JP2019054794A - アッセイ - Google Patents

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Abstract

【課題】簡易な様式で試料の分析を可能とする装置及び方法の提供。【解決手段】流体状態の試料を収容するように適合され、反応チャンバーを含む装置中に流体全血試料を導入する工程、反応チャンバーが第一の表面及び第二の表面を含み、第一の表面又は第二の表面上に配置されたマイクロアレイをさらに含む工程、並びに装置中でマイクロアレイに基づく分析を行うことによって、全血試料中のウイルス感染と関連する核酸の存在及び／又は量の指標となる値を測定する工程を含む方法。【選択図】図１ａ

Description

優先権の主張
本願は、２００７年７月２３日に出願された米国特許出願９５１，３５８号（参照により、その全体が組み込まれる。）の優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、アッセイ、例えば、ポリヌクレオチドのためのアッセイに関する。
生物学的試料中の病原体の存在は、病原体の存在に関連するポリヌクレオチドに関して試料をアッセイすることによって測定することができる。細菌、カビ及びウイルスは、関連するポリヌクレオチドに対するアッセイに基づいて測定することができる病原体の例である。
ＥＰ０６３７９９９は、ポリヌクレオチド重合反応を実施することによって、試料中の予め選択されたポリヌクレオチドを増幅するための装置を開示する。この装置は、試料注入ポート及び注入ポートから伸長する中規模流動システムを画するように微細加工された基材を含む。中規模流動システムは、予め選択されたポリヌクレオチドの重合及び増幅のために必要とされる試薬が与えられている注入ポートと流体連通しているポリヌクレオチド重合反応チャンバーを含む。この装置は、反応チャンバー（ＰＣＲチャンバー）中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するために使用し得る。ＰＣＲチャンバーには、試料ポリヌクレオチド、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、プライマー及びポリメラーゼ連鎖反応に必要とされる他の試薬が供給され、装置には、二本鎖ポリヌクレオチドのハイブリッド形成を解除し、プライマーを徐冷し、並びにポリヌクレオチドを重合及び増幅するように制御された温度に、反応チャンバーの内容物の温度を熱的に制御するための手段が提供されている。
しかしながら、旧来の微小流体装置の様々な作業を適切に協調させることは困難であり得る。
欧州特許出願公開第０６３７９９９号明細書
簡易な様式で試料の分析を可能とする装置及び方法に対する要求が存在し得る。
要旨
典型的な実施形態によれば、堅固な基材と、該基材を少なくとも部分的に覆う柔軟なカバー要素と、基材中に形成され、液体を収容するように適合され、及び１つ又はそれ以上の細胞、芽胞又はウイルスの内容物を放出するように適合された第一の構造と（内容物は、標的分子（例えば、構造又はチャンバー又はウェル中の乾燥された緩衝液）を含む。）、基材中に形成され、液体を収容するように適合され、並びに標的分子を捕捉するように及び標的分子の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定するように適合された少なくとも１つの結合要素を含む第二の構造（第一の構造とは異なり得る。）と、少なくとも第一の構造と第二の構造を相互接続する微小流体ネットワークと、並びに微小流体ネットワークの一部を選択的に閉鎖するために基材に対して柔軟なカバー要素を押圧することによって第一の構造と第二の構造の間に液体流を生じさせるように適合されたアクチュエータ要素とを含む、装置が提供される。
別の典型的な実施形態によれば、液体を収容するように適合された構造と（該構造は、少なくとも１つの結合要素を含み、及び微小流体ネットワークと流体連通している。）並びに少なくとも１つの結合要素に標的分子が捕捉される様式で微小流体ネットワークを通じた流体流を調節するように適合され、構造中での標的分子の増幅を調節するように適合され、及び少なくとも１つに結合要素に捕捉された標的分子の存在及び／又は量に対する指標となる化合物の検出を調節するように適合された調節ユニットとを含む装置が提供される。
さらに別の典型的な実施形態によれば、少なくとも１つの結合要素を含み及び微小流体ネットワークと流体連通している構造中に液体を収容すること、少なくとも１つの結合要素に標的分子が捕捉される様式で微小流体ネットワークを通じた流体流を調節すること、構造中の標的分子を増幅すること、並びに少なくとも１つに結合要素に捕捉された標的分子の存在及び／又は量に対する指標となる化合物を検出することを含む方法が提供される。
さらに別の典型的な実施形態によれば、液体を収容するように適合された構造を含み、該構造は第一の化合物を捕捉するように適合された第一の結合要素を含み、並びに第一の化合物の存在及び／又は量に対する指標となる第二の化合物（第一の化合物と異なり得る。）を捕捉するように適合された第二の結合要素（第一の結合要素と異なり得る。）を含む装置が提供される。
別の典型的な実施形態によれば、予め規定された分析作業を実施するように微小流体装置を通じて、調節ユニットの調節下で、その中において試料が誘導される装置が提供され得る。この装置は、分析の間に必要とされる幾つかの又は全ての固相連結手順を実施し得る中央ウェル／中央構造（第二のウェル又は第二の構造とも表記され得る。）を備えることができる。中央ウェルと表記され得るこの構造において、精製又は分離目的のために試料の標的分子を捕捉すること、（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲによって）標的分子を増幅すること、並びに標的分子の存在／不存在又は標的分子の量に関する情報を誘導することができる（例えば、光学的）検出手順を実行することが可能であり得る。
従って、迅速且つ正確な様式で、多くの人手を必要とせずに、生化学的又は医学的な結果を与え得る強力で、完全に自動的な生化学的分析システムが提供され得る。例えば、このような装置を用いて、定性的又は定量的な様式で、患者の全血試料中のＨＩＶ感染に伴う核酸を検出することが可能であり得る。
次に、この装置のさらなる典型的な実施形態を説明する。しかしながら、これらの実施形態は、方法に対しても適用される。典型的な実施形態によれば、中央ウェル中で検出される化合物は、標的分子である。この目的のために、中央ウェルには、特異的な結合要素（例えば、標的分子を捕捉するために必要とされる他の結合要素とは異なる結合要素）が付与され得る。換言すれば、このような実施形態において、標的分子（例えば、標的分子は、例えば、遊離のウイルスに由来するＲＮＡ、細胞に随伴したウイルスに由来するＲＮＡ、プロウイルスＤＮＡ、逆転写されたウイルスＤＮＡ、すなわち、ウイルス複製の「中間体」及びプロウイルスＤＮＡ由来の転写物、すなわち、宿主ＤＮＡゲノムの転写によって得られるＲＮＡ分子など、遊離のウイルス及び細胞に随伴したウイルス（ＨＩＶなど）に由来する核酸）を結合要素であり得る。
あるいは、例えば、ＰＣＲ産物に、ＲＮＡに又はＤＮＡに結合する能力を有し得るレポーター化合物などの特異的化合物を付与することも可能である。このようなシナリオでは、レポーター化合物は、検出されることによって、試料中の標的分子の存在及び／又は量に関する情報を間接的に与えることを可能とする化合物であり得る。
この少なくとも１つの結合要素は、標的分子を捕捉するように適合され得る。例えば、少なくとも１つの結合要素は、全ウイルス核酸などの標的分子を含む複合体を捕捉することができる標識されたビーズを含み得る。
この少なくとも１つの結合要素は、標的分子の存在及び／又は量に対する指標となる化合物を捕捉するように適合され得る。従って、分離した各標的分子を直接検出できるのみならず、例えば、結合要素上に捕捉されたレポーター化合物を検出することによって、標的分子を間接的に検出することも可能である。
この少なくとも１つの結合要素は標的分子を捕捉するように適合された第一の結合要素を含むことができ、並びに標的分子の存在及び／又は量に対する指標となるレポーター化合物を捕捉するように適合された第二の結合要素（第一の結合要素とは異なり得る。）を含み得る。従って、化合物の２つの異なる種類（１つは、特に、溶解後に標的分子を捕捉するための化合物（例えば、標的ポリヌクレオチドのある領域に対して特異的な結合部分とアンカー基とを含む捕捉分子）、もう１つは検出用の化合物（例えば、標的ポリヌクレオチドと複合体を形成することができるレポーター化合物（標的ポリヌクレオチドとの複合体の形成は、第二の結合要素によるレポーター化合物の捕捉を阻害する。））を提供することが可能である。換言すれば、捕捉は、検出から機能的に分離することができる。例えば、第一の結合要素は、例えば、捕捉分子のアンカー基に結合することによって、捕捉分子及び標的分子を含む複合体に結合するように構成されているビーズであり得るのに対して、第二の結合要素はレポーター化合物を捕捉することができる中央ウェルの表面であり得る。第二の結合要素である中央ウェルの表面は、表面上のレポーター化合物を捕捉することができる１つ又はそれ以上の異なるレポーター特異的捕捉分子を含み得る。
この構造、すなわち、様々な固相カップリング手順が行われる中央チャンバーはウェルであり得る。「ウェル」は、基材中に形成され、その中で様々な分析手順を行い得る試料チャンバーを与える陥入又は陥凹であり得る。このようなウェルは、マイクロリットルとミリリットルの間の大きさの容積を有する円柱状の構造又はポットであり得る。
中央ウェル又は第二の構造は、例えば、中央ウェルの注入口及び必要に応じて排出口を密封することによって、不可逆的に密封可能であり得る。
この微小流体ネットワークは、１つのチャネル又は相互接続されたチャネルの複数を含み得る。「チャネル」は、幅及び高さより著しく大きな長さを有することにより、これに沿って液体が輸送され得る経路を与える流体構造（例えば、実質的に一次元の構造）を表し得る。単一のチャネルを与えることができ、又はチャネルシステムを形成するために数個のチャネルを相互接続し得る。このようなチャネルシステムは、このようなシステムの分岐において、１つのチャネルから別のチャネルへの液体流を可能とし得る。1つ又はそれ以上のウェルを、このようなチャネルシステムに一体化し得る。
上記のような構造、例えば、「中央」構造に加えて、この微小流体ネットワークは少なくとも１つのさらなる構造を含み得る。換言すれば、チャネル及び中央ウェルとは別に、さらなるチャネル及び／又はさらなるウェルなど、さらなる微小流体要素を付与し得る。従って、ウェル及びチャネルの複雑な系を与え得る。
（溶解構造又は溶解ウェルなどの）少なくとも１つのさらなる構造は、１つ又はそれ以上の細胞、芽胞又はウイルスの、標的分子を含む内容物を放出するように適合され得る。従って、このようなさらなる構造は溶解チャンバーと表記することができ、溶解チャンバー内では、その後の分析のために、細胞などの生物学的化合物はその内容物を放出するように強制される。換言すれば、さらなる構造は、内容物を放出するためにこのような作業を実施する生化学的因子を含み、これにより、中央ウェルに輸送されるべき改変された試料を与える構造を含み得る。この目的のために、溶解構造などのさらなる構造は、溶解試薬、例えば、細胞膜及び／又はウイルスのキャプシドを崩壊させる１つ又はそれ以上の界面活性剤を含むカオトロピック塩又は試薬を含み得る。これに代えて又はこれに加えて、（例えば、以下に記載されているような温度調節ユニット及び／又は温度制御ユニットを使用し、又は含めることによって）細胞膜及び／又はウイルスキャプシドを破壊するために、さらなる構造、例えば溶解ウェルは試料を加熱するように適合させ得る。
この少なくとも１つのさらなる構造は、標的分子と複合体を形成することができる捕捉プローブも含み得る。従って、アンカー基を有する捕捉分子の存在下で試料を溶解することが可能であり得る。
（ＰＣＲ試薬を含むウェルなどの）少なくとも１つのさらなる構造は、標的分子の増幅を促進する少なくとも１つの物質を含み得る。換言すれば、すなわち、増幅を促進するために必要とされる生化学的因子を含むさらなるウェルが付与され得る。しかしながら、さらなる構造中にはＰＣＲ剤を含め得るが、実際のＰＣＲ増幅手順は、中央ウェル中など、別の位置で実施され得る。しかしながら、典型的な実施形態によれば、以下でさらに詳しく説明されているように、試料材料の喪失を避けるために、増幅物質ウェルを含むウェルを通じて、中央ウェルから再度中央ウェルへと試料を輸送して戻すことが有利であり得る。増幅を促進する物質は、ＰＣＲに必要とされる物質（酵素、プライマー、緩衝液など）であり得、以下で詳しく記載されている。
この少なくとも１つのさらなる構造はウェルでもあり得る。従って、微小流体ネットワークによって接続されたウェルの複数を付与することができる。しかしながら、ウェル以外の構造中で、例えばチャネル中で、溶解を実施し、及び／又は増幅材料を提供することが可能であり得る。
この装置は、その上に及び／又はその中に構造を形成し得る基材を含み得る。従って、装置のコンポーネントを収容する流体は、基材中へ一体的に統合され得る。あるいは、構造は、基材の上に形成され得、例えば、印刷し、又はスポット状に付与することができる。柔軟なカバー要素と適切に協調し得る堅固な基材の材料に対する例は、ポリカーボナート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ＰＥＴ、ＰＭＭＡ、ポリエチレン、アクリルグラス、ＰＵ、ＰＥＥＫ、ＰＶＣ、ガラスなどである。
特に、この基材は堅固であり得、極めて効率的な様式で基材を少なくとも部分的に覆う１つ又はそれ以上の柔軟なカバー要素と協調することが可能となる。特に、柔軟なカバー要素は堅固な基材を覆うことができ、アクチュエータは（バルブ機能などを実行するために）チャネルを選択的に閉鎖するために、カバー要素を基材に対して押圧し得る。
典型的な実施形態によれば、この基材は、第一の表面と該第一の表面とは対向する第二の表面とを有し得る。この構造は、この基材の第一の表面（特に、第一の主表面）上に及び／又は中に付与し得る。主表面は、その上に構造が構成される基材の主要な表面である。さらなる構造は、この基材の第二の表面（特に、第二の主表面）上に及び／又は中に付与し得る。流体の接続構造は、特に、この基材を貫通する穴及び／又は第一の表面を第二の表面と接続する基材の表面部分中の溝を通じて付与し得る。このような流体接続構造は、第一及び第二の表面の間に配置し得、構造をさらなる構造と流体連通させるように構成し得る。このような実施形態において、この基材は、２つの対向する主表面において加工され、これにより、微小流体構造を形成し得る。これらの構造は、この基材の表面に沿って形成されたチャネル又は基材を直接通過するチャネルを含み得る接続構造によって接続され得る。従って、このような基材の主表面は何れも液体輸送作業を与えるために加工され得るので、この基材の両主表面部分を極めて効率的に使用され得る装置が提供され得る。必要に応じて、このような基材は、一方又は両方の側において、（特に柔軟な）カバー要素で被覆し得、これにより、例えば、一方又は両方の主表面上の柔軟な部分に対して作用するアクチュエータによって、両表面上の流体構造を通じた流体流を効率的に調節することが可能となる。従って、両側に流体構造を有する中央基材が提供され得る。特に、これは、３つの層、すなわち基材及び少なくとも部分的に柔軟な２つのカバー要素によって形成されるカートリッジを製造することを可能とし得る。このような３つの層構造は、微小流体構造を収容する中間層（例えば、堅固である。）を挟み込む（例えば柔軟な）基礎要素と（例えば柔軟な）カバー要素を有し得る。基礎要素及び／又はカバー要素は、中央基材を完全に覆うことができ、又は、例えばアクチュエータをベースとする調節のための基礎としてカバー機能が所望される位置において、部分的にのみ覆うことができる（例えば、図２１参照）。
この基材の他に、この装置は少なくとも１つのさらなる基材を含むことができ、さらなる構造はさらなる基材の上及び／又は中に付与し得る。この基材がさらなる基材とともに接続され、又は取り付けられ、又は組み立てられ、又は設置されている作動状態において、構造及びさらなる構造が流体連通され得るように、この基材及びさらなる基材は、可逆的に又は取り外し可能に互いに接続可能又は取り付け可能又は組み立て可能又は設置可能であるように適合され得る。このような実施形態によれば、互いに柔軟に接続され得る幾つかのモジュールを組み合わせることによって、その中で装置を形成し得るモジュラー構造が付与され得る。モジュラー構造の組によって、対応するカートリッジを形成し得、モジュールの各々が以下の特性を有することができ、協同的に形成された他のモジュールとともに使用し得る。
−各モジュールは、少なくとも２つの流体接続を有するチャンバーを含む。
−チャンバーは堅固な要素及び弾性的な要素を含む。
−弾性的な要素の動きによって、少なくとも１つの流体接続を閉鎖することができ、チャンバーの内容物の混合を実施し得る。
この少なくとも１つの結合要素は、標的分子の分析中の固相カップリング手順の複数が少なくとも１つの結合要素において行われるように適合させ得る。「固相カップリング手順」という用語は、具体的には、機能化／結合要素における固着及びハイブリッド形成などのあらゆる種類を含み得る。この文脈において、「結合要素又は支持要素」には、捕捉分子のアンカー基を結合するように構成されているあらゆる物質、表面若しくは機能化及び／又はポリヌクレオチドを捕捉するように構成されている表面が含まれ得る。固相カップリング手順には、分析又は検出されるべき分子が固相表面に特異的に結合される、すなわち、溶液中ではなく固体表面上に結合される全ての手順が含まれ得る。
標的分子の分析中における全ての固相カップリング手順が少なくとも１つの結合要素において行われるように、この少なくとも１つの結合要素を適合させ得る。換言すれば、このような実施形態では、中央ウェル／構造以外の別のウェルでは、固相カップリング手順が行われない。これによって、単一のウェル中で全ての固相カップリング手順を実施することが可能となり得、小型の高性能装置が可能となり得る。標的分子の分析中における正確に２つの固相カップリング手順が少なくとも１つの結合要素において行われるように、少なくとも１つの結合要素を適合させ得る。これらの２つの固相カップリング手順は複数成分の試料由来の標的分子を捕捉すること、及び標的分子の存在若しくは不存在又は量に対する指標となる化合物を検出することに関し得る。記載されている実施形態において、このような両作業に対してウェルの設備を共同的に使用できるようにするために、これらの２つの手順は、単一のウェル中で行われる。１つのウェル中にこのような二つの作業を組み合わせることによって、液体流の経路を短く保ち、装置を小さく保ち、分析時間を短く保ち得る。
幾つかの実施形態において、標的分子の分析中における正確に３つの固相カップリング手順が少なくとも１つの結合要素において行われるように、この少なくとも１つの結合要素を適合させ得る。これらの３つの固相カップリング手順は複数成分の試料由来の標的分子を捕捉すること、標的核酸の逆転写から得られた核酸を捕捉すること、及び標的分子の存在若しくは不存在又は量に対する指標となる化合物を検出することに関し得る。記載されている実施形態において、このような全ての作業に対してウェルの設備を共同的に使用できるようにするために、これらの３つの手順は、単一のウェル中で行われる。１つのウェル中にこのような３つの作業を組み合わせることによって、液体流の経路を短く保ち、装置を小さく保ち、分析時間を短く保ち得る。
あるいは、試料中の標的分子の分析中における正確に１つの固相カップリング手順が少なくとも１つの結合要素において行われるように、この少なくとも１つの結合要素を適合させ得る。生化学的分析又は実験の全体が、単一の固相カップリング手順のみを含み、例えば、試料の精製のみが予測され、検出が予測されていない場合に、このような実施形態は特に有利であり得る。
この少なくとも１つの結合要素に隣接して配置された装置の少なくとも一部が実質的に１ｎｍと実質的に１０μｍの間の波長の範囲にある電磁波照射に対して透過性であり得、これにより、標的分子の存在及び／又は量に対する指標となり、及びこの少なくとも１つの結合要素に捕捉された化合物の電磁波照射をベースとする検出が可能となる。このような実施形態において、特に、中央ウェルに近い基材の一部は、検出目的で使用される電磁波照射に対して、特に近赤外線、可視光及び／又は紫外線ドメインの電磁波照射に対して透過性であり得る。この措置を採ることにより、中央ウェル中の電磁波照射を基礎とする検出（例えば、蛍光をベースとする検出）も実施することが可能であり得る。少なくとも１つの結合要素に隣接して配置された装置の一部が実質的に４００μｍと実質的に８００μｍの間の波長の範囲にある電磁波照射に対して透過性である場合には、化合物の光学的検出が可能となる。
この装置は、構造中に配置された液体の温度を操作するように適合された温度操作ユニットを含み得、又はこのような温度操作ユニットと接続可能であり得る。このような温度操作ユニットは、試料を特定の温度にすることができる又は特定の温度パターン若しくは系列を実行することができる加熱及び／又は冷却要素を含み得る。
この温度操作ユニットはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するための温度系列に従って構造中に配置された液体の温度を操作するように適合され得る。このようなポリメラーゼ連鎖反応は、例えば、約９５℃、約５５℃及び約７２℃への温度サイクルを必要とし得る。温度のこのような系列は、通常、特定の予め定められた時間間隔で実施されなければならず、所定の複数回数を繰り返すことができる。
この少なくとも１つの結合要素は、捕捉分子のアンカー基を結合するように構成され得る。特に、少なくとも１つの結合要素はポリヌクレオチドを捕捉するように構成され得る。
この少なくとも１つの結合要素は、捕捉分子（例えば、構造の表面上に配置された（例えば、ウェル中に固定化された）レポーター特異的捕捉分子）、粒子上に（例えば、ビーズ上に）配置された捕捉分子（例えば、構造（例えば、多孔性ガラス構造）の多孔性表面上に配置された捕捉分子、並びに１つ又はそれ以上の異なる捕捉分子（例えば、構造の表面に関して異なる位置に配置されたレポーター特異的捕捉分子（例えば、例えば競合的アッセイにおいて、ウェル中にアレイ様の様式で固定化されている捕捉分子の異なる種類））からなる群の少なくとも１つを含み得る。幾つかの実施形態において、この少なくとも１つの結合要素は、ビオチンなどのアンカー基を捕捉するための捕捉分子も含み得る。
この構造は、実質的に１μｌと実質的に１ｍｌの間の範囲、特に実質的に２０μｌと実質的に３００μｌの間の範囲の容積を有し得る。例えば、実質的に１００μｌの容積を有するウェルが提供され得る。
この基材は、装置に液体を供給するための挿管を受容するように構成された溝を有し得る。試料供給用の挿管は、単に、微小流体チャネル系と適切な調和及び協調が為されるように溝の中に配置する必要があるに過ぎず、これにより、特別な技術を有しておらず、又は訓練を施されていない使用者でも実施し得る簡易な分析が可能となるので、このような実施形態において、使用者が装置を取り扱うのは極めて容易であり得る。
この基材は構造に隣接するウィンドウ部分を有し得、及び実質的に１ｎｍと実質的に１０μｍの間の波長の範囲の電磁波照射（すなわち、近赤外線、可視光又は紫外線照射）、特に実質的に４００ｎｍと実質的に８００ｎｍの波長の範囲の電磁波照射（すなわち、特に可視光照射）に対して透過性であり、これにより、構造又は微小流体ネットワークを通じた（より正確には、構造又は微小流体ネットワークに達する）液体流のメニスカスの、電磁波照射をベースとする検出が可能となる。このような実施形態において、この基材の光学的に透過性のウィンドウ部分は放射線検出装置によって検出され得る。微小流体ネットワーク又は構造を通じて拍出された流体のメニスカスがウィンドウ部分を通過すると、ウィンドウ部分を通じた伝達特性は特徴的な様式で突発的に変化し得、これにより、放射線検出装置にシグナルを生成し、メニスカスがこの装置中の特定の領域に達したという事実が示唆される。アクチュエータの協調的な動き及び／又は温度操作ユニットの調節は、この装置を通じて拍出された試料の現在位置と適切に合致させることができるので、このシグナルは引き金を引く目的のために有用であり得、又はアクチュエータに対する制御シグナルとして有用であり得る。例えば、このような措置を取ることによって、過剰流が生じたときに、水又は緩衝液の所定の容量が装置内に拍出されたことを検出し得る。
構造及びさらなる構造からなる群の少なくとも１つは、２つの流体開口部を含み得る。このような流体開口部は、流体注入口及び流体排出口であり得る。
このカバー要素は、柔軟なカバー要素であり得る。特に、堅固な基材と協調して、カバー要素と基材は、カバー要素に対して作用するアクチュエータによって適切に制御され得る、三次元的に密封されたチャネルを形成し得る。外的な力の影響下で、特定の位置において、カバー要素が少なくとも部分的に変形可能である場合には、構造又は微小流体ネットワークを開放又は閉鎖することによって、液体の流れを選択的に可能とし、又は不能とすることが可能であり得る。この他に、このようなカバー要素を用いて、構造に沿った液体の輸送が可能である。
特に、アクチュエータ要素が付与され、カバー要素を変形するように作動されるように適合される場合には、一体化された混合、ポンプ及び／又はバルブ機能を有する高性能のラブ−オン−チップ（ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ）が提供され得る。
この構造の何れの一つも、生物学的に、生化学的に及び／又は化学的に活性を有する１つ又はそれ以上の物質を含み得る。従って、捕捉分子、レポーター特異的捕捉分子、検出可能なマーカー、溶解試薬及びＰＣＲ試薬を含み得るこのような物質が、乾燥された形態で、特に凍結乾燥された形態でウェル中に存在する場合には、完全に自動的な分析を実行するために、使用者が単に（水、緩衝液及び試料などの）液体を充填するだけでよい装置を提供することが可能である。必要な生化学的成分が異なるウェル中に付与されている場合には、使用者は、調節ユニット中に保存された順序に基づいて、単に実験を開始し、異なる注入チャンバーに水又は緩衝液を提供し得る。残りは、完全に自動的な装置によって実施される。
このチャネルは、実質的に５０μｍと実質的に１ｍｍの間の範囲、特に実質的に１００μｍと実質的に３００μｍの間の範囲の幅（基材の表面平面中の次元であり、流体流の方向と垂直な次元である。）を有し得る。例えば、このチャネルの幅は実質的に２００μｍであり得る。このチャネルの高さ（基材の表面平面と垂直で、及び流体流の方向と垂直な方向の次元である。）は、実質的に２０μｍと実質的に３００μｍの間の範囲、特に実質的に５０μｍと実質的に２００μｍの間の範囲であり得る。例えば、このチャネルの高さは実質的に１００μｍであり得る。これとは対照的に、このチャネルの長さは幅及び高さよりずっと大きくすることができ、例えば、１ｍｍより大きく、特に１ｃｍより大きくすることができ、又は数センチメートルでさえあり得る。
この構造は、液体用の輸送媒体として適合された材料を含み得る。例えば、この材料は固体材料、ゲル材料、液体材料及びこれらの組み合わせからなる群の少なくとも１つを含み得る。従って、この構造は、陥凹であり得、又は液体用担体としての役割を果たす材料によって形成され得る。
このカバー要素は、柔軟な膜又は柔軟な密封を含み得る。このような柔軟な膜又は柔軟な密封は、ラテックスなどの材料から構成され得、これにより、（例えば、アクチュエータ要素によって生成される）機械的な力の影響下で、このカバー要素を柔軟に変形させることが可能となる。
この装置は、このカバー要素を変形し、これにより、構造中及び／又は微小流体ネットワーク中の液体の流体流特性を調節するように作動されるように適合されたアクチュエータ要素を含み得る。このようなアクチュエータ要素は調節ユニットの調節下に置くことができ、柔軟なカバー要素に対して協同して作用するピン又はステンシルの複数を有し得、これにより、チャネルを選択的に開放又は閉鎖し、拍出又は混合などの目的で、チャネル又はウェルの容量を一時的に低下させることができる。
このアクチュエータ要素は、チャネルの直線部分に沿って液体の流体流特性を調節するように特に適合され得る。流体が真っ直ぐなチャネルに沿って流れる場合には、垂直に配置されたアクチュエータ要素は、このチャネルが特定の部分で閉鎖されたときに、流体の流れを効率的に停止させ得る。
このアクチュエータ要素は、バルブとして、流体混合装置として、及び／又は流体ポンプとして機能するように適合させ得る。
より具体的には、このアクチュエータ要素は、カバー要素を変形して、これにより、調節ユニットによって規定される流体流スキームに従って液体の流体流特性を調節するために協調して作動されるように適合されたアクチュエータ要素の複数を含み得る。従って、様々なチャネルを通じた流体及び試料の輸送を含む特定の実験又はアッセイを使用者が選択した場合には、この調節ユニットは、柔軟なカバー要素のこのような可逆的圧縮を与えることにより、完全に自動的にアッセイを実行するために、アクチュエータ要素の各ステンシルを単に調節する。
このアクチュエータユニットを調節して、標的分子が少なくとも１つの結合要素に捕捉され、標的分子が構造中で増幅され、並びに標的分子の存在及び／又は量に対する指標となり、及び少なくとも１つの結合要素に捕捉された化合物が検出される様式でカバー要素を変形させるように、この調節ユニットを適合させ得る。従って、調節ユニットは、様々なコンポーネントの機能を調和させる装置の中央制御装置であり得る。
このアクチュエータ要素は、往復されるように構成された１つ又はそれ以上のピンを含み得る。ピンを前方に移動させることによって、チャネル中の基材の方向に柔軟なカバー要素を押圧することによって、このチャネルを閉鎖し得る。ピンが後方に動かされると、流体が流れることができるように、このチャネルを再度開放させ得る。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上のピンは、少なくとも部分的に弾性的な先端を有し得る。
さらに、基材の主表面に対して垂直な方向に移動できるように、このアクチュエータ要素を取り付け得る。平面状基材に対して垂直な方向に往復運動させることによって、効率的な開放及び閉鎖を可能とし得る。特に、構造を通じた液体の輸送を不能とするために、構造の少なくとも一部を選択的に閉鎖するように、このアクチュエータ要素を移動可能に取り付け得る。別の手順モードでは、構造を通じた液体の輸送を可能とするために、構造の少なくとも一部を選択的に開放するように、このアクチュエータ要素を移動させ得る。
構造を通じた液体の流体流を選択的に可能又は不能とするために、基材の主表面に対して垂直に往復運動するように、このアクチュエータ要素を適合させ得る。往復運動するアクチュエータの使用は、流体流を可逆的及び選択的に可能又は不能とすることができ、装置の極めて柔軟な動作が可能となり、（一方向性バルブ機能を実行するためにチャネルが不可逆的に閉鎖されるアプローチとは対照的に）装置を複数回使用することが可能となる。
このアクチュエータ要素は、構造を通じて液体を拍出させるために、基材の主表面に対して垂直な方向に往復運動するように適合させ得る。従って、このアクチュエータ要素は構造の容積又は高さを調節することが可能である。このアクチュエータ要素は、構造を選択的に閉鎖することもできる。構造の閉鎖は、バルブ機能、混合機能又は拍出機能に関連して実施され得る。しかしながら、検出されるべき標的分子の局所濃度を増加させ、及び／又はバックグラウンドシグナルを除去するために、検出目的で、構造及び／又は結合要素を圧縮させることが可能なので、検出期の間にこのようなアクチュエータを使用することも可能である。これは、精度を増大させ得る。
このアクチュエータ要素を機械的に駆動するために駆動ユニットを取り付けることが可能であり、この駆動ユニットは、調節ユニットによって調節可能であり得る。このような駆動ユニットは、空気圧式駆動機構、水力学的駆動機構又は電磁的駆動機構を含み得る。
この少なくとも１つの結合要素は、三次元媒体、例えば、ゲル、粒子、ビーズ又は多孔性マトリックスを含み得る。この三次元媒体は、アクチュエータ要素を移動させることによって可逆的に圧縮可能であるように配置され、及び構成され得る。標的分子の存在又は量に対する指標となる化合物又は複合体が付着された三次元媒体（ビーズなど）を圧縮することによって、検出されるべき分子の局所濃度が選択的に増大され得るので、この措置を取ることによって、極めて正確な検出を行うことが可能であり得る。
この装置は、バイオセンサーアッセイ装置、微小流体カートリッジ又はラブ・オン・チップとして適合させ得る。従って、完全な生化学的実験を行うために、小規模で、様々な生化学的機能を組み合わせ得る。
温度センサーを取り付け、装置を通じて輸送される液体の温度を感知するように適合させ得る。基材中に温度センサーを組み込むことにより、微小流体ネットワークを通じた液体流の温度を感知し得る。あるいは、基材に対してカバー要素を押圧したときに、アクチュエータが流体の局所温度を同時に測定し得るように、アクチュエータ要素に、例えばステンシル様アクチュエータの先端に、温度センサーを配置し得る。
この装置は、液体の温度を操作するように適合された、好ましくはアクチュエータ要素に配置された温度操作ユニットを含み得る。このような温度操作ユニットは、例えば基材中に一体化されたワイヤーを加熱し、ウェル中の試料を加熱する形態で、基材内に一体化させ得る。あるいは、このような温度操作ユニットは、外部電磁波照射源などの外部装置とすることができ、（例えば、レーザーからの）電磁波照射をウェル上に誘導して、エネルギー源として電磁波照射を用いて、ウェル中の流体を加熱し得る。さらにこれに代えて、この温度操作ユニットは、加熱要素のみならず、冷却要素を含み得る。このような実施形態に関して、ペルティエ冷却装置は少ない労力で実装し得る。
温度操作ユニットを取り付け、液体の温度を操作するように適合させることが可能であり、この温度操作ユニットは、第一の加熱要素及び第二の加熱要素を含むことができ、構造は第一の加熱要素と第二の加熱要素の間に配置されている。環状プレート中の陥凹は電磁波照射を中央ウェル上に誘導させることができ、陥凹及び第二の加熱要素を通じて、蛍光放射が検出できるようになるので、２つのこのような加熱プレート（１つは連続したプレートであり、他の１つは環状プレートである。）を取り付けることによって、電磁波照射をベースとする検出装置を用いて装置を作動できなくすることなく、加熱を実施し得る。
典型的な実施形態において、加熱／冷却要素の少なくとも１つは、柔軟に戴置される。加熱／冷却要素を柔軟に戴置することによって、第一の加熱／冷却要素と第二の加熱／冷却要素との間に構造（例えば、第二の構造又は中央ウェル）を容易に挿入することが可能となり得る。さらに、加熱／冷却要素の少なくとも１つを柔軟に戴置することによって、柔軟な加熱／冷却要素を構造の表面に接触させ、これにより、効率的な熱伝導を可能とするように、構造（例えば、第二の構造又は中央ウェル）の表面へ柔軟な加熱／冷却要素を柔軟に適合させることが可能となり得る。
典型的な実施形態によれば、柔軟に戴置することは、加熱／冷却要素全体の柔軟な戴置である。
さらなる典型的な実施形態によれば、柔軟に戴置することは、加熱／冷却要素そのものの柔軟性である。
さらに、２つの加熱／冷却要素を柔軟に戴置することもできる。プローブ装置を挟み込むために、両加熱／冷却要素はバタフライ様式で配置し得る。同じ様式において、単一の加熱／冷却要素を押圧カウンタープレートとともに配置し得る。これにより、プローブ装置を挿入するときに、とりわけ、プローブ装置がその最終位置に到達した後に、プローブ装置の表面方向に加熱／冷却要素が移動したときに、一切の引っ掻き傷を回避し得る。
幾つかの実施形態において、加熱要素又は冷却要素の各々又は両方は、ペルティエ素子である。
温度制御ユニットを取り付け、構造中の液体の温度を制御するように適合させ得る。このような制御体は、実際の温度を測定すること、並びにこの測定に基づいて、加熱及び／又は冷却機能を実施し、これにより、温度を所望の値に調整することを含み得る。
検出ユニットを取り付け、標的分子の存在及び／又は量に対する指標となり、並びに少なくとも１つの結合要素に捕捉された化合物を構造中で検出するように適合させ得る。このような検出ユニットは、光学的検出ユニット、特に蛍光検出ユニットを含み得る。
この基材及びこのカバー要素は、互いに接続された分離した要素であり得る。あるいは、基材及びカバー要素は、異なる材料で作製され得る。
輸送ユニットを取り付け、構造及び／又は微小流体ネットワークを通じて液体を輸送するように適合させ得る。このような輸送ユニットは、ポンプ、特に、圧縮空気ポンプ、水圧式ポンプ、蠕動式ポンプ及び真空ポンプからなる群の１つを含み得る。さらに、通常の使用の間に、所望の様式で、重力が装置を通じた液体の流れを促進するように、装置を適合させ得る。従って、輸送ユニットの活動の不存在下において、液体は、所望の方向へ直接流れ得る。しかしながら、この輸送ユニットのスイッチがオンになると、この輸送ユニットの影響は重力の影響より大きくなり得、これにより、重力に逆らった方向への流体の流れを選択的に開始することが可能となる。従って、重力及び特殊な輸送ユニットの組み合わせは極めて有利であり得、エネルギーを節約する作動を可能とし得る。
この輸送ユニットは、構造中及び／又は微小流体ネットワーク中に気泡を発生させることによって、液体を輸送するように適合され得る。この装置を通じて気泡を移動させることによって、この装置を通じた液体の輸送を補助し、又は促進し得る。
少なくとも１つのフィルター、特に少なくとも１つのフリットを構造に（すなわち、中央ウェルの注入口及び／又は排出口に）配置させることができ、この構造中に配置された少なくとも１つの結合要素（例えば、ビーズ）が構造外に洗い流されないように適合させ得る。流体流の影響下で、機械的な力が、この構造中のビーズ又は他の結合要素に対して作用し得る。しかしながら、フリット（すなわち、焼結材料で作製され得る多孔性フィルター要素）が構造の注入口及び／又は排出口に取り付けられると、ビーズが中央チャンバー外に洗い流されるのを確実に防止し得る。この装置内の対応する形状の環状溝の中に挿入され得るようにするために、環状形状を有するフリットを付与し得る。
この少なくとも１つの結合要素は、表面機能化を含み得る。「表面機能化」という用語は、特異的な結合機能を実行することができるように表面が加工されている事実を表し得る。このような実施形態において、結合要素はウェルの表面の一部であり得、又はウェルの表面に結合され、又は付着され得る。
この基材及びこのカバー要素は、互いに直接接触した状態であり得る。あるいは、基材は、カバー要素と直接接触しないことができる。様々な幾何的現実化が可能である。
この構造に隣接して配置されている基材の一部は実質的に４００ｎｍと実質的に８００ｎｍの間の波長の範囲にある電磁波照射に対して透過性とすることができ、これにより、構造中での光学的検出が可能となる。従って、検出のために、可視光を使用し得る。このような検出は、光吸収、光反射又は例えば、検出されるべき分子又は複合体に付着された蛍光標識を用いた蛍光生成に基づいて行い得る。
この少なくとも１つの結合要素は、標的分子の分析中における少なくとも２つの固相カップリング手順が少なくとも１つの結合要素の正確に１つにおいて行われるように適合させ得る。換言すれば、複数の固相カップリング手順のために１つの同じ結合要素が使用され得る。例えば、試料から標的分子を捕捉するために、付着された基を有するビーズを使用し得、その後の検出のための基礎として、増幅及び標識された標的分子などの化合物を捕捉するために、その後使用され得る。
あるいは、この少なくとも１つの結合要素は、標的分子の分析中における少なくとも２つの固相カップリング手順が少なくとも１つの結合要素の異なる要素において行われるように適合させ得る。 例えば、装置は複数の結合要素を含み、標的分子の分析の間の少なくとも２つの固相カップリング操作が少なくとも１つの結合要素の２つ又はそれ以上において起こるように、少なくとも１つの結合要素が適合される。このような構成では、例えば、一方で試料由来の捕捉分子及び他方で標的分子の指標となる検出成分は、結合要素の異なる２つの種類を用いて捕捉される。例えば、試料から標的分子を捕捉するために、ビーズが提供され得る。他方で、試料中の標的分子の存在又は量に対する指標となる成分、例えばレポーター化合物を捕捉するための競合アッセイにおいて、捕捉分子、例えば、ウェル中に固定化されたレポーター特異的捕捉分子を使用し得る。
本発明の別の典型的な実施形態によれば、方法は、それぞれ標的核酸と捕捉分子を含む複合体を形成させること（各捕捉分子は標的核酸のある領域に対して特異的な結合部分とアンカー基を含む。）；複合体を結合要素と接触させること（結合要素は、複合体を結合要素に結合させるために捕捉分子のアンカー基を結合するように構成されている。）；１つ又はそれ以上の標的核酸を増幅に供すること；結合要素に関して、増幅された標的核酸を捕捉すること；並びに捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することを含む。
