CN105543084B - 分析系统 - Google Patents

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Abstract

一种分析系统,该系统包括:致动器单元，适于控制微流体装置的弹性覆盖元件,从而控制微流体装置结构中的和/或微流体网络中的流体的流动；荧光检测单元，适于检测所述结构中表明靶分子存在或存在数量并且被至少一个结合元件捕获的物质；用于机械驱动制动元件的驱动元件；适于将液体运输通过结构和/或微流体网路的运输单元；用于控制制动元件让弹性覆盖元件变形的控制单元；和用于让流体处于一定温度的温度操纵单元。

Description

分析系统
本申请是中国发明专利申请，申请号：2008801002257，题目：分析方法的分案申请
优先权声明
本申请要求2007年7月23日提交的美国申请No.60/951,358的优先权，以其全文引为参考。
发明领域
本发明涉及分析方法，例如多核苷酸的分析方法。
发明背景
生物样品中病原体的存在可以通过分析样品中与病原体的存在有关的多核苷酸来确定。细菌，霉菌和病毒是可以在相关多核苷酸的分析的基础上确定的病原体的例子。
EP 0 637 999公开了通过进行多核苷酸聚合反应在样品中扩增预先选定的多核苷酸的装置。该装置包括显微制造限定出样品入口的基体，以及从入口延伸出的中等尺度的流动系统。中等尺度的流动系统包括多核苷酸聚合反应室，它与入口流体连通，入口提供用于预先选定的多核苷酸的聚合和扩增所需的试剂。装置可用于在反应室(PCR 室)中执行聚合酶链反应(PCR)。PCR室被提供样品多核苷酸，聚合酶，核苷三磷酸，引物和聚合酶链反应所需的其它试剂，装置被提供有用于对反应室内含物的温度进行温度控制的工具，以将温度控制到使双链多核苷酸去杂交，使引物退火，以及使多核苷酸聚合和扩增的温度。
但是，使常规的微流体装置适合地协调各种不同的任务，可能是困难的。
发明简述
对于能够以简单的方式进行样品分析的装置和方法可能存在着需求。
根据示例性的实施方案，提供了装置，所述装置包括刚性的基体，至少部分覆盖着基体的弹性覆盖元件，在基体中形成的第一结构，该结构适于容纳液体并适于释放一种或多种细胞，孢子或病毒的内含物，内含物中包含有靶分子(例如结构或室或孔中干燥的缓冲液)，在基体中形成的第二结构(它可以与第一结构不同)，该结构适于容纳液体并包括至少一个结合元件，该结合元件适于捕获靶分子并用于测定表明靶分子的存在和/或量的值，微流体网路，将至少第一结构和第二结构相互连通，还包括致动器元件，适于通过将弹性覆盖元件压向基体以选择性关闭一部分微流体网路，来实现第一结构和第二结构之间的流体流动。
根据另一示例性的实施方案，提供了装置，所述装置包括有适于容纳液体的结构，其中结构包括至少一个结合元件，并与微流体网路流体连通，以及控制单元，适于控制流体流过微流体网路，由此使得靶分子被捕获在至少一个结合元件上，适于控制结构中靶分子的扩增，并适于控制表明靶分子的存在和/或量并捕获在至少一个结合元件上的化合物的检测。
根据另一示例性的实施方案，提供了方法，所述方法包括将液体容纳在包括至少一个结合元件并与微流体网路流体连通的结构中，控制流体流过微流体网路，由此使得靶分子被捕获在至少一个结合元件上，在结构中扩增靶分子，以及检测能够表明靶分子的存在和/或量并捕获在至少一个结合元件上的化合物。
根据另一示例性的实施方案，提供了装置，所述装置包括有适于容纳液体的结构，其中结构包括有适于捕获第一化合物的第一结合元件，并包括有适于捕获表明第一化合物的存在和/或量的第二化合物(可以与第一化合物不同)的第二结合元件(可以与第一结合元件不同)。
根据另一示例性的实施方案，可以提供装置，其中样品在控制单元的控制下被指导通过微流体装置，由此使得可以执行预定的分析任务。在装置中，可以提供能够执行几个或所有在分析过程中所需的固相结合过程的中心孔/中心结构(也可以被称为第二孔或第二结构)。在结构(可以白称为中心孔)中，捕获样品的靶分子(出于纯化或分离的目的)，扩增靶分子(例如通过聚合酶链反应PCR)，以及执行允许获得与靶分子的存在/不存在或甚至量有关的信息的(例如光学) 检测步骤，是可能的。
因此，可以提供强有力的，全自动的生物化学分析系统，允许以快速准确的方式，并且不需要过多的人力，获得生物化学或医学结果。例如，使用这样的装置，可以定性或定量的方式在患者的全血样品中检测与HIV感染有关的核酸。
接下来，将进一步解释装置的示例性实施方案。然而，这些实施方案也适于所述方法。根据示例性的实施方案，在中心孔中被检测的化合物是靶分子。为此，可以在中心孔中提供特定的结合元件(例如与捕获靶分子所需的结合元件不同的结合元件)。换句话说，在这样的实施方案中，靶分子(例如，源自于游离的或细胞相关病毒例如HIV 的核酸，包括源自于游离病毒的RNA，源自于细胞相关病毒的RNA，前病毒DNA，反转录病毒DNA，即病毒复制的“中间体”，以及源自于前病毒DNA的转录本，即通过宿主DNA基因组的转录获得的RNA 分子)可以与结合元件结合。
或者，也可以提供特定的化合物例如报告化合物，它们能够与例如PCR产物，RNA或DNA结合。在这种方案中，报告化合物可以是被检测的，从而允许间接地获得与样品中靶分子的存在和/或量有关的信息的化合物。
至少一个结合元件可以适于捕获靶分子。例如，至少一个结合元件可以包括能够捕获复合物包括靶分子，例如全病毒核酸的标记的珠子。
至少一个结合元件可以适于捕获表明靶分子的存在和/或量的化合物。因此，不仅可以直接检测单独的个体靶分子，而且还可能间接地检测靶分子，例如通过检测捕获在结合元件上的报告化合物。
至少一个捕获元件可以包括适于捕获靶分子的第一结合元件，并可以包括适于捕获指示靶分子的存在和/或量的报告化合物的第二结合元件(可以不同于第一结合元件)。因此，可以提供两种不同种类的化合物，一种特异性用于在裂解后捕获靶分子，例如含有特异性针对靶多核苷酸的区域的结合部分以及锚定基团的捕获分子；另一种用于检测目的，例如能够与靶多核苷酸形成复合物的报告化合物，复合物与靶多核苷酸形成复合物抑制报告化合物被第二结合元件的捕获。换句话说，捕获可以与检测在功能上去偶联。例如，第一结合元件可以是被构成为与含有捕获分子和靶分子的复合物结合，例如通过与捕获分子的锚定基团结合的珠子，而第二结合元件可以是能够捕获报告化合物的中心孔的表面。作为第二结合元件的中心孔的表面可以包含能够捕获表面上的报告化合物的一种或多种不同的报告化合物特异性捕获分子。
结构，也就是说发生各种不同固相结合过程的中心元件，可以是孔。“孔”可以是在基体上形成并提供可以在其中进行各种分析过程的样品室的缺口或凹陷。这样的孔可以是圆柱形结构或罐形穴，其体积在微升和毫升之间的量级上。中心孔或第二结构可以通过例如密封中心孔的入口，以及任选的密封中心孔的出口被不可逆转地密封。
微流体网路可以包含通道或大量相互连通的通道。“通道”可以是指长度明显大于宽度和高度的流体结构(例如基本上一维的结构)，从而为液体能够沿着它运输提供了通路。可以提供单一通道，或者几个通道可以被相互连通而形成通道系统。这样的通道系统可以允许液体在该系统的分支处从一个通道流到另一个通道。可以将一个或多个孔整合在这样的通道系统中。
除了上述的结构例如“中心”结构之外，微流体网路可以包含至少一个另外的结构。换句话说，除了通道和中心孔之外，可以提供其它的微流体元件，例如其它的通道和/或其它的孔。因此，可以提供孔和通道的复杂的系统。
至少一种其它的结构(例如裂解结构或裂解孔)可以适于释放一种或多种细胞，孢子或病毒的内含物，内含物包括靶分子。因此，这样的其它结构可以是指裂解室，生物化合物例如细胞在其中被迫释放出它们的内含物，用于后续的分析。换句话说，其它结构可以包括含有执行这样的释放内含物的任务的生化试剂的结构，从而提供运输到中心孔中的修饰的样品。就此而言，其它结构，诸如裂解结构可以含有裂解试剂，例如离液序列高的盐，或含有一种或多种裂解细胞膜和/ 或病毒衣壳的去污剂的试剂。可选地或此外，另外的结构例如裂解孔可以适于加热样品以便破坏细胞膜和/或病毒衣壳(例如通过使用或包括下面描述的温度控制单元和/或温度调节单元)。
至少一个另外的结构也可以包括能够与靶分子形成复合物的捕获探针。因此，在存在带有锚定基团的捕获分子的情况下裂解样品是可能的。
至少一个另外的结构(例如含有PCR试剂的孔)可以包括至少一种促进靶分子的扩增的基体。换句话说，可以提供另外的孔，其中含有，即，促进扩增所需的生化试剂。然而，尽管PCR试剂可以包含在另外的结构中，但事实上PCR扩增步骤可以在另一个位置执行，也就是在中心孔中。然而，根据将在下面更详细解释的示例性实施方案，将样品从中心孔通过包含扩增物质的孔再运输返回到中心孔，同时避免样品材料的损失，可能是有利的。促进扩增的物质可以是PCR所需的物质(例如酶，引物，缓冲液等)，将在下面详细描述。
至少一个另外的结构也可以是孔。因此，可以提供通过微流体网路连通的多个孔。但是，在孔之外其它的结构例如通道中进行裂解和/ 或提供扩增材料，也是可能的。
装置可以包含基体，可以在其上和/或其中形成结构。因此，装置的流体容纳部件可以整体整合在基体中。可选地，结构可以在基体上形成，例如印刷上或点上。可以与弹性覆盖元件适合地协同使用的刚性基体材料的例子是聚碳酸酯，聚丙烯，聚苯乙烯，PET，PMMA，聚乙烯，丙烯酸玻璃，PU，PEEK,，PVC，玻璃，等等。
具体来说，基体可以是刚性的，使得它与至少部分覆盖着基体的一个或者多个弹性覆盖元件以非常有效的方式协同使用。具体来说，弹性覆盖元件可以覆盖刚性基体，致动器可以将覆盖元件压向基体，以选择性关闭通道(用于执行阀功能等)。
按照示例性实施方案，基体可以具有第一表面以及与第一表面相对的第二表面。结构可以提供在基体的第一表面(特别是第一主表面) 上和/或中。主表面是在其上构造结构的基体的主要表面。另外的结构可以提供在基体的第二表面(特别是第二主表面)上和/或中。可以提供流体连通结构，特别是透过基体的贯穿孔和/或基体表面部分中的沟槽，将第一表面与第二表面连通。这样的流体连通结构可以布置在第一和第二表面之间，并且可以被构造为在结构与另外的结构之间提供流体连通。在这样的实施方案中，可以对基体的两个相对的主表面进行加工，从而形成微流体结构。这些结构可以通过含有沿着基体的表面形成的通道的连通结构连通，也可以直接穿过基体。因此，可以提供其中基体的两个主表面部分都可以以非常有效的方式使用的装置，因为该基体的两个主表面都可以被加工以提供液体运输任务。可选地，这样的基体可以在一个或两个侧面上用(特别是弹性的)覆盖元件覆盖，以允许有效地控制流体流过两个表面上的流体结构，例如通过致动器作用于一个或两个主表面上的弹性部分。因此，中心基体可以在两个侧面上提供有流体结构。具体来说，这可以允许制造由三个层形成的盒，这三个层是基体以及两个至少部分弹性的覆盖元件。这样的三层结构可以具有(例如弹性的)底部元件和(例如弹性的)覆盖元件，中间夹心有用于容纳微流体结构的中间层(例如是刚性的)。底部元件和/或覆盖元件可以完全覆盖中心基体，也可以仅仅是部分覆盖，例如在需要覆盖功能作为基础进行基于致动器的控制的部位(参见例如图21)。
除了基体之外，装置可以包括至少一个另外的基体，其中在另外的基体上和/或中可以提供另外的结构。基体和另外的基体可以适于彼此之间可以连接，或可以固定，或可以装配，或可以可逆地或可拆卸地安装，使得在基体与另外的基体连接或固定或装配或安装的操作状态下，结构与另外的结构可以变得流体连通。根据这样的实施方案，可以提供模块式构造，其中装置可以通过将几个可以彼此可弹性连接的模块合并起来而形成。相应的盒可以通过模块式构造组形成，其中每个模块可以具有下面的性质，并可以与其它协同形成的模块组合使用：
-它包括具有至少两个流体通路的室；
-室包括刚性的部件和有弹性的部件；
-至少一个流体通路可以通过弹性部件的移动而关闭，并可以实现室的内含物的混合。
至少一个结合元件可以被改造，以便在靶分子的分析过程中，多个固相结合过程发生在至少一个结合元件上。术语“固相结合过程”可以具体包括在功能化/结合元件上任何种类的锚定和杂交等。在本文中，“结合元件或支持元件”可以包括任何物质，被构造为与捕获分子的锚定基团结合的表面或功能化元件，和/或被构造为捕获多核苷酸的表面。固相结合过程可以包括任何其中被分析或检测的分子与固相表面特异性结合的步骤，也就是说，被分析或检测的分子不在溶液中结合，而是结合在固体表面上。
至少一个结合元件可以被改造，以便在靶分子的分析过程中，所有固相结合过程都发生在至少一个结合元件上。换句话说，在这样的实施方案中，没有固相结合过程发生在中心孔/结构之外的其它孔上。这可以允许在单个孔中进行所有固相结合过程，使得微型高效的装置成为可能。至少一个结合元件可以被改造，以便在靶分子的分析过程中，恰好两个固相结合过程发生在至少一个结合元件上。这两个固相结合过程可以涉及从多组分样品中捕获靶分子，以及检测指示靶分子的存在或不存在或量的化合物。在所述实施方案中，这两个步骤在单个孔中进行，允许协同使用孔的供应物执行这两个任务。将这两个任务合并在一个孔中，可以保持液体流动路径短，保持装置小，并保持分析时间短。
在某些实施方案中，至少一个结合元件可以被改造，以便在靶分子的分析过程中，恰好三个固相结合过程发生在至少一个结合元件上。这三个固相结合过程可以涉及从多组分样品中捕获靶分子，捕获来自于靶核酸的反转录的核酸，以及检测指示靶分子的存在或不存在或量的化合物。在所述实施方案中，这三个步骤在单个孔中进行，允许协同使用孔的供应物执行所有这些任务。将这三个任务合并在一个孔中，可以保持液体流动路径短，保持装置小，并保持分析时间短。
或者，至少一个结合元件可以被改造，以便在样品中靶分子的分析过程中，恰好一个固相结合过程发生在至少一个结合元件上。当全部生化分析或实验只包括单个固相结合过程，例如仅仅是为了样品纯化进行预先观察而不是为了检测时，这样的实施方案可能是特别有利的。
位于至少一个结合元件附近的装置的至少一部分可以透过波长范围在基本上1nm到基本上10μm之间的电磁辐射，以便能够对表明靶分子的存在和/或量并捕获在至少一个结合元件上的化合物进行基于电磁辐射的检测。在这种实施方案中，基体的特别是靠近中心孔的部分可以透过用于检测目的的电磁辐射，特别是在近红外，可见光和紫外范围中的电磁辐射。通过采用这种方式，也可能在电磁辐射的基础上 (例如基于荧光的检测)在中心孔中进行检测。当装置位于至少一个结合元件附近的部分可以透过波长范围在基本上400μm到基本上800 μm之间的电磁辐射时，能够进行化合物的光学检测。
装置可以包括温度操纵单元或可以与温度操纵单元相连，该温度操纵单元适于操纵位于结构中的液体的温度。这样的温度操纵单元可以包括加热和/或冷却元件，允许将样品带到特定的温度，或执行特定的温度组合形式或顺序。
温度操纵单元可以被改造，以按照执行聚合酶链反应(PCR)的温度顺序操纵位于结构中的液体的温度。这样的聚合酶链反应可能需要温度循环，例如大约95℃，大约55℃和大约72℃。这样的温度顺序通常必须执行特定的预定时间间隔，并且必须重复预定的多次。
至少一个结合元件可以被构造为与捕获分子的锚定基团结合。具体来说，至少一个结合元件可以被构造为捕获多核苷酸。
至少一个结合元件可以包括选自捕获分子，例如布置在结构的表面上(例如固定在孔中)的报告化合物特异性捕获分子，布置在粒子上(例如珠子上)的捕获分子，布置在结构的多孔表面(例如多孔玻璃结构)上的捕获分子中的至少一个，以及一种或多种不同的捕获分子，例如布置在结构的表面上不同位置的报告化合物特异性捕获分子 (例如不同种类的捕获分子以阵列似的方式固定在孔中，例如在关于竞争性分析的文本中)。在某些实施方案中，至少一个结合元件也可以包括用于捕获锚定基团例如生物素的捕获分子。
结构可以具有基本上1μl到基本上1ml之间的体积，特别是基本上20μl到基本上300μl之间。例如，可以提供具有基本上100μl体积的孔。
基体可以具有成形成以接受插管，为装置供应液体的沟槽。在这样的实施方案中，对于用户来说操纵装置可能是非常容易的，因为只需要将用于样品供应的插管放置在沟槽中，与微流体通道系统适合地匹配和协作，从而允许进行容易的分析，甚至即使是没有特别的经验或训练过的用户也可以进行。
基体可以在结构附近具有窗口部分，可以透过波长范围在基本上 1nm到基本上10μm之间的电磁辐射(也就是说近红外，可见光或紫外辐射)，特别是波长范围在基本上400nm到基本上800nm之间的电磁辐射(具体来说是可见光辐射)，从而允许流过(更准确来说到达)结构或微流体网路的液体的弯月液面的基于电磁辐射的检测。在这样的实施方案中，基体的透光的窗口部分可以通过辐射检测器检测。当泵抽通过微流体网路或结构的流体的弯月液面通过窗口部分时，可以特征性的方式急剧改变通过窗口部分的传播性质，从而在辐射检测器上产生表明弯月液面已经到达装置中的特定区域的事实的信号。该信号可用于触发目的，或作为致动器的控制信号，因为致动器的协同移动和/或温度操纵单元的控制可以适合按照被泵抽通过装置的样品的当前位置来产生。例如，通过采取这样的措施，当发生溢流时，可以检测到预定体积的水或缓冲液已经被泵抽进入装置中。
结构和另外的结构构成的至少一个可以包括两个流体开口。这样的流体开口可以是流体入口和流体出口。
覆盖元件可以是弹性的覆盖元件。特别是与刚性基体配合时，覆盖元件和基体可以形成在三维空间上密封的通道，可以通过作用于覆盖元件上的致动器适合地控制。当覆盖元件的特定位置在外部力量的影响下至少部分可变形时，通过打开或关闭结构或微流体网路选择性地使液体能够或不能流动，是可能的。除此之外，使用这样的覆盖元件，沿着结构运输液体是可能的。
特别是当提供了致动器元件并将其改造成被致动时能够使覆盖元件变形时，可以提供整合有混合，泵抽和/或阀功能的高性能芯片实验室(lab-on-chip)。
任何一个结构可以含有一种或多种具有生物学，生物化学和/或化学活性的物质。因此，当这样的物质，可以包括捕获分子，报告化合物特异性捕获分子，可检测标记物，裂解试剂和PCR试剂，以干燥的形式，特别是冷冻干燥的形式存在于孔中时，提供用户只需要用液体 (例如水，缓冲液和样品)进行填充就可以进行全自动分析的装置，是可能的。当必需的生化成分被提供在不同的孔中时，用户可以简单地基于储存在控制单元中的顺序来开始实验，并可以将水或缓冲液提供给不同的输入室。其余部分将由全自动装置来执行。
通道可以具有基本上50μm到基本上1mm之间，特别是基本上 100μm到基本上300μm之间的宽度(即是在基体的表面平面中垂直于流体流动方向上的维度)。例如，通道的宽度可以是基本上200μm。通道的高度(在垂直于基体的表面平面并垂直于流体流动方向的方向上的维度)可以在基本上20μm到基本上300μm，特别是基本上50μm 到基本上200μm之间的范围内。例如，通道的高度可以是基本上100 μm。与此相比，通道的长度可以远远大于宽度和高度，例如可以大于 1mm，具体来说可以大于1cm，或甚至可以是几厘米。
结构可以包括适合用作液体的运输介质的材料。例如，材料可以包含固体材料，凝胶材料，液体材料中的至少一种及其组合。因此，结构可以是凹陷，或可以由用作液体的载体的材料而形成。
覆盖元件可以包括弹性的膜或弹性的密封件。这样的弹性膜或弹性密封件可以由例如乳胶这样的材料制成，从而使得覆盖元件可以在机械力(例如由致动器元件产生的)的影响下弹性地变形。
装置可以包括适合于被致动以使得覆盖元件变形的致动器元件，从而控制结构和/或微流体网路中液体的流体流动性质。这样的致动器元件可以在控制单元的控制之下，可以具有多个协同作用于弹性覆盖元件上的销针(pin)或型板，从而选择性打开或关闭通道，出于泵抽或混合目的暂时减小通道或孔的体积，等等。
具体来说，致动器元件可以被改造适于控制沿着通道的直线部分的液体的流体流动性质。当流体沿着直线通道流动时，当该通道在特定部分被关闭时，垂直布置的致动器元件可以有效地使流体不能流动。
致动器元件可以被改造以用作阀，用作流体混合器，和/或用作流体泵。
更具体来说，致动器元件可以包括多个被改造适合于被协同致动使得覆盖元件变形的致动器元件，从而按照控制单元确定的流体流动方案控制液体的流体流动性质。因此，当用户选择了包括通过各种不同通道运输流体和样品的特定的实验或分析方法时，控制单元简单地控制致动器元件的各个型板，提供弹性覆盖元件的这种可逆的压缩，从而完全自动地执行分析。
控制单元可以被改造适于控制致动器元件将覆盖元件变形的方式，使得靶分子被捕获在至少一个结合元件上，使得靶分子在结构中被扩增，并使得指示靶分子的存在和/或量并捕获在至少一个结合元件上的化合物被检测。因此，控制单元可以是装置的中央调节器，协调各个不同部件的功能。
致动器元件可以包括一个或多个销针，它们被构造为往复式的。通过在向前方向上移动销针，可以通过在通道中将弹性覆盖元件压向基体而关闭该通道。当销针向后移动时，通道可以被再次打开，允许流体流动。在某些实施方案中，一个或多个销针可以具有至少部分弹性的尖端。
致动器元件还可以被提供成可在垂直于基体的主表面的方向上移动。通过在垂直于平面基体的方向上往复移动，有效地打开和关闭成为可能。特别是，致动器元件可以被提供成可移动的，以选择性关闭至少一部分结构，使得液体不能通过结构进行运输。在另一种操作模式下，致动器元件可以被移动，以选择性打开至少一部分结构，使得液体能够运输通过结构。
致动器元件可以改造成垂直于基体的主表面往复移动，来选择性地使液体能够或不能流动流体通过结构。使用往复的致动器可以允许流体可逆地和选择性地能够或不能流动，允许非常灵活地操作装置，并允许多次使用装置(与其中通道被不可逆关闭以执行单向阀功能的方法相反)。
致动器元件可以适于在垂直于基体的主表面的方向上往复移动，以将液体泵抽通过结构。因此，通过致动器元件控制结构的体积或高度是可能的。致动器元件还可以选择性关闭结构。关闭结构可以在阀功能，混合功能或泵抽功能的背景下进行。但是，在检测阶段使用这样的致动器也是可能的，因为出于检测的目压缩结构和/或结合元件以增加被检测的靶分子的局部浓度，和/或除去背景信号，是可能的。这可以允许增加准确性。
可以提供驱动单元以机械驱动致动器元件，其中驱动单元可以通过控制单元控制。这样的驱动单元可以包括气动驱动机构，液力驱动机构或电磁驱动机构。
至少一个结合元件可以包括三维的介质，例如凝胶，粒子，珠子或多孔基质。三维介质可以布置和构造为可以通过移动致动器元件可逆地压缩。通过采取这样的措施，有可能进行非常准确的检测，因为被检测的分子的局部浓度，可以通过将其上已经结合有指示靶分子的存在或量的化合物或复合物的三维介质(例如珠子)进行压缩来选择性增加。
装置可以适于生物传感器分析装置，微流体盒或芯片实验室。因此，在小规模上，各种不同的生化功能可以被合并，以进行完整的生化实验。
可以提供温度传感器，并被改造适于感应运输通过装置的液体的温度。温度传感器可以整合在基体中，从而感应流过微流体网路的液体的温度。可选地，温度传感器可以布置在致动器元件上，例如在型板类致动器的尖端上，以便当将覆盖元件压向基体时，致动器可以同时测量流体的局部温度。
装置可以包括适于操作液体的温度的温度操纵单元，它优选布置在致动器元件上。这样的温度操纵单元也可以整合在基体中，例如以电热丝的形式整合在基体中，并加热孔中的样品。或者，这样的温度操纵单元可以是外部装置，例如外部电磁辐射源，其中电磁辐射(例如来自激光器)可以被导入孔中，导致使用电磁辐射作为能量源加热孔中的流体。此外可选地，温度操纵单元可以不包括或不仅仅包括加热元件，还可以包括冷却元件。对于这样的实施方案来说，可以不费力地使用珀耳帖致冷器(Peltier cooler)。
可以提供温度操纵单元并改造为适于操作液体的温度，其中温度操纵单元可以包含第一加热元件和第二加热元件，结构被布置在第一加热元件和第二加热元件之间。通过提供这样的两个加热板，一个是连续的板，另一个是环形板，可以在使装置仍然能够使用基于电磁辐射的检测器操作的情况下进行加热，因为环形板中的凹陷可以使电磁辐射被导入到中心孔中，并允许通过凹陷和第二加热元件检测荧光辐射。
根据示例性的实施方案，至少一个加热/冷却元件被弹性地装配。弹性装配加热/冷却元件可以允许容易在第一和第二加热/冷却元件之间插入结构，例如第二结构或中心孔。另外，弹性装配至少一个加热/ 冷却元件可以允许弹性加热/冷却元件与结构的表面弹性配合，所述结构为例如第二结构或者中心孔，从而迫使弹性加热/冷却元件接触结构的表面并且因此进行有效的热传导。
根据示例性的实施方案，弹性装配是弹性装配整个加热/冷却元件。
根据其他示例性的实施方案，弹性装配是指加热/冷却元件本身的弹性。
另外，还可以弹性装配两个加热/冷却元件。这两个加热/冷却元件可以蝶式布置夹在探测装置之间。以相同的方式，单个加热/冷却元件可以被布置成带有反压板。这可以避免当插入探测装置时任何的刮擦，尤其是当在探测装置达到其最终的位置后，加热/冷却元件向探针装置的表面移动时。
在一些实施方案中，加热元件或者冷却元件的每一个或者二者是珀耳帖(Peltier)元件。
可以提供温度调节单元，并被改造为适于调控结构中液体的温度。这样的调控实体可以包括测量实际温度，以及在该测量的基础上进行加热和/或冷却行为，从而将温度调节到所需的值。
可以提供检测单元并被改造为适于检测结构中指示靶分子的存在和/或量，并捕获在至少一个结合元件上的化合物。这样的检测单元可以包括光学检测单元，特别是荧光检测单元。
基体和覆盖元件可以是分别的元件，它们彼此相连。或者，基体和覆盖元件可以由不同材料制成。
可以提供运输单元，并被改造为适于运输液体通过结构和/或微流体网路。这样的运输单元可以包括泵，特别是压缩空气泵，液压泵，蠕动泵和真空泵中的一个。此外，装置可以被改造，使得在正常使用时，重力促使液体以所需的方式流过装置。因此，在运输单元不活动时，液体可以直接按所需方向流动。但是，当运输单元打开时，运输单元的影响可以超过重力的影响，从而允许选择性地起始与重力相反方向的流体流动。因此，重力与特定运输单元的组合可能是非常有利的，可以允许节能运作。
运输单元可以被改造适于通过驱动结构和/或微流体网路中的气泡来运输液体。通过将气泡移动通过装置，可以支持或促进液体运输通过装置。
至少一个过滤器，特别是至少一个熔融玻璃过滤器，可以布置在结构上(也就是说在中心孔的入口和/或出口处)，可以被改造适于防止布置在结构中的至少一个结合元件(例如珠子)从结构中被洗出。在流体流动的影响下，机械力可以作用在结构中的珠子或其它结合元件上。但是，当在结构的入口和/或出口处提供熔融玻璃过滤器，即由烧结材料制成的多孔过滤元件时，可以安全地阻止珠子被洗出中心室。熔融玻璃过滤器可以被提供为环形形状，允许被插入到装置中相应形状的环形沟槽中。
至少一个结合元件可以包括表面功能化。术语“表面功能化”可以是指表面被加工处理成可以进行特定的结合功能这个事实。在这样的实施方案中，结合元件可以是孔的表面的一部分，或连接或结合到孔的表面上。
基体和覆盖元件可以彼此直接接触。或者，基体可以不与覆盖元件直接接触。各种不同的几何构型都可能实现。
基体的位于结构附近的一部分可以透过波长范围在基本上400nm 到基本上800nm之间的电磁辐射，从而允许在结构中进行光学检测。因此，可见光可用于检测目的。这样的检测可以在光吸收，光反射或荧光的产生的基础上进行，例如使用与被检测的分子或复合物结合的荧光标记物。
至少一个结合元件可以被改造，使得在靶分子的分析过程中，至少两个固相结合过程发生在至少一个结合元件的恰好一个上。换句话说，同一个结合元件可用于多个固相结合过程。例如，带有结合基团的珠子可用于将靶分子捕获出样品，并且随后可用于捕获化合物例如被扩增的和标记的靶分子，作为后续检测的基础。
或者，至少一个结合元件可以被改造，使得在靶分子的分析过程中，至少两个固相结合过程发生在不同的至少一个结合元件上。例如，装置包括多个结合元件，并且至少一个结合元件被改造，使得在靶分子的分析过程中，至少两个固相结合过程发生在至少一个结合元件的两个或者多个上。在这样的构造中，例如一方面从样品捕获分子，另一方面检测表明靶分子的成分，是使用两种不同的结合元件来捕获的。例如，可以提供珠子用于将靶分子捕获出样品。另一方面，可以在竞争性分析的情况下使用捕获分子，例如固定在孔中的报告化合物特异性捕获分子，以捕获表明样品中靶分子的存在或量的成分，例如报告化合物。
根据本发明的另一个示例性的实施方案，提供了方法，所述方法包括了形成复合物，每种复合物含有靶核酸和捕获分子，其中每个捕获分子含有特异性针对靶核酸的区域的结合部分，以及锚定基团；将复合物与结合元件相接触，结合元件被构造为与捕获分子的锚定基团结合，从而将复合物结合在结合元件上；对一或多种靶核酸进行扩增；将扩增的靶核酸捕获在相应的结合元件上；以及测定表明被捕获的靶分子的存在和/或量的值。
一或多种靶核酸可以是单链或双链核酸。
方法还可以包括在将一或多种靶核酸进行扩增之前将靶核酸进行反转录。
方法还可以包括将捕获的被扩增的靶核酸从结合元件上释放，并重复将一或多种靶核酸进行扩增和将扩增的靶核酸捕获在相应的结合元件上的步骤。在这样的实施方案中，从结合元件上释放被捕获的扩增的靶核酸，以及重复将一或多种靶核酸进行扩增和将扩增的靶核酸捕获在相应的结合元件上的步骤的循环，可以进行至少10次或至少20 次。
表明被捕获的靶核酸的存在和/或量的值可以在至少一个循环后测定，例如在每个从结合元件上释放被捕获的扩增的靶核酸，以及重复将一或多种靶核酸进行扩增和将扩增的靶核酸捕获在相应的结合元件上的步骤的循环之后。
结合元件可以包括一个或多个能够捕获靶核酸的捕获分子。在这样的实施方案中，靶核酸被一个或多个捕获分子捕获到相应的结合元件上。结合元件还可以包含粒子。
形成包含有靶核酸和捕获分子的复合物的步骤的进行，可以与将复合物与结合元件相接触的步骤在空间上分开。
方法还可以包括对靶核酸进行标记。在例如将一或多种靶核酸进行扩增之前或期间，和/或在将扩增的靶核酸捕获到相应的结合元件上之前，可以通过加入一个或多个可检测的标记物对靶核酸进行标记。一个或多个可检测的标记物可以是荧光标记物。
表明被捕获的靶核酸的存在和/或量的值的测定，可以包括对获得的一个或多个指示值进行时间依赖性的监测。
方法还可以包括在形成包含有靶核酸和捕获分子的复合物之前，提供一或多种靶核酸。提供一或多种靶核酸的步骤可以包括从生物学材料上释放靶核酸。在这样的实施方案中，生物学材料可以选自一种或多种原核细胞，一种或多种真核细胞，一种或多种红细胞，以及一种或多种病毒粒子，以及它们的混合物。此外，从生物学材料中释放靶核酸可以包括将生物学材料与裂解试剂相接触。
提供一或多种靶核酸可以包括提供含有一或多种靶核酸的样品，其中样品可以选自全血，血浆，血清，尿液，痰液，唾液和脑脊髓液。
提供一或多种靶核酸可以与含有靶分子和捕获分子的复合物的接触步骤，对一或多种靶核酸进行扩增的步骤，将扩增的靶核酸捕获到相应的结合元件上的步骤，以及测定表明捕获的靶核酸的存在和/或量的值的步骤，在空间上分开进行。
方法还可以包括将一或多种靶核酸与并存的材料分离开。
在其它的实施方案中，示例性实施方案的方法在上面描述的装置中进行。例如，方法可以在装置中进行，该装置包括刚性基体；至少部分覆盖了基体的弹性覆盖元件；在基体中形成的第一结构，被改造为适于容纳液体，并被改造为适于释放一种或多种细胞，孢子或病毒的内含物，内含物中包含有靶分子，例如靶核酸；在基体上形成的第二结构，被改造为适于容纳液体并包括至少一个结合元件，该结合元件被改造为适于捕获靶分子并被改造为适于测定表明靶分子的存在和/ 或量的值；微流体网路，将至少第一结构和第二结构相互连通；以及致动器单元，被改造为适于通过将弹性覆盖元件压向基体以选择性关闭一部分微流体网路，来实现第一结构和第二结构之间的流体流动。此外，方法可以在装置中进行，该装置包括被改造为适于容纳液体的结构，其中结构包括至少一个结合元件，并与微流体网路流体连通；以及控制单元，被改造为适于控制流体流过微流体网路的方式，使得靶分子例如靶核酸被捕获在至少一个结合元件上，被改造为适于控制结构中的靶分子的扩增，并被改造为适于控制被捕获在至少一个结合元件上的化合物的检测。
装置可以包括被改造为适于容纳液体的第一结构。在这样的实施方案中，包括靶核酸和捕获分子的复合物在第一结构中形成。
此外，装置可以包括第二结构，它被构造用于检测一或多种靶核酸，含有覆盖着第二孔的覆盖元件，以及适于被驱动使得覆盖元件变形的致动器单元。在这样的实施方案中，表明被捕获的靶核酸的存在和/或量的值的测定，可以在第二结构中进行。
此外，将一或多种靶核酸进行扩增和/或将扩增的靶核酸捕获在相应的结合元件上，也可以在第二结构中进行。
