形成复合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括与第一核苷酸特异的结合区域和第一可检测标记，第一可检测标记具有，一种未复合状态即第一可检测特征，以及复合状态即第二可检测特征，第二可检测特征不同于第一可检测特征；一定数量的报告化合物可以与第二核苷酸形成复合物，其中每一个报告化合物包括第二核苷酸特异的结合区域和第二可检测标记；以及能捕捉报告化合物的结合成员；其中第二核苷酸与报告化合物形成的复合物抑制结合成员对报告化合物的捕捉；以第一和/或第二核苷酸为目标进行循环扩增，如PCR；每一个形成的复合物包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物；一定数量的报告化合物子集与一个第二核苷酸形成复合物；

其中优选的第一和第二核苷酸的扩增是在一定数量的报告化合物子集与至少一定数量的第二核苷酸子集形成的复合物步骤前启动。

在上述方法中，表示第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值可以根据校正曲线被测定，该校正曲线与表示报告化合物的存在和/或存在数量的指示值及第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值的有关。

在一个具体的实施例中，测定样品中核苷酸的存在和/或存在数量的方法包括：

在反应室中提供一定数量的第一核苷酸；一定数量的第二核苷酸；一定数量的能与第一核苷酸形成复合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括与第一核苷酸特异的结合区域和第一可检测标记，第一可检测标记具有，一种未复合状态即第一可检测特征，以及复合状态即第二可检测特征，第二可检测特征不同于第一可检测特征；一定数量的报告化合物可以与第二核苷酸形成复合物，其中每一个报告化合物包括能与第二核苷酸特异的结合区域和第二可检测标记；其中反应室包括能捕捉报告化合物的结合成员，其中第二核苷酸与报告化合物形成的复合物抑制了结合成员对报告化合物的捕捉；配制的盖元件至少是部分可变形的；

以第一和/或第二核苷酸为目标进行扩增，例如，等温或循环扩增；

每一个形成的复合物包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物；一定数量的报告化合物子集与一个第二核苷酸形成复合物；

捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的报告化合物的子集；

测定溶液中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值；

测定表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值，基于表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值，测定表示第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值。

在另一个具体的实施例中，测定样品中核苷酸存在和/或存在数量的方法包括：

在反应室中提供一定数量的第一核苷酸；一定数量的第二核苷酸；一定数量的能与第一核苷酸形成复合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括第一核苷酸特异的结合区域和第一可检测标记，第一可检测标记具有，一种未复合状态即第一可检测特征，以及复合状态即第二可检测特征，第二可检测特征不同于第一可检测特征；一定数量的报告化合物可以与第二核苷酸形成复合物，其中每一个报告化合物包括能与第二核苷酸特异的结合区域和第二可检测标记；其中反应室包括能捕捉报告化合物的结合成员，其中第二核苷酸与报告化合物形成的复合物抑制了结合成员对报告化合物的捕捉；配制的盖元件至少是部分可变形的，那样所述反应室的内部体积具有一种松弛状态和一种压缩状态；

以第一和/或第二核苷酸为目标进行扩增，例如等温或循环扩增；

在松弛状态内部体积的反应室中测定表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值；

在具有压缩状态内部体积的反应室中测定表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值，并且基于结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值，测定表示第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值。

在反应室中提供一定数量的第一核苷酸；一定数量的第二核苷酸；一定数量的能与第一核苷酸形成复合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括第一核苷酸特异的结合区域和第一可检测标记，第一可检测标记具有，一种未复合状态即第一可检测特征，以及复合状态即第二可检测特征，第二可检测特征不同于第一可检测特征；一定数量的报告化合物可以与第二核苷酸形成复合物，其中每一个报告化合物包括第二核苷酸特异的结合区域和第二可检测标记；其中反应室包括能捕捉报告化合物的结合成员，其中第二核苷酸与报告化合物形成的复合物抑制了结合成员对报告化合物的捕捉；配制的盖元件至少是部分可变形的，那样所述反应室的内部体积具有一种松弛状态和一种压缩状态；以第一和/或第二核苷酸为目标进行扩增，例如等温或循环扩增；

在具有松弛状态内部体积的反应室的溶液中测定表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值；

在具有压缩状态内部体积的反应室中测定表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值，并且基于表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值，测定表示第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值。

在反应室中引进一定数量的第一核苷酸；一定数量的第二核苷酸；一定数量的能与第一核苷酸形成复合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括与第一核苷酸特异的结合区域和第一可检测标记，第一可检测标记具有，一种未复合状态即第一可检测特征，以及复合状态即第二可检测特征，第二可检测特征不同于第一可检测特征；一定数量的报告化合物可以与第二核苷酸形成复合物，其中每一个报告化合物包括第二核苷酸特异的结合区域和第二可检测标记；其中反应室包括第一表面、第二表面和一个能捕捉报告化合物的结合成员，其中第一和第二表面间的距离是可变的，那样所述反应室具有一种松弛状态的内部体积和一种压缩状态的内部体积，其中第二核苷酸与报告化合物形成的复合物抑制了结合成员对报告化合物的捕捉；

在具有松弛状态内部体积的反应室的溶液中测定被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值；

从下文要描述的实施例中可以清晰的看到上文已定义的一些方面以及更深入的解读，并用这些实施例来解释说明。

附图的简要说明

下文中将详细描述实施例，但本发明不意味着受限于实施例。附图中的说明是示意作用的。

图1是如本文描述的典型的检测装置的示意图。

图2是如本文描述的一个反应室的示意图。

图3显示了本文描述的方法的典型实施例中大部分体积(溶液)和一个微阵列交替产生的荧光图。

图4显示了荧光图形的数据分析，分别来自图3所示的大部分体积(溶液，见图4a)的荧光图像和微阵列所产生的荧光图像(见图4b)。

图5a)显示了存在靶标DNA的情况下竞争性报告因子监测的扩增与分子信标间的比较。

图5b)显示了没有靶标DNA存在的对照反应情况下竞争性报告因子监测的扩增与分子信标间的比较。

图6显示了溶液中荧光信号强度的时间进程(第一/靶标核苷酸的检测)。

图7显示了对于IPC(内部阳性对照)和PHC(阳性杂交对照)的阵列上的荧光信号强度的时间进程。由于溶液中缺乏竞争者PHC信号强度进程符合二级动力学。

详细说明

说明书的详细内容，其中，在本说明书和权利要求中使用的术语“包含”或“包括”，它不排除其他元件或步骤。对于本发明的目的，术语“由......组成”被认为是术语“包括”的任意实施例。如果在下文中一个组合被定义为包括至少一定数目的实施例，这也是可以理解为公开一个组合，该组合可以任意地且仅由这些实施例组成。

除非特别的规定，当指一个单名词如“一个”或“一种”时，一种不确定或确定的定冠词被使用，这包括那个名词的复数形式。例如在提到的一种第一或第二核苷酸时，这也可以被理解为多种第一或/第二核苷酸。反之亦然，当名词的复数形式被使用时，这也可以被理解为单数形式。

此外，本发明的说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三或(a)、(b)、(c)等被用于区分相似的元件并不一定按描述顺序或时间顺序。这可以被理解为这些使用的术语在适当的环境下是可互换的，本文所述的实施例可以用不同于本文描述或示例的顺序被实施。

这些术语的定义将在所使用术语的下文中进一步被诠释。

生物样品的分析可以包括测定样品中是否存在一种或多种核苷酸(例如，DNA,RNA,mRNA，rRNA)。例如一种分析方法可以研究一种样品来测定是否具有表示特定病原物的核苷酸的存在。

根据一个实施例，测定样品中多种核苷酸的存在和/或存在数量的方法包括：

(a)提供

一定数量的第一核苷酸；

一定数量的第二核苷酸；

一定数量的能与第一核苷酸形成复合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括与第一核苷酸特异的结合区域和第一可检测标记，第一可检测标记具有，一种未复合状态即第一可检测特征，以及复合状态即第二可检测特征；

一定数量的报告化合物，报告化合物可以与第二核苷酸形成复合物，其中每一个报告化合物包括第二核苷酸特异的结合区域以及第二可检测的标记；

可以捕捉报告化合物的结合成员；其中第二核苷酸与报告化合物形成的复合物抑制了结合成员对报告化合物的捕捉；

(b)每一个形成的复合物包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物；

(d)捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的报告化合物子集；

(e)测定表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值；

(f)测定表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值。

特别的，第一核苷酸可以通过测定溶液中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值来检测，然而第二核苷酸，如对照核苷酸，可以通过测定结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值来检测。这可以避免了使用不同的发色团来检测溶液中的多种核苷酸。另外，通过表面结合的底物或探针来检测表示对照的存在和/或存在数量的指示值，那么实施与扩增无关的对照是可行的，如酶对照，从而避免相应的假扩增子的合成。

本文所述术语“核苷酸”或“靶标核苷酸”或“靶标被分析物”，表示可以用所述方法检测的任何核苷酸分子(例如可以与FRET化合物形成复合物的靶标核苷酸，或可以与报告化合物形成复合物的靶标核苷酸或对照核苷酸；详见下文)。这样的核苷酸分子包括自然产生的核苷酸例如脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核酸(RNA)也可以是人工设计的核苷酸，如核苷酸类似物尤其如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)，它们可以用重组基因技术产生或化学合成(例如自然产生的核苷酸的具体实施例包括DNA序列如基因组DNA或cDNA分子以及RNA序列如hnRNA，mRNA或rRNA分子或它们的反向互补核苷酸序列。这些核苷酸可以是任何长度，单链或双链分子。一般，靶标核苷酸的长度为10至10000个核苷酸，如20至2000个核苷酸，30至1000个核苷酸或50至500个核苷酸。如本文使用的术语“核苷酸”可以被理解为核糖核苷酸和脱氧核苷酸(如RNA和DNA分子)。