この１つ又はそれ以上の標的核酸は、一本鎖又は二本鎖核酸であり得る。
この方法は、１つ又はそれ以上の標的核酸を増幅に供する前に、標的核酸を逆転写に供することをさらに含み得る。
この方法は、捕捉された、増幅された標的核酸を結合要素から放出させること、並びに１つ又はそれ以上の標的核酸を増幅に供する工程及び結合要素に関して、増幅された標的核酸を捕捉する工程を反復することをさらに含み得る。このような実施形態において、捕捉された、増幅された標的核酸を結合要素から放出させること、並びに１つ又はそれ以上の核酸を増幅に供する工程及び結合要素に関して、増幅された標的核酸を捕捉する工程を反復するサイクルは、少なくとも１０回、又は少なくとも２０回実施され得る。
捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値は、捕捉された、増幅された標的核酸を結合要素から放出させ、並びに１つ又はそれ以上の標的核酸を増幅に供する工程及び結合要素に関して、増幅された標的核酸を捕捉する工程を反復する少なくとも１つのサイクル後に、例えば、各サイクル後に測定され得る。
この結合要素は、標的核酸を捕捉することができる１つ又はそれ以上の捕捉分子を含み得る。このような実施形態において、１つ又はそれ以上の捕捉分子により、標的核酸は、結合要素に関して捕捉される。
この結合要素は、粒子をさらに含み得る。
それぞれ標的核酸と捕捉分子を含む複合体を形成させる工程は、複合体を結合要素と接触させる工程とは空間的に隔てて実施し得る。
この方法は、標的核酸を標識することをさらに含み得る。この標的核酸は、例えば、１つ又はそれ以上の標的核酸を増幅に供する前若しくは間に、及び／又は増幅された標的核酸を、結合要素に関して捕捉する前に、１つ又はそれ以上の検出可能なマーカーを添加することによって標識され得る。この１つ又はそれ以上の検出可能なマーカーは、蛍光マーカーであり得る。
捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる１つ又はそれ以上の値の測定は、得られた１つ又はそれ以上の指標値の時間依存的モニタリングを含み得る。
この方法は、それぞれ標的核酸と捕捉分子を含む複合体を形成させる前に、１つ又はそれ以上の標的核酸を提供することをさらに含み得る。この１つ又はそれ以上の標的核酸を提供する工程は、生物学的材料から標的核酸を放出させることを含み得る。このような実施形態において、生物学的材料は１つ又はそれ以上の原核細胞、１つ又はそれ以上の真核細胞、１つ又はそれ以上の赤血球及び１つ又はそれ以上のウイルス粒子並びにこれらの混合物からなる群から選択され得る。さらに、生物学的材料からの標的核酸を放出させることは、生物学的材料を溶解試薬と接触させることを含み得る。
この１つ又はそれ以上の標的核酸を提供することは、１つ又はそれ以上の標的核酸を含む試料を提供することを含み得、試料は、全血、血漿、血清、尿、痰及び脳脊髄液からなる群から選択され得る。
この１つ又はそれ以上の標的核酸を提供することは、それぞれ標的核酸と捕捉分子を含む複合体を接触させること、１つ又はそれ以上の標的核酸を増幅に供すること、結合要素に関して、増幅された核酸を捕捉すること、並びに捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することから空間的に分離して実施し得る。
この方法は、１つ又はそれ以上の標的核酸をきょう雑物質から分離することをさらに含み得る。
さらなる実施形態において、この典型的な実施形態に係る方法は、上記のような装置中で実施される。例えば、方法は、堅固な基材と、該基材を少なくとも部分的に覆う柔軟なカバー要素と、基材中に形成され、液体を収容するように適合され、及び１つ又はそれ以上の細胞、芽胞又はウイルスの内容物を放出するように適合された第一の構造と（内容物は、標的核酸などの標的分子含む。）、基材中に形成され、液体を収容するように適合され、並びに標的分子を捕捉するように及び標的分子の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定するように適合された少なくとも１つの結合要素を含む第二の構造と、少なくとも第一の構造と第二の構造を相互接続する微小流体ネットワークと、並びに微小流体ネットワークの一部を選択的に閉鎖するために基材に対して柔軟なカバー要素を押圧することによって第一の構造と第二の構造の間に流体流を生じさせるように適合されたアクチュエータユニットとを含む装置において実施され得る。さらに、方法は、液体を収容するように適合された構造と（該構造は、少なくとも１つの結合要素を含み、微小流体ネットワークと流体連通している。）並びに少なくとも１つの結合要素に標的核酸などの標的分子が捕捉される様式で微小流体ネットワークを通じた流体流を調節するように適合され、構造中での標的分子の増幅を調節するように適合され、及び少なくとも１つに結合要素に捕捉された化合物の検出を調節するように適合された調節ユニットとを含む装置において実施し得る。
この装置は、液体を収容するように適合された第一の構造を含み得る。このような実施形態において、それぞれ標的核酸と捕捉分子を含む複合体は、第一の構造中で形成される。
さらに、この装置は、１つ又はそれ以上の標的核酸を検出するように構成され、並びに第二のウェルを覆うカバー要素及び該カバー要素を変形させるために作動されるように適合されたアクチュエータユニットを含む第二の構造を含み得る。このような実施形態において、捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することは、第二の構造中で実施され得る。
さらに、１つ若しくはそれ以上の標的核酸を増幅に供すること、及び／又は結合要素に関して、増幅された標的核酸を捕捉することも、第二の構造中でも実施され得る。
捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値の測定は、カバー要素を変形させるように作動されるアクチュエータを用いて実施し得る。このカバー要素は、第二の構造又は中央ウェル又は検出ウェルの容積が減少するように変形させ得る。このような実施形態において、捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定した後に、第二のウェルの容積は再度増加させ得る。
本発明の別の典型的な実施形態によれば、以下を含む方法が提供される。レポーター化合物のある量；捕捉分子のアンカー基を結合するように構成されている第一の結合要素；レポーター化合物を捕捉することができる第二の結合要素；レポーター化合物と複合体を形成することができる標的核酸のある量（レポーター化合物との複合体の形成は第二の結合要素によるレポーター化合物の捕捉を阻害する。）；及び捕捉分子のある量（各捕捉分子は標的核酸のある領域に対して特異的な結合部分及びアンカー基を含む。）を提供すること；それぞれ標的核酸及び捕捉分子を含む複合体を形成させること；複合体を第一の結合要素に結合させるために、複合体を第一の結合要素と接触させること；第一の結合要素から標的核酸の量の少なくとも一部を放出させること；標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させること；
第二の結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉すること；並びに第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる１つ又はそれ以上の値を測定すること。
このレポーター化合物は、１つ又はそれ以上の検出可能な標識、例えば、２つの検出可能な標識を含み得る。１つ又はそれ以上の検出可能な標識は、蛍光標識であり得る。
さらに、このレポーター化合物はオリゴヌクレオチドであり得る。
この方法は、第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値に基づいて、標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することをさらに含み得る。
この方法は、第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定する工程の後に、レポーター化合物の量の残りの一部を第二の結合要素から放出させること；標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させること；第二の結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉すること；並びに第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標と値を測定することをさらに含み得る。このような実施形態において、放出させる、複合体を形成させる、捕捉する及び測定する工程は、Ｎ回のさらなる回数（Ｎは、1より大きい又は１に等しい整数、例えば、Ｎ＞５、Ｎ＞１０又はＮ＞２０である。）実施され得る。
さらに、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程及び第二の結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程は同時に実施し得る。
この方法は、標的核酸を増幅に供することをさらに含み得る。このような実施形態において、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程の前に、標的核酸の増幅が開始され得る。
標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程及び第二の結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程が化学的平衡状態になる前に、第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値が測定され得る。特に、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成する工程及び第二の結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程を開始してから１秒ないし１２０秒後に、第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値が測定され得る。
この方法は、標的核酸を増幅に供する前に、標的核酸を逆転写に供することをさらに含み得る。
第二の結合要素は、第二の結合要素上のレポーター化合物を捕捉することができる１つ又はそれ以上の異なるレポーター特異的捕捉分子を含み得る。このような実施系チアにおいて、捕捉分子はオリゴヌクレオチドであり得る。異なるレポーター特異的捕捉分子が第二の結合要素に関して異なる位置の上に配置され得る。さらに、このレポーター化合物は、レポーター特異的捕捉分子と複合体を形成させることによって、第二の結合要素上に捕捉させ得る。標的核酸と複合体を形成することが可能なレポーター化合物の相互作用部位の少なくとも一部はレポーター特異的捕捉分子と複合体を形成することも可能であり得る。レポーター特異的捕捉分子及び標的核酸は、レポーター化合物との複合体の形成に関して競合し得る。
この増幅は、二本鎖核酸を変性させる工程を含み得る。二本鎖核酸は、標的核酸とのレポーター化合物の複合体、レポーター特異的捕捉分子とのレポーター化合物の複合体、レポーター化合物の二本鎖及び標的核酸の二本鎖を含み得る。
この増幅は、プライマー分子を標的核酸に徐冷させる工程をさらに含み得る。この実施形態において、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程及び／又は第二の結合要素上の、標的核酸と複合体を形成しないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程と同時に徐冷工程が実施され得る。
この増幅は、循環増幅、例えばＰＣＲであり得る。ＰＣＲを実施することは、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用することを含み得る。この循環増幅は、少なくとも１０サイクル又は少なくとも２０サイクルを含み得る。
第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値は、循環増幅の少なくとも１つのサイクル後に、例えば各サイクル後に測定され得る。さらに、標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値が、第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定した後に毎回測定され得る。
第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することは、指標値の時間依存的モニタリングを含み得る。
さらに、標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値は、レポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値と相関させる較正曲線に基づいて測定され得る。
この典型的な実施形態の方法は、上に記載されているような装置中で実施することもできる。例えば、方法は、堅固な基材と、該基材を少なくとも部分的に覆う柔軟なカバー要素と、基材中に形成され、液体を収容するように適合され、及び１つ又はそれ以上の細胞、芽胞又はウイルスの内容物を放出するように適合された第一の構造と（内容物は、標的核酸を含む。）、基材中に形成され、液体を収容するように適合され、並びに標的核酸を捕捉するように及び標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定するように適合された少なくとも１つの結合要素を含む第二の構造と、少なくとも第一の構造と第二の構造を相互接続する微小流体ネットワークと、並びに微小流体ネットワークの一部を選択的に閉鎖するために基材に対して柔軟なカバー要素を押圧することによって第一の構造と第二の構造の間に流体流を生じさせるように適合されたアクチュエータユニットとを含む装置において実施され得る。方法は、液体を収容するように適合された構造と（該構造は、少なくとも１つの結合要素を含み、及び微小流体ネットワークと流体連通している。）並びに少なくとも１つの結合要素に標的核酸が捕捉される様式で微小流体ネットワークを通じた流体流を調節するように適合され、構造中での標的核酸の増幅を調節するように適合され、及び少なくとも１つの結合要素に捕捉された化合物の検出を調節するように適合された調節ユニットとを含む装置において実施することもできる。
この装置は、液体を収容するように適合された第一の構造をさらに含み得る。このような実施形態において、それぞれ標的核酸と捕捉分子を含む複合体を形成させる工程は、第一の構造中で実施される。
この装置は液体を収容するように適合された第二の構造をさらに含むことができ、第一の結合要素、及び必要に応じて第二の結合要素は第二の構造中に付与され得る。このような実施形態において、それぞれ標的核酸及び捕捉分子を含む複合体を形成させること；複合体を第一の結合要素に結合させるために、複合体を第一の結合要素と接触させること；第一の結合要素から標的核酸の量の少なくとも一部を放出させること；標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させること；第二の結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉すること；並びに第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することは、第二の構造、例えば、中央ウェル中で行われる。
捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量の指標となる値の測定は、カバー要素を変形させるように作動されるアクチュエータを用いて実施し得る。カバー要素は、中央ウェル又は第二の構造又は検出ウェルの容積が低下するように変形され得る。このような実施形態において、中央ウェルの容積は、同じく、捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定した後に増加させ得る。
１つ又はそれ以上の標的核酸を提供することは、１つ又はそれ以上の標的核酸を有する試料を提供することを含み得る。試料は、１μＬから５０μＬの容量を有する液体試料であり得る。さらに、試料は、液体全血試料であり得る。
方法は、標的分子又はレポーター特異的捕捉分子と複合体を形成していないレポーター化合物と複合体を形成することができる消光化合物の一定量を添加することをさらに含み得る。消光化合物は、標識による検出可能なシグナルの生成を妨害する１つ又はそれ以上の部分（例えば、蛍光色素の励起から生じた発光を「乗っ取る」消光基）を含み得る。例えば、消光基は、レポーター化合物の検出可能な標識によって発せられたシグナル（例えば、蛍光シグナル）を抑制又は阻害することが可能であり得る。このような実施形態において、消光化合物は、１つ又はそれ以上の消光基が複合体内のレポーター化合物の検出可能な標識と近接するように、標的分子又はレポーター特異的捕捉分子と複合体を形成していないレポーター化合物と複合体を形成することが可能であり得る。
消光化合物は、オリゴヌクレオチドであり得る。この実施形態において、消光オリゴヌクレオチドは、レポーターオリゴヌクレオチドの配列領域と相補的であり、従って、消光化合物とレポーター化合物間の塩基対形成を可能とする少なくとも１つの特異的な配列領域を含み得る。
消光基には、例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｑｘｌ消光物質（ＡｎａＳｐｅｃ）及びＩｏｗａ ｂｌａｃｋ ｑｕｅｎｃｈｅｒなどの一般的な消光物質が含まれ得る。
消光化合物は、上記装置の第二の構造中に付与され得る。このような実施形態において、消光化合物は、第二の結合要素上に捕捉されていないレポーター化合物と複合体を形成し得る。
上記装置の第二の構造は、標的核酸の増幅を開始させる前に、不可逆的に密封され得る。第二の構造の不可逆的な密封は、例えば、第二の構造と接続された熱密封性チャネル及び／又はバルブによって、第二の構造の注入口及び必要に応じて排出口を密封する（例えば、溶接する）ことによって達成され得る。
別の典型的な実施形態によれば、二本鎖アンプリコンを形成させるために、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを増幅すること、アンプリコンを選択的に結合するように構成された表面と（例えば、アンカー基と）、及びアンカー基によって表面に結合されたアンプリコンとアンプリコンを接触させること、アンプリコンの存在を光学的に測定すること、を含む方法が提供される。方法は、光学的に検出する工程後に、アンプリコンを表面から放出させること、放出されたアンプリコンを少なくとも１つ以上の増幅サイクルに供すること、得られたアンプリコンを表面と、及びアンカー基によって表面に結合されたアンプリコンと接触させること、アンプリコンの存在を光学的に測定すること、をさらに含み得る。方法は、Ｎ回のさらなる回数（Ｎは、１より大きい又は１に等しい整数である。）、放出、増幅に供すること、接触及び光学的測定の工程を実施することをさらに含み得る。特に、Ｎ＞５、より具体的にはＮ＞１０、さらに具体的には、Ｎ＞２０である。
この方法は、増幅の工程の前に、標的ポリヌクレオチドを提供すること、それぞれ病原体から放出された標的ポリヌクレオチド及び少なくとも１つの捕捉分子を含む複合体を形成させること（各捕捉分子は標的ポリヌクレオチドのある領域に対して特異的な結合部分とアンカー基を含む。）、並びに複合体を表面と接触させること（表面は、複合体及び表面を非選択的に結合するために、捕捉分子のアンカー基を非選択的に結合するように構成されている。）をさらに含み得る。このような方法において、ポリヌクレオチドを提供することは、標的ポリヌクレオチドを含む、１つ又はそれ以上の細胞、芽胞又はウイルスの内容物を放出させることを含み得る。放出の工程は、１つ又はそれ以上の細胞、芽胞又はウイルスを含む試料を、溶解試薬及び捕捉分子と接触させることを含み得る。試料を溶解試薬及び捕捉分子と接触させる工程は、試料を、凍結乾燥された形態の溶解試薬及び捕捉分子と接触させることを含み得る。
このような方法において、標的ポリヌクレオチドを提供する工程は付属物質を提供することを含み得、この方法は、表面に結合された複合体と付属物質を分離することをさらに含み得る。このような方法において、付属物質は、ポリヌクレオチドがそこから放出される少なくとも１つの細胞、芽胞又はウイルスの内容物を含むことができる。表面は、粒子の表面であり得る。
別の典型的な実施形態によれば、１つ又はそれ以上の標的ポリヌクレオチドを提供すること、それぞれ標的ポリヌクレオチド及び少なくとも１つの捕捉分子を含む複合体を形成させること（各捕捉分子は標的ポリヌクレオチドのある領域に対して特異的な結合部分とアンカー基を含む。）、並びに複合体を表面と接触させること（表面は、複合体及び表面を非選択的に結合させるために、捕捉分子のアンカー基を非選択的に結合するように構成されている。）を含む方法が提供される。このような方法において、提供する工程は、１つ又はそれ以上の細胞、芽胞又はウイルスの内容物を放出させることを含むことができ、内容物はポリヌクレオチドを含む。この方法は、表面に結合された複合体と１つ又はそれ以上の細胞、芽胞又はウイルスから放出された他の内容物と分離することをさらに含み得る。
別の典型的な実施形態によれば、レポーター化合物の量、レポーター化合物を捕捉することができる結合要素及びレポーター化合物と複合体を形成することができる標的核酸の量を含む組成物を形成させること（レポーター化合物との複合体の形成は結合要素によるレポーター化合物の捕捉を阻害する。）；標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させること；結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉すること；並びに結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することを含む方法が提供される。
換言すれば、この方法は、レポーター化合物の量の一部の複合体を標的核酸の量の少なくとも一部と複合体を形成させること及び標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を結合要素上に捕捉させることを含み得る。
この方法は、バイオセンサーアッセイ装置、微小流体カートリッジ及びラブ・オン・チップ（ｌａｂ ｏｎ ｃｈｉｐ）からなる群から選択される装置中で実施され得る。
幾つかの実施形態において、方法は、結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値に基づいて、標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することをさらに含む。結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値の測定は、指標値の時間依存的モニタリングを含み得る。特定の実施形態において、標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値は、レポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値と相関させる較正曲線に基づいて測定される。
他の実施形態において、方法は、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程の後に、結合要素からレポーター化合物の量の残りの一部を放出させること、結合要素上の標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉すること、並びに結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することをさらに含む。
放出、複合体の形成、捕捉並びにレポーター及び／又は標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定する工程は、Ｎ回のさらなる回数（Ｎは、１より大きい又は１に等しい整数である。）実施され得る。特定の実施形態において、Ｎは、＞５、＞１０又は＞２０である。
この方法は、複合体を形成させる工程の前に、結合要素上に、レポーター化合物の量の少なくとも一部を捕捉させること；結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定すること；並びに、捕捉されたレポーター化合物を結合要素から放出させること、をさらに含み得る。
幾つかの実施形態において、さらに、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程及び結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程は同時に実施される。
さらなる実施形態において、方法は、標的核酸を増幅に供することを含む。標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程の前に、標的核酸の増幅が開始され得る。
標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体の形成、及び結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部の捕捉が化学的平衡状態になる前に、結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値が測定され得る。幾つかの実施形態において、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程及び結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程から１秒ないし１２０秒後に、指標値が測定される。
このレポーター化合物は、１つ又はそれ以上の検出可能な標識、例えば２つの検出可能な標識を含み得る。特定の実施形態において、この１つ又はそれ以上の検出可能な標識は、蛍光標識である。他の特定の実施形態において、このレポーター化合物はオリゴヌクレオチドである。
他の実施形態において、方法は、標的核酸を増幅に供する前に、標的核酸を逆転写に供することをさらに含む。
他の実施形態において、組成物を形成する工程は、第一のレポーター化合物のある量と、第一のレポーター化合物と複合体を形成することができる第一の標的核酸ある量と（第一のレポーター化合物との複合体の形成は結合要素による第一のレポーター化合物の捕捉を阻害する。）、第二のレポーター化合物のある量と、及び第二のレポーター化合物と複合体を形成することができる第二の標的核酸のある量（第二のレポーター化合物との複合体の形成は結合要素による第二のレポーター化合物の捕捉を阻害する。）とを含む組成物を形成することを含む。
方法において使用される結合要素は、結合要素上にレポーター化合物を捕捉することができる１つ又はそれ以上の異なる捕捉分子を含み得る。この捕捉分子は、レポーター特異的捕捉分子とも表記され得る。特定の実施形態において、この捕捉分子はオリゴヌクレオチドである。異なる捕捉分子は、結合要素に関して、異なる位置の上にも配置され得る。
レポーター化合物は、捕捉分子との複合体を形成することによって、結合要素上に捕捉され得る。特定の実施形態において、標的核酸と複合体を形成することが可能なレポーター化合物の相互作用部位の少なくとも一部は捕捉分子と複合体を形成することもできる。他の特定の実施形態において、捕捉分子及び標的核酸は、レポーター化合物との複合体の形成に関して競合する。
他の実施形態において、増幅は、二本鎖核酸を変性させる工程を含む。二本鎖核酸は、標的核酸とのレポーター化合物の複合体、捕捉分子とのレポーター化合物の複合体、レポーター化合物の二本鎖及び標的核酸の二本鎖を含み得る。
この増幅は、プライマー分子を標的核酸に徐冷させる工程も含み得る。標的核酸の量の少なくとも一部とのレポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程及び／又は結合要素上の標的核酸と複合体を形成しないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程と同時に徐冷工程が実施され得る。
この増幅は、循環増幅であり得る。特定の実施形態において、循環増幅はＰＣＲである。循環増幅は、少なくとも１０サイクル又は少なくとも２０サイクルを含み得る。他の実施形態において、ＰＣＲを実施することは、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用することを含む。
結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値は、循環増幅の少なくとも１つのサイクル後に測定され得る。特定の実施形態において、この値は、循環増幅の各サイクル後に測定される。他の実施形態において、標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値が、結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定した後に毎回測定される。
方法は、標的分子又はレポーター特異的捕捉分子と複合体を形成していないレポーター化合物と複合体を形成することができる消光化合物の一定量を添加することをさらに含み得る。消光化合物は、標識による検出可能なシグナルの生成を妨害する１つ又はそれ以上の部分（例えば、蛍光色素の励起から生じた発光を「乗っ取る」消光基）を含み得る。例えば、消光基は、レポーター化合物の検出可能な標識によって発せられたシグナル（例えば、蛍光シグナル）を抑制又は阻害することが可能であり得る。このような実施形態において、消光化合物は、１つ又はそれ以上の消光基が複合体内のレポーター化合物の検出可能な標識と近接するように、標的分子又はレポーター特異的捕捉分子と複合体を形成していないレポーター化合物と複合体を形成することが可能であり得る。
消光化合物は、オリゴヌクレオチドであり得る。この実施形態において、消光オリゴヌクレオチドは、レポーターオリゴヌクレオチドの配列領域と相補的であり、従って、消光化合物とレポーター化合物間の塩基対形成を可能とする少なくとも１つの特異的な配列領域を含み得る。
消光基には、例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｑｘｌ消光物質（ＡｎａＳｐｅｃ）及びＩｏｗａ ｂｌａｃｋ消光物質などの一般的な消光物質が含まれ得る。
別の典型的な実施形態によれば、流体状態の試料を収容するように適合された装置中に、液体全血試料を導入すること；並びに装置中で行われた分析に基づいて、全血試料中のウイルス感染と関連する核酸の存在及び／又は量の指標となる値を測定することを含む、方法が提供される。特に、測定された値は、ウイルス感染と関連する全核酸の存在及び／又は量の指標であり得る。装置中に導入された全血試料の容量は、１μＬから５０μＬであり得る。
幾つかの実施形態において、方法は、ウイルス感染と関連する全核酸の存在及び／又は量の指標となる値に基づいて、感染された患者中のウイルス負荷量の指標となる値を測定することをさらに含む。
他の実施形態において、流体全血試料は、患者から直接装置中に導入される。特に、流体全血試料は、患者の指先の穿刺から取得され得る。方法は、キャピラリーが指先と接触した状態を保ちながら、指先での穿刺から得られた血液をキャピラリーと接触させることをさらに含み得る。一実施形態において、方法は、キャピラリー及び血液を接触させた後に、キャピラリーを装置に接続させることをさらに含む。
別の典型的な実施形態によれば、１μＬから５０μＬの容量を有する流体試料を準備すること；並びに流体試料中のウイルス感染と関連する核酸の存在及び／又は量の指標となる値を測定することを含む方法が提供される。幾つかの実施形態によれば、方法は、流体状態の試料を収容するように適合された装置中に、流体試料を導入すること；並びに装置中で行われた分析に基づいて、流体試料中のウイルス感染と関連する核酸の存在及び／又は量の指標となる値を測定することをさらに含む。測定された値は、ウイルス感染と関連する全核酸の存在及び／又は量の指標であり得る。
幾つかの実施形態において、方法は、ウイルス感染と関連する全核酸の存在及び／又は量の指標となる値に基づいて、感染された患者中のウイルス負荷量の指標となる値を測定することをさらに含む。
さらなる実施形態において、流体試料は、処理されていない全血試料であり得る全血試料である。さらに、流体試料の容量は、１μｌから１０μｌであり得る。
特定の実施形態において、ウイルス感染は、ＨＩＶによる感染である。
方法の実施形態中で使用されている装置は、流体試料中のウイルス感染と関連する核酸を検出するために適合され得る。さらなる実施形態において、装置は、バイオセンサーアッセイ装置、微小流体カートリッジ及びラブオンチップからなる群から選択される。
幾つかの実施形態において、装置中において行われた分析は、試料から核酸を放出させることをさらに含み、放出は流体試料を可溶化試薬と接触させることを含み得る。
分析は、複合体を形成することも含み得、各複合体はウイルス感染と関連する核酸及び捕捉分子を含み、各捕捉分子はアンカー基及びウイルス感染と関連する核酸の領域に対して特異的な結合部分を含む。
他の実施形態において、装置中で行われた分析は装置の第一の結合要素と複合体を接触させることをさらに含み、第一の結合要素は捕捉分子のアンカー基を結合するように、従って、第一の結合要素へ複合体を結合するように構成されている。複合体を形成する工程は、複合体を第一の結合要素と接触させる工程から空間的に分離して実施され得る。
幾つかの実施形態において、分析は、典型的にはＰＣＲによる、検出されるべき核酸の増幅をさらに含む装置中で行われる。増幅された核酸は、第一の結合要素に関して捕捉され得る。
分析は、ウイルス感染と関連する核酸との複合体を形成することができるレポーター化合物の一定量及びレポーター化合物を捕捉することができる第二の結合要素を準備することをさらに含むことができ、核酸との複合体の形成は、第二の結合要素によるレポーター化合物の捕捉を阻害する。
幾つかの実施形態において、方法は、ウイルス感染と関連する核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させること；第二の結合要素上のウイルス感染と関連する核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉すること；並びに第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量の指標となる値を測定すること；並びに、レポーター化合物の量の指標となる値に基づいて、ウイルス感染と関連する核酸の量の指標となる１つ又はそれ以上の値を必要に応じて測定することを含む。
さらに、方法は、レポーター分子を第二の結合要素から放出させながら、ウイルス感染と関連する核酸を増幅に供することを含み得る。
別の典型的な実施形態において、本発明は、ＨＩＶを検出するために及び／又は患者中のＨＩＶ負荷量を測定するための、本明細書中に定義されている方法の使用に向けられる。
別の典型的な実施形態において、本発明は、診断マーカーとしての、全ウイルス核酸の量の使用に関する。特定の実施形態において、全ウイルス核酸の量は、本明細書中に記載されている方法によって測定される。
他の特定の実施形態において、診断マーカーとして使用される全ウイルス核酸は、ＨＩＶ核酸である。マーカーとして使用される全ＨＩＶ核酸の量は、ＨＩＶを検出し、患者中のＨＩＶ負荷量を測定し、ＨＩＶに感染した患者中での疾病の進行をモニタリングし、及び／又はＨＩＶに感染した患者の抗ウイルス治療の効率性をモニタリングするための指標であり得る。全ＨＩＶ核酸の量は、遊離のウイルス及び細胞に随伴したウイルスに由来する核酸を含むことができ、この核酸は、次いで、遊離のウイルスに由来するＲＮＡ、細胞に随伴したウイルスに由来するＲＮＡ、プロウイルスＤＮＡ、逆転写されたウイルスＤＮＡ及び転写されたプロウイルスＲＮＡを含み得る。
上記方法の何れか１つを実施するように構成された装置が提供され得る。
上記態様及びさらなる態様は、本明細書中の以下に記載されるべき実施形態の実施例から明らかとなり、実施形態のこれらの実施例を参照しながら説明される。
以下でさらに詳しく典型的な実施形態が記載されているが、本発明を以下の実施形態に限定するものではない。図面中の図解は、模式的なものである。異なる図面中で、類似又は同一の要素が同じ参照記号を用いて提供されている。
図１ａは、典型的な実施形態に従うポリヌクレオチドアッセイ法のフローチャートである。 図１ｂは、典型的な実施形態に従って図１ａの方法を実施する上で有用な検出システムの図である。 図１ｄは、粒子に結合されたアンプリコンを示している。 図１ｅは、粒子に結合されたアンプリコンを示している。 図２は、図１ｂ及び１ｃの検出システムにおける使用に適した、典型的な実施形態に係るアッセイ装置を図解する。 図３は、装置を作動させるためのステンシルアクチュエータとともに示されている図２のアッセイ装置である。 図４は、新鮮な緩衝液又は凍結乾燥された溶解緩衝液（溶解緩衝液は、機能の喪失なしに、溶解乾燥されたペレットとして保存することができる。）の何れかを用いて実施されたアッセイの結果（ＲＴ−ＰＣＲ産物曲線及びゲル電気泳動）を示している。 図５は、血液−溶解混合物から得られたオリゴヌクレオチド（すなわち、ＨＩＶＲＮＡ）を捕捉するために使用されるストレプトアビジンセファローススラリーの量の効果を示しており、ストレプトアビジンセファローススラリーの２００μｌ、１００μｌ又は５０μｌを用いて実施されたアッセイの結果から、スラリー５０μｌの結合能が実質的に全てのＲＮＡ分子を捕捉するのに十分であることが明らかとなる。 図６は、血液−溶解混合物から得られたオリゴヌクレオチド（すなわち、ＨＩＶＲＮＡ）を捕捉するために使用されるストレプトアビジンセファローススラリーの量の効果を示しており、ストレプトアビジンセファローススラリーの10μＬ及び7μＬを用いて実施されたアッセイの結果から、スラリー１０μＬの結合能が実質的に全てのＲＮＡ分子を捕捉するのに十分であることが明らかとなる。 図７は、分析されるべきポリヌクレオチドと捕捉プローブの間での複合体形成（すなわち、ハイブリッド形成）に対する温置時間の効果を示しており、温置時間の２分後には、ポリヌクレオチドの大幅な量が回収されないのに対して、温置の１０分後には、上清中にＲＮＡを全く検出することができない。 図８は、分析されるべきポリヌクレオチドと捕捉プローブの間での複合体形成（すなわち、ハイブリッド形成）に対する、温置時間の効果を示している。 図９は、捕捉工程（すなわち、ストレプトアビジンセファロース粒子への、複合体のビオチンアンカー基の結合）に対する温置時間の効果を示しており、温置時間の５分が、全てのポリヌクレオチド分子を捕捉する（すなわち、ＲＮＡ分子が上清中に検出されない。）のに十分であることを示している。 図１０は、新鮮なストレプトアビジンセファロース粒子又は数時間又は７日間の保存後の凍結乾燥されたストレプトアビジンセファロース粒子（ストレプトアビジンセファロース粒子は、機能の喪失なしに、溶解乾燥し、再構成することができる。）の何れかを用いて実施されたアッセイ（ＲＴ−ＰＣＲ産物曲線）の結果を示している。 図１１は、新鮮な洗浄緩衝液又は凍結乾燥された洗浄緩衝液（洗浄緩衝液は、機能の喪失なしに、溶解乾燥し、再構成することができる。）の何れかを用いて実施されたアッセイの結果（ＲＴ−ＰＣＲ産物曲線）を示している。 図１２は、ストレプトアビジンセファロース粒子のＲＴ−ＰＣＲとの適合性を示すために実施された試験（ＲＴ−ＰＣＲ産物曲線及びアガロースゲル電気泳動）の結果を示しており、ストレプトアビジンセファロース粒子スラリー１０μＬは、増幅効率の喪失なしに、ＲＴ−ＰＣＲ増幅へ適用され得る。 図１３は、典型的な実施形態に従うアッセイの特異性を示しており、結果（（ＲＴ−ＰＣＲ産物曲線及びアガロースゲル電気泳動）は、ＨＩＶ−ＲＮＡがストレプトアビジンセファロース粒子に非特異的に（すなわち、捕捉プローブの不存在下で）結合せず、且つ溶解工程の間にも放出されるヒト血液細胞のＲＮＡが一切捕捉／増幅されないことを示している。 図１４は、ストレプトアビジンセファロース粒子上でのアンプリコン検出の蛍光画像を示しており、ビオチン標識されたアンプリコンは、ストレプトアビジンセファロース粒子上に捕捉され、捕捉されたアンプリコンへの蛍光標識プローブのハイブリッド形成後に可視化された。 図１５は、アガロースゲル電気泳動が、さらなる処理工程（すなわち、溶出、希釈又は濃縮）なしに、増幅のためのテンプレートとして、ストレプトアビジンセファロース粒子上に捕捉されたポリヌクレオチド（すなわち、ＨＩＶ−ＲＮＡ）を直接使用できることを示していることを図解する。 図１６は、ストレプトアビジンセファロース粒子の各蛍光画像を示しており、陰性プローブと比べて、より多くの蛍光性ストレプトアビジンセファロース粒子が陽性プローブ中に検出される。 図１７は、典型的な実施形態に係る装置を模式的に図解している。 図１７は、典型的な実施形態に係る装置を模式的に図解している。 図１７は、典型的な実施形態に係る装置を模式的に図解している。 図１７は、典型的な実施形態に係る装置を模式的に図解している。 図１８は、別の典型的な実施形態に係る装置の前面を図解している。 図１９は、図１８の装置の背面を図解している。 図２０は、典型的な実施形態に係る装置の平面図を表している。 図２１は、典型的な実施形態に係る装置の断面図を表している。 図２２は、本発明に従ってポリヌクレオチドを検出するための競合的方法の典型的な実施形態を模式的に図解している。 図２３は、試料中のヒトポリオウイルス１ＤＮＡの量を測定するための本発明に係る競合的アッセイの典型的な実施形態の結果を示している。 図２４は、試料中のＨＩＶｇａｇ／ｅｎｖＰＣＲ産物の量を測定するためのアレイをベースとする本発明の競合的アッセイの典型的な実施形態の原理及び結果を示している。 図２５は、図２４に示されているアッセイの間の様々な工程を図解している。 図２６は、本発明のポリヌクレオチドを検出するための競合的方法の典型的な実施形態を模式的に図解している。 図２６は、本発明のポリヌクレオチドを検出するための競合的方法の典型的な実施形態を模式的に図解している。 図２６は、本発明のポリヌクレオチドを検出するための競合的方法の典型的な実施形態を模式的に図解している。 図２６は、本発明のポリヌクレオチドを検出するための競合的方法の典型的な実施形態を模式的に図解している。 図２７は、試料中のＨＩＶサブタイプＢ及びＨＩＶサブタイプＯ２の量を測定するための本発明の競合的アッセイの典型的な実施形態の結果を示している。 図２７は、試料中のＨＩＶサブタイプＢ及びＨＩＶサブタイプＯ２の量を測定するための本発明の競合的アッセイの典型的な実施形態の結果を示している。 図２８は、試料中のＨＩＶサブタイプＢの様々な量を測定するための本発明の競合的アッセイの典型的な実施形態の結果を示している。 図２８は、試料中のＨＩＶサブタイプＢの様々な量を測定するための本発明の競合的アッセイの典型的な実施形態の結果を示している。 図２９は、ＨＩＶ陽性患者から得た血漿及び全血試料中のＨＩＶ−１ＲＮＡのそれぞれのコピー数を測定するＰＣＲを基礎とするアッセイの結果を示している。ＨＩＶ−１ＲＮＡの少なくとも４０コピーが検出された試料のみが、分析中に含められている。 図３０は、ＨＩＶ−１ＲＮＡの４０コピー又はそれ以下が検出された血漿試料に対する、図２９に示されているＰＣＲを基礎とするアッセイの結果を示している。 図３１は、図２９に従う別のＰＣＲを基礎とするアッセイの結果を示している。 図３２から３４は、抗ウイルス療法を受けている異なるＨＩＶ陽性患者のそれぞれの血漿及び全血ウイルス負荷量を図示している。 図３２から３４は、抗ウイルス療法を受けている異なるＨＩＶ陽性患者のそれぞれの血漿及び全血ウイルス負荷量を図示している。 図３２から３４は、抗ウイルス療法を受けている異なるＨＩＶ陽性患者のそれぞれの血漿及び全血ウイルス負荷量を図示している。 図３５は、全血及び血漿試料中のウイルスのコピー数の典型的な経時変化を図示している。 図３６は、別の典型的な実施形態に従う装置を模式的に示している。