使用被致动的致动器使得覆盖元件变形，可以进行表明被捕获的靶核酸的存在和/或量的值的测定。覆盖元件可以被变形，使得第二结构或者中心孔或者检测孔的体积减小。在这样的实施方案中，在测定表明被捕获的靶核酸的存在和/或量的值之后，第二孔的体积可以被重新增加。
按照本发明的另一个示例性实施方案，提供了方法，该方法包括：提供一定量的报告化合物；第一结合元件被构造为与捕获分子的锚定基团结合；第二结合元件能够捕获报告化合物；一定量的靶核酸能够与报告化合物形成复合物；与报告化合物形成复合物抑制了报告化合物被第二结合元件的捕获；一定量的捕获分子，其中每个捕获分子含有特异性针对靶核酸的区域的结合部分以及锚定基团；形成包含有靶核酸和捕获分子的复合物；将复合物与第一结合元件相接触，将复合物结合到第一结合元件上；从第一结合元件上释放出至少一部分量的靶核酸；形成一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸的复合物；将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在第二结合元件上；以及测定表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值。
报告化合物可以含有一种或多种可检测标记，例如两种可检测标记。一种或多种可检测标记可以是荧光标记。此外，报告化合物可以是寡核苷酸。
方法还可以包括根据表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值，来确定表明靶核酸的存在和/或量的值。
方法还可以包括在测定了表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值之后，将剩余部分量的报告化合物从第二结合元件上释放出来；形成一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸的复合物；将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在第二结合元件上；以及测定表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值。在这样的实施方案中，释放，形成复合物，捕获和测定的步骤可以进行额外的N次，其中N是大于或等于1的整数，例如N≥5，N≥10或N≥20。
此外，一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤，以及将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在第二结合元件上的步骤，可以伴随进行。
方法还可以包括将靶核酸进行扩增。在这样的实施方案中，靶核酸的扩增可以在形成一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸的复合物的步骤之前开始。
表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值，可以在一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤，以及将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在第二结合元件上的步骤达到化学平衡之前进行测定。具体来说，表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值，可以在一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤，以及将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在第二结合元件上的步骤开始后1秒到120秒时进行测定。
方法还可以包括在将靶核酸进行扩增之前对它们进行反转录。
第二结合元件可以包括能够将报告化合物捕获在第二结合元件上的一种或多种不同的报告化合物特异性捕获分子。在这样的实施方案中，捕获分子可以是寡核苷酸。不同的报告化合物特异性捕获分子可以布置在相应的第二结合元件的不同位置上。此外，报告化合物可以通过与报告化合物特异性捕获分子形成复合物而捕获在第二结合元件上。报告化合物能够与靶核酸形成复合物的相互作用位点的至少一部分，也能够与报告化合物特异性捕获分子形成复合物。报告化合物特异性捕获分子和靶核酸可以竞争与报告化合物形成复合物。
扩增可以包括变性双链核酸的步骤。双链核酸可以包括报告化合物与靶核酸的复合物，报告化合物与报告化合物特异性捕获分子的复合物，双链的报告化合物和双链的靶核酸。
扩增还可以包括将引物分子与靶核酸退火的步骤。在该实施方案中，退火步骤可以与一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤，和/或将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在第二结合元件上的步骤相伴进行。
扩增可以是循环式的扩增，例如PCR。PCR的进行可以包括使用具有外切核酸酶活性的聚合酶。循环式扩增可以包括至少10个循环或至少20个循环。
表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值，可以在至少一个循环后进行测定，例如在循环式扩增的每个循环后。此外，表明靶核酸的存在和/或量的值，可以在每次表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值被测定之后进行测定。
表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的测定，可以包括指示值的时间依赖性监测。
此外，表明靶核酸的存在和/或量的值，可以根据将表明报告化合物的存在和/或量的值与表明靶核酸的存在和/或量的值相关联的校正曲线来确定。
该示例性实施方案的方法也可以在上述的装置中进行。例如，方法可以在装置中进行，该装置包括刚性基体；至少部分覆盖了基体的弹性覆盖元件；在基体中形成的第一结构，适于容纳液体，并适于释放一种或多种细胞，孢子或病毒的内含物，内含物中包含靶核酸；在基体上形成的第二结构，适于容纳液体并含有至少一个结合元件，该结合元件适于捕获靶核酸并适于测定表明靶核酸的存在和/或量的值；微流体网路，将至少第一结构和第二结构相互连通；以及致动器单元，适于通过将弹性覆盖元件压向基体以选择性关闭一部分微流体网路，来实现第一结构和第二结构之间的流体流动。方法也可以在装置中进行，该装置包括适于容纳液体的的结构，其中结构包括至少一个结合元件，并与微流体网路流体连通；以及控制单元，适于控制流体流过微流体网路，使得靶核酸被捕获在至少一个结合元件上，适于控制结构中的靶分子的扩增，并适于控制被捕获在至少一个结合元件上的化合物的检测。
装置还可以包含适于容纳液体的第一结构。在这样的实施方案中，含有靶核酸和捕获分子的复合物的形成在第一结构中进行。
此外，装置可以包含适于容纳液体的第二结构，在第二结构中可以提供第一以及可选的第二结合元件。在这样的实施方案中，形成含有靶核酸和捕获分子的复合物；将复合物与第一结合元件相接触，以将复合物结合到第一结合元件上；从第一结合元件上释放至少一部分量的靶核酸；形成一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸的复合物；将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在第二结合元件上；以及测定表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值，在第二结构例如中心孔中进行。
测定表明被捕获的报告化合物的存在和/或量的值可以在致动器被致动使覆盖元件变形的情况下进行。覆盖元件变形的方式可以是使得中心孔或者第二结构或者检测孔的体积降低。在这样的实施方案中，中心孔的体积可以在测定表明被捕获的报告化合物的存在和/或量的值后再次增加。
提供一或多种靶核酸可以包括提供含有一或多种靶核酸的样品。样品可以是体积为1μl到50μl的液体样品。此外，样品可以是液体全血样品。
方法还可包括添加一定量的能与报告化合物形成复合物但是不与靶分子或者报告分子特异性捕获分子复合的淬灭剂。淬灭剂化合物可以含有干扰由标记物产生可检测信号的一个或者多个部分(例如，淬灭基团“劫持”从荧光团的激发得到的发射)。例如，淬灭基团可能能够压制或者抑制由报告化合物的可检测标记物发射的信号，例如荧光信号。在这样的实施方案中，淬灭化合物可能能够与报告化合物形成复合物，但是不与靶分子或者报告分子特异性捕获分子复合，使得一种或者多种淬灭基团与复合物内的报告化合物的可检测标记物极接近。
淬灭化合物可以是寡核苷酸。在这样的实施方案中，淬灭寡核苷酸可以含有至少一个与报告寡核苷酸的序列区域互补的特异性序列区域，从而在淬灭化合物和报告化合物之间形成碱基配对。
淬灭基团可以包括常用的淬灭剂例如黑洞淬灭剂(Black Hole Quenchers)(Biosearch Technologies)，Qxl淬灭剂(AnaSpec)和Iowa黑淬灭剂(Iowa blackQuencher)。
淬灭化合物可以如上所述提供在装置的第二结构中。在这样的实施方案中，淬灭化合物可以与未捕获在第二结合元件上的报告化合物形成复合物。
如上所述的装置的第二结构可以在开始靶核酸的扩增之前不可逆地密封。第二结构的不可逆地密封可以通过例如热封与第二结构相连的通道和/或阀，密封(例如，焊接)第二结构的入口以及任选地密封第二结构的出口实现。
根据另一个示例性的实施方案，提供了方法，所述方法包括扩增至少一种靶多核苷酸以形成双链扩增子，将扩增子与被构造为能够选择性结合扩增子(例如，用锚定基团)的表面相接触，使扩增子通过锚定基团结合到表面上，可选地测定扩增子的存在。方法还可以包括在可选的检测步骤后将扩增子从表面上释放，将释放出的扩增子进行另外至少一轮扩增循环，将获得的扩增子与表面相接触，使扩增子通过锚定基团结合到表面上，可选地测定扩增子的存在。方法还可以包括进行释放，进行扩增循环，接触和可选的测定的步骤N次，其中N 是大于或等于1的整数。特别是N≥5，更特别是N≥10，更特别是N≥20。
方法还可以包括在扩增步骤之前，提供靶多核苷酸，形成含有从病原体释放出的靶多核苷酸和至少一个捕获分子的复合物，每个捕获分子含有特异性针对靶多核苷酸的区域的结合部分和锚定基团，以及将复合物与表面相接触，表面被构造为非选择性地与捕获分子的锚定基团结合，从而将复合物与表面非选择性地结合。在这样的方法中，提供多核苷酸可以包括释放一种或多种细胞，孢子或病毒的内含物，内含物中包含靶多核苷酸。释放的步骤可以包括将含有一种或多种细胞，孢子或病毒的样品与裂解试剂和捕获分子相接触。将样品与裂解试剂和捕获分子相接触的步骤可以包括将样品与冷冻干燥形式的裂解试剂和捕获分子相接触。
在这样的方法中，提供靶多核苷酸的步骤可以包括提供相伴的材料，方法还可以包括分离表面结合的复合物和相伴的材料。在这样的方法中，相伴的材料可以包括多核苷酸从中释放出来的至少一种细胞，孢子或病毒的内含物。表面可以是粒子的表面。
根据另一个示例性的实施方案，提供了方法，所述方法包括提供一或多种靶多核苷酸，形成含有靶多核苷酸和至少一种捕获分子的复合物，每个捕获分子含有特异性针对靶多核苷酸的区域的结合部分和锚定基团，以及将复合物与表面相接触，表面被构造为非选择性地与捕获分子的锚定基团结合，从而将复合物与表面非选择性地结合。在这样的方法中，提供的步骤可以包括释放一种或多种细胞，孢子或病毒的内含物，内含物中包含多核苷酸。方法还可以包括将表面结合的复合物与从一种或多种细胞，孢子或病毒释放出的其它内含物分离开来。
根据另一个示例性的实施方案，提供了方法，所述方法包括形成含有一定量报告化合物，能够捕获报告化合物的结合元件，以及一定量能够与报告化合物形成复合物的靶核酸的物质的组合物，与报告化合物形成复合物抑制了结合元件对报告化合物的捕获；形成一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸的复合物；将没有与靶核酸复合的剩余部分量的报告化合物捕获在结合元件上；以及测定捕获在结合元件上的表明报告化合物的存在和/或量的值。
换句话说，方法可以包括允许一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物，并允许没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物被捕获在结合元件上。
方法可以在选自生物传感器分析装置，微流体盒和芯片实验室的装置中进行。
在某些实施方案中，方法还包括在表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的基础上测定表明靶核酸的存在和/或量的值。表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的测定，可以包括指示值的时间依赖性的监测。在具体的实施方案中，表明靶核酸的存在和/或量的值，是根据将表明报告化合物的存在和/或量的值与表明靶核酸的存在和/或量的值相关联的校正曲线来确定的。
在其它实施方案中，方法还包括在将一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物，将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在结合元件上，以及测定表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的步骤之后，从结合元件上释放剩余部分量的报告化合物。
释放，形成复合物，捕获以及确定表明报告化合物和/或靶核酸的存在和/或量的值的步骤，可以进行另外的N次，其中N是大于或等于 1的整数。在具体的实施方案中，N≥5，≥10或≥20。
方法在形成复合物的步骤之前，还可以包括：将至少一部分量的报告化合物捕获在结合元件上；测定表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值；以及从结合元件上释放捕获的报告化合物。
在某些实施方案中，将一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤，以及将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在结合元件上的步骤，可以相伴进行。
在其它实施方案中，方法包括对靶核酸进行扩增。靶核酸的扩增可以在将一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤之前开始。
表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值，可以在将一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤，以及将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在结合元件上的步骤达到化学平衡之前进行测定。在某些实施方案中，指示值在一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤，以及将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在结合元件上的步骤开始后1秒到120秒时进行测定。
报告化合物可以包含一种或多种可检测的标记，例如两种可检测的标记。在具体的实施方案中，一种或多种可检测的标记是荧光标记。在其它具体实施方案中，报告化合物是寡核苷酸。
在它实施方案中，方法还包括在将靶核酸进行扩增之前，对它们进行反转录。
在其它实施方案中，形成物质的组合物的步骤包括形成物质的组合物，该物质包括一定量的第一报告化合物，一定量的能够与第一报告化合物形成复合物的第一靶核酸，与第一报告化合物形成复合物抑制了结合元件对第一报告化合物的捕获，一定量的第二报告化合物，以及一定量的能够与第二报告化合物形成复合物的第二靶核酸，与第二报告化合物形成复合物抑制了结合元件对第二报告化合物的捕获。
在方法中使用的结合元件可以包含一种或多种能够将报告化合物捕获在结合元件上的不同的捕获分子。捕获分子也可以被称为报告化合物特异性捕获分子。在具体的实施方案中，捕获分子是寡核苷酸。不同的捕获分子也可以布置在相应的结合元件的不同位置上。
报告化合物可以通过与捕获分子形成复合物而捕获在结合元件上。在具体的实施方案中，报告化合物上的至少一部分能够与靶核酸形成复合物的相互作用位点，也能够与捕获分子形成复合物。在其它具体的实施方案中，捕获分子和靶核酸竞争与报告化合物形成复合物。
在其它实施方案中，扩增包括变性双链核酸的步骤。双链核酸可以包括报告化合物与靶核酸的复合物，报告化合物与捕获分子的复合物，双链报告化合物以及双链靶核酸。
扩增也可以包括将引物分子与靶核酸退火的步骤。退火步骤可以与一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤，和/或将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在结合元件上的步骤相伴进行。
扩增可以是循环式的扩增。在具体的实施方案中，循环式的扩增是PCR。循环式扩增可以包含至少10个循环或至少20个循环。在其它实施方案中，进行PCR包括了使用具有外切核酸酶活性的聚合酶。
表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值，可以在循环式扩增的至少一个循环后进行测定。在具体的实施方案中，该值在循环式扩增的每个循环后测定。在其它实施方案中，表明靶核酸的存在和/或量的值，在每次表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值被测定之后进行测定。
该方法还可以包括增添一定量的能够与报告化合物形成复合物但是不与靶分子或者报告分子特异性捕获分子复合的淬灭化合物。淬灭化合物可以包含一个或者多个干扰由标记物产生可检测信号的部分(例如，淬灭基团“劫持”从荧光团激发产生的发射)。例如淬灭基团可能能够压制或者抑制由报告化合物的可检测标记发射的信号，例如荧光信号。在这样的实施方案中，淬灭化合物可能能够与报告化合物形式复合物但是不与靶分子或者报告分子特异性捕获分子复合，使得一个或者多个淬灭基团与复合物内报告化合物的可检测标记极接近。
淬灭剂化合物可以是寡核苷酸。在该实施方案中，淬灭剂寡核苷酸可以包含至少一个特异性序列区域，其与报告寡核苷酸的序列区域互补，从而允许在淬灭化合物和报告化合物之间形成碱基配对。
淬灭基团可以包括常用的淬灭剂例如黑洞淬灭剂(Biosearch Technologies)，Qxl淬灭剂(AnaSpec)和Iowa黑淬灭剂。
根据另一个示例性的实施方案，提供了方法，该方法包括将液体全血样品引入装置中，所述装置被改造为适于容纳流体状态的样品；和基于在装置中进行的分析测定表明全血样品中与病毒感染有关的核酸的存在和/或量的值。尤其是，测定的值可以表明与病毒感染有关的总核酸的存在和/或量。被引入装置的全血样品的体积可以是1μl至50 μl。
在一些实施方案中，方法还包括基于表明与病毒感染有关的总核酸的存在和/或量的值测定表明被感染患者的病毒载量的值。
在其他实施方案中，流体全血样品被直接从患者引入装置中。尤其是，流体全血样品可以获自患者的指尖刺扎。该方法还可以包括将获自指尖刺扎的血液与毛细管接触，同时毛细管保持与指尖的接触。在一个实施方案中，该方法还包括在毛细管和血液接触后将毛细管与装置连接。
根据另一个示例性的实施方案，提供了方法，所述方法包括提供具有1μl到50μl体积的流体样品；以及测定流体样品中表明与病毒感染有关的核酸的存在和/或量的值。在一些实施方案中，该方法还包括向装置中引入流体样品，所述装置被改造为适于容纳流体状态的样品；和基于在装置中进行的分析测定流体样品中表明与病毒感染有关的核酸的存在和/或量的值。测定的值可以表明与病毒感染有关的总核酸的存在和/或量。
在一些实施方案中，方法还包括基于表明与病毒感染有关的总核酸的存在和/或量的值测定表明被感染患者的病毒载量的值。
在其他实施方案中，流体样品是全血样品，其可以是未处理的全血样品。此外，流体样品的体积可以是1μl至10μl。
在具体的实施方案中，病毒感染是HIV感染。
用于该方法的实施方案中的装置可以被改造为适于检测流体样品中与病毒感染有关的核酸。在其他实施方案中，装置选自生物传感器分析装置，微流体盒以及芯片实验室。
在一些实施方案中，在装置中进行的分析还包括从样品释放核酸，其可以包括将流体样品与裂解试剂接触。
分析还可能包括形成复合物，其中每个复合物包含与病毒感染有关的核酸以及捕获分子，并且其中每个捕获分子包含锚定基团以及与病毒感染有关的核酸的区域特异性结合的部分。
在其他的实施方案中，在装置中进行的分析还包括使复合物与装置的第一结合元件接触，第一结合元件被构造为结合捕获分子的锚定基团并由此将复合物与第一结合元件结合。形成复合物的步骤可以与使复合物与第一结合元件接触的步骤在空间上分开进行。
在一些实施方案中，在装置中进行的分析还包括典型地通过PCR 扩增待检测的核酸。扩增的核酸可以相对于第一结合元件被捕获。
分析还可以包括提供一定量的能够与病毒感染有关的核酸形成复合物的报告化合物，能够捕获报告化合物的第二结合元件，与核酸形成复合物抑制由第二结合元件捕获报告化合物。
在一些实施方案中，该方法还包含一部分量的报告化合物与病毒感染有关的至少一部分量的核酸形成复合物；将剩余一部分量的不与病毒感染有关的核酸复合的报告化合物捕获在第二结合元件上；以及测定表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值；以及任选地，基于表明报告化合物的量的值测定表明与病毒感染有关的核酸的量的一个或者多个值。
此外，该方法可以包括对与病毒感染有关的核酸进行扩增，同时使得报告分子从第二结合元件上释放。
在另一个示范性的实施方案中，本发明涉及使用本文限定的方法检测HIV和/或用于测定患者的HIV载量。
在另一个示例性的实施方案中，本发明涉及通过利用总病毒核酸的量作为诊断标志。在具体的实施方案中，通过本文描述的方法测定总病毒核酸的量。
在其他具体的实施方案中，用作诊断标志的总的病毒核酸是HIV 核酸。用作标志的总HIV核酸的量可以表明用于检测HIV，测定患者的HIV载量，监控感染HIV的患者的疾病进展和/或监控感染HIV的患者的抗病毒治疗效力。总HIV核酸的量可以包括源于游离和源于细胞相关病毒的核酸，其依次可以包括源于游离病毒的RNA，源于细胞相关病毒的RNA，前病毒DNA，逆转录病毒DNA，和转录前病毒RNA。
可以提供被构造用于执行任何一个上述方法的装置。
上面限定的方面和其他方面根据以下描述的实施方案的实施例是显而易见的，并且参考实施方案的这些实施例进行解释。
附图说明
以下将对示例性的实施方案进行更详细的描述，但是并不是对本发明的限制。图中的说明是纲要性的。在不同的图中，相似的或同样的元件被提供有同样的附图标记。
图1a是根据示例性的实施方案的多核苷酸分析方法的流程图。
图1b是根据示例性的实施方案的可用于执行图1a的方法的检测系统的视图。
图1c是根据示例性的实施方案的图1b的检测系统的视图，其中检测系统被显示为进行图1a的方法的检测步骤时的致动状态。
图1d显示了与粒子结合的扩增子。
图1e显示了与粒子结合的扩增子。
图2是根据示例性的实施方案的适于图1b和1c的检测系统中的分析装置。
图3是图2的分析装置，与用于操作装置的型板致动器一起显示。
图4显示了使用新鲜的或冷冻干燥的裂解缓冲液进行的分析的结果(RT-PCR产物曲线和凝胶电泳)，其中裂解缓冲液可以作为冷冻干燥的丸粒储存而不丧失功能。
图5显示了用于从血液裂解混合物中捕获寡核苷酸(即HIV RNA) 的链亲和素琼脂糖浆液的量的影响，其中使用200μl，100μl或50μl链亲和素琼脂糖浆液进行的分析的结果表明，50μl浆液的结合能力就足以捕获基本上所有的RNA分子。
图6显示了用于从血液裂解混合物中捕获寡核苷酸(即HIV RNA) 的链亲和素琼脂糖浆液的量的影响，其中使用10μl和7μl链亲和素琼脂糖浆液进行的分析的结果表明，10μl浆液的结合能力就足以捕获基本上所有的RNA分子。
图7显示了温育时间对被分析的多核苷酸和捕获探针之间复合物的形成(即杂交)的影响，其中在温育时间2分钟后，绝大部分的多核苷酸不能被回收到，而温育10分钟后，在上清液中不能检测到RNA。
图8显示了温育时间对被分析的多核苷酸和捕获探针之间复合物的形成(即杂交)的影响。
图9显示了温育时间对捕获步骤(即复合物的生物素锚定基团与链亲和素琼脂糖粒子的结合)的影响，其中显示出5分钟的温育时间就足以捕获所有的多核苷酸分子(即在上清液中不能检测到RNA分子)。
图10显示了使用新鲜的或储存了几小时或7天的冷冻干燥的链亲和素琼脂糖粒子进行的分析的结果(RT-PCR产物曲线)，其中链亲和素琼脂糖粒子可以被冷冻干燥并复溶而不丧失功能。
图11显示了使用新鲜的或冷冻干燥的清洗缓冲液进行的分析的结果(RT-PCR产物曲线)，其中清洗缓冲液可以被冷冻干燥并复溶而不丧失功能。
图12显示了进行的用于显示链亲和素琼脂糖粒子与RT-PCR的相容性的试验的结果(RT-PCR产物曲线和琼脂糖凝胶电泳)，其中10μL 链亲和素琼脂糖粒子悬浮液可以用于RT-PCR扩增而不损失扩增效能。
图13显示了按照示例性实施方案的分析方法的特异性，其中结果 (RT-PCR产物曲线和琼脂糖凝胶电泳)显示，HIV RNA不与链亲和素琼脂糖粒子非特异性结合(即在不存在捕获探针的情况下)，在裂解过程中同时释放的人类血细胞的任何RNA也不被捕获/扩增。
图14显示了在链亲和素琼脂糖粒子上检测扩增子的荧光图像，其中生物素标记的扩增子被捕获在链亲和素琼脂糖粒子上，在荧光标记的探针与被捕获的扩增子杂交后被可视化。
图15说明了琼脂糖凝胶电泳显示出，捕获在链亲和素琼脂糖粒子上的多核苷酸(即HIV RNA)可以直接用作扩增的模板而不需要其它的处理步骤(即洗脱，稀释或浓缩)。
图16显示了链亲和素琼脂糖粒子的相应的荧光图像，其中与阴性探针相比，在阳性探针中检测到了更多的荧光链亲和素琼脂糖粒子。
图17概要说明了根据示例性的实施方案的装置。
图18描绘了根据示例性的实施方案的装置的前侧面。
图19图示了图18的装置的后侧面。
图20图示了根据示例性的实施方案的装置的主视图。
图21描绘了根据示例性的实施方案的装置的横截面图。
图22示意说明了根据本发明用于检测多核苷酸的竞争性方法的示例性的实施方案。
图23显示了根据本发明用于测定样品中人类I型脊髓灰质炎病毒 DNA的竞争性分析方法的示例性实施方案的结果。
图24显示了根据本发明用于测定样品中HIV gag/env PCR产物的量的基于阵列的竞争性分析方法的示例性实施方案的原理以及结果。
图25说明了在图24中显示的分析的过程中的不同的步骤。
图26示意说明了根据本发明用于检测多核苷酸的竞争性方法的示例性实施方案。
图27显示了根据本发明用于测定样品中HIV B亚型和HIV O2亚型的量的竞争性分析的示例性实施方案的结果。
图28显示了根据本发明用于测定样品中不同量的HIV B亚型的竞争性分析的示例性实施方案的结果。
图29显示了基于PCR的测定HIV阳性患者的血浆和全血样品中的HIV-1 RNA各自的拷贝数的分析结果。该分析中包括的仅仅是那些已经检测到至少40个拷贝的HIV-1 RNA的样品。
图30显示了图29中显示的检测到没有或者HIV-1 RNA的拷贝数小于40的血浆样品的基于PCR的分析结果。
图31显示了根据图29的另一个基于PCR的分析结果。
图32至34描绘了接受抗病毒治疗的不同的HIV-阳性患者的血浆和全血各自的病毒载量。
图35描绘了全血和血浆样品中病毒拷贝数的典型时间过程。
图36示意说明了根据另一个示例性实施方案的装置。
发明详述
生物学样品的分析可以包括测定一种或多种多核苷酸(例如 DNA，RNA，mRNA或rRNA)是否存在于样品中。例如，人们可以分析样品，以确定表明特定病原体的存在的多核苷酸是否存在。
根据本发明示例性的实施方案，用于分析的方法包括形成复合物，每个复合物含有靶核酸和捕获分子，其中每个捕获分子含有特异性针对靶核酸的区域的结合部分和锚定基团；将复合物与结合元件接触，结合元件被构造为与捕获分子的锚定基团结合，以将复合物结合到结合元件上；对一或多种靶核酸进行扩增；将扩增的靶核酸捕获大相应的结合元件上；以及对表明被捕获的靶核酸的存在和/或量的值进行测定。
本文使用的术语“靶核酸”是指可以通过使用方法检测的任何核酸分子(即能够与捕获分子形成复合物的靶核酸；参见下文)。这样的核酸分子的例子包括天然存在的核酸例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，以及人工设计的核酸，例如核酸类似物例如尤其是肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)，它们是化学合成的或通过重组基因技术产生的(参见例如Sambrook,J.等(1989)《分子克隆实验指南》(第二版)(Molecular,Cloning:A LaboratoryManual,2nd ed.)， Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。天然存在的核酸的具体的例子包括DNA序列例如基因组DNA或cDNA分子，以及RNA序列例如hnRNA，mRNA或rRNA分子，或其反向互补的核酸序列。这样的核酸可以是任何长度的，既可以是单链的也可以是双链的分子。典型情况下，靶核酸的长度为10到10000个核苷酸，例如 20到2000个核苷酸，30到1000个核苷酸或50到500个核苷酸。在本文中使用的术语“核苷酸”应该被理解为是指核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸(即RNA和DNA分子)。
靶核酸可以是与病毒感染有关的核酸。与病毒感染有关的核酸是指任何存在于被分析的，已经被一种或多种病毒感染的液体样品中的病毒来源的核酸分子(即其核苷酸序列与病毒基因组中相应的序列一致或互补)。感染从中获得液体样品的宿主的病毒，可以是任何DNA 病毒(即具有DNA基因组的病毒)或RNA病毒(即具有RNA基因组的病毒)(综述在例如Büchen-Osmond,C.(2003).《病毒的分类学与分类》，在《临床微生物学手册》(第八版)第二卷中，(Taxonomy and Classification of Viruses.In:Manual of ClinicalMicrobiology,8th ed.,vol. 2)，p.1217-1226,ASM Press,Washington DC)。DNA病毒的例子包括尤其是乳多空病毒科(Papovaviridae)(例如乳头瘤病毒)，腺病毒科(Adenoviridae)(例如腺病毒)和疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如Epstein-Barr病毒，细胞肥大病毒)的病毒。RNA病毒的例子包括尤其是小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒，鼻病毒)，黄病毒科(Flaviviridae)(例如丙型肝炎病毒)，纤丝病毒科(Filoviridae)(例如马尔堡病毒，埃博拉病毒)和逆转录病毒科 (Retroviridae)(例如人类免疫缺陷病毒(HIV))的病毒。在本发明的某些实施方案中，被检测的核酸与逆转录病毒科的成员引起的感染相关，特别是它们与HIV感染相关。本文中使用的术语“HIV”是指 HIV-1和HIV-2，以及从其衍生的任何亚型。
因为许多DNA病毒以及逆转录病毒(值得注意的是逆转录病毒的复制以便需要将RNA病毒基因组反转录成DNA)可以潜伏的前病毒形式将它们的遗传信息整合到宿主细胞的基因组中，因此术语“与病毒感染有关的核酸”不仅仅是指源自于游离的和细胞相关的病毒的核酸，而且还指整合在宿主基因组中的前病毒DNA分子，反转录的病毒 DNA分子(即病毒复制的“中间体”)，以及源自于前病毒DNA的转录本(即通过宿主DNA基因组的转录获得的RNA分子)。