靶标被分析物或靶标核苷酸可以是一种与细菌或病毒感染有关的核苷酸。

与细菌感染有关的核苷酸意味着源于细菌的任何核苷酸分子(如其核苷酸序列与细菌基因组中的相应序列是相同的或互补的)，它们存在于已经被一种或多种细菌感染的待分析的液体样品中。引起细菌感染的细菌的实例包括结核分枝杆菌，链球菌，假单胞菌，志贺氏杆菌，弯曲杆菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和沙门氏菌。其中具有最高风险的细菌性疾病是肺结核，由细菌结核杆菌引起，杀死每年约200万人，主要集中在撒哈拉以南非洲。因此，在一些实施例中，待检测的靶标核苷酸或靶被分析物与由结核分枝杆菌引起的感染相关。

与病毒感染有关的核苷酸意味着源于病毒的任何核苷酸分子(例如其核苷酸序列与病毒基因组中的相应序列是相同的或互补的)，它们存在于已经被一种或多种病毒感染的待分析的液体样品中。病毒侵染染宿主，从寄主中获得的液体的样品，可以是任何DNA病毒(即具有DNA基因组的病毒)或RNA病毒(即具有RNA基因组的病毒)(参照如,Büchen-Osmond,C.(2003).Taxonomy and Classification of Viruses.In:Manual of ClinicalMicrobiology,8th ed.,vol.2,p.1217-1226,ASM Press,Washington DC)。DNA病毒的实例尤其包括乳多空病毒家族(例如乳头状瘤病毒)，腺病毒家族(例如腺病毒)和疱疹病毒家族(例如EB病毒，巨细胞病毒)。RNA病毒的实例特别包括小核糖核酸家族(例如脊髓灰质炎病毒，鼻病毒)黄病毒科家族(例如丙型肝炎病毒)，丝状病毒家族(例如马尔堡病毒，埃博拉病毒)和逆转录病毒家族(例如人免疫缺陷病毒(HIV))。在一些实施方案中，待检测的靶标核苷酸与逆转录病毒成员引起的感染有关，特别是它们与HIV引起的感染有关联。如本文所用的术语“HIV”，指HIV-1和HIV-2的种属以及它们衍生的任何亚型。

因为许多DNA病毒以及逆转录病毒(特别是，所述逆转录病毒的复制通常需要把RNA病毒基因组反转录为DNA)，可以将它们的遗传信息以潜在前病毒的形式整合进宿主细胞的基因组，术语“与病毒感染相关的核苷酸”不仅指来自游离的和感染细胞相关病毒的核苷酸，还指被整合到宿主的基因组中的潜在前病毒DNA分子，反转录的病毒DNA分子(即病毒复制的“中间体“)，和潜在前病毒DNA衍生的转录物(即被宿主DNA基因组的转录得到RNA分子)。

一般，本文公开的方法中靶标核苷酸不是单独纯在的形式，而是包括一种或多种靶标核苷酸的样品的形式。这里使用的术语“一种或多种种属”指一种或多种不同类型的核苷酸如具有不同核苷酸序列的分子和/或具有不同来源的分子(如来自不同病原物感染的寄主细胞的核苷酸)

一般，这里所用的第一核苷酸是如上所述的一种靶标被分析物或靶标核苷酸。

在一些实施例中，第二核苷酸可以是如上所述的靶标被分析物。另外或可选择的，第二核苷酸可以是一种对照核苷酸。对照核苷酸可以包括阳性和阴性扩增对照，下文有更详细的描述。

假如第一和第二核苷酸都是靶标被分析物，第二核苷酸一般不同于第一核苷酸，即不同类型的核苷酸如具有不同核苷酸序列的分子和/或不同来源的分子(即受不同病原物感染的寄主细胞的核苷酸)。在这个实施例中，第一核苷酸也可以被作为第一靶标被分析物，并且第二核苷酸也可以被作为第二靶标被分析物。例如第一版被分析物与HIV感染有关，第二靶标被分析物与HCV感染有关。

一般，第一和/或第二核苷酸的扩增子，即靶标被分析物和/或对照核苷酸的扩增子，具有10至300个核苷酸，例如15至250个核苷酸，30至200个核苷酸或50至100个核苷酸。

另外，这里使用的“第二核苷酸”也可以包括超过一种核苷酸类型例如不同于第一靶标被分析物的一种或多种靶标被分析物(即第二、第三、第四、第五靶标被分析物等)并且一种或多种对照核苷酸(即阳性和阴性扩增对照核苷酸)。

这里所用的术语“样品”指可以使用这里所述的方法被分析的任何液体，其可以包括一种或多种待测的靶标核苷酸。然后，样品可以包括溶于水或适当缓冲液(即Tris/EDTA)的纯化的核苷酸制备物以及各种生物样品。可以用本文所述的方法分析的液体样品的实例特别包括有机和无机化学溶液，饮用水，污水，人类和非人类体液例如全血，血浆，血清，尿，痰液，唾液或脑脊髓，来自动物、植物或组织培养物的细胞提取物，原核生物和真核生物的细胞悬浮液，噬菌体制剂等的细胞提取物。

在具体的实施例中，例如当靶标核苷酸与细菌侵染有关如结核杆菌感染的情况下，可以用本文所述的方法分析的液体样品是人类唾液样品或人类尿液样品。

在另一个具体的实施例中，例如当靶标核苷酸与病毒侵染有关如HIV或丙型肝炎C病毒感染的情况下，可以用本文所述的方法分析的液体样品是人类全血样品或人类血浆样品。

这里所用的术语“全血”指具有所有成分的血液。在其他词语中，全血包括血细胞如红细胞、白血球和血小板，以及悬浮有血细胞的血浆。

样品进一步包括一种或多种附加试剂例如稀释剂、溶剂或缓冲液，它们可以来自样品的任意纯化过程和/或为使用本文所述方法之前的样品处理过程。然而，在一些实施例中，被分析的样品是未经处理的样品例如未经处理的全血样品。本文所用的术语“未经处理的”，可以理解为收集样本后(例如，从患者抽血)至使用本文所述的方法正如下方所述的检测装置中进行以此为目标的检测之前，没有进一步的样品处理发生(例如，分馏方法，干燥/重建，等等)。

包括这样未经处理样品的典型的核苷酸的检测方法如下文所述。

待分析的流体样品的体积可以是在1微升至30毫升的范围内，例如5微升至20毫升或10微升至10毫升。

特别的，待分析的尿液或唾液样品的体积可以在1微升至30毫升的范围内，一般是在1微升至25毫升的范围内或1毫升至20毫升或1毫升至15毫升或1毫升至10毫升。在特别的实施例中或唾液的体积是在5毫升至15毫升的范围内例如约10毫升。然而样品的体积超过30毫升也在本发明的范围内。

另外，待分析的全血或血浆样品的体积可以在1微升至50微升的范围内，一般在1微升至45微升或1微升至40微升或1微升至30微升或1微升至25微升或1微升至20微升或1微升至15微升。在具体的实施例中，流体样品的体积如人类全血是在1微升至10微升的范围内。然而分在样品为全血的情况下样品体积超过50微升也在本发明的范围内。

这里所用的术语“报告分子”或“报告化合物”可以指任何能与一种或多种第二核苷酸形成复合物的分子并且其能在支持成员上被捕捉，例如结合成员，其中

与第二核苷酸形成的复合物抑制了支持成员上对报告化合物的捕捉，例如结合成员。因此这里所用的“能形成复合物”指报告化合物与第二核苷酸间的任何互作。特别的，该术语可以指分子间通过一个共同的或不同的结合域实现的相互结合，结合域被包含在报告分子中，调节与靶标的互作(例如通过互补的核苷酸之间的Watson-Crick碱基配对)。一般，互作是可逆的。类似的，术语“在支持成员上被捕捉”或“在结合成员上被捕捉”也指任何报告分子与既定的结合成员间的直接或间接(例如通过捕捉分子；详见下文)的互作。这种互作一般也是可逆的。

一般来说报告化合物可以是具有10至100个核苷酸的核苷酸分子(即如上所述的RNA或DNA分子)，例如15至50个核苷酸，15至40个核苷酸或20至30个核苷酸。通常报告分子是单链核苷酸分子或寡核苷酸。报告化合物被这样设计，那样这个报告化合物与待测的第二核苷酸结合抑制了结合成员对报告化合物的捕捉。

核苷酸报告分子可以包含至少一个特异结合域(这里也指“互作位点”)即不仅能与第二核苷酸互作(例如与第二核苷酸的至少部分互补序列区域结合，因而允许例如报告分子和待测的第二核苷酸间Watson-Crick碱基配对)，而且能在结合成员被捕捉。通常报告化合物中包括的特异结合域的长度为至少12个核苷酸，例如至少15个核苷酸，至少18个核苷酸或至少22个核苷酸。在具体的实施例中，报告化合物的结合部分的核苷酸序列是与第二核苷酸的相应的核苷酸序列互补的。

可以采用一种或多种种类的报告分子，例如依赖不同类型核苷酸的数量，例如待测的第二核苷酸。术语“一种或多种种类”指一种或多种不同类型的报告化合物例如一种或多种具有不同核苷酸序列的核苷酸分子。

这里所用的“结合成员”可以指任何固体基质，在这些固体基质上报告分子可以被捕捉。这样的基质实例尤其包括合成颗粒例如磁珠(如，聚苯乙烯顺磁珠，也被称为)和乳胶珠。本文所用的“结合成员”，可以指任何固体基质，在这些固体基质上报告化合物可以被直接的(通过包含在报告化合物中的锚定基团)或以间接的方式被捕捉，间接的方式为通过一种或多种报告特异捕捉化合物，能通过共价或非共价互作捕捉报告化合物到结合成员上。可以使用的结合成员的实例尤其包括阵列元件的基板(例如，显微镜载玻片，晶片或陶瓷材料)。