詳細な説明
生物学的試料の分析は、１つ又はそれ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はｒＲＮＡ）が試料中に存在するかどうかを測定することを含み得る。例えば、特定の病原体の存在の指標となるポリヌクレオチドが存在するかどうかを測定するために、試料を分析し得る。
本発明の典型的な実施形態によれば、分析のための方法は、それぞれ標的核酸と捕捉分子を含む複合体を形成させること（各捕捉分子は標的核酸のある領域に対して特異的な結合部分とアンカー基を含む。）；複合体を結合要素と接触させること（結合要素は、複合体を結合要素に結合させるために捕捉分子のアンカー基を結合するように構成されている。）；１つ又はそれ以上の標的核酸を増幅に供すること；結合要素に関して、増幅された標的核酸を捕捉すること；並びに捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することを含む。
本明細書において使用される「標的核酸」という用語は、この方法を使用することによって検出され得る核酸分子（すなわち、捕捉分子と複合体を形成することができる標的核酸、以下参照）を表し得る。このような核酸分子の例には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）などの天然に存在する核酸及び人工的に設計された核酸、例えば核酸類縁体、とりわけ、化学的に合成され又は組換え遺伝子技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹを参照。）を用いて作製されるペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロックされた核酸（ＬＮＡ；ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）などが含まれる。天然に存在する核酸の具体例には、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ分子などのＤＮＡ配列及びｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ若しくはｒＲＮＡ分子などのＲＮＡ配列又はこれらの逆相補核酸配列が含まれる。このような核酸はあらゆる長さであり得、一本鎖又は二本鎖分子の何れかであり得る。典型的には、標的核酸は、１０から１００００ヌクレオチドの長さ、例えば、２０から２０００ヌクレオチド、３０から１０００ヌクレオチド又は５０から５００ヌクレオチドの長さである。本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子）の両方を表すものと理解すべきである。
この標的核酸は、ウイルス感染に関連する核酸であり得る。ウイルス感染に関連する核酸は、１つ又はそれ以上のウイルス種によって感染された分析すべき液体試料中に存在するウイルス起源のあらゆる核酸分子（すなわち、そのヌクレオチド配列は、ウイルスゲノム内の対応する配列と同一であり、又は相補的である。）を表す。そこから液体試料が得られた宿主に感染しているウイルスは、あらゆるＤＮＡウイルス（すなわち、ＤＮＡゲノムを有するウイルス）又はＲＮＡウイルス（すなわち、ＲＮＡゲノムを有するウイルス）であり得る（例えば、Ｂｕｃｈｅｎ−Ｏｓｍｏｎｄ， Ｃ． （２００３） Ｔａｘｏｎｏｍｙ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｉｎ：Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ８ｔｈ ｅｄ．， ｖｏｌ．２，ｐ．１２１７−１２２６，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣに概説されている。）。ＤＮＡウイルスの例には、とりわけ、パポバウイルス科（例えば、パピローマウイルス）、アデノウイルス科（例えば、アデノウイルス）及びヘルペスウイルス科（例えば、エプシュタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）の科が含まれる。ＲＮＡウイルスの例には、とりわけ、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス）、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、フィロウイルス科（例えば、マールブルグウイルス、エボラウイルス）及びレトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の科が含まれる。幾つかの実施形態において、検出すべき核酸は、レトロウイルス科の一員によって引き起こされる感染症と関連しており、特に、ＨＩＶ感染症と関連している。本明細書において使用される「ＨＩＶ」という用語は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２種の両方並びにこれらに由来する全てのサブタイプを表す。
多くのＤＮＡウイルス及びレトロウイルス科（注目すべきことに、レトロウイルス科の複製は、ＲＮＡウイルスゲノムのＤＮＡへの逆転写を一般に必要とする。）は潜伏性のプロウイルスの形態で、宿主細胞ゲノム中へ遺伝情報を組み込むことができるので、「ウイルス感染症と関連する核酸」という用語は、遊離のウイルス及び細胞に随伴したウイルスに由来する核酸を表すのみならず、宿主のゲノム中に組み込まれているプロウイルスＤＮＡ分子、逆転写されたウイルスＤＮＡ分子（すなわち、ウイルス複製の「中間体」）及びプロウイルスＤＮＡ由来の転写物（すなわち、宿主ＤＮＡゲノムの転写によって得られたＲＮＡ分子）も表す。
典型的には、この標的核酸は、単離された形態で本発明の方法に供せられるのではなく、標的核酸の１つ又はそれ以上の種を含むと推測される試料の形態で方法に供せられる。本明細書において使用される「１つ又はそれ以上の種」という用語は、異なるヌクレオチド配列を有する分子及び／又は異なる起源から伝達された分子（例えば、宿主細胞に感染している異なる病原体に由来する核酸）など、核酸の１つ又はそれ以上の異なる種類を表す。
本明細書において使用される「試料」という用語は、本発明を使用することによる分析が予定され、検出すべき標的核酸の１つ又はそれ以上の種を含むと推測されるあらゆる液体を表す。従って、試料は、水又は適切な緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ）及び様々な生物学的試料中に溶解された、精製された核酸調製物を含み得る。本発明を用いて分析することができる液体試料の例には、とりわけ、有機及び無機の化学溶液、飲料水、下水、全血、血漿、血清、尿、痰、唾液又は脳脊髄液などのヒト及びヒト以外の体液、動物、植物又は組織培養物からの細胞抽出物、原核細胞及び真核細胞懸濁物、ファージ調製物などが含まれる。
本明細書において使用される「全血」という用語は、その構成成分を全て有する血液を表す。換言すれば、全血は、赤血球、白血球及び血小板などの血液細胞、並びにその中に血液細胞が懸濁されている血漿の両方を含む。
この試料は、この試料を本発明の方法に供する前に、必要に応じて行われる試料の精製及び／又は加工に由来し得る希釈剤、溶媒又は緩衝液などの１つ又はそれ以上のさらなる因子をさらに含み得る。しかしながら、本発明の幾つかの実施形態において、分析される試料は、処理されていない全血試料などの処理されていない試料である。本明細書において使用される「処理されていない」という用語は、（例えば、患者からの血液採取によって）試料を収集した後に、及び試料を本発明の方法に供する前に、試料のさらなる処理（例えば、分画法、乾燥／再構成など）が行われないことと理解すべきである。
このような処理されていない試料を含む典型的な核酸検出法は、以下に記載されている。
分析すべき流体試料の容量は、１μｌから５０μｌの範囲、典型的には、１μｌから４５μｌ又は１μｌから４０μｌ又は１μｌから３０μｌ又は１μｌから２５μｌ又は１μｌから２０μｌ又は１μｌから１５μｌの範囲であり得る。特定の実施形態において、流体試料の容量は１μＬから１０μｌの範囲である。しかしながら、全血試料が分析される場合には、５０μＬを超える試料容量も本発明の範囲に属する。
本明細書において使用される「捕捉分子」という用語は、特異的な結合動作及び／又は特徴的な反応性を示し、このため、標的核酸との複合体の形成に適したあらゆる分子を表す。核酸は、典型的には、捕捉分子として使用される。捕捉分子として使用することができる核酸の例には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）などの天然に存在する核酸及びとりわけ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロックされた核酸（ＬＮＡ）などの核酸類縁体が含まれる。天然に存在する核酸の具体例には、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ分子などのＤＮＡ配列及びｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ若しくはｒＲＮＡ分子などのＲＮＡ配列又はこれらの逆相補核酸配列が含まれる。このような核酸はあらゆる長さであり得、一本鎖又は二本鎖分子の何れかであり得る。典型的には、核酸捕捉分子は、１０から１５０ヌクレオチドの、例えば、２０から１００ヌクレオチド又は３０から７０ヌクレオチドの長さを有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、この捕捉分子は、所定の流体試料中に存在する目的のあらゆる標的核酸を増幅するために、ＰＣＲ中でのプライマーとして使用される。
幾つかの実施形態において、本発明において使用される捕捉分子は、標的核酸（例えば、ウイルス感染と関連する核酸）の配列領域に対して相補的であり、従って、捕捉分子と検出すべき核酸の間での塩基対形成を可能とする少なくとも１つの特異的配列領域（すなわち、上に引用されている結合部分）を含み得る。典型的には、この特異的結合領域は、少なくとも２０ヌクレオチド長、例えば、少なくとも３０ヌクレオチド又は少なくとも４０ヌクレオチドである。特に、捕捉分子の結合領域のヌクレオチド配列は、標的核酸の対応するヌクレオチド配列に対して相補的である。本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの両方（すなわち、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子）を表すものとして理解すべきである。
捕捉分子は、分析すべき流体試料を導入する前に、液体を収容するように適合された上記装置の少なくとも１つの構造のうち１つ又はそれ以上に（例えば、凍結乾燥された形態又は乾燥された形態で）提供され得る。あるいは、捕捉分子は、試料とともに（すなわち、同時に）装置内に導入することができ、又は試料が既に導入された後に導入することができる。
本発明の範囲内において、捕捉分子の１つ又はそれ以上の種を使用し得る。「１つ又はそれ以上の種」という用語は、異なるヌクレオチド配列を有する１つ又はそれ以上の核酸分子などの捕捉分子の１つ又はそれ以上の異なる種類を表す。同時に使用される捕捉分子の２以上の種は、「ライブラリー」とも称される。このようなライブラリーには、少なくとも２つの異なる分子が含まれるのみならず、より多くの異なる分子、例えば、少なくとも５つの異なる種、少なくとも１０の異なる種、少なくとも３０の異なる種などが含まれ得る。これらライブラリーは、アレイ要素の形態で又は他のあらゆる空間的配置でも存在し得る。
本発明の幾つかの実施形態において、この装置中で実施される分析は、検出すべき標的核酸と捕捉分子を含む複合体を装置の結合要素と接触させることをさらに含み、結合要素は、結合要素へ複合体を結合させるために、捕捉分子のアンカー基を結合するように構成されている。
本明細書において使用される「結合要素」又は「支持要素」という用語は、共有的相互作用又は非共有的相互作用により、捕捉分子のアンカー基を介して、捕捉分子（及び、このような捕捉分子を含むあらゆる複合体も）を結合することができるあらゆるマトリックスを表す。このようなマトリックスの例は、とりわけ、アレイ要素の基材又は磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｒ）としても知られる、常磁性ポリスチロールビーズ）及びラテックスビーズなどの合成粒子並びにＣＰＧなどの多孔性表面を含む。捕捉分子の種類、アンカー基の種類及び予定される用途に応じて、各事例において、極めて多様な結合が可能である。例えば、捕捉分子のアンカー基がビオチン部分であり得る場合には、これは、結合要素に付着されているアビジン又はストレプトアビジン基に結合され得る。あるいは、捕捉分子は、結合要素に結合されたチミジン残基の対応する伸長と相互作用するアデノシン残基の伸長（例えば、１０アデノシン残基）を含み得る。アンカー基を含む特異的な結合試薬は、様々な業者から市販されており、本分野において十分に確立されている（例えば、上記、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ，上記；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．上記及びＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈ， Ｆ．， ａｎｄ Ｚｏｒｂａｓ Ｈ．上記参照）。
結合要素は、分析されるべき流体試料を導入する前に、上記装置の少なくとも１つの構造の１つ又はそれ以上の中に付与され得る。これにより、結合要素は、捕捉分子と同じ１つ若しくはそれ以上の構造中に付与することができ、又は少なくとも１つの異なる構造中に付与することができる。典型的には、標的核酸との捕捉分子の複合体を形成させる工程は、複合体を結合要素と接触させる工程とは空間的に分離して、すなわち、この装置の異なる構造又はウェル又は反応チャンバー中で行われる。例えば、標的核酸との捕捉分子の複合体を形成させる工程は「溶解ウェル」中で実施することができ、複合体を結合要素と接触させる工程は、図１７中に引用されている「中央ウェル」中で実施される。このような実施形態において、捕捉分子及び結合要素は、液体を収容するように適合された異なる構造中に通常付与される。試料を添加する前に、結合要素を装置中に付与する代わりに、試料とともに（すなわち、同時に）又は試料が既に導入された後に、結合要素を装置中に導入され得る。
特定の実施形態において、方法は、増幅（すなわち、さらなる検出を容易にするために、試料をさらなる分析に供する前に、試料中に存在する標的核酸の量を増加させること）に、標的核酸を供することをさらに含む。典型的には、標的核酸の増幅は、循環増幅を用いて達成される。循環増幅は、２に等しい又は２より多い増幅サイクルのあらゆる数を含み得る。通常、循環増幅反応は、少なくとも１０サイクル又は少なくとも２０サイクルを含む。
典型的な循環増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＰＣＲは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、上記及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他、上記に詳しく記載されている、分子生物学における確立された標準的方法である。典型的には、ＰＣＲは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、二本鎖ＤＮＡ分子を増幅するために使用される。幾つかの実施形態において、循環増幅において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性、特に５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。このようなＤＮＡポリメラーゼの例には、とりわけ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ又はＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（これらは、複数の業者から市販されている。）が含まれる。
標的核酸がＲＮＡ分子である場合には、本発明の方法は、標的核酸を増幅に供する前に、逆転写（すなわち、対応するＲＮＡ分子からＤＮＡ分子を生成すること）に供することをさらに含み得る。逆転写は、分子生物学における別の標準的方法であり、同じく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、上記及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他、上記に記載されている。
この目的（すなわち、核酸増幅）のために、上記装置は、反応チャンバー内の温度を調節及び／又は制御するための１つ又はそれ以上の温度調節ユニット及び／又は温度制御ユニットを含み得る。このような温度調節ユニット及び／又は温度制御ユニットは、１つ又はそれ以上の別々の加熱及び／又は冷却要素を含むことができ、これは装置の１つ又はそれ以上の反応チャンバーに直接接触させ得る。典型的には、１つ又はそれ以上の加熱及び／又は冷却要素は、熱伝導性材料から作製される。このような熱伝導性材料の例には、とりわけ、ケイ素、酸化アルミニウムセラミックのようなセラミック材料及び／又は高い等級の鋼、アルミニウム、銅又は真鍮のような金属が含まれる。本発明を実施するのに適した適切な温度調節ユニット及び／又は温度制御ユニットの典型的な詳細な記述は、国際特許出願ＷＯ０１／０２０９４号（その関連する内容は、明示的に、本明細書に引用される。）にも見出すことができる。
例えば、液体を収容するように適合された構造内の温度を調節／制御することは、電気伝導性材料製のチャンバー体を使用することによっても達成することができる。本明細書において使用される「チャンバー体」は、装置の少なくとも１つの構造又は反応チャンバーを少なくとも部分的に取り囲む固形体を表すものと理解すべきである。少なくとも１つの構造は、少なくとも部分的に、チャンバー体の一体的コンポーネントであり得る（すなわち、チャンバー体と同じ材料で作製されている。）。電気伝導性材料の例には、５から３０％の炭素繊維を有するポリアミド、５から３０％の炭素繊維を有するポリカーボナート、２から２０％のステンレス鋼繊維を有するポリアミド及び５から４０％の炭素繊維を有するポリフェニレンスルフィドなどの電気伝導性合成材料が含まれる。さらに、チャンバー体は、膨張及び先細りを含むように設計され得、これにより、反応チャンバー又は対応する表面の特異的な加熱が可能となる。
液体を収容するための構造は、構造中の圧力が増加するように、増幅されるべき標的核酸を含む溶液で満たされ得る。構造中の圧力の増加は、加熱要素及び／又は冷却要素に対して、構造の柔軟なカバー要素に力を加え得る。
構造中の温度の測定は、本分野において十分に確立された様々な方法によって、例えば、一体化された抵抗センサー、半導体センサー、光導波管センサー、多色性色素又は液晶を使用することによって実施することができる。さらに、反応チャンバー中の温度は、チャンバー体中の一体化された温度センサー、高温計若しくは赤外線センサーを使用することによって、又はその上で検出が行われる表面における屈折率若しくは試料のｐＨ値などのパラメータの温度依存性変化を測定することによって、例えば、ｐＨ感受性の指標の色変化を測定することによって測定することができる。
通常、ＰＣＲなどの増幅は、循環様式で繰り返し実行される変性、プライマーの徐冷及びプライマーの伸長という３つの基礎的な工程を含む。しかしながら、増幅は、それぞれ、第一の「真の」増幅サイクルの前に最初の変性工程を、及び／又は最終増幅サイクルの完了後に最終伸長工程をさらに含み得る。幾つかの実施形態において、標的核酸増幅は、（少なくとも）二本鎖核酸を変性させる工程及び／又は標的核酸においてプライマー分子を徐冷及び伸長させる組み合わされた工程を含む（すなわち、「二段階ＰＣＲ」）。
典型的には、変性工程は、分析すべき試料を、典型的には０．５秒から５分間、９４から９５℃の温度まで加熱して、二本鎖核酸テンプレートの鎖を解離させることを含む。分析すべき試料をこのような変性工程に供することは、二本鎖標的核酸及び（結合要素に付着された）標的核酸との捕捉分子の複合体を含む試料中で二本鎖核酸の同時変性をもたらし（すなわち、可能とし）、後者は、結合要素からの標的核酸の放出をもたらす。
典型的には、徐冷工程は、変性された核酸テンプレート鎖へのプライマー分子の会合（すなわち、ハイブリッド形成／塩基対形成）を可能とするために、分析すべき試料を、典型的には１秒から５分間、４０から６５℃の温度まで冷却することを含む。使用される反応温度は、徐冷されるべきプライマー分子のヌクレオチド配列組成、融解温度、分子内折り畳みを形成する傾向（例えば、二本鎖ヘアピン又はターン構造の形成）など、徐冷されるべきプライマー分子の化学的及び／又は物理的特性に依存する。本発明の幾つかの実施形態内で、分析すべき試料をこのような徐冷工程に供することは、二本鎖標的分子の再会合及び捕捉分子との標的核酸の複合体の形成をもたらし（すなわち、可能とし）、後者は、結合要素上への標的核酸の捕捉又は再捕捉をもたらす。従って、本発明の幾つかの実施形態において、徐冷工程は、捕捉分子との複合体を形成することによって、標的核酸を結合要素上に捕捉する工程と同時に行われる。
最後に、典型的な伸長工程は、ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡテンプレート鎖の完全長コピーを作製するために、ハイブリッド形成されたプライマー分子を伸長させることを含む。増幅されるＤＮＡ断片の長さは、使用されるプライマーの対の５’末端によって決定される。典型的には、伸長工程は、１秒から１０分間、７０から７２℃の温度で行われる。本発明の幾つかの実施形態において、分析されるべき試料をこのような伸長工程に供することは、徐冷工程の間に形成された、標的核酸とのプライマーの複合体を伸長させて、その後に検出できる検出可能なマーカーを必要に応じて取り込んだ、二本鎖の増幅された核酸断片を生成させることによって、分析されるべき標的核酸の複製をもたらし得る。
幾つかの実施形態において、例えば、安全上の理由のために、中央ウェル又は第二の構造は、標的核酸の増幅を開始する前に、不可逆的に密封され得る。中央ウェルの不可逆的な密封は、中央ウェルの注入口及び必要に応じて、排出口を密封することによって達成され得る。例えば、中央ウェルと接続されたチャネル及び／又はバルブは、加熱密封され又は溶接され得る。プラスチックが融解され及びチャンネル又はバルブがロックされるように、熱いピンをチャネル又はバルブと接触させることによって、プラスチックチャネル又はバルブを、例えば、加熱密封させ得る。
特定の実施形態において、方法は、典型的には、結合要素に関して（すなわち、標的核酸をその上に固定化する）、分析されるべき試料をＰＣＲに供することによって増幅された標的核酸を捕捉することをさらに含む。既に上述されているように、アンカー基を介して結合要素になお結合されている捕捉分子との複合体を形成させることによって、結合要素に関して、標的核酸を捕捉し得る。
方法は、捕捉された、増幅された標的核酸を結合要素から放出させること、並びに１つ又はそれ以上の標的核酸を増幅に供する工程及び結合要素に関して、増幅された標的核酸を捕捉する工程を反復することをさらに含み得る。本明細書において使用される「放出」は、結合要素からの標的核酸の脱離又は結合解除を含み得る。これは、例えば、何れかの共有結合の切断を介して酵素的に達成することができ、又は相補的塩基対形成を介して、核酸捕捉分子によって標的核酸が結合要素に結合されている場合には、その中でアッセイが行われている構造中の温度を増加させ、これにより、核酸鎖分離（すなわち、変性）をもたらすことによって達成することができる。
このような実施形態において、捕捉された、増幅された標的核酸を結合要素から放出させること、並びに１つ又はそれ以上の標的核酸を増幅に供する工程及び結合要素に関して、増幅された標的核酸を捕捉する工程を反復するサイクルは、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも５０回又は少なくとも１００回実施し得る。捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定する工程は、捕捉された、増幅された標的核酸を結合要素から放出させ、並びに１つ又はそれ以上の標的核酸を増幅に供する工程及び結合要素に関して、増幅された標的核酸を捕捉する工程を反復する少なくとも１つのサイクル後に、例えば、各サイクル後に実施し得る。
それぞれ標的核酸と捕捉分子（各捕捉分子は標的核酸のある領域に対して特異的な結合部分とアンカー基を含む）を含む複合体を形成する工程は、複合体を結合要素（結合要素は、複合体を結合要素に結合するために、捕捉分子のアンカー基を結合するように構成されている。）と複合体を接触させる工程とは、空間的に分離して実施し得る。このような実施形態において、方法は、液体を収容するように適合された少なくとも２つの構造を含む装置中で実施される。少なくとも２つの構造は、例えば、微小流体ネットワークと流体連通され得る。例えば、方法は、図１８及び図１９に図解されているように、装置５００中で実施され得る。それぞれ標的核酸と捕捉分子を含む複合体は、第一の構造５０２の中で形成され得る。次いで、複合体は、第二の構造５１２へ移すことができ、第二の構造５１２中において、複合体は、捕捉分子のアンカー基を結合するように構成されている上記結合要素と接触される。
本明細書において使用される「捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定する」という用語は、結合要素上に捕捉された（又は再捕捉された）標的核酸の定性的及び／又は定量的測定を可能とする電気伝導度、酸化還元電位、光学的吸収、蛍光強度又は生物発光などのパラメータの検出／測定を表す。これらのパラメータの１つのみを測定し得るが、２以上のパラメータ（例えば、電気伝導度及び適切な標識によって引き起こされた蛍光シグナルの強度）を同時に又は連続して測定することも可能である。
検出反応を実施するために、標的核酸は１つ又はそれ以上の検出可能な標識で標識され得る。本明細書において使用される「１つ又はそれ以上の検出可能な標識」という用語は、化学的、物理的又は酵素的反応中に検出可能な化合物又は標識を直接的に又は間接的に生成する１つ又はそれ以上の適切な化学物質又は酵素を含むあらゆる化合物又は部分であり得る。従って、このような標識は、レポーター化合物との相互作用を形成することが可能であることにより、目的のレポーター化合物の検出のために必要であり得、又は検出を促進する。本明細書において使用される場合、この用語は、検出可能な標識そのもの（「マーカーとも称される。」）及び１つ又はそれ以上のこのような検出可能なマーカーに結合されたあらゆる化合物の両方を含むものと理解すべきである。さらに、標識による検出可能なシグナルの生成を妨害する部分（例えば、消光物質及び蛍光色素が互いに近接している限り、蛍光色素の励起から生じた発光を「乗っ取る」消光物質）も検出可能な標識に属し得る。検出可能な標識は、例えば、修飾された及び／又は標識されたリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はジデオキシヌクレオチドの形態で、標的核酸に取り込まれ又は付着され得る。
使用され得る検出可能なマーカー又は標識には、化学的、物理的又は酵素的な反応において、検出可能な化合物又はシグナルを直接的に又は間接的に生成するあらゆる化合物が含まれる。
標識は、本分野において周知の方法によって達成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，上記；及びＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．，ａｎｄ ＺｏｒｂａｓＨ．，上記参照）。標識は、とりわけ、蛍光標識、酵素標識、着色された標識、発色性標識、発光標識、放射性標識、ハプテン、ビオチン、金属錯体、金属及びコロイド状の金から選択することができる。標識のこれらの種類の全てが、本分野において十分に確立されている。このような標識によって媒介される物理的反応の例は、放射性標識を使用するときには、Ｘ線の照射又は励起又は発光時の蛍光又はリン光の発光である。アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−ラクタマーゼは、発色性反応産物の形成を触媒する酵素標識の例である。特定の実施形態において、検出可能な標識は、蛍光標識である。多数の蛍光標識が本分野において十分に確立されており、様々な業者から市販されている（例えば、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， １０ｔｈ ｅｄ．（２００６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡを参照）。
このような標識を検出するために、支持要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定するのに適した検出システムを使用し得る。検出システムは、装置５００に接続され得る。典型的には、検出システムは、第二の構造５１２の１つに対向して、必要に応じて、検出が行われる特定の表面領域に対向して配置される。適切な検出システムの選択は、検出のために使用される標識の種類又は実施される分析の種類などの幾つかのパラメータに依存する。様々な光学的及び非光学的検出システムが本分野において十分に確立されている。方法とともに使用することができる検出システムの一般的な記述は、例えば、「Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ， Ｆ．，及びＺｏｒｂａｓ Ｈ．、上記」に見出すことができる。
典型的には、検出システムは光学的検出システムである。幾つかの実施形態において、方法の実施は、蛍光、光学的吸収、共鳴転移などのパラメータの測定に基づき得る単純な検出システムを含む。
さらなる実施形態において、検出システムは、蛍光色素で標識された、スペクトル的に励起された核酸の蛍光強度の比較に基づく。蛍光とは、特定の波長の光によって励起されたときに、それ自身の光を放射し、特徴的な吸収及び発光挙動をもたらす特定の分子の能力である。特に、蛍光シグナルの定量的検出は、蛍光顕微鏡の改変された方法を用いて行われる（概説に関して、例えば、Ｌｉｃｈｔｍａｎ， Ｊ．Ｗ．， ａｎｄ Ｃｏｎｃｈｅｌｌｏ， Ｊ．Ａ．（２００５） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２， ９１０−９１９；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ， Ｔ． （２００５） Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９５，２４５−２６５を参照されたい。）。これにより、それぞれ光吸収及び光放射から生じたシグナルは、１つ又はそれ以上のフィルター及び／又は菫青石によって分離され、適切な検出装置上に画像化される。データ解析は、デジタル画像処理を用いて実施される。画像処理は、本分野において周知の幾つかのソフトウェアパッケージ（ＭａｔｈｅｍａｔｉｃａＤｉｇｉｔａｌＩｍａｇｅＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、ＥＩＫＯＮＡ又はＩｍａｇｅ−ＰＲＯなど）を用いて実現することができる。このような目的に適した別のソフトウェアは、Ｉｃｏｎｏｃｌｕｓｔソフトウェア（Ｃｌｏｎｄｉａｇ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）である。
適切な検出システムは、落射蛍光又は暗視野蛍光顕微鏡などの蛍光シグナルを測定するための古典的方法を基礎とし得る（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．（１９９９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， ２ｎｄ ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，ＮＹ（参照により、その全体が組み込まれる。）中に概説されている。）。
使用し得る別の光学検出システムは、点光源を介して、レンズの焦平面中で対象物が照射される共焦点蛍光顕微鏡である。重要なことは、点光源、対象物及び点光検出装置は、光学的に共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）平面上に位置していることである。このような共焦点系の例は、例えば、「Ｄｉａｓｐｒｏ， Ａ．（２００２）Ｃｏｎｆｏｃａｌ ａｎｄ ２−ｐｈｏｔｏｎ− ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ， Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｄｖａｎｃｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｒｏｋｅｎ，ＮＪ」に詳しく記載されている。通常、蛍光−光学系は、自動焦点を持たない蛍光顕微鏡、例えば固定された焦点を有する蛍光顕微鏡である。
同じく使用し得るさらなる蛍光検出法には、とりわけ、全内部蛍光顕微鏡（ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（例えば、Ａｘｅｌｒｏｄ，Ｄ．（１９９９）Ｓｕｒｆａｃｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｗｉｔｈ ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ，ｉｎ：Ｌａｃｅｙ，Ａ．（ｅｄ．）Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３９９−４２３）、蛍光寿命画像化顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（例えば、Ｄｏｗｌｉｎｇ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｄ．Ｏｐｔｉｃｓ４６，１９９−２０９参照）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ；例えば、Ｐｅｒｉａｓａｍｙ，Ａ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔｉｃｓ６，２８７−２９１参照）、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ；例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ Ｈａｓｔｉｎｇｓ，Ｊ．Ｗ．（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＣｅｌｌＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４，１９７−２３０参照）及び蛍光相関分光法（例えば、Ｈｅｓｓ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４１，６９７−７０５参照）；が含まれる。
特定の実施形態において、検出は、蛍光又は生物発光消光物質対のそれぞれの形成を基礎とするＦＲＥＴ又はＢＲＥＴを用いて行われる。ＦＲＥＴの使用は、例えば、「Ｌｉｕ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２， ５８９−５９３」及び「Ｓｚｏｌｌｏｓｉ，Ｊ． ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８２ ２５１−２６６」にも記載されている。ＢＲＥＴの使用は、例えば、「Ｐｒｉｎｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．７，１００７−１０１２」及び「Ｘｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ（１９９９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６，１５１−１５６」中にも記載されている。
捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる１つ又はそれ以上の値を測定することは、得られた１つ又はそれ以上の指標値の時間依存的モニタリング（すなわち、測定／検出工程の反復実施及び経時的な指標値の過程のモニタリング）を含み得る。
標的核酸を提供する工程は、試料中に含まれる生物学的材料から標的核酸を放出させることを含み得る。この目的のために、試料は、（例えば、以下に記載されているような温度調節ユニット及び／又は温度制御ユニットを使用することによって）細胞膜及び／又はウイルスキャプシドを破壊するために加熱され得る。幾つかの実施形態において、この放出工程は、溶解試薬、例えば、細胞膜及び／又はウイルスのキャプシドを崩壊させる１つ又はそれ以上の界面活性剤を含む試薬と流体試料を接触させることを含む。このような溶解試薬は本分野において周知であり（例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）」、多くの業者によって市販されている。