典型情况下，靶核酸不以分离的形式，而是以怀疑含有一种或多种靶核酸的样品的形式用于本发明的方法。本文使用的术语“一种或多种”是指一种或多种不同类型的核酸，例如具有不同核苷酸序列的分子和/或从不同的来源传下来的分子(例如从感染宿主细胞的不同病原体衍生的核酸)。
本文使用的术语“样品”是指任何待通过使用本发明分析的，并且被怀疑含有一种或多种被检测的靶核酸的液体。因此，样品可以包括溶解在水或适合的缓冲液(例如Tris/EDTA)中的纯化的核酸制备物，以及各种不同的生物学样品。可以使用该发明进行分析的液体样品的例子包括尤其是有机和无机化学物溶液，饮用水，污水，人类和非人类的体液例如全血，血浆，血清，尿液，痰液，唾液或脑脊髓液，来自动物，植物或组织培养物的细胞提取液，原核和真核细胞悬浮液，噬菌体制备液等。
本文使用的术语“全血”是指含有其所有组分的血液。换句话说，全血包括血细胞例如红细胞，白细胞和血小板，以及血细胞悬浮在其中的血浆。
样品还可以包含一种或多种其它试剂，例如稀释剂，溶剂或缓冲液，它们可能来自于样品在进行本发明的方法之前进行的任选的纯化和/或步骤。但是，在本发明的某些实施方案中，被分析的样品是未处理的样品，例如未处理的全血样品。本文使用的术语“未处理的”表示在样品收集(例如从患者抽取血液)之后和将其进行本发明的方法之前，没有发生进一步的样品加工(例如分级方法，干燥/复溶等)。
以下描述包括这样的未处理样品的典型的核酸检测方法。
被分析的流体样品的体积可以在1μl到50μl的范围内，典型情况下在1μl到45μl，或1μl到40μl，或1μl到30μl，或1μl到25μl，或1μl 到20μl，或1μl到15μl的范围内。在具体的实施方案中，流体样品的体积在1μl到10μl的范围内。然而，在全血样品是分析样品的情况下，超过50μl的样品体积也在本发明的范围内。
本文使用的术语“捕获分子”是指显示出特异性结合行为和/或特征性的反应性的任何分子，使其适合于与靶核酸形成复合物。典型情况下使用核酸作为捕获分子。可以用作捕获分子的核酸的例子包括天然存在的核酸例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，以及核酸类似物例如尤其是肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。天然存在的核酸的具体的例子包括DNA序列例如基因组DNA或cDNA分子，以及RNA序列例如hnRNA，mRNA或rRNA分子，或其反向互补的核酸序列。这样的核酸可以是任何长度的，既可以是单链的也可以是双链的分子。典型情况下，核酸捕获分子是长度为10到150个核苷酸，例如20到100个核苷酸或30到70个核苷酸的单链寡核苷酸。在具体的实施方案中，捕获分子可以在PCR中用作引物，以扩增在给定的流体样品中存在的任何目标靶核酸。
在某些实施方案中，本发明使用的捕获分子可以包括至少一个特异性序列区域(即上面所指的结合部分)，它与靶核酸(例如与病毒感染有关的核酸)的序列区域互补，从而允许捕获分子与被检测的核酸之间的碱基配对。典型情况下，特异性结合区域长度为至少20个核苷酸，例如至少30个核苷酸或至少40个核苷酸。具体来说，捕获分子的结合区域的核苷酸序列与靶核酸的相应核苷酸序列互补。本文使用的术语“核苷酸”应被理解为是指核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸(即， RNA和DNA分子)。
在导入被分析的流体样品之前，可以在一个或多个上面描述的装置的适于容纳液体的至少一个结构中提供捕获分子(例如以冷冻干燥的或干燥的形式)。或者，捕获分子可以与样品一起(例如相伴地) 或在样品已经导入后导入到装置中。
在本发明的范围内，可以使用一种或多种捕获分子。术语“一种或多种”是指一种或多种不同类型的捕获分子，例如一种或多种具有不同核苷酸序列的核酸分子。相伴使用的一种以上的捕获分子也可以被称为“文库”。这样的文库包含至少两种，但是也可以包含许多种不同的分子，例如至少不同的5种，至少不同的10种，至少不同的30 种等。文库也可以阵列元件或任何其它空间布置的形式存在。
在本发明的某些实施方案中，在装置中进行的分析还包括将含有被检测的靶核酸和捕获分子的复合物与装置的结合元件相接触，结合元件被构造为与捕获分子的锚定基团结合，以便将复合物与结合元件结合。
本文使用的术语“结合元件”或“支持元件”是指捕获分子(因此还有含有这些捕获分子的任何复合物)可以经过捕获分子的锚定基团通过共价的或非共价的相互作用连接到其上的任何基质。这样的基质的例子包括尤其是阵列元件的基质或合成的粒子，例如磁性珠子(例如顺磁性聚苯乙烯珠子，也被称为)和乳胶珠子，以及多孔的表面例如CPG等。依赖于捕获分子的类型，锚定基团的类型以及目标应用，在每种情况下可能有各种不同的连接。例如，在捕获分子的锚定基团可以是生物素基团的情况下，它可以与连接到结合元件上的亲和素或链亲和素基团偶联。或者，捕获分子可以含有一段腺苷残基(例如10个腺苷残基)，它将与结合在结合元件上的一段相应的胸苷残基相互作用。具体的含有锚定基团的偶联试剂可以从不同的供应商商购，在本技术领域是公知的(参见例如Sambrook,J.等，同上； Ausubel,F.M.等，同上；以及Lottspeich,F.和Zorbas H.，同上)。
在导入被分析的流体样品之前，结合元件可以被提供在如上所述的至少一个装置的一个或多个结构中。因此，结合元件可以被提供在与捕获分子相同的一个或者多个结构中，或在至少一个不同的结构中。典型情况下，形成捕获分子与靶核酸的复合物的步骤与将复合物与结合元件相接触的步骤，在空间上分开进行，即在装置的不同结构或孔或反应室中进行。例如，形成捕获分子与靶核酸的复合物的步骤在“裂解孔”中进行，将复合物与结合元件相接触的步骤在“中心孔”中进行，参考图17。在这样的实施方案中，捕获分子和结合元件通常被提供在适于容纳液体的不同的结构中。除了在加入样品前在装置中提供结合元件之外，结合元件也可以与样品一起(即相伴地)或在样品已经导入之后导入到装置中。
在具体实施方案中，方法还包括将靶核酸进行扩增，也就是说，在对它们进行进一步分析之前增加它们在样品中存在的量，以便于进一步的检测。典型情况下，靶核酸的扩增通过循环式扩增来进行。循环式扩增可以包含等于或大于2的任何数量的扩增循环。通常情况下，循环式扩增反应包含至少10个或至少20个循环。
示例性的循环式扩增是聚合酶链反应(PCR)。PCR是分子生物学中已建立的标准方法，被详细描述在例如Sambrook等，同上；和 Ausubel,F.M.等，同上中。典型情况下，通过使用热稳定的DNA聚合酶，PCR被用于扩增双链DNA分子。在某些实施方案中，在循环式扩增中使用的DNA聚合酶具有核酸外切酶活性，特别是5'→3'核酸外切酶活性。这样的DNA聚合酶的例子包括尤其是Taq DNA聚合酶或 Tth DNA聚合酶(可以从多个供应商商购)。
在靶核酸是RNA分子的情况下，本发明的方法还包括对靶核酸进行扩增之前对它们进行反转录(即是从相应的RNA分子产生DNA分子)。反转录是分子生物学中的另一种标准方法，也描述在例如 Sambrook等，同上；和Ausubel,F.M.等，同上中。
为此目的，即，核酸扩增目的来说，上述装置还可以包含一个或多个温度控制单元和/或温度调节单元，用于控制和/或调节反应室中的温度。这样的温度控制单元和/或温度调节单元可以包含一个或多个分离的加热和/或冷却元件，它们可以与装置的一个或多个反应室直接接触。典型情况下，一个或多个加热和/或冷却元件由导热材料制成。这样的导热材料的例子包括尤其是硅，陶瓷材料例如氧化铝陶瓷，和/或金属例如高级别钢，铝，铜或黄铜。适于进行本发明的温度控制单元和/或温度调节单元的示例性详细描述也可以在国际专利申请WO 01/02094中发现，其中的相关内容明确地引为参考。
例如，在适合于容纳液体的结构中控制/调控温度，也可以通过使用由导电材料制成的室来完成。本文使用的术语“室体”应该被理解为是指至少部分围绕着装置的至少一种结构或反应室的固体物体。至少一种结构至少部分可以是室体的完整的部件(即由与室体相同的材料制成)。导电材料的例子包括导电的合成材料，例如具有5到30％碳纤维的聚酰胺，具有5到30％碳纤维的聚碳酸酯，具有2到20％不锈钢纤维的聚酰胺，以及具有5到40％碳纤维的聚苯硫醚。此外，室体可以被设计成含有增大和缩小的部分，允许对反应室或相应的表面进行特异性加热。
用于容纳液体的结构可以使得结构中的压力增加的方式被填充含有被扩增的靶核酸的溶液。结构中的压力增加可以迫使结构的弹性覆盖元件靠着加热元件和/或冷却元件。
结构中温度的测量可以通过本技术领域公知的各种方法来进行，例如通过使用整合的阻抗传感器，半导体传感器，光波导传感器，多色染料或液晶。此外，反应室中的温度可以使用室体中整合的温度传感器，高温计或红外传感器来测定，或通过测量参数，例如发生检测的表面的折射率或样品的pH值，的温度依赖性变化来测定，例如通过测量pH敏感性指示剂的颜色变化。
通常情况下，扩增例如PCR包含三个基本步骤——变性，引物的退火和引物的延伸，它们以循环的方式重复地进行。但是，扩增还可以分别在第一次“真正的”扩增循环之前包含最初的变性步骤，和/或在完成最后的扩增循环之后包含最后的延伸步骤。在某些实施方案中，靶核酸的扩增包括(至少)变性双链核酸的步骤，和/或在靶核酸上退火和延伸引物分子的组合步骤(即“两步PCR”)。
典型情况下，变性步骤包括将被分析的样品加热到94-95℃的温度，一般为0.5秒到5分钟，从而导致双链核酸模板解链。将被分析的样品进行这样的变性步骤，导致(即允许)样品中的双链核酸，包括双链靶核酸和捕获分子与靶核酸的复合物(结合到结合元件上)，同时变性，后者导致靶核酸从结合元件上释放。
典型情况下，退火步骤包括将被分析的样品冷却到40-65℃的温度，一般为1秒到5分钟，以允许引物分子与变性的核酸模板链的结合(即杂交/碱基配对)。使用的反应温度依赖于被退火的引物分子的化学和/或物理性质，例如它们的核苷酸序列组成，熔点温度，它们发生分子内折叠(例如形成双链发夹或转角结构)的倾向等。在本发明的某些实施方案中，被分析的样品进行这样的退火步骤，导致(即允许)双链靶分子的重新结合，以及靶核酸与捕获分子的复合物的形成，后者导致将靶核酸捕获或重新捕获在结合元件上。因此，在本发明的某些实施方案中，退火步骤和通过与捕获分子形成复合物将靶核酸捕获在结合元件上的步骤相伴进行。
最后，典型的延伸步骤包括使用DNA聚合酶对杂交的引物分子进行延伸以产生DNA模板链的全长的拷贝。扩增的DNA片段的长度由使用的引物对的5'末端确定。典型情况下，延伸步骤在70-72℃下进行 1秒到10分钟。在本发明的某些实施方案中，将被分析的样品进行这样的延伸步骤，可以通过允许在退火步骤中已经形成的引物与靶核酸的复合物延伸，产生任选掺入了随后可以被检测的可检测的标记物的双链的被扩增的核酸片段，从而导致了被分析的靶核酸的复制。
在一些实施方案中，例如为了安全的原因，可以在引发靶核酸的扩增之前不可逆地密封中心孔或者第二结构。不可逆地密封中心孔可以通过密封中心孔的入口以及任选的出口来实现。例如，与中心孔相连的通道和/或阀可以被热密封或者焊接。塑料通道或者阀例如可以通过将热杆与通道或者阀相连进行热密封以使塑料熔融和通道或者阀关闭。
在具体的实施方案中，方法还包括将典型情况下通过将被分析的样品进行PCR而被扩增的靶核酸捕获到相应的结合元件上(即将靶核酸固定在其上)。正如上面已经描述的，靶核酸可以通过与通过锚定基团仍然结合在结合元件上的捕获分子形成复合物而捕获在相应的结合元件上。
方法还可以包括将捕获的被扩增的靶核酸从结合元件上释放，以及重复将一种或多种靶核酸进行扩增和将扩增的靶核酸捕获在相应的结合元件上的步骤。本文使用的术语“释放”是指从结合元件上分开或解开靶核酸。这可以通过例如裂解任何共价键来酶法实现，或者在靶核酸是通过核酸捕获分子经互补碱基配对而结合到结合元件上的情况下，通过增加分析发生在其中的结构中的温度，从而导致核酸链的分离(即变性)来完成。
在这样的实施方案中，从结合元件上释放捕获的被扩增的靶核酸，以及重复将一种或多种靶核酸进行扩增和将扩增的靶核酸捕获在相应的结合元件上的步骤的循环，而可以被进行至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少50次或至少100次。测定表明被捕获的靶核酸的存在和/或量的值的步骤，可以在至少一个循环后进行，例如在每个从结合元件上释放捕获的被扩增的靶核酸，以及重复将一种或多种靶核酸进行扩增和将扩增的靶核酸捕获在相应的结合元件上的步骤的循环后进行。
形成含有靶核酸和捕获分子的复合物，其中每个捕获分子含有特异性针对靶核酸的区域的结合部分和锚定基团的步骤，可以与将复合物与结合元件相接触的步骤在空间上分开进行，其中结合元件被构造为与捕获分子的锚定基团结合，从而将复合物结合到结合元件上。在这样的实施方案中，方法在含有至少两个适于容纳脂质的结构的装置中进行。至少两个结构可以例如与微流体网路流体连通。例如，方法可以在图18和19中显示的装置500中进行。含有靶核酸和捕获分子的复合物可以在第一结构502中形成。然后可以将复合物转移到第二结构512中，复合物在其中与上述的被构造为与捕获分子的锚定基团结合的结合元件相接触。
本文使用的术语“表明被捕获的靶核酸的存在和/或量的值的测定”，是指检测/测定允许对捕获(或重新捕获)在结合元件上的靶核酸进行定性和/或定量测量的参数，例如电导性，氧化还原电势，光吸收，荧光强度或生物发光。可以只测定这些参数中的一种，但是相伴或相继测定一种以上的参数(例如电导性和由适当的标记物引起的荧光信号的强度)也是可能的。
为了进行检测反应，可以将靶核酸用一种或多种可检测的标记物进行标记。本文使用的术语“一种或者多种可检测的标记物”是指任何包含一种或多种适合的化学物质或酶的化合物或基团，可以在化学，物理或酶反应中直接或间接产生可检测的化合物或信号。因此，通过能够与目标报告化合物形成相互作用，这样的标记物可能是该报告化合物的检测所必需的，或将促进该报告化合物的检测。在本文中使用时，该术语应该被理解为包括了可检测标记物本身(也被称为“标记”)，以及任何与一种或多种这样的可检测标记结合的化合物。此外，干扰标记物产生可检测信号的基团(例如在淬灭剂与荧光团彼此紧邻时“劫持”荧光团的激发产生的发射的淬灭剂)也可以属于可检测标记物。可检测标记物可以被整合或连接到靶核酸上，例如以修饰的和/或标记的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸或双脱氧核糖核苷酸的形式。
可以使用的可检测的标志或者标记物包括任何在化学，物理或者酶反应中直接或者间接产生可检测化合物或者信号的化合物。标记可以通过本技术领域熟知的方法来完成(参见例如Sambrook,J.等，同上；以及Lottspeich,F.和Zorbas H.，同上)。标记物可以尤其选自荧光标记物，酶标记物，有色标记物，生色标记物，发光标记物，放射活性标记物，半抗原，生物素，金属复合物，金属和胶体金。所有这些类型的标记物在本技术领域中是公知的。由这样的标记物介导的物理反应的例子是在辐射或激发后发射荧光或磷光，或当使用放射活性标记物时发射X-射线。碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶和β-内酰胺酶是酶标记物的例子，它们催化产色反应产物的形成。在具体的实施方案中，可检测的标记物是荧光标记物。大量的荧光标记物在本技术领域中是公知的，可以从不同的供应商商购(参见例如《手册：荧光探针和标记技术指南》(第10版)(The Handbook-A Guide to FluorescentProbes and Labeling Technologies,10th ed.)，(2006),《分子探针》(MolecularProbes)，Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)。
为了检测这样的标记物，可以使用适合于测定表明捕获在支持元件上的报告化合物的存在和/或量的值的检测系统。检测系统可以与装置500相连。典型情况下，检测系统位于一个第二结构512对面，任选位于发生检测的特定表面区域的对面。合适的检测系统的选择取决于若干参数，例如用于检测的标记物的类型，所进行分析的种类。多种光学和非光学检测系统是本领域公知的。可以与方法使用的通常意义的检测系统参见例如，LottspeichF.,和Zorbas H.,同上中。
典型情况下，检测系统是光学检测系统。在某些实施方案中，方法的进行包括简单的检测系统，它可以基于参数例如荧光，光吸收，共振转移等的测量。
在其它实施方案中，检测系统是基于用荧光团标记的光谱激发的核酸的荧光强度的比较。荧光是特定分子当被产生特征性吸收和发射行为的特定波长的光激发时，发射出它们自己的光的能力。具体来说，荧光信号的定量检测是通过修改过的荧光显微镜方法来进行的(综述参见例如Lichtman,J.W.和Conchello,J.A.(2005)Nature Methods 2, 910-919；Zimmermann,T.(2005)Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.95, 245-265)。由此，从光吸收和光发射产生的信号分别被一个或多个滤光片和/或堇青石分离，并成像在适当的检测器上。数据分析通过数字图像处理方法来进行。图像加工可以使用本技术领域众所周知的几种软件包来实现(例如精确数字图像处理软件(Mathematica Digital ImageProcessing)，EIKONA，或Image-PRO)另一种适合于这种目的的软件是Iconoclust软件(Clondiag Chip Technologies GmbH,Jena, Germany)。
适合的检测系统可以基于测定荧光信号的经典方法，例如外荧光或暗视野荧光显微术(综述在例如Lakowicz,J.R.(1999)的《荧光光谱学原理》(第二版)(Principles ofFluorescence Spectroscopy,2nd ed.)， Plenum Publishing Corp.,NY,中)。
另一种可以使用的光学检测系统是共聚焦荧光显微术，其中通过点光源将物体在透镜的聚焦平面中照亮。重要的是，点光源，物体和点光检测器位于光学共轭的平面上。这样的共聚焦系统的例子在例如 Diaspro,A.(2002)《共聚焦和二光子显微术：基础，应用和进展》 (Confocal and 2-photon-microscopy:Foundations,Applications andAdvances)，Wiley-Liss,Hobroken,NJ,中有详细的描述。荧光-光学系统通常是不带自动聚焦的荧光显微镜，例如具有固定焦距的荧光显微镜。
其它也可以使用的荧光检测方法包括尤其是全内部荧光显微术 (参见例如Axelrod,D.(1999)的《具有逐渐消失的照明的表面荧光显微术》(Surface fluorescencemicroscopy with evanescent illumination)，在Lacey,A.主编的《生物学中的光学显微术》(Light Microscopy in Biology，Oxford University Press,New York,399-423)中)，荧光寿命成像显微术(参见例如Dowling,K.等，(1999)J.Mod.Optics 46, 199-209)，荧光共振能量转移(FRET；参见例如Periasamy,A.(200I) J.Biomed.Optics 6,287-291)，生物发光共振能量转移(BRET；参见例如Wilson,T.和Hastings,J.W.(1998)Annu.Rev.CellDev.Biol.14, 197-230)，以及荧光关联光谱术(参见例如Hess,S.T.等，(2002)Biochemistry 41,697-705)。
在具体实施方案中，检测使用FRET或BRET进行，它们是基于荧光或生物发光淬灭剂对的相应形成。FRET的应用也描述在例如Liu, B.等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102,589-593；和Szollosi,J. 等，(2002)J.Biotechnol.82,251-266中。BRET的应用被详细描述在例如Prinz,A.等，(2006)Chembiochem.1,1007-1012；和Xu,Y.等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96,151-156中。
一个或多个表明捕获的靶核酸的存在和/或量的值的测定，可以包括对一个或多个获得的指示值进行时间依赖性的监测(即重复地进行测定/检测步骤并监测指示值的随时间的过程)。
提供靶核酸的步骤可以包括从包含在样品中的生物学材料释放靶核酸。为此，可以将样品加热以破坏细胞膜和/或病毒壳体(例如通过使用下面描述的温度控制单元和/或温度调节单元)。在某些实施方案中，该释放步骤包括将流体样品与裂解试剂相接触，裂解试剂例如含有一种或多种分解细胞膜和/或病毒壳体的去污剂的试剂。这样的裂解试剂在本技术领域中是众所周知的(参见例如Sambrook,J.等，(1989) 《分子克隆实验指南》(第二版)，Molecular,Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)，并可从许多供应商商购。
方法还可以包括从相伴的材料中分离该一种或多种靶核酸。
靶核酸的提供，可以与将含有靶核酸和捕获分子的复合物与结合元件相接触，将靶核酸进行扩增，将扩增的靶核酸捕获在相应的结合元件上，以及测定表明捕获的靶核酸的存在和/或量的值的步骤，在空间上分开进行。例如，靶核酸可以提供在与含有靶核酸和捕获分子的复合物在其中形成的相同的结构502中。
在另一个实施方案中，方法在下面描述的装置中进行。例如，装置可以含有第一孔502，含有靶核酸和捕获分子的复合物形成在第一孔 502中。此外，装置可以含有第二孔512，表明捕获的靶核酸的存在和 /或量的值的测定可以在被成形用于检测一种或多种靶核酸的第二孔 512中进行。第二孔512可以包含覆盖着第二孔的覆盖元件，以及适于被致动以使覆盖元件变形的致动器。此外，将一种或多种核酸进行扩增和/或将扩增的靶核酸(重新-)捕获到相应的结合元件上，也可以在第二孔512中进行。
表明捕获的靶核酸的存在和/或量的值的测定，可以使用被致动以使覆盖元件变形的致动器来进行。在这样的实施方案中，覆盖元件可以变形，使得检测孔512的体积减小。此外，在表明捕获的靶核酸的存在和/或量的值被测定后，第二孔的体积可以被重新增加。
根据本发明的另一个示例性实施方案，提供了方法，包括：
a)提供一定量报告化合物；第一结合元件被成形成与捕获分子的锚定基团结合；第二结合元件能够捕获报告化合物；一定量的靶核酸能够与报告化合物形成复合物；与报告化合物形成复合物抑制了报告化合物被第二结合元件的捕获；一定量的捕获分子，其中每个捕获分子含有特异性针对靶核酸的区域的结合部分和锚定基团；
b)形成复合物，每个复合物含有靶核酸和捕获分子；
c)将复合物与第一结合元件相接触，以将复合物结合到第一结合元件上；
d)从第一结合元件上释放出至少一部分量的靶核酸；
e)形成一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸的复合物；
f)将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在第二结合元件上；以及
g)测定表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值。
本文使用的术语“报告分子”或“报告化合物”是任何能够与一种或多种靶核酸形成复合物，并且可以被捕获在支持元件例如第二结合元件上的分子，其中与靶核酸形成复合物抑制了报告化合物捕获在支持元件例如第二结合元件上。因此，本文使用的术语“能够形成复合物”是指报告分子和靶核酸之间的任何相互作用。换句话说，该术语表示，可以通过报告分子中包含的介导与靶的相互作用的共同的或不同的结合区域来实现的分子之间的彼此结合(例如通过互补核苷酸序列之间的Watson-Crick碱基配对)。典型情况下，相互作用是可逆的。类似地，术语“被捕获在支持元件上”或“被捕获在第二结合元件上”，也指报告分子与给定支持元件的任何直接或间接的(例如通过捕获分子，参见下文)相互作用。该相互作用一般来说也是可逆的。
一般来说，报告分子可以是长度为10到100个核苷酸，例如15 到50个核苷酸，15到40个核苷酸或20到30个核苷酸的核酸分子(即上面描述的RNA或DNA分子)。通常情况下，报告分子是单链核酸分子(即寡核苷酸)。报告化合物被构造为使得这样的报告分子与被检测的靶核酸的结合抑制了报告分子被捕获在第二结合元件上。核酸报告分子可以包括至少一个特异性结合区域(在本文中也称为“相互作用位点”)，该区域不仅能够与靶核酸相互作用(例如通过结合到靶核酸的至少部分互补的序列区域上，从而例如允许报告分子与被检测的靶核酸之间的Watson-Crick碱基配对)，而且能够被捕获在第二结合元件上。典型情况下，报告分子中包含的特异性结合区域长度为至少12个核苷酸，例如至少15个核苷酸，至少18个核苷酸或至少22 个核苷酸。在具体的实施方案中，报告分子的结合部分的核苷酸序列与靶核酸的相应核苷酸序列互补。
可以使用一种或多种报告分子。术语“一种或多种”是指一种或多种不同类型的报告分子，例如一种或多种具有不同核苷酸序列的核酸分子。
本文使用的“第一结合元件”可以是上面描述的结合元件。例如，第一结合元件可以是指任何固体基质，捕获分子，以及因此含有这样的捕获分子的任何复合物，可以通过捕获分子的锚定基团通过共价或非共价相互作用结合到其上。这样的基质的例子包括尤其是合成的粒子例如磁性珠子(例如顺磁性聚苯乙烯珠子，也被称为) 和乳胶珠子。
本文使用的“第二结合元件”可以是上面描述的结合元件。例如，第二结合元件是指任何固体基质，报告分子可以直接(例如通过报告分子中包含的锚定基团)捕获在其上，或以间接的方式通过一个或多个能够通过共价或非共价相互作用将报告分子捕获到第二结合元件上的报告化合物特异性捕获分子捕获在其上。可以使用的第二结合元件的例子包括尤其是阵列元件的基体(例如显微镜载玻片，晶片或陶瓷材料)。
本文使用的术语“报告化合物特异性捕获分子”是指任何例如连接或固定在第二结合元件上的，显示出特异性结合性质和/或特征性反应性的分子，这使得它适合于与报告分子形成复合物(即与报告分子结合)。典型情况下使用核酸作为捕获分子。可以用作报告化合物特异性捕获分子的核酸的例子包括天然存在的核酸例如脱氧核糖核酸 (DNA)或核糖核酸(RNA)，以及核酸类似物例如尤其是肽核酸(PNA) 或锁核酸(LNA)。天然存在的核酸的具体的例子包括DNA序列例如基因组DNA或cDNA分子，以及RNA序列例如hnRNA，mRNA或rRNA 分子，或其反向互补的核酸序列。这样的核酸可以是任何长度的，既可以是单链的也可以是双链的分子。典型情况下，报告化合物特异性捕获分子是长度为10到100个核苷酸，例如15到50个核苷酸或20 到30个核苷酸的单链寡核苷酸。
报告化合物特异性捕获分子可以包含至少一个特异性序列区域 (即结合区域)，它被构造为与报告分子结合，例如与报告分子的互补序列区域通过报告化合物特异性捕获分子和被检测的核酸之间的碱基配对发生相互作用。典型情况下，特异性结合区域的长度为至少12 个核苷酸，例如至少15个核苷酸，至少18个核苷酸或至少22个核苷酸。在具体的实施方案中，报告化合物特异性捕获分子的结合区域的核苷酸序列与报告分子的相应的核苷酸序列互补。
在某些实施方案中，报告化合物的至少一部分能够与靶核酸形成复合物的相互作用位点，也能够与报告化合物特异性捕获分子形成复合物。换句话说，报告化合物特异性捕获分子与靶核酸竞争与报告化合物形成复合物，即是包含在报告化合物特异性捕获分子和靶核酸中的相应结合区域识别报告分子的同样的或至少相似的对应序列。本文中使用的术语“相似的序列”是指序列之间的差异仅仅是一个或多个单核苷酸误配(即核苷酸的非互补配对)或一个或几多个单核苷酸添加，插入或缺失(即附加的或缺少的核苷酸残基)。因此，包含在报告化合物特异性捕获分子和靶核酸中的相应结合区域至少是部分同一的。本文中使用的术语“部分同一的”是指序列之间的差异仅仅是如上所述的一个或多个单核苷酸，或序列具有重叠的结合位点，即序列共有一部分共同的核苷酸序列，但是在序列区域的至少一个其它部分中不同。但是，包含在报告化合物特异性捕获分子和靶核酸中的相应结合区域识别报告分子的不同的，非重叠的(例如相邻的)序列，但是报告化合物特异性捕获分子或靶核酸与报告分子的结合在空间上干扰另一个分子与报告分子的结合，也是可能的。
在一些实施方案中，一方面形成报告化合物和靶核酸的复合物的步骤与另一方面在第二结合元件上捕获报告化合物(例如通过与报告分子特异性捕获分子形成复合物)的步骤之间的化学平衡可能受到改变报告分子特异性捕获分子的序列(相对于报告化合物的序列)以及报告化合物的序列(相对于靶核酸的序列)的相似性和/或部分同一性的影响。
例如，可以选择报告分子特异性捕获分子的序列，使得结合区域相对于报告分子化合物序列比报告化合物序列相对于靶核酸序列的结合区域更短或者更长。由此可见，报告化合物相对于靶核酸的结合亲和性相比于报告化合物相对于报告分子特异性捕获分子的结合亲和性可能增加或者降低。
可以使用一种或多种报告化合物特异性捕获分子。术语“一种或多种”是指一种或多种不同类型的报告化合物特异性捕获分子，例如一种或多种具有不同核苷酸序列的核酸分子。一种以上的报告化合物特异性捕获分子的相伴使用也被称为“文库”。这样的文库包含至少两种不同的分子，但是也可以包含许多种不同的分子，例如至少不同的10种，至少不同的20种，至少不同的50种等。文库也可以布置在相应的第二结合元件的不同位置上。例如，它们可以以阵列或任何其它空间布置的形式存在。
本文使用的术语“阵列”(也被称为“微阵列”)是指结合元件，例如第二结合元件(也被称为基体)上捕获分子，例如报告化合物特异性捕获分子的确定的空间布置(布局)，其中阵列中每个分子的位置被独立地确定。典型情况下，微阵列含有确定的位点或预定的区域，即被称为“阵列元件”或“点”，它们可以特定的样式布置，其中每个阵列元件一般只包含一种捕获分子。捕获分子例如报告化合物特异性捕获分子在支持物例如第二结合元件上的布置，可以通过共价或非共价相互作用来产生。但是，捕获分子也可以直接固定在用于执行方法的装置的反应室中(参见下文)。
“靶核酸”可以是上述的靶核酸。例如，靶核酸可以是与病毒感染诸如HIV感染相关的核酸。
典型情况下，靶核酸不是以分离的形式用于本发明的方法，而是以上述怀疑含有一种或多种靶核酸的样品的形式。本文使用的术语“一种或者多种”是指一种或多种不同类型的核酸，例如具有不同的核苷酸序列的分子和/或从不同来源传下来的分子(例如源自于感染宿主细胞的不同病原体的核酸)。
本文使用的术语“样品”是指任何如上所述的液体样品。可以被分析的液体样品的实例尤其包括人和非人体流体诸如全血。在本发明的某些实施方案中，被分析的样品是如上所述未处理的样品诸如未处理的全血样品。被分析的流体样品的体积可以在1μl至50μl的范围内，典型地在1μl至45μl，或者1μl至40μl，或者1μl至30μl，或者1μl至25μl，或者1μl至20μl，或者1μl至15μl的范围内。在具体的实施方案中，流体样品的体积在1μl至10μl的范围内。然而，在分析全血样品的情况下，超过50μl的样品体积也在本发明的范围内。
本文使用的术语“测定表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值”是指检测/测定参数诸如对捕获(或者重新捕获) 在第二结合元件上的报告分子进行定性和/或定量测定的电导率，氧化还原电势，吸光度，荧光强度或者生物发光。可以只测定这些参数中的一个参数，也可以相伴或者连续地测定超过一个参数(例如，电导率和由合适的标记产生的荧光信号的强度)。
在某些实施方案中，方法还包括根据表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值来确定表明靶核酸的存在和/或量的值。也就是说，可以根据在靶核酸/报告分子复合物形成之前存在的报告化合物的存在和/或量与该复合物形成之后被捕获在第二结合元件上的报告化合物的量之间的差别，来计算特定样品中存在的一种或多种靶核酸的存在和/或量。