这里所用的术语“报告特异捕捉化合物”或“报告特异捕捉分子”指可以被附着到或固定在结合成员上的任何化合物或分子，，显示了特异的结合性和/或特征性反应，促使具有报告化合物的复合物的形成(即与报告化合物结合)。核苷酸或寡核苷酸一般被用作报告特异捕捉分子。被用作报告特异捕捉分子的核苷酸实例

包括天然的核苷酸例如脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)以及核苷酸类似物例如特别是肽核苷酸(PNA)或锁核苷酸(LNA)。天然的核苷酸的具体实例包括DNA序列如基因组DNA或cDNA分子以及RNA分子例如hnRNA,mRNA或rRNA分子或它们的逆转录核苷酸序列。这样的核苷酸可以是任何长度并且可以是单链或双链分子。一般报告特异捕捉化合物是具有10至100个核苷酸长度的单链寡核苷酸，如具有15至50个核苷酸或20至30个核苷酸。

报告特异捕捉化合物可以包括至少一个特异序列区域(如结合域)，其被配置用来与报告化合物结合，例如，通过报告特异捕捉分子与待测的核苷酸间的碱基配对来与报告分子的互补序列区域互作。一般特异结合区域的长度至少为12个核苷酸，如至少15个核苷酸，如至少18个核苷酸，如至少22个核苷酸，在特定的实施例中，报告特异捕捉化合物的结合域的核苷酸序列与报告化合物的相应核苷酸序列互补。

在一些实施例中，能与第二核苷酸形成复合物的报告化合物的至少部分互作位点也能与报告特异捕捉化合物形成复合物。特别的，报告特异捕捉分子和第二核苷酸竞争与报告化合物形成复合物，如报告特异特异捕捉分子和第二核苷酸中各自包含的结合区域识别报告分子上的相同或至少相似的对应序列。这里所用的术语“类似序列”指那些仅一个或多个单核苷酸错配(例如不互补的核苷酸对)或由一个或多个单核苷酸的添加，插入或缺失的序列(或缺少核苷酸残基)。因此包括在报告特异捕捉分子和第二核苷酸中的各自的结合区域至少可以是部分相同的。这里所用的术语“部分相同”指如上所述仅一个或多个单核苷酸不同的序列，或具有重叠结合位点的序列，如共享一个共同核苷酸序列但在序列的其他部分至少有一个不同的地方。然而也可能报告特异捕捉分子与靶标核苷酸的各自包含的结合区域识别不同的不重叠(如相邻的)报告分子的序列，使报告特异捕捉分子或者靶标核苷酸与报告分子结合到报告分子上，来空间干扰另外一个与报告分子的结合。

在一些实施例中，一方面报告化合物与第二核苷酸形成复合物，另一方在结合成员上捕捉报告化合物(如通过与报告特异捕捉分子形成复合物)，这些步骤间的化学平衡分别受报告特异捕捉分子(与报告化合物的序列有关)和报告化合物(与第二核苷酸有关)的序列相似和/或部分相同程度变化的影响。

例如，可以选择报告特异捕捉分子序列，那样与报告化合物序列有关的结合区域比与第二核苷酸序列有关的报告化合物序列的结合区域的更短或更长。在这种方式下，报告化合物与第二核苷酸相关的结合亲和力，跟报告化合物与报告特异捕捉分子相关的结合亲和力相比会增加或减少。

可以采用一种或多种种类的报告特异捕捉分子。术语“一种或多种种类”指一种或多种不同类型的报告特异捕捉分子例如具有不同核苷酸序列的一种或多种核苷酸分子。同时使用超过一个种类的报告特异捕捉分子也被称为“文库”。这样的文库包括至少两种但也包括更多不同的分子，如至少10种不同种类，至少20种不同种类，至少50种不同种类等等。不同的报告特异捕捉化合物或文库也可以被排列在结合成员的不同位置。例如它们可以以阵列的形式或其他空间排列存在。

这里所用的术语“阵列”(也被称为“微阵列”)指一种捕捉分子的已确定的空间排列如在结合成员上的报告特异捕捉分子，也被称为“底物”，其中在阵列中的每一个分子的位置是被分开的。一般阵列包括已确定的位点或预定的区域，如所谓的“阵列元件”或“斑点”，它们可以以特别的方式被排列，其中每一个阵列元件一般仅包括一种报告特异捕捉分子。在结合成员上的报告特异捕捉分子的排列可以通过共价或非共价互作的方式实现。

FRET效率可以被测定并用来鉴定所述的第一核苷酸与FRET化合物间的互作。本技术人员公知通过监测FRET供体或FRET受体发出的荧光的改变，有多种方式可以测定FRET的效率。

特别的荧光共振能力转移(FRET),荧光共振能量转移(FRET)，共振能量转移(RET)或电子能量转移(EET),是两种发色团间的能量转移机制。供体发色团这里被简单的称为供体或发色图，最初是电子激发态，通过非辐射偶极-偶极耦合可以转换能量给受体发色团，这里被称为受体或淬灭剂。假如(供体)发色图和淬灭剂彼此在一定的距离内FRET效率的检测可以被确定。当供体和受体发色团都是荧光时，术语“荧光能量共振转移”是被经常使用的。

这里所用的FRET化合物可以指能与第一核苷酸形成复合物的一种化合物，其中FRET化合物包括可以一个供体发色图(如荧光标记)，该供体发色团可以被光源被激发。另外，在这个实施例中第一核苷酸可以设有受体发色图或猝灭剂。在另一个实施例中，FRET化合物包括一个受体发色团或猝灭剂，并且第一核苷酸包括一个供体发色团。在另一个实施例中，FRET化合物可以同时包括一个供体发色团和一个受体发色团或，换句话说，一个发色团和一个猝灭剂。

这里所用的第一可检测标记指供体发色团或FRET化合物的发色团。一般第一可检测标记或FRET化合物的供体发色团是一个荧光标记或荧光团。

FRET化合物的复合状态是指FRET化合物处于与第一核苷酸复合的状态。FRET化合物的未复合状态是指FRET化合物处于未与第一核苷酸复合的状态。

这里所用的FRET化合物的第一可检测特征可以指一种状态，其中发色团是猝灭，如荧光团。在这个实施例中，第二可检测特征可以指一种状态，其发色团是开启的，如荧光团。相应的，溶液中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸捕捉的存在和/或存在数量的指示值可以在FRET化合物的复合状态中被确定。

在其他的实施例中，这里所用的第一可检测特性可以指发色团的发射状态是开启的，如荧光团。在这个实施例中，第二可检测特性可以指发色团的发射状态是猝灭的，如荧光团。

在一些实施例中，因为供体发色团和受体发色团的距离很靠近，例如在1至10nm的距离内，当FRET化合物处于未复合状态时，如未与第一核苷酸复合，该距离使得FRET处于供体发色团和受体发色团之间，发色团如荧光团的发射状态被猝灭。因为供体发色团和受体发色团不在一定的距离内，该距离允许FRET处于供体发色团和受体发色团之间，当FRET复合物处于复合状态时，如与第一核苷酸复合，发色团如荧光团的发射状态被开启。

在一些实施例中，因为供体发色团和受体发色团的距离很靠近，例如在1至10nm的距离内，当FRET化合物处于复合状态时，如与第一核苷酸复合，该距离使得FRET处于供体发色团和受体发色团之间，发色团的发射状态被猝灭,如荧光团。因为供体发色团和受体发色团不在一定的距离内，当FRET复合物未处于复合状态时，如未与第一核苷酸复合，该距离允许FRET处于供体发色团和受体发色团之间，发色团如荧光团的发射状态被开启。

在一些实施例中，FRET化合物包括LightCycler探针系统。在这个实施例中，LightCycler探针系统包括FRET供体化合物和FRET受体化合物。一般，FRET供体化合物和FRET受体化合物都是寡核苷酸。FRET供体化合物和FRET受体化合物可以与第一核苷酸在一定的位置结合，该位置足够靠近FRET。

在一个具体的实施例中，LightCycler探针系统由一对荧光标记的单链寡核苷酸探针组成。一条寡核苷酸探针可以在3’端用供体荧光染料标记，其他寡核苷酸探针可以用受体荧光染料在5’端标记。游离的第二探针的3’羟基基团可以用磷酸集团锁住防止DNA聚合酶的延伸。一般两个标记间相互间隔1至5个核苷酸。在PCR的退火步骤过程中，PCR引物与LightCycler探针可以杂交到它们的特异靶标位点，使供体染料非常贴近受体染料。当供体染料受到LightCycler仪器的光激发时，通过荧光能量共振转移能量从供体转移到受体染料。当两种探针在溶液中时是自由悬浮彼此分开的没有能量转移发生。检测探针的杂交是通过供体荧光信号的减少或受体荧光信号的增加来检测的。

在其他实施例中，FRET化合物可以是分子信标。分子信标可以包括寡核苷酸杂交探针，能报告溶液中第一核苷酸的存在。分子信标也常被称为分子信标探针。一般分子信标是具有内部猝灭发色团的发夹形分子如荧光，当它们与靶标核苷酸序列结合时，如发色团的发射如荧光团被恢复。一个典型的分子信标的长度可以是20至30个核苷酸，例如20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30个核苷酸,如25个核苷酸。中间的核苷酸例如中间15个核苷酸一般与靶标核苷酸互补，相互不形成碱基配对，而每一个末端的核苷酸，如每一个末端的5个核苷酸，是相互互补的，而不是与靶标核苷酸互补。

特别的，典型的分子信标结构被分成4个部分，包括一个环，其一般是分子信标上的18-30个碱基对，与靶标序列互补，一个主干(或信标杆)，其通过附着到环的两个短的末端形成，如5-7个核苷酸，相互互补的寡核苷酸，其中在分子信标的5’末端共价附着荧光染料，3’猝灭剂是非荧光的，可以共价附着到分子信标的3’端。可选择的分子信标的3’末端是共价附着的荧光染料，5’猝灭剂就是非荧光，可以共价附着到分子信标的5’末端。分子信标的制备对在本领域技术人员来说是有据可查的。