この方法は、１つ又はそれ以上の標的核酸をきょう雑物質から分離することをさらに含み得る。
標的核酸を提供することは、それぞれ標的核酸と捕捉分子を含む複合体を結合要素と接触させる工程、標的核酸を増幅に供する工程、結合要素に関して、増幅された標的核酸を捕捉する工程、並びに捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定する工程から空間的に分離して実施し得る。例えば、それぞれ標的核酸と捕捉分子を含む複合体がその中で形成される同じ構造５０２中に、標的核酸を提供し得る。
さらなる実施形態において、方法は、上記のような装置中で実施される。例えば、装置は第一のウェル５０２を含むことができ、それぞれ標的核酸と捕捉分子を含む複合体は、第一のウェル５０２中で形成される。さらに、装置は第二のウェル５１２を含むことができ、捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することは、１つ又はそれ以上の標的核酸を検出するように構成された第二のウェル５１２中で実施され得る。第二のウェル５１２は、第二のウェルを覆うカバー要素及び該カバー要素を変形するように作動されるように適合されたアクチュエータユニットを含み得る。さらに、１つ若しくはそれ以上の標的核酸を増幅に供すること、及び／又は結合要素に関して、増幅された標的核酸を（再）捕捉することも、第二のウェル５１２中でも実施され得る。
捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる１つ又はそれ以上の値の測定は、カバー要素を変形させるように作動されるアクチュエータを用いて実施し得る。このような実施形態において、カバー要素は、検出ウェル５１２の容積が減少するように変形させ得る。さらに、捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定した後に、第二のウェルの容積は再度増加させ得る。
本発明の別の典型的な実施形態によれば、以下を含む方法が提供される。
ａ）レポーター化合物のある量；捕捉分子のアンカー基を結合するように構成されている第一の結合要素；レポーター化合物を捕捉することができる第二の結合要素；レポーター化合物と複合体を形成することができる標的核酸のある量（レポーター化合物との複合体の形成は第二の結合要素によるレポーター化合物の補足を阻害する。）；捕捉分子のある量（各捕捉分子は標的核酸のある領域に対して特異的な結合部分及びアンカー基を含む。）を提供すること；
ｂ）それぞれ標的核酸及び捕捉分子を含む複合体を形成すること；
ｃ）複合体を第一の結合要素に結合させるために、複合体を第一の結合要素と接触させること；
ｄ）第一の結合要素から標的核酸の量の少なくとも一部を放出させること；
ｅ）標的核酸の量の少なくとも一部とのレポーター化合物の量の一部の複合体を形成させること；
ｆ）第二の結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉すること；並びに
ｇ）第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定すること。
本明細書において使用される「レポーター分子」又は「レポーター化合物」という用語は、１つ又はそれ以上の標的核酸と複合体を形成することができ、及び支持要素（例えば、第二の結合要素）上に捕捉されることができるあらゆる分子を表し、標的核酸との複合体の形成は、支持要素（例えば、第二の結合要素）上へのレポーター化合物の捕捉を阻害する。これにより、本明細書において使用される「複合体を形成することができる」という用語は、レポーター分子と標的核酸との間のあらゆる相互作用を表し得る。換言すれば、この用語は、標的との相互作用を媒介する、レポーター分子中に含まれる共通の又は異なる結合領域を介して（相補的ヌクレオチド配列間のワトソン・クリック塩基対形成を介するなど）達成され得る互いへの分子の結合を表す。典型的には、相互作用は可逆的である。同様に、「支持要素上に捕捉されていること」又は「第二の結合要素上に捕捉されていること」という用語は、所定の支持要素とのレポーター分子のあらゆる直接又は間接的（例えば、捕捉分子を介した；以下参照）相互作用も表す。この相互作用も、一般に可逆的である。
一般に、レポーター分子は、１０から１００ヌクレオチド、例えば、１５から５０ヌクレオチド、１５から４０ヌクレオチド又は２０から３０ヌクレオチドの長さを有する核酸分子（すなわち、上述のようなＲＮＡ又はＤＮＡ分子）であり得る。通常、レポーター分子は、一本鎖核酸分子（すなわち、オリゴヌクレチド）である。レポーター化合物は、検出されるべき標的核酸へのこのようなレポーター分子の結合が第二の結合要素上のレポーター分子の捕捉を阻害するように構成されている。核酸レポーター分子は、（例えば、標的核酸の少なくとも部分的に相補的な領域へ結合して、例えば、レポーター分子と検出されるべき標的核酸との間のワトソン・クリック塩基対形成を可能とすることによって）標的核酸と相互作用することができるのみならず、第二の結合要素上にも捕捉され得る少なくとも１つの特異的結合領域（本明細書では、「相互作用部位」とも称される。）を含み得る。典型的には、レポーター分子中に含まれた特異的結合領域は、少なくとも１２ヌクレオチド長、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド又は少なくとも１８ヌクレオチド又は少なくとも２２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、レポーター分子の結合部分のヌクレオチド配列は、標的核酸の対応するヌクレオチド配列に対して相補的である。
レポーター分子の１つ又はそれ以上の種を使用し得る。「１つ又はそれ以上の種」という用語は、異なるヌクレオチド配列を有する１つ又はそれ以上の核酸分子などのレポーター分子の１つ又はそれ以上の異なる種類を表す。
本明細書において使用される「第一の結合要素」は、上述のような結合要素であり得る。例えば、第一の結合要素は、共有的相互作用又は非共有的相互作用により、捕捉分子のアンカー基を介して、捕捉分子（及び、このような捕捉分子を含むあらゆる複合体も）を結合することができるあらゆる固体マトリックスを表し得る。このようなマトリックスの例には、とりわけ、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｒ）としても知られる、常磁性ポリスチロールビーズ）及びラテックスビーズなどの合成粒子が含まれる。
本明細書において使用される「第二の結合要素」は、上述のような結合要素であり得る。例えば、第二の結合要素は、直接的に（例えば、レポーター分子中に含まれるアンカー基を介して）又は共有若しくは非共有的相互作用によって、レポーター分子を第二の結合要素に捕捉することができるレポーター特異的捕捉分子の１つ又はそれ以上の種を介した間接的な様式で、その上にレポーター分子を捕捉することができるあらゆる固体マトリックスを表す。使用可能な第二の結合要素の例には、とりわけ、アレイ要素の基材（例えば、顕微鏡スライド、ウェハー又はセラミック材料）が含まれる。
本明細書において使用される「レポーター特異的捕捉分子」という用語は、これをレポーター分子との複合体の形成（すなわち、レポーター分子への結合）に適するものとする特異的な結合挙動及び／又は特徴的な反応性を示す第二の結合要素上に、例えば、付着され、又は固定化されるあらゆる分子を表す。核酸は、典型的には、捕捉分子として使用される。レポーター特異的捕捉分子として使用することができる核酸の例には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）などの天然に存在する核酸及びとりわけ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロックされた核酸（ＬＮＡ）などの核酸類縁体が含まれる。天然に存在する核酸の具体例には、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ分子などのＤＮＡ配列及びｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ若しくはｒＲＮＡ分子などのＲＮＡ配列又はこれらの逆相補核酸配列が含まれる。このような核酸はあらゆる長さであり得、一本鎖又は二本鎖分子の何れかであり得る。典型的には、レポーター特異的捕捉分子は、１０から１００ヌクレオチドの、例えば、１５から５０ヌクレオチド又は２０から３０ヌクレオチドの長さを有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
レポーター特異的捕捉分子は、レポーター分子を結合するように、例えば、レポーター特異的捕捉分子と検出されるべき核酸との間の塩基対形成を介したレポーター分子の相補的配列領域と相互作用するように構成された少なくとも１つの特異的配列領域（すなわち、結合領域）を含み得る。典型的には、特異的結合領域は、少なくとも１２ヌクレオチド長、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド又は少なくとも２２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、レポーター特異的捕捉分子の結合領域のヌクレオチド配列は、レポーター分子の対応するヌクレオチド配列に対して相補的である。
幾つかの実施形態において、標的核酸と複合体を形成することが可能なレポーター化合物の相互作用部位の少なくとも一部はレポーター特異的捕捉分子と複合体を形成することもできる。換言すれば、レポーター特異的捕捉分子と標的核酸は、レポーター化合物と複合体を形成することに関して競合する。すなわち、レポーター特異的捕捉分子中に含まれる各結合領域と標的核酸は、レポーター分子の同一の又は少なくとも類似の対応する配列を認識する。本明細書において使用される「類似の配列」という用語は、１つ若しくはそれ以上の単一ヌクレオチドのミスマッチ（すなわち、ヌクレオチドの非相補的な対）のみが異なり、又は１つ若しくはそれ以上の単一ヌクレオチドの付加、挿入若しくは欠失（すなわち、付加された又は欠如しているヌクレオチド残基）が異なる配列を表す。従って、レポーター特異的捕捉分子及び標的核酸中に含まれる各結合領域は少なくとも部分的に同一である。 本明細書において使用される「部分的に同一」という用語は、上述のように１つ若しくはそれ以上の単一ヌクレオチドのみが異なる配列、又は重複する結合部位を有する配列、すなわち、共通のヌクレオチド配列を共有するが、配列領域の少なくとも１つの他の部分が異なる配列を表す。しかしながら、レポーター特異的捕捉分子及び標的核酸中に含まれる各結合領域と標的核酸は、レポーター分子の異なる、重複していない（例えば、隣接する）配列を認識することも可能であるが、レポーター特異的捕捉分子又は標的核酸の、レポーター分子への結合は、他の分子の結合を立体的に妨害する。
幾つかの実施形態において、一方で、レポーター化合物と標的核酸の複合体を形成する工程と、他方で、（例えば、レポーター特異的捕捉分子との複合体を形成することによって）第二の結合要素上へレポーター化合物を捕捉する工程との間の化学的平衡は、上述されているように、それぞれ、（レポーター化合物配列に関して）レポーター特異的捕捉分子及び（標的核酸に関して）レポーター化合物の配列の類似性及び／又は部分的同一性の程度を変動させることによって影響を受け得る。
例えば、標的核酸配列に関するレポーター化合物配列の結合領域より、レポーター化合物配列に関する結合領域が短くなるように、又は長くなるように、レポーター特異的捕捉分子配列を選択し得る。このようにして、レポーター特異的捕捉分子に関するレポーター化合物の結合親和性と比べた標的核酸に関するレポーター化合物の結合親和性を増加又は減少させ得る。
レポーター特異的捕捉分子の１つ又はそれ以上の種を使用し得る。「１つ又はそれ以上の種」という用語は、異なるヌクレオチド配列を有する１つ又はそれ以上の核酸分子などのレポーター特異的捕捉分子の１つ又はそれ以上の異なる種類を表す。同時に使用されるレポーター特異的捕捉分子の２以上の種は、ライブラリーとも称され得る。このようなライブラリーには、少なくとも２つの異なる分子が含まれるのみならず、より多くの異なる分子、例えば、少なくとも１０つの異なる種、少なくとも２０の異なる種、少なくとも５０の異なる種なども含まれ得る。ライブラリーは、第二の結合要素に関して、異なる位置の上にも配置され得る。例えば、ライブラリーは、アレイ又は他のあらゆる空間配置の形態で存在し得る。
本明細書において使用される「アレイ（「マイクロアレイ」とも称される。）用語は、結合要素（例えば、第二の結合要素）（基材とも称される。）上への、レポーター特異的捕捉分子などの捕捉分子の確定された空間的配置（レイアウト）を表し、アレイ中の各分子の位置は別々に決定される。典型的には、マイクロアレイは、特定のパターンで配置され得る確定された部位又は所定の領域（いわゆる、アレイ要素又はスポット）を含み、各アレイ要素は、捕捉分子の唯一の種を典型的に含む。支持体、例えば、第二の結合要素上のレポーター特異的捕捉分子などの捕捉分子の配置は、共有又は非共有的相互作用を用いて作製され得る。しかしながら、捕捉分子は、方法を実施するために使用される装置の反応チャンバー内に直接固定化され得る（以下参照）。
「標的核酸」は、上述のような標的核酸であり得る。例えば、標的核酸は、ＨＩＶなどのウイルス感染と関連する核酸であり得る。
典型的には、標的核酸は、単離された形態で本発明の方法に供されず、標的核酸の１つ又はそれ以上の種を含むと推測される上記試料の形態で供される。本明細書において使用される「１つ又はそれ以上の種」という用語は、異なるヌクレオチド配列を有する分子及び／又は異なる起源に由来する分子（例えば、宿主細胞に感染している異なる病原体に由来する核酸）などの核酸の１つ又はそれ以上の異なる種類を表す。
本明細書において使用される「試料」という用語は、上に記載されているように、あらゆる液体試料を表す。分析可能な液体試料の例には、とりわけ、全血などのヒト及びヒト以外の体液が含まれ得る。本発明の幾つかの実施形態において、分析される試料は、上記のように、処理されていない全血試料などの処理されていない試料である。分析されるべき流体試料の容積は、１μｌから５０μｌの範囲、典型的には、１μｌから４５μｌ又は１μｌから４０μｌ又は１μｌから３０μｌ又は１μｌから２５μｌ又は１μｌから２０μｌ又は１μｌから１５μｌの範囲であり得る。特定の実施形態において、流体試料の容積は、１μｌから１０μｌの範囲である。しかしながら、全血試料が分析される場合には、５０μｌを超える試料容量も、本発明の範囲に属する。
本明細書において使用される「第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定する」という用語は、第二の結合要素上に捕捉された（又は再捕捉された）レポーター分子の定性的及び／又は定量的測定を可能とする、電気伝導度、酸化還元電位、光学的吸収、蛍光強度又は生物発光などのパラメータの検出／測定を表す。これらのパラメータの１つのみを測定することができるが、２以上のパラメータ（例えば、電気伝導度及び適切な標識によって引き起こされた蛍光シグナルの強度）を同時に又は連続して測定することも可能である。
幾つかの実施形態において、方法は、第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値に基づいて、標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することをさらに含む。すなわち、ある試料中に存在する１つ又はそれ以上の標的核酸の存在及び／又は量は、標的核酸／レポーター分子複合体の形成の前に存在するレポーター化合物の存在及び／又は量と複合体形成後に第二の結合要素上に捕捉されているレポーター化合物の量との差に基づいて計算され得る。
検出反応を実施するために、レポーター化合物は、上述のように、１つ又はそれ以上の検出可能な標識を含み得る。例えば、レポーター化合物は、２つの検出可能な標識を含み得る。特定の実施形態において、検出可能な標識は、蛍光標識である。多数の蛍光標識が本分野において十分に確立されており、様々な業者から市販されている（例えば、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ − Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， １０ｔｈ ｅｄ． （２００６）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡを参照）。
このような標識を検出するために、方法を実施するために使用される装置は、第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定するのに適した検出システムをさらに含み得る。例えば、上述のように結合要素上に捕捉された標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定するのに適した検出システムを使用し得る。
幾つかの実施形態において、方法は、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程の後に、第二の結合要素からレポーター化合物の量の残りの一部を放出させること、結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉すること、並びに第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することをさらに含む。本明細書において使用される「放出」という用語は、第二の結合要素からのレポーター分子の剥離又は結合解除を表す。これは、例えば、何れかの共有結合の切断を介して酵素的に、又は相補的な塩基対形成を介して、レポーター特異的核酸捕捉分子によって、核酸レポーター分子が第二の結合要素に結合されている場合には、その中でアッセイが行われている構造中の温度を増加させて、核酸鎖の分離（すなわち、変性）をもたらすことによって達成され得る。
さらなる実施形態において、放出、複合体の形成、捕捉及び測定の工程は、Ｎ回のさらなる回数（Ｎは、１より大きい又は１に等しい整数である。）反復される。換言すれば、方法は、環状様式で実施される。特定の実施形態において、整数Ｎは、＞５、＞１０又は＞２０である。
さらに、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程及び第二の結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程は同時に実施し得る。
特定の実施形態において、方法は、増幅（すなわち、さらなる検出を容易にするために、試料をさらなる分析に供する前に、試料中に存在する標的核酸の量を増加させること）に、標的核酸を供することをさらに含む。典型的には、標的核酸の増幅は、循環増幅を用いて達成される。循環増幅は、２に等しい又は２より多い増幅サイクルのあらゆる数を含み得る。通常、循環増幅反応は、少なくとも１０サイクル又は少なくとも２０サイクルを含む。
典型的な循環増幅は、上述のようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。典型的には、ＰＣＲは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、二本鎖ＤＮＡ分子を増幅するために使用される。幾つかの実施形態において、循環増幅において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性、特に５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。このようなＤＮＡポリメラーゼの例には、とりわけ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ又はＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（これらは、複数の業者から市販されている。）が含まれる。この５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を用いることによって、ＤＮＡポリメラーゼは、標的核酸に結合されているレポーター分子の標識された５’末端を核酸分解的に攻撃して、このようなレポーター分子の進行性分解をもたらし得る。その結果、第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の量は、増幅反応の各サイクルの間に、さらに減少する。場合により、使用されるＤＮＡポリメラーゼは、特定の配列位置において新生ＤＮＡ鎖に付加された誤ったヌクレオチドを除去するために３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性（「校正活性」）を示し得る。両エキソヌクレアーゼ活性を有するこのようなＤＮＡポリメラーゼの例には、とりわけ、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（何れの酵素も、様々な業者から市販されている。）が含まれる。
標的核酸がＲＮＡ分子である場合には、方法は、増幅に供する前に、上述のように、標的核酸を逆転写に供することをさらに含み得る。
標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程の前に、標的核酸の増幅が開始され得る。すなわち、レポーター化合物が標的核酸との複合体を形成し、及び標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物が第二の結合要素上に捕捉され得るようにしながら、標的核酸が増幅に供される。
この目的（すなわち、核酸増幅）のために、構造又は反応チャンバー、例えば中央ウェル５０２内の温度を調節及び／又は制御するための、上述のような１つ又はそれ以上の温度調節ユニット及び／又は温度制御ユニットをさらに含み得る図１８及び図１９に図解されている装置５００を、方法を実施するために使用し得る。反応チャンバー中の温度の測定は、上述のように行うことができる。
液体を収容するための構造には、構造中の圧力が増加されるように、増幅されるべき標的核酸を含む溶液を満たすことができ、構造中の圧力増加は、加熱要素及び／又は冷却要素に対して構造の１つ又はそれ以上の柔軟なカバー要素に力を加える。例えば、核酸標的の増幅を行うために、１つ又はそれ以上の柔軟なカバー要素は、凸状の屈曲を行い、これにより、加熱要素及び／又は冷却要素に対して１つ又はそれ以上のカバー要素を押圧し、効率的な熱的伝導を可能とするように、構造を満たし得る。
反応チャンバー中の温度の測定は、上述のように実施することができる。
通常、ＰＣＲなどの増幅は、環状様式で繰り返し行われる３つの基本的工程（変性、プライマーの徐冷及びプライマーの伸長）を含む。しかしながら、増幅は、それぞれ、第一の「真の」増幅サイクルの前の最初の変性工程及び／又は最終増幅サイクルの完了後の最終伸長工程をさらに含み得る。方法の幾つかの実施形態において、標的核酸増幅は、二本鎖核酸を変性させる工程及び／又は標的核酸においてプライマー分子を徐冷し、及び伸長する統合された工程を（少なくとも）含む（すなわち、「二段階ＰＣＲ」）。
変性工程は、９４から９５℃の温度まで、典型的には、０．５秒から５分間、分析されるべき試料を加熱することを含み、これにより、二本鎖核酸テンプレートの鎖解離をもたらす。分析されるべき試料をこのような変性工程に供することによって、二本鎖標的分子、二本鎖レポーター分子、標的核酸とのレポーター化合物の複合体及び（第二の結合要素に付着された）レポーター特異的捕捉分子とのレポーター化合物の複合体など、試料中の二本鎖核酸の同時変性をもたらし得（すなわち、可能とし得）、後者は、第二の結合要素からのレポーター化合物の放出をもたらす。
徐冷工程は、変性された核酸テンプレート鎖へのプライマー分子の会合（すなわち、ハイブリッド形成／塩基対）を可能とするために、４０から６５℃の温度まで、典型的には１秒から５分間、分析されるべき試料を冷却することを含む。使用された反応温度は、プライマー分子のヌクレオチド配列組成、融点、分子内折り畳み（例えば、二本鎖ヘアピン又は折り返し構造の形成）の傾向など、徐冷されるべきプライマー分子の化学的及び／又は物理的特異性に依存する。このような徐冷工程へ分析されるべき試料を供することによって、二本鎖標的分子の再会合、二本鎖レポーター分子の再会合、核酸標的とのレポーター化合物の複合体の形成及び標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の、レポーター特異的捕捉分子との複合体の形成（後者は、第二の結合要素上のレポーター化合物の捕捉又は再捕捉をもたらす。）をもたらし得る（すなわち、可能とし得る。）。従って、幾つかの実施形態において、徐冷工程は、レポーター化合物の量の一部の、標的核酸の量の少なくとも一部との複合体を形成させる工程と同時に、及び／又は第二の結合要素上の標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程と同時に行われる。
最後に、伸長工程は、ＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡテンプレート鎖の完全長コピーを作製するために、ハイブリッド形成されたプライマー分子を伸長させることを含む。増幅されたＤＮＡ断片の長さは、使用されるプライマーの対の５’末端によって決定される。典型的には、伸長工程は、７０から７２℃の温度で、１秒から１０分間行われる。分析されるべき試料をこのような伸長工程に供することは、その後に検出され得る必要に応じて標識されたレポーター化合物を取り込んだ二本鎖の増幅された核酸断片を生じさせるために、徐冷工程中に形成された、標的核酸の量の少なくとも一部とのレポーター化合物の量の一部の複合体を伸長させることにより、分析されるべき標的核酸の複製をさらにもたらし得る。
幾つかの実施形態において、例えば、安全上の理由のために、中央ウェル又は第二の構造は、標的核酸の増幅を開始する前に、不可逆的に密封され得る。中央ウェルの不可逆的な密封は、中央ウェルの注入口及び必要に応じて、排出口を密封することによって達成され得る。例えば、中央ウェルと接続されたチャネル及び／又はバルブは、加熱密封され、又は溶接され得る。プラスチックが融解され及びチャンネル又はバルブがロックされるように、熱いピンをチャネル又はバルブと接触させることによって、プラスチックチャネル又はバルブは、加熱密封され得る。
検出反応を実施するために、レポーター化合物は、上述のような１つ又はそれ以上の検出可能な標識（例えば、蛍光標識）で標識され得る。検出可能な標識は、例えば、修飾された及び／又は標識されたリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド又はジデオキシヌクレオチドの形態で、レポーター分子へ取り込ませ、又は付着させ得る。このような標識を検出させるために、上記検出システム（例えば、光学的検出システム）を使用し得る。
標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値の検出／測定は、アッセイが行われている間に、１回だけ又は２回以上実施し得る。単一のアッセイの間に２以上の検出工程が実施される場合、幾つかの実施形態では、得られた結果の平均値を計算し得る。とりわけ、１つ若しくはそれ以上の標的核酸の存在、長さ若しくは配列を決定するために及び／又はその／それらの量を計算するために、検出の１つ又はそれ以上のサイクルにおいて得られたデータを分析し、当業者に公知の適切なコンピュータソフトウェアを用いて、数学的に処理し得る。
幾つかの実施形態において、特にレポーター化合物が標的核酸より過剰であれば、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させ、及び第二の結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉することが化学的平衡状態になる前に、第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値が測定される。例えば、測定／検出工程は、増幅反応の徐冷工程の間に実施される。しかしながら、徐冷工程の完了後に（すなわち、伸長工程の間に又は伸長工程の完了後に）測定／検出反応を実施することも可能である。
さらなる実施形態において、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成する工程及び第二の結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程を開始してから１秒ないし１２０秒（例えば、１、５、１０、１５、２０、３０、６０又は１２０秒）後に、第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値が測定される。
他の実施形態において、第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値が、変性、徐冷及び伸長工程を含む循環増幅の少なくとも１つのサイクル後に、例えば、徐冷工程の間に又は徐冷工程の完了後に測定される。特定の実施形態において、値は、循環増幅の各サイクル後に測定される。他の特定の実施形態において、標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値が、第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定した後に毎回測定される。
幾つかの実施形態において、第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値の測定は、指標値の時間依存的モニタリング（すなわち、測定／検出工程の反復実施及び経時的な指標値の過程のモニタリング）を含む。
さらなる実施形態において、標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値は、レポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値と相関させる較正曲線に基づいて測定される。
方法は、液体を収容するように適合された構造と（該構造は、少なくとも１つの結合要素を含み、及び微小流体ネットワークと流体連通している。）並びに少なくとも１つの結合要素に標的分子が捕捉される様式で微小流体ネットワークを通じた流体流を調節するように適合され、構造中での標的核酸の増幅を調節するように適合され、及び少なくとも１つに結合要素に捕捉された化合物の検出を調節するように適合された調節ユニットとを含む上述のような装置において実施され得る。例えば、方法は、堅固な基材と、該基材を少なくとも部分的に覆う柔軟なカバー要素と、基材中に形成され、液体を収容するように適合され、及び１つ又はそれ以上の細胞、芽胞又はウイルスの内容物を放出するように適合された第一の構造と（内容物は、標的分子を含む。）、基材中に形成され、液体を収容するように適合され、並びに標的分子を捕捉するように及び標的分子の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定するように適合された少なくとも１つの結合要素を含む第二の構造と、少なくとも第一の構造と第二の構造を相互接続する微小流体ネットワークと、並びに微小流体ネットワークの一部を選択的に閉鎖するために基材に対して柔軟なカバー要素を押圧することによって第一の構造と第二の構造の間に流体流を生じさせるように適合されたアクチュエータユニットとを含む装置において実施され得る。
例えば、第一のウェル５０２を含む装置５００を使用することができる。このような実施形態において、それぞれ標的核酸と捕捉分子を含む複合体を形成させる工程は、第一のウェル中で実施される。
装置５００は、第二のウェル５１２を含み得る。このような実施形態において、第一の結合要素及び第二の結合要素は、第二のウェル中に付与され、及び複合体を第一の結合要素に結合させるために、複合体を第一の結合要素と接触させる工程；第一の結合要素から標的核酸の量の少なくとも一部を放出させる工程；標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程；第二の結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程；並びに第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる１つ又はそれ以上の値を測定する工程は、第二のウェル中で行われる。
捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値の測定は、カバー要素を変形させるように作動されるアクチュエータを用いて実施し得る。カバー要素は、中央ウェル又は第二の構造又は検出ウェルの容積が低下するように変形され得る。このような実施形態において、中央ウェルの容積は、同じく、捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定した後に増加させ得る。
方法は、標的分子又はレポーター特異的捕捉分子と複合体を形成していないレポーター化合物と複合体を形成することができる消光化合物の一定量を添加することをさらに含み得る。消光化合物は、標識による検出可能なシグナルの生成を妨害する１つ又はそれ以上の部分（例えば、蛍光色素の励起から生じた発光を「乗っ取る」消光基）を含み得る。例えば、消光基は、レポーター化合物の検出可能な標識によって発せられたシグナル（例えば、蛍光シグナル）を抑制又は阻害することが可能であり得る。このような実施形態において、消光化合物は、１つ又はそれ以上の消光基が複合体内のレポーター化合物の検出可能な標識と近接するように、標的分子又はレポーター特異的捕捉分子と複合体を形成していないレポーター化合物と複合体を形成することが可能であり得る。
消光化合物は、オリゴヌクレオチドであり得る。この実施形態において、消光オリゴヌクレオチドは、レポーターオリゴヌクレオチドの配列領域と相補的であり、従って、消光化合物とレポーター化合物間の塩基対形成を可能とする少なくとも１つの特異的な配列領域を含み得る。
消光基には、例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＱｘＩ消光物質（ＡｎａＳｐｅｃ）及びＩｏｗａ ｂｌａｃｋ消光物質などの一般的な消光物質が含まれ得る。
消光化合物は、上記装置の第二の構造中に付与され得る。このような実施形態において、消光化合物は、第二の結合要素上に捕捉されていないレポーター化合物と複合体を形成し得る。
上記装置の第二の構造は、標的核酸の増幅を開始させる前に、不可逆的に密封され得る。第二の構造の不可逆的な密封は、例えば、第二の構造と接続された熱密封性チャネル及び／又はバルブによって、第二の構造の注入口及び必要に応じて排出口を密封する（例えば、溶接する）ことによって達成され得る。
本発明の別の典型的な実施形態によれば、方法は、
−レポーター化合物のある量、レポーター化合物を結合することができる結合要素及びレポーター化合物を結合することができる標的核酸の量のある量を含む組成物を形成させること（レポーター化合物への標的核酸の結合は結合要素へのレポーター化合物の結合を阻害する。）；
−標的核酸の量の少なくとも一部と、レポーター化合物の量の一部とを結合させること；
−結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部とを結合させること；並びに
−結合要素に結合されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定すること
を含む。
本明細書中において使用される「標的核酸」という用語は、方法を使用することによって検出することができるあらゆる核酸分子（すなわち、レポーター化合物との複合体を形成することができる標的核酸；下記参照）を表す。このような核酸分子の例には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）などの天然に存在する核酸及び組換え遺伝子技術を用いて化学的に合成され又は作製された人工的に設計された核酸（例えば、とりわけ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又は鍵型核酸（ＬＮＡ）などの核酸類縁体）（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）を参照されたい。）が含まれる。天然に存在する核酸の具体例には、ゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ分子などのＤＮＡ配列並びにｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ若しくはｒＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子又はこれらの逆相補核酸配列が含まれる。このような核酸は、あらゆる長さであり得、一本鎖又は二本鎖分子であり得る。典型的には、標的核酸は、１０から１０，０００ヌクレオチドの長さ、例えば、２０から２，０００ヌクレオチド、３０から１，０００ヌクレオチド又は５０から５００ヌクレオチドである。本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子）の両方を表すものと理解すべきである。
典型的には、標的核酸は単離された形態で方法に提供されるのではなく、標的核酸の１つ又はそれ以上の種を含むことが推測される試料の形態で提供される。本明細書において使用される「１つ又はそれ以上の種」という用語は、異なるヌクレオチド配列を有する分子及び／又は異なる起源から生じた分子（例えば、宿主細胞に感染している異なる病原体に由来する核酸）などの核酸の１つ又はそれ以上の異なる種類を表す。
本明細書において使用される「試料」という用語は、方法を使用することによって分析されるべき、及び検出されるべき標的核酸の１つ又はそれ以上の種を含むと推測されるあらゆる液体を表す。従って、試料という用語は、水又は適切な緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ）中に溶解された精製された核酸調製物及び様々な生物学的試料を含む。方法を用いて分析することができる液体試料の例には、とりわけ、有機及び無機の化学的溶液、飲料水、下水道、全血、血漿、血清、尿、痰、唾液又は脳脊髄液、動物、植物又は組織培養物から得た細胞抽出物、原核及び真核細胞懸濁液、ファージ調製物などのヒト及びヒト以外の体液が含まれる。
試料は、試料を本発明の方法に供する前に、必要に応じて行われる試料の精製及び／又は加工から生じ得る希釈液、溶媒又は緩衝液などの１つ又はそれ以上のさらなる薬剤をさらに含み得る。しかしながら、幾つかの実施形態において、分析される試料は、処理されていない全血試料などの処理されていない試料である。本明細書において使用される「処理されていない」という用語は、（例えば、患者からの採血によって）試料を集めた後に、及び試料を本発明の方法に供する前に、さらなる試料の処理（例えば、分画法、乾燥／再構成など）は行われないことを理解すべきである。
このような処理されていない試料を含む典型的な核酸検出法は、以下に記載されている。
本明細書において使用される「レポーター分子」又は「レポーター化合物」という用語は、１つ又はそれ以上の標的核酸と複合体を形成することができ及び結合要素上で捕捉され得るあらゆる分子を表し、標的核酸との複合体の形成は結合要素上でのレポーター化合物の捕捉を阻害する。これにより、本明細書において使用される「複合体を形成することができる」という用語は、レポーター分子と標的核酸との間のあらゆる相互作用を表す。換言すれば、この用語は、（相補的ヌクレオチド配列間のワトソン・クリック塩基対形成などの）標的との相互作用を媒介するレポーター分子中に含まれる共通の又は異なる結合領域を介して達成され得る、分子の相互結合を表す。典型的には、相互作用は可逆的である。同様に、「結合要素上に捕捉されている」という用語は、ある結合要素とのレポーター分子のあらゆる直接的又は間接的（例えば、捕捉分子を介した、以下参照）な相互作用も表す。この相互作用も、一般に、可逆的である。