为了形成检测反应，报告化合物可以包含一种或多种如上所述的可检测标记物。例如，报告化合物可以包含两种可检测的标记物。在具体的实施方案中，可检测标记物是荧光标记物。大量的英冠给标记物在本技术领域中是公知的，并且可以从不同的供应商商购(参见例如《手册：荧光探针和标记技术指南》(第10版)(The Handbook-A Guide toFluorescent Probes and Labeling Technologies,10th ed.) (2006)，《分子探针》，(Molecular Probes)，Invitrogen Corporation, Carlsbad,CA,USA)。
为了检测这样的标记物，用于进行方法的装置还可以包含适合于测定表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的检测系统。例如，可以使用如上所述的适合于测定表明捕获在结合元件上的靶核酸的存在和/或量的值的检测系统。
在某些实施方案中，方法还包括在一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤之后，从第二结合元件上释放出剩余部分量的报告化合物，将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在第二结合元件上，以及测定表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值。本文使用的术语“释放”，是指从第二结合元件上分开或解开报告分子。这可以通过例如裂解任何共价键来酶法实现，或者在核酸报告分子是通过报告分子特异性核酸捕获分子经互补碱基配对而结合到第二结合元件上的情况下，通过增加分析发生在其中的结构中的温度，从而导致核酸链的分离(即变性)来完成。
在其它实施方案中，释放，形成复合物，捕获和测定的步骤可以被重复额外的N次，其中N是大于或等于1的整数。换句话说，方法以循环的方式进行。在具体的实施方案中，整数N是≥5，≥10或≥20。
此外，一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤，以及将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在第二结合元件上的步骤，可以相伴进行。
在具体的实施方案中，方法还包括将靶核酸进行扩增，也就是说，在将它们进行进一步分析之前增加它们在样品中存在的量，以促进进一步的检测。典型情况下，靶核酸的扩增通过循环式扩增来实现。循环式扩增可以包含任何等于或大于2的数量的扩增循环。通常情况下，循环式扩增反应包含至少10个或至少20个循环。
示例性的循环式扩增是如上所述的聚合酶链反应(PCR)。典型情况下，通过使用热稳定的DNA聚合酶，PCR被用于扩增双链DNA 分子。在某些实施方案中，在循环式扩增中使用的DNA聚合酶具有核酸外切酶活性，特别是5'→3'核酸外切酶活性。这样的DNA聚合酶的例子包括尤其是Taq DNA聚合酶或Tth DNA聚合酶(可以从多个供应商商购)。利用该5'→3'核酸外切酶活性，DNA聚合酶可以核裂解性地攻击与靶核酸结合的报告分子的标记的5'-末端，导致该报告分子的逐渐降解。结果，捕获在第二结合元件上的报告化合物的量在每个扩增反应的循环期间又降低。任选地，使用的DNA聚合酶也可以表现出 3'→5'核酸外切酶活性(“校对活性”)，用于除去已经在特定序列位置加入到新生DNA链中的不正确的核苷酸。这样的具有两种核酸外切酶活性的DNA聚合酶的例子包括尤其是Pwo DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶(两种酶也可以从不同的供应商商购)。
如果靶核酸是RNA分子，方法还可以包括在对靶核酸进行扩增之前如上所述对它们进行反转录。
靶核酸的扩增可以在一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤之前开始。也就是说，将靶核酸进行扩增，同时允许报告化合物与靶核酸形成复合物，并且没有与靶核酸形成复合物的报告化合物被重新捕获在第二结合元件上。
为此目的，即为了核酸扩增，在图18和19中显示的装置500可用于执行方法，该装置还包含了一种或多种如上所述的温度控制单元和/或温度调节单元，用于控制和/或调控结构或反应室，例如中心孔502 中的温度。
用于容纳液体的结构可以使得结构中的压力增加的方式被填充含有被扩增的靶核酸的溶液，由此，结构中的压力增加迫使结构的一个或者多个弹性覆盖元件靠向加热元件和/或冷却元件。例如，为了进行核酸靶的扩增，可以填充结构，使得一个或者多个弹性覆盖元件进行凸弯，从而将一个或者多个覆盖元件压向加热元件和/或冷却元件并进行有效的热传导。
反应室中的温度的测量可以按照上面的描述来进行。
通常情况下，扩增例如PCR包含三个基本步骤——变性，引物的退火和引物的延伸，它们以循环的方式重复地进行。但是，扩增还可以分别在第一次“真正的”扩增循环之前包含最初的变性步骤，和/或在完成最后的扩增循环之后包含最后的延伸步骤。在方法的某些实施方案中，靶核酸的扩增包括(至少)变性双链核酸的步骤，和/或在靶核酸上退火和延伸引物分子的组合步骤(即“两步PCR”)。
变性步骤包括将被分析的样品加热到94-95℃的温度，一般为0.5 秒到5分钟，从而导致双链核酸模板解链。将被分析的样品进行这样的变性步骤，可以导致(即允许)样品中的双链核酸，包括双链靶分子，双链报告分子，报告化合物与靶核酸的复合物，以及报告化合物与报告化合物特异性捕获分子的复合物(结合到第二结合元件上)同时变性，后者导致报告化合物从第二结合元件上的释放。
退火步骤包括将被分析的样品冷却到40-65℃的温度，一般为1 秒到5分钟，以允许引物分子与变性的核酸模板链的结合(即杂交/碱基配对)。使用的反应温度依赖于被退火的引物分子的化学和/或物理性质，例如它们的核苷酸序列组成，熔点温度，它们发生分子内折叠 (例如形成双链发夹或转角结构)的倾向等。被分析的样品进行这样的退火步骤，可以进一步导致(即允许)双链靶分子的重新结合，双链报告分子的重新结合，报告化合物与核酸靶形成复合物，以及不与靶核酸复合的报告化合物与报告化合物特异性捕获分子形成复合物，后者导致将报告化合物捕获或者重新捕获在第二结合元件上。因此，在本发明的某些实施方案中，退火步骤和一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤和/或剩余一部分量的不与靶核酸复合的报告化合物捕获第二结合元件上的步骤相伴进行。
最后，延伸步骤包括使用DNA聚合酶对杂交的引物分子进行延伸以产生DNA模板链的全长拷贝。扩增的DNA片段的长度由使用的引物对的5'末端确定。典型情况下，延伸步骤在70-72℃下进行1秒到 10分钟。将被分析的样品进行这样的延伸步骤，可以通过在退火步骤中已经形成的一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸的复合物延伸，产生任选掺入了随后可以被检测的标记报告化合物的双链的被扩增的核酸片段，从而进一步导致了被分析的靶核酸的复制。
在一些实施方案中，例如为了安全的原因，可以在引发靶核酸的扩增之前不可逆地密封中心孔或者第二结构。不可逆地密封中心孔可以通过密封中心孔的入口以及任选的出口来实现。例如，与中心孔相连的通道和/或阀可以被热密封或者焊接。塑料通道或者阀可以通过将热杆与通道或者阀相接触进行热密封以使塑料熔融和通道或者阀关闭。
为了进行检测反应，报告化合物可以用一种或者多种如上所述的可检测标记物进行标记，例如用荧光标记物进行标记。可检测标记物可以并入或者连接于报告分子，例如以修饰和/或标记核糖核苷酸，脱氧核苷酸或者双脱氧核苷酸的形式。为了检测这样的标记物，可以使用如上所述的检测系统，例如光学检测系统。
在进行分析的过程中，表明靶核酸的存在和/或量的值的检测/测定可以只进行一次，也可以进行一次以上。在单个分析过程中进行了一个以上检测步骤的情况下，在某些实施方案中可以计算获得的结果的平均值。在一个或多个检测循环中获得的数据可以使用本技术领域的专业人员已知的适合的计算机软件来分析和进行数学处理，以确定尤其是一种或多种靶核酸的存在，长度或序列，和/或计算它/它们的量。
在某些实施方案中，特别是如果报告化合物超过靶核酸的量，表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的测定，在一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸的复合物的形成，和没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物在第二结合元件上的捕获达到平衡之前进行。例如，测定/检测步骤在扩增反应的退火步骤期间进行。但是，在退火步骤完成之后(即延伸步骤期间或完成之后)进行测定/检测，也是可能的。
在其它实施方案中，表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的测定，在一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤和将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在第二结合元件上的步骤之后1秒到120秒内进行 (例如1，5，10，15，20，30，60或120秒)。
在其它实施方案中，表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的测定，在包含了变性，退火和延伸步骤的循环式扩增的至少一个循环后进行，例如在退火步骤期间或完成之后进行。在具体的实施方案中，该值的测定在每个循环式扩增的循环之后进行。在其它具体实施方案中，表明靶核酸的存在和/或量的值的测定，在每次表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值被测定之后进行。
在某些实施方案中，表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的测定，包括了对指示值的时间依赖性的监测(即重复地执行测定/检测步骤，并监测指示值随时间的过程)。
在其它实施方案中，表明靶核酸的存在和/或量的值，是根据将表明报告化合物的存在和/或量的值与表明靶核酸的存在和/或量的值相关联的校正曲线来测定的。
方法可以在上述的装置中进行，该装置含有适于容纳液体的结构，其中结构含有至少一个结合元件，并与微流体网路流体连通；控制单元，适于控制流体流过微流体网路，以便靶分子被捕获在至少一个结合元件上，适于控制靶分子在结构中的扩增，并适于控制捕获在至少一个结合元件上的化合物的检测。例如，方法可以在装置中进行，该装置含有刚性基体；至少部分覆盖基体的弹性覆盖元件；在基体中形成的第一结构，适于容纳液体并适于释放一种或多种细胞，孢子或病毒的内含物，内含物中包含靶分子；在基体中形成的第二结构，适于容纳液体，并含有至少一个结合元件，适于捕获靶分子并用于测定表明靶分子的存在和/或量的值；微流体网路，至少将第一结构和第二结构相互连通；以及致动器单元，适于通过将弹性覆盖元件压向基体以选择性关闭一部分微流体网路，来实现第一结构和第二结构之间的流体流动。
例如，可以使用包含了第一孔502的装置500。在这样的实施方案中，形成含有靶核酸和捕获分子的复合物的步骤在第一孔中进行。
装置500可以包含第二孔512。在这样的实施方案中，第一结合元件和第二结合元件被提供在第二孔中，并且将复合物与第一结合元件相接触以将复合物结合在第一结合元件上的步骤，从第一结合元件上释放至少一部分量的靶核酸的步骤，形成一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸的复合物的步骤，将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在第二结合元件上的步骤，以及测定表明捕获在第二结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的步骤，在第二孔中进行。
测定表明被捕获的报告化合物的存在和/或量的值可以用致动器致动以使覆盖元件变形进行。覆盖元件的变形方式可以使得中心孔或者第二结构或者检测孔的体积降低。在这样的实施方案中，中心孔的体积可以在测定表明被捕获的报告化合物的存在和/或量的值后再次增加。
方法还可包括添加一定量的能与报告化合物形成复合物但是不与靶分子或者报告分子特异性捕获分子形成复合物的淬灭剂。淬灭剂化合物可以含有干扰由标记物产生可检测信号的一个或者多个部分(例如，淬灭基团“劫持”从荧光团的激发得到的发射)。例如，淬灭基团可能能够压制或者抑制由报告化合物的可检测标记物发射的信号，例如荧光信号。在这样的实施方案中，淬灭化合物可能能够与报告化合物形成复合物，但是不与靶分子或者报告分子特异性捕获分子复合，使得一种或者多种淬灭基团与复合物内的报告化合物的可检测标记物极接近。
淬灭化合物可以是寡核苷酸。在该实施方案中，淬灭寡核苷酸可以含有至少一个与报告寡核苷酸的序列区域互补的特异性序列区域，从而在淬灭化合物和报告化合物之间形成碱基配对。
淬灭基团可以包括常用的淬灭剂例如黑洞淬灭剂(Biosearch Technologies)，Qxl淬灭剂(AnaSpec)和Iowa黑淬灭剂。
淬灭化合物可以如上所述提供在装置的第二结构中。在这样的实施方案中，淬灭化合物可以与未捕获在第二结合元件上的报告化合物形成复合物。如上所述的装置的第二结构可以在开始靶核酸的扩增之前不可逆地密封。第二结构的不可逆密封可以通过例如热封与第二结构相连的通道和/或阀，密封(例如，焊接)第二结构的入口以及任选密封第二结构的出口实现。
按照本发明的另一个示例性实施方案，方法包括：
-形成物质的组合物，该物质包含：
一定量的报告化合物，
能够结合报告化合物的结合元件，以及
一定量的能够与报告化合物结合的靶核酸，
靶核酸与报告化合物的结合抑制了报告化合物与结合元件的结合；
-将一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸结合；
-将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物结合在结合元件上；以及
-测定表明结合在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值。
本文使用的术语“靶核酸”是指可以通过使用方法检测的任何核酸分子(即能够与报告化合物形成复合物的靶核酸；参见下文)。这样的核酸分子的例子包括天然存在的核酸例如脱氧核糖核酸(DNA) 或核糖核酸(RNA)，以及人工设计的核酸，例如核酸类似物例如尤其是肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)，它们是化学合成的或通过重组基因技术产生的(参见例如Sambrook,J.等(1989)《分子克隆实验指南》(第二版)(Molecular,Cloning:ALaboratory Manual,2nd ed.)， Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY)。天然存在的核酸的具体的例子包括DNA序列例如基因组DNA或cDNA分子，以及RNA序列例如hnRNA，mRNA或rRNA分子，或其反向互补的核酸序列。这样的核酸可以是任何长度的，既可以是单链的也可以是双链的分子。典型情况下，靶核酸的长度为10到10000个核苷酸，例如 20到2000个核苷酸，30到1000个核苷酸或50到500个核苷酸。在本文中使用的术语“核苷酸”应该被理解为是指核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸(即RNA和DNA分子)。
典型情况下，靶核酸不以分离的形式，而是以怀疑含有一种或多种靶核酸的样品的形式用于本发明的方法。本文使用的术语“一种或多种”是指一种或多种不同类型的核酸，例如具有不同核苷酸序列的分子和/或从不同的来源传下来的分子(例如从感染宿主细胞的不同病原体衍生的核酸)。
本文使用的术语“样品”是指任何待通过使用本发明的方法被分析的，并且被怀疑含有一种或多种被检测的靶核酸的液体。因此，术语样品可以包括溶解在水或适合的缓冲液(例如Tris/EDTA)中的纯化的核酸制备物，以及各种不同的生物学样品。可以使用该方法进行分析的液体样品的例子包括尤其是有机和无机化学物溶液，饮用水，污水，人类和非人类的体液例如全血，血浆，血清，尿液，痰液，唾液或脑脊髓液，来自动物，植物或组织培养物的细胞提取液，原核和真核细胞悬浮液，噬菌体制备液等。
样品还可以包含一种或多种其它试剂，例如稀释剂，溶剂或缓冲液，它们可能来自于样品在进行本发明的方法之前进行的任选的纯化和/或处理步骤。但是，在本发明的某些实施方案中，被分析的样品是未处理的样品，例如未处理的全血样品。本文使用的术语“未处理的”应该被理解为在样品收集(例如从患者抽取血液)之后和将其进行本发明的方法之前，没有发生进一步的样品加工(例如分级方法，干燥/ 复溶等)。
以下描述包括这样的未处理样品的典型的核酸检测方法。
本文使用的术语“报告分子”或“报告化合物”是任何能够与一种或多种靶核酸形成复合物，并且可以被捕获在结合元件上的分子，其中与靶核酸形成复合物抑制了报告化合物捕获在结合元件上。因此，本文使用的术语“能够形成复合物”是指报告分子和靶核酸之间的任何相互作用。换句话说，该术语表示，可以通过报告分子中包含的介导与靶的相互作用的共同的或不同的结合区域来实现的分子之间的彼此结合(例如通过互补核苷酸序列之间的Watson-Crick碱基配对)。典型情况下，相互作用是可逆的。类似地，术语“被捕获在结合元件上”也指报告分子与给定结合元件的任何直接或间接的(例如通过捕获分子，参见下文)相互作用。该相互作用一般来说也是可逆的。
一般来说，报告分子可以是长度为10到100个核苷酸，例如15 到50个核苷酸，15到40个核苷酸或20到30个核苷酸的核酸分子(即上面描述的RNA或DNA分子)。通常情况下，报告分子是单链核酸分子(即寡核苷酸)。报告化合物被构造为使得这样的报告分子与被检测的靶核酸的结合抑制了报告分子被捕获在第二结合元件上。核酸报告分子可以包括至少一个特异性结合区域(在本文中也称为“相互作用位点”)，该区域不仅能够与靶核酸相互作用(例如通过结合到靶核酸的至少部分互补的序列区域上，从而例如允许报告分子与被检测的靶核酸之间的Watson-Crick碱基配对)，而且能够被捕获在结合元件上。典型情况下，报告分子中包含的特异性结合区域长度为至少 12个核苷酸，例如至少15个核苷酸，至少18个核苷酸或至少22个核苷酸。在具体的实施方案中，报告分子的结合部分的核苷酸序列与靶核酸的相应核苷酸序列互补。
可以使用一种或多种报告分子。术语“一种或多种”是指一种或多种不同类型的报告分子，例如一种或多种具有不同核苷酸序列的核酸分子。
本文使用的术语“结合元件”或者“支持元件”是指任何固体基质，报告分子可以直接(例如通过报告分子中包含的锚定基团)捕获在其上，或以间接的方式通过一个或多个能够通过共价或非共价相互作用将报告分子捕获到结合元件上的捕获分子捕获在其上。可以使用的结合元件的例子包括尤其是阵列元件的基体(例如显微镜载玻片，晶片或陶瓷材料)或合成的粒子例如磁性珠子(例如顺磁性聚苯乙烯珠子，也被称为)和乳胶珠子。
本实施方案中使用的术语“捕获分子”是指任何被含在(例如，连接在或者固定在)结合元件上显示出特异性结合行为和/或特征性的反应性的分子，使其适合于与报告分子形成复合物(即，与报告分子结合)。在该实施方案中使用的捕获分子也可以指报告分子特异性捕获分子。典型情况下使用核酸作为捕获分子。可以用作捕获分子的核酸的例子已经在以上分别与靶和报告分子一起进行了描述。这样的核酸可以是任何长度的，既可以是单链的也可以是双链的分子。典型情况下，核酸捕获分子是长度为10到200个核苷酸，例如15到100个核苷酸或20到70个核苷酸的单链寡核苷酸。
捕获分子可以包括至少一个特异性序列区域(即结合区域)，它被构造为结合报告分子，例如与报告分子的互补序列区域经捕获分子和待检测的核酸的碱基配对相互作用。典型情况下，特异性结合区域长度为至少15个核苷酸，例如至少20个核苷酸，至少40个核苷酸或至少50个核苷酸。在具体的实施方案中，捕获分子的结合区域的核苷酸序列与报告分子的相应核苷酸序列互补。
在某些实施方案中，报告化合物的至少一部分能够与靶核酸形成复合物的相互作用位点，也能够与捕获分子形成复合物。换句话说，捕获分子与靶核酸竞争与报告化合物形成复合物，即是包含在捕获分子和靶核酸中的相应结合区域识别报告分子的同样的或至少相似的对应序列。本文中使用的术语“相似的序列”是指序列之间的差异仅仅是一个或多个单核苷酸误配(即核苷酸的非互补配对)或一个或多个单核苷酸添加，插入或缺失(即附加的或缺少的核苷酸残基)。因此，包含在捕获分子和靶核酸中的相应结合区域至少是部分同一的。本文中使用的术语“部分同一的”是指序列之间的差异仅仅是如上所述的一个或多个单核苷酸，或序列具有重叠的结合位点，即序列共有一部分共同的核苷酸序列，但是在序列区域的至少一个其它部分中不同。但是，包含在捕获分子和靶核酸中的相应结合区域识别报告分子的不同的，非重叠的(例如相邻的)序列，但是捕获分子或靶核酸与报告分子的结合在空间上干扰另一个分子与报告分子的结合，也是可能的。
在一些实施方案中，一方面形成报告化合物和靶核酸的复合物的步骤与另一方面在第二结合元件上捕获报告化合物(例如通过与报告分子特异性捕获分子形成复合物)的步骤之间的化学平衡可能如上所述分别受到改变报告分子特异性捕获分子的序列(相对于报告化合物的序列)以及报告化合物(相对于靶核酸)的相似性和/或部分同一性的影响。
例如，可以选择报告分子特异性捕获分子的序列，使得结合区域相对于报告化合物序列比报告化合物序列相对于靶核酸序列的结合区域更短或者更长。由此可见，报告化合物相对于靶核酸的结合亲和性相比于报告化合物相对于报告分子特异性捕获分子的结合亲和性可能增加或者降低。
可以使用一种或多种捕获分子。术语“一种或多种”是指一种或多种不同类型的捕获分子，例如一种或多种具有不同核苷酸序列的核酸分子。一种以上的捕获分子的相伴使用也被称为“文库”。这样的文库包含至少两种不同的分子，但是也可以包含许多种不同的分子，例如至少不同的5种，至少不同的10种，至少不同的30种等。文库也可以布置在相应的结合元件的不同位置上。例如，它们可以阵列或任何其它空间布置的形式存在。
本文使用的术语“阵列”(也被称为“微阵列”)是指结合元件 (也被称为“基体”)上捕获分子的确定的空间布置(布局)，其中阵列中每个分子的位置被独立地确定。典型情况下，微阵列含有确定的位点或预定的区域，即被称为“阵列元件”或“点”，它们可以特定的样式布置，其中每个阵列元件一般只包含一种捕获分子。捕获分子在支持物上的布置，可以通过共价或非共价相互作用来产生。但是，捕获分子也可以直接固定在用于执行方法的装置的反应室中(参见下文)。
在第一步中，方法可以包括形成物质的组合物，该物质包含一定量的报告化合物，结合元件和一定量的靶核苷酸。本文使用的术语“形成组合物”是指上述成分的任何组合或混合。这可以通过将成分同时地，相继地或分别地导入到适合用于进行该方法的分析装置的一个或多个反应室中来实现。可选地，在将混合物导入装置中之前，将单独的成分进行混合，也是可能的。
正如前面已经描述的，方法还可以使用一种以上的报告化合物和一种以上的靶核苷酸来进行。因此，在某些实施方案中，形成物质的组合物的步骤包括形成含有下列成分的物质的组合物：
-一定量的第一报告化合物，
-一定量的能够与第一报告化合物形成复合物的第一靶核酸，与第一报告化合物形成复合物抑制了第一报告化合物被结合元件的捕获，
-一定量的第二报告化合物，以及
-一定量的能够与第二报告化合物形成复合物的第二靶核酸，与第二报告化合物形成复合物抑制了第二报告化合物被结合元件的捕获。
本文使用的术语“装置”是指任何适合于通过被发明的方法分析样品的仪器设备。用于本方法的典型的装置描述在本文中。这样的装置的示例性实施方案描述在图17到19中。其它适合于进行本方法的装置描述在欧洲专利申请EP 06 122 695和国际专利申请WO2007/051861中，这两篇专利文献的相关内容也在此明确引为参考。
典型地，装置可以包括至少一个用于容纳液体样品的结构(在本文也称为“反应室”或“反应空间”)。本文使用的术语“反应室”是指在装置的底面和顶面(也称为第一和第二表面)之间形成的空间，其中进行至少一个实际分析的步骤，例如检测靶核酸。底面和顶面可以彼此相对或者基本上相对放置。例如，他们可以彼此平行或者基本上平行放置。
在某些实施方案中，反应室可以包含两个或多个子室。这可以通过提供带有一个或多个分区或洞的第一表面和/或第二表面来实现，这些表面用作两个或多个子室之间的侧壁。
在其他实施方案中，用于本方法的装置包括了一个以上反应室，以在不同的反应室中平行地执行一个样品的多个分析，或以连续的方式执行分析的不同步骤。就此而言，反应室可以彼此之间流体连通。本文使用的术语“彼此流体连通”是指单个反应室之间的任何相互连通，可以是直接地，也可以是间接地通过其它的方式例如共同的样品导入通道，填充单元，加工单元等。但是，本文中使用的该术语不必需意味着在导入样品后，反应室彼此之间永久地流体连通。反应室也可能是暂时流体连通的，例如通过位于反应室之间的连接处的单向或双向阀来实现。
在导入被分析的样品(包含靶核酸)之前，报告分子和/或捕获分子可以被提供(例如以冷冻干燥和干燥的形式)在装置的至少一个反应室的一个或者多个中(或者一个或者多个子室中)，在所述装置中进行检测分析。报告分子和/或捕获分子可以被提供在相同的反应室(或者子室)或者不同的反应室(或者子室)中。或者，报告分子和/或捕获分子可以与样品一起导入到装置中(即相伴地)或在样品已经导入之后导入到装置中。
类似地，在导入被分析的样品(包含靶核酸)之前，结合元件可以被提供在装置的至少一个反应室的一个或者多个中(或者一个或者多个子室中)，在所述装置中进行检测分析。结合元件可以被提供在与报告分子和/或捕获分子相同的反应室(或者子室)或者不同的反应室(或者子室)中。例如，也可以是进行形成报告分子与靶核酸的复合物的步骤与将报告分子捕获在结合元件上的步骤在空间上分开进行，即在装置的不同反应室(或者子室)中进行。在这样的实施方案中，各个成分通常不提供在同一反应室中。除了在添加样品之前在装置中提供结合元件，也可以与样品一起导入到装置中(即相伴地)或在样品已经导入之后导入到装置中。
在具体的实施方案中，本方法中使用的装置是选自生物传感器分析装置，微流体盒和芯片实验室的装置。
在形成了物质的组合物之后，方法可以包括将一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤。换句话说，可以允许报告化合物与靶核酸结合，例如通过报告化合物和靶核酸的互补核苷酸序列的碱基配对形成双链核酸分子。一部分量的报告化合物与至少一部分量的存在的靶核酸形成复合物的事实，表明在分析开始时存在的报告化合物的总浓度可能超过存在的靶核酸的总浓度。
随后，可以将没有与靶核酸形成复合物的剩余量的报告化合物，通过上面描述的报告分子中包含的一个或多个结合区域捕获(即结合) 到结合元件上(直接地，或结合到连接在结合元件上的捕获分子上)。因为靶核酸与报告分子的复合物的形成抑制了报告分子在结合元件上的捕获，与执行形成靶核酸/报告分子复合物的步骤之前存在的量相比，靶核酸/报告分子复合物的形成减少了可以被捕获在结合元件上的报告分子的量。
在本发明方法的具体实施方案中，一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤，以及将没有与靶核酸复合的剩余部分量的报告化合物捕获在结合元件上的步骤伴随进行。
最后，方法可以包括测定表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值。本文使用的术语“表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的测定”是指检测/测定允许对捕获(或重新捕获)在结合元件上的报告分子进行定性和/或定量测定的参数，例如电导性，氧化还原电势，光吸收，荧光强度或生物发光。可以只测定这些参数中的一种，但是相伴地或相继地测定一种以上的参数(例如电导性和由适合的标记物产生的荧光信号的强度)，也是可能的。
在一些实施方案中，方法还包括基于表明被捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值测定表明靶核酸的存在和/或量的值。也就是说，存在于特定样品中的一种或者多种靶核酸的存在和/或量可以基于在形成靶核酸/报告分子复合物之前存在的报告化合物的存在和/ 或量和在所述复合物形成之后被捕获在结合元件上的报告化合物的量之间的差异进行计算。
为了执行检测反应，报告化合物可以包含一种或多种如上所述的可检测标记物，例如荧光标记物。例如，报告化合物可以包括两种可检测标记物。可检测标记物可以整合或连接到报告分子上，例如以修饰的和/或标记的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸或双脱氧核糖核苷酸的形式。
为了检测这样的标记物，用于执行方法的装置还可以含有如上所述适合于测定表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的检测系统，例如光学检测系统。检测系统可以与反应室相连。典型情况下，检测系统位于至少一个反应室之一的对面，可选地位于发生检测的特定表面区域的对面。
在某些实施方案中，方法还包括在将一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物，将没有与靶核酸形成复合物的剩余部分量的报告化合物捕获在结合元件上，以及测定表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的步骤之后，将剩余部分量的报告化合物从结合元件上释放出来。本文使用的术语“释放”，是指从结合元件上分开或解开报告分子。这可以通过例如裂解任何共价键来酶法实现，或者在核酸报告分子是通过核酸捕获分子经互补碱基配对而结合到结合元件上的情况下，通过增加分析发生在其中的反应室中的温度，从而导致核酸链的分离(即变性)来完成。
在其它实施方案中，释放，形成复合物，捕获和测定的步骤可以被重复额外的N次，其中N是大于或等于1的整数。换句话说，方法以循环的方式进行。在具体的实施方案中，整数N是≥5，≥10或≥20。
在某些实施方案中，在形成复合物的步骤之前，方法还包括将至少一部分量的报告化合物捕获在结合元件上；测定表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值；以及从结合元件上释放被捕获的报告化合物。因此，进行这些附加的步骤能够测定在允许报告化合物与靶核酸之间形成复合物之前，最初存在的报告化合物的量。将获得的值与将没有与靶核酸形成复合物的部分量的报告化合物捕获在结合元件上之后测定到的值进行比较，提供了对样品中存在的靶核酸的存在和/或量的测定。
在具体的实施方案中，方法还包括对靶核酸进行扩增，也就是说，在将它们进行进一步分析之前增加它们在样品中存在的量，以便于进一步的检测。典型情况下，靶核酸的扩增通过循环式扩增的方式来实现。循环式扩增可以包含任何等于或大于2的数量的扩增循环。通常，循环式扩增反应包括至少10个或至少20个循环。
示例性的循环式扩增是如上所述的聚合酶链反应(PCR)。典型情况下，通过使用热稳定的DNA聚合酶，PCR被用于扩增双链DNA 分子。在某些实施方案中，在循环式扩增中使用的DNA聚合酶具有核酸外切酶活性，特别是5'→3'核酸外切酶活性。这样的DNA聚合酶的例子包括尤其是Taq DNA聚合酶或Tth DNA聚合酶(可以从多个供应商商购)。利用该5'→3'核酸外切酶活性，DNA聚合酶可以核裂解性地攻击与靶核酸结合的报告分子的标记的5'-末端，导致该报告分子的逐渐降解。结果，捕获在结合元件上的报告化合物的量在每个扩增反应的循环期间又降低。任选地，使用的DNA聚合酶也可以表现出3'→5' 核酸外切酶活性(“校对活性”)，用于除去已经在特定序列位置加入到新生DNA链中的不正确的核苷酸。这样的具有两种核酸外切酶活性的DNA聚合酶的例子包括尤其是Pwo DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶(两种酶也可以从不同的供应商商购)。