当上述的分子信标是闭合的环形时，猝灭残基靠近荧光团，导致后者荧光发射的猝灭。在这个实施例中，假如待测的第一核苷酸与环的直链互补，那么杂交会发生。第一核苷酸与环间形成的双链体可能比环的主干更稳定，因为前者的双链体包括了更多的碱基对。分子信标的构形改变迫使茎杂交体解离，荧光和猝灭剂

相互分离，恢复荧光。因此，一旦荧光与猝灭剂具有一定的距离，光照射杂交物导致荧光发射。具有发射光说明发生了杂交，因此在检测样品中第一核苷酸序列是存在的。

在其他实施例中，FRET化合物可以从环tag探针、链置换探针或Taqman探针中选择。

对本领域技术人员来说这些和其他FRET化合物是公知的。FRET的使用如下列文献所述：Marras,S.A.E.(2006)Methods Mol Biol.335,3-16；Liu,B.et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102,589-593；and Szollosi,J.et al.(2002)J.Biotechnol.82,251-266，它们的相关内容被明确的包含在参考文献中。如马哈斯(Marras,S.A.E.(2006)Methods Mol Biol.335,3-16)详细描述了对于不同类型的荧光杂交探针和荧光分光光度热循环仪适当的荧光团淬灭剂组合的选择，也描述了荧光杂交探针的示例性的荧光标记和猝灭剂标签。

FRET化合物的存在数量一般是过量的与报告化合物的种类相比，如超过5倍至100倍或10倍至80倍或20倍至50倍或30倍至40倍。

另外，第一核苷酸可以以很低的拷贝数量在样品中存在。在一些实施例中，每份样品中存在的第一核苷酸可以少于100个拷贝。例如，每份样品中存在的第一核苷酸化合物可以是80个拷贝或更少，或70个拷贝或更少，或60个拷贝或更少，或50个拷贝或更少，或40个拷贝或更少，或20个拷贝或更少，或10个拷贝或更少。

在另一个实施例中，每份样品中存在的第二核苷酸可以是100个拷贝或更多，如每份样品中200个拷贝或更多，或每份样品至少300个拷贝，或每份样品至少400个拷贝，或每份样品至少500个拷贝，或每份样品至少600个拷贝，或每份样品至少700个拷贝，或每份样品至少800个拷贝，或每份样品至少900个拷贝，或每份样品至少1000个拷贝，或至少5000个拷贝，或至少10000个拷贝。

这里所用的术语“确定表示结合成员上报告化合物的存在和/或存在数量的指示值”可以指参数的检测/确定例如导电性，氧化还原电势，光吸收，荧光强度或生物发光，它们被允许用于定量和/或定性测定在结合成员上捕捉的报告化合物。可以仅测定这些参数中的一个，但也可能可以同时的或连续的测定多个参数(如由适宜标记产生的导电性和荧光信号的强度)。

为了进行检测反应，报告化合物可以用一种或多种可检测标记来标记，也被称为“第二可检测标记”。这里所用的的术语“第二可检测标记”指任何化合物或基团，其包括一种或多种适当的化学物质或酶，可以直接的或间接的产生一种可检测的化合物或化学的、物理的或酶促反应信号。因此这样的标记是必要的因为其通过与所述的报告化合物互作，可促进目的报告化合物的检测这里所用的术语可以被理解为包括两种可检测标记本身(也被称为“标签”)以及任何耦合到一种或多种这样的可检测标签上的化合物。此外，通过标记干扰可检测信号的产生的基团也属于可检测标记(如只要猝灭剂和荧光彼此很靠近，猝灭剂“劫持”发射导致荧光的激发)。可检测标记可以被整合到或附着到靶标核苷酸上，如以修饰和/或标记核糖核苷酸，脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸的形式。

使用的可检测标签或标记包括任何化合物，其可直接的或间接的产生化学的、物理的或酶促反应的可检测化合物或信号。在本领域可采用很多方法进行添加标记(详见如Sambrook,J.et al.,supra；and Lottspeich,F.,and Zorbas H.,supra)。标记可特别选自荧光标记、酶标记、有色标记、发色标记、发光标记、放射性标记、半抗原、生物素、金属复合物、金属和硅体金。所有这些标记类型都是本领域已被公开确认的。这些标记介导的物理反应的实例是当使用放射性标记时对于X射线的放射或激发或发射能产生荧光或磷光的发射。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和β-内酰胺酶是酶标记的实例，它们可以催化发色反应产物的形成。

在具体的实施例中，第二可检测标记是一种荧光标记。本领域中多种荧光是已被公开确定并可以从不同的供应商获得的(详见例如The Handbook-A Guide toFluorescent Probes and Labeling Technologies,10th ed.(2006),Molecular Probes,Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)。

在一些实施例中，FRET化合物的第一可检测标记与报告化合物的第二可检测标记都是荧光标记。在这些实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记都可发射范围为300nm至850nm，如450nm至750nm或550nm至650nm的波长。在具体的实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记发射相同的波长，如完全相同的，如相同的荧光例如在具体的实施例中其中第一可检测标记和第二可检测标记发射相同的波长，例如是完全相同的，一般FRET化合物的数量与报告化合物的种类相比是过量存在的，如过量5倍至100倍或10倍至80倍或20倍至50倍或30倍至40倍。

为了检测这些标记，可使用适合的检测系统，该方法用于确定表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在的数量及在结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值，如在微阵列上。检测系统可以采用下述的手持式检测装置。一般检测系统被置于结合成员的相反位置。适宜的检测系统的选择依赖于几个参数，例如待测的标记类型或采用的分析种类。各种光学检测系统是本领域公开确认的。可采用的检测系统和方法的常用描述可以在如Lottspeich,F.and Zorbas H.(同上)中找到。

通常情况下，检测系统是基于光谱刺激荧光标记的核苷酸产生的荧光强度的比较。荧光是特殊的分子，在受到特殊波长激发时导致一种特有的吸收和发射行为能发射出的它们特有的光。特别的荧光信号的定量检测是通过荧光显微法的改良方法进行的(参照Lichtman,J.W.,and Conchello,J.A.(2005)Nature Methods 2,910-919；Zimmermann,T.(2005)Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.95,245-265)因此信号作为光吸收和光发射的结果，分别可以通过一种或多种过滤器和/或堇青石分开，并在适当的检测器上成像。数据分析采用数字图像处理方式进行。图像处理可以用本领域熟知的多种软件包处理(如EIKONA或Image-PRO的数学数字图像处理系统)。以此为目的的的适当的软件是Iconoclust软件(Clondiag芯片技术公司，耶拿，德国)。

适当的检测系统可以基于检测荧光信号的“经典”方法如荧光显微法或暗视野的荧光显微法(参考如Lakowicz,J.R.(1999)Principles of Fluorescence Spectroscopy,2^nd ed.,Plenum Publishing Corp.,NY)。

另一个可用的光学检测系统是共聚焦荧光显微方法，所述目标对象是通过点光源在透镜的聚焦平面上被照明。点光源，目标对象和点光源检测器可以位于光学上的共轭平面。(Diaspro,A.(2002)Confocal and 2-photon-microscopy:Foundations,Applicationsand Advances,Wiley-Liss,Hobroken,NJ.)详细描述了这种共聚焦系统的实例。荧光光学系统通常是没有自动对焦的荧光显微镜，例如具有固定焦点的荧光显微镜。

另外所用的荧光检测方法尤其包括全内荧光显微镜(见Axelrod,D.(1999)Surface fluorescence microscopy with evanescent illumination,in:Lacey,A.(ed.)Light Microscopy in Biology,Oxford University Press,New York,399-423)，荧光生命周期成像显微镜(见例如Dowling,K.et al.(1999)J.Mod.Optics 46,199-209),fluorescence resonance energy transfer (FRET；see,for example,Periasamy,A.(2001)J.Biomed.Optics 6,287-291)，生物性光共振能量转移(BRET；see,e.g.,Wilson,T.,and Hastings,J.W.(1998)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.14,197-230)和荧光相关光谱(见如Hess,S.T.et al.(2002)Biochemistry 41,697-705)。

在一些实施例中，该方法进一步包括测定表示第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值，基于结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值。特别的，在特定的样品中可以计算存在的一种或多种第二核苷酸的存在和/或存在数量，基于第二核苷酸与报告分子形成复合物前的报告化合物的存在和/或存在数量与形成所述的复合物之后结合成员上捕捉的报告化合物的数量。

为了进行检测反应，报告化合物可以包括上述的一种或多种可检测标记。例如报告化合物可以包括两种可检测标记。在具体的实施例中，可检测标记是上述的荧光标记。可检测标记可以被整合或附着到报告分子上，如以修饰和/或标记核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸或双脱氧核苷酸的方式。

为了检测这样的标记，用于实施该方法所用的检测仪器可以进一步包括一个检测系统，该系统适用于确定结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值。例如检测系统适用于确定结合成员上捕捉的靶标核苷酸的存在和/或存在数量的指示值，如上所述。

在测定过程中，表示第一和/或第二核苷酸存在和/或存在数量的指示值的测定/确定可以仅进行一次或超过一次。如果在单个测定过程中超过一个检测步骤被进行，在一些实施例中获得的结果的均值可以被计算出。为了确定一种或多种第一或第二核苷酸的存在、长度或序列并/或计算它/它们的数量，在一次或多次检测循环中获得的数据可以被分析并用本领域技术人员公知的适当的计算机软件进行精确的处理。

在一些实施例中，测定结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值包括指示值的时间依赖性监测，例如随着时间的推移重复进行测定/检测步骤并监测指示值的过程。另外或可选择的，测定FRET化合物的存在和/或存在数量的指示值包括指示值的时间依赖性的监测，例如随着时间的推移重复进行确定/检测步骤并监测指示指示值的过程。