一般に、レポーター分子は、１０から１００のヌクレオチド、例えば、１５から５０のヌクレオチド、１５から４０のヌクレオチド又は２０から３０のヌクレオチドの長さを有する核酸分子（すなわち、上記のようなＲＮＡ又はＤＮＡ分子）であり得る。通常、レポーター分子は、一本鎖核酸分子（すなわち、オリゴヌクレオチド）である。検出されるべき標的核酸へのこのようなレポーター分子の結合が結合要素上のレポーター分子の捕捉を阻害するように、レポーター化合物が構成されている。核酸レポーター分子は、（例えば、標的核酸の少なくとも部分的に相補的な配列領域へ結合し、これにより、例えば、レポーター分子と検出されるべき標的核酸との間のワトソン・クリック塩基対形成を可能にすることによって）標的核酸との相互作用を可能するのみならず、結合要素上に捕捉することもできる少なくとも１つの特異的な結合領域（本明細書おいて、「相互作用部位」とも称される。）を含み得る。典型的には、レポーター分子中に含まれる特異的結合領域は、少なくとも１２ヌクレオチド長、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド又は少なくとも２２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、レポーター分子の結合部分のヌクレオチド配列は、標的核酸の対応するヌクレオチド配列に対して相補的である。
レポーター分子の１つ又はそれ以上の種を使用し得る。「１つ又はそれ以上の種」という用語は、異なるヌクレオチド配列を有する１つ又はそれ以上の核酸分子など、レポーター分子の１つ又はそれ以上の異なる種類を表す。
本明細書において使用される「結合要素」又は「支持部材」という用語は、（例えば、レポーター分子中に含まれるアンカー基を介して）直接的に又は共有若しくは非共有相互作用によって結合要素へレポーター分子を捕捉することができる捕捉分子の１つ若しくはそれ以上の種を介した間接的様式で、その上でレポーター分子を捕捉することができるあらゆる固体マトリックスを表す。使用することができる結合要素の例は、とりわけ、アレイ要素の基材（例えば、顕微鏡スライド、ウェハー又はセラミック材料）又は磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｒ）としても知られる常磁性ポリスチロールビーズ）及びラテックスビーズなどの合成粒子を含む。
この実施形態において使用される「捕捉分子」という用語は、捕捉分子をレポーター分子との複合体の形成（すなわち、レポーター分子への結合）に適したものとする、特異的な結合挙動及び／又は特徴的な反応性を示す結合要素上に含まれる（例えば、結合要素に付着され又は結合要素上に固定化された）あらゆる分子を表す。この実施形態において使用される捕捉分子は、レポーター特異的捕捉分子とも表記され得る。典型的には、核酸が捕捉分子として使用される。捕捉分子として使用することができる核酸の例は、それぞれ、標的及びレポーター分子に関連して上述されている。このような核酸は、あらゆる長さであり得、一本鎖又は二本鎖分子であり得る。典型的には、核酸捕捉分子は、１０から２００ヌクレオチドの、例えば、１５から１００ヌクレオチド又は２０から７０ヌクレオチドの長さを有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
捕捉分子は、レポーター分子を結合するように、例えば、捕捉分子と検出されるべき核酸との間の塩基対形成を介したレポーター分子の相補的配列領域と相互作用するように構成された、少なくとも１つの特異的配列領域（すなわち、結合領域）を含み得る。典型的には、特異的結合領域は、少なくとも１５ヌクレオチド長、例えば、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド又は少なくとも５０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、捕捉分子の結合領域のヌクレオチド配列は、レポーター分子の対応するヌクレオチド配列に対して相補的である。
幾つかの実施形態において、標的核酸と複合体を形成することができるレポーター化合物の相互作用部位の少なくとも一部は、捕捉分子とも複合体を形成することもできる。換言すれば、捕捉分子と標的核酸は、レポーター化合物との複合体の形成に関して競合する。すなわち、捕捉分子及び標的核酸中に含まれるそれぞれの結合領域は、レポーター分子の同じ又は少なくとも類似の対応する配列を認識する。本明細書において使用される「類似の配列」という用語は、１つ若しくはそれ以上の単一ヌクレオチドの不一致（すなわち、ヌクレオチドの非相補的な対）のみが異なる配列又は１つ若しくはそれ以上の単一ヌクレオチドの付加、挿入若しくは欠失（すなわち、ヌクレオチド残基の付加又は欠如）が異なる配列を表す。従って、捕捉分子及び標的核酸中に含まれるそれぞれの結合領域は、少なくとも部分的に同一である。本明細書において使用される「部分的に同一」という用語は、上述されているように、１つ若しくはそれ以上の単一ヌクレオチドにおいてのみ異なる配列、又は重複する結合部位を有する配列、すなわち、共通のヌクレオチド配列を共有するが、配列領域の少なくとも１つの他の部分が異なる配列を表す。しかしながら、捕捉分子及び標的核酸中に含まれているそれぞれの結合領域は、レポーター分子の異なる重複していない（例えば、隣接する）配列を認識するが、レポーター分子への捕捉分子又は標的核酸の結合は、他の分子の結合を立体的に妨害することも可能である。
幾つかの実施形態において、一方で、レポーター化合物と標的核酸の複合体を形成する工程と、他方で、（例えば、レポーター特異的捕捉分子との複合体を形成することによって）第二の結合要素上にレポーター化合物を捕捉する工程との間の化学的平衡は、上述されているように、それぞれ、（レポーター化合物配列に関して）レポーター特異的捕捉分子及び（標的核酸に関して）レポーター化合物の配列の類似性及び／又は部分的同一性の程度を変動させることによって影響を受け得る。
例えば、標的核酸配列に関して、レポーター化合物配列の結合領域より、レポーター化合物配列に関して結合領域がより短くなるように、又はより長くなるように、レポーター特異的捕捉分子配列を選択し得る。このようにして、レポーター特異的捕捉分子に関するレポーター化合物の結合親和性と比べた標的核酸に関するレポーター化合物の結合親和性を増加又は減少させ得る。
捕捉分子の１つ又はそれ以上の種を使用し得る。「１つ又はそれ以上の種」という用語は、異なるヌクレオチド配列を有する１つ又はそれ以上の核酸分子など、捕捉分子の１つ又はそれ以上の異なる種類を表す。同時に使用される捕捉分子の２以上の種は、「ライブラリー」とも称される。このようなライブラリーは、少なくとも２つの種を含むが、多くのさらなる異なる分子、例えば、少なくとも５つの異なる種、少なくとも１０の異なる種、少なくとも３０の異なる種なども含み得る。ライブラリーは、結合要素に関して異なる位置上にも配置され得る。例えば、ライブラリーは、アレイの形態で又は他のあらゆる空間的配置で存在し得る。
本明細書において使用される「アレイ」（「マイクロアレイ」とも称される。）という用語は、結合要素（「基材」とも称される。）上への捕捉分子の規定された空間的配置（レイアウト）を表し、アレイ中の各分子の位置は個別に決定される。典型的には、マイクロアレイは、特定のパターンで配置され得る規定の部位又は所定の領域（すなわち、いわゆる、「アレイ要素」又は「スポット」）を含み、各アレイ要素は、典型的には、捕捉分子の１つの種のみを含む。支持体上の捕捉分子の配置は、共有又は非共有相互作用を用いて作製することができる。しかしながら、捕捉分子は、方法を実施するために使用される装置の反応チャンバー内に直接固定化することもできる（下記参照）。
第一の工程において、方法は、レポーター化合物のある量、結合要素及び標的ヌクレオチドのある量を含む組成物を形成することを含み得る。本明細書において使用される「組成物を形成する」という用語は、上記成分のあらゆる混和又は混合を表す。これは、方法を実施するのに適した分析装置の１つ又はそれ以上の反応チャンバー中に、同時に、連続的に又は別々に成分を導入することによって達成され得る。あるいは、混合物を装置中に導入する前に、各成分を混合することも可能である。
既に上述されているように、方法は、２以上のレポーター化合物及び２以上の標的ヌクレオチドを用いて実施することも可能である。従って、幾つかの実施形態において、組成物を形成する工程は、
−第一のレポーター化合物のある量と、
−第一のレポーター化合物と複合体を形成することができる第一の標的核酸の量と（第一のレポーター化合物との複合体の形成は結合要素による第一のレポーター化合物の捕捉を阻害する。）、
−第二のレポーター化合物のある量、並びに
−第二のレポーター化合物と複合体を形成することができる第二の標的核酸のある量（第二のレポーター化合物との複合体の形成は結合要素による第二のレポーター化合物の捕捉を阻害する。）
を含む組成物を形成することを含む。
本明細書中において使用される「装置」は、方法を用いて試料のアッセイを行うのに適したあらゆる機器類を表す。方法において使用するための適切な装置は、本明細書に記載されている。このような装置の典型的な実施形態は、図１７から１９に図解されている。方法を実施するのに適したさらなる装置は、欧州特許出願ＥＰ０６１２２６９５及び国際特許出願ＷＯ２００７／０５１８６１号に記載されており、両文献の関連する内容は同じく明示的に本明細書に引用される。
典型的には、装置は、液体試料を収容するための少なくとも１つの構造（本明細書において、「反応チャンバー」又は「反応空間」とも称される。）を含み得る。本明細書において使用される「反応チャンバー」という用語は、下部表面と上部表面（第一及び第二の表面とも称される。）間の装置内に形成され、実際の分析の少なくとも１つの工程（例えば、標的核酸の検出）がその中で行われる空間を表す。下部及び上部表面は、互いに対向して又は実質的に対向して配置され得る。例えば、下部及び上部表面は、互いに平行に又は実質的に平行に配置され得る。
幾つかの実施形態において、反応チャンバーは２つ又はそれ以上のサブチャンバーを含み得る。これは、第一の表面及び／又は第二の表面に、２つ又はそれ以上のサブチャンバー間の側壁としての役割を果たす１つ又はそれ以上の仕切り又は空洞を付与することによって達成することができる。
さらなる実施形態において、平行して１つの試料の複数アッセイを実施するために又は異なる反応チャンバー中で連続してアッセイの異なる工程を実施するために、方法において使用される装置は２以上の反応チャンバーを含む。この目的のために、反応チャンバーは、互いに流体連通され得る。本明細書において使用される「互いに流体連通する」という用語は、一般的な試料導入路、充填ユニット、処理ユニットなどの追加手段を介した、直接的又は間接的な各反応チャンバー間のあらゆる相互接続を表す。しかしながら、本明細書において使用されるこの用語は、試料を導入した後に、反応チャンバーが永続的に互いに流体連通されていることを必ずしも意味しない。反応チャンバーは、例えば、反応チャンバー間の接続部における一方向性又は二方向性バルブによって達成される一過性の流体連通である。
分析されるべき試料（標的核酸を含む。）を導入する前に、検出アッセイがその中で行われる装置の少なくとも１つの反応チャンバーの１つ又はそれ以上の中に（又は１つ若しくはそれ以上のサブチャンバー中に）、レポーター分子及び／又は捕捉分子を（例えば、凍結乾燥された又は乾燥された形態で）付与し得る。レポーター分子及び／又は捕捉分子は、同じ反応チャンバー（又はサブチャンバー）中に又は異なる反応チャンバー（又はサブチャンバー）中に付与し得る。あるいは、レポーター分子及び／又は捕捉分子は、試料とともに（すなわち同時に）又は試料が既に導入された後に、装置中に導入され得る。
同様に、分析されるべき試料（標的核酸を含む。）を導入する前に、検出アッセイがその中で行われる装置の少なくとも１つの反応チャンバーの１つ又はそれ以上の中に（又は１つ若しくはそれ以上のサブチャンバー中に）、結合要素を付与し得る。結合要素は、レポーター分子及び／又は捕捉分子と同じ反応チャンバー（又はサブチャンバー）中に又は異なる反応チャンバー（又はサブチャンバー）中に付与し得る。例えば、レポーター分子を結合要素へ捕捉する工程と空間的に隔てて（すなわち、装置の異なる反応チャンバー（又はサブチャンバー）中で）、レポーター分子の標的分子との複合体を形成する工程を実施することも可能であり得る。このような実施形態において、各成分は、通常、同じ反応チャンバー中に付与されない。試料を添加する前に、装置中に結合要素を付与する代わりに、試料と一緒に（すなわち、同時に）又は試料が既に導入された後に、結合要素を装置中に導入し得る。
特定の実施形態において、方法において使用される装置は、バイオセンサーアッセイ装置、微小流体カートリッジ及びラブ−オン−チップからなる群から選択される装置である。
組成物を形成した後に、方法は、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程を含み得る。換言すれば、例えば、それぞれ、レポーター化合物及び標的核酸の相補的ヌクレオチド配列の塩基対形成を介して、二本鎖核酸分子を形成することによって、レポーター分子を標的核酸に結合させることが可能である。レポーター化合物の量の一部が存在する標的核酸の量の少なくとも一部と複合体を形成するという事実は、アッセイの最初に存在するレポーター分子の総濃度が存在する標的核酸の総濃度を超え得ることを表す。
続いて、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の残りの量は、（直接、又は結合要素に付着されている捕捉分子への結合によって）上記レポーター分子中に含まれる１つ又はそれ以上の結合領域を介して、結合要素上に捕捉（すなわち、結合）され得る。レポーター分子との標的核酸の複合体の形成は結合要素上のレポーター分子の捕捉を阻害するので、標的核酸／レポーター分子複合体の形成は、標的核酸／レポーター分子複合体を形成させる工程を実施する前に存在する量と比べて、結合要素上に捕捉され得るレポーター分子の量を減少させる。
本発明の方法の特定の実施形態において、レポーター化合物の量の一部の、標的核酸の量の少なくとも一部との複合体を形成させる工程及び結合要素上の標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程は、同時に行われる。
最後に、方法は、結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することを含み得る。本明細書において使用される「結合上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定する」という用語は、結合要素上に捕捉された（又は再捕捉された）レポーター分子の定性的及び／又は定量的測定を可能とする電気伝導度、酸化還元電位、光学的吸収、蛍光強度又は生物発光などのパラメータの検出／測定を含む。これらのパラメータの１つのみを測定することが可能であるが、２以上のパラメータ（例えば、電気伝導度及び適切な標識によって引き起こされた蛍光シグナルの強度）を同時に又は連続して測定し得る。
幾つかの実施形態において、方法は、結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値に基づいて標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することをさらに含む。すなわち、ある試料中に存在する１つ又はそれ以上の標的核酸の存在及び／又は量は、標的核酸／レポーター分子複合体の形成前に存在するレポーター化合物の存在及び／又は量と複合体形成後の結合要素上に捕捉されているレポーター化合物の量との間の差に基づいて計算され得る。
検出反応を実施するために、レポーター化合物は、上述のように、１つ又はそれ以上の検出可能な標識、例えば蛍光標識を含み得る。例えば、レポーター化合物は、２つの検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識は、例えば、修飾された及び／又は標識されたリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はジデオキシヌクレオチドの形態で、レポーター分子に取り込まれ又は付着され得る。
このような標識を検出するために、方法を実施するために使用される装置は、結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定するのに適した上述のような検出システム、例えば、光学的検出システムをさらに含み得る。検出システムは、反応チャンバーに接続され得る。典型的には、検出システムは、少なくとも１つの反応チャンバーの１つに対向して、必要に応じて、検出が行われる特定の表面領域に対向して配置される。
幾つかの実施形態において、方法は、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程の後に、結合要素からレポーター化合物の量の残りの一部を放出させること、結合要素上の、標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉すること、並びに結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定することをさらに含む。本明細書において使用される「放出する」という用語は、結合要素からのレポーター分子の剥離又は結合解除を表す。これは、例えば、何れかの共有結合の切断を介して酵素的に達成することができ、又は相補的塩基対形成を介して、核酸捕捉分子によって、核酸レポーター分子が結合要素に結合されている場合には、その中でアッセイが行われている反応チャンバー中の温度を増加させ、これにより、核酸鎖分離（すなわち、変性）をもたらすことによって達成することができる。
さらなる実施形態において、放出する、複合体を形成する、捕捉する及び測定する工程は、Ｎ回のさらなる回数（Ｎは、１より大きい又は１に等しい整数である。）反復される。換言すれば、方法は、環状様式で実施される。特定の実施形態において、整数Ｎは、＞５、＞１０又は＞２０である。
幾つかの実施形態において、複合体を形成させる工程の前に、方法は、結合要素上にレポーター化合物の量の少なくとも一部を捕捉すること；結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定すること；並びに捕捉されたレポーター化合物を結合要素から放出させることをさらに含む。従って、これらの追加の工程を実施することによって、受容体化合物と標的核酸との間で複合体の形成が可能になる前に、最初に存在するレポーター化合物の量を測定することが可能になる。得られた値を、結合要素上の標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の一部を捕捉した後に測定された値と比較することによって、試料中に存在する標的核酸の存在及び／又は量に対する指標が得られる。
特定の実施形態において、方法は、増幅（すなわち、さらなる検出を容易にするために、試料をさらなる分析に供する前に、試料中に存在する標的核酸の量を増加させること）に、標的核酸を供することをさらに含む。典型的には、標的核酸の増幅は、循環増幅を用いて達成される。循環増幅は、２に等しい又は２より多い増幅サイクルのあらゆる数を含み得る。通常、循環増幅反応は、少なくとも１０サイクル又は少なくとも２０サイクルを含む。典型的な循環増幅は、上述のようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。典型的には、熱安定的なＤＮＡポリメラーゼを使用することによって二本鎖ＤＮＡ分子を増幅するために、ＰＣＲが使用される。幾つかの実施形態において、環状増幅において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性、特に、５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。このようなＤＮＡポリメラーゼの例には、とりわけ、（複数の業者から市販されている）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ又はＴｔｈＤＮＡポリメラーゼが含まれる。この５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を用いて、ＤＮＡポリメラーゼは、標的核酸に結合されたレポーター分子の標識された５’末端を核酸分解的に攻撃することができ、このようなレポーター分子の進行性の分解をもたらす。その結果、結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の量は、増幅反応の各サイクルの間にさらに減少する。必要に応じて、使用されるＤＮＡポリメラーゼは、ある配列位置の新生ＤＮＡ鎖に付加された誤ったヌクレオチドを除去するために、３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性（「校正活性」）も示し得る。両エキソヌクレアーゼ活性を有するこのようなＤＮＡポリメラーゼの例には、とりわけ、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（両酵素は、様々な業者からも市販されている。）が含まれる。
標的核酸がＲＮＡ分子であれば、方法は、増幅に供される前に、標的核酸を上述のように逆転写へ供することをさらに含み得る。
標的核酸の増幅は、レポーター化合物の量の一部の、標的核酸の量の少なくとも一部との複合体を形成させる工程の前に開始され得る。すなわち、レポーター化合物に標的核酸と複合体を形成させながら、及び標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物を結合要素上に再捕捉させながら、標的核酸を増幅に供する。
この目的（すなわち、核酸増幅）のために、方法において使用される装置は、反応チャンバー内の温度を調節及び／又は制御するために、上述されているような１つ又はそれ以上の温度調節ユニット及び／又は温度制御ユニットをさらに含み得る。
反応チャンバー中の温度の測定は、上述のように実施することができる。通常、ＰＣＲなどの増幅は、環状様式で繰り返し行われる３つの基本的工程（変性、プライマーの徐冷及びプライマーの伸長）を含む。しかしながら、増幅は、それぞれ、第一の「真の」増幅サイクルの前の最初の変性工程及び／又は最終増幅サイクルの完了後の最終伸長工程をさらに含み得る。本発明の方法の幾つかの実施形態において、標的核酸増幅は、二本鎖核酸を変性させる工程及び／又は標的核酸においてプライマー分子を徐冷し、及び伸長する統合された工程を（少なくとも）含む（すなわち、「二段階ＰＣＲ」）。
変性工程は、９４から９５℃の温度まで、典型的には、０．５秒から５分間、分析されるべき試料を加熱することを含み、これにより、二本鎖核酸テンプレートの鎖解離をもたらす。分析されるべき試料をこのような変性工程に供することによって、二本鎖標的分子、二本鎖レポーター分子、標的核酸とのレポーター化合物の複合体及び（結合要素に付着された）捕捉分子とのレポーター化合物の複合体など、試料中の二本鎖核酸の同時変性をもたらし得（すなわち、可能とし得）、後者は、結合要素からのレポーター化合物の放出をもたらす。
徐冷工程は、変性された核酸テンプレート鎖へのプライマー分子の会合（すなわち、ハイブリッド形成／塩基対）を可能とするために、４０から６５℃の温度まで、典型的には１秒から５分間、分析されるべき試料を冷却することを含む。使用される反応温度は、プライマー分子のヌクレオチド配列組成、融点、分子内折り畳み（例えば、二本鎖ヘアピン又は折り返し構造の形成）の傾向など、徐冷されるべきプライマー分子の化学的及び／又は物理的特性に依存する。このような徐冷工程へ分析されるべき試料を供することによって、二本鎖標的分子の再会合、二本鎖レポーター分子の再会合、核酸標的とのレポーター化合物の複合体の形成及び標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の、捕捉分子との複合体の形成（後者は、結合要素上のレポーター化合物の捕捉又は再捕捉をもたらす。）をさらにもたらし得る（すなわち、可能とし得る。）。従って、幾つかの実施形態において、徐冷工程は、レポーター化合物の量の一部の、標的核酸の量の少なくとも一部との複合体を形成させる工程と同時に、及び／又は結合要素上の標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程と同時に行われる。
最後に、伸長工程は、ＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡテンプレート鎖の完全長コピーを作製するために、ハイブリッド形成されたプライマー分子を伸長させることを含む。増幅されたＤＮＡ断片の長さは、使用されるプライマーの対の５’末端によって決定される。典型的には、伸長工程は、７０から７２℃の温度で、１秒から１０分間行われる。分析されるべき試料をこのような伸長工程に供することは、その後に検出され得る必要に応じて標識されたレポーター化合物を取り込んだ二本鎖の増幅された核酸断片を生じさせるために、徐冷工程中に形成された、標的核酸の量の少なくとも一部とのレポーター化合物の量の一部の複合体を伸長させることにより、分析されるべき標的核酸の複製をさらにもたらし得る。
標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値の検出／測定は、アッセイが行われている間に、１回だけ、又は２回以上実施し得る。単一のアッセイの間に２以上の検出工程が実施される場合には、得られた結果の平均値を計算することができる。とりわけ、１つ若しくはそれ以上の標的核酸の存在、長さ若しくは配列を決定するために、及び／又はその／それらの量を計算するために、検出の１つ又はそれ以上のサイクルにおいて得られたデータを分析し、当業者に公知の適切なコンピュータソフトウェアを用いて、数学的に処理し得る。
幾つかの実施形態において、特に、レポーター化合物が標的核酸より過剰である場合には、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体の形成と結合要素上の標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部の捕捉とが化学的に平衡状態になる前に、結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値が測定される。例えば、測定／検出工程は、増幅反応の徐冷工程の間に行われる。しかしながら、徐冷工程の完了後に（すなわち、伸長工程の間又は完了後に）測定／検出反応を実施することも可能である。
さらなる実施形態において、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程及び結合要素上の標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程を開始してから１秒から１２０秒（例えば、１、５、１０、１５、２０、３０、６０又は１２０秒）後に、結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値が測定される。
他の実施形態において、結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値は、変性、徐冷及び伸長工程を含む環状増幅の少なくとも１つのサイクルの後に、例えば、徐冷工程の間又は完了後に、測定される。特定の実施形態において、値は、環状増幅の各サイクル後に測定される。他の特定の実施形態において、標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値は、結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を決定した後に、毎回測定される。
幾つかの実施形態において、結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量の指標となる値の測定は、指標となる値の時間依存的モニタリング（すなわち、測定／検出工程の実施及び指標となる値の経時的なモニタリングの反復）を含む。
さらなる実施形態において、標的核酸の存在及び／又は量の指標となる値は、レポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値と相関付ける較正曲線に基づいて測定される。
方法は、標的分子又はレポーター特異的捕捉分子と複合体を形成していないレポーター化合物と複合体を形成することができる消光化合物の一定量を添加することをさらに含み得る。消光化合物は、標識による検出可能なシグナルの生成を妨害する１つ又はそれ以上の部分（例えば、蛍光色素の励起から生じた発光を「乗っ取る」消光基）を含み得る。例えば、消光基は、レポーター化合物の検出可能な標識によって発せられたシグナル（例えば、蛍光シグナル）を抑制又は阻害することが可能であり得る。このような実施形態において、消光化合物は、１つ又はそれ以上の消光基が複合体内のレポーター化合物の検出可能な標識と近接するように、標的分子又はレポーター特異的捕捉分子と複合体を形成していないレポーター化合物と複合体を形成することが可能であり得る。
消光化合物は、オリゴヌクレオチドであり得る。この実施形態において、消光オリゴヌクレオチドは、レポーターオリゴヌクレオチドの配列領域と相補的であり、従って、消光化合物とレポーター化合物間の塩基対形成を可能とする少なくとも１つの特異的な配列領域を含み得る。
消光基には、例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｑｘｌ消光物質（ＡｎａＳｐｅｃ）及びＩｏｗａ ｂｌａｃｋ消光物質などの一般的な消光基が含まれ得る。
消光化合物は、上記装置の第二の構造中に付与され得る。このような実施形態において、消光化合物は、第二の結合要素上に捕捉されていないレポーター化合物と複合体を形成し得る。
上記装置の第二の構造は、標的核酸の増幅を開始させる前に、不可逆的に密封され得る。第二の構造の不可逆的な密封は、例えば、第二の構造と接続された熱密封性チャネル及び／又はバルブによって、第二の構造の注入口及び必要に応じて排出口を密封する（例えば、溶接する）ことによって達成され得る。
別の典型的な実施形態によれば、
−流体状態の試料を収容するように適合された装置中に、流体全血試料を導入すること；並びに
−装置中で行われた分析に基づいて、全血試料中のウイルス感染と関連する核酸の存在及び／又は量の指標となる値を測定することを含む、方法が提供される。
特に、測定された値は、ウイルス感染と関連する全核酸の存在及び／又は量の指標である。
別の典型的な実施形態によれば、
−１μＬから５０μＬの容量を有する流体試料を準備すること；並びに
−装置中で行われた分析に基づいて、試料中のウイルス感染と関連する核酸の存在及び／又は量の指標となる値を測定することを含む方法が提供される。
必要に応じて、方法は、流体状態の試料を収容するように適合された装置中に、流体試料を導入すること；並びに装置中で行われた分析に基づいて、全血試料中のウイルス感染と関連する核酸の存在及び／又は量の指標となる値を測定することをさらに含み得る。
特に、測定された値は、ウイルス感染と関連する全核酸の存在及び／又は量の指標である。
本明細書において使用される「流体試料」又は「液体試料」という用語は、方法によって分析され、及び検出されるべき１つ又はそれ以上の核酸（すなわち、ウイルス感染と関連する核酸）を含むと推測される液体を表す。典型的には、分析されるべき流体試料は、生物学的試料である。分析され得る流体試料の例には、とりわけ、全血、血漿、血清、尿、痰、唾液又は脳脊髄液、細胞抽出物、組織培養物などの、ヒト及びヒト以外の体液が含まれる。幾つかの実施形態において、分析されるべき流体試料は、血液試料（すなわち、例えば、全血、血漿及び血清）、特に、全血試料である。
分析されるべき流体試料の容積は、１μｌから５０μｌの範囲、典型的には、１μｌから４５μｌ又は１μｌから４０μｌ又は１μｌから３０μｌ又は１μｌから２５μｌ又は１μｌから２０μｌ又は１μｌから１５μｌの範囲であり得る。特定の実施形態において、流体試料の容積は、１μｌから１０μｌの範囲である。しかしながら、全血試料が分析される場合には、５０μｌを超える試料容量も、本発明の範囲に属する。
本明細書において使用される「全血」という用語は、その全ての構成成分を有する血液を表す。換言すれば、全血は、赤血球、白血球及び血小板などの血液細胞並びに血液細胞がその中に懸濁されている血漿をともに含む。
本明細書において使用される「血漿」という用語は、血液の液体溶媒を表し、水、血漿タンパク質並びに血清アルブミン、血液凝固因子、免疫グロブリン（抗体）、ホルモン、二酸化炭素、様々な他のタンパク質及び様々な電解質（主に、ナトリウム及び塩化物）などの他の物質の微量を含有する実質的に水性の溶液である。
本明細書において使用される「血清」という用語は、凝固タンパク質が除去された血漿を表す。
さらなる実施形態において、装置中に導入された流体試料は、処理されていない全血試料である。本明細書において使用される「処理されていない」という用語は、（例えば、患者からの採血によって）試料を集めた後に、及び試料を本発明の方法に供する前に、さらなる試料の処理（例えば、分画法、試料保存のために、例えば、ろ紙上で全血を乾燥させ、水に再溶解することによる乾燥された血液試料の再構成など）は行われないことと理解すべきである。
しかしながら、例えば、冷蔵庫又は冷凍機中での試料の保存そのものは、上に定義されている処理工程と考えるべきではない。従って、収集後直ちに、試料を装置中に導入してもよく、又は１時間若しくはそれ以上から１日若しくはそれ以上若しくは１週若しくはそれ以上、試料を保存した後に、試料を装置中に導入してもよい。
さらに、全血試料は、試料の長期保存時に血餅の形成を引き起こし、従って、その存在がその後の分析を妨害し得る血液凝固因子を含むので、抗凝固物質（すなわち、血液凝固の阻害剤）の添加も、本発明の意義における試料の処置ではない。抗凝固物質として作用する複数の化合物が、本分野において周知である。抗凝固物質の例には、とりわけ、天然又は合成の（すなわち、化学的合成及び／又は組換えＤＮＡ技術によって得られる）ビタミンＫアンタゴニスト、天然又は合成の直接的トロンビン阻害剤、シトラート、オキサラート、ヘパリン及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が含まれる。
他の実施形態において、流体全血試料は、患者から直接（すなわち、上に定義されているように、処理されていない形態で）装置中に導入される。特に、流体全血試料は、患者の指先の穿刺から取得され得る。例えば、指先の穿刺後に、外的操作なしに、毛細管力によって血液が導入されるように、血液を毛細管と接触させることによって、漏出する血液を収集し得る。次いで、血液が装置中に通過できるように、又は装置中へ能動的に輸送され得るように、使用されているアッセイ装置に対して毛細管を配置させ得る。あるいは、穿刺からの血液の漏出が装置中に導入され得るように、（例えば、開口部上に指先を直接押し付けることにより）以下に詳述されている装置の開口部の１つへ直接隣接して穿刺された指先を配置させることができる。
本明細書において使用される「ウイルス感染と関連する核酸」という用語は、１つ又はそれ以上のウイルス種によって感染された、分析されるべき流体試料中に存在するウイルス起源のあらゆる核酸分子（すなわち、そのヌクレオチド配列が、ウイルスゲノム内の対応する配列と同一であり、又は相補的である。）を表す。流体試料が得られた宿主に感染するウイルスは、あらゆるＤＮＡウイルス（すなわち、ＤＮＡゲノムを有するウイルス）又はＲＮＡウイルス（すなわち、ＲＮＡゲノムを有するウイルス）であり得る（例えば、Ｂｕｃｈｅｎ−Ｏｓｍｏｎｄ，Ｃ．（２００３）．Ｔａｘｏｎｏｍｙ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｉｎ：Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ８ｔｈ ｅｄ．， ｖｏｌ．２， ｐ．１２１７−１２２６， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ中に概説されている。）。ＤＮＡウイルスの例には、とりわけ、パポバウイルス科（例えば、パピローマウイルス）、アデノウイルス科（例えば、アデノウイルス）及びヘルペスウイルス科（例えば、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス）の科が含まれる。ＲＮＡウイルスの例には、とりわけ、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス）、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、フィロウイルス科（例えば、マールブルグウイルス、エボラウイルス）及びレトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））が含まれる。幾つかの実施形態において、検出されるべき核酸は、レトロウイルス科の一員によって引き起こされる感染症と関連しており、特に、ＨＩＶ感染症と関連している。本明細書において使用される「ＨＩＶ」という用語は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の両種を表し、並びにこれらに由来するあらゆるサブタイプを表す。
多くのＤＮＡウイルス及びレトロウイルス科（特に、レトロウイルス科の複製には、ＲＮＡウイルスゲノムのＤＮＡへの逆転写を一般に必要とする。）は、潜伏性プロウイルスの形態で、宿主細胞のゲノム中へ遺伝情報を組み込むことができるので、「ウイルス感染と関連する核酸」という用語は、遊離のウイルス及び細胞に随伴したウイルスに由来する核酸を表すのみならず、宿主ゲノム中に組み込まれているプロウイルスＤＮＡ分子、逆転写されたウイルスＤＮＡ分子（すなわち、ウイルス複製の「中間体」）及びプロウイルスＤＮＡに由来する転写物（すなわち、宿主ＤＮＡゲノムの転写によって得られるＲＮＡ分子）も表す。
特定の実施形態において、方法は、分析されるべき流体試料中の全ウイルス核酸の量を測定することが意図される。換言すれば、方法は、患者のウイルス感染と関連する核酸の全ての異なる種（すなわち、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の両方）及び細胞のサブセット（すなわち、空間的に隔てられた核酸プール）の検出を目的とし得る。典型的には、検出されるべき核酸は、ＨＩＶ感染などのウイルス感染の単一種と関連する。しかしながら、患者がウイルスの異なる種類での同時感染に罹患することも可能であり得る。方法は、単一の分析で同時に又は複数の別個の分析で（但し、同じ流体試料を用いて、実施し得る。）、ウイルスの異なる各種類と関連する核酸の存在及び／又は（全）量を測定することをさらに含み得る。
従って、患者がＨＩＶに感染している場合には、その患者から得られた全血試料中に存在し得るＨＩＶ感染と関連する核酸は、遊離のＨＩＶに由来するＲＮＡ分子（すなわち、血漿中を自由に循環しているウイルス粒子）、細胞に随伴しているＨＩＶに由来するＲＮＡ分子（すなわち、血液細胞の何れかの種類に付着されたウイルス粒子）、宿主のゲノム中に組み込まれているプロウイルスＨＩＶＤＮＡ分子、逆転写されたＨＩＶＤＮＡ分子及びプロウイルスＤＮＡに由来するＨＩＶ転写物を含む。しかしながら、他の全てのＨＩＶ核酸種は患者の除去された血液細胞に随伴しているので、同じ患者から得られた血漿試料は、遊離のＨＩＶに由来するＲＮＡ分子のみを含む。
本明細書において使用される「装置」という用語は、上記方法を用いて試料をアッセイするのに適したあらゆる機器類を表すが、但し、装置は、「流体状態の試料を収容するように適合されている」ものとする（これは、試料を装置中に収容しながら、試料の流体（すなわち、液体）状態が維持されるように、装置が構成されていることを意味する。）。すなわち、ろ紙上に試料を適用し、過剰な液体を蒸発させるなど、核酸分析が行われる前に、試料は決して装置中で乾燥されない。本明細書において、このような装置は、「微小流体装置」とも称される。
方法において使用するための典型的な装置は、本明細書中に記載されている。このような装置の典型的な実施形態は、図１７から１９に示されている。方法を実施するのに適したさらなる装置は、欧州特許出願ＥＰ０６１２２６９５号及び国際特許出願ＷＯ２００７／０５１８６１号（両者の関連する内容も、本明細書に明示的に引用される。）中に記載されている。
方法を実施するために使用される装置は、液体試料を収容するための少なくとも１つの構造（本明細書において、「反応チャンバー」又は「反応空間」とも称される。）を含む。本明細書において使用される「反応チャンバー」という用語は、下部表面と上部表面（第一及び第二の表面とも称される。）間の装置内に形成され、実際の分析の少なくとも１つの工程（例えば、標的核酸の検出）がその中で行われる空間を表す。下部及び上部表面は、互いに対向して又は実質的に対向して配置され得る。例えば、下部及び上部表面は、互いに平行に又は実質的に平行に配置され得る。
幾つかの実施形態において、少なくとも１つの反応チャンバーの少なくとも一部は、核酸検出を容易にするために、透明な材料、すなわち、光透過性材料で作製されている。適切な透過性材料の例には、とりわけ、ガラス又はガラス様材料（例えば、アクリルガラス）及び合成ポリマー（例えば、ポリメチルメタクリラート、アクリル又はポリエチレン）が含まれる。