如果靶核酸是RNA分子，方法还可以包括在对靶核酸进行扩增之前如上所述对它们进行反转录。
靶核酸的扩增可以在一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤之前开始。也就是说，将靶核酸进行扩增，同时允许报告化合物与靶核酸形成复合物，并且没有与靶核酸复合的报告化合物被重新捕获在结合元件上。
为此目的，即为了核酸扩增，本方法中使用的装置还可包含一种或多种如上所述的一种或者多种温度控制单元和/或温度调节单元，用于控制和/或调节反应室中的温度。
反应室中的温度的测量可以按照上面的描述来进行。通常情况下，扩增例如PCR包含三个基本步骤——变性，引物的退火和引物的延伸，它们以循环的方式重复地进行。但是，扩增还可以分别在第一次“真正的”扩增循环之前包含最初的变性步骤，和/或在完成最后的扩增循环之后包含最后的延伸步骤。在本发明方法的某些实施方案中，靶核酸的扩增包括(至少)变性双链核酸的步骤，和/或在靶核酸上退火和延伸引物分子的组合步骤(即“两步PCR”)。
变性步骤包括将被分析的样品加热到94-95℃的温度，一般为0.5 秒到5分钟，从而导致双链核酸模板解链。将被分析的样品进行这样的变性步骤，可以导致(即允许)样品中的双链核酸，包括双链靶分子，双链报告分子，报告化合物与靶核酸的复合物，以及报告化合物与捕获分子的复合物(结合到结合元件上)同时变性，后者导致报告化合物从结合元件上释放。
退火步骤包括将被分析的样品冷却到40-65℃的温度，一般为1 秒到5分钟，以允许引物分子与变性的核酸模板链的结合(即杂交/碱基配对)。使用的反应温度依赖于被退火的引物分子的化学和/或物理性质，例如它们的核苷酸序列组成，熔点温度，它们发生分子内折叠 (例如形成双链发夹或转角结构)的倾向等。被分析的样品进行这样的退火步骤，可以进一步导致(即允许)双链靶分子的重新结合，双链报告分子的重新结合，报告化合物与核酸靶形成复合物，以及不与靶核酸复合的报告化合物与捕获分子形成复合物，后者导致将报告化合物捕获或者重新捕获在结合元件上。因此，在某些实施方案中，退火步骤和一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤和/或剩余一部分量的不与靶核酸复合的报告化合物捕获在结合元件上的步骤相伴进行。
最后，延伸步骤包括使用DNA聚合酶对杂交的引物分子进行延伸以产生DNA模板链的全长的拷贝。扩增的DNA片段的长度由使用的引物对的5'末端确定。典型情况下，延伸步骤在70-72℃下进行1秒到 10分钟。将被分析的样品进行这样的延伸步骤，可以通过在退火步骤中已经形成的一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸的复合物延伸，产生任选掺入了随后可以被检测的标记报告化合物的双链的被扩增的核酸片段，从而进一步导致了被分析的靶核酸的复制。
在进行分析期间，表明靶核酸的存在和/或量的值的检测/测定，可以只进行一次，也可以进行一次以上。在单一分析过程中进行一个以上检测步骤的情况下，计算获得的结果的平均值。在一个或多个检测循环中获得的数据，可以使用本技术领域的专业人员所熟知的适合的计算机软件进行分析和数学处理，以确定尤其是一种或多种靶核酸的存在，长度或序列，和/或计算它/它们的量。
在某些实施方案中，特别是如果报告化合物超过靶核酸的量，表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的测定，在一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸的复合物的形成，和没有与靶核酸复合的剩余部分量的报告化合物在结合元件上的捕获达到化学平衡之前进行。例如，测定/检测步骤在扩增反应的退火步骤期间进行。但是，在退火步骤完成之后(即延伸步骤期间或完成之后)进行测定/检测反应，也是可能的。
在其它实施方案中，表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的测定，在一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物的步骤和将没有与靶核酸复合的剩余部分量的报告化合物捕获在结合元件上的步骤开始之后1秒到120秒内进行(例如1，5， 10，15，20，30，60或120秒)。
在其它实施方案中，表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的测定，在包含了变性，退火和延伸步骤的循环式扩增的至少一个循环后进行，例如在退火步骤期间或完成之后进行。在具体的实施方案中，该值的测定在循环式扩增的每个循环之后进行。在其它具体实施方案中，表明靶核酸的存在和/或量的值的测定，每次在表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值被测定之后进行。
在某些实施方案中，表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值的测定，包括了对指示值的时间依赖性的监测(即重复地执行测定/检测步骤，并监测指示值随时间的过程)。
在其它实施方案中，表明靶核酸的存在和/或量的值，是根据将表明报告化合物的存在和/或量的值与表明靶核酸的存在和/或量的值相关联的校正曲线来测定的。
方法还可包括添加一定量的能与报告化合物形成复合物但是不与靶分子或者报告分子特异性捕获分子复合的淬灭剂。淬灭剂化合物可以含有干扰由标记物产生可检测信号的一个或者多个部分(例如，淬灭基团“劫持”从荧光团的激发得到的发射)。例如，淬灭基团可能能够压制或者抑制由报告化合物的可检测标记物发射的信号，例如荧光信号。在这样的实施方案中，淬灭化合物可能能够与报告化合物形成复合物，但是不与靶分子或者报告分子特异性捕获分子复合，使得一种或者多种淬灭基团与复合物内的报告化合物的可检测标记物极接近。
淬灭化合物可以是寡核苷酸。在这样的实施方案中，淬灭寡核苷酸可以含有至少一个与报告寡核苷酸的序列区域互补的特异性序列区域，从而在淬灭化合物和报告化合物之间形成碱基配对。
淬灭基团可以包括常用的淬灭剂例如黑洞淬灭剂(Biosearch Technologies)，Qxl淬灭剂(AnaSpec)和Iowa黑淬灭剂。
淬灭化合物可以如上所述提供在装置的第二结构中。在这样的实施方案中，淬灭化合物可以与未捕获在第二结合元件上的报告化合物形成复合物。
如上所述的装置的第二结构可以在开始靶核酸的扩增之前不可逆地密封。第二结构的不可逆地密封可以通过例如热封与第二结构相连的通道和/或阀，密封(例如，焊接)第二结构的入口以及任选地密封第二结构的出口实现。
根据另一个示例性的实施方案，提供了方法，该方法包括：
-将流体全血样品引入装置中，所述装置被改造为适于容纳流体状态的样品；和
-基于在装置中进行的分析测定全血样品中表明与病毒感染有关的核酸的存在和/或量的值。
尤其是，测定的值表明与病毒感染有关的总核酸的存在和/或量。
根据另一个示例性的实施方案，提供了方法，该方法包括：
-提供1μl至50μl体积的流体样品；和
-基于在装置中进行的分析测定样品中表明与病毒感染有关的核酸的存在和/或量的值。
任选地，方法还可以包括将流体样品引入装置中，所述装置被改造为适于容纳流体状态的样品；和基于在装置中进行的分析测定全血样品中表明与病毒感染有关的核酸的存在和/或量的值。
尤其是，测定的值表明与病毒感染有关的总核酸的存在和/或量。
本文使用的术语“流体样品”或“液体样品”是指待通过使用本方法被分析的，并且被怀疑含有一种或多种被检测的核酸(即，与病毒感染有关的核酸)的液体。通常待分析的流体样品是生物学样品。可以被分析的流体样品的例子包括尤其是人类和非人类的体液例如全血，血浆，血清，尿液，痰液，唾液或脑脊髓液，细胞提取液等。在某些实施方案中，待分析的流体样品是血液样品(即，例如全血，血浆和血清)，尤其是全血样品。
被分析的流体样品的体积可以在1μl到50μl的范围内，典型情况下在1μl到45μl，或1μl到40μl，或1μl到30μl，或1μl到25μl，或1μl 到20μl，或1μl到15μl的范围内。在具体的实施方案中，流体样品的体积在1μl到10μl的范围内。然而在全血样品是被分析的样品的情况下，超过50μl的体积也在本发明的范围内。
本文使用的术语“全血”是指含有其所有组分的血液。换句话说，全血包括血细胞例如红细胞，白细胞和血小板，以及血细胞悬浮在其中的血浆。
本文使用的术语“血浆”(或者“血浆”)是指血液的液体介质，并且实质上是含有水，血浆蛋白和痕量的其他物质，诸如血清血蛋白，凝血因子，免疫球蛋白(抗体)，激素，二氧化碳，多种其他蛋白和多种电解质(主要是钠和氯化物)的水性溶液。
本文使用的术语“血清”是指已经除去了凝血蛋白的血浆。
在其他实施方案中，被导入装置的流体样品是未处理的全血样品。本文使用的术语“未处理的”表示在样品收集(例如从患者抽取血液) 之后和将其进行本发明的方法之前，没有发生进一步的样品加工(例如分级方法，干燥全血，例如在滤纸上用于储藏样品以及通过复溶在水中将干燥的血液样品复溶等)。
然而，样品本身的储藏例如储藏在冰箱或者冷冻机中，并不被认为是如上所定义的处理步骤。由此，样品可以在收集后立即引入装置或者也可以在储藏样品一个或者一个以上的小时或者一或者以上的天数或者周数后被引入装置。
另外，因为全血样品包含凝血因子，其将引起在样品的延期储存后形成血块，或者其存在可能因此干扰随后的分析，添加抗凝剂(即凝血的抑制剂)也不是在本发明意义上的样品处理。作为抗凝剂的多种化合物是本领域公知的。抗凝剂的例子尤其包括天然的或者合成的 (即通过化学合成和/或重组DNA技术获得的)维生素K拮抗物，天然的或者合成的直接的凝血抑制因子，柠檬酸盐，草酸盐，肝素和乙二胺四乙酸(EDTA)。
在其他的实施方案中，流体全血样品被直接从患者引入装置(即以上述的未处理的形式)。尤其是，流体全血样品可以获自患者的指尖刺扎。例如，在刺扎指尖后通过将血液接触毛细管，使得血液无需外部操作通过毛细作用力引入血液，可以收集渗出的血液。然后可以将毛细管相对于所使用的分析装置进行放置使得血液可以流入装置或者可以被主动地转入装置。或者，可以将刺扎后的指尖立即靠近装置的一个开口放置，所述装置的开口在以下详细描述(例如，通过将指尖直接挤压在这样的开口上)，使得从刺扎渗出的血液可以被引入装置中。
本文使用的术语“与病毒感染有关的核酸”是指任何存在于被分析的，已经被一种或多种病毒感染的流体样品中的病毒来源的核酸分子(即其核苷酸序列与病毒基因组中相应的序列同一或互补)。感染从中获得流体样品的宿主的病毒，可以是任何DNA病毒(即具有DNA 基因组的病毒)或RNA病毒(即具有RNA基因组的病毒)(综述在例如Büchen-Osmond,C.(2003).《病毒的分类学与分类》，在《临床微生物学手册》(第八版)第二卷中，(Taxonomyand Classification of Viruses.In:Manual of Clinical Microbiology,8th ed.,vol.2)，p. 1217-1226,ASM Press,Washington DC)。DNA病毒的例子包括尤其是乳多空病毒科(Papovaviridae)(例如乳头瘤病毒)，腺病毒科 (Adenoviridae)(例如腺病毒)和疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如Epstein-Barr病毒，细胞肥大病毒)的病毒。RNA病毒的例子包括尤其是小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒，鼻病毒)，黄病毒科(Flaviviridae)(例如丙型肝炎病毒)，纤丝病毒科 (Filoviridae)(例如马尔堡病毒，埃博拉病毒)和逆转录病毒科 (Retroviridae)(例如人类免疫缺陷病毒(HIV))的病毒。在某些实施方案中，被检测的核酸与逆转录病毒科的成员引起的感染相关，特别是它们与HIV感染相关。本文中使用的术语“HIV”是指HIV-1和 HIV-2，以及从其衍生的任何亚型。
因为许多DNA病毒以及逆转录病毒(值得注意的是逆转录病毒的复制以便需要将RNA病毒基因组反转录成DNA)可以潜伏的前病毒形式将它们的遗传信息整合到宿主细胞的基因组中，因此术语“与病毒感染有关的核酸”不仅仅是指源自于游离的和细胞相关的病毒的核酸，而且还指整合在宿主基因组中的前病毒DNA分子，反转录的病毒 DNA分子(即病毒复制的“中间体”)，以及源自于前病毒DNA的转录本(即通过宿主DNA基因组的转录获得的RNA分子)。
在具体的实施方案中，方法意在测定待分析的流体样品中总病毒核酸的量。换言之，方法可能意在检测所有不同类型的(即RNA和 DNA分子)以及细胞子集(即，空间上分开的核酸集合)的与患者的病毒感染相关的核酸。典型地，被检测的核酸与病毒感染的单个类型诸如HIV感染相关。然而，也可能患者患有与不同类型的病毒的共感染。本方法还可以包括测定在单个分析中相伴的或者在多个分开的分析中(然而，可以使用相同的流体样品进行)的与各自不同类型的病毒相关的核酸的存在和/或(总的)量。
由此，在患者感染HIV的情况下，则可能存在于从患者获得的全血样品中存在的与HIV感染有关的核酸包含源于游离HIV的RNA分子(即，在血浆中自由流通的病毒颗粒)，源于细胞相关HIV的RNA 分子(即与任何类型的血细胞结合的病毒颗粒)，与宿主的基因组整合的前病毒HIV DNA分子，反转录HIV DNA分子和源于前病毒DNA的 HIV转录本。然而，从同一患者获得的血浆样品只包含源于游离HIV 的RNA分子，因为所有与患者的血细胞相关的其他的HIV核酸都已经被除去。
本文使用的术语“装置”是指任何适合于通过以上描述的方法分析样品的仪器设备，前提是该装置“被改造为适于容纳流体状态的样品”，其意味着装置被构造为使得保持样品的流体(即，液体)状态，同时将样品容纳在装置中。也就是说，在进行核酸分析之前，装置中样品不以任何方式进行干燥，使得通过将样品施加在滤纸上并使多余的液体蒸发。因此，这样的装置也称为“微流体装置”。
用于本方法的典型的装置描述在本文中。这样的装置的示例性实施方案描述在图17到19中。其它适合于进行本方法的装置描述在欧洲专利申请EP 06 122 695和国际专利申请WO 2007/051861中，这两篇专利文献的相关内容也在此明确引为参考。
用于进行本方法的装置包括至少一个用于容纳液体样品的结构(在本文也称为“反应室”或“反应空间”)。本文使用的术语“反应室”是指在装置的底面和顶面(也称为第一和第二表面)之间形成的空间，其中进行至少一个实际分析的步骤，例如检测靶核酸。底面和顶面可以彼此相对或者基本上相对放置。例如，他们可以彼此平行或者基本上平行放置。
在一些实施方案中，至少一个反应室的至少一部分由透明材料制成，也就是，由透光材料制成，以便核酸的检测。适当的透明材料的实例尤其包括玻璃或者玻璃样材料(例如，丙烯酸类玻璃)以及合成的聚合物(例如，聚甲基丙烯酸甲酯，丙烯酸类材料或者聚乙烯)。
在其他的实施方案中，至少一个反应室的至少一部分是弹性的或者是能弹性变形的。也就是说，反应室的至少一个或者多个部分由可弹性变形的材料例如弹性膜(例如硅橡胶)制成。
在所使用的一些装置中，至少一个反应室可以包含两个或多个子室。这可以通过提供带有一个或多个分区或洞的第一表面和/或第二表面来实现，这些表面用作两个或多个子室之间的侧壁。
在一些实施方案中，装置包括了一个以上反应室，以在不同的反应室中平行地执行一个样品的多个分析，或以连续的方式执行分析的不同步骤(也参见图17)。就此而言，反应室可以彼此之间流体连通。本文使用的术语“彼此流体连通”是指单个反应室之间的任何相互连通，可以是直接地，也可以是间接地通过其它的机构例如共同的样品导入通道，填充单元，加工单元等(也称作“微流体网路”)。但是，本文中使用的该术语不必需意味着在导入样品后，反应室彼此之间永久地流体连通。反应室也可能是暂时流体连通的，例如通过位于反应室之间的连接处的单向或双向阀来实现。
在用于本方法的分析装置中，至少一个反应室的至少一个的底面和顶面之间的距离可以经一或多个致动器(也称为置换器)改变。致动器表示用于相对于彼此垂直移动底面和/或顶面，或者其至少一或多个部分的装置。由此，所述表面之间距离的变化在整个表面积上未必是必要地，而是可能也局限于一个或者两个所述表面的表面积的至少一部分上。典型地，底面和/或顶面之间的距离例如通过致动器加压降低到所述表面的一个或者两个的至少一部分。致动器可以构成底面或者顶面的不可分割的部分(例如被装配为凸出物或者扣形物)或者可以代表位于反应室外的独立的自主(self-contained)的实体(诸如作为梃杆或者型板)。
顶面和底面之间的距离经一个或者多个致动器的变化可以产生特定的反应室内至少一部分样品的位移和/或不同的反应室(或者子室)之间至少一部分样品的移动(运输)，在不同的反应室(或者子室)中可以发生不同的方法步骤。也就是说，通过操作致动器样品在装置的至少一个反应室内或者之间移动。所述表面之间距离的重复和交替的降低和重新增加因此还将产生反应室内样品的相应正向和反向的移动(即混合样品)。
如果不是经一或多个致动器改变反应室的底面和顶面之间的距离，装置中流体样品的运输或者移动尤其可以通过泵，尤其是通过使用真空泵或者蠕动泵来实现。
本文使用的装置的反应室还可以包括一个或者多个布置在至少一个反应室的底面和/或顶面上的微阵列(在本文中也称为“阵列”或者“阵列元件”)。本文使用的“微阵列”是指捕获分子(例如，一或多种探针分子或者物质文库；参照以下)在支持元件(也称为“基质”或者“结合元件”)的限定的空间排列(布局)，其中分别地确定微阵列内每个分子的位置。典型地，微阵列包括限定的位点或者预定确定的区域，即所谓的阵列元件或者点，其可以特定的式样排列，其中每个阵列元件典型地只包含一种捕获分子。捕获分子在支持元件上的排列可以通过共价或者非共价相互作用产生。微阵列的适当的基质尤其包括显微镜用载玻片，晶片或者陶瓷材料。然而，捕获分子也可以直接固定在底面和/或顶面上。
用于本发明的方法的装置的反应室还可以包括一或多个开口，其可以是可锁定的的和/或可密封的，并且其可以用于将待分析的样品以及任何其他的试剂，检测剂等可能任选地也是进行该方法所需的试剂直接导入。或者，这样的开口也可用于连接装置的任何其他没有被设计作为装置的组成部分的(补充的)组件，诸如尤其是填充单元，加工单元，温度控制单元，具体的检测单元和废物容器。
在具体实施方案中，装置是选自生物传感器分析装置，微流体盒以及芯片实验室的装置。
在一些实施方案中，装置被改造为适于检测流体(即液体)样品中的核酸。换句话说，装置还可以包括如上所述的检测系统，例如，光学检测系统，其可以与反应室相连。典型情况下，检测系统位于至少一个反应室之一的对面，可选地位于发生检测的特定表面区域的对面。适当的检测系统的选择取决于若干参数，诸如用于检测的标记物的类型或者进行分析的种类。在一些实施方案中，进行该方法包括简单的检测系统，其可能基于诸如荧光，吸光度，共振转移等参数的测量。
典型地，装置和系统是自主的。也就是说，他们未必除去和/或替换反应室中的样品和/或任何其他的试剂同时进行分析。由此，这样的装置可以只包含样品入口而不含出口。
待分析的流体样品可以经至少一个反应室的一或多个开口被直接导入装置中，所述至少一个反应室可以是可锁定的和/或可密封的。通过利用合适的压力产生机构，任选地可以与其他的反应物(诸如缓冲液或其它稀释剂，染料，标记物，分析反应物或用于进行检测分析的酶)一起将样品转移到反应室中，压力产生机构为例如吸移管，注射器或自动操作单元，其可以是例如处理装置的功能单元。或者，也可以在没有任何外部操作的情况下通过毛细力将样品导入到反应室中，例如通过将样品放置于紧邻于限定反应室的任一表面中存在的一个开口中。
该方法的进行可以无需除去和/或替换反应室中的样品和/或任何其它反应物，同时进行该方法。然而，某些应用可能需要将其他的反应物导入反应室中，诸如将含有任何标记物的一或多种试剂导入到反应室中，以便进行目的核酸的检测。这种其他的溶液也可以在导入样品之前或与样品相伴，或者在将样品导入到反应室中后，直接导入到如上所述的反应室中。在某些实施方案中，将其他的反应物在添加样品之前提供在装置中，尤其是以冷冻干燥或干燥形式诸如粉末，颗粒或小球的形式提供。
或者，导入待分析的样品以及任选的其他反应物，也可以间接方式通过一或多种填充单元，所述填充单元可以是装置的不可分割的部分，或者被设计成可连接于反应室进行填充并在使用后拆开的单独的部分。能够容纳待分析液体样品并且能够(可逆地)连接于反应室的任何容器也可以用作填充单元。例如，填充单元可以是适于采集血样的毛细管。
装置可以包含作为不可分割的一部分的或者可拆开的单独的废物容器，其用于接收来自反应室的多余介质。任选地，废物容器还含有气体，液体，或固体填料介质，尤其诸如纤维素，填充材料，以及二氧化硅凝胶，其可逆地或者不可逆地结合多余的物质。此外，废物容器可以包含一或多种通气孔或可以在其内部装备有真空装置用于增加多余材料向废物容器的转移。
在样品以及任选地任何其他的反应物已经导入到反应室中，或者已经从一个或者多个填充单元转移到反应室之后，样品可以任选地在反应室中温育给定的时间段以使其适当的扩散在整个反应空间。典型地，温育期在1秒至30分钟的范围内，例如10秒至15分钟的范围内，或30秒至10分钟的范围内。
在某些实施方案中，在装置中进行的分析还包括从待分析的流体样品释放核酸。为此目的，可以加热样品以便破坏细胞膜和/或病毒衣壳(例如，通过使用如下所述的温度控制单元和/或温度调节单元)。在某些实施方案中，该释放步骤包括将流体样品与如上所述的裂解反应物接触。
在其他实施方案中，在装置中进行的分析还包括扩增与病毒感染有关的核酸，也就是说在将其进行进一步的分析之前增加其在样品中的存在量以便促进其的进一步的检测。典型地，通过如上所述的聚合酶链式反应(PCR)实现核酸扩增。
尤其为此目的，即，为了核酸扩增，用于该方法的装置还可以包括如上所述的温度控制单元和/或温度调节单元用于控制和/或调节反应室中的温度。
可以如上所述测量反应室中的温度。
在某些实施方案中，在装置中进行的分析还包括形成复合物，每种复合物包含与病毒感染相关的核酸以及捕获分子，其中捕获分子包括特异性针对与病毒感染相关的核酸区域的结合部分，以及锚定基团。
本文使用的术语“捕获分子”，是指任何显示出特异性结合行为和/或特征性反应性的分子，这些性质使其适合于与待检测的核酸形成复合物。典型情况下，使用核酸作为捕获分子。可用作捕获分子的核酸的例子，包括天然存在的核酸例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，以及核酸类似物例如尤其是肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。天然存在的核酸的具体的例子包括DNA序列例如基因组DNA或 cDNA分子，以及RNA序列例如hnRNA，mRNA或rRNA分子，或其反向互补的核酸序列。这样的核酸可以是任何长度的，既可以是单链的也可以是双链的分子。典型情况下，核酸捕获分子是长度为10到150 个核苷酸，例如20到100个核苷酸，25到80个核苷酸或30到70个核苷酸的单链寡核苷酸。在具体的实施方案中，捕获分子可以在PCR 中用作引物，以扩增在给定的流体样品中存在的任何目标靶核酸。
在某些实施方案中，捕获分子包括至少一个特异性序列区域(即上面所指的结合部分)，它和与病毒感染有关的核酸(即靶核酸)的序列区域互补，从而允许捕获分子与被检测的核酸之间的碱基配对。典型情况下，特异性结合区域长度为至少12个核苷酸，例如至少15 个核苷酸、至少18个核苷酸或至少22个核苷酸。具体来说，捕获分子的结合区域的核苷酸序列与靶核酸的相应核苷酸序列互补。本文使用的术语“核苷酸”应被理解为是指核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸(即， RNA和DNA分子)。
在导入待分析的流体样品之前，可以在装置的至少一个反应室的一个或多个中提供捕获分子(例如以冷冻干燥的或干燥的形式)。或者，捕获分子可以与样品一起(即相伴地)或在样品已经导入后导入到装置中。
可以使用一种或多种捕获分子。术语“一种或多种”是指一种或多种不同类型的捕获分子，例如一种或多种具有不同核苷酸序列的核酸分子。相伴使用的一种以上的捕获分子也可以被称为“文库”。这样的文库包含至少两种，但是也可以包含许多种不同的分子，例如至少不同的5种，至少不同的10种，至少不同的30种等。文库也可以以阵列元件或任何其它空间布置的形式存在。
在其他实施方案中，在装置中进行的分析还包括将含有待检测的核酸和捕获分子的复合物与装置的第一结合元件相接触，该第一结合元件被构造为与捕获分子的锚定基团结合，以便将复合物与第一结合元件结合。
本文使用的术语“第一结合元件”是指捕获分子、因此还有含有这些捕获分子的任何复合物，可以经过捕获分子的锚定基团通过共价的或非共价的相互作用连接到其上的任何固体基质。这样的基质的例子包括尤其是阵列元件的基质(参见上文)或合成的粒子，例如磁性珠子(例如顺磁性聚苯乙烯珠子，也被称为)和乳胶珠子。依赖于捕获分子的类型，锚定基团的类型以及目标应用，在每种情况下可能有各种不同的连接。例如，捕获分子的锚定基团可以是生物素基团，它可以与连接到结合元件上的亲和素或链亲和素基团偶联。或者，捕获分子可以含有一段腺苷残基(例如10个腺苷残基)，它将与结合在结合元件上的一段相应的胸苷残基相互作用。具体的偶联试剂可以从不同的供应商商购，在本技术领域是公知的(参见例如Sambrook, J.等，同上；Ausubel,F.M.等，同上；以及Lottspeich,F.和Zorbas H.，同上)。
在导入待分析的流体样品之前，第一结合元件可以被提供在装置的至少一个反应室的一个或多个中。因此，结合元件可以被提供在与捕获分子相同的一个或者多个反应室中，或在至少一个不同的反应室中。典型情况下，形成捕获分子与病毒感染相关核酸的复合物的步骤，与将复合物与第一结合元件相接触的步骤，在空间上分开进行，即在装置的不同反应室中进行(例如在图17中指称的“裂解孔”和“中心孔”)。在这样的实施方案中，捕获分子和第一结合元件通常被提供在不同反应室中。除了在加入样品前在装置中提供第一结合元件之外，第一结合元件也可以与样品一起(即相伴地)或在样品已经导入之后导入到装置中。
在具体实施方案中，方法还包括典型情况下通过将待分析样品进行PCR而扩增的靶核酸相对于第一结合元件捕获(即将靶核酸固定化在第一个捕获元件上)。
在其他具体实施方案中，在装置中进行的分析还包括提供报告分子，该报告分子含有能够与病毒感染相关核酸形成复合物的相互作用位点，以及能够被捕获在装置的第二结合元件上的相互作用位点。
本文使用的术语“报告分子”或“报告化合物”，是指任何能够与待检测的靶核酸和第二结合元件二者相互作用的分子。因此，通过报告分子中包含的共同的或不同的结合区而发生相互作用。一般来说，报告分子是长度为10到100个核苷酸，例如15到50个核苷酸或20 到30个核苷酸的核酸分子(即上面描述的RNA或DNA分子)。通常情况下，报告分子是单链核酸分子(即寡核苷酸)。在某些实施方案中，核酸报告分子含有单一结合区，它不仅能够与靶核酸相互作用，而且能够被捕获在第二结合元件上。典型情况下，相互作用是可逆的。捕获在第二结合元件上的步骤可以通过报告分子中包含的锚定基团来实现，与上面已经描述的捕获分子的情况相同。一般来说，报告分子中包含的特异性结合区域长度为至少12个核苷酸，例如至少15个核苷酸，至少18个核苷酸或至少22个核苷酸。尤其是，报告分子的结合部分的核苷酸序列与靶核酸的相应核苷酸序列互补。
在导入待分析的流体样品之前，报告分子可以被提供(例如以冷冻干燥/干燥的形式)在装置的至少一个反应室的一个或多个中。因此，报告分子可以被提供在与捕获分子和/或第一结合元件相同的一个或者多个反应室中，或在至少一个不同的反应室中。但是，在可选情况下，报告分子也可以与样品一起(即相伴地)或在样品已经导入之后导入到装置中。
在某些实施方案中，报告分子与上述的报告物特异性捕获分子，竞争与病毒感染相关的核酸的结合，即是包含在报告物特异性捕获分子和报告分子中的相应结合区域，识别靶核酸的同样的或至少相似的对应序列。本文中使用的术语“相似的序列”，是指序列之间的差异仅仅是一个或多个单核苷酸误配(即核苷酸的非互补配对)或一个或多个单核苷酸添加、插入或缺失(即附加的或缺少的核苷酸残基)。换句话说，包含在报告物特异性捕获分子和报告分子中的相应结合区域至少是部分同一的。本文中使用的术语“部分同一的”，是指序列之间的差异仅仅是如上所述的一个或多个单核苷酸，或序列具有重叠的结合位点，即序列共有一部分共同的核苷酸序列，但是在序列区域的至少一个其它部分中不同。但是，也有可能包含在竞争的捕获分子和靶核酸中的相应结合区域识别报告分子的不同的、非重叠的(例如相邻的)序列，但是捕获分子或靶核酸与报告分子的结合在空间上干扰另一个分子与报告分子的结合。
用于本发明的典型的报告分子以及用于检测与病毒感染相关的核酸的典型的竞争性分析方法，将在本文中描述。
本文使用的术语“第二结合元件”，可以是指与第一结合元件相同类型的固相基质(即第一和第二结合元件可以是相同的)或不同类型的固相基质。在导入待分析的流体样品之前，第二结合元件可以被提供在本发明使用的装置的至少一个反应室的一个或多个中。因此，第二结合元件可以被提供在与捕获分子和/或第一结合元件和/或报告分子相同的一个或者多个反应室中，或在至少一个不同的反应室中。除了在加入样品前在装置中提供第二结合元件之外，第二结合元件也可以与样品一起(即相伴地)或在样品已经导入之后导入到装置中。
在某些实施方案中，在装置中进行的分析还包括：
-使报告分子从第二结合元件上释放，释放的报告分子与病毒感染相关核酸形成复合物，没有与病毒感染相关核酸复合的报告分子被重新捕获在第二结合元件上；
-测定表明了捕获在第二结合元件上的报告分子的量的一个或多个值，和/或
-根据表明了报告分子的量的值，确定表明了与病毒感染相关的核酸的量的一个或多个值。
从第二结合元件释放报告分子的步骤，可以通过在装置的提供有第二结合元件的一个或多个反应室中增加温度来实现。温度的改变可以通过使用一个或多个如上所述的温度控制和/或温度调节单元来实现。这样的温度增加可以发生在例如在装置中进行的PCR的变性步骤过程中。报告分子与靶核酸之间复合物的形成，和/或没有与靶核酸复合的报告分子在第二结合元件上的重新捕获，可以通过在相应的一个或多个反应室中降低温度来实现，例如在PCR的退火和/或延伸步骤过程中。用于进行PCR扩增的实验设置和温度分布情况，在本技术领域中已很好地建立。因此，在某些实施方案中，与病毒感染相关的核酸被进行进一步扩增，同时使报告分子从第二结合元件上释放，释放的报告分子与病毒感染相关核酸形成复合物，没有与病毒感染相关核酸复合的报告分子被重新捕获在第二结合元件上。
在某些实施方案中，方法还包括在执行实际的检测反应之前，将一种或多种含有一种或多种可检测部分的药剂引入装置的反应室中。也就是说，含有一种或多种可检测部分的药剂，可以在导入样品(即它们可以提供在一个或多个反应室中)之前、与样品同时或在已经导入样品之后，直接或经如上所述的填充单元导入到反应室中。
本文使用的术语“含有一种或多种可检测部分的药剂”，是指任何含有一种或多种适合的化学物质或酶(即一种或多种“部分”)，可以在化学，物理或酶反应中直接或间接产生可检测的化合物或信号的化合物。因此，通过能够与所述靶核酸和/或报告化合物形成相互作用，这样的药剂可能是靶核酸和/或目标报告化合物的检测所必需的，或将有助于它们的检测。在本文中使用时，该术语应该被理解为包括可检测标志物本身(也被称为“标记物”)，以及任何与一种或多种这样的可检测标志物结合的化合物。此外，干扰标记物产生可检测信号的基团(例如只要在淬灭剂与荧光团彼此紧邻时“劫持”荧光团的激发产生的发射的淬灭剂)，也属于可检测标记物。可检测标志物也可以是捕获分子和/或靶核酸和/或报告分子的一部分或被结合到其上，例如以修饰的和/或标记的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸或双脱氧核糖核苷酸的形式。
可以使用的可检测标志物或标记物在上文已经描述，包括荧光标记物。