在一些实施例中，其中第一和/或第二核苷酸进行等温扩展，结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值和/或表示FRET化合物的存在和/或存在数量的指示值的时间依赖性可以包括每秒、每2秒、每3秒、每5秒、每10秒、每20秒、每30秒、每60秒、每90秒或每120秒进行测定/检测步骤。

在一些实施例中，其中第一和/或第二核苷酸进行循环扩展，表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值和/或表示FRET化合物的存在和/或存在数量的指示值的时间依赖性可以包括每一个循环、每两个循环、每三个循环、每四个循环、每五个循环进行测定/检测步骤。

在进一步的实施例中，表示第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值是基于报告化合物的存在和/或存在数量的指示值以及第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值相关的校正曲线决定的。

在一些实施例中，该方法进一步包括在进行一定数量的报告化合物的子集簇与至少一定数量的第二核苷酸的子集簇形成复合体的步骤之后，从结合成员上释放剩余的报告化合物子集，捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的一定数量的报告化合物子集簇，并测定结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值。这里所用的术语“释放”指从结合成员上分开的或释放的报告分子。这是可以被实现的，例如通过裂解任何共价键的酶促反应或在这样的情况下，其中核苷酸报告分子通过互补碱基配被报告特异核苷酸捕捉分子耦合到结合成员上，通过增加进行测定的反应室的温度，导致核苷酸链分离(即变性)。

在进一步的实施例中，释放、形成复合物、捕捉和测定步骤是重复N次，其中N是一个大于或等于1的整数。换句话说，该方法是以循环方式进行。在具体的实施例中，该整数N是≥5,≥10或≥20。

另外，以下步骤是可以同时进行的，一定数量的报告化合物的子集与至少一定数量的第二核苷酸的子集形成复合物的步骤，和剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的一定数量的报告化合物子集的捕捉步骤。

在另一个实施例中，以下的步骤都是同时进行的，步骤(i)每一个形成的复合物包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物，(ii)一定数量的报告化合物子集与至少一定数量的第二核苷酸子集形成复合物，(iii)捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的一定数量的报告化合物子集。

在一些实施例中，该方法进一步包括以第一和第二核苷酸为目标进行扩增，即以相同的物质为目标来实施进一步检测之前，为了帮助进一步检测，增加其在样品中的存在数量。

在一定数量的报告化合物与至少一定数量的第二核苷酸的子集形成复合物的步骤之前，第一和第二核苷酸的扩展可以被启动。尤其是，以多种核苷酸为目标的扩增，当允许报告化合物与第二核苷酸形成复合物的时候，未与第二核苷酸复合的报告化合物将在结合成员上被重新捕捉。

在一个具体的实施例中，以下的步骤都是同时进行的，步骤(i)每一个形成的复合物包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物，(ii)一定数量的报告化合物子集与至少一定数量的第二核苷酸子集形成复合物，(iii)捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的一定数量的报告化合物子集，(iv)以第一和/或第二核苷酸为目标进行扩增

一般，核苷酸扩增是通过等温扩增方法实施的。在等温条件下扩增核苷酸避免了热循环的使用。对本领域技术人员来说有几种等温核苷酸扩增方法是已知的，包括转录介导的扩增，基于核苷酸序列的扩增，RNA介导的扩增技术，链置换扩增，滚环扩增，环介导的等温扩增，等温多重置换扩增，解旋酶依赖性扩增，单引物等温扩增，和循环依赖解旋酶扩增。等温核苷酸扩增技术参照文献(P.Gill and A.Ghaemi,Nucleosides NucleotidesNucleic Acids,27(3):224-243(2008))。

在这里所述的方法中使用的一个等温扩增的实例是切口酶扩增反应(NEAR)，其可以采用一种链置换DNA聚合酶，在由切口酶造成的切口处启动，从靶标序列上快速扩增出很多短核苷酸。

在这里所述的方法中使用的一个等温扩增的实例是环介导的等温扩增(LAMP)，其使用如4-6个引物识别如靶标DNA的6-8个特别的区域。链置换DNA聚合酶启动合成，两个引物形成环结构来促进随后的几轮扩增。

在这里所述的方法中使用的一个等温扩增的实例是链置换扩增(SDA)，其依赖于链置换DNA聚合酶，典型的为Bst DNA聚合酶，大片段或Klenow片段(3'-5'外切)，在切口位点启动，该位点被包含在引物中由有限直链限制性内切酶或切口酶造成。切口位点被每一次聚合酶的置换步骤重新生成，导致指数式扩增。

在这里所述的方法中使用的一个等温扩增的实例是解旋酶依赖的扩增(HDA)，其采用解旋酶的双链DNA解旋活性，通过链置换DNA聚合酶使得引物退火并延伸。像PCR，该系统只需要两个引物。

在一些实施例中，在等温扩增过程中，上述的FRET化合物如分子信标被用于测定第一核苷酸的存在和/或存在数量，并且上述的报告化合物的用于测定第二核苷酸的存在和/或存在数量。在这些实施例中，第一核苷酸的存在和/或存在数量可以通过FRET化合物的方式来确定，例如分子信标，其可以与第一核苷酸特异的结合，并根据溶液中第一核苷酸的存在数量，在溶液中产生上述的信号。第二核苷酸的存在和/或存在数量可以通过检测标记的报告化合物在结合成员表面如微阵列产生的信号被测定，，该标记报告化合物同时与第二核苷酸和附着在结合成员如微阵列的表面上的报告特异捕捉分子特异的结合。

在可选择的实施例中，核苷酸扩增是通过循环扩增的方式进行的。循环扩增可以包括可以等于或大于2的任何数量的扩增循环。通常循环扩增反应包括至少10个或至少20个循环。一个循环扩增的实例是聚合酶链式反应(PCR)。PCR是分子生物学的标准方法，其在文献中被详细描述如(Sambrook et al.,supra)和(Ausubel,F.M.et al.,supra.)。一般PCR采用热稳定DNA聚合酶进行双链DNA分子的扩增。

在一些实施例中，在扩增中使用的DNA聚合酶具有核苷酸外切酶活性，特别是5'→3'核苷酸外切酶活性。这样的DNA聚合酶实例尤其包括Taq DNA聚合酶或Tth DNA聚合酶(其可以从多个供应商市售获得)。DNA聚合酶通过这种5'→3'核苷酸外切酶活性可以侵袭与第二核苷酸结合的报告分子的5'末端，导致这个报告分子被逐渐降解。结果就是在扩增反应过程中结合成员上捕捉的报告化合物的数量又减少了。可选择的，采用的DNA聚合酶也可以展现3'→5'核苷酸外切酶活性(“校对活性”)用来去除在新的DNA链上特定序列位置上添加的不正确的核苷酸。这样的同时具有核酸外切酶活性的DNA聚合酶的实例尤其包括PwoDNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶(两种酶都可以从各种供应商市售获得)。假如想要降解报告化合物来产生和/或促进可检测信号，一般使用具有5'→3'核苷酸外切酶的DNA聚合酶。

在一些实施例中，在循环扩增过程中上述的FRET化合物如TaqMan探针被用于测定第一核苷酸的存在和/或存在数量，并且如上所述的报告化合物被用于测定第二核苷酸的存在和/或存在数量。在这样的实施例中，第一核苷酸的存在和/或存在数量可以通过FRET化合物的方式被测定，FRET化合物例如TaqMan探针与第一核苷酸特异结合，并且如上所述在溶液中产生信号依赖于溶液中存在的第一核苷酸的扩增数量。第二核苷酸的存在和/或存在数量可以通过检测由标记报告化合物在结合成员如微阵列的表面产生的信号来测定，该标记报告化合物同时与第二核苷酸和附着在结合成员如微阵列的表面上报告特异捕捉分子特异的结合。

如果第一和/或第二核苷酸是一种RNA分子，该方法进一步包括在以第一和/或第二核苷酸为目标的为目标扩增前，如上所述以第一和/或第二核苷酸为目标进行反转录。反转录是另一种分子生物学的标准方法，也在文献中被详细描述如(Sambrook et al.,supra)和(Ausubel,F.M.et al.,supra.)。

在一个测定核苷酸存在和/或存在数量的典型实施例中，如样品中的第一核苷酸，扩增对照对照可以被用于检测扩增抑制物。特别的，第二核苷酸可以是一种内部对照对照核苷酸，选自内部阳性扩增对照和对照内部阴性扩增对照。这样的对照对照核苷酸可以被添加到样品中，如上所述的体液样品。

内部扩增对照的构建可用几种方法进行，在于本技术人员的选择和判断。内部扩增对照可以是质粒DNA，其携带克隆的内部扩增对照序列或纯化的PCR产物。在一些实施例中，内部扩增核苷酸是一种人工合成核苷酸，其在通常条件下是不存在于待分析的体液样品中的。例如内部对照核苷酸是在扩增前被反转录的盔甲RNA。

内部阳性扩增对照核苷酸或竞争性内部扩增对照核苷酸或内部阳性对照可以从靶标被分析物的部分序列或全序列来设计。特别的，第一核苷酸和内部阳性扩增对照核苷酸可以具有相同的引物结合位点。例如，内部阳性扩增对照核苷酸可以具有与第一核苷酸的部分序列相对应的序列。共享的同一引物结合位点可以允许相似的或基本相同的扩增条件。为了避免第一核苷酸和内部阳性扩增对照核苷酸间的竞争，可以过量使用相应的扩增子引物。

在这个实施例中，结合成员上的报告化合物结合位点，如报告特异捕捉探针，是内部阳性扩增对照核苷酸特异的，允许其区分在结合成员上的内部阳性扩增对照核苷酸和任意其他对照核苷酸。

内部阴性扩增对照核苷酸或非竞争性内部扩增对照核苷酸可以是一种核苷酸，其序列不必与靶标被分析物或内部阳性扩增对照核苷酸具有同源性。例如，内部阴性扩增对照核苷酸可以具有一种序列，其不包括扩增子引物的引物结合位点，该序列用于扩增靶标核苷酸或第一核苷酸或内部阳性扩增对照核苷酸。