他の実施形態において、少なくとも１つの反応チャンバーの少なくとも一部は、柔軟であり、又は弾性的に変形可能である。すなわち、反応チャンバーの少なくとも１つ又はそれ以上の一部が、弾性的に変形可能な材料、例えば、弾性的な膜（例えば、シリコーンゴム）から作製される。
使用される幾つかの装置において、少なくとも１つの反応チャンバーは、２つ又はそれ以上のサブチャンバーを含み得る。これは、２つ又はそれ以上のサブチャンバー間の側方側壁としての役割を果たす１つ又はそれ以上の仕切り又は空洞を第一の表面及び／又は第二の表面に付与することによって達成することができる。
幾つかの実施形態において、装置は、１つの試料の複数のアッセイを平行して実施するために、又は異なる反応チャンバー中で、連続的にアッセイの異なる工程を実施するために、２以上の反応チャンバーを含む（図１７も参照。）。この目的のために、反応チャンバーは、互いに、流体連通させ得る。本明細書において使用される、「流体連通する」という用語は、直接的に又は共通の試料導入路、充填ユニット、処理ユニットなどのさらなる手段（「微小流体ネットワーク」とも称される。）を介して間接的に、各反応チャンバー間でのあらゆる相互接続を表す。しかしながら、本明細書において使用される場合、この用語は、試料を導入した後に、反応チャンバーが、恒常的に互いに流体連通していることを必ずしも意味するものではない。反応チャンバーは、例えば、反応チャンバー間の接続部における一方向又は二方向バルブによって達成される、一過性の流体連通であり得る。
方法において使用されるアッセイ装置において、少なくとも１つの反応チャンバーの少なくとも１つの下部表面と上部表面間の距離は、１つ又はそれ以上のアクチュエータ（変位装置とも称される。）を介して変動させ得る。アクチュエータは、下部表面及び／若しくは上部表面又はこれらの少なくとも１つ若しくはそれ以上の一部を互いに関して垂直に移動させるための手段を表す。従って、表面間の距離の変動は、表面領域全体にわたって必ずしも起こらなくてもよく、表面の一方又は両方の表面領域の少なくとも１つの部分へ局所的に限定され得る。典型的には、下部表面及び／又は上部表面間の距離は、例えば、表面の一方又は両方の少なくとも一部へ、アクチュエータを介して圧力をかけることによって短縮される。アクチュエータは、下部表面又は上部表面の一体化された一部を構成することができ（例えば、隆起又はバックルとして構成される。）、又は反応チャンバーの外側に配置された独立の、すなわち、内蔵型の構成要素（他ペット又はステンシルなど）に相当し得る。
１つ又はそれ以上のアクチュエータを介した上部表面と下部表面間の距離の変動は、特定の反応チャンバー内の試料の少なくとも一部を除去し、及び／又は異なる方法の工程がその中で行われ得る異なる反応チャンバー（又はサブチャンバー）間の試料の少なくとも一部を移動（輸送）させ得る。すなわち、アクチュエータを作動させることによって、装置の少なくとも１つの反応チャンバー内に又は装置の少なくとも１つの反応チャンバー間に、試料が移動される。従って、表面間の距離の反復的な交互の短縮及び再増加は、反応チャンバー内での、試料の対応する前方及び後方への移動（すなわち、試料の混合）ももたらす。
１つ又はそれ以上のアクチュエータを介して、反応チャンバーの下部表面及び上部表面間の距離を変動させることに代えて、装置中での流体試料の輸送又は移動は、とりわけ、ポンプを用いて、特に、真空ポンプ又は蠕動ポンプを使用することによって達成され得る。
本明細書において使用される装置の反応チャンバーは、少なくとも１つの反応チャンバーの下部表面及び／又は上部表面上に配置された１つ又はそれ以上のマイクロアレイ（本明細書において、「アレイ」又は「アレイ要素」とも称される。）をさらに含み得る。本明細書において使用される「マイクロアレイ」は、支持部材（「基材」又は「結合要素」とも称される。）上への捕捉分子（例えば、プローブ分子の１つ若しくはそれ以上の種又は物質ライブラリー；以下も参照）。の規定の空間的配置（レイアウト）を表し、マイクロアレイ内の各分子の位置は別個に決定されている。典型的には、マイクロアレイは、特定のパターンで配置され得る規定の部位又は所定の領域（すなわち、いわゆる、アレイ要素又はスポット）を含み、各アレイ要素は、典型的には、捕捉分子の１つの種のみを含む。支持体上の捕捉分子の配置は、共有又は非共有相互作用を用いて作製することができる。マイクロアレイ用の適切な基材には、とりわけ、顕微鏡スライド、ウェハー又はセラミック材料が含まれる。しかしながら、下部表面及び／又は上部表面上に、捕捉分子を直接固定化することもできる。
方法において使用される装置の反応チャンバーは、ロック可能及び／又は密封可能であり得る、並びに分析されるべき試料及び方法を実施するためにも場合により必要とされ得るあらゆる追加の試薬、検出試薬などの直接的導入のために使用され得る１つ又はそれ以上の開口部をさらに含み得る。あるいは、このような開口部は、とりわけ、充填ユニット、処理ユニット、温度調節ユニット、特異的検出ユニット及び廃棄容器など、装置の一体的な部分として設計されていない装置のあらゆる追加的（補充的）モジュールを取り付けるためにも使用され得る。
特定の実施形態において、装置は、バイオセンサーアッセイ装置、微小流体カートリッジ及びラブオンチップからなる群から選択される装置である。
幾つかの実施形態において、装置は、流体（すなわち、液体）試料中の核酸を検出するように適合される。換言すれば、装置は、反応チャンバーに接続され得る、上記のような検出システム、例えば、光学的検出システムをさらに含む。典型的には、検出システムは、少なくとも１つの反応チャンバーの１つに対向して配置されており、場合により、検出が行われる特定の表面領域に対向して配置されている。適切な検出システムの選択は、検出のために使用される標識の種類又は実施される分析の種類など、幾つかのパラメータに依存する。幾つかの実施形態において、方法の実施は、蛍光、光吸収、共鳴転移などのパラメータの測定に基づき得る単純な検出システムを含む。
典型的には、装置及びシステムは、自己含有されている。すなわち、アッセイを実施する間に、装置及びシステムは、反応チャンバー中の試料及び／又は他の何れかの試薬の除去及び／又は置換を必ずしも必要としない。従って、このような装置は、試料注入ポートのみを含み得るが、排出ポートは含まない。
分析されるべき流体試料は、ロック可能及び／又は密封可能であり得る少なくとも１つの反応チャンバーの１つ又はそれ以上の開口部を介して、装置中に直接導入され得る。適切な圧力生成手段、例えば、ピペット、注射器又は自動化されたユニット（例えば、加工処理装置の機能的ユニットであり得る。）を使用することによって、必要に応じてさらなる試薬（緩衝液又は他の希釈剤、検出分析を実施するための染料、標識、アッセイ試薬又は酵素など）とともに、試料を反応チャンバー中に転移させ得る。あるいは、例えば、反応チャンバーを区切る表面の何れかの中に存在する開口部の１つに直接隣接して試料を配置することによって、一切の外的な操作なしに、毛細管力によって、試料を反応チャンバー中に導入することもできる。
方法は、方法を実施しながら、反応チャンバー中の試料及び／又は他の何れかの試薬を除去及び／又は置換する必要なしに実施し得る。しかしながら、幾つかの用途は、目的の核酸のさらなる検出を可能とするために何らかの標識を含む１つ又はそれ以上の薬剤などの、さらなる試薬を反応チャンバー中に導入することを必要とする場合があり得る。このようなさらなる溶液は、試料を導入する前に又は試料と同時に又は試料が反応チャンバー中に導入された後に、上述のように反応チャンバー中に直接導入することもできる。幾つかの実施形態において、試料を添加する前に、特に、粉末、顆粒又はペレットなどの凍結乾燥された形態又は乾燥形態で、さらなる試薬が装置内に付与される。
あるいは、分析すべき試料の導入及び必要に応じてさらなる試薬の導入は、装置の一体的な部分であり得る１つ若しくはそれ以上の充填ユニットを用いて間接的な様式で行うことが可能であり得、又は反応チャンバーを充填するために反応チャンバーに取り付け、使用後には取り外すことができる別個の部分として設計され得る。分析されるべき液体試料を保持することができ、及び反応チャンバーへ（可逆的に）接続され得るあらゆる容器を充填ユニットとして使用し得る。例えば、充填ユニットは、血液試料の採取に適した毛細管であり得る。
装置は、反応チャンバーから余剰溶媒を取り込む役割を果たす一体型の又は取り外し可能な別個の廃棄容器を含み得る。必要に応じて、廃棄容器は、余剰物質を可逆的に又は不可逆的に結合するさらなる気体、液体又は固体充填媒体（とりわけ、セルロース、フィルター材料及びシリカゲルなどの）を含む。さらに、廃棄容器は、余剰材料の廃棄容器への転移を向上させるために、１つ若しくはそれ以上の換気装置を含み得、又はその内部に真空を付与され得る。
試料及び必要に応じて何れかの追加試薬が反応チャンバー中に導入された後、又は１つ若しくはそれ以上の充填ユニットから反応チャンバー中に転移された後、反応空間全体に適切な拡散を可能とするために、所定の期間、反応チャンバー中で、試料を必要に応じて温置し得る。典型的には、温置期間は、１秒から３０分の範囲、例えば、１０秒から１５分の範囲、又は３０秒から１０分の範囲である。
幾つかの実施形態において、装置中で行われる分析は、分析されるべき流体試料から核酸を放出させることをさらに含む。この目的のため、細胞膜及び／又はウイルスのキャプシドを破壊するために、（例えば、以下に記載されているような温度調節ユニット及び／又は温度制御ユニットを使用することによって）試料を加熱し得る。幾つかの実施形態において、この放出工程は、流体試料を上に記載されているような溶解試薬と接触させることを含む。
さらなる実施形態において、装置中で行われる分析は、ウイルス感染と関連する核酸を増幅すること、すなわち、さらなる検出を容易にするために、試料をさらなる分析に供する前に、試料中に存在する核酸の量を増加させることをさらに含む。典型的には、核酸増幅は、上述のようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて達成される。
とりわけ、この目的（すなわち、核酸増幅）のために、方法において使用される装置は、反応チャンバー内の温度を調節及び／又は制御するために、上述されているような温度調節ユニット及び／又は温度制御ユニットをさらに含み得る。
反応チャンバー中の温度の測定は、上述のように実施することができる。
幾つかの実施形態において、装置中で実施される分析は、複合体を形成することをさらに含み、各複合体はウイルス感染と関連する核酸及び捕捉分子を含み、捕捉分子はウイルス感染と関連する核酸の領域に対して特異的な結合部分及びアンカー基を含む。
この実施形態において使用される「捕捉分子」という用語は、捕捉分子を検出されるべき核酸との複合体の形成に適したものとする、特異的な結合挙動及び／又は特徴的な反応性を示すあらゆる分子を表す。典型的には、捕捉分子として核酸が使用される。捕捉分子として使用することができる核酸の例には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）などの天然に存在する核酸及びとりわけ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又は鍵型核酸（ＬＮＡ）などの核酸類縁体が含まれる。天然に存在する核酸の具体例には、ゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ分子などのＤＮＡ配列並びにｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ若しくはｒＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子又はこれらの逆相補核酸配列が含まれる。このような核酸は、あらゆる長さであり得、一本鎖又は二本鎖分子であり得る。典型的には、核酸捕捉分子は、１０から１５０ヌクレオチドの、例えば、２０から１００ヌクレオチド、２５から８０ヌクレオチド又は３０から７０ヌクレオチドの長さを有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、ある流体試料中に存在するあらゆる興味深い標的核酸を増幅するために、ＰＣＲ中におけるプライマーとして捕捉分子が使用される。
幾つかの実施形態において、捕捉分子は、ウイルス感染と関連する核酸（すなわち、標的核酸）の配列領域に対して相補的であり、従って、捕捉分子と検出されるべき核酸との間での塩基対形成を可能とする少なくとも１つの特異的配列領域（すなわち、上に参照されている結合部分）を含む。典型的には、特異的結合領域は、少なくとも１２ヌクレオチド長、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド又は少なくとも２２ヌクレオチドである。特に、捕捉分子の結合領域のヌクレオチド配列は、標的核酸の対応するヌクレオチド配列に対して相補的である。本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子）の両方を表すものとして理解すべきである。
分析されるべき流体試料を導入する前に、装置の少なくとも１つの反応チャンバーの１つ又はそれ以上の中に、（例えば、凍結乾燥された形態又は乾燥形態で）捕捉分子を付与し得る。あるいは、捕捉分子は、試料とともに（すなわち同時に）又は試料が既に導入された後に、装置中に導入され得る。
捕捉分子の１つ又はそれ以上の種を使用し得る。「１つ又はそれ以上の種」という用語は、異なるヌクレオチド配列を有する１つ又はそれ以上の核酸分子など、捕捉分子の１つ又はそれ以上の異なる種類を表す。同時に使用される捕捉分子の２以上の種は、「ライブラリー」とも称される。このようなライブラリーは、少なくとも２つの異なる分子を含むが、多くのさらなる異なる分子、例えば、少なくとも５つの異なる種、少なくとも１０の異なる種、少なくとも３０の異なる種なども含み得る。ライブラリーは、アレイ要素の形態で又は他のあらゆる空間的配置でも存在し得る。
他の実施形態において、装置中で行われる分析は、検出されるべき核酸及び捕捉分子を含む複合体を、該複合体を第一の結合要素に結合させるために、捕捉分子のアンカー基を結合するように構成されている装置の第一の結合要素と接触させることをさらに含む。
本明細書において使用される「第一の結合要素」という用語は、共有又は非共有相互作用により、捕捉分子のアンカー基を介して、捕捉分子を結合することができ、従って、このような捕捉分子を含むあらゆる複合体も結合することができるあらゆる固体マトリックスを表す。このようなマトリックスの例は、アレイ要素（上記参照）、又はとりわけ、磁気ビーズ（例えば、常磁性ポリスチロールビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｒ）としても知られる。））及びラテックスビーズなどの合成粒子を含む。捕捉分子の種類、アンカー基の種類及び予定される用途に応じて、各事例において、多様な結合が可能である。例えば、捕捉分子のアンカー基は、結合要素に付着されているアビジン又はストレプトアビジン基に結合され得るビオチン部分であり得る。あるいは、捕捉分子は、結合要素に結合されたチミジン残基の対応する連なりと相互作用するアデノシン残基の連なり（例えば、１０個のアデノシン残基）を含み得る。特異的な結合試薬は、様々な業者から市販されており、本分野において十分に確立されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．，上記；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ，上記、及びＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．， ａｎｄ Ｚｏｒｂａｓ Ｈ．，上記、参照）。
分析されるべき流体試料を導入する前に、装置の少なくとも１つの反応チャンバーの１つ又はそれ以上の中に、第一の結合要素を付与し得る。これにより、捕捉分子と同じ１つ若しくはそれ以上の反応チャンバー中に、又は少なくとも１つの異なる反応チャンバー中に、結合要素を付与し得る。典型的には、ウイルス感染と関連する核酸との捕捉分子の複合体を形成する工程は、第一の結合要素と複合体を接触させる工程から空間的に隔てられて、すなわち、装置の異なる反応チャンバー中で（例えば、図１７に引用されている「溶解ウェル」及び「中央ウェル」）実施される。このような実施形態において、捕捉分子及び第一の結合要素は、通常、異なる反応チャンバー中に付与される。試料を添加する前に、装置中に第一の結合要素を付与する代わりに、試料と一緒に（すなわち、同時に）又は試料が既に導入された後に、第一の結合要素を装置中に導入し得る。
特定の実施形態において、方法は、典型的には第一の結合要素に関して、分析されるべき試料をＰＣＲに供することによって増幅された標的核酸を捕捉する（すなわち、第一の結合要素上に標的核酸を固定化する）ことをさらに含む。
他の特定の実施形態において、装置中で行われる分析は、ウイルス感染と関連する核酸との複合体を形成することができ、及び装置の第二の結合要素上に捕捉され得る相互作用部位を含むレポーター分子を準備することをさらに含む。
本明細書中において使用される「レポーター分子」又は「レポーター化合物」という用語は、検出されるべき標的核酸及び第二の結合要素の両方と相互作用することができるあらゆる分子を表す。これにより、相互作用は、レポーター分子中に含まれる共通の又は異なる結合領域を介して起こる。一般に、レポーター分子は、１０から１００のヌクレオチド、例えば、１５から５０のヌクレオチド又は２０から３０のヌクレオチドの長さを有する核酸分子（すなわち、上記のようなＲＮＡ又はＤＮＡ分子）である。通常、レポーター分子は、一本鎖核酸分子（すなわち、オリゴヌクレオチド）である。幾つかの実施形態において、核酸レポーター分子は、標的核酸と相互作用することが可能であるのみならず、第二の結合要素上にも捕捉され得る単一の結合領域を含む。典型的には、相互作用は可逆的である。第二の結合要素上に捕捉する工程は、捕捉分子に関して上述されているように、レポーター分子中に含まれるアンカー基を用いて達成され得る。一般に、レポーター分子中に含まれる特異的結合領域は、少なくとも１２ヌクレオチド長、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド又は少なくとも２２ヌクレオチドである。特に、レポーター分子の結合部分のヌクレオチド配列は、標的核酸の対応するヌクレオチド配列に対して相補的である。
分析されるべき流体試料を導入する前に、本発明において使用される装置の少なくとも１つの反応チャンバーの１つ又はそれ以上の中に、（例えば、凍結乾燥された形態／乾燥形態で）レポーター分子を付与し得る。これにより、捕捉分子及び／又は第一の結合要素と同じ１つ若しくはそれ以上の反応チャンバー中に、又は少なくとも１つの異なる反応チャンバー中に、レポーター分子を付与し得る。あるいは、しかしながら、レポーター分子は、試料とともに（すなわち同時に）又は試料が既に導入された後に、装置中に導入され得る。
幾つかの実施形態において、上記レポーター分子及びレポーター特異的捕捉分子は、ウイルス感染と関連する核酸への結合に関して競合する。すなわち、レポーター特異的捕捉分子中に含まれるそれぞれの結合領域及びレポーター分子は、標的核酸の同じ又は少なくとも類似の対応する配列を認識する。本明細書において使用される「類似の配列」という用語は、１つ若しくはそれ以上の単一ヌクレオチドの不一致（すなわち、ヌクレオチドの非相補的な対）のみが異なる配列又は１つ若しくはそれ以上の単一ヌクレオチドの付加、挿入若しくは欠失（すなわち、ヌクレオチド残基の付加又は欠如）が異なる配列を表す。換言すれば、レポーター特異的捕捉分子及びレポーター分子中に含まれるそれぞれの結合領域は、少なくとも部分的に同一である。本明細書において使用される「部分的に同一」という用語は、上述されているように、１つ若しくはそれ以上の単一ヌクレオチドにおいてのみ異なる配列、又は重複する結合部位を有する配列、すなわち、共通のヌクレオチド配列を共有するが、配列領域の少なくとも１つの他の部分が異なる配列を表す。しかしながら、競合する捕捉分子及び標的核酸中に含まれているそれぞれの結合領域は、レポーター分子の異なる重複していない（例えば、隣接する）配列を認識するが、レポーター分子への捕捉分子又は標的核酸の結合は、他の分子の結合を立体的に妨害することも可能である。
本発明において使用するための典型的なレポーター分子及びウイルス感染と関連する核酸を検出するための典型的な競合的アッセイは、本明細書中に記載されている。
本明細書において使用される「第二の結合要素」という用語は、第一の結合要素と同じ固体マトリックスの種類（すなわち、第一及び第二の結合要素は、同一であり得る。）又は固体マトリックスの異なる種類を表し得る。分析されるべき流体試料を導入する前に、本発明において使用される装置の少なくとも１つの反応チャンバーの１つ又はそれ以上の中に、第二の結合要素を付与し得る。これにより、捕捉分子及び／若しくは第一の結合要素及び／若しくはレポーター分子と同じ１つ若しくはそれ以上の反応チャンバー中に、又は少なくとも１つの異なる反応チャンバー中に、第二の結合要素を付与し得る。試料を添加する前に、装置中に第二の結合要素を付与する代わりに、試料と一緒に（すなわち、同時に）又は試料が既に導入された後に、第二の結合要素を装置中に導入し得る。
幾つかの実施形態において、装置中で行われるアッセイは、
−第二の結合要素からレポーター分子を放出させ、放出されたレポーター分子に、ウイルス感染と関連する核酸との複合体を形成させ、及びウイルス感染と関連する核酸と複合体を形成していないレポーター分子を第二の結合要素上に再捕捉させること；
−第二の結合要素上に捕捉されたレポーター分子の量に対する指標となる１つ若しくはそれ以上の値を測定すること；及び／又は
−レポーター分子の量に対する指標となる値に基づいて、ウイルス感染と関連する核酸の量に対する指標となる１つ若しくはそれ以上の値を測定すること
をさらに含む。
第二の結合要素からレポーター分子を放出させる工程は、第二の結合要素がその中に付与されている装置の１つ又はそれ以上の反応チャンバー中の温度を増加させることによって達成され得る。温度の変動は、上記のように１つ又はそれ以上の温度調節及び／又は温度制御ユニットを使用することによって達成され得る。このような温度増加は、例えば、装置中で行われるＰＣＲの変性工程の間に起こり得る。レポーター分子と標的核酸の間での複合体の形成及び／又は第二の結合要素上の標的核酸と複合体を形成していないレポーター分子の再捕捉は、例えば、ＰＣＲの徐冷及び／又は伸長工程の間に、それぞれの１つ又はそれ以上の反応チャンバー中の温度を減少させることによって達成することができる。ＰＣＲ増幅を実施するための実験的な設定及び温度特性は、本分野において十分に確立されている。従って、幾つかの実施形態において、レポーター分子を第二の結合要素から放出させ、放出されたレポーター分子に、ウイルス感染と関連する核酸との複合体を形成させ、及びウイルス感染と関連する核酸と複合体を形成していないレポーター分子を第二の結合要素上に再捕捉させながら、ウイルス感染と関連する核酸は、さらに増幅に供される。
幾つかの実施形態において、方法は、実際の検出反応を実施する前に、装置の反応チャンバー中に、１つ又はそれ以上の検出可能な部分をそれぞれ含む１つ又はそれ以上の因子を導入することをさらに含む。すなわち、１つ又はそれ以上の検出可能な部分を含む因子は、上述のように、試料を導入する前に（すなわち、１つ又はそれ以上の反応チャンバー中に、因子は付与され得る。）、試料と同時に、又は直接若しくは充填ユニットを介して試料が導入された後に、反応チャンバー中に導入され得る。
本明細書において使用される「１つ又はそれ以上の検出可能な部分を含む因子」という用語は、化学的、物理的又は酵素的反応において、検出可能な化合物又はシグナルを直接又は間接的に生成する、１つ又はそれ以上の適切な化学物質又は酵素（すなわち、１つ又はそれ以上の「部分」）を含むあらゆる化合物を表す。従って、このような因子は、目的の標的核酸及び／又はレポーター化合物との相互作用の形成を可能とすることによって、目的の標的核酸及び／又はレポーター化合物の検出のために必要とされ得、又は検出を容易にする。本明細書において使用されるこの用語は、検出可能なマーカーそのもの（「標識」とも称される。）及び１つ又はそれ以上のこのような検出可能なマーカーに結合されたあらゆる化合物を含むものと理解すべきである。さらに、標識による検出可能なシグナルの生成を妨害する部分（例えば、消光物質と蛍光色素が互いに近接する限り、蛍光色素の励起から生じた発光を「乗っ取る」消光物質）も、検出可能な標識に属する。検出可能なマーカーは、例えば、修飾された及び／又は標識されたリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド又はジデオキシヌクレオチドの形態の捕捉分子及び／又は標的核酸及び／又はレポーター分子の一部であり得、又はこれらに結合され得る。
使用され得る検出可能なマーカー又は標識は上記されており、蛍光性標識が含まれる。
本明細書において使用される「ウイルス感染と関連する核酸の存在及び／又は量に関して指標となる値を測定する」という用語は、所定の流体試料中に存在する標的核酸の定性的及び／又は定量的測定を可能とする、電気伝導度、酸化還元電位、光学的吸収、蛍光強度又は生物発光などのパラメータの検出／測定を表す。これらのパラメータの１つのみを測定することができるが、２以上のパラメータ（例えば、電気伝導度及び適切な標識によって引き起こされた蛍光シグナルの強度）を同時に又は連続して測定することも可能である。
幾つかの実施形態において、方法は、ウイルス感染と関連する全核酸の存在及び／又は量の指標となる値に基づいて、患者中のウイルス負荷量に対する指標となる１つ又はそれ以上の値を測定することをさらに含む。本明細書において使用される「ウイルス負荷量」という用語は、血液の所定の容量中に存在するウイルスの量（血液１ｍＬ当りに存在するウイルスのコピー数として通常計算される。）を表す。ウイルスコピー数は、本分野において周知の適切なコンピュータソフトウェアパッケージ（上記参照）を使用することによって、とりわけ、所定の試料中に存在するウイルス核酸の全濃度に基づいて測定され得る。
検出反応は、使用される装置の特定の反応チャンバー（「検出チャンバー」とも称される。）中で、又は「検出ゾーン」と称される反応チャンバーの特定のセグメント（例えば、透明な材料で作製されている、反応チャンバーの下部表面及び／又は上部表面の１つ又はそれ以上の部分の間に位置する領域）中で行われ得る。定量的な測定のために、それぞれ、既知の容量を有する検出チャンバー及び／又は検出ゾーンを含む装置が使用され得る。
標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値の検出／測定は、アッセイが行われる間に、一回だけ又は二回以上行われ得る。単一のアッセイの間に２回以上の検出工程の場合には、得られた結果の平均値が計算される。検出の１又はそれ以上のサイクルにおいて得られたデータは、とりわけ、１つ若しくはそれ以上の標的核酸の存在、長さ又は配列を測定するために、及び／又はその／それらの量を計算するために、当業者に公知の適切なコンピュータソフトウェアを用いて分析し、数学的に処理され得る。別の典型的な実施形態によれば、本発明は、ある流体試料中の、特に全血試料中のＨＩＶを検出するための（すなわち、ウイルスの存在のみを決定するための）、本明細書中に記載されている方法の使用及び患者中のＨＩＶ負荷量を測定するための（すなわち、存在するウイルスの量を測定するための）使用に関する。
別の典型的な実施形態によれば、本発明は、例えば、本明細書中に記載されている方法によって測定された全ウイルス核酸の量の、診断マーカーとしての使用に関する。特定の実施形態において、診断マーカーとして使用される全ウイルス核酸は、ＨＩＶ核酸である。
試料の「廃棄された」部分に存在している全てのポリヌクレオチドは、さらなる分析から除外されるので、試料の分画又はその他の加工処理工程が偽陰性のアッセイ結果を引き起こし得ることが見出されている。このことは、例えば、初期段階で病的状態の開始を証明するために、稀なポリヌクレオチド（すなわち、極めて低いコピー数で存在するに過ぎない核酸）の確実な検出が必要とされる用途においてのみならず、例えば、このデータを、病状及び／又は進行を評価するためのマーカーとして使用するために、試料中に存在する１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドの正確な定量的測定を目的としたあらゆる使用においても特に重要である。
例えば、感染すると、それらの宿主ウイルスは、直ちに複製を開始し、継続的なウイルス放出をもたらし、従って、ウイルスの増殖及び拡散をもたらし得る。これに加えて又はこれに代えて、ウイルスの少なくとも幾つかの種類が、例えば、宿主細胞のゲノム中に組み込まれたプロウイルスの形態で、複製の前に、潜伏（すなわち、静止）状態を経る場合があり得る。従って、患者が特定のウイルスによって感染されているかどうかを測定するために、方法は、活発に複製されたウイルス粒子に起因する核酸を検出することのみならず、標的細胞自体の密接な一部としてのプロウイルス核酸を検出することをも含み得る。さらに、ウイルスは、遊離の粒子又は「輸送担体」として使用される宿主細胞の表面に結合された粒子としても存在し得る。遊離の粒子として、及び／又は宿主細胞に付着された粒子として、及び／又はプロウイルスとして感染した患者中に付随して存在し得るウイルスの臨床的に重要な一例は、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）である。
既に上述されているように、ウイルスの生活環は高度に多様であり得る。典型的には、感染に際して、ウイルスは、宿主細胞中で複製し、新たなウイルス粒子の集合後に、宿主細胞から子孫が放出される。しかしながら、宿主に感染して直ちに複製することに代えて、幾つかのウイルスは、潜伏したプロウイルスの形態で、宿主細胞のゲノム中へその遺伝情報を統合する。さらに、ウイルスは、専ら、例えば、血流中を循環する遊離のウイルス粒子の形態で宿主内を拡散し得る。他のウイルスは、遊離のウイルス粒子として存在するのみならず、例えば、血液細胞に付着された状態を保ち、血液細胞を輸送担体として使用する細胞随伴ウイルスの形態でも存在し得る。特に、このような多様なウイルスプールは、宿主中で異なる寿命（インビボ半減期）も示し得る（すなわち、異なる期間にわたって検出可能であり得る。）（図３５も参照）。例えば、ＨＩＶ感染の場合には、血漿中を循環する遊離のウイルスは平均０．３日の寿命（すなわち、０．２４日のインビボ半減期）を有するのに対して、感染した細胞（例えば、ＨＩＶプロウイルスを有する白血球）は、２．２日の平均半減期（すなわち、１．６日のインビボ半減期）を有することが示されている（例えば、Ｐｅｒｅｌｓｏｎ， Ａ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１，１５８２−１５８６））。
従って、ウイルスの生活環の異なる状態を全て含み、ある宿主中に存在し得る全ての異なる（空間的に限局された）ウイルスプールを高い感度で検出する指標を用いることが、罹患した患者中の特定のウイルスを確実に検出するのに、及び／又はウイルスの負荷量を正確に測定するのに適切である。このことは、ウイルスコピー数の僅かな変化でさえ、例えば、再感染の開始に対する又は抗ウイルス療法の付随的（ｉｎｃｉｄｅｎｔ）効力に対する指標となり得るかなり低いウイルス負荷量（例えば、５０００ウイルスコピー未満／ｍＬ血漿又は２０００ウイルスコピー未満／ｍＬ血漿）のみを有する患者において特に重要であり得る。
全ウイルス核酸の量、特に、患者から得られた処理されていない試料中の全ウイルス核酸の量は、ウイルス感染を診断するための優れた臨床マーカーとなり得る指標に相当することが見出された。
例えば、患者がＨＩＶに感染している場合には、その患者から得られた全血試料中に存在し得るＨＩＶ感染と関連する核酸は、遊離のＨＩＶに由来するＲＮＡ分子（すなわち、血漿中を自由に循環しているウイルス粒子）、細胞に随伴しているＨＩＶに由来するＲＮＡ分子（すなわち、血液細胞の何れかの種類に付着されたウイルス粒子）、宿主のゲノム中に組み込まれているプロウイルスＨＩＶＤＮＡ分子、逆転写されたＨＩＶＤＮＡ分子及びプロウイルスＤＮＡに由来するＨＩＶ転写物を含む。しかしながら、他の全てのＨＩＶ核酸種は患者の除去された血液細胞に随伴しているので、同じ患者から得られた血漿試料は、遊離のＨＩＶに由来するＲＮＡ分子のみを含む。従って、全血試料に由来する全ＨＩＶ核酸の量は、血漿試料に由来する全ＨＩＶ核酸の量より信頼性が高いＨＩＶ用の診断マーカーに相当することが明らかである（図３５も参照）。
マーカーとして使用される全ＨＩＶ核酸の量は、ＨＩＶを検出し、患者中のＨＩＶ負荷量を測定し、ＨＩＶに感染した患者中での疾病の進行をモニタリングし、及び／又はＨＩＶに感染した患者の抗ウイルス治療の効率性をモニタリングするための指標であり得る。全ＨＩＶ核酸の量は、遊離のウイルス及び細胞に随伴したウイルスに由来する核酸を含むことができ、この核酸は、次いで、遊離のウイルスに由来するＲＮＡ、細胞に随伴したウイルスに由来するＲＮＡ、プロウイルスＤＮＡ、逆転写されたウイルスＤＮＡ及び転写されたプロウイルスＲＮＡを含み得る。
図１ａを参照すると、分子標的を測定するための方法１００は、（アンカー基を有する捕捉分子の存在下で、試料、例えば、全血を溶解するための）溶解工程１０２、（ＨＩＶ核酸とアンカー基を有する捕捉プローブの複合体を形成するための（例えば、ハイブリッド形成））複合体形成工程１１０、（アンカー基を介して、固体マトリックス上に複合体を捕捉するための）捕捉工程１１４、（全ての非結合材料、例えば、核酸、タンパク質、低分子量きょう雑物質などを除去するための）洗浄工程１１８、（捕捉された核酸を増幅及び標識するための）増幅工程１２０及び（アンプリコンを検出するための）検出工程１２６を含む。方法１００に従って、ポリヌクレオチドは、試料の１つ又はそれ以上の標的病原体から放出される。標的病原体に伴われている放出されたポリヌクレオチドは、表面で捕捉される。捕捉されたポリヌクレオチドは、試料のきょう雑物質（例えば、増幅阻害剤）から分離される。分離された、捕捉されたポリヌクレオチドは増幅されて、アンプリコンを形成する。ポリヌクレオチドの存在は、アンプリコンを検出することによって決定される。増幅されたポリヌクレオチドは標的病原体に伴われているので、１つ又はそれ以上の標的病原体の存在及び／又は正体を（例えば、定性的に及び／又は定量的に）決定することができる。典型的な実施形態において、方法１００は、血液試料中に存在する１つ又はそれ以上のウイルスの測定に基づいて、ウイルス負荷量を測定することを含む。次に、方法１００の様々な工程について論じる。
溶解工程１０２において、血液試料１０４中に存在する病原体からポリヌクレオチド１０６が放出される。ポリヌクレオチドは、所望に応じて（例えば、熱的に、化学的に、機械的に又はこれらの組み合わせによって）、標的病原体から放出させることができる。典型的な実施形態において、試料中の病原体を溶解する物質を含む溶解液と試料１０４を混ぜ合わせることによって、ポリヌクレオチドが放出される。病原体を溶解することができる液体の例は、「ＢｏｏｍＲ．，Ｓｏｌ ＣＪ．， Ｓａｌｉｍａｎｓ Ｍ．Ｍ．， Ｊａｎｓｅｎ Ｃ．Ｌ．， Ｗｅｒｔｈｅｉｍ−ｖａｎ Ｄｉｌｌｅｎ Ｐ．Ｍ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｏｏｒｄａａ Ｊ．， Ｒａｐｉｄ Ａｎｄ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９０ Ｍａｒ；２８（３）：４９５−５０３」（参照により、本明細書に組み込まれる。）に見出される。
典型的な溶解液は、変性剤（例えば、グアニジンチオシアナート（ＧｕＳＣＮ）（例えば、約４．５７Ｍ））、ｐＨ緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（例えば、ｐＨ６．４、４５ｍＭ）、キレート物質（例えば、ＥＤＴＡ２０ｍＭ）及び界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００１．２％（ｗ／ｖ）及び／又はサポニン（例えば、０．２％））、塩（例えば、ＭｇＣｌ２（例えば、７５ｍＭ）及び／又はＺｎＣｌ２（例えば、１ｍＭ））の１つ又はそれ以上を含む。
溶解工程１０２は、放出されたポリヌクレオチド１０６、試料１０４のきょう雑物質（例えば、細胞成分、増幅阻害剤、タンパク質及び他の物質）及び捕捉分子１０８ｉを含む混合物を形成することを典型的に含む。各捕捉分子１０８ｉは、ポリヌクレオチド結合部分１０９ｉ及びビオチンアンカー基１１１を含む。各ポリヌクレオチド結合部分１０９ｉは、ポリヌクレオチド１０６の異なる領域に対して相補的な（例えば、特異的な）ポリヌクレオチド配列である。例えば、捕捉分子１０８ａは、ポリヌクレオチド１０６の標的領域１１３に対して相補的な結合部分１０９ａを含み、捕捉分子１０８ｂはポリヌクレオチド１０６の異なる標的領域１１５に対して相補的な結合部分１０９ｂを含む。典型的には、各ポリヌクレオチドを測定するために、少なくとも１つの（例えば、２つ又はそれ以上、３つ又はそれ以上、４つ又はそれ以上）異なる捕捉分子が使用される。
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチド１０６は、捕捉分子１０８ｉの存在下で、標的病原体から放出される。これは、例えば、捕捉分子１０８ｉ及び溶解液成分と試料１０４を実質的に同時に混ぜ合わせることによって達成することができる。試料１０４は捕捉分子１０８ｉと混ぜ合わせることができ、溶解液の成分は、捕捉分子１０８ｉ及び液体状態又は乾燥された（例えば、凍結乾燥された）状態の溶解液成分と混ぜ合わせることができる。
別の実施形態において、ポリヌクレオチドは試料１０４の病原体から放出され、得られた混合物は捕捉分子１０８ｉと混ぜ合わされる。例えば、試料１０４及び捕捉分子１０８ｉを除外した溶解液成分を混ぜ合わせ、温置された混合物を捕捉分子１０８ｉと混ぜ合わせる前に、一定の時間、温置することができる。
典型的な実施形態において、ポリヌクレオチド１０６はＨＩＶ−ＲＮＡであり、捕捉分子１０８ｉの結合部分１０９ｉはその領域に対して相補的である。
複合体形成工程１１０に話を変えると、１つ又はそれ以上の捕捉分子１０８ｉはポリヌクレオチド１０６と結合して（例えば、ハイブリッドを形成して）、複合体１１２を形成する。複合体形成工程１１０は、例えば、複合体１１２を形成するのに十分な捕捉分子１０８ｉの存在下で、十分な時間、放出されたポリヌクレオチド１０６を温置させることによって実施することができる。幾つかの実施形態において、温置期間は少なくとも約６０秒（例えば、少なくとも約１２０秒、少なくとも約３６０秒）である。幾つかの実施形態において、温置期間は約６００秒又はそれ以下（例えば、約４８０秒又はそれ以下、約４２０秒又はそれ以下）である。典型的な実施形態において、温置期間は約５分である。
測定されるべき各ポリヌクレオチドに関して、捕捉分子１０８ｉの総濃度は、典型的には、複合体１１２中のポリヌクレオチドの多く（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、実質的に全て）を捕捉するのに十分である。幾つかの実施形態において、捕捉分子１０８ｉの１つ又はそれ以上（例えば、ほとんど又は全て）のそれぞれの濃度は少なくとも約０．１μＭ（例えば、少なくとも約０．２５μＭ、少なくとも０．５μＭ）である。捕捉分子の１つ又はそれ以上（例えば、ほとんど又は全て）の各々濃度は、典型的には、約２μＭ又はそれ以下（例えば、約１．５μＭ又はそれ以下、約１μＭ又はそれ以下）である。典型的な実施形態において、捕捉分子の１つ又はそれ以上（例えば、ほとんど又は全て）の各々濃度は、約０．６２５μＭである。
捕捉工程１１４に話を変えると、複合体１１２と捕捉粒子１１７は結合されて、捕捉複合体１１９を形成する。各捕捉複合体１１９は、１つ又はそれ以上の１１２及び捕捉粒子１１７を含む。複合体１１２は、典型的には、粒子１１７に非選択的に結合されている。各捕捉粒子１１７は、ストレプトアビジン捕捉表面１１６を含む。捕捉粒子１１７は、捕捉分子１０８ｉの１つ又はそれ以上のビオチンアンカー基とストレプトアビジン捕捉表面１１６の間での相互作用によって、各複合体１１２を捕捉する。典型的な捕捉粒子１１７は、エタノールを除去するために、ｄｉＨ２Ｏで予め洗浄された、約３４μｍの直径を有するストレプトアビジンセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む。アッセイ当り約１００００から２００００個のビーズが使用され、全血１０μＬ当りビオチン約３ｎｍｏｌの結合能に相当する。
典型的には、捕捉工程１１４は、複合体１１２を形成するのに十分な時間、ポリヌクレオチド１０６及び捕捉分子１０８ｉとともに試料１０４を温置した後に開始される。例えば、得られた混合物を捕捉粒子１１７と結合させる前に、試料１０４を、溶解液と捕捉分子１０８ｉの存在下で温置することができる。