本文中使用的术语“测定表明与病毒感染有关的核酸的存在和/或量的值”，是指检测/测定允许对给定流体样品中存在的靶核酸进行定性和/或定量测定的参数，例如电导率、氧化还原电势、吸光度、荧光强度或生物发光。可以仅仅测定这些参数中的一个，但是相伴或相继测定一个以上的参数(例如电导率和由适合的标记物引起的荧光信号强度)也是可能的。
在某些实施方案中，方法还包括根据表明与病毒感染相关的核酸的存在和/或总量的值，来确定一个或多个表明了患者中病毒载量的值。本文使用的术语“病毒载量”，是指在给定体积的血液中存在的病毒的量(通常被计算为每ml血液中存在的病毒的拷贝数)。病毒拷贝数尤其可以通过使用本技术领域熟知的适合的计算机软件包(参见上文)，基于给定样品中存在的病毒核酸的总浓度来确定。
检测反应可以在使用的装置的特定反应室(也被称为“检测室”) 中进行，或在被称为“检测区”的反应室的特定区段(例如位于由透明材料制成的反应室的底面和/或顶面的一个或多个部分之间的区域) 中进行。对于定量测量来说，可以使用含有分别具有已知体积的检测室和/或检测区的装置。
表明靶核酸的存在和/或量的值的检测/测定，在分析进行过程中可以只进行一次或进行一次以上。在单次分析过程中进行一次以上检测步骤的情况下，计算获得的结果的平均值。在一个或多个检测循环中获得的数据，可以使用本技术领域的专业人员已知的适合的计算机软件进行分析和数学处理，以便尤其是确定一种或多种靶核酸的存在、长度或序列，和/或计算它/它们的量。
根据另一个示例性实施方案，本发明涉及使用本文定义的方法，在给定的流体样品、特别是全血样品中检测HIV(即只用于确定病毒的存在)，还涉及了使用该方法确定患者的HIV载量(即用于确定存在的病毒的量)。
根据另一个示例性实施方案，本发明涉及使用例如通过本文定义的方法测定的总病毒核酸的量作为诊断标志物。在具体实施方案中，用作诊断标志物的总病毒核酸是HIV核酸。
已经发现，样品的分级或其它处理步骤可能引起假阴性分析结果，因为所有那些存在于样品的“被丢弃”部分中的多核苷酸，都将在进一步分析中被分散。这不仅在需要可靠地检测稀少多核苷酸(即核酸仅以非常低的拷贝数存在)、以便例如在早期阶段证明病原状态的发生的应用中特别重要，而且在任何旨在精确地定量测定样品中存在的一种或多种多核苷酸，以例如使用该数据作为标志物评估疾病状态和/ 或进展的应用中，也是特别重要的。
例如，在感染宿主后，病毒可以立即进行复制，导致了不断发展的病毒释放，从而引起病毒繁殖和传播。此外或任选地，至少某些类型的病毒在繁殖之前可能经历潜伏(即静止)状态，例如以整合在宿主细胞基因组中的前病毒的形式。因此，为了确定患者是否被特定病毒感染，方法可以包括不仅检测源自于活跃复制的病毒粒子的核酸，而且检测作为靶细胞自身的固有部分的前病毒的核酸。此外，病毒可以作为游离粒子存在，或结合到被用作“运输载体”的细胞的表面上。可以相伴作为游离粒子和/或黏附于宿主细胞的粒子和/或前病毒而存在于被感染患者中的病毒的一个临床重要的例子，是人类免疫缺陷病毒(HIV)。
正如上面已经指出的，病毒的生命周期可以是高度多样性的。典型情况下，在感染后，病毒在宿主细胞中复制，在新的病毒粒子装配后，子代从宿主细胞释放。但是，某些病毒在感染宿主后不是立即复制，而是将它们的遗传信息以潜伏的前病毒的形式整合到宿主细胞基因组中。此外，病毒可以在宿主中只以在例如血流中循环的游离病毒粒子的形式传播。其它病毒不仅作为游离病毒粒子出现，而且还以与细胞结合的病毒的形式出现，它们保持黏附于例如血细胞上，使用它们作为运输载体。值得注意的是，这些多种多样的病毒库，在宿主中也可以表现出不同的生命期(体内半衰期)，也就是说，它们可以在不同的时间期间检测到(也参见图35)。例如，在HIV感染的情况下，已经显示在血浆中循环的游离病毒的平均生命期为0.3天(即体内半衰期为0.24天)，而被感染的细胞(例如带有HIV前病毒的白细胞)的平均生命期为2.2天(即体内半衰期为1.6天)(参见例如Perelson,A.S. 等，(1996)Science 271,1582-1586)。
因此，使用包含了所有病毒生命周期的不同状态并以高的灵敏度检测在给定宿主中可能存在的所有不同(空间受限的)病毒库的措施，适合于在受感染患者中可靠地检测特定病毒和/或精确地测定病毒载量。这在只具有相当低的病毒载量(例如低5000个病毒拷贝/ml血浆，或低于2000个病毒拷贝/ml血浆)的患者中可能是特别重要的，在这样的患者中即使病毒拷贝数的少量变化也可以表明重新感染的发生或抗病毒疗法的相关效能。
已经发现，总病毒核酸的量、特别是从患者获得的未处理样品中总病毒核酸的量，代表了这样的措施，因此它可以代表用于诊断病毒感染的优异的临床标志物。
例如，在患者已经被HIV感染的情况下，在从该患者获得的全血样品中可能存在的与HIV感染相关的核酸，包括源自于游离HIV(即在血浆中自由循环的病毒粒子)的RNA分子，源自于与细胞相关HIV (即黏附于任何类型血细胞上的病毒粒子)的RNA分子，整合到宿主基因组中的前病毒HIV DNA分子，反转录的HIV DNA分子，以及源自于前病毒DNA的HIV转录本。但是，从同样患者获得的血浆样品只含有源自于游离HIV的RNA分子，因为所有其它HIV核酸物质都与已经被移除的患者的血细胞相关。因此，显然，源自于全血样品的总 HIV核酸的量，与源自于血浆样品的总HIV核酸量相比，代表了HIV 的更真实的诊断标志(也参见图35)。
用作标志物的总HIV核酸的量可以表明用于HIV的检测、患者中 HIV载量的测定、感染HIV的患者中疾病进展的监测和/或感染HIV的患者的抗病毒治疗效率的监测。总HIV核酸的量可以包括源自于游离的和与细胞相关的病毒的核酸，它们反过来可以包括源自于游离病毒的RNA、源自于与细胞相关的病毒的RNA、前病毒DNA、反转录的病毒DNA以及转录的前病毒RNA。
参考图1a，用于测定分子靶的方法100包含了裂解步骤102(用于在存在带有锚定基团的捕获分子的情况下裂解样品，例如全血)，复合物形成步骤110(用于形成HIV核酸和带有锚定基团的捕获探针的复合物，例如杂交)，捕获步骤114(用于通过锚定基团将复合物捕获在固相基质上)，清洗步骤118(用于除去所有未结合的物质，例如核酸，蛋白，低分子量污染物等)，扩增步骤120(用于扩增和标记捕获的核酸)和检测步骤126(用于检测扩增子)。按照方法100，多核苷酸从样品的一种或多种靶病原体中释放。被释放的与靶病原体有关的多核苷酸被捕获在表面上。将被捕获的多核苷酸与样品中的相伴物质(例如扩增抑制剂)分离开来。分离出的捕获的多核苷酸被扩增以形成扩增子。通过检测扩增子确定多核苷酸的存在。因为扩增的多核苷酸与靶病原体有关，一种或多种靶病原体的存在和/或身份可以被确定(例如定性地和/或定量地)。在示例性的实施方案中，方法100包括了根据血液样品中存在的一种或多种病毒的测定来测定病毒载量。下面，将讨论方法100的各个不同的步骤。
在裂解步骤102中，多核苷酸106从血液样品104中存在的病原体中释放。可以按照所需方法将多核苷酸从靶病原体中释放(例如热的，化学的，机械的方法，或通过它们的组合)。在示例性实施方案中，通过将样品104与含有裂解样品中的病原体的物质的裂解液体相组合来释放多核苷酸。能够裂解病原体的液体的例子可以在Boom R., Sol C.J.,Salimans M.M.,Jansen C.L.,Wertheim-van Dillen P.M.,van der Noordaa J.,RapidAnd Simple Method For Purification Of Nucleic Acids,(用于纯化核酸的快速和简单的方法)J.Clin.Microbiol.1990 Mar；28(3):495-503,中发现，在此引为参考。
示例性的裂解液体含有一种或多种变性剂(例如硫氰酸胍 (GuSCN)(例如基本上4.57M))，pH缓冲剂(例如Tris-HCl(例如pH 6.4，45mM)，螯合剂(例如EDTA 20mM)，以及去污剂(例如Triton X-100，1.2％(w/v)和/或皂苷(例如0.2％))，盐(例如 MgCl2(例如75mM)和/或ZnCl2(例如1mM))。
裂解步骤102典型情况下包括形成含有被释放的多核苷酸106，样品104的伴随物(例如细胞成分，扩增抑制剂，蛋白和其它物质) 以及捕获分子108i的混合物。每个捕获分子108i含有多核苷酸结合部分109i和生物素锚定基团111。每个多核苷酸结合部分109i是与多核苷酸106的不同区域互补的(例如特异性针对它的)多核苷酸序列。例如，捕获分子108a含有与多核苷酸106的靶区域113互补的结合部分109a，捕获分子108b含有与多核苷酸106的不同的靶区域115互补的结合部分109b。典型情况下，对于每个被测定的多核苷酸，使用至少一种(例如两种或以上，三种或以上，四种或以上)不同的捕获分子。
在某些实施方案中，多核苷酸106在存在捕获分子108i的情况下从靶病原体中释放。这可以通过例如将样品104基本上同时与捕获分子108i和裂解液体成分进行组合来完成。样品104可以与捕获分子108i 组合，裂解液体成分可以与捕获分子108i组合，裂解液体成分在液体状态或干燥(例如冷冻干燥)状态下。
在可选的实施方案中，多核苷酸从样品104的病原体中释放，获得的混合物与捕获分子108i组合。例如，可以将样品104和除了捕获分子108i之外的裂解液体成分组合，并允许温育一段时间，然后再将温育过的混合物与捕获分子108i组合。
在示例性的实施方案中，多核苷酸106是HIV-RNA，捕获分子108i 的结合部分109i与其区域互补。
现在转到复合物形成步骤110，将一种或多种捕获分子108i与多核苷酸106组合(例如与其杂交)，以形成复合物112。复合物形成步骤110可以通过例如允许被释放的多核苷酸106在存在捕获分子108i 的情况下温育一段足以形成复合物112的时间来进行。在某些实施方案中，温育时间为至少大约60秒(例如至少大约120秒，至少大约360 秒)。在某些实施方案中，温育时间为大约600秒或以下(例如大约 480秒或以下，大约420秒或以下)。在示例性的实施方案中，温育时间是大约5分钟。
对于每个被测定的多核苷酸来说，捕获分子108i的总浓度典型情况下足以捕获复合物112中的大部分(例如至少60％，至少75％，至少90％，基本上全部)多核苷酸。在某些实施方案中，一种或多种(例如大部分或全部)捕获分子108i的每种的浓度是至少大约0.1μM(例如至少大约0.25μM，至少大约0.5μM)。一种或多种(例如大部分或全部)捕获分子的每种中的浓度，在典型情况下是大约2μM或以下(例如大约1.5μM或以下，大约1μM或以下)。在示例性的实施方案中，一种或多种(例如大部分或全部)捕获分子的每种的浓度是大约0.625μM。
转到捕获步骤114，将复合物112和捕获粒子117组合以形成复合物119。每个捕获复合物119含有一个或多个复合物112和捕获粒子 117。复合物112典型情况下非选择性地结合到粒子117上。每个捕获粒子117含有链亲和素捕获表面116。捕获粒子117通过捕获分子108i 的一个或多个生物素锚定基团111与链亲和素捕获表面116之间的相互作用捕获每个复合物112。示例性的捕获粒子117包括直径为大约 34μM的链亲和素琼脂糖珠子(Amersham)，该珠子用diH2O预先清洗以除去乙醇。每次分析使用大约10000到20000颗珠子，相当于每 10μl全血大约3nmol生物素的结合能力。
典型情况下，捕获步骤114在将样品104与多核苷酸106和捕获分子108i温育一段足以形成复合物112的时间后开始。例如，样品104 可以在存在裂解液体和捕获分子108i的情况下温育，然后将获得的混合物与捕获粒子117组合。
典型情况下，捕获分子108i和粒子117的总浓度，足以定量捕获与样品104中的一种或多种靶病原体中的每种有关的一种或多种选定的多核苷酸106中的每种。因此，对于每种被测定的多核苷酸106来说，基本上所有(例如至少75％，至少90％，至少95％，至少97.5％或基本上所有)的多核苷酸被捕获分子108i和粒子117捕获。
转向清洗步骤118，将捕获复合物119与没有被粒子117捕获的相伴的物质(例如核酸，蛋白，细胞成分，裂解试剂等)分离开。在某些实施方案中，使用具有小得足以阻止复合物119通过，但大得足以允许没有被粒子117捕获的物质通过的孔径的过滤器，对捕获复合物119进行过滤。
捕获复合物119可以用清洗液体清洗，以增加与相伴的物质的分离。在某些实施方案中，使用了两种或以上不同的清洗液体。在某些实施方案中，第一清洗液体含有去污剂以除去通过疏水相互作用粘附到粒子上的低分子量物质，蛋白和其它细胞成分，第二清洗液体用于除去去污剂，否则可能干扰随后的扩增过程。示例性的第一清洗液体包含0.15MLiCl，0.1％SDS(因为SDS是PCR抑制剂，它可以在PCR 步骤前被除去)，10mM Tris-HCl pH8.0和1mM EDTA。示例性的第二清洗液体包含0.15M LiCl，10mM Tris-HCl pH 8.0，1mMEDTA。适合的清洗液体被描述在例如美国专利公开No.20040215011A1中。
转向扩增步骤120，使用探针122对多核苷酸106进行扩增。典型情况下，扩增是PCR扩增。在示例性的实施方案中，多核苷酸106 是RNA，扩增是RT-PCR。在某些实施方案中，病原体是HIV。
参考图1d，在某些实施方案中，扩增步骤120产生了扩增子130。在杂交条件(例如温度)下，扩增子130被固定在粒子117的链亲和素表面116上的捕获探针分子108a，108b和108c捕获。将扩增子用荧光标记试剂125标记，该试剂中含有光学标记物124(例如荧光标记物) 和与扩增子130的区域互补的多核苷酸部分129。
参考图1e，在可选的实施方案中，每个探针122包含光学标记物 124(例如荧光标记物)。其它的探针108j包含与扩增子130的区域互补的多核苷酸部分109j，并且还带有生物素锚定基团111。将探针分子 108j捕获到粒子117的链亲和素表面116上。扩增步骤124产生了直接标记的扩增子130，每个扩增子含有标记物124。将扩增子130用固定在粒子117的链亲和素表面116上的探针分子108j捕获。探针108j 的结合部分109j可以与用于捕获步骤114的探针108i的相同或不同。探针108j和/或珠子117可以与多核苷酸106以及其它用于进行扩增步骤120的成分混合。
在检测步骤126中，扩增子130被检测(例如通过标记物111的荧光检测)。检测步骤126可以用捕获在粒子117的链亲和素表面116 上的扩增子130来进行。可以进行检测步骤126，而不用首先将扩增子与不含探针122的液体组合。例如，可以使用在减小了表面的距离后在第一和第二表面之间存在的捕获的扩增子130来进行检测步骤126。这种用于进行检测步骤126的方法的实施方案接下来参考图1b和图1c 进行讨论。
参考图1b和图1c，用于进行方法100的至少检测步骤126的系统 200，含有微流体盒202，检测系统210，型板致动器212，以及与检测系统210和致动器212相连的处理器218。
盒202包含了第一基体206和第二基体208，它们一起限定了检测室204。第一基体206典型情况下对于用于激发和检测来自扩增子 130的标记物124的荧光的光的波长来说是透光的(例如透明的)。第一基体206可以由例如聚合物，玻璃或硅石形成。第二基体208由可弯曲的或弹性的材料(例如弹性聚合物)形成。第一基体206一般不如第二基体208弹性。
致动器212含有型板214和被成形用于驱动型板朝向和远离第二基体208的型板驱动器236。型板致动器236可以由例如压缩空气，电磁铁，压电式装置或其它适合的致动装置致动。如图1c中所示，当被致动朝向第二基体208的壁238时，型板214减少了第一基体206的内壁232与第二基体208的内壁234之间的距离“d”。在图1c的减少的距离状态下，至少某些带有被捕获的扩增子130的捕获粒子117保留在表面232和234之间。相反，大部分围绕着粒子117的液体从表面232和234之间被移走。
检测系统210被构造为在图1c的减少的距离状态下检测盒202中扩增子130的存在。检测系统210包含光源246(例如激光器)，成像检测器240以及光学系统242。在使用中，光源246照亮存在于基体 206和208的内表面232和234之间的物质。从扩增子130的标记物124发射的荧光250被检测。被检测到的荧光250指示扩增子130的存在。处理器218接收来自检测系统210的指示了被检测的荧光的信号。处理器218可以测定扩增子130的存在，因此也能够测定样品104中相应病原体的存在。
一般来说，保留在内表面232和234之间的液体发射出与扩增子 130的存在无关的背景荧光252。背景荧光252的强度通常与保留在内表面232和234之间的液体的量成比例。但是，来自扩增子130的标记物124的标记物荧光250的强度，在空间上位于粒子117的附近。成像检测器240接收和检测标记物荧光250和背景荧光252。但是，因为在图1c的减少的距离状态下液体从内表面232和234之间被移走，因此与图1b的未减少的状态下相比，标记物荧光252相对于背景荧光 250的信噪比较高。
方法100的示例性实施方案可以如下进行。从个体获得大约5到 10μl的毛细血管血液(例如指尖，耳垂)。将血样与大约90μl含有裂解成分和捕获分子108i的裂解缓冲液组合。将得到的混合物在21℃搅拌温育大约5分钟。将温育过的混合物与对应于3nmol生物素结合能力的相当于大约10μl浆液的量的粒子117(即作为在20％乙醇中的粒子浆液购买的粒子)组合。将含有粒子的混合物在21℃搅拌温育大约 5分钟。温育后，通过用型板致动器系统350操作盒300来除去上清液。将粒子用第一清洗缓冲液清洗(例如每次用50μl体积清洗，共3次)，然后用第二清洗缓冲液清洗(例如每次用50μl体积清洗，共3次)。清洗后，除去上清液。将清洗过的粒子与扩增介质组合，并进行 qRT-PCR扩增，以检测(例如定量)被捕获的多核苷酸106。
参考图14，检测了来自扩增子130的荧光(例如，使用仪器的减少的距离模式，例如图1b和图1c中显示的)。扩增子130可以在扩增的多个不同加热和冷却循环的每个循环之后进行检测。通过这种方式，可以及时跟踪扩增子浓度的增加。典型情况下，扩增子在结合到粒子 117上时被检测到。
尽管在描述方法100时包含了从病原体释放多核苷酸的步骤，但方法100可以包含其它用于提供多核苷酸的步骤。在某些实施方案中，多核苷酸从非病原性细胞(例如植物，人类，动物等)释放。在某些实施方案中，多核苷酸是基因表达分析的产物。在某些实施方案中，多核苷酸的提供不需要释放步骤，和/或提供为已经从细胞或其它生物学样品中释放出来的多核苷酸。
接下来，将讨论典型情况下能够进行方法100的大多数(例如所有)步骤的分析系统和微流体盒的实施方案。
参考图2，微流体盒300含有第一基体301，第二基体303和微流体网路305。第一和第二基体301和303可以具有与对盒202的基体 206和208所描述的相似的性质。
微流体网路305被构造为接受样品和各种不同的试剂材料，允许对这些材料进行操作(例如混合，运输和温育)，以便于表明一种或多种靶病原体的存在的扩增子的检测。
微流体网路305包含了样品入口302，它通过通道304与裂解室 306相连，裂解室通过通道308和接头307与检测室332相连；第一液体入口310通过通道312与第一试剂室314相连，该第一试剂室通过通道316与接头307相连；第二液体入口318通过通道319与第二试剂室320相连，该第二试剂室通过通道322与接头307相连；第三液体入口324通过通道326与扩增标记试剂室328相连，该扩增标记试剂室通过通道330与接头307相连。接头307通过废物通道336与废物室334相连。检测室332通过废物通道340与废物室334相连，废物通道含有过滤器，其大小可以阻止粒子317通过，但是允许在方法 100的清洗步骤118中描述的未捕获的物质通过。
典型情况下，试剂室306，314，320，328含有用于进行方法100 所述的步骤的冷冻干燥的试剂(例如作为丸粒)。在使用中，液体(例如水，缓冲液，水性溶剂或其它液体)被导入到相应室的入口中。液体使冷冻干燥的试剂溶解，形成了液体。在示例性的实施方案中，裂解室306含有促进靶病原体的裂解的冷冻干燥的试剂和对应于病原体的多核苷酸的捕获分子308i。典型情况下，反应室306的冷冻干燥的试剂用样品(例如全血样品)单独溶解，或与加入的液体组合起来溶解。在示例性实施方案中，室314含有冷冻干燥的试剂，当与导入到入口310的液体组合时形成了清洗液体(例如第一清洗液体(缓冲液))。示例性实施方案中，室320含有冷冻干燥的试剂，当与导入到入口318 的液体组合时形成了清洗液体(例如第二清洗液体(缓冲液))。在示例性实施方案中，室328含有冷冻干燥的试剂，当与导入到入口324 的液体组合时形成了扩增混合物(例如第二清洗液体(缓冲液))。
典型情况下，在使用装置300之前，粒子116被放置在室306的网路305的下游中。例如，在使用前粒子116可以放置在检测室332 中。粒子116可以通过下面讨论的型板的适合的致动，用来自室306， 314，320，328的液体清洗。
参考图3，显示了微流体盒300以及用于操作盒300的型板致动系统350。致动器系统300含有致动器基部352和多个型板354i。每个型板354i用与型板驱动器236相似的相应的型板驱动器来致动。在使用中，盒300随着弹性基体303定位，面对着致动器基部352和型板 354i。每个型板354i在空间上对应于微流体网路305的不同位置。例如，型板354d对应于废物通道336。当致动时，型板354d压迫覆盖在通道336上的基体303，从而阻塞了通道336，并阻止流体沿着它们通过。
因此，第二基体303或覆盖元件的弹性性质，确保了当型板施加机械力在弹性的第二基体303的指定部分上时，它可以可逆的方式变形。换句话说，如果需要可逆的阀作用，第二基体303的变形是可逆的，使得当型板354i施加的力量被除去时，第二基体303返回到其初始的位置，使得流体可以再次沿着相应的通道336通过。
与此相反，第一基体301的刚性性质是指第一基体301的材料被构造为使得一旦通过型板354i施加力到第一基体301上，第一基体301 不会发生对阀的功能有影响的变形。因此，第二基体303提供了弹性，而第一基体301提供了稳定性。
其它型板类似地对应于网路305的其它通道。型板354a和354c 分别对应于废物通道340和接头307。型板354a和354c的致动封闭了检测室332，允许进行多个加热和冷却的循环而不显著损失其中的液体。过滤器341允许用来自室306，314，320和328的液体清洗室332中的粒子116而不损失粒子。还有其它的型板，分别对应于室306，314， 320，328和332。这些型板的重复致动可用于搅拌室中的物质(例如液体)，以便于混合(例如样品和试剂的混合)。沿着通道顺序地致动型板可用于沿着通道移动液体。可以通过例如致动相应的型板操作室的上游，下游和上方，来清空室中的内含物。
在一个实施方案中，基体是足够可逆的，使得在重复的型板致动和移除后(例如至少10次，或至少50次)，基体返回到其原始位置，使得微流体网路位于特定型板下的部分可以被重复地阻塞和重新打开。
盒300可以如下操作。将一定量(例如大约5-10μl之间)的样品 (例如全血)和任选量(例如大约5到50μl之间)的液体(例如水) 通过入口302导入到室306的网路305中。将一定量(例如大约20到 200μl之间)的液体通过相应的入口导入到室314，320和328中。分别导入的样品和任选的液体使室306，314，320和328中存在的冷冻干燥试剂复溶。对应于每个室的型板被致动，搅拌其中的液体试剂混合物，以促进混合。在裂解室306中，裂解缓冲液从病原体释放多核苷酸106(例如像在裂解步骤102中那样)。将释放的多核苷酸与捕获分子108i组合以形成复合物112(例如像在复合物形成步骤110中那样)。
将室306中的裂解混合物移到检测室332中，并与粒子116混合和温育，形成了捕获复合物119(例如，像在捕获步骤114中那样)。室332中的混合物可以例如使用型板进行搅拌。在捕获步骤114温育结束时，使用操作盒300的型板致动系统350将液体/上清液从检测室 332移除到废物室334中。
在从废物室332除去液体/上清液后，将清洗液体从室314和320 通过室332移动，以便将复合物119与相伴的物质分离开(例如，像在清洗步骤118中那样)。在清洗过程中可以通过型板354b对室332 进行搅拌。
在室332中将相伴物质与复合物119分离后，将扩增试剂从室328 移动到检测室332，对得到的内含物进行多次PCR循环(例如，像在扩增步骤120中那样)。
在一个或多个扩增循环的每个循环后，致动型板354b以减小检测室332的相对的内表面之间的距离。复合物119，如果存在的话，保持捕获在内表面之间，而其他内含物则相对被除去，如同在图1c中对于装置200讨论的那样。检测一般使用荧光检测系统进行(例如像对装置200描述的那样)。典型情况下，对复合物112的扩增子130进行检测，扩增子处于杂交状态并结合到粒子117，类似于复合物119(例如，像在检测步骤126中那样)。在每个循环之后，扩增子130的群体数量增加。从捕获复合物119产生的荧光强度也随之增加。可以监测荧光强度随着循环数的增加，以确定可以对扩增子130进行定量的阈值循环。因为多核苷酸106的捕获是定量进行的(例如，像在捕获步骤114中那样)，因此扩增子130的定量检测允许对样品中存在的多核苷酸106的量进行定量测定。因此，在例如病原体是病毒(例如 HIV)的情况下，样品(例如全血)中的病毒载量可以被测定。
盒300还可以包括含有多个固定化的多核苷酸的阵列，每个多核苷酸对应于不同病原体亚型的多核苷酸序列。在检测步骤126之后，进行扩增子130的杂交以确定病原体亚型。在示例性的实施方案中，阵列含有被构造为以确定HIV的亚型的多核苷酸。
尽管描述的盒300的操作包含了添加液体试剂，但液体试剂也可以储存在盒上，例如在透明包装(blister pack)中，并在使用时释放。
适合于光学测定标记物124的存在的系统的其它例子被描述在下列每个申请中：2005年5月6日提交的国际专利申请 PCT/EP2005/004923的美国连续申请，该国际专利申请指定美国并要求了2004年5月6日提交的德国专利申请DE 10 2004 022 263的优先权，以及2006年11月6日提交的专利申请号No.US 11/593,021的美国连续申请。
接下来，参考图4到图16，将对按照示例性实施方案的分析过程中的各种不同步骤进行解释。
图4图示了裂解。
图5到图10图示了RNA复合物在固相基质上的捕获。
图11图示了清洗。
图12和图13图示了扩增。
图14到图16图示了检测。
图17a图示了示例性的系统400，用于执行至少从样品捕获靶，扩增靶和检测一个或多个表明样品中靶的存在的值的步骤。
图17b图示了示例性的系统400，用于执行至少从样品捕获靶，扩增靶和在操作状态下检测一个或多个表明样品中靶的存在的值的步骤。
图17c图示了在图17a和17b中描绘的阀单元435的示例性实施方案。
图17d图示了在图17c中描绘的阀2的示例性实施方案。
参考图17a和b，示例性的系统400包含了微流体盒401，检测系统455，用于加热和/或冷却至少一部分盒的系统451，致动器元件 441-444和致动器437-440，阀单元435，压缩机431，液体储存器461 和处理器471。
盒401包含了基体402和第一覆盖元件403，它们共同限定了第一和第二孔408和407。第一覆盖元件403是至少部分弹性的，允许覆盖元件被可逆地压向基体402。盒还含有第二覆盖元件，与基体402一起限定了通道410，411和412。在某些实施方案中，第二覆盖元件也是至少部分弹性的。通道和孔通过洞413，414，415，416相互连通，以形成微流体网路。
在各种不同的实施方案中，基体402可以是由任何适合的材料，例如塑料，玻璃，金属或半导体制成的物理体。它可以是任何基本上平面的(即二维的)或非平面的(即三维的)表面。这样的三维物体的例子是具有腔或洞的物理体，包括含有流体通路(例如通道)的反应室(其中可以发生生物，化学或生物化学反应)。
第一孔408，也可以被称为裂解孔，适于容纳流体，并用于释放细胞，孢子或病毒的内含物，内含物中含有通过系统400分析的靶分子。例如，第一孔408可以适于通过包含上述的裂解试剂409来释放细胞，孢子或病毒的内含物。裂解试剂409可以以干燥的形式提供。
第二孔407也可以被称为中心孔，适于容纳流体，并含有粒子406 作为第一结合元件，粒子适于捕获与捕获分子复合的靶，并任选地含有第二结合元件417，适于捕获报告分子。第二孔407还含有过滤元件 405，以阻止粒子406通过，但允许气体，液体和溶解在液体中的物质通过。孔407和408经过洞415和414通过通道411相互连通。
更通常来说，第一或第二孔408，407可以是任何结构，即任何可以用作载体以接受样品或物质的物理实体。特别是，这样的结构可以包含凹陷例如沟槽，孔或通道，或者也可以包括其中可以容纳物质，并通过它可以移动物质的材料，例如凝胶。
在各种不同的实施方案中，结合元件含有被成形成结合具有特定构型的分子的部件。这样的结合元件可以是也可以不是固定在表面上的分子。结合能力也可以直接来自于表面构型(例如多孔的表面结构)。将结合元件提供作或提供在三维元件例如珠子或多孔支持物上，也是可能的。然后这样的三维元件的表面，或结合到三维元件例如粒子的表面上的分子，可以用作结合元件。对不同分子敏感的不同结合元件，也可以布置(例如以类似矩阵的方式)在结构的表面上。结合元件的例子在上面与本文公开的各种不同方法一起进行了描述。
裂解孔408和中心孔407的体积可以是100μl。在示例性实施方案中，通道410-412的宽度是200μm，通道410-412的高度是100μm。
在各种不同的实施方案中，这样的微流体网路可以包含一个或多个通道和/或孔，它们可以彼此相互连通。例如，这样的微流体网路的各种不同通道可以是分叉的或分支的，从而允许沿着预定的路径通过微流体网路运输液体(未显示)。
系统400还可以包含致动器系统，它含有由气动致动器437，438， 439，440驱动的致动器元件441，442，443和444，以及阀单元435，压缩机431和压缩空气储存器433。压缩机431可以经常调整压缩空气储存器433中的预定压力。
每个致动器元件441，442，443，444由相应的致动器致动。在使用中，盒401用至少部分弹性的覆盖元件403定位到面对致动器和致动器元件。每个致动器元件在空间上对应于盒401的微流体网路的不同位置。例如，致动器元件442对应于洞414，它经过通道411和洞415通向孔407。当致动时，致动器元件442压缩覆盖在洞414上的至少部分弹性的盖子403，从而阻塞了洞414，防止流体沿着它通过。其它致动器元件类似对应于其它结构。例如，致动器元件443和444分别对应于洞415和416。致动器元件415和416的致动密封了第二孔 407，允许例如进行多个加热和冷却循环，而不明显损失其中的液体。
对于致动器元件442的示例性的致动来说，控制单元发送信号到阀单元。阀单元打开通向致动器438的气动接头436，从而对致动器 438施加压力。因此，致动器元件442移动出来，压缩覆盖着洞414的至少部分弹性的盖子403。为了释放致动器元件，控制单元发送相应的信号到阀单元。阀单元关闭通向致动器438的气动接头，从而将致动器元件442移动回来，释放了覆盖着洞414的至少部分弹性的盖子403。
致动器元件可以适于使第一弹性的盖子403弹性变形，以执行各种不同的任务。例如，如上所述，致动器元件442适于压缩覆盖着洞 414的至少部分弹性的盖子403，从而阻塞洞414，并阻止流体沿着它流过，而致动器元件441适于通过重复地压住和释放覆盖着孔408的第一弹性盖子来将液体在孔408中移动。
在一个实施方案中，致动器元件可以是能够通过机械力选择性打开或关闭微流体网路的每个单独的结构的元件。例如，这样的致动器元件可以是销针或型板，它们可以压向弹性的覆盖元件，将后者压到基体的表面上，从而选择性地打开或关闭通道。
在某些实施方案中，致动器元件441，442，443和444的尖端由弹性材料制成，例如硅酮，树胶等。致动器元件442，443和444的直径可以是洞414，415和416的直径的1.5倍。洞414，415和416的典型的直径是0,5mm。
如上所述，提供了与致动器437-440相连的气动阀单元435。阀单元435从控制单元471接收驱动信号。因此，控制单元471控制致动器元件441-444的操作。