另外，在这个实施例中，在结合成员上的报告化合物的结合位点是内部阴性扩增对照核苷酸特异的，以区分阴性扩增对照核苷酸、内部阳性扩增对照核苷酸以及其他结合成员上的对照核苷酸。在内部阴性扩增对照核苷酸没有扩增时，报告化合物特异的报告化合物结合位点上的信号被希望在整个过程中保持一致，该报告化合物能与内部阴性扩增对照核苷酸形成复合物。例如，对于一个有效的测试，为了报告化合物能与内部阴性扩增对照核苷酸形成复合物，报告化合物上报告化合物特异的结合位点上的信号可能需要与没有报告Ct指示值时保持一致，否则测试被认为无效。

其他对照也可以用于这里所述的方法。例如对于这里所述的内部扩增对照，附加的或可选择的，对照可以选自阳性杂交对照、处理阳性对照、处理阴性对照和试剂对照。

阳性杂交对照可以是一种报告化合物，其不与任何第一和第二核苷酸形成复合物。

处理阳性对照可以是被掺入足够数量的靶标被分析物的阴性样品，并在整个过程中被加工处理。

处理阴性对照可以指被掺入足够数量的与靶标被分析物密切相关但非靶标被分析物的阴性样品，其在整个过程中被加工处理。

非模板对照(空白)指含有各种试剂的对照，但不是靶标或内部扩增对照核苷酸。

对于核苷酸扩增，检测仪器被用于实施该方法，该方法包括一种或多种温度控制单位和/或温度调节单位用来控制和/或调节设备或反应室里面的温度。这样的温度控制单位和/或温度调节单位可以包括一种或多种单独的加热和/或冷却元件，其可以直接接触检测装置的反应室。一般，一种或多种加热和/或冷却元件有导热材料制作成。这样的导热材料的实例尤其包括硅，陶瓷材料如氧化二铝陶瓷，和/或像高级钢，铝，铜，或铜的金属。适用于实施这里所述方法的温度控制单位和/或温度调节的实例性的详细描述也可以在专利WO01/02094中找到，其相关的内容在这里被明确的提及。

反应室中温度的检测可以通过本领域公知的各种方法来进行，如通过使用完整的电阻传感器，半导体传感器，光导传感器，多色染料或液晶。此外反应室中的温度可以通过腔室内的完整的温度传感器、高温计或传感器、或通过来参数随温度的改变来测量，如检测发生表面的折射指数或样品的pH指示值，例如通过测定pH敏感指示剂的颜色改变来测定。

在一些实施例中如出于安全的原因，反应室可以在核苷酸扩增启动之前不可逆的封闭。不可逆的封闭反应室可以采用通过封闭入口，和任意的反应室的出口。例如与反应室连接的通道和/或阀可以是热封闭的或焊接的。通过使热栓与通道或阀接触，从而塑料杯熔化并且通道或阀被锁定，那样通道塑料通道或阀就被热封闭了。

提供第一和/或第二核苷酸的步骤可以包括从样品中包含的生物材料中释放第一和/或第二核苷酸。结果是，样品被加热来破坏细胞膜和/或病毒衣壳(如通过采用如上所述的温度控制单位和/或温度调节单位)。在一些实施例中，这个释放步骤包括使体液样品与溶解试剂接触，例如含有一种或多种洗涤剂的试剂，其可以分裂细胞膜和/或病毒衣壳。这样的溶解试剂是本领域公知的(见例如Sambrook,J.et al.(1989)Molecular,Cloning:ALaboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY)并可以通过很多供应商市售获得。

该方法可以进一步包括使第一和/或第二核苷酸从伴随物中分离。

用于表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值，以及在结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值可以被连续的或同时测定。

接下去，要讨论的检测装置或测定系统或微流体盒的实例，一般能进行大多数这里所述的发放的所有步骤。示例性的检测装置、反应室和相应的方法也在专利WO 2005/108604,WO 2008/055915,WO 2008/135564和T.Ulrich等(T.Ulrich et al.,PloS ONE,7,4,e35438(2012))被详细描述，它们的相关内容在这里被明确指出。

特别的，这里所述的方法可以在一个检测转置中被实施，通过在扩增过程中去除来自溶液的背景信号，该检测装置能检测在结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值。在一个实施例中，这个从检测转置的反应室移除溶液是可逆的。例如，为了扩增和检测，可以使用包含如下所述反应室的检测装置。

特别的，表示溶液中被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值和/或表示在结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值可以在包含结合成员和盖元件的反应室中被检测。结合成员被配制在盖元件上面或在盖元件相对的表面。在这些实施例中，盖元件可以被配置为至少部分可变形的，使得所述反应室具有松弛状态的内部体积和处于压缩状态的内部体积。

在一个具体的实施例中，表示被溶液中的FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值和/或表示在结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值可以在一个反应室中被检测，该反应室包含第一表面、第二表面和能捕捉报告化合物的结合成员，其中第一和第二标记间的距离是可变的，那样反应室具有松弛状态的内部体积和处于压缩状态的内部体积。

特别的，在具有压缩状态内部体积的反应室中，含有未与结合成员连接的可检测标记的液体，从所述结合成员和与结合成员相对的反应室的表面之间的区域被移除。因此，在具有松弛状态内部体积的反应室中，含有未与结合成员连接的可检测标记的液体，不从所述结合成员和与结合成员相对的反应室的表面之间的区域被移除。

特别的，表示被溶液中的FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值在具有松弛状态内部体积的反应室内被测定。另外，表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值可以在具有压缩状态内部体积的反应室内被测定。

例如，测定被捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值可以采用一个操纵柔性盖元件的变形的致动器。盖元件可以在减小反应室体积的方式下变形。在这样的实施例中，测定被捕捉的报告化合物存在和/或存在数量的指示值后，反应室的体积再次增加。另外或可选择的，在检测过程中致动器可以压缩反应室来减少可变该元件与基质间的距离，因而移除含有物质的液体，该物质未与来自检测区域的结合成员耦合。

在一个示例性实施例中，结合成员被配制在反应室中并且所有步骤都在反应室中进行，这些步骤是形成包括第一核苷酸和FRET化合物的每一个复合物；形成一定数量的报告化合物子集与第二核苷酸形成的复合物；和捕捉一定数量的未与结合成员上的第二核苷酸复合的剩余报告化合物子集。另外，以第一和/或第二核苷酸为目标来扩增和/或关于结合成员(重新)捕捉报告化合物也可以在反应室中进行。

提供第一和/或第二核苷酸可以在空间上与各种步骤分开进行，这些步骤是形成每个都含有一个第一核苷酸和一个FRET化合物的复合物，形成一定数量的报告化合物子集与第二核苷酸的复合物；以第一和/或第二核苷酸为目标进行扩增，捕捉未在结合成员上与第二核苷酸形成复合物的一定数量的剩余的报告化合物，测定表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值，以及测定表示在结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值。

这里所述的方法可以如在一个检测装置中进行，该装置包含适用于容纳液体的反应室，其中反应室至少包括一个结合成员，并与一个微流体网络液体连通。例如该方法可在一个检测装置中进行，该装置包括一个硬基质、至少部分覆盖上述基质的可变形的盖元件，在基质中形成的一种结构或反应室，适用于容纳液体并包括至少一个结合成员，该结合成员适用于捕捉报告化合物，并且为了测定

报告化合物的存在和/或存在数量的指示值，任选的微流体网络至少与反应室通过进一步的结构相互连接，如该结构用于提供第一和/或第二核苷酸的结构。检测装置可以被放置在探测器系统的相关位置或里面。这样的探测器系统可以包括一个致动器装置，该致动器用于使可变盖元件压向硬基质。

示例性检测装置如图1所示。这样的检测装置的机械模块可以包括用于可逆的压缩和释放检测装置反应室的活塞或致动器(a)。温度控制模块可以包括在中央(b)有孔的两个珀尔帖元件。结合成员的荧光图(c)，如一个阵列，可以通过光学检测模块获得(d)。通过过程控制模块(e)可以控制所有组件的协调同步进行，也可以控制扩增反应的热动态。获得图像后，将杂交模式通过图像分析模块进行分析。结果可以被可视化为结合成员的各个探针与反应时间的强度曲线图。

示例性反应室如图2所示。试验装置的未经压缩的反应室可以用含有高浓度的荧光标记报告探针的反应混合物填充。因此，结合成员上的杂交模式的成像，例如捕捉探针阵列，对抗背景是行不通的(a)。为了采集图像，可采用活塞或致动器(b)施加压力，结合成员(c)被紧密地压在反应室的顶部，从而移动所述荧光液(d)。移动的液体可以被压入一个完整的气动弹簧(e)中。获取图像(f)之后反应室被允许松弛和液体样品可以回到松弛的反应室中。

在上述的测试装置和反应室中进行的示例性方法中，样品可以包含有竞争性的报告化合物和分子信标，一旦形成供体发色团特异的扩增子，样品中的荧光信号就改变了。结合成员可以包括具有报告特异捕捉化合物的微阵列，这个报告特异捕捉化合物适用于与报告化合物形成复合物，并在微阵列上生成荧光信号。报告化合物也对扩增产物的序列具有特异性，例如用作内部阳性扩增对照或作为内部阴性对照的模拟片段。反应开始后，溶液与微阵列的图像被交替地制作出(见图3)。

对来自溶液和来自微阵列的图形分别进行数据分析(见图4)。

如图4a所述，由于分子信标与第一核苷酸的合成扩增产物形成复合物，溶液中的荧光强度增加。图4a所示是NEAR扩增的特征曲线。图4b显示了由于报告化合物与溶液中第二核苷酸的合成扩增产物结合导致荧光信号减少。