典型的には、捕捉分子１０８ｉ及び粒子１１７の総濃度が、試料１０４中の１つ又はそれ以上の標的病原体の各々に伴われている１つ又はそれ以上の選択されたポリヌクレオチド１０６の各々を定量的に捕捉するのに十分である。従って、測定されるべき各ポリヌクレオチド１０６に関して、ポリヌクレオチドの実質的に全て（例えば、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％又は実質的に全て）が、捕捉分子１０８ｉ及び粒子１１７によって捕捉される。
洗浄工程１１８に話を変えると、捕捉複合体１１９は、粒子１１７によって捕捉されなかったきょう雑物質（例えば、核酸、タンパク質、細胞成分、溶解試薬など）から分離される。幾つかの実施形態において、捕捉複合体１１９の通過を妨げるのに十分小さいが、粒子１１７によって捕捉されなかった物質の通過を許容するのに十分大きい孔を有するフィルターを用いて、捕捉複合体１１９がろ過される。
捕捉複合体１１９は、並存する物質の分離を強化するために、洗浄液で洗浄することができる。幾つかの実施形態において、２つ又はそれ以上の異なる洗浄液が使用される。幾つかの実施形態において、疎水性相互作用を介して、粒子に接着している低分子量物質、タンパク質及び他の細胞成分を除去するために、第一の洗浄液は界面活性剤を含有し、第二の洗浄液は、除去しなければ、その後の増幅プロセスを妨害し得る界面活性剤を除去する。典型的な第一の洗浄液は、０．１５ＭＬｉＣｌ、０．１％ＳＤＳ（ＳＤＳはＰＣＲ阻害剤なので、ＰＣＲ手順前に除去され得る。）、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０及び１ｍＭＥＤＴＡを含む。典型的な第二の洗浄液は、０．１５ＭＬｉＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡを含む。典型的な洗浄液は、例えば、米国特許出願公開２００４０２１５０１１Ａ１に記載されている。
増幅工程１２０に話を変えると、ポリヌクレオチド１０６は、プローブ１２２を用いて増幅される。典型的には、増幅はＰＣＲ増幅である。典型的な実施形態において、ポリヌクレオチド１０６はＲＮＡであり、増幅はＲＴ−ＰＣＲである。幾つかの実施形態において、病原体はＨＩＶである。
図１ｄを参照すると、幾つかの実施形態において、増幅工程１２０はアンプリコン１３０を産生する。ハイブリッド形成条件下（例えば、温度）において、アンプリコン１３０は、粒子１１７のストレプトアビジン表面１１６に固定された捕捉プローブ分子１０８ａ、１０８ｂ及び１０８ｃによって捕捉される。アンプリコンは、光学的標識１２４（例えば、蛍光標識）及びアンプリコン１３０の一領域に対して相補的なポリヌクレオチド部分１２９を含む蛍光標識剤１２５で標識される。
図１ｅを参照すると、別の実施形態において、各プローブ１２２は、光学的標識１２４（例えば、蛍光標識）を含む。他のプローブ１０８ｊは、アンプリコン１３０のある領域に対して相補的なポリヌクレオチド部分１０９ｊを含み、ビオチンアンカー基１１１も担持する。プローブ分子１０８ｊは、粒子１１７のストレプトアビジン表面１１６に捕捉される。増幅工程１２４は、それぞれ標識１２４を含む直接標識されたアンプリコン１３０を産生する。アンプリコン１３０は、固定化されたプローブ分子１０８ｊによって、粒子１１７のストレプトアビジン表面１１６上に捕捉される。プローブ１０８ｊの結合部分１０９ｊは、捕捉工程１１４に使用されるプローブ１０８ｉと同一であり得、又は異なり得る。プローブ１０８ｊ及び／又はビーズ１１７は、増幅工程１２０を実施するために使用される他の成分と一緒に、ポリヌクレオチド１０６と結合され得る。
検出工程１２６において、（例えば、標識１１１の蛍光検出によって）アンプリコン１３０が検出される。検出工程１２６は、粒子１１７のストレプトアビジン表面１１６に捕捉されたアンプリコン１３０を用いて実施することができる。検出工程１２６は、プローブ１２２を含まない液体とアンプリコンを最初に混合せずに実施することができる。例えば、検出工程１２６は、第一の表面と第二の表面の距離を低下させた後に、第一の表面と第二の表面の間に存在する捕捉されたアンプリコン１３０を用いて実施することができる。検出工程１２６を実施するためのこの方法の実施形態は、図１ｂ及び図１ｃに関して、次に論述されている。
図１ｂ及び図１ｃを参照すると、方法１００の少なくとも検出工程１２６を実施するためのシステム２００は、微小流体カートリッジ２０２、検出システム２１０、ステンシルアクチュエータ２１２並びに検出システム２１０及びアクチュエータ２１２と連動しているプロセッサ２１８を含む。
カートリッジ２０２は、第一の基材２０６及び第二の基材２０８を含み、両者で検出チャンバー２０４を画する。第一の基材２０６は、アンプリコン１３０の標識１２４由来の蛍光を励起及び検出するために有用な光の波長に関して、典型的には、光学的に透過性（例えば、透明）である。第一の基材２０６は、例えば、ポリマー、ガラス又はシリカから形成され得る。第二の基材２０８は、可撓性の又は柔軟な物質（例えば、弾性ポリマー）から形成される。一般に、第一の基材２０６は、第二の基材２０８より柔軟性が低い。
アクチュエータ２１２は、ステンシル２１４並びに第二の基材２０８に向かうように、及び第二の基材２０８にから離れるようにステンシルを駆動するように構成されたステンシル駆動装置２３６を含む。ステンシル駆動装置２３６は、例えば、圧縮空気、電磁気、圧電又は別の適切な駆動作用によって作動され得る。図１ｃから明らかなように、第二の基材２０８の壁２３８に向かうように作動される場合、ステンシル２１４は第一の基材２０６の内壁２３２と第二の基材２０８の内壁２３４の間の距離［ｄ］を減少させる。図１ｃの距離が減少した状態において、捕捉されたアンプリコン１３０を有する少なくとも幾つかの捕捉粒子１１７は、表面２３２、２３４の間に留まる。これに対して、粒子１１７を取り囲む液体の多くは、表面２３２、２３４の間から排除される。
検出システム２１０は、図１ｃの距離が低下した状態において、カートリッジ２０２により、アンプリコン１３０の存在を検出するように構成される。検出システム２１０は、光源２４６（例えば、レーザー）、画像検出装置２４０及び光学システム２４２を含む。使用時に、光源２４６は、基材２０６、２０８の内面２３２、２３４の間に存在する物質を照射する。アンプリコン１３０由来の標識１２４から放射される蛍光２５０が検出される。検出された蛍光２５０は、アンプリコン１３０の存在の指標である。プロセッサ２１８は、検出された蛍光の指標である、検出システム２１０由来のシグナルを受信する。プロセッサ２１８は、アンプリコン１３０の存在を測定することができ、従って、試料１０４中の対応する病原体の存在を測定することができる。
一般に、内面２３２、２３４の間に残存する液体は、アンプリコン１３０の存在と関連しないバックグラウンド蛍光２５２を放射する。バックグラウンド蛍光２５２の強度は、内面２３２、２３４の間に残存する液体の量に、一般に比例する。しかしながら、アンプリコン１３０の標識１２４由来の標識蛍光２５０の強度は、粒子１１７の近くに、空間的に局在化されている。画像化検出装置２４０は、標識蛍光２５０とバックグラウンド蛍光２５２の両方を受光し、検出する。しかしながら、図１ｃの距離が減少した状態では、内面２３２、２３４間の液体は排除されるので、図１ｂの減少していない状態より、バックグラウンド蛍光２５０に対する標識蛍光２５２のシグナル対ノイズが高い。
方法１００の典型的な実施形態は、以下のように行うことができる。毛細血液（例えば、指の先、耳たぶ）の約５及び１０μｌを個体から採取する。溶解成分及び捕捉分子１０８ｉを含む溶解緩衝液約９０μｌと、血液試料を混ぜ合わせる。２１℃で、約５分間、撹拌しながら、得られた混合物を温置する。温置された混合物を、スラリー約１０μｌと等しい粒子１１７の量（３ｎｍｏｌビオチンの結合能と対応する。）と合わせる。すなわち、２０％エタノール中の粒子のスラリーとして、粒子を購入する。２１℃で、約５分間、撹拌しながら、粒子との混合物を温置する。温置後、カートリッジ３００を稼動させるためのステンシルアクチュエータシステム３５０によって上清を除去する。第一の洗浄緩衝液で（例えば、各回５０μＬの容量を用いて３回）、次いで、第二の洗浄緩衝液で（例えば、各回５０μＬの容量を用いて３回）、粒子を洗浄した。洗浄後、上清を除去する。洗浄された粒子を増幅培地と混合し、捕捉されたポリヌクレオチド１０６の検出（例えば、定量）のためにｑＲＴ−ＰＣＲ増幅に供する。
図１４を参照すると、（例えば、図１ｂ及び１ｃに示されているような装置の減少した距離モードを用いて）アンプリコン１３０からの蛍光が検出される。アンプリコン１３０は、増幅の複数の異なる加熱及び冷却サイクルの各々の後に検出することができる。このようにして、アンプリコン濃度の蓄積を経時的に追跡することができる。アンプリコンは、典型的には、粒子１１７に結合されながら検出される。
方法１００は、病原体からポリヌクレオチドを放出させる工程を含むものとして記載されているが、方法１００は、ポリヌクレオチドを提供するための他の工程を含むことができる。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、非病原性細胞（例えば、植物、ヒト、動物など）から放出される。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、遺伝子発現分析の産物である。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、放出工程を必要とせずに、及び／又は細胞若しくは他の生物学的試料から既に放出されたポリヌクレオチドとして提供される。
次に、方法１００のほとんどの（例えば、全ての）工程を典型的に実施することができるアッセイシステム及び微小流体カートリッジの実施形態について論じる。
図２を参照すると、微小流体カートリッジ３００は、第一の基材３０１、第二の基材３０３及び微小流体ネットワーク３０５を含む。第一及び第二の基材３０１、３０３は、カートリッジ２０２の基材２０６、２０８に対して記載されているものと類似の特性を有することができる。
微小流体ネットワーク３０５は、試料及び様々な試薬材料を受容し、これらの材料に対して行うべき手順（例えば、混合、輸送及び温置）を可能とし、１つ又はそれ以上の標的病原体の存在の指標となるアンプリコンの検出を促進するように構成される。
微小流体ネットワーク３０５は、チャネル３０４によって溶解チャンバー３０６へ接続された試料注入口３０２（溶解チャンバー３０６は、チャネル３０８及び合流部３０７によって、検出チャンバー３３２へ接続されている。）；第一の液体注入口３１０は、チャネル３１２によって、第一の試薬チャンバー３１４へ接続されており、第一の試薬チャンバー３１４は、チャネル３１６によって、合流部３０７へ接続されており；第二の液体注入口３１８は、チャネル３１９によって、第二の試薬チャンバー３２０へ接続されており、第二の試薬チャンバー３２０は、チャネル３３２によって、合流部３０７へ接続されている。第三の液体注入口３２４は、チャネル３２６によって、増幅標識試薬チャンバー３２８へ接続されており、増幅標識試薬チャンバー３２８はチャネル３３０によって合流部３０７へ接続されている。合流部３０７は、廃棄チャネル３３６を介して、廃棄チャンバー３３４へ接続されている。検出チャンバー３３２は、廃棄チャネル３４０を介して、廃棄チャンバー３３４へ接続されており、廃棄チャネル３４０は、方法１００の洗浄工程１１８において記載されているように、粒子３１７の通過を妨げるが、捕捉されていない材料の通過を許容するサイズにされたフィルターを含む。
典型的には、試薬チャンバー３０６、３１４、３２０、３２８は、方法１００に対して記載されている工程を実施するために使用される凍結乾燥された試薬（例えば、ペレットとして）を含む。使用時には、液体（例えば、水、緩衝液、水性溶媒又は他の液体）が、チャンバーに対応する注入口に導入される。液体は、凍結乾燥された試薬を可溶化して、液体を形成する。典型的な実施形態において、溶解チャンバー３０６は、標的病原体及び病原体のポリヌクレオチドに対応する捕捉分子３０８ｉの溶解を促進するために、凍結乾燥された試薬を含む。典型的には、チャンバー３０６の凍結乾燥された試薬は、単独で、又は添加された液体と組み合わせて、試料（例えば、全血試料）によって可溶化される。典型的な実施形態において、チャンバー３１４は、注入口３１０に導入された液体と混合されたときに、洗浄液（例えば、第一の洗浄液（緩衝液））を形成するための凍結乾燥された試薬を含む。典型的な実施形態において、チャンバー３２０は、注入口３１８に導入された液体と混合されたときに、洗浄液（例えば、第二の洗浄液（緩衝液））を形成するための凍結乾燥された試薬を含む。典型的な実施形態において、チャンバー３２８は、注入口３２４に導入された液体と混合されたときに、増幅混合物（例えば、第二の洗浄液（緩衝液））を形成するための凍結乾燥された試薬を含む。
装置３００の使用前に、粒子１１６は、チャンバー３０６の下流に位置するネットワーク３０５内に、典型的に配置される。例えば、粒子１１６は、使用前に、検出チャンバー３３２内に配置され得る。粒子１１６は、次に論述されているように、ステンシルの適切な動作によって、チャンバー３０６、３１４、３２０、３２８からの液体で洗浄され得る。
図３を参照すれば、微小流体カートリッジ３００が、カートリッジ３００を作動させるためのステンシルアクチュエータシステム３５０と組み合わせて示されている。アクチュエータシステム３００は、アクチュエータ基部３５２及び複数のステンシル３５４ｉを含む。各ステンシル３５４ｉは、ステンシル駆動装置２３６と類似の対応するステンシル駆動装置によって作動される。使用時に、カートリッジ３００は、アクチュエータ基部３５２及びステンシル３５４ｉと向かい合う柔軟な基材３０３とともに配置される。各ステンシル３５４ｉは、微小流体ネットワーク３０５の異なる位置に空間的に対応する。例えば、ステンシル３５４ｄは、廃棄チャネル３３６に対応する。作動されると、ステンシル３５４ｄはチャネル３３６の上に横たわる基材３０３を圧縮することにより、チャネル３３６を閉塞し、チャネル３３６に沿った流体の通過を妨げる。
従って、第二の基材３０３又はカバー要素の柔軟な特性は、ステンシル３５４ｉが柔軟な第二の基材３０３の専用の部分上に機械的力を発揮したときに、第二の基材３０３又はカバー要素が可逆的な様式で変形できるようにする。換言すれば、可逆的なバルブ作用が望まれるのであれば、ステンシル３５４ｉによって付与される力が取り除かれたときに、対応するチャネル３３６を沿って、再度、流体が通過できるように、第二の基材３０３がその元の位置の方向に戻る程度まで、第二の基材３０３の変形は可逆的である。
これに対して、第一の基材３０１の堅固な特性は、第一の基材３０１上に、ステンシル３５４ｉによる力が加わった際に、バルブ機能に対して影響を有し得る第一の基材３０１の変形が起こらないように、第一の基材３０１の素材が構成されているという事実を表す。その結果、第二の基材３０３は柔軟性を与えるのに対して、第一の基材３０１は安定性を与える。
他のステンシルは、ネットワーク３０５の他のチャンネルへ同様に対応する。ステンシル３５４ａ、３５４ｃは、それぞれ、廃棄チャネル３４０及び合流部３０７に対応する。ステンシル３５４、３５４ｃの作動は検出チャンバー３３２を密封し、その中の液体を著しく喪失することなく、複数の加熱及び冷却を実施することを可能とする。フィルター３４１は、粒子を喪失することなく、チャンバー３０６、３１４、３２０、３２８からの液体を用いて、チャンバー３３２内の粒子１１６を洗浄することを可能とする。さらに別のステンシルは、それぞれ、チャンバー３０６、３１４、３２０、３２８及び３３２に対応する。これらのステンシルの反復動作は、（例えば、試料及び試薬の）混合を促進するために、チャンバー内の材料（例えば、液体）を撹拌するために使用することができる。チャネルに沿って液体を移動させるために、チャネルに沿ってステンシルを順次動作させることを使用できる。チャンバーの内容物は、例えば、チャンバーの上流、下流及びチャンバーに作動するそれぞれのステンシルの動作によって空にすることができる。
一実施形態において、反復されたステンシルの動作及び除去（例えば、少なくとも１０の動作及び除去、又は少なくとも５０の動作及び除去）の際に、特定のステンシルの下に横たわる微小流体ネットワークの一部が繰り返し閉塞及び再開放され得るように、基材がその元の位置に向けて戻る点で基材は十分に可逆的である。
カートリッジ３００は、以下のように作動することができる。試料（例えば、全血）のある量（例えば、約５から１０μｌの間）及び必要に応じて添加される液体（例えば、水）のある量（例えば、約５と５０μｌの間）が、注入口３０２を介して、チャンバー３０６ネットワーク３０５に導入される。液体のある量（例えば、約２０と２００μｌの間）は、対応する注入口を介して、チャンバー３１４、３２０、３２８へ導入される。それぞれに導入された試料及び必要に応じて使用される液体は、チャンバー３０６、３１４、３２０、３２８中に存在する凍結乾燥された試薬を再び可溶化する。各チャンバーに対応するステンシルは、チャンバー内の液体試薬混合物を撹拌して、混合を促進するために作動される。溶解チャンバー３０６内において、溶解緩衝液は、（例えば、溶解工程１０２におけるように）病原体からポリヌクレオチド１０６を放出する。放出されたポリヌクレオチドは、（例えば、複合体形成工程１１０におけるように）捕捉分子１０８ｉと結合して、複合体１１２を形成する。
チャンバー３０６の溶解混合物は、検出チャンバー３３２に移動され、粒子１１６と合わされ、捕捉複合体１１９（例えば、捕捉工程１１４におけるように）を形成するために温置される。チャンバー３３２内の混合物は、例えば、ステンシルを用いて撹拌することができる。捕捉工程１１４の温置の終了時に、カートリッジ３００を作動させるためのステンシルアクチュエータシステム３５０を用いて、検出チャンバー３３２から廃棄チャンバー３３４へ、液体／上清を除去する。
廃棄チャンバー３３２から液体／上清を除去し、洗浄液をチャンバー３１４から除去した後、（例えば、洗浄工程１１８におけるように）複合体１１９から付随物を分離するために、チャンバー３１４、３２０からの洗浄液を、チャンバー３３２を通じて移動させる。チャンバー３３２は、洗浄の間、ステンシル３５４ｂを介して撹拌することができる。
チャンバー３３２内の複合体１１９から付随物を分離した後、チャンバー３２８からの増幅試薬が検出チャンバー３３２へ移動され、（例えば、増幅工程１２０におけるように）得られた内容物は複数のＰＣＲサイクルへ供せられる。
１つ又はそれ以上の各増幅サイクル後に、検出チャンバー３３２の対向する内面間の距離を減少させるために、ステンシル３５４ｂが作動される。複合体１１９は、存在すれば、内面の間に捕捉されたままであるのに対して、他の内容物は、図１ｃ中の装置２００に関して論述したように、相対的に排除される。典型的には、検出は、（例えば、装置２００に対して記載されているように）蛍光検出システムを用いて実施される。検出は、（例えば、検出工程１２６におけるように）ハイブリッド形成され、複合体１１９として、粒子１１７に結合された状態の複合体１１２のアンプリコン１３０を用いて、典型的に実施される。各サイクル後に、アンプリコン１３０の集団が増加する。捕捉複合体１１９から得られた蛍光強度は、これに従って増加する。アンプリコン１３０を定量することができる閾値サイクルを決定するために、サイクル数に伴う蛍光強度の増加をモニタリングすることができる。ポリヌクレオチド１０６は、（例えば、捕捉工程１１４におけるように）定量的に捕捉されるので、アンプリコン１３０の定量的検出によって、試料中に存在するポリヌクレオチド１０６の量を定量的に測定することが可能となる。従って、例えば、病原体がウイルス（例えば、ＨＩＶ）である場合には、試料（例えば、全血）内のウイルス負荷量を測定することができる。
カートリッジ３００は、それぞれが異なる病原体サブタイプのポリヌクレオチド配列に対応する複数の固定化されたポリヌクレオチドを含むアレイをさらに含むことができる。検出工程１２６の後、病原体サブタイプを決定するために、アンプリコン１３０のハイブリッド形成が行われる。典型的な実施形態において、アレイは、ＨＩＶのサブタイプを決定するように構成されたポリヌクレオチドを含む。
カートリッジ３００の動作は液体試薬の添加を含むものとして記載されているが、液体試薬は、ブリスターパックとして、カートリッジ上に保存し、使用の間に放出させることができる。
標識１２４の存在を光学的に測定するのに適したシステムの他の例は、以下の出願：米国を指定国とし、２００４年５月６日に出願されたドイツ国特許出願ＤＥ１０２００４０２２２６３号の優先権を主張する２００５年１月６日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００４９２３号の米国継続出願、出願番号ＵＳ１１／５９３，０２１を有し、２００６年１１月６日に出願された米国継続出願の各々に記載されている。
次に、図４から図１６を参照すると、典型的な実施形態に従った分析手順の間の様々な工程が説明されている。
図４は、溶解チャンバーを図解する。
図５から図１０は、固体マトリックス上へのＲＮＡ複合体の捕捉を図解する。
図１１は、洗浄を図解する。
図１２及び図１３は、増幅を図解する。
図１４から図１６は、検出を図解する。
図１７ａは、試料からの標的を捕捉する工程、標的を増幅する工程及び試料中の標的の存在の指標となる１つ又はそれ以上の値を検出する工程を少なくとも実施するための典型的なシステム４００を図解する。
図１７ｂは、試料からの標的を捕捉する工程、標的を増幅する工程及び試料中の標的の存在の指標となる１つ又はそれ以上の値を検出する工程を少なくとも実施するための、作動状態にある典型的なシステム４００を図解する。
図１７ｃは、図１７ａ及び１７ｂに図示されているバルブユニット４３５に対する典型的な実施形態を図解する。
図１７ｄは、図１７ｃに図示されているバルブ２に対する典型的な実施形態を図解する。
図１７ａ及びｂを参照すると、典型的なシステム４００は、微小流体カートリッジ４０１、検出システム４５５、カートリッジ４５１の少なくとも一部分を加熱及び／又は冷却するためのシステム、アクチュエータ要素４４１から４４４及びアクチュエータ４３７から４４０、バルブユニット４３５、コンプレッサ４３１、液体貯蔵槽４６１及びプロセッサ４７１を含む。
カートリッジ４０１は、基材４０２及び第一のカバー要素４０３を含み、両者で第一及び第二のウェル４０８及び４０７を画する。カバー要素が基材４０２の方向へ可逆的に押圧され得るようにするために、第一のカバー要素４０３は、少なくとも部分的に柔軟である。カートリッジは第二のカバー要素をさらに含み、第二のカバー要素は基材４０２とともに、チャネル４１０、４１１、４１２を画する。幾つかの実施形態において、第二のカバー要素も、少なくとも部分的に柔軟である。チャネル及びウェルは、穴４１３、４１４、４１５、４１６によって相互接続されて、微小流体ネットワークを形成する。
様々な実施形態において、基材４０２は、プラスチック、ガラス、金属又は半導体などのあらゆる適切な材料から構成されたあらゆる物理体であり得る。基材４０２は、実質的に平面状の（すなわち、二次元の）又は非平面状の（すなわち、三次元の）あらゆる表面であり得る。このような三次元の物体の例は、（チャネルのような）流体路を含む反応チャンバー（その中で、生物学的、化学的又は生化学的反応が起こり得る。）を含む空洞又はウェルを有する物理体である。
溶解ウェルとも表記され得る第一のウェル４０８は、流体を収容するように、及びシステム４００によって分析すべき標的分子を含む、細胞、芽胞又はウイルスの内容物を放出するように適合されている。例えば、第一のウェル４０８は、上述のように、溶解試薬４０９を含むことによって、細胞、芽胞又はウイルスの内容物を放出するように適合され得る。溶解試薬４０９は、乾燥された形態で提供し得る。
中央ウェルとも表記され得る第二のウェル４０７は流体を収容するように適合され、第一の結合要素としての粒子４０６を含み（該粒子は、捕捉分子と複合体を形成した標的を捕捉するように適合されている。）、及び、レポーター分子を捕捉するように適合された第二の結合要素４０７を必要に応じて含む。第二のウェル４０７は、粒子４０６の通過を妨げるが、気体、液体及び液体中に溶解された物質の通過を許容するフィルター要素４０５をさらに含む。ウェル４０７及び４０８は、穴４１５及び４１４を介して、チャネル４１１によって相互接続されている。
より一般には、第一及び第二のウェル４０８、４０７はあらゆる構造、すなわち試料又は物質を受容するための担体としての役割を果たし得るあらゆる物理的実体であり得る。特に、このような構造は、溝、ウェル又はチャネルなどの陥凹を含むことができ、又はその中に物質を収容し、それを通じて、ゲルなどの物質を移動させることができる材料を覆うこともできる。
様々な実施形態において、結合要素は、特異的な立体構造を有する分子を結合するように構成されている成分を含む。このような結合要素は、表面上に固定化された分子であり得、又はあり得ない。結合能は、表面立体構造（例えば、多孔性表面構造）からも直接生じ得る。結合要素は、ビーズ又は多孔性支持体などの三次元要素として、又は三次元要素上に提供されることも可能である。このような三次元要素又は三次元要素の表面に付着されたさらなる分子（例えば、粒子）の表面は、その後、結合要素として役割を果たし得る。異なる分子に対して感受性を示す異なる結合要素も、（例えば、マトリックス様の様式で）構造の表面上に配置し得る。結合要素の例は、本明細書に開示されている様々な方法に関して上述されている。
溶解ウェル４０８及び中央ウェル４０７の容積は１００μｌであり得る。典型的な実施形態において、チャネル４１０から４１２の幅は２００μｍであり、チャネル４１０から４１２の高さは１００μｍである。
様々な実施形態において、このような微小流体ネットワークは、互いに相互接続され得る１つ又はそれ以上のチャネル及び／又はウェルを含み得る。例えば、このような微小流体ネットワークの様々なチャネルは、二股に分かれ又は分岐することができ、これにより、所定の経路（図示せず）に沿って、微小流体ネットワークを通じた液体の輸送が可能となる。
システム４００は、空気圧式アクチュエータ４３７、４３８、４３９、４４０によって駆動されるアクチュエータ要素４４１、４４２、４４３、４４４を含むアクチュエータシステム、バルブユニット４３５、コンプレッサ４３１及び圧縮空気用貯留槽４３３も含む。コンプレッサ４３１は、圧縮空気用貯留槽４３３の中が所定の圧力になるように絶えず調整し得る。
アクチュエータ要素４４１、４４２、４４３、４４４の各々は、対応するアクチュエータによって作動される。使用時に、カートリッジ４０１は、アクチュエータ及びアクチュエータ要素と向かい合う少なくとも部分的に柔軟なカバー要素４０３とともに配置される。各アクチュエータ要素は、カートリッジ４０１の微小流体ネットワークの異なる位置に空間的に対応する。例えば、アクチュエータ要素４４２は穴４１４に対応し、チャネル４１１及び穴４１５を介して、ウェル４０７に通じる。作動されると、アクチュエータ要素４４２は、穴４１４の上に横たわる少なくとも部分的に柔軟なカバー４０３を圧縮し、これにより、穴４１４を閉塞し、穴４１４に沿った流体の通過を妨げる。他のアクチュエータ要素は、同様に、他の構造に対応する。例えば、アクチュエータ要素４４３及び４４４は、それぞれ、穴４１５及び４１６に対応する。アクチュエータ要素４１５、４１６の作動は第二のウェル４０７を密封し、例えば、その中の液体を著しく喪失することなく、複数の加熱及び冷却サイクルを実行できるようにする。
アクチュエータ要素４４２の典型的な動作のために、調節ユニットはバルブユニットに信号を送る。バルブユニットは、アクチュエータ４３８への空気圧式接続４３６を開放し、これにより、アクチュエータ４３８に圧力をかける。従って、アクチュエータ要素４４２は外に移動し、穴４１４の上に横たわる少なくとも部分的に柔軟なカバー４０３を圧縮する。アクチュエータ要素を開放するために、調節ユニットはバルブユニットにそれぞれの信号を送る。バルブユニットはアクチュエータ４３８に通じる空気圧式接続を閉鎖し、これにより、アクチュエータ４４２を元に戻し、穴４１４の上に横たわる少なくとも部分的に柔軟なカバー４０３を開放する。
アクチュエータ要素は、第一の柔軟なカバー４０３を弾性的に変形させて様々な作業を行うように適合させ得る。例えば、上述のように、アクチュエータ要素４４２は、穴４１４の上に横たわる少なくとも部分的に柔軟なカバー４０３を圧縮するように適合されることにより、穴４１４を閉塞し、穴４１４に沿った流体の通過を妨げるのに対して、アクチュエータ要素４４１は、ウェル４０８の上に横たわる第一の柔軟なカバーを繰り返し押圧し、開放することによって、ウェル４０８内の液体を移動させるように適合される。
一実施形態において、アクチュエータ要素は、機械的な力によって微小流体ネットワークの構造の各構造を選択的に開放又は閉鎖するように移動できる要素であり得る。例えば、このようなアクチュエータ要素は、柔軟なカバー要素を基材の表面上に押圧することにより、チャネルを選択的に開放又は閉鎖するために、柔軟なカバーに対して押圧され得るピン又はステンシルであり得る。
幾つかの実施形態において、アクチュエータ要素４４１、４４２、４４３、４４４の先端は、シリコーン、ゴムなどの弾性材料で作製されている。アクチュエータ要素４４２、４４３及び４４４の直径は、穴４１４、４１５及び４１６の直径の１．５倍であり得る。穴４１４、４１５及び４１６に対する典型的な直径は０．５ｍｍである。
上述されているように、アクチュエータ４３７から４４０に連結された空気圧式バルブユニット４３５が提供される。バルブユニット４３５は、調節ユニット４７１からの駆動シグナルを受信する。従って、調節ユニット４７１はアクチュエータ要素４４１から４４４の作動を調節する。
マイクロプロセッサなどの調節ユニット４７１が取り付けられ、流体試料の標的分子が結合要素４０６に捕捉される様式で、流体試料の分析を調節するように適合される。調節ユニット４７１は、中央ウェル４０７中の標的分子の増幅をさらに調節する。さらに、調節ユニット４７１は、標的分子の存在及び／又は量に対する指標となり、並びに結合要素４１７に捕捉された化合物の検出を調節する。標的分子の分析の間の全ての固相結合手順は、中央ウェル４０７中の結合要素４０６において行われる。特に、溶解ウェル４０８中では、固相結合手順は行われない。
ある実施形態において、調節ユニットは、装置の１つ又はそれ以上の他の要素の機能を調節することができ、及び各コンポーネントの機能を特に調和させ得る電気的要素であり得る。調節ユニットには、特定の分析、実験又はアッセイを実施することができるように、コード又はアルゴリズムを格納することができ、又はソフトウェアで、ハードウェアで、又は混成形態（すなわち、ソフトウェア及びハードウェアコンポーネントを含む。）でユーザ定義することができる。特に、このような調節ユニットは、処理能力を有し（場合により、保存能も有する）、特定の実験プロトコールを実施するように構成されたプロセッサを含み得る。特に、このような調節ユニットは、マイクロプロセッサ又はＣＰＵ（中央演算装置）であり得る。
空気圧式冷却装置４５３、温度センサー（図示せず）及び基材４０２の上面の近くに配置された加熱及び／又は冷却プレート４５１及び中央ウェル４０７中での分子の光学的検出を可能とするために、中央陥凹部４５９を有する第二の環状加熱及び／又は冷却プレート４５１を含む温度操作ユニットによって、中央ウェル４０７中の流体の温度を操作することができる。幾つかの実施形態において、加熱及び／又は冷却プレートは、加熱プレートの及び／又は第二のウェルの温度を調整するための温度センサーを含む。調節ユニット４７１は、プレート４５１の温度分布を調節することにより、（例えば、分析の間に標的分子を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための温度系列に従って）中央構造４０７中の液体の温度を操作し得る。特に、温度操作ユニット４５１は、中央ウェル４０７中に配置された液体の温度を９５℃まで上昇させる能力を有する。
加熱／冷却要素又はプレート４５１は、柔軟に戴置され得る。柔軟な戴置は、加熱／冷却要素全体の柔軟な戴置であり得る。加熱／冷却要素４５１を支持するフレームは、蝶番が加熱／冷却要素又はプレート４５１全体の柔軟な配置を可能とするように、例えば、担体構造へ蝶番で接続され得る。
これに代えて又はこれに加えて、柔軟に戴置することはまた、それ自体、加熱／冷却要素４５１の柔軟性でもあり得る。これは、例えば、加熱／冷却源／ドレーンを含む、柔軟性のある層により達成され得る。加熱／冷却要素層を作動させるために、柔軟性のある層の後ろにある種の作動装置が提供され得る。このような作動装置は、例えば、可膨張式エアピローであり得る。しかし、柔軟性のある層はまた、裏面に弾性部材とともに提供され得、これにより、本構造に押し付けられた際に柔軟に適合するようになる。
従って、加熱／冷却要素の少なくとも１つを柔軟に備え付けることによって、柔軟性のある加熱／冷却要素４５１が本構造又はプローブデバイスに柔軟に適応し得るので、効率的な熱転移が行われ得る。
加熱／冷却要素４５１は、連結された柔軟性のある加熱／冷却要素４５１全体であり、柔軟性のある、加熱／冷却要素４５１そのものであり得る。
実際に、また２つの加熱／冷却要素４５１も柔軟に備え付けられ得る。プローブデバイスを挟み込むために、両方の加熱／冷却要素がバタフライ様に配置され得る。同様にして、圧縮カウンタープレートとともに１個の加熱／冷却要素４５１が配置され得る。これにより、プローブデバイスを挿入した際に、特にプローブデバイスがその最終的位置に到達した後に加熱／冷却要素４５１がプローブデバイスの表面に向かって移動させられる際に、スクラッチが回避され得る。
基材４０２とカバー要素４０４の間に、流体界面４１８が提供され、チャネル４１０及び穴４１３を介して、水若しくは緩衝液などの液体又は空気などの気体を微小流体システム中に挿入することを可能とする。試料４８１を微小流体システム中に挿入することを可能とする別のインターフェース４８２を備え得る。
幾つかの実施形態において、基材４０２は、少なくとも部分的に、光学的に透明であることにより、以下で説明されているように、中央ウェル４０７中のコンポーネントの光学的放射をベースとした検出を可能とする。
レーザーダイオードなどの光学的光源（図示せず）を含む検出システム４５５は、第二の加熱要素４５１中の陥凹部４５９を通じて中央チャンバー４０７中に衝突する電磁波照射光線を生成するように適合される。このチャンバー４０７中の蛍光マーカーの存在下で、第二の加熱要素４５１中の陥凹部４５９を通じて伝播することができる第二の電磁的光線が生成され、光ダイオードなどの検出システム４５５中の検出装置（図示せず）によって検出され得る。標的分子の濃度の指標となる検出装置システム４５５の検出シグナルは、調節ユニットインタフェース４５６を介したさらなる処理のために、調節ユニット４７１へ提供され得る。従って、図１７から明らかなように、調節ユニット４７１は、検出装置システム４５５の機能も協調させる。
幾つかの実施形態において、検出の間、柔軟なカバー要素４０３と４０４の間の距離又は柔軟なカバー要素４０３及び４０４と基材４０２の距離を低下させることにより、検出ゾーンから、結合要素４０６又は４１７の一つに結合されていない材料を含む液体を除去するために、検出アクチュエータ４５７は中央ウェルを圧縮する。
ウェル４０８、４０７によって、通過穴４１３、４１４、４１５、４１６によって、及びチャネル４１０、４１１、４１２によって形成された微小流体ネットワークを通じて、水又は緩衝液などの液体を拍出させるために、液体供給４６１が付与される。
装置４００を通じた液体の輸送は、陰圧によって液体を吸引することによっても実施することができる（図示せず）。
以下で典型的に説明されているように、チャンバー４０８中の流体レベルを調節するために、光学センサー４６４を付与することができる。ウェル４０８に液体供給４６１からの液体が充填されるべき場合には、調節ユニット４７１は、インターフェース４４６を介して、バルブユニット４３５へ対応するシグナルを送信する。バルブユニットはバルブを開放して、空気圧式接続４６３を介して、液体供給４６１に圧力をかけ、これにより、液体接続４６２、チャネル４１０及び穴４１３を介して、ウェル４０８中に液体供給４６１からの液体を押圧する。
光学センサー４６４がウェル４０８中の液体の存在の指標となるシグナルを検出すると、センサーはインターフェース４６５を介して調節ユニット４７１へシグナルを送信する。次いで、調節ユニット４７１は、バルブユニット４３５へシグナルを送信する。バルブユニットはバルブを閉鎖することにより、液体供給４６１に対する圧力を停止し、これにより、ウェル４０８外への液体の移動を停止させる。
チャネル（４１０、４１１、４１２、センサーは図示せず）又はウェル（４０７、センサーは図示せず）などの他の構造中の液体レベルを調節するために、他の光学センサーを取り付け得る。
様々な実施形態において、試料４８１は、あらゆる固体、液体若しくは気体物質又はこれらの組み合わせを含み得る。例えば、物質は液体又は懸濁物であり得、より具体的には、生物学的物質（血液、特に全血など）であり得る。このような物質には、タンパク質、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、ウイルス、細菌などが含まれ得る。複数の実施形態において、試料は、標的を含んでいる可能性がある組成物である。
図１７から理解できるように、調節ユニット４７１は、インターフェース４４７を介して、ポンプ４３１も調節する。圧縮された空気に対する貯蔵槽４３３は、ポンプ手順をアクチュエータ４３７から４４０、空気圧式冷却装置４５３及び検出アクチュエータ４５７の実行と調和させるように付与され得る。
システム４００は、入力／出力装置とも表記され得るユーザインターフェースユニット４７２をさらに含む。ユーザインターフェースユニット４７２を介して、ユーザは、システム４００によって実行される実験を定義することができる。換言すれば、ユーザインターフェース４７２によって、特定のアッセイを実行するように、ユーザはシステム４００をプログラムすることが可能となり得る。ユーザインターフェース４７２は、ＬＣＤ、プラズマ装置又は陰極線管などのディスプレイユニットを有するグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）を含むことができる。さらに、ユーザインターフェース４７２に、キーパッド、ジョイスティック、ボタン、トラックボール又は音声認識システムのマイクロフォンなどの入力要素を付与することができる。ユーザインターフェース４７２は、データ接続を介して、調節ユニットに接続される。
図１７ｃ及びｄを参照すると、幾つかの実施例において、バルブユニット４３５は、多数の（ｎ）単一バルブ（２）からなる。各バルブは、チャネル（２．３）及び固定子（２．２）（何れも連続的に戴置され、一定の圧力をかけるために、４つのバネで固定されている。）を含むローター（２．１）から構成されている。各バルブは４つの穴（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）を有しており、ａは換気装置と接続されており、ｂ）はコンプレッサに接続されており、ｃ）は空気圧式アクチュエータと接続されており、及びｄ）はアクチュエータの換気部位に接続されている。
キャリア（３）は、チューブ内側に配置されているボールネジ（４）に接続されている。チューブ（６）内のスロットは、キャリアを移動可能とする。駆動シャフト（５）の回転移動はボールネジ及び接続されたキャリアをＸ方向に移動させる。これにより、各バルブ（２）の位置にキャリアが移動可能となる。キャリアは、ローター（２．１）の中に嵌まり込む。チューブ（６）の９０°移動は、キャリア（３）及びローター（２．１）の９０°移動をもたらす。ローター円板中のローター及びポケットは、バルブ接続を開放又は閉鎖させる（ａ、ｂ及びｃ、ｄ；ｄ，ａ及びｂ、ｃ）。
以下では、図１８及び図１９を参照して、別の典型的な実施形態に係る装置５００を説明する。図１８は前面図を示し、図１９は装置５００の背面図を示す。装置５００は、装置５００に試料を供給することができる挿管（図示せず）を挿入するための、基材４０２の中に形成された溝５０１を含む。溶解のために必要とされる材料を乾燥された形態でその中に保存することができる溶解チャンバー５０２が取り付けられている。中央ウェル５１２は、装置５００を作動させるのに必要とされる全ての固相カップリング手順を実施する役割を果たす。その中に様々なさらなる物質が乾燥された形態で提供され、洗浄手順、ＰＣＲ手順などの役割を果たすことができるさらなるウェル５０４、５０６、５０８及び５１０が設置されている。もはや分析のために不要となった液体をその中に輸送することができるウェルとして、廃棄チャンバー５１４が設置されている。
図１８及び図１９には示されていないが、廃棄チャンバー５１４に入る流体を吸収することができる液体吸収性材料を廃棄チャンバー５１４に取り付け得る。この措置を講じることによって、装置５００の他の部分中への廃棄チャンバー５１４からの液体の望ましくない逆流を確実に予防し、これにより、一切のきょう雑を回避し得る。例えば、（おむつ中に使用し得る）膨潤可能なポリマーをこのような目的のために使用し得る。