提供了控制单元471例如微处理器，适于控制流体样品的分析，使得流体样品的靶分子被捕获在结合元件406上。控制单元471还控制中心孔407中的靶分子的扩增。此外，控制单元471控制表明靶分子的存在和/或量，并捕获在结合元件417上的化合物的检测。在靶分子分析的过程中，所有固相结合过程发生在中心孔407的结合元件406 上。特别是，没有固相结合过程发生在裂解孔408中。
在实施方案中，控制单元可以是能够控制装置的一种或多种其它部件的功能，并且能够具体协调每个部件的功能的电子部件。在控制单元中，编码或算法可以被储存或被用户定义在软件，硬件，或混合形式(即包括软件和硬件部件)中，使得能够进行特定的分析，实验或测定。具体来说，这样的控制单元可以包含具有处理能力(任选地还具有储存能力)并被构造为以执行特定的实验方案的处理器。具体来说，这样的控制单元可以是微处理器或CPU(中央处理器)。
中心孔407中流体的温度可以被温度操纵单元操纵，温度操纵单元含有气动冷却器453，温度传感器(未显示)，以及布置在基体402 的上表面附近的加热和/或冷却板451和具有中央凹陷459的第二环形加热和/或冷却板451以允许中心孔407中的分子的光学检测。在某些实施方案中，加热和/或冷却板包含了用于调整加热板和/或第二孔的温度的温度传感器。控制单元471可以控制板451的温度分布，从而操作中心结构407中液体的温度(例如在分析过程中按照温度顺序执行聚合酶链反应，以扩增靶分子)。具体来说，温度操纵单元451具有将位于中心孔407中的液体的温度升高到高达95℃的能力。
加热/冷却元件或板451可以弹性地装配。弹性装配可以是整个加热/冷却元件的弹性装配。支撑加热/冷却元件451的框架可以与例如承载结构铰接，使得铰接可以允许整个加热/冷却元件451弹性定位。
可选地或此外，弹性装配也可以是加热/冷却元件451自身的弹性。这可以通过例如弹性层来实现，其中弹性层包含加热/冷却源/排水管。在弹性层后方可以提供任何类型的致动器，用于致动加热/冷却元件层。这样的致动器可以是例如可膨胀的气枕。但是，弹性层也可以在背侧提供有回弹元件，使得当被压向结构时能够弹性匹配。
因此，通过弹性装配至少一个加热/冷却元件，可以执行有效的温度转变，因为弹性的加热/冷却元件451可以弹性适合于结构或探针装置。
加热/冷却元件451可以是组合弹性的完整加热/冷却元件451，也可以是本身弹性的加热/冷却元件451。
事实上，还可以弹性装配两个加热/冷却元件451。这两个加热/冷却元件可以蝶式布置夹在探测装置之间。以相同的方式，单个加热/冷却元件451可以被布置成带有反压板。这可以避免当插入探测装置时任何的刮擦，尤其是当在探测装置达到其最终的位置后，加热/冷却元件451向探测装置的表面移动时。
在基体402和覆盖元件404之间，提供了流体界面418，以允许通过通道410和洞413将液体例如水或缓冲液或气体例如空气插入到微流体系统中。还可以提供另一个界面482，允许将样品481插入到微流体系统中。
在某些实施方案中，基体402至少部分是透光的，从而允许对中心孔407中的成分进行基于光辐照的检测，这将在下面解释。
含有光源(未显示)例如激光二极管的检测系统455适于产生电磁辐射光束，通过第二加热元件451中的凹陷459入射中心室407。在该室407中存在荧光标记的情况下，产生了次级电磁光束，可以通过第二加热元件451中的凹陷459传播，并可以被检测系统455中的检测器(未显示)例如发光二极管检测。检测系统455的表明靶分子的浓度的检测信号可以通过控制单元界面456提供给控制单元471，用于进一步处理。因此，正如可以从图17中看到的，控制单元471也协调检测系统455的功能。
在某些实施方案中，在检测过程中，检测致动器457压缩中心孔，以减小弹性的覆盖元件403与404之间或弹性的覆盖元件403和404 与基体402之间的距离，从而从检测区中排出含有没有结合到结合元件406或417之一上的物质的液体。
提供了液体供给461，以将液体例如水或缓冲液泵过由孔408和 407，贯穿孔413，414，415，416和通道410，411和412形成的微流体网路。
液体通过装置400的运输也可以通过用负压(未显示)吸吮液体来进行。
可以提供光学传感器464，用于按照下面的示例性解释控制室408 中的液位。如果孔408用来自液体供给461的液体进行填充，控制单元471通过界面446发送相应的信号到阀单元435。阀单元通过气动接头463打开阀，将压力施加在液体供给461上，从而将液体从液体供给461通过液体接头462，通道410和洞413压入孔408。
当光学传感器464检测到表明孔408中液体的存在的信号时，传感器发送信号通过界面465到达控制单元471。然后控制单元471发送信号到阀单元435。阀单元关闭阀，从而停止了液体供给461上的压力，进而停止了孔408外部的液体的移动。
也可以提供其它的光学传感器，以控制其它结构例如通道(410， 411和412，传感器未显示)或孔(407，传感器未显示)中的液位。
在各种不同的实施方案中，样品481可以包含任何固体，液体或气态物质或其组合。例如，物质可以是液体或悬浮液，更具体来说是生物学物质(例如血液，特别是全血)。这样的物质可以包括蛋白，多肽，核酸，脂类，碳水化合物，病毒，细菌等。在实施方案中，样品是可能含有靶的物质的组合物。
正如可以从图17看出的那样，控制单元471还通过界面447控制泵431。可以提供压缩空气储存器433，以将泵抽过程与气动冷却器453 的致动器437-440的性能和检测致动器457相协调。
系统400还包含用户界面单元472，它也可以被称为输入/输出装置。通过用户界面单元472，用户可以定义系统400所运行的实验。换句话说，用户界面472可以使用户对系统400进行编程，以便执行具体的分析。这样的用户界面472可以包含具有显示单元例如LCD，等离子体装置或阴极射线管的图形用户界面(GUI)。此外，在用户界面 472上可以提供输入元件，例如键盘，操纵杆，按钮，轨迹球或甚至声音识别系统的麦克风。用户界面472与控制单元通过数据连线连接。
参考图17c和d，在某些实施方案中，阀单元435含有多个(n) 单阀(2)。每个阀由含有通道(2.3)的转子(2.1)和定子(2.2)构成，二者用4条弹簧连续安装和固定，以施加恒定的压力。每个阀有4 个洞(a，b，c，d)，a与通气设备相连，b与压缩机相连，c与气动致动器相连，d与致动器的通气位点相连。
载体(3)与放置在管内部的球形螺钉相连。管(6)中的导槽使得载体可以移动。驱动轴(5)的旋转移动将导致球形螺钉和相连的载体在X轴方向运动。这使得载体能够运动到每个阀(2)的位置。载体将锁在转子(2.1)中。
管(6)的90°的运动将导致载体(3)和转子(2.1)的90°的运动。转子和转子盘中的袋将打开或关闭阀接头(a，b和c，d；d，a和 b，c)。
下面，参考图18和图19，将对按照另一个示例性实施方案的装置500进行解释。图18显示了装置500的前视图，图19显示了后视图。装置500含有在基体402中形成的沟槽501，用于插入套管(未显示)，通过它可以将样品供应到装置500中。提供了裂解室502，其中裂解所需的物质可以以干燥的形式储存。中心孔512用于执行操作装置500所需的所有固相结合过程。提供了其它的孔504，506，508和 510，在其中提供了干燥形式的各种其它物质，可用于清洗步骤，PCR 步骤等。提供了废物室514作为孔，分析所不再需要的液体可以被运输到其中。
尽管在图18和图19中没有显示，但在废物室514中可以提供液体吸附性物质，可以吸收进入废物室514的流体。通过采取这种措施，可以确保防止不需要的液体从废物室514回流到装置500的其它部分中，从而避免任何污染。例如，可膨胀的聚合物(也可以用于尿布中) 可用于这样的目的。
正如可以从图18具体看到的，提供了多个流体连接端口520，524， 521，525，540，542，544，545，548，578，580，558，562，564， 560，561，552，550，516，554，530，528，532和526，用于连接不同的通道，它们将在下面解释。
正如可以从图19看到的，显示了其它的流体连接端口541，560， 566，519，512。此外，预见到多个通道538，522，518，527，529， 536，572，574，576，539，562，570，546，556，568和534，连接各个流体连接端口520，524，521，525，540，542，544，545，548， 578，580，558，562，564，560，561，552，550，516，554，530， 528，532，526，541，560，566，519和孔502，504，506，508，510 和512。此外，显示了流体入口593，通过它可以将流体例如水注射到装置500中。通过流体出口594，可以从装置500中排出流体(例如排出空气以降低压力)。还显示了流体入/出口597。
显示了可以被遮光板挡住的第一窗口部分598和可以被遮光板挡住的第二窗口部分599，当装置500中的流体柱的弯月液面通过与遮光板相关的透明窗口部分598，599时，可以用于进行光学检测。当一个遮光板检测到对应于窗口部分598，599的室之一充满了液体或溢流后，这可以被光学检测到，并可以用于产生控制控制单元(在图18和图19 中没有显示)的控制信号，以相应地控制装置500的操作。
当插管的第一部分被插入到沟槽501中时，插管的第二部分可以插入到患者中，以从患者获取血样，并将全血样品直接注射到装置500 中。
尽管没有显示在图18和图19中，但任何一个流体连接端口520， 524，521，525，540，542，544，545，548，578，580，558，562， 564，560，561，552，550，516，554，530，528，532，526，541， 560，566，519可以被能够被致动器销针(在图18和图19中没有显示) 压缩的弹性元件覆盖，使得销针可用于选择性打开或关闭任何单独的一个流体连接端口520，524，521，525，540，542，544，545，548， 578，580，558，562，564，560，561，552，550，516，554，530，528，532，526，541，560，566，519，从而实现阀的功能。
尽管没有显示在图18和图19中，孔502，504，506，508，510 和512中任何一个可以被能够被致动器销针(在图18和图19中没有显示)压缩的弹性元件覆盖，使得销针可用于选择性地压在孔502，504， 506，508，510和512上，从而用作混合器或泵。
正如可以从图18看到的那样，形成中心孔512的部件587是模压的塑料元件，可以被插入到基体402的沟槽585，583中。该塑料元件 587可以从两侧形成图案或构成，以便可以形成部件590，591，578， 548，580，558等。
下面，将对在装置500中，特别是基于中心孔512进行的分析进行解释，这种分析可以允许以快速的方式，例如在1小时之内，执行 HIV载量的测定。
珠子可以提供在中心室512中。这些珠子可以构造为从以前裂解的样品捕获靶分子(例如HIV RNA)。例如，珠子可以被构造为与捕获分子的锚定基团结合，以结合含有靶多核苷酸和捕获分子的复合物，其中捕获分子含有特异性针对靶多核苷酸的区域的结合部分和锚定基团。
附图标记541表示与压缩空气的连接(参见图19中的箭头)，以便压缩空气可以通过元件538，518，516，并进入孔502。因此，使用压缩空气泵抽空孔502是可能的。在通过沟槽501提供的血样应该用水稀释的情况下，该水可以通过流体入口593提供。
在一个实施方案中，全血样品(或其它样品)可以被运输到孔502 中，用于例如裂解。血液可以被吸入到装置500中，通过首先压缩哟室，将血液施加入到毛细管中，将毛细管与裂解室502相接触，然后释放裂解室502，从而将血液吸入到装置500中。
为此，将上述的相应的裂解试剂以干燥的形式提供在裂解孔502 中。裂解孔还可以含有包含锚定基团和特异性针对靶多核苷酸的区域的结合部分的捕获分子。然后，将现在可以包含含有靶多核苷酸和捕获分子的复合物的样品通过部件554和556(通过压缩空气)运输到部件558。在这种情况下，部件552被相应的致动器关闭。经过部件558， 580，样品可以被运输到中心孔512中。为此，中心孔512的沟槽591 和590可以装备有过滤器，例如熔融玻璃过滤器(没有显示在图18和图19中)，以阻止在流体流动力的影响下，中心孔502中的珠子从该孔502中被除去。因此，经过沟槽591和590中的过滤器或熔融玻璃过滤器，被裂解的样品可以通过部件576运输到中心孔512中。
在中心孔512中，可以提供第一结合元件例如珠子或功能化表面，以便靶或含有靶多核苷酸和捕获分子的复合物可以结合在中心室512 的固相捕获结构上。可以进行温育，以便珠子与样品材料适当地混合。
空气流将液体(即被裂解的样品的未被捕获的成分)从中心孔512 经过部件558，560，561压到废物514中。因此，许多没有被中心孔 512中的珠子捕获的样品的成分被运输到废物室514中。因此，只有靶保留在中心孔512中，而全血样品的剩余部分现在在废物514中。因此，中心孔512现在收容有珠子以及含有捕获探针和靶的复合物。
然后，可以对中心孔512进行清洗，其中以固体形式提供在清洗孔504中的清洗缓冲液的成分被用于产生清洗缓冲液。这样的清洗步骤可能是有利的，因为在捕获步骤后，某些不纯物质仍然可能存在于室502中，特别是在使用全血样品时，或样品通过插入到沟槽501中的插管提供时。
清洗缓冲液可以在空气压力的作用下经部件541，540，542，546， 548，578，591，574，512被泵抽。
正如上面已经指出的那样，清洗缓冲液被制备在清洗孔504中。在清洗孔504中，用于这种清洗缓冲液的盐可以以干燥的形式存在。为了制备清洗缓冲液，水可以从部件566经过部件564，562，570，552 (当部件554关闭时)，527(当部件532，525，530关闭时)运输，以便水被提供到部件521(开放)。水可以被泵抽到清洗孔504中，直到与部件520相连的透明窗口被水充满，这可以由通过部件520旁的透明窗口附近的遮光板检测弯月液面来检测。一旦收到相应的检测信号，水的供应可以被终止。
然后，致动器(未显示)可以上下往复地压缩覆盖在清洗孔504 上的弹性覆盖元件，以进行混合，溶解提供在其中的盐。
然后通过对各个阀进行相应的控制并通过提供压缩空气，清空充满水的通道，使得水可以被泵抽到废物室514中。
然后可以将在清洗孔504中制备的清洗缓冲液压入中心孔512，使得可以在中心孔512中进行清洗程序。在清洗之后，可以将清洗溶液泵入到废物室514中。
接下来，可以进行反转录，将靶RNA转化成相应的DNA。这样的步骤在检测反转录病毒例如HIV的情况下是特别需要的，在其它情况下，例如当检测DNA病毒时，则不是必须的。为了执行这样的反转录，可以将反转录所需的成分例如引物，酶和缓冲液从反转录孔508泵抽到中心孔512中。
任选的，反转录孔508中的成分还可以含有另一套其它的捕获分子，可以具有捕获在反转录过程中在中心孔512中产生的DNA分子的特异性能力。
因为在反转录后，靶DNA没有保留在室512的珠子上，因此将溶液运输到废物容器514中将减小样品的量。为此，现在将样品从中心孔512泵到PCR孔510中，在该样品中可以溶解PCR盐，其中PCR 孔510中的PCR缓冲液可以含有聚合酶，能够与靶多核苷酸形成复合物的报告分子，引物和/或缓冲液。或者，反转录缓冲液含有针对合成的DNA链的捕获分子，这些链的捕获以与最初捕获HIV核酸相同的方式进行。然后，可以将样品泵回到中心孔512中。
但是，真正的PCR扩增然后在中心孔512中进行。为此，通过执行温度循环在中心孔512中进行PCR，也就是说，重复例如40次95℃ 5秒和60℃10秒的步骤。在另一个实施方案中，温度循环包含3种或以上不同的温度，例如可以进行包括30个循环的95℃20秒，55℃30秒和72℃30秒。但是，其它的PCR循环方案也可以在中心孔中进行。
在某些实施方案中，为了调节中心孔512中的温度，可以在中心孔512的上方和下方提供两个加热和/或冷却板。在另一个实施方案中，两个加热和/或冷却孔或板中的一个可以是连续的，另一个可以具有凹陷，以允许随后进行光学检测。
在某些实施方案中，从PCR孔510泵入中心孔512的样品的体积，可以使中心孔中的压力增加。这种压力的增加迫使中心孔的弹性覆盖元件压向两个加热和/或冷却板，与其它部件一起，用于加热/冷却板与中心孔之间的有效热转移。
在某些实施方案中，如上所述，检测可以在扩增过程中发生。
例如，在第一实施方案中，可以在中心孔512中进行捕获分子的竞争性分析。因此，在该实施方案中，第一结合元件例如珠子被用于捕获含有靶核酸和捕获分子的复合物，第二结合元件含有固定在中心孔512中的报告化合物特异性捕获分子的阵列，被用于检测。竞争性分析包括将一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物，这些复合物的形成抑制了报告化合物被固定在中心孔512中的报告化合物特异性捕获分子的阵列捕获。固定在中心孔512中的报告化合物特异性捕获分子能够捕获至少剩余部分量的没有与靶多核苷酸复合的报告化合物。通过在孔512中提供不同类型的报告化合物特异性捕获分子的阵列用于检测，辨别不同类型的HIV病毒，例如1型HIV 和2型HIV，是可能的，甚至辨别HIV病毒的不同亚型也是可能的。
在第二个实施方案中，使用与已经用于捕获步骤并用于检测的结合元件相同的结合元件，例如珠子，也是可能的。在该实施方案中，通过锚定基团连接到珠子上的捕获寡核苷酸可以与被扩增的靶DNA的复合物杂交，该扩增的靶DNA本身可以含有荧光标记物。
被捕获的报告化合物或被捕获的靶分子可以通过光学检测进行检测，例如使用如上所述的荧光标记物。具体来说，可以操作具有光源 (未显示)和光检测器(未显示)的光学系统，以便测量PCR过程中信号的时间依赖性，这使得可以推导出HIV的病毒载量。换句话说，可以获得并评估荧光信号的时间依赖性。
下面，参考图20，将对按照示例性实施方案的装置600进行解释。
图20的实施方案类似于图18，19的实施方案，因此相应的部件用同样的附图标记来表示。为了简单明了起见，在图20中，通道和流体端口没有用附图标记来表示。对于相应的解释，参考图18和图19。
图20显示了与孔504相关的窗口部分602和与孔506有关的窗口部分694，它们能够用于弯月液面检测，因此能够用于溢流检测，并以此作为基础确定作用在孔504，506上和作用在各种不同流体连接端口上的控制致动器的控制信号。
标出了重力矢量的方向，以显示在某些实施方案中装置600可以被操作的位置。在这些实施方案中，装置600的操作是基于重力和通过压缩空气接头606和供水接头608提供的液体运输力的组合。此外，提供了通气接头610和通气接头612，以对相应的流体结构进行通气。
图20示意性显示了部分613，它可以作为图20的整体解决方案的可选方案，提供为单独的模块，可以与其它模块组合起来，形成用户定义的装置，在该装置中各种不同模块被装配在一起。
下面，残开图21，将对按照另一个示例性实施方案的装置700进行解释。
装置700含有刚性基体704，其中形成了第一贯通洞709和第二贯通洞707。在基体704的第一主表面上形成了第一孔720和第二孔 708。在基体704的相反的主表面上，形成了通道706。通道706与孔 720和708分别通过洞709和707流体连通。
在刚性基体704的上表面上，形成了第一弹性覆盖元件708，并附着在刚性基体704上。在基体704的下表面上形成了第二覆盖元件，并层压在刚性基体704上。
正如可以从图21进一步看出的那样，提供了第一致动器元件701 和第二致动器元件702，第一致动器元件701适于压在覆盖元件720的第一部分上，以选择性关闭贯穿洞通道709或整个孔720。通过相应的方式，第二致动器元件702可以选择性打开或关闭孔708和/或贯穿洞 707。因此，可以控制流体流过通道706进入一个或两个孔720或708。
图22显示了本发明的示例性竞争性分析的示意图。标记的核酸报告分子(显示为灰色曲线)通过核酸捕获分子(显示为黑色曲线)连接到结合元件(这里举例为珠子)上。被检测的靶核酸以双链形式(两条链被显示为浅灰色/黑色曲线)存在于样品中。对样品进行(循环扩增反应的)变性步骤，允许靶核酸的链解离，报告分子从结合元件上释放。在随后的退火步骤中，允许一部分量的报告分子与至少一部分量的靶核酸形成复合物，其中由于捕获分子和核酸靶竞争与报告分子的结合，靶核酸/报告分子复合物的形成抑制了报告分子被捕获在结合元件上的能力。允许没有与靶核酸复合的剩余部分量的报告化合物重新捕获在结合元件上。在这个阶段，表明捕获在结合元件上的报告化合物的存在和/或量的值，以及在其基础上的表明靶核酸的存在和/或量的值，通过检测报告分子中包含的标记物产生的信号而被测定。在退火步骤之后或同时，进行扩增反应的延伸步骤。然后，可以对样品进行另一个扩增循环。
图23显示了使用本发明的示例性竞争性分析测定样品中人类脊髓灰质炎病毒1DNA(称为“EV”，是指“肠道病毒DNA”)的量的结果与使用同样的靶进行的标准Taq-man分析的比较。对各含有104个DNA拷贝的两个样品进行了平行的分析：第一样品(图表中的标记“探针”)被进行PCR扩增，使用Rotor-Gene 6000实时旋转PCR分析仪(Corbett LifeSciences,Sydney,Australia)按照制造商的说明书进行。使用的PCR引物导致扩增了150bp的DNA片段。片段的检测使用了所谓的探针来完成，它分别在其5’末端含有6-羰基-荧光素(FAM)标记，在其3’末端含有6-羰基四甲基罗丹明-琥珀酰亚胺酯 (TAMRA)标记(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)。总共进行了50个PCR循环。第二样品(“竞争性分析”)还包含了与探针具有相同的核苷酸序列，但是在其3’末端含有CY3羰花青标记 (Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)代替了FAM/TAMRA标记的报告分子，并使用本发明的一个实施方案的装置进行扩增。在扩增过程中检测到的获得的荧光信号显示在图中。
图24图示了原理并显示了本发明的用于在样品中测量HIV gag/env PCR产物的量的示例性的基于阵列的竞争性分析的结果。图 24A图示了分析的原理(也参见图22)。开始时，没有扩增的PCR产物即靶核酸存在。荧光标记的核酸报告分子被结合到捕获在阵列的基体上的报告化合物特异性探针上。如果没有PCR产物产生，在每一轮扩增反应后，与报告化合物特异性探针杂交的报告分子的量保持恒定，因此测定到的荧光信号也保持恒定。如果PCR产物被合成，在每一个 PCR循环后，与报告化合物特异性探针杂交的报告分子的量减少了，因此测定到的荧光信号也降低了。图24B显示了用于测定151bp的 HIV1gag/env PCR产物的量的基于阵列的竞争性分析的结果。将不同量的片段(相对于104-106个拷贝)以及在其5’末端含有CY3羰花青标记(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)的报告分子(“anti_cdso29_5'CY3”)一起进行了36个循环的PCR扩增。两种不同类型的探针分子，一种是非特异性的(“ara_54986_NH2”)，一种是报告化合物特异性的(“cdso29_NH2”)，以图25A中显示的布置被捕获在阵列基体上，并布置在使用的分析装置的反应室中。使用Iconoclust软件(Clondiag Chip Technologies GmbH,Jena,Germany)测定了CT值(“阈值”，即对指数扩增阶段的开始的度量，其中荧光以及因此DNA的量以线性方式增加)，并与针对用于产生校正曲线的相应DNA浓度进行作图(图24C)。在所有使用了受体特异性探针的样品中，随着PCR循环数量的增加，观察到了荧光强度的逐渐的降低。相反，在使用非特异探针的样品中，没有观察到荧光(图24B)。
图25描绘了PCR扩增的不同阶段时在图24中显示的分析中使用的阵列。阵列基体上不同点的布置图示在图25A中。黑色圆圈表示使用了特异性探针(参见图24)来捕获报告分子的点(四个平行样品)，而白色圆圈表示使用了非特异性探针来捕获报告分子的点(四个平行样品)。灰色圆圈代表阳性对照，其中荧光标记被点样在阵列基体上。图25B分别显示了在扩增循环1，12，18和21后获取的阵列(对应于图24B中的105个DNA拷贝-样品)的照片。在通过特异性探针分子捕获在阵列上的样品中，在PCR扩增过程中可以观察到荧光信号强度的降低。
图26A-D表示了本发明用于检测多核苷酸的竞争性方法的示例性实施方案的图解说明。如图26A所示，开始时没有扩增的PCR产物即靶核酸存在。标记的核酸报告分子(显示为黑色曲线，并被称为靶/探针特异性报告分子)被结合到捕获在阵列的基体上的报告化合物特异性探针上。信号对应于标记的内部对照分子(显示为浅灰色曲线)，它被结合到捕获在阵列的基体上的内部对照特异性探针上。如图26B 所示，如果PCR进入指数期早期，报告分子不仅与捕获在基体上的报告分子特异性探针结合，而且与PCR产物的报告分子特异性区域结合。因此，如果PCR产物被合成，与捕获在基体上的报告分子特异性探针杂交的报告分子的量将减少，因此测定到的信号将降低。当PCR在指数期时信号明显降低(参见图26C)。当PCR达到平台期时，捕获在基体上的报告分子特异性探针的信号保持低水平(参见图26D)。
图27显示了本发明的用于测定样品中HIV亚型B和HIV亚型O2 的量的竞争性分析的示例性实施方案的结果。在图27A的实验中，样品中只存在HIV亚型B。可以看到，对应于特异性针对HIV亚型O2 (HIV sub O2)的标记的核酸报告分子的信号保持恒定，而对应于特异性针对HIV亚型B(HIV sub B)的标记的核酸报告分子的信号在经过大约13个PCR循环后显著降低了(参见图26)。在图27B的实验中，样品中只存在HIV亚型O2。可以看到，对应于特异性针对HIV亚型B (HIV sub B)的标记的核酸报告分子的信号保持恒定，而对应于特异性针对HIV亚型O2(HIV sub O2)的标记的核酸报告分子的信号在经过大约25个PCR循环后显著降低了(参见图26)。
图28显示了本发明的用于测定样品中HIV亚型B的不同量的竞争性分析的示例性实施方案的结果。如果样品中存在106个拷贝的HIV，对应于特异性针对HIV亚型B(HIV subB)的标记的核酸报告分子的信号在经过大约13个PCR循环后显著降低(参见图28A)。如果样品中只存在104个HIV拷贝，对应于特异性针对HIV亚型B(HIV sub B) 的标记的核酸报告分子的信号在经过大约19个PCR循环后显著降低 (参见图28B)。从图28可以明显看出，在信号降低前所需的PCR循环的数量是可检测的，这允许对被分析的样品中存在的靶核酸的量作出结论。
图29描述了测定来自52个感染HIV患者的血浆和全血样品中相应的HIV-1 RNA拷贝数的基于PCR分析(COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV分析；Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)的结果。简单来说，患者的全血样品通过静脉穿刺获得。向样品中加入EDTA 以防止凝集。通过将全血样品以4000x g离心5分钟并移除细胞碎片来纯化血浆。将1ml血浆样品和10μl全血样品(与990μl磷酸缓冲盐水混合)在COBAS AmpliPrep/COBASTaqMan 48装置中(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)，按照制造商的说明书进行自动处理。病毒拷贝数(每ml样品体积)由COBAS AmpliLink软件包自动计算，并显示成全血样品与血浆样品相比的散点图。将全血样品获得的值乘以系数100以校正不同的血液样品体积(10μl全血对1ml血浆)。对于其中检测到的拷贝数低于40的血浆样品来说，拷贝数按照图30的描述进行计算。由于是对数标度，在血液或血浆样品中产生阴性结果 (即每ml 0个病毒拷贝)的样品没有显示。
图30描述了对于其中没有检测到或检测到的HIV-1 RNA拷贝低于40的血浆样品进行的图29中显示的分析的结果。病毒拷贝数(每 ml样品体积)通过根据相应的拷贝数/ml样品的所有计算值(即在获得的AmpliLink结果文件中给出的阈值)产生校正曲线，来人工进行计算。
图31描述了图1中显示的另一种分析的结果，测定了在来自245 位HIV感染患者(包括图29中研究的52位患者)的血浆和全血样品中HIV-1 RNA的相应拷贝数。
图32显示了接受HIV抗病毒疗法的HIV阳性患者(患者028号) 的相应血浆和全血病毒载量测定。病毒载量按照图29的分析方法进行测定。在疗法过程中的不同日期收集全血和血浆样品。由于遵医嘱的问题(即患者没有根据处方服用药物)，在开始监测患者对药物治疗的反应后大约60天时，观察到了全血样品中HIV载量的突然增加(但在血浆样品中没有)。
图33显示了接受HIV抗病毒疗法的两位HIV阳性患者的相应血浆和全血病毒载量测定：患者003号(图33A)和患者004号(图33B)。病毒载量按照图29的分析方法进行测定。在疗法过程中的不同日期收集全血和血浆样品。在两位患者中，都观察到了血浆中低的病毒载量和全血中相对高的病毒载量。从这些数据可以看出，病毒在疗法过程中仍然活跃复制，但复制的HIV库主要是与细胞相关的，因此血浆样品中的病毒载量保持非常低。
图34显示了接受HIV抗病毒疗法的两位HIV阳性患者的相应血浆和全血病毒载量测定：患者009号(图34A)和患者066号(图34B)。病毒载量按照图29的分析方法进行测定。在疗法过程中的不同日期收集全血和血浆样品。在患者009号中，血浆中的病毒载量低于检测极限，但是在全血中(显然主要是与细胞相关的)可以检测到HIV。在患者066号中，由于遵医嘱的问题(即患者没有根据处方服用药物)，直到开始监测患者对药物治疗的反应后35天时，观察到了全血样品中 HIV载量的增加。随后，开始了另一种疗法，导致了病毒载量的降低。尽管对于全血和血浆病毒载量来说观察到的时间进程是相似的，但从绝对数量来说，任何时候全血样品中病毒载量都高于血浆样品的病毒载量。
图35显示了在全血和血浆样品中观察到的病毒拷贝数的典型的时间进程。符号“ldl”表示所进行的分析的检测下限。在任何时候，在全血样品中观察到的病毒拷贝数都高于血浆样品的相应拷贝数(参考表示“拷贝数差异”的“dc1”和“dc2”)。但是，在许多情况下，在血浆样品中与在全血样品中相比，病毒拷贝数分别降低得较早和增加得较晚(参考表示“时间差异”的“dt1”和“dt2”)。
下面，参考图36，将对根据本发明的另一个示例性实施方案的装置800进行解释。
提供了裂解室802，裂解所需的材料可以干燥的形式储存在其中。中心孔812用于执行所有操作装置800所需的固相偶联步骤以及靶的扩增。提供了其他孔804、806和808，在其中以干燥形式提供了各种不同的其他物质，可用于清洗步骤、PCR步骤等。例如，在开始分析前的初始状态下，裂解孔802、PCR/RT缓冲液孔808、清洗缓冲液孔 806和清洗缓冲液孔804含有用于分析的相应步骤的适合药剂。废物室 814以孔的形式提供，分析不再需要的液体可以运输到其中。
尽管在图36中没有显示，但在废物室814中可以提供液体吸附剂材料，可用于吸收进入废物室814的流体。通过采取这种措施，可以确保防止不想要的液体从废物室814回流到装置800的其他部分中，从而避免任何污染。例如，可膨胀的聚合物(也可用于尿布中)可用于这样的目的。
废物室814可以包含开口815，用于装置800的通风。开口可以用滤器加帽，只允许气体通过，防止液体、气溶胶和大分子例如DNA 或RNA离开装置。
此外，显示了储液器816，流体可以通过它储存在装置中和/或注射到装置800中。在某些实施方案中，储液器816是含有分析所必需的水或其他溶剂的储液器，其中储液器的容积可变。通过例如经致动器817施加外力以降低容积，可以将储液器816的内含物注射到装置 800中。在某些实施方案中，储液器816是经隔膜(未显示)与微流体网路相连的室。在开始分析之前，室与流体网路流体分隔。当开始分析时，隔膜将打开，从而将储液器与流体网路相连，允许储液器的内含物在外力作用下释放到装置800的通道和孔中。