这里所述的方法可以被用于免疫测定和核苷酸检测的床边护理。

下面的实施例仅用于说明具体实施方案，并且不应当被理解为以任何方式来限制本发明的范围。

实例1

肺结核DNA利用等温NEAR在如图1和图2所示的检测装置中进行扩增，该检测装置包括一个可压缩的反应室和像结合成员一样能捕捉报告化合物的阵列。样品包括引物(反向引物：Tb_DR_R25c 5’-AGACTCCATATGGAGTCTCATCTTTCCGTCCCC-3’,正向引物：Tb_DR_F165’-CGACTCCATATGGAGTCGTCGTCAGACCCAAAA-3’)，分子信标MB_P2_7(5’-TCGGGGCAGACCCAAAACCCCGA-3’)，报告化合物Anti_Tb_Target_CMA(5’-CCCAAAACCCCGAGAGG-3’)，酶(切口酶和链置换酶)和靶标DNA。作为对照反应，没有靶标DNA的情况下进行这个扩增也就是没有模板对照。这个扩增在56℃进行600秒。每15秒采集图像。结果如图5a)和图5b)所示。

如图5a)所示，图5a显示了竞争性报告监测扩增与分子信标间的比较，溶液中的荧光增加了，由于分子信标与靶标DNA形成复合物。此外，也可以看出阵列上报告化合物的信号减少了因为报告化合物与NEAR扩增产物形成的复合物。

图5b)显示了在没有靶标DNA的对照反应中竞争性报告监测扩增与分子信号间的比较，因为缺少靶标DNA，溶液中的荧光随时间保持不变。此外，除了典型的漂白效果，在阵列上报告化合物的信号不会减少。

实例2：

存在一个内部阳性对照(IPC)和一个阳性杂交对照(PHC)的情况下肺结核DNA的检测

肺结核DNA(靶标DNA)和内部阳性对照DNA(IPC)利用等温NEAR在如图1和图2所示的检测装置中进行，该检测装置包括一个可压缩的反应室和像结合成员一样能捕捉报告化合物的阵列。靶标被分析物和IPC的模板在引物结合位点上具有相同的序列，但与报告化合物和FRET化合物(这里是分子信标)的结合位点的序列各自不同。因此两者的扩增子可以被相同引物扩增并且可以通过不同的探针彼此独立地被检测到。

扩增反应混合物包括引物(反向引物TB_DR_25c，正向引物TbDR_F16)，分子信标MB_PS_7,IPC报告化合物和IPC。此外，不能与IPC扩增子形成复合物的报告化合物被添加作为阳性杂交对照(PHC：5‘-ccgactactacgggacgctggga-3‘)为了显示IPC报告物信号强度的改变是存在IPC扩增子的特异表现。因此这个PHC对照在杂交动力学方面不同于IPC报告物。

模板靶标：100GE(基因组当量)

模板IPC500GE

正向引物浓度750nM

反向引物浓度50nM

报告物浓度IPC:10nM

报告物浓度PHC:10nM

分子信标浓度200nM

扩增在56℃进行约600秒。每15秒采集图像。结果如图6和7所示。

虽然内部阳性对照DNA最初比靶标DNA多5倍，靶标DNA可以用与内部阳性对照DNA相同的测定方法来被检测(检测溶液中FRET化合物捕捉的靶标被分析物，以及检测阵列上的内部阳性对照报告物)。由于溶液中缺乏竞争物，PHC信号强度过程具有二级动力学特点。

一些实施例涉及：

1.样品中核苷酸的存在和/或存在数量的测定方法，包括

(a)提供

一定数量的第一核苷酸；

一定数量的第二核苷酸；

一定数量的FRET化合物能与第一核苷酸形成复合物，其中FRET化合物包括第一核苷酸的区域特异的结合区域，以及第一可检测标记，其具有一种未复合状态，即第一可检测特征和一种复合状态，即第二可检测特征。

一定数量报告化合物能与第二核苷酸形成复合物，其中每一个报告化合物包括第二核苷酸特异的结合区域和第二可检测标记。

结合成员能捕捉报告化合物；其中形成的第二核苷酸与报告化合物的复合物

抑制了结合成员对报告化合物的捕捉；

(c)一定数量的报告化合物的子集与第二核苷酸形成复合物；

(d)捕捉未与结合成员上的第二核苷酸形成复合物的剩余的报告化合物的子集；

(e)测定表示FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值；

2.实施例的方法进一步包括测定表示第二核苷酸存在和/或存在数量的指示值，基于结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值。

3.实施例1或2的方法中，其中第一可检测标记是一个荧光标记。

4.实施例1至实施例3中的任意的方法中，其中第二可检测标记是一个荧光标记。

5.实施例1至实施例4中的任意方法中，其中第一可检测标记和第二可检测标记都是荧光标记。

6.实施例5的方法中，其中第一可检测标记和第二可检测标记发射的波长范围为300nm至850nm。

7.在实施例5或实施例6的方法中，其中第一可检测标记和第二可检测标记是完全相同的。

8.实施例1至实施例7的任意方法中，其中被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和存在数量的指示值是以FRET化合物的复合状态被测定的。

9.实施例1至实施例8的任意方法中，其中第一核苷酸是一种被分析物。

10.实施例1至实施例9的任意方法中，其中第二核苷酸是选自第二被分析物和对照核苷酸。

11.实施例1至实施例10的任意方法中，其中每个样品中第一核苷酸的存在数量小于100个拷贝。

12.实施例1至实施例11的任意方法中，其中第二核苷酸是存在的，其存在数量是每个样品100个拷贝或更多。

13.实施例1至实施例12的任意方法中，其中以下步骤是同时进行的，(i)每一个形成的复合物包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物，(ii)一定数量报告化合物子集与至少一定数量的第二核苷酸子集形成复合物，(iii)捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合一定数量的报告化合物的子集。

14.实施例1至实施例13的任意方法中，进一步包括以第二和/或第二核苷酸为目标的扩增，其中可选择的，在一定数量的报告化合物的子集与至少一定数量的第二核苷酸的子集形成复合物的步骤之前，第一和第二核苷酸的扩增被启动了。

15.在实施例14的方法中，其中以下的步骤是同时进行的，(i)每一个形成的复合物包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物，(ii)一定数量的报告化合物子集与至少一定数量的第二核苷酸的子集形成复合物，(iii)捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的一定数量的报告化合物的子集，，以及(iv)以第一和/或第二核苷酸为目标进行扩增。

16.在实施例14或15的方法中，其中第二核苷酸可以选自阳性扩增对照和阴性扩增对照。

17.实施例1至实施例16的任意方法中，其中结合成员包括一个或多个不同的报告特异捕捉化合物，其能捕捉结合成员上的报告化合物。

18.在实施例17的方法中，其中报告特异捕捉化合物是寡核苷酸。

19.在实施例17和18的方法中，其中不同的报告特异捕捉化合物被配制在与结合成员有关的不同位置。

20.在实施例17和19的方法中，其中通过与报告特异捕捉化合物形成复合物，报告化合物在结合成员上被捕捉。

21.在实施例17和20的方法中，其中能与第二核苷酸形成复合物的报告化合物的至少部分互作位点也能与报告特异捕捉化合物形成复合物。

22.在实施例17和21的方法中，其中报告特异捕捉化合物与第二核苷酸竞争来与报告化合物形成复合物。

23.在实施例1至实施例22的方法中，其中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值和/或表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值是在含有结合成员和盖元件的反应室中被测定的。

24.在实施例23的方法中，其中盖元件被配制为至少部分可变形的，那样反应室具有一个松弛状态的内部体积和一个压缩状态的内部体积。

25.在实施例24的方法中，其中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值是在具有松弛状态内部体积的反应室中被测定的。

26.在实施例23至25的方法中，其中表示在结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值是在具有压缩状态内部体积的反应室中被测定的。

27.在实施例1至26的任意方法中，其中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值，及表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值是连续的或同时被测定的。

28.在实施例1至27的任意方法中，其中报告化合物是寡核苷酸。

29.在实施例1至28的任意方法中，进一步包括在以第一和/或第二核苷酸为目标进行扩增前，以它们为目标进行反转录。

30.在实施例14至29的任意方法中，其中扩增包括使双链核苷酸变性的步骤，其中双链核苷酸包括报告化合物与第二核苷酸的复合物，报告化合物与报告特异捕捉化合物的复合物，双链报告化合物和双链第一和/或第二核苷酸，和/或扩增包括引物化合物对第一和/或第二核苷酸退火的步骤，其中可选择的退火步骤是与形成复合物的步骤和/或捕捉报告化合物的步骤同时进行的，形成的复合物的步骤是一定数量的报告化合物子集与至少一定数量的第二核苷酸子集形成的复合物，捕捉步骤是捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的一定数量的报告化合物子集的步骤。

31.在实施例14至30的任意方法中，其中扩增是等温扩增方法，其中可选择的等温扩增方法是等温NEAR。

32.在实施例14至30的任意方法中，其中扩增是一个循环扩增，其中可选择的循环扩增是一个PCR，其中可选择的进行PCR包括采用具有核苷酸外切酶活性的聚合酶，其中表示在结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值可选择在循环扩增进行至少一个循环后被测定的，可选择在循环扩增的每个循环后被测定，其中表示第一和/或第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值可选择在每次测定结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值后被测定。

33.在实施例2至32的任意方法中，其中表示第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值是基于校正曲线被测定的，该校正曲线与报告化合物的存在和/或存在数量的指示值以及第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值有关。

34.测定样品中核苷酸的存在和/或存在数量的方法包括在反应室中提供一定数量的第一核苷酸；一定数量的第二核苷酸；一定数量的能与第一核苷酸形成复合物的FRET化合物，，其中FRET化合物包括第一核苷酸特异的结合域，并且第一可检测标记具有一种未复合状态，即第一可检测特征，和一种复合状态，及第二可检测特征；以及一定数量的能与第二核苷酸形成复合物的报告化合物，其中每一个报告化合物包括第二核苷酸特异的结合域和第二可检测标记；其中反应室包括能捕捉报告化合物的结合成员，其中第二核苷酸报告化合物形成的复合物抑制了结合成员对报告化合物的捕捉，被配制的盖元件是至少部分可变形的，那样反应室具有松弛状态的内部体积和压缩状态的内部体积；以第一和/或第二核苷酸和为目标进行扩增；每一个形成的复合物包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物；