正如可以从图36具体看到的，提供了多个流体连接端口820-826。尽管在图36中没有显示，但任何一个流体连接端口820-826都可以用可以被致动器销针(在图36中没有显示)压缩的弹性元件覆盖，使得销针可用于选择性打开或关闭任何单独的一个流体连接端口820-826，从而实现阀的功能，如同在图17a和b或图21中解释的。
此外，可以预见到，多个通道830-837的微流体网路与各种不同的流体连接端口820-826和孔802、804、806、808和812相连。
显示了可以被遮光板挡住的窗口部分840，当装置800中的流体柱的弯月液面通过与遮光板相关的透明窗口部分840时，可以用于进行光学检测。当一个遮光板检测到对应于窗口部分840的室之一充满了液体或溢流后，这可以被光学检测到，并可以用于产生控制单元(在图36中没有显示)的控制信号，以相应地控制装置800的操作。
尽管在图36中没有显示，但任何一个孔802、804、806、808和 812都可以用可以被致动器销针(在图36中没有显示)压缩的弹性元件覆盖，使得销针可用于选择性地压在孔802、804、806、808和812 上，从而用作混合器或泵。
指称编号818是指与压缩空气的连接，以便压缩空气可以被导入到装置800中。例如当流体连接端口821-824和826关闭、流体连接端口820和825打开时，压缩空气可以经接口818流入孔802，经连接端口820、通道830、流体连接端口825流入孔812。因此，在孔802充满液体的情况下，有可能使用压缩空气将孔802的内含物泵入孔812。例如，装置可以含有可以被穿孔的隔膜，以便将空气或气体泵入装置。通过将空气或气体泵入装置，可以通过打开相应的阀或流体连接端口，迫使或压缩液体从孔802、804、806和808进入中心孔812。
下面，将对在装置800中，特别是基于中心孔812进行的示例性分析进行解释，这种分析可以允许以快速的方式，例如在1小时之内，执行HIV载量的测定。
在中心室812中可以提供结合元件例如珠子812a。结合元件可以构造为从以前裂解的样品捕获靶分子(例如HIV RNA和DNA)。例如，结合元件可以被构造为与捕获分子的锚定基团、例如生物素结合，以结合含有靶多核苷酸和捕获分子的复合物，其中捕获分子含有特异性针对靶多核苷酸的区域的结合部分和锚定基团。中心孔812可以装备有过滤器，例如熔融玻璃过滤器(没有显示在图36中)，以阻止在流体流动力的影响下，中心孔812中的珠子从该孔中被除去。
在一个实施方案中，全血样品(或任何其它样品)可以被运输到孔802中，用于例如裂解。可以通过首先将血液施加到毛细管801中，将毛细管801与裂解室802相接触，然后用塞子(未显示)封闭毛细管从而增加毛细管801中的压力，迫使或压缩血液样品进入裂解室802 中，来将血液导入或压入到装置800中。
为此，将上述的相应的裂解试剂以干燥的形式提供在裂解孔802 中。裂解孔还可以含有各包含锚定基团和特异性针对靶多核苷酸的区域的结合部分的捕获分子。然后，将现在可以包含各含有靶多核苷酸和捕获分子的复合物的样品，运输到中心孔812中。
在中心孔812中，可以提供第一结合元件例如珠子812a或功能化表面，以便靶或含有靶多核苷酸和捕获分子的复合物可以结合在中心室812的固体捕获结构上。可以进行温育，以便珠子与样品材料适当地混合。
中心孔812可以通过例如通道836与另一个用作气压弹簧的孔850 或室流体连通。另一个孔850也被称为弹簧孔，可以适合于接收中心孔812的内含物。当中心孔容纳有液体时其内含物被置换出来的中心孔812，通过微流体网路相连。在容纳液体前包含在中心孔812中的填充物质，通常情况下为空气，然后可以储存在弹簧孔850中。应该指出，弹簧孔可以储存不论稠度如何的任何物质，即液体和气体。
弹簧孔850也可以适合于在从中心孔812接收内含物时建立起压力。孔850也可以适合于通过将内含物例如气体或空气释放到中心孔中，来将建立起的压力释放到中心孔812中。因此，孔850可以用作气压弹簧，允许通过打开的阀825将液体置换出中心孔812。在这种实施方案中，通过例如外部压缩空气源主动置换可以被认为是多余的，因为建立起的压力代替例如外部压缩空气用于将容纳的液体置换出中心孔812。
例如，当填充中心孔812时，气压弹簧中包含的空气或气体将被压缩，气压弹簧中的压力将增加。因此，当填充中心孔时，液体可以在压力下导入，例如使用500到2000mbar的压力，例如800mbar。如果填充压力被降低(例如通过打开阀825)，气压弹簧850中的压力将大于填充压力，使得插入的溶液将被压出或被迫流出中心孔812。
气压弹簧850的维度可以使其中建立起的累积压力足以将中心孔的内含物完全清空到废物容器814中。例如，气压弹簧孔850的体积可以基本上与中心孔812一样大。在某些实施方案中，气压弹簧的体积是中心孔812的体积的2或3倍，或中心孔812的体积的一半。例如，气压弹簧孔850的体积可以在50到300μl之间，例如100μl、150 μl、200μl或250μl。
孔850可以提供有通道836，作为孔850与中心孔812之间的流体连通，即液体或气体连通。通道836在中心孔一侧的开口，在正常操作位置中可以位于与重力方向相反的方向上。这意味着在正常重力条件下，开口在中心孔812的上部。因此，这可以避免中心孔812容纳的液体被无意释放到孔850中。孔850可以与中心孔812通过微流体网路流体连通。因此，孔850可以用作压力储存器或压缩气体弹簧，可以远离第二个结构放置。
根据示例性实施方案，在中心孔812与孔850之间提供有检测装置840，例如遮光板，该检测装置840适合于检测容纳在中心孔812中的容纳液体的存在。装置840可以位于中心孔412与孔850之间的流体连通中的任何位置。
通过释放弹簧孔850中建立起的压力(例如通过打开流体连接端口825和826)，将液体(即裂解样品的未捕获成分)从中心孔812被迫或压出到废物孔814中。因此，没有被中心孔812中的珠子捕获的样品成分被运输到废物室814中。因此，只有靶保留在中心孔812中，全血样品的其余部分现在在废物室814中。因此，中心孔812中现在容纳珠子和含有捕获探针和靶的复合物在一起。
随后，可以对中心孔812进行清洗，其中以固体形式提供在清洗缓冲液孔804中的用于清洗缓冲液的成分，被用于产生清洗缓冲液。这样的清洗步骤可能是有利的，因为在捕获步骤后，某些杂质可能仍存在于室812中。
正如上面已经指出的，清洗缓冲液在清洗缓冲液孔804中制备。在清洗孔804中，用于这样的清洗缓冲液的盐可以干燥形式存在。为了制备清洗缓冲液，可以将水从储液器816，经通道830、833和流体连接端口821(当流体连接端口820、822、823、825和826关闭时)运输到清洗孔804中，直到与部件821相连的透明窗840充满水为止，这可以通过透过孔804旁的透明窗附近的遮光板检测弯月液面来检测。在接收到相应的检测信号后，可以终止水的供应。
在某些实施方案中，然后可以使用致动器(未显示)上下往复地压缩覆盖在清洗孔804上的弹性覆盖元件，以进行混合，溶解提供在其中的盐。
然后可以通过经部件818、831、804、821、833、830、825施加压力，将在清洗缓冲液孔804中制备的清洗缓冲液泵入中心孔812，使得可以在中心孔812中进行清洗程序。通过将孔804的内含物泵入孔 812，孔850中的压力增加。在这种清洗之后，可以通过例如如上所述的释放孔850的压力，将清洗溶液泵入到废物室814中。
然后，可以同样地制备孔806和808中的缓冲液，并转移到或转移出室812。
接下来，可以进行反转录并随后PCR，将靶RNA转化成相应的 DNA并随后扩增DNA。这样的步骤在检测反转录病毒例如HIV的情况下是特别需要的，但在其它情况下，例如当检测DNA病毒时，反转录步骤则不是必须的。为了执行这样的反转录PCR，可以将反转录所需的成分例如引物、酶和缓冲液从RT/PCR孔808泵抽到中心孔812 中。
然后在中心孔812中进行PCR扩增。为此，通过执行温度循环在中心孔812中进行PCR，也就是说，重复例如40次95℃5秒和60℃10 秒的步骤。在另一个实施方案中，温度循环包含3种或以上不同的温度，例如可以进行包括30或40个循环的95℃20秒，55℃30秒和 72℃30秒。但是，其它的PCR循环方案也可以在中心室中进行。
在某些实施方案中，为了调节中心孔812中的温度，可以在中心孔812的上方和下方提供两个加热板。在另一个实施方案中，两个加热孔中的一个可以是连续的，另一个可以具有凹陷，以允许随后进行光学检测。在某些实施方案中，加热板是加热和/或冷却板，例如珀耳帖(Peltier)元件。
在某些实施方案中，如上所述，检测可以在扩增过程中发生。
例如，在第一实施方案中，可以在中心孔812中进行捕获分子的竞争性分析。因此，在该实施方案中，第一结合元件例如珠子被用于捕获各含有靶分子和捕获分子的复合物，第二结合元件含有固定在中心孔812中的报告化合物特异性捕获分子的阵列，被用于检测。竞争性分析包括将一部分量的报告化合物与至少一部分量的靶核酸形成复合物，这些复合物的形成抑制了报告化合物被固定在中心孔812中的报告化合物特异性捕获分子的阵列捕获。固定在中心孔812中的报告化合物特异性捕获分子能够捕获至少剩余部分量的没有与靶多核苷酸复合的报告化合物。通过在孔812中提供不同类型的报告化合物特异性捕获分子的阵列812b用于检测，辨别不同类型的HIV病毒，例如1 型HIV和2型HIV，是可能的，甚至辨别HIV病毒的不同亚型也是可能的。
在另一个实施方案中，使用与已经用于捕获步骤并用于检测的相同的结合元件，例如珠子，也是可能的。在该实施方案中，通过锚定基团连接到珠子上的捕获寡核苷酸可以与被扩增的靶DNA的复合物杂交，该扩增的靶DNA本身可以含有荧光标记物。
被捕获的报告化合物或被捕获的靶分子可以通过光学检测进行检测，例如使用如上所述的荧光标记物。具体来说，可以操作具有光源 (未显示)和光检测器(未显示)的光学系统，以便测量PCR过程中信号的时间依赖性，这使得可以推导出HIV的病毒载量。换句话说，可以获得并评估荧光信号的时间依赖性。
根据示例性实施方案，在开始PCR之前，中心孔812将被不可逆地密封。这种密封可以通过焊接入口以及如果需要的话、焊接出口来进行。在存在第三个结构、例如气压弹簧或弹簧孔850的情况下，只密封入口是可能的。可以通过例如使用压入到阀825中或通道上的热销针，导致塑料熔融从而密封阀或通道，来进行这种密封。因此可以安全地密封PCR室。
根据另一个示例性实施方案，用于PCR的中心孔被充满，使得弹性的第一和第二个面或覆盖层进行凸弯。因此可以将层迫使或压向加热/冷却元件，从而允许加热/冷却元件与中心孔之间的有效热转换。
在某些实施方案中，为了进行试验，将装置的毛细管810充满血液。当用盖子(在图36中未显示)覆盖毛细管时，血液将供应到裂解室或裂解孔。现在将装置插入到检测器中，开始进行分析。首先，所有室或孔(除了中心孔之外)将充满水。打开相应的阀或流体连接端口，从储液器816出来的水将被泵入孔中，直到位于孔802上部的遮光板或检测装置840检测到孔802被充满的信号。流向相应孔的水流将被停止，然后将填充下一个孔。通过用水填充，相应孔中的干燥试剂或反应物将溶解。当相应的溶液准备好使用时，首先将裂解孔802 的内含物泵入中心孔812。为此，将打开裂解孔下的阀或流体连接端口以及连通中心孔的阀或流体连接端口，使得在两个孔之间建立流体连通。当含有靶核酸的裂解混合物流入中心孔812时，靶核酸将通过中心孔中结合基质上的捕获分子被捕获。为了增加靶核酸的捕获效率，通过将裂解混合物在中心孔和裂解孔之间移动多次，将裂解混合物多次泵入中心孔中。然后，通过使用如上所述的气压弹簧850，将裂解溶液泵入废物容器中。
下面的实施例对本发明进行了进一步的描述，它们的目的仅仅是图示本发明的具体实施方案，而不以任何方式对本发明的范围构成限制。
实施例
实施例1：用于测定人类脊髓灰质炎病毒1 DNA的竞争性分析
所进行的竞争性分析的原理示意显示在图22中。将人类脊髓灰质炎病毒1分离株TCDC01-861的DNA(GenBank登记号AF538843)克隆在适当的表达载体(Clontech,Inc.Palo Alto,CA, USA)中，用作DNA模板(在本文中也称为“EV”(肠道病毒)DNA)。
对两个各含有104个DNA拷贝的样品进行了平行的分析：第一样品使用Rotor-Gene6000实时旋转PCR分析仪(Corbett Life Sciences, Sydney,Australia)按照制造商的说明书进行了PCR扩增。
第二样品还包含了与探针具有相同的核苷酸序列，但是在其3’末端含有CY3羰花青标记(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA, USA)代替了FAM/TAMRA标记的报告分子，并使用分析装置在反应室中直接进行扩增，其中阵列被放置在可加热的基部表面上。
使用了下面的PCR引物：
正向PCR引物：
pr_for_EV_02：5'-CAAACCAGTGATTGGCCTGTCGTAACG-3'
(对应于AF538843的492-518位核苷酸)
反向PCR引物：
pr_rev_EV_01：5'-TTCACCGGATGGCCAATCCAATTCG-3'
(对应于AF538843的617-641位核苷酸)
因此，PCR导致了150bp的DNA片段的扩增。按照制造商的说明书，PCR样品含有200nM(终浓度)的每种PCR引物，以及和Ultrasense RT-PCR试剂盒(Invitrogen Corporation, Carlsbad,CA,USA)的反应缓冲液。
此外，为了检测扩增的PCR片段，使用Rotor-Gene 6000实时旋转PCR分析仪，相应的PCR样品含有100nM(终浓度)的双重标记的所谓探针，它分别在其5’末端含有6-羰基-荧光素(FAM) 标记(即荧光团)，在其3’末端含有6-羰基四甲基罗丹明-琥珀酰亚胺酯(TAMRA)标记(即淬灭剂)(两种标记都是从Invitrogen Corporation, Carlsbad,CA,USA购买的)。探针具有下面的序列：
HP_EV2_001：FAM-5'-ACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTT-3'- TAMRA
(对应于AF538843的536-561位核苷酸)
为了进行竞争性分析，PCR样品还含有20nM(终浓度)的报告分子，它与探针具有相同的核苷酸序列，但是具有不同的标记，具体为在其3’末端含有CY3羰花青标记(Invitrogen Corporation, Carlsbad,CA,USA)：
EV2_02CY3：5'-ACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTT-3'-CY3
(对应于AF538843的536-561位核苷酸)
按照下面的温度模式进行了实时PCR：94℃2分钟，然后进行50 个循环的94℃5秒，62℃30秒和72℃30秒。
在PCR过程中两个反应的荧光信号都显示在图23中。
实施例2：用于测定HIV1 gag/env DNA的基于阵列的竞争性分析
进行的竞争性分析的原理示意显示在图24A中。将合成的HIVl gag/env融合构建物的DNA(EMBL登记号A06258)克隆到表达载体(Clontech,Inc.PaloAlto,CA,USA)的EcoRI内切核酸酶限制性位点中，用作DNA模板。
此外，使用了下面的PCR引物：
正向PCR引物：
cdia：5'-TGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTATGTC-3'
(对应于A06258的214-232位核苷酸)
反向PCR引物：
cdis：5'-ATCAAGCAGCCATGCAAATGTT-3'
(对应于A06258的384-405位核苷酸)
因此，PCR导致了151bp的DNA片段的扩增，它具有下面的序列：5'-ATC AAG CAGCCA TGC AAA TGT TAA AAG AGA CCA TCA ATG AGG AAG CTG CAG AAT GGG ATA GAT TGCATC CAG TCC ATG GAG GGC CTA TTG CAC CAG GCC AGA TGA GAG AAC CAA GGG GAA GTGACA TAG CAG GAA CTA CTA GTA CCC TTC A-3'。
PCR在分析装置的反应室中直接进行，其中阵列被放置在可加热的基部表面上。PCR样品含有200nM(终浓度)每种PCR引物，以及和Ultrasense RT-PCR试剂盒(Invitrogen Corporation, Carlsbad,CA,USA)的反应缓冲液。为了产生校正曲线，使用了对应于0，104，105，和106个DNA拷贝的不同量的DNA模板(在1μ中) (每种浓度进行四份实验)。
为了进行竞争性分析，PCR样品还含有10nM(终浓度)的报告分子，它在其5’末端具有CY3羰花青标记(Invitrogen Corporation, Carlsbad,CA,USA)：
anti_cdso29_5'CY3：
CY3-5'-TCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGT-3'
(与下面描述的cdso29_NH2探针分子互补)
按照下面的温度模式进行了PCR：95℃30秒，然后进行36个循环的95℃5秒，50℃30秒和72℃30秒。
在每个循环中，在退火步骤结束时，使用位于分析装置的顶表面对面的光学检测系统和Iconoclust软件包(Clondiag Chip Technologies GmbH,Jena,Germany)，测定了报告分子与两种类型的探针的相互作用。在数据获取过程中曝光时间是2.5秒。
两种不同类型的探针分子以图25A中显示的布置方式被捕获在阵列基体上。单独的荧光标记物被用作阳性对照。使用了下面的探针：
非特异性探针：
ara_54986_NH2：5'-ACCAGCTTTGAACCCAACAC-3'
受体特异性探针：
cdso29_NH2：5'-ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGA-3'
使用Iconoclust软件(Clondiag Chip Technologies GmbH,Jena, Germany)确定了CT值(“阈值”)，作为指数扩增期开始的度量，在指数扩增期中荧光以及因此DNA的量以线性方式增加，并与针对使用的相应的DNA浓度进行作图，产生了校正曲线(图24C)。测定到的平均CT值如下：在104个DNA拷贝的样品中是22.0；在105个DNA 拷贝的样品中是18.5；在106个DNA拷贝的样品中是15.0。
在所有使用了受体特异性探针的样品中，随着PCR循环数量的增加，观察到了荧光强度的逐渐的降低。相反，在使用非特异探针的样品中，没有观察到荧光(图24B)。
阵列基体上不同点的布置示意图示在图25A中。黑色圆圈表示使用了特异性探针(参见图24)来捕获报告分子的点(四个平行样品)，而白色圆圈表示使用了非特异性探针来捕获报告分子的点(四个平行样品)。灰色圆圈代表阳性对照，其中荧光标记被点样在阵列基体上。
图25B分别显示了在扩增循环1，12，18和21后获取的阵列(对应于图24B中的105个DNA拷贝的样品)的照片。在通过特异性探针分子捕获在阵列上的样品中，在PCR扩增过程中可以观察到荧光信号强度的逐渐降低，这反过来对应于被扩增的PCR产物的量的相伴的增加，可以通过与相应的校正曲线进行比较来定量。
实施例3：测定HIV阳性患者的血液样品中HIV的载量
血液样品最初从52位在德国Friedrich-Schiller-University Jena的 HIV救护车上进行治疗的HIV感染患者获得。患者没有根据他们的性别、年龄、HIV感染的病原学、临床症状、存在的HIV类型/亚型、伴随的疾病等进行分组。
通过静脉穿刺从患者获得了患者的全血样品。向样品中加入终浓度为5mM的EDTA，以防止样品凝结(即血凝块的形成)。将样品储存在4℃，在收集样品后24小时内进行分析。
通过将全血样品以4000x g离心5分钟并移除细胞碎片来纯化血浆。对1ml血浆样品和10μl全血样品(与990μl磷酸缓冲盐水混合) 进行进一步分析。为了进行用于病毒检测的COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV分析(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)，需要1ml 的样品体积。
将全血和血浆样品在COBAS AmpliPrep装置中按照制造商的说明书进行自动处理。简单来说，将850μl样品在存在蛋白酶K的情况下在离液序列高的缓冲液中进行裂解，以释放出任何核酸。此外，制备了阴性对照(不含任何核酸)和两个阳性对照，阳性对照分别含有对应于大约500个拷贝/ml和500000个拷贝/ml的病毒载量的RNA标准品。
样品中存在的核酸通过非特异性捕获在磁性二氧化硅颗粒上来进行纯化。在清洗后，通过加入75μl洗脱缓冲液，将核酸从二氧化硅颗粒上洗脱。将50μl洗脱物与50μl ofCOBAS TaqMan master混合物(还含有HIV特异性PCR引物)混合，并转移到COBAS TaqMan 48装置，按照制造商的说明书进行定量RT-PCR。
样品的病毒载量(即HIV拷贝数/ml样品)——相对于开始处理前加入到每个样品中的标准RNA进行归一化——通过COBAS AmpliLink软件包自动计算。将全血样品获得的值乘以系数100以校正不同的血液样品体积(10μl全血对1ml血浆)。
显然，在该自动数据分析中包含的仅仅是其中检测到了至少40个 HIV-1 RNA拷贝的样品，该拷贝数代表了AmpliLink软件的检测极限。任何具有低于40个HIV-1 RNA拷贝的样品(即当对使用的不同样品体积进行校正后，实际上对应于40个拷贝的HIV-1 RNA/ml血浆和4000 个拷贝的HIV-1 RNA/ml全血)通过人工进行分析。病毒拷贝数/每ml 样品，通过根据相应的拷贝数/ml样品的所有计算值(即在获得的 AmpliLink结果文件中给出的阈值)产生校正曲线，来进行计算。
获得的结果概述在下面的表1中，该表显示了相应的全血和血浆样品数，其中检测到了无(“阴性”)、少于40个拷贝/ml(“<40”) 和大于40个拷贝/ml(“阳性”)的HIV RNA。
结果——表示成从全血样品计算的值对从相应的血浆样品计算的值的散点图——也显示在图30和31中。具体来说，图29显示了通过 AmpliLink软件进行的自动数据分析获得的结果，而图30显示了通过对血浆和全血样品进行人工计算而获得的结果，其中检测到了无或少于40个拷贝的HIV RNA。
表1
根据获得的结果，显然使用血浆样品检测HIV可能导致假阴性结果。在分析的几位HIV感染患者中，血浆样品的病毒载量是阴性的，表明在血流中不存在任何循环的感染HIV粒子，即使在相应的全血样品中可以检测到相当高拷贝数的HIV RNA。
这些结果在随后的包含了总共245位HIV感染患者的(包括在第一次分析中调查的52位患者)的分析中得到了证实。分析如上所述进行。获得结果——表示成散点图——显示在图31中，也概述在下面的表2中。
表2
分析的样品 总数 阴性 阳性<40
1ml血浆 245 109(44％) 42(17％)
10μl全血 245 50(20％) 36(15％)
在分析的245个血浆样品中有61％是HIV阴性或含有少于40个拷贝的HIV-1 RNA(即当对使用的不同样品体积进行校正后，实际上对应于40个拷贝的HIV-1 RNA/ml血浆和4000个拷贝的HIV-1 RNA/ml 全血)，而这部分在分析的245个全血样品中仅占35％。换句话说，在65位(43％)血浆样品不含或含有少于40个拷贝的HIV-1 RNA的患者中，相应的全血样品事实上是HIV阳性的(即可以监测到多于40 个拷贝的HIV-1 RNA)。
推测这些“附加的”HIV库主要归因于与血细胞黏附的HIV粒子，这些血细胞例如嗜中性细胞、B淋巴细胞、血小板和红细胞(参见上面背景部分中的讨论)，这部分HIV粒子被认为代表了感染细胞中连续的病毒复制的重要标志物。因此，使用血浆样品的分析方法不能检测源自于与细胞相关的HIV的核酸，因此导致了假阴性结果，对于受到感染的患者来说可能是有害的。因此，总HIV核酸的量似乎代表了比血浆中的病毒载量更精确和可靠的诊断标志物。
实施例4：使用全血样品中的HIV载量作为诊断标志物
按照在实施例1中描述的分析方法，在疗法过程中的不同时间点，对来自上述对象集合的5位接受了HIV抗病毒疗法的HIV阳性患者(即患者028号、003号、004号、009号和066号)的相应血浆和全血病毒载量，进行了测定。获得的相应结果概述在下面的表3到7和图33到35中。
对于患者028号来说，在开始监测患者对HIV疗法的反应后不同的天数(即在第5、25、61和68天)收集全血和血浆样品。获得的分析结果显示在表3和图32中。
表3：HIV#028
收集样品的天数 血浆病毒载量(拷贝/ml) 全血病毒载量(拷贝/ml)
5 0 280
25 7 100
61 0 410
68 0 16384
令人吃惊的是，在开始监测患者对药物治疗的反应后第68天收集的样品中，观察到了全血中HIV载量的急剧和突然的增加，而血浆中的HIV载量仍然检测不到。在向Jena大学医院的HIV救护车报告了该观察之后，发现患者在治疗期间已经停止了按照处方服用药物。显然，这种遵医嘱的问题导致了只能在全血中检测到的HIV复制的增加。
尽管这种现象的原因仍然不清楚，但显然HIV拷贝数的总体增加主要归因于保持黏附于血细胞的增加数量的HIV粒子，即在血浆样品中不能检测到的HIV库。
对于患者003号和004号来说，在开始监测患者对HIV疗法的反应后不同的天数(即对于003号在第0、60、98和172天，对于004 号在第0、42、98和158天)收集全血和血浆样品。获得的分析结果显示在表4和5以及分别在图33A 和33B 中。
表4：HIV#003
收集样品的天数 血浆病毒载量(拷贝/10μl) 全血病毒载量(拷贝/10μl)
0 0.26 260.5
60 5.65 2565
98 2.04 2460
172 2.31 2470
表5：HIV#004
收集样品的天数 血浆病毒载量(拷贝/10μl) 全血病毒载量(拷贝/10μl)
0 0.24 21.1
42 0.20 112
98 2.19 259
158 0.97 249
在两位患者中，一致地观察到了血浆中的低病毒载量和全血中相对高的病毒载量。从这些数据，可以看出在治疗过程中病毒仍活跃地复制，但是复制的HIV库还是主要是与细胞相关的，因此在血浆样品中不能检测到。
对于患者009号和066号来说，在开始监测患者对HIV疗法的反应后不同的天数(即对于009号在第0、66和136天，对于066号在第0、11、35和42天)收集全血和血浆样品。获得的分析结果显示在表6和7以及分别在图34A 和34B 中。
表6：HIV#009
收集样品的天数 血浆病毒载量(拷贝/10μl) 全血病毒载量(拷贝/10μl)
0 0 43.5
66 0 15.7
136 0 3.6
表5：HIV#066
收集样品的天数 血浆病毒载量(拷贝/10μl) 全血病毒载量(拷贝/10μl)
0 2.3 61.4
11 1400 5410
35 4650 6675
42 75.8 292
在患者009号中，血浆中的病毒载量低于检测极限，但是全血中的HIV可以检测到。因此，该活跃复制的HIV库依然表现出主要是细胞相关的。
在患者066号中，由于遵医嘱问题(即患者没有按处方服用药物)，在开始监测患者对药物治疗的反应后直到35天，在全血样品中都观察到了HIV载量的增加。随后开始了另一种疗法，导致病毒载量的降低。尽管对于全血和血浆病毒载量来说观察到的相应时间进程是相似的，但从绝对数量来说，任何时候全血样品中病毒载量都高于血浆样品的病毒载量。
因此，根据这些结果，全血样品中的HIV载量与血浆中的病毒载量相比，似乎代表了更有意义和显著的诊断标志物，不仅用于在HIV 感染的患者中监测疾病发展，而且可用于监测抗病毒治疗的效能。
应该注意的是，术语“包含”不排除其它的要素或特征，并且单数的表达方式不排除复数形式。与不同的实施方案相关联描述的要素也可以组合起来。
还应该注意，权利要求书中的附图标记不讲被解释为对权利要求的范围的限制。

Claims (16)

1.一种分析系统，该系统包括：
-致动器单元，适于控制微流体装置的弹性覆盖元件，从而控制微流体装置结构中的和/或微流体网络中的流体的流动；
-荧光检测单元，适于检测所述结构中表明靶分子存在或存在数量并且被至少一个结合元件捕获的物质；
-用于机械驱动致动器单元的驱动元件；
-适于将液体运输通过结构和/或微流体网路的运输单元；
-用于控制致动器单元让弹性覆盖元件变形的控制单元；和
-用于让流体处于一定温度的温度操纵单元，其中，温度操纵单元包括第一加热元件和第二加热元件，其中结构被布置在第一加热元件和第二加热元件之间，其中，至少一个加热元件是弹性地被安装在该结构的表面上，从而允许弹性的适用于加热元件，和，其中，第一加热元件为连续的，和第二加热元件具有凹陷，从而允许电磁辐射被导向到该结构和允许通过第二加热元件上的凹陷来进行荧光辐射检测。
2.根据权利要求1所述的系统，所述的被安装的弹性元件是弹性的加热或制冷元件。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其中温度操纵单元被安放在致动器单元上。
4.根据权利要求1或2所述的系统，其中，所述的至少一个加热元件为珀耳帖元件。
5.根据权利要求1或2所述的系统，其中，进一步包括感应通过微流体装置中流体的温度的温度传感器。
6.根据权利要求1或2所述的系统，其中，致动器单元位于控制单元之下并具有多个协同作用于弹性覆盖元件上的销针或型板，从而，为了混合目的的选择性地打开或关闭通道或结构。
7.根据权利要求1或2所述的系统，其中，结构包括孔，微流体网路包括通道。
8.根据权利要求1或2所述的系统，其中，其中致动器单元包括多个适合于被协同致动使得覆盖元件变形的致动器元件，从而按照由控制单元限定的流体流动方案控制液体的流体流动特性。
9.根据权利要求1或2所述的系统，其中，致动器单元被提供为可移动的，以选择性关闭至少一部分结构，使得液体不能运输通过结构。
10.根据权利要求1或2所述的系统，其中，其中致动器单元被提供成可移动的，以选择性打开至少一部分结构，使得液体能够运输通过结构。
11.根据权利要求1或2所述的系统，其中驱动单元包括气动驱动机构，液力驱动机构和电磁驱动机构中的至少一种。
12.根据权利要求1或2所述的系统，其中运输单元包括泵。
13.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述的微流体装置包括：装置，包括：
（a）刚性的基体；
（b）至少部分覆盖着基体的弹性覆盖元件；
（c）在基体中形成的第一结构，适于容纳液体并适于释放一种或多种细胞，孢子或病毒的内含物，所述内含物中含有靶分子；
（d）在基体中形成的第二结构，适于容纳液体并含有至少一个结合元件，该结合元件适于捕获靶分子并用于测定表明靶分子的存在和/或量的值；
（e）将至少第一结构和第二结构相互连通的微流体网路。
14.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述的微流体装置包括：装置，包括：
（a）刚性的基体；
（b）至少部分覆盖着基体的弹性覆盖元件；
（c）在基体中形成的第一结构，适于容纳液体并适于释放一种或多种细胞，孢子或病毒的内含物，所述内含物中含有靶分子；
（d）在基体中形成的第二结构，适于容纳液体并含有至少一个结合元件，该结合元件适于捕获靶分子并用于测定表明靶分子的存在和/或量的值；
（e）将至少第一结构和第二结构相互连通的微流体网路；其中，该微流体网路能够被所述的致动器单元控制，通过该致动器单元将弹性覆盖元件压向基体以选择性关闭一部分，来实现第一结构和第二结构之间的流体流动。
15.根据权利要求12所述的系统，其中所述泵是压缩空气泵，液压泵，蠕动泵和真空泵中的一种。
16.根据权利要求7所述的系统，其中，所述微流体网路包括大量相互连通的通道。
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