一定数量的报告化合物子集与一个第二核苷酸形成复合物；

捕捉未与结合成员上的第二核苷酸复合的剩余的一定数量的报告化合物的子集；测定在具有松弛状态内部体积的反应室里的溶液中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值；

测定在具有压缩状态内部体积的反应室里中表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值，并且，基于表示结合成员上捕捉的报告化合物存在和/或存在数量的指示值，测定第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值。

Claims

1.检测样品中核苷酸的存在和/或存在数量的方法包括

(a)提供

一定数量的第一核苷酸；

一定数量的第二核苷酸；

一定数量的能与第一核苷酸形成复合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括第一核苷酸特异的结合域，和第一可检测标记，其可以处于一种未复合状态，即第一可检测特征，以及处于一种复合状态，即第二可检测特征；

一定数量的能与第二核苷酸形成复合物的报告化合物，其中每一个报告化合物包括第二核苷酸特异的结合域和第二可检测标记；

结合成员能捕捉报告化合物；其中第二核苷酸与报告化合物形成的复合物抑制了结合成员对报告化合物的捕捉；

(b)以第一和/或第二核苷酸为目标进行扩增；

(c)每一个形成的复合物包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物；

(d)一定数量的报告化合物子集与一个第二核苷酸形成复合物；

(e)捕捉未与结合成员上的第二核苷酸形成复合物的剩余的一定数量的报告化合物子集；

(f)测定被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值；

(g)测定表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值。

2.在权利要求1所述的方法中，进一步包括基于结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值，测定表示第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值。

3.在权利要求1或2所述的方法中，其中第一可检测标记是一种荧光标记。

4.在权利要求1至3所述的方法中，其中第二可检测标记是一种荧光标记。

5.在权利要求1至4所述的方法中，其中第一可检测标记和第二可检测标记都是荧光标记。

6.在权利要求5所述的方法中，其中第一可检测标记和第二可检测标记发射的波长范围为300nm至850nm。

7.在权利要求5或6所述的方法中，其中第一可检测标记和第二可检测标记是完全相同的。

8.在权利要求1至7所述的任意方法中，其中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值是在FRET化合物处于复合状态时被测定的。

9.在权利要求1至8所述的任意方法中，其中第一核苷酸是一种被分析物。

10.在权利要求1至9所述的任意方法中，其中第二核苷酸选自第二被分析物和对照核苷酸。

11.在权利要求1至10所述的任意方法中，其中每个样品中第一核苷酸的存在数量不少于100个拷贝。

12.在权利要求1至11所述的任意方法中，其中每个样品中第二核苷酸的存在数量为100个拷贝或更多。

13.在权利要求1至12所述的任意方法中，其中以下步骤是可以同时进行的，(i)每一个形成的复合物中包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物，(ii)一定数量的报告化合物子集与至少一定数量的第二核苷酸子集形成复合物，(iii)捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的一定数量的报告化合物子集。

14.在权利要求1至13所述的任意方法中，其中在一定数量的报告化合物子集与至少一定数量的第二核苷酸子集形成复合物之前，第一和第二核苷酸的扩增被启动。

15.在权利要求1至13所述的任意方法中，其中以下步骤是同时进行的，这些步骤为(i)每一个形成的复合物中包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物，(ii)一定数量的报告化合物子集与至少一定数量的第二核苷酸子集形成复合物，(iii)捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的一定数量的报告化合物子集，(iv)以第一和/或第二核苷酸为目标进行扩增。

16.在权利要求14或15所述的方法中，其中第二核苷酸选自阳性扩增对照和阴性扩增对照。

17.在权利要求1至16所述的任意方法中，其中结合成员包括一个或多个不同的报告特异捕捉化合物，其能捕捉结合成员上的报告化合物。

18.在权利要求17所述的方法中，其中报告特异捕捉化合物是寡核苷酸。

19.在权利要求17和18所述的方法中，其中不同的报告特异捕捉化合物被排列与结合成员相关的不同位置。

20.在权利要求17至19所述的任意方法中，其中通过与报告特异捕捉化合物形成复合物，报告化合物在结合成员是被捕捉。

21.在权利要求17至20所述的任意方法中，其中能与第一核苷酸形成复合物的报告化合物，至少它的部分互作位点也能与报告特异捕捉化合物形成复合物。

22.在权利要求17至21所述的任意方法中，其中报告特异捕捉化合物和第二核苷酸竞争与报告化合物形成复合物。

23.在权利要求1至22所述的任意方法中，其中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值，和/或表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值是在含有结合成员和盖元件的反应室被测定的，其中可选择的盖元件被配制为至少部分可变形的，那样反应室具有松弛状态的内部体积和压缩状态的内部体积。

24.在权利要求1至22所述的任意方法中，其中表示被FTET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值，和/或表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值是在反应室被测定的，该反应室含有第一表面、第二表面和能捕捉报告化合物的结合成员，其中第一和第二表面间的距离是可变的，那样反应室具有松弛状态的内部体积和压缩状态的内部体积。

25.在权利要求24所述的方法中，其中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值是在具有松弛状态内部体积的反应室中被测定的。

26.在权利要求23至25所述的方法中，其中表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值是在具有压缩状态内部体积的反应室中被测定的。

27.在权利要求1至26所述的任意方法中，其中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值以及表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值是被连续或同时测定的。

28.在权利要求1至27所述的任意方法中，其中报告化合物是寡核苷酸。

29.在权利要求1至28所述的任意方法中，进一步包括在以第一和/或第二核苷酸为目标进行扩增前，进行以第一和/或第二核苷酸为目标的反转录。

30.在权利要求14至29所述的任意方法中，其中扩增包括双链核苷酸的变性步骤，其中双链核苷酸包括报告化合物与第二核苷酸的复合物，报告化合物与报告特异捕捉化合物的复合物，双链报告化合物和双链第一和/或第二核苷酸，和/或扩增包括引物化合物对第一和/或第二核苷酸的退火步骤，其中可选择性的退火步骤与形成复合物的步骤和/或捕捉报告化合物的步骤同时进行，所形成复合物为一定数量的报告化合物子集与至少一定数量的第二核苷酸子集形成的复合物，捕捉步骤为捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的一定数量的报告化合物子集的步骤。

31.在权利要求14至30所述的任意方法中，其中扩增是等温扩增方法，其中可选择的等温扩增方法是等温NEAR。

32.在权利要求14至30所述的任意方法中，其中扩增是循环扩增，其中可选择的循环扩增是一种PCR，其中可选择的PCR的实施包括使用具有外切酶性的聚合酶，其中可选择的表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值的测定是在循环扩增进行至少一个循环后，可选择的是在循环扩增进行每一次循环后，其中可选择的表示第一和/或第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值是在每次测定表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值之后被测定的。

33.在权利要求2至32所述的任意方法中，其中表示第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值是基于校正曲线被测定的，校正曲线与表示报告化合物的存在和/或存在数量的指示值以及表示第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值有关。

34.测定样品中核苷酸的存在和/或存在数量的方法包括：

在反应室中提供一定数量的第一核苷酸；一定数量的第二核苷酸；一定数量的能与第一核苷酸形成复合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括第一核苷酸特异的结合域，和第一可检测标记，其处于未复合状态时，为第一可检测特征，处于复合状态时，即第二可检测特征；以及一定数量的报告化合物，能与第二核苷酸形成复合物，其中每一个报告化合物包括第二核苷酸特异的结合域和第二可检测标记；其中反应室包括能捕捉报告化合物的结合成员，其中第二核苷酸与报告化合物形成的复合物抑制了结合成员对报告化合物的捕捉，盖元件被配制为至少部分可变形的，那样反应室具有松弛状态的内部体积和压缩状态的内部体积；以第一和/或第二核苷酸为目标进行等温扩增；每一个形成的复合物包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物；

一定数量的报告化合物子集与一个第二核苷酸形成复合物；

捕捉剩余的未与结合成员上的第二核苷酸复合的一定数量的报告化合物子集；

测定具有松弛状态内部体积的反应室的溶液中被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值；

测定具有压缩状态内部体积的反应室中结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值；并且基于结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值，测定表示第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值。

35.测定样品中核苷酸的存在和/或存在数量的方法包括

向反应室中导入一定数量的第一核苷酸；一定数量的第二核苷酸；一定数量的能与第一核苷酸复合的FRET化合物，其中FRET化合物包括第一核苷酸特异的结合域，和第一可检测标记，其处于未复合状态时，即为第一可检测特征，处于复合状态时即为第二可检测特征；和一定数量的报告化合物，能与第二核苷酸形成复合物，其中每个报告化合物包括第二核苷酸特异的结合域和第二可检测标记；其中反应室包括第一表面、第二表面和能捕捉报告化合物的结合成员，其中第一和第二表面间的距离是可变的，那样反应室具有松弛状态的内部体积和压缩状态的内部体积，并且其中第二核苷酸与报告化合物形成的复合物抑制了结合成员对报告化合物的捕捉；

以第一和/或第二核苷酸为目标来进行等温扩增；每一个形成的复合物包括一个第一核苷酸和一个FRET化合物；

一定数量的报告化合物子集与第二核苷酸子集形成复合物；

测定在具有松弛状态内部体积的反应室的溶液中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在数量的指示值；

测定在具有压缩状态内部体积的反应室中表示被结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值，并基于表示结合成员上捕捉的报告化合物的存在和/或存在数量的指示值，测定表示第二核苷酸的存在和/或存在数量的指示值。