図１８から具体的に理解できるように、チャネルの様々な１つを接続する流体接続ポート５２０、５２４、５２１、５２５、５４０、５４２、５４４、５４５、５４８、５７８、５８０、５５８、５６２、５６４、５６０、５６１、５５２、５５０、５１６、５５４、５３０、５２８、５３２及び５２６の複数が付与され、これらは以下で説明される。
図１９から明らかなように、さらなる流体接続ポート５４１、５６０、５６６、５１９、５１２が示されている。さらに、チャネル５３８、５２２、５１８、５２７、５２９、５３６、５７２、５７４、５７６、５３９、５６２、５７０、５４６、５５６、５６８及び５３４の複数は、様々な流体接続ポート５２０、５２４、５２１、５２５、５４０、５４２、５４４、５４５、５４８、５７８、５８０、５５８、５６２、５６４、５６０、５６１、５５２、５５０、５１６、５５４、５３０、５２８、５３２、５２６、５４１、５６０、５６６、５１９並びにウェル５０２、５０４、５０６、５０８、５１０及び５１２を接続することが予想される。この他に、流体注入ポート５９３が示されており、流体注入ポート５９３を介して、水などの流体を装置５００中に注入し得る。流体排出ポート５９４を介して、（圧力を低下させるために除去された空気などの）流体を装置５００から除去し得る。さらなる流体注入／排出ポート５９７も示されている。
光障壁によって到達可能な第一のウィンドウ部分５９８及び光障壁によって到達可能な第二のウィンドウ部分５９９が示されており、これらは、装置５００内の流体カラムのメニスカスが光障壁に関連する透明なウィンドウ部分５９８、５９９を通過するときに、光学的に検出する役割を果し得る。ウィンドウ部分５９８、５９９に対応するチャンバーの１つが液体又は流出液に満たされていることを光障壁の１つが検出すると、これは光学的に検出されることができ、調節ユニット（図１８及び図１９には図示されていない。）を調節し、対応して、装置５００の動作を調節するために調節シグナルを生成する役割を果し得る。
挿管の第一の部分が溝５０１中に挿入されると、患者から血液試料を採取し、全血試料を装置５００中に直接注入するために、挿管の第二の部分は患者の中に挿入され得る。
図１８及び図１９には示されていないが、ピンが流体接続ポート５２０、５２４、５２１、５２５、５４０、５４２、５４４、５４５、５４８、５７８、５８０、５５８、５６２、５６４、５６０、５６１、５５２、５５０、５１６、５５４、５３０、５２８、５３２、５２６、５４１、５６０、５６６、５１９の何れか各１つを選択的に開放又は閉鎖して、バルブ機能を実現するように、流体接続ポート５２０、５２４、５２１、５２５、５４０、５４２、５４４、５４５、５４８、５７８、５８０、５５８、５６２、５６４、５６０、５６１、５５２、５５０、５１６、５５４、５３０、５２８、５３２、５２６、５４１、５６０、５６６、５１９の何れの一つも、アクチュエータピン（図１８及び図１９には図示されていない。）によって圧縮され得る柔軟な部材によって覆われ得る。
図１８及び図１９には示されていないが、ピンがウェル５０２、５０４、５０６、５０８、５１０及び５１２上に選択的に押圧する役割を果たし、混合装置又はポンプとしての役割を果たせるように、ウェル５０２、５０４、５０６、５０８、５１０及び５１２の何れの１つも、アクチュエータピン（図１８及び図１９には図示されていない。）によって圧縮され得る柔軟な要素によって覆われ得る。
図１８から理解できるように、中央ウェル５１２を形成するコンポーネント５８７は、基材４０２の溝５８５、５８３の中に挿入され得る成型されたプラスチック部材である。このプラスチック部材５８７は、コンポーネント５９０、５９１、５７８、５４８、５８０、５５８などが形成されるように、両側からパターン化され、又は構造化され得る。
以下では、特に中央ウェル５１２を基礎とする装置５００中で行われるアッセイが説明されており、このアッセイは、迅速に、例えば１時間以内に、ＨＩＶ存在量の測定を実行することを可能とし得る。
中央チャンバー５１２の中には、ビーズを付与し得る。これらのビーズは、予め溶解された試料からの標的分子（例えば、ＨＩＶＲＮＡ）を捕捉するように構成され得る。例えば、ビーズは、捕捉分子のアンカー基を結合して、標的ヌクレオチドと捕捉分子を含む複合体を結合するように構成することができ、捕捉分子は、標的ポリヌクレオチドの一領域に対して特異的な結合部分とアンカー基を含む。
参照番号５４１は、圧縮された空気が要素５３８、５１８、５１６を通過し、ウェル５０２の中に入ることができるように、圧縮された空気（図１９の矢印を参照）への接続を表す。従って、圧縮された空気を用いて、ウェル５０２を汲み出して空にすることができる。溝５０１を介して供給された血液試料を水で希釈すべき場合には、このような水は、流体注入口５９３を介して供給され得る。
一実施形態において、例えば溶解のために、全血試料（又は他の何らかの試料）をウェル５０２中に輸送し得る。まず、チャンバーを圧縮し、溶解チャンバー５０２と接触している毛管に血液を付与し、次いで、溶解チャンバー５０２を開放することにより、血液を装置５００中に浸すことによって、血液を装置５００の中に浸すことができる。
この目的のために、上述されているような対応する溶解剤が、溶解ウェル５０２中に、乾燥された形態で提供されている。溶解ウェルは、それぞれアンカー基と標的ポリヌクレオチドのある領域に対して特異的な結合部分とを含む捕捉分子をさらに含み得る。それぞれ標的ポリヌクレオチドと捕捉分子を含む複合体をこの時点で含み得る試料は、次いで、（圧縮された空気を介して）コンポーネント５５４、５５６を介して、コンポーネント５５８に輸送することができる。このシナリオでは、コンポーネント５５２は、対応するアクチュエータによって閉鎖される。コンポーネント５５８、５８０を介して、中央ウェル５１２中に試料を輸送され得る。この目的のために、中央ウェル５１２の溝５９１、５９０は、流体の流れる力の影響下にある中央ウェル５０２から、このウェル５０２中のビーズが除去されないように、フリット（図１８及び図１９には図示せず）などのフィルターを備えることができる。従って、溝５９１、５９０中のフィルター又はフリットを介して、溶解された試料は、コンポーネント５７６を介して、中央ウェル５１２中へ輸送され得る。
中央ウェル５１２には、標的又は標的ポリヌクレオチドと捕捉分子を含む複合体が中央チャンバー５１２中の固体捕捉構造上で結合できるように、ビーズ又は表面機能化などの第一の結合要素を付与され得る。ビーズが試料材料と適切に混合するように、温置を実行し得る。
空気の流れが、コンポーネント５５８、５６０、５６１を介して、中央ウェル５１２から廃棄５１４中へ液体（すなわち、溶解された試料の捕捉されていないコンポーネント）を押圧する。従って、中央ウェル５１２中のビーズによって捕捉されなかった試料コンポーネントの多くは、廃棄チャンバー５１４の中に輸送される。従って、標的のみが中央ウェル５１２中に留まり、全血試料の残りは、この時点で、廃棄５１４の中に存在する。従って、中央ウェル５１２は、この時点で、捕捉プローブと標的を含む複合体と一緒に、ビーズを収容する。
その後、中央ウェル５１２を洗浄することができ、洗浄ウェル５０４中に、固体様式で与えられた洗浄緩衝液に対するコンポーネントが、洗浄緩衝液を作製するために使用される。特に、全血が使用される場合、又は溝５０１の中に挿入された挿管を介して試料が供給される場合、捕捉手順後に、幾らかの不純物がチャンバー５０２中に存在し得るので、このような洗浄手順は有利であり得る。
洗浄液は、空気圧の影響下で、コンポーネント５４１、５４０、５４２、５４６、５４８、５７８、５９１、５７４、５１２を介して拍出され得る。
既に上述されているように、洗浄緩衝液は洗浄ウェル５０４中で調製される。洗浄ウェル５０４では、このような洗浄緩衝液のための塩が乾燥された形態で存在し得る。洗浄緩衝液を調製するために、水がコンポーネント５２１（開放）に供給されるように、（コンポーネント５５４を閉鎖しながら）コンポーネント５６４、５６２、５７０、５５２、５２７（コンポーネント５３２、５２５、５３０は閉鎖されている。）を介して、コンポーネント５６６から水を輸送し得る。コンポーネント５２０に連結された透過性ウィンドウが水で満たされるまで（水で満たされたことは、コンポーネント５２０の隣の透過性ウィンドウに隣接する光障壁を通過するメニスカスを検出することによって検出し得る。）、水を洗浄ウェル５０４の中に汲み入れ得る。対応する検出シグナルを受領した時点で、水の供給が停止され得る。
次いで、洗浄ウェル５０４を覆う柔軟なカバー要素を圧縮して、洗浄ウェル５０４の中に提供されている塩を溶解するための混合を実施するために、アクチュエータ（図示せず）を上下に往復運動させ得る。
次いで、廃棄チャンバー５１４中に水が汲み入れられるように、様々なバルブの対応する調節によって、及び圧縮された空気を供給することによって、水で満たされたチャネルを空にすることができる。
洗浄手順が中央ウェル５１２中で実施され得るように、洗浄ウェル５０４中の調製された洗浄緩衝液は、次いで、中央ウェル５１２中へ押し出され得る。この洗浄後、洗浄溶液は廃棄チャンバー５１４中に拍出され得る。
次に、標的ＲＮＡを対応するＤＮＡへ転化させるために、逆転写を行うことができる。このような手順は、ＨＩＶなどのレトロウイルス科を検出する場合に特に必要であり、例えば、ＤＮＡウイルスが検出される場合など、他の事例では省略することができる。このような逆転写を行うために、プライマー、酵素及び緩衝液などの逆転写のために必要とされる成分は、逆転写ウェル５０８から中央ウェル５１２中へ拍出し得る。
必要に応じて、逆転写ウェル５０８中の成分は、逆転写の間に産生された中央ウェル５１２中のＤＮＡ分子を捕捉する特異的能力を有し得るさらなる捕捉分子の別の組も含み得る。
逆転写後に、標的ＤＮＡはチャンバー５１２のビーズに留まらないので、溶液を廃棄容器５１４中へ輸送することは試料の量を低下させる。この目的のために、試料は、この時点で、中央ウェル５１２からＰＣＲウェル５１０中へ拍出され、この試料内のＰＣＲを溶解することができ、ＰＣＲウェル５１０中のＰＣＲ緩衝液は、標的ポリヌクレオチド、プライマー及び／又は緩衝液と複合体を形成することができるポリメラーゼ、レポーター分子を含み得る。あるいは、逆転写緩衝液は合成されたＤＮＡ鎖へ誘導される捕捉分子を含有し、これらの鎖の捕捉はＨＩＶ核酸の最初の捕捉と同様に起こる。この後、試料はポンプ作用で中央ウェル５１２中に汲み戻すことができる。
しかしながら、実際のＰＣＲ増幅は、その後、中央ウェル５１２中で行われる。この目的のために、温度サイクルを実施することによって、すなわち、例えば９５℃で５秒及び６０℃で１０秒の手順を４０回繰り返すことによって、中央ウェル５１２中でＰＣＲが行われる。別の実施形態において、例えば、９５℃で２０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で３０秒の３０サイクルなど、３つ又はそれ以上の異なる温度を含む温度サイクルを実施することができる。しかしながら、他のＰＣＲサイクルプロトコールも、中央チャンバー中で実施することができる。
幾つかの実施形態において、中央ウェル５１２中の温度を調整するために、中央ウェル５１２の上及び下に、２つの加熱及び／又は冷却プレートを取り付けることができる。別の実施形態において、２つの加熱及び／又は冷却ウェル又はプレートのうちの一方は連続的であり得、及び他方は、その後の光学的検出を可能とするために陥凹を有し得る。
幾つかの実施形態において、ＰＣＲウェル５１０から中央ウェル５１２に送り出された試料の容積は、中央ウェルの圧が上昇するような容積であり得る。この圧上昇により、２枚の加熱及び／又は冷却プレートに対して中央ウェルの柔軟性のあるカバー素子が押し付けられ、これにより、とりわけ、加熱／冷却プレートと中央ウェルとの間の熱転移が効率的になる。
幾つかの実施形態において、増幅の間に、上述のように検出が行われ得る。
例えば、第一の実施形態において、捕捉分子の競合的アッセイは中央ウェル５１２中で行い得る。従って、この実施形態において、ビーズなどの第一の結合要素は、それぞれ標的分子と捕捉分子を含む複合体を捕捉するために使用され、中央ウェル５１２中に固定化されたレポーター特異的捕捉分子のアレイを含む第二の結合要素は検出のために使用される。競合的アッセイは、標的核酸の量の少なくとも一部との、レポーター化合物の量の一部の複合体を形成することを含み、これらの複合体の形成は中央ウェル５１２中に固定化されたレポーター特異的捕捉分子のアレイによるレポーター化合物の捕捉を阻害する。中央ウェル５１２中に固定化されたレポーター特異的捕捉分子は、標的ポリヌクレオチドと複合体を形成していないレポーター化合物の量の少なくとも残りの一部を捕捉することができる。検出のために、ウェル５１２中にレポーター特異的捕捉分子の異なる種類のアレイを与えることによって、ＨＩウイルスの異なる型、例えば、１型ＨＩＶと２型ＨＩＶを区別することが可能であり、ＨＩウイルスの異なる再タイプ間を識別することさえ可能であり得る。
第二の実施形態において、同じく検出のために、捕捉手順のために既に使用された同じ結合要素、例えばビーズを使用することが可能である。この実施形態において、アンカー基を介してビーズに付着されている捕捉オリゴヌクレオチドは、それ自体蛍光標識を含み得る増幅された標的ＤＮＡの複合体とハイブリッドを形成し得る。
捕捉されたレポーター化合物又は捕捉された標的分子は、例えば上述のような蛍光標識を用いて、光学的検出によって検出され得る。特に、光源（図示せず）及び光検出装置（図示せず）を有する光学システムは、ＰＣＲの間にシグナルの時間依存性を測定する様式で作動することができ、これは、ＨＩＶのウイルス負荷量を導くことができる。換言すれば、蛍光シグナルの時間依存性が獲得され、評価され得る。
以下では、図２０を参照して、典型的な実施形態に係る装置６００を説明する。
図２０の実施形態は図１８、１９の実施形態と類似しているので、対応するコンポーネントは同じ参照数字で表記されている。簡略化及び明確化のために、図２０中では、チャネル及び流体ポートは参照数字を用いて表記されていない。対応する説明のために、図１８及び図１９が参照される。
図２０は、ウェル５０４、５０６に対して作用する、及び様々な流体連通ポートに対して作用するアクチュエータを調節するための調節信号を測定するための基礎として、メニスカスの検出を可能とするための、従って、流出の検出を可能とするための、ウェル５０４に関連するウィンドウ部分６０２及びウェル５０６に関連するウィンドウ部分６０４を示している。
幾つかの実施形態において、何れの位置において装置６００が作動され得るかを示すために、重力ベクターｇの方向が示されている。これらの実施形態において、装置６００の動作は、重力と圧力空気接続部６０６と水供給接続部を介して付与される液体輸送力との組み合わせに基づいている。さらに、対応する流体構造に排出口を作るための排出口接続６１０及び排出口接続６１２が設けられている。
図２０は、図２０の一体的解決法の代わりに、その中で様々なモジュールが一緒に組み立てられる、ユーザ定義される装置を形成するために他のモジュールと組み合わせることができる別個のモジュールとして与えられ得る部分６１３を模式的に示している。
以下では、図２１を参照して、別の典型的な実施形態に係る装置７００を説明する。
装置７００は、その中に第一の通過穴７０９と第二の通過穴７０７が形成されている堅固な基材７０４を含む。基材７０４の第一の主表面上に、第一のウェル７２０及び第二のウェル７０８が形成されている。基材７０４の反対側主表面上には、チャネル７０６が形成されている。チャネル７０６は、それぞれ、通過穴７０９、７０７を介して、ウェル７２０、７０８と流体連通している。
堅固な基材７０４の上面には、第一の柔軟なカバー要素７０８が形成されており、堅固な基材７０４に接着されている。基材７０４の下面上には、第二のカバー要素７０５が形成されており、堅固な基材７０４と層板化されている。
図２１からさらに理解され得るように、第一のアクチュエータ要素７０１と第二のアクチュエータ要素７０２が付与されており、第一のアクチュエータ要素７０１は、通過穴チャネル７０９又はウェル全体７２０を選択的に閉鎖するために、カバー要素７２０の第一の部分に押圧するように適合されている。対応する様式で、第二のアクチュエータ要素７０２は、ウェル７０８及び／又は通過穴７０７を選択的に開放又は閉鎖し得る。従って、ウェル７２０又は７０８の一方又は両方中への流体通過チャネル７０６の流れを調節することができる。
図２２は、本発明に従う典型的な競合的アッセイの模式図を表す。標識された核酸レポーター分子（灰色の波線として示されている。）は、結合要素（ここでは、ビーズとして例示されている。）上の核酸捕捉分子（黒い波線として示されている。）を介して付着されている。検出すべき標的核酸は、二本鎖形態で試料中に存在する（２つの鎖は、薄い灰色／黒い波線として示されている。）。（循環増幅反応の）変性工程へ試料を供することによって、標的核酸の鎖を解離させ、結合要素からレポーター分子を放出させることができる。その後の徐冷工程の間に、レポーター分子の量の一部を標的核酸の量の少なくとも一部と複合体を形成させる（標的核酸／レポーター分子複合体の形成は、レポーター分子の結合に関する捕捉分子と核酸標的の競合のために、結合要素上に捕捉されているレポーター分子の能力を阻害する。）。標的核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を、結合要素の上に再捕捉させる。この段階で、結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値及びこれに基づいて、標的核酸の存在及び／又は量に対する指標となる値は、受容体分子中に含まれる標識によって生成されたシグナルを検出することによって測定される。徐冷工程と連続して又は同時に、増幅反応の伸長工程が実施される。次いで、試料は、別の増幅サイクルに供することができる。
図２３は、同じ標的を用いて行われる標準的なＴａｑ−ｍａｎアッセイと比べて、試料中のヒトポリオウイルス１ＤＮＡ（「エンテロウイルスＤＮＡ」に対して「ＥＶ」と表記される。）の量を測定するための本発明に従う典型的な競合アッセイの結果を示している。それぞれ１０４ＤＮＡコピーを含有する２つの試料を平行して分析した。第一の試料（図表中の標識「プローブ」）は、製造業者の指示に従い、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ６０００リアルタイム回転式ＰＣＲ分析装置（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、ＰＣＲ増幅に供した。用いたＰＣＲプライマーは、１５０塩基対のＤＮＡ断片の増幅をもたらした。断片の検出は、それぞれ、その５’末端に６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）標識及びその３’末端に６−カルボキシテトラメチルローダミン−スクシンイミジルエステル（ＴＡＭＲＡ）標識を含むいわゆるＴａｑｍａｎ（Ｒ）プローブ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて実施された。計５０のＰＣＲサイクルを行った。第二の試料（「競合的アッセイ」）は、Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）プローブと同じヌクレオチド配列を有するレポーター分子をさらに含んだが、ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ標識の代わりに、その３’末端にＣＹ３カルボシアニン標識（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含み、本発明の一実施形態に係る装置を用いて増幅された。増幅の間に検出された、得られた蛍光シグナルが、図表中に示されている。
図２４は、試料中のＨＩＶｇａｇ／ｅｎｖＰＣＲ産物の量を測定するための、アレイをベースとする本発明の典型的な競合的アッセイの原理及び結果を示している。図２４Ａは、アッセイの原理を模式的に図解している（図２２も参照）。当初、増幅されたＰＣＲ産物、すなわち標的核酸は存在しない。標識された蛍光核酸レポーター分子は、アレイの基材上に捕捉されたレポーター特異的プローブに結合される。
ＰＣＲ産物が産生されない場合には、レポーター特異的プローブにハイブリッド形成するレポーター分子の量は、増幅反応の各サイクル後に一定のままであるので、測定される蛍光シグナルも一定のままである。ＰＣＲ産物が合成される場合には、レポーター特異的プローブにハイブリッド形成するレポーター分子の量は各ＰＣＲサイクル後に減少し、その結果、測定される蛍光シグナルも対応して減少する。図２４Ｂは、１５１塩基対ＨＩＶｇａｇ／ｅｎｖＰＣＲ産物の量を測定するためのアレイをベースとする競合的アッセイ結果を示している。その５’末端にＣＹ３カルボシアニン標識（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を含むレポーター分子（「（ａｎｔｉ ｃｄｓｏ２９ ５’ＣＹ３’’）」）と一緒に、断片の異なる量（１０４から１０６コピーに対応する。）をＰＣＲ増幅の３６サイクルに供した。プローブ分子の２つの異なる種類（非特異的なプローブ分子（「ａｒａ ５４９８６ ＮＨ２」）及びレポーター特異的プローブ分子（「ｃｄｓｏ２９ ＮＨ２」））を図２５Ａに示されている配置でアレイ基材上に捕捉し、使用されるアッセイ装置の反応チャンバー内に配置した。Ｉｃｏｎｏｃｌｕｓｔソフトウェア（Ｃｌｏｎｄｉａｇ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ， Ｊｅｎａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＣＴ値（「閾値」、すなわち、蛍光の増加、従って、ＤＮＡ量の増加が線形的に起こる指数的増幅期の開始に対する指標）を求め、較正曲線を作成するために、用いたそれぞれのＤＮＡ濃度に対してプロットした（図２４Ｃ）。受容体特異的プローブを使用する全ての試料において、ＰＣＲサイクルの数が増加するにつれて、蛍光強度の段階的減少が観察された。これに対して、非特異的プローブを用いた試料では、蛍光は観察されなかった（図２４Ｂ）。
図２５は、ＰＣＲ増幅の異なる段階において、図２４に示されているアッセイ中で使用されるアレイを図示する。アレイ基材上の異なるスポットの配置が、図２５Ａに模式的に図解されている。黒丸はレポーター分子を捕捉するために特異的プローブ（図２４参照）が使用されたスポット（４つの平行試料）を表すのに対して、白丸はレポーター分子を捕捉するために非特異的プローブが使用されたスポット（４つの平行試料）を表す。灰色の丸は、蛍光標識がアレイ基材上にスポット付与された陽性対照を表す。図２５Ｂは、それぞれ、１、１２、１８及び２１増幅サイクル後に撮影されたアレイ（図２４Ｂ中の１０５ＤＮＡコピー試料に対応している。）の写真を示している。特異的プローブ分子を介してアレイ上に捕捉された試料中では、ＰＣＲ増幅の過程中に、蛍光シグナル強度の減少を観察することができる。
図２６ＡからＤは、本発明に従うポリヌクレオチドの検出のための競合的方法の典型的実施形態の模式的図解を表す。図２６Ａに示されているように、増幅されたＰＣＲ産物、すなわち標的核酸は当初存在しない。標識された核酸レポーター分子（黒い波線として示されており、標的／プローブ特異的レポーターと表記されている。）は、アレイの基材上に捕捉されたレポーター特異的プローブに結合されている。シグナルは、アレイの基材上に捕捉された内部対照特異的プローブに結合されている標識された内部対照分子（薄い灰色の波線として示されている。）のものと対応している。図２６Ｂに示されているように、ＰＣＲが初期指数関数期に入ると、レポーター分子は、基材上に捕捉されたレポーター特異的プローブに結合するのみならず、ＰＣＲ産物のレポーター特異的領域にも結合する。従って、ＰＣＲ産物が合成される場合には、基材上に捕捉されたレポーター特異的プローブにハイブリッド形成するレポーター分子の量は減少し、その結果、測定されるシグナルも対応して減少する。ＰＣＲが指数関数期に入ると、指数シグナルは著しく減少する（図２６Ｃ参照）。ＰＣＲが安定期に達すると、基材上に捕捉されたレポーター特異的プローブ上のシグナルは低い状態を保つ（図２６Ｄ）。
図２７は、試料中のＨＩＶサブタイプＢ及びＨＩＶサブタイプＯ２の量を測定するための本発明に係る競合的アッセイの典型的な実施形態の結果を示している。図２７Ａの基礎となる実験において、ＨＩＶサブタイプＢのみが試料中に存在した。ＨＩＶサブタイプＯ２（ＨＩＶｓｕｂＯ２）に対して特異的な標識された核酸レポーター分子に対応するシグナルは一定のままであるのに対して、ＨＩＶサブタイプＢ（ＨＩＶｓｕｂＢ）に対して特異的な標識された核酸レポーター分子に対応するシグナルは、ＰＣＲの約１３サイクル後に著しく減少することが明らかである（図２６参照）。図２７Ｂの基礎となる実験では、ＨＩＶサブタイプＯ２のみが試料中に存在した。ＨＩＶサブタイプＢ（ＨＩＶｓｕｂＢ）に対して特異的な標識された核酸レポーター分子に対応するシグナルは一定のままであるのに対して、ＨＩＶサブタイプＯ２（ＨＩＶｓｕｂＯ２）に対して特異的な標識された核酸レポーター分子に対応するシグナルは、ＰＣＲの約２５サイクル後に著しく減少することが明らかである（図２６参照）。
図２８は、試料中のＨＩＶサブタイプＢの異なる量を測定するための本発明に係る競合的アッセイの典型的な実施形態の結果を示している。ＨＩＶの１０６コピーが試料中に存在する場合には、ＨＩＶサブタイプ（ＨＩＶｓｕｂＢ）に対して特異的な標識された核酸レポーター分子に対応するシグナルは、ＰＣＲの約１３サイクル後に著しく減少する（図２８Ａ参照）。ＨＩＶの１０４コピーのみが試料中に存在する場合には、ＨＩＶサブタイプ（ＨＩＶｓｕｂＢ）に対して特異的な標識された核酸レポーター分子に対応するシグナルは、ＰＣＲの約１９サイクル後に著しく減少する（図２８Ｂ参照）。シグナルの減少が検出可能となる前に必要とされるＰＣＲサイクルの量は分析すべき試料中に存在する標的核酸の量についての結論を可能にすることが図２８から明らかである。
図２９は、５２名のＨＩＶ感染患者からの血漿試料及び全血試料中のＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡの個々のコピー数を決定するＰＣＲに基づくアッセイの結果を示す（ＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ ＴａｑＭａｎ ＨＩＶアッセイ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。簡潔に述べると、静脈穿刺により患者の全血試料を得た。凝固を防ぐためにＥＤＴＡを試料に添加した。４０００ｘｇで５分間、全血試料を遠心し、細胞残屑を除去することにより、血漿を精製した。製造者の説明書に従い、ＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ ＴａｑＭａｎ４８装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において、血漿試料１ｍＬ及び全血試料１０μＬ（９９０μＬリン酸緩衝食塩水と混合）を自動的に処理した。ＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＬｉｎｋソフトウェアパッケージによりウイルスコピー数（試料体積１ｍＬあたり）を自動的に計算し、血漿試料に対する全血試料の散布図として示す。全血試料に対して得られる値に係数１００をかけ、様々な血液試料体積に対して補正した（１ｍＬ血漿に対して１０μＬ全血）。検出されたウイルスコピーが４０未満であるこれらの血漿試料に対して、図３０に記載のようにコピー数を計算した。対数目盛のため、血液又は血漿試料の何れかにおいて陰性の結果となる試料（即ち１ｍＬあたり０ウイルス）は示さない。
図３０は、検出されたＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡがないか又はＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡが４０コピー未満であったこれらの血漿試料に対して図２９で示されるアッセイの結果を示す。個々のコピー数／ｍＬ試料に対する全計算値に基づき検量線を作成することによって、ウイルスコピー数（試料１ｍＬあたり）を手動で計算した（即ち得られたＡｍｐｌｉＬｉｎｋ結果ファイルで与えられる閾値）。
図３１は、２４５名のＨＩＶ感染患者からの血漿及び全血試料中のＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡの個々のコピー数を調べる、図１で示されるような別のアッセイの結果を示す（図２９で調べられた５２名の患者を含む。）。
図３２は、ＨＩＶ抗ウイルス療法を受けるＨＩＶ陽性患者（患者＃０２８）の個々の血漿及び全血ウイルス負荷量の測定を示す。ウイルス負荷量は、図２９のアッセイに従い決定した。投薬計画中に異なる日に全血及び血漿試料を回収した。コンプライアンスの問題のために（即ち患者は処方どおりに薬物を摂取していなかった。）、薬物療法に対する患者の反応の監視開始後約６０日に、全血試料中でＨＩＶ負荷量の急激な上昇が観察された（しかし血漿試料では観察されなかった。）。
図３３は、ＨＩＶ抗ウイルス療法を受ける２名のＨＩＶ陽性患者の個々の血漿及び全血ウイルス量の測定を示す：患者＃００３（図３３Ａ）及び患者＃００４（図３３Ｂ）。図２９のアッセイに従い、ウイルス量を測定した。投薬計画中の異なる日に全血及び血漿試料を回収した。両患者において、血漿中のウイルス量は低く、全血中のウイルス量は比較的高いことが観察された。これらのデータから、投薬計画中、ウイルスは依然として活発に複製するが、ＨＩＶプールの複製は主に細胞結合型であり、従って血漿試料中のウイルス量が非常に低いままであることが理解され得る。
図３４は、ＨＩＶ抗ウイルス療法を受ける２名のＨＩＶ陽性患者の個々の血漿及び全血ウイルス量の測定を示す：患者＃００９（図３４Ａ）及び患者＃０６６（図３４Ｂ）。図２９のアッセイに従い、ウイルス量を測定した。投薬計画中の異なる日に全血及び血漿試料を回収した。患者＃００９において、血漿中のウイルス量は検出限界以下であったが、全血では（明らかに主に細胞結合型）ＨＩＶを検出することができた。患者＃０６６において、服薬遵守の問題によって（即ち患者は処方どおりに薬物を摂取していなかった。）、薬物療法に対する患者の反応の監視を開始してから３５日後まで両方の全血試料でＨＩＶ量の上昇が観察された。後で、別の療法を開始し、その結果、ウイルス量が低下した。全血及び血漿ウイルス量に対して観察される個々の経時変化は同様であったが、絶対数において、全血試料中のウイルス量は常に血漿試料のウイルス量よりも高かった。
図３５は、全血及び血漿試料中で観察されるウイルスコピー数の典型的な経時変化を示す。「ＩｄＩ」という表記は、行われる分析の検出下限を示す。全血試料中で観察されるウイルスコピー数は常に血漿試料の個々のコピー数よりも多い（「ｄｅｌ」及び「ｄｃ２」は「コピー数の違い」を指す。）。しかし、多くの場合、それぞれ、血漿試料中で、ウイルスコピー数はより早くから低下し、増加するのは全血試料よりも遅い（「ｄｔｌ」及び「ｄｔ２」は「時間の違い」を指す。）。
次に、図３６を参照して、別の代表的実施形態による装置８００を説明する。
溶解の必要がある物質が乾燥形態で保存され得る溶解チャンバー８０２が提供される。中央ウェル８１２は、装置８００を操作するために必要な全ての固相カップリング手順ならびに標的の増幅を行うのに役立つ。様々なさらなる物質が乾燥形態で提供され、洗浄手順、ＰＣＲ手順などに役立ち得る、さらなるウェル８０４、８０６及び８０８が提供される。例えば、アッセイ開始前の元の状態において、溶解ウェル８０２、ＰＣＲ／ＲＴ緩衝液ウェル８０８、洗浄緩衝液ウェル８０６及び洗浄緩衝液ウェル８０４は、アッセイの個々の段階に対する適切な薬剤を含有する。分析に必要ない液体が輸送され得るウェルとして、廃液チャンバー８１４が提供される。
図３６では示されないが、廃液チャンバー８１４において、廃液チャンバー８１４に入る液体を吸収し得る液体吸収材が提供され得る。この措置を取ることにより、廃液チャンバー８１４から装置８００のその他の部分への液体の不要な逆流を安全に防ぎ得、これにより汚染を回避することができる。例えば、このような目的のために膨潤性ポリマー（おむつでも使用され得る。）が使用され得る。
廃液チャンバー８１４は、装置８００を通気するための隙間８１５を含み得る。気体のみが通過でき、液体、エアロゾル及びＤＮＡ又はＲＮＡなどの巨大分子が装置から出るのを防ぐフィルターによってこの隙間に蓋をすることができる。
さらに、流体リザーバー８１６は、これを介して装置内に流体が保存され得、及び／又は装置８００に注入され得ることが示される。ある実施形態において、流体リザーバー８１６は、分析に必要とされ得る水又は別の溶媒を含有するリザーバーであり、このリザーバーは様々な容積である。容積を小さくすることにより、例えば作動装置８１７を介して外力をかけることにより、リザーバー８１６の内容物が装置８００に注入され得る。ある実施形態において、流体リザーバー８１６は、隔壁を介してマイクロ流体ネットワークに連結されるチャンバーである（示さない。）。分析開始前に、このチャンバーは、流体ネットワークから流体的に分離されている。分析を開始する際に、隔壁が開けられ、それにより流体リザーバーが流体ネットワークに連結され、それによって外力下でリザーバーの内容物が装置８００のチャンネル及びウェルに放出されるようになる。
特に図３６から分かるように、複数の流体連結ポート８２０−８２６が提供される。図３６では示されないが、作動装置ピンが流体連結ポート８２０−８２６の何らかの個々の１つを選択的に開閉するのに役立ち得るように、作動装置ピンにより圧縮され得る柔軟性のある部材によって、流体連結ポート８２０−８２６の何れか１つがカバーされ得、このようにして、例えば図１７ａ及びｂ又は図２１で説明されるように、バルブ機能が発揮される。さらに、複数のチャンネル８３０−８３７のマイクロ流体ネットワークは、様々な流体連結ポート８２０−８２６及びウェル８０２、８０４、８０６、８０８及び８１２を連結することが予測される。
光バリアにより接近可能な窓部８４０は、装置８００内の液体カラムのメニスカスが光バリアに関して透明な窓部８４０を通過する際に光学的に検出するのに役立ち得ることが示される。光バリアの１つが、窓部８４０に対応するチャンバーの１つに液体が満たされるか又は溢出したことを検出した場合、これは光学的に検出され得、対応して装置８００の操作を調節するために、調節ユニットを調節するための調節シグナルを生成させるのに役立ち得る（図３６では示さない。）。
図３６では示されないが、作動装置ピンがウェル８０２、８０４、８０６、８０８及び８１２を選択的に圧縮するのに役立ち得るように、作動装置ピンにより圧縮され得る柔軟性のある部材によって、ウェル８０２、８０４、８０６、８０８及び８１２の何れか１つがカバーされ得（図３６では示されない。）、従ってこれらのウェルはミキサー又はポンプとして作用する。
参照数８１８は、圧搾空気が装置８００へ導入され得るような、圧搾空気への連結部を示す。例えば、流体連結ポート８２１−８２４及び８２６が閉じられ、流体連結ポート８２０及び８２５が開かれる場合、圧搾空気は、連結部８１８を介してウェル８０２に、連結ポート８２０、チャンネル８３０、流体連結ポート８２５を介して、ウェル８１２に流れ得る。このようにして、ウェル８０２に液体が満たされると、圧搾空気を用いてウェル８１２にウェル８０２の内容物を送り込むことができる。例えば、本装置は、空気又は気体を本装置に送り出すために、穿孔され得る隔壁を含み得る。装置に空気又は気体を送り出すことにより、個々のバルブ又は流体連結ポートを開くことによって、ウェル８０２、８０４、８０６及び８０８から中央ウェル８１２に液体を推し進めるか又は押し出すことができる。
次に、特に中央ウェル８１２に基づく、装置８００で行われる代表的アッセイは、速い方法で、例えば１時間未満でＨＩＶ量の決定を行うことを可能にし得るといえよう。
中央チャンバー８１２内で、ビーズ８１２ａなどの結合部材が提供され得る。前もって溶解された試料から標的分子（例えばＨＩＶ ＲＮＡ及びＤＮＡ）を捕捉するために、この結合部材が構成され得る。例えば、この結合部材は、標的ポリヌクレオチド及び捕捉分子を含む複合体を結合させるための捕捉分子のビオチンなどのアンカー基を結合するために構成され得、この捕捉分子は、標的ポリヌクレオチド及びアンカー基の領域に特異的な結合部分を含む。中央ウェル８１２には、中央ウェル８１２のビーズが流体の流動力の影響下でこのウェルから除去されるのを防ぐガラス原料などのフィルター（図３６では示されない。）が備えられ得る。
ある実施形態において、例えば溶解のために、全血試料（又は何らかのその他の試料）がウェル８０２に輸送され得る。血液をキャピラリー８０１に最初に添加し、キャピラリー８０１が溶解チャンバー８０２と接触し、次いでプラグでキャピラリーを閉じ（示さない。）、それによってキャピラリー８０１内の圧が上昇し、溶解チャンバー８０２へと血液試料が推し進められるか又は押し出されることによって、装置８００に血液が導入され得るか又は押し出され得る。
このために、溶解ウェル８０２において乾燥形態で上述のような対応する溶解剤が提供される。この溶解ウェルは、アンカー基及び標的ポリヌクレオチドの領域に特異的なビオチン部分をそれぞれ含む捕捉分子をさらに含み得る。次に、標的ポリヌクレオチド及び捕捉分子をそれぞれ含む複合体を含み得る試料が中央ウェル８１２に輸送され得る。
中央ウェル８１２において、標的ポリヌクレオチド及び捕捉分子を含む標的又は複合体が中央チャンバー８１２の固体捕捉構造で結合され得るように、ビーズ８１２ａ又は表面官能化などの第一の結合部材が提供され得る。ビーズが的確に試料物質と混合するように、温置が行われ得る。
中央ウェル８１２は、空気バネとして機能するさらなるウェル８５０又はチャンバーを伴う例えばチャンネル８３６を介した流体輸送路中にあり得る。ばねウェルとしても示されるさらなるウェル８５０は、中央ウェル８１２の内容物を受容するのに適切であり得る。中央ウェル８１２は（内容物がそこから移動する。）、中央ウェル８１２に液体が提供される際、マイクロ流体ネットワークを介して連結される。液体提供前に中央ウェル８１２に含まれている充填物質（通常は空気）は、ばねウェル８５０中に保存され得る。ばねウェルは、濃度にかかわりなく、あらゆる物質、即ち液体及び気体を保存し得ることに注意されたい。
バネウェル８５０はまた、中央ウェル８１２からの内容物を受容する際に圧が上昇するようになされ得る。ウェル８５０はまた、内容物、例えば気体又は空気を中央ウェルに放出することにより、中央ウェル８１２へ上昇した圧を放出するようになされ得る。このようにして、ウェル８５０は空気バネとして機能し得、これによって、開放されたバルブ８２５を通じて中央ウェル８１２から液体を移動させることができる。この実施形態において、例えば外部圧縮空気の代わりに、上昇した圧力が、中央ウェル８１２から収容液体を移動させるのに役立つので、例えば外部圧縮空気供給による能動的移動が無用になり得る。
例えば、中央ウェル８１２を充填する場合、空気バネに含まれる空気又は気体が圧縮され、空気バネ内の圧が上昇する。このようにして、中央ウェルを充填する場合、加圧下で、例えば５００から２０００ｍｂａｒ、例えば８００ｍｂａｒの圧で、液体が導入され得る。充満圧が低くなる場合（例えばバルブ８２５を開くことにより）、挿入溶液が中央ウェル８１２から搾り取られ又は押し出されるように、空気バネ８５０の圧が充満圧よりも高くなる。
空気バネ８５０は、そこにおける上昇蓄積圧が中央ウェルの内容物を廃液容器８１４へと移し完全に空にするのに十分となるように寸法が決められ得る。例えば、空気バネウェル８５０の容積は、基本的に中央ウェル８１２と同じ大きさであり得る。ある実施形態において、空気バネの容積は中央ウェル８１２の２倍もしくは３倍の容積であるか又は中央ウェル８１２の容積の半分である。例えば、空気バネウェル８５０の容積は、５０から３００μＬの間、例えば１００μＬ、１５０μＬ、２００μＬ又は２５０μＬなどであり得る。
ウェル８５０は、ウェル８５０と中央ウェル８１２との間に、流体輸送路、即ち液体又は気体輸送路としてのチャンネル８３６とともに提供され得る。中央ウェル側のチャンネル８３６の開口部は、標準操作位置の重力の方向と逆の方向に位置し得る。これは、開口部が標準重力条件において中央ウェル８１２の上部にあることを意味する。このようにして、中央ウェル８１２の収容液が意図せずにウェル８５０に放出されることを回避することができる。ウェル８５０は、マイクロ流体ネットワークを介した中央ウェル８１２との流体輸送路であり得る。従って、ウェル８５０は、圧力リザーバー又は圧縮ガスバネとして機能を果たし得、第二の構造から離れて位置し得る。
代表的実施形態に従い、検出装置８４０、例えば光バリアは、中央ウェル８１２とウェル８５０との間に提供され、検出装置８４０は、中央ウェル８１２に収容される収容液の存在を検出するのに適している。装置８４０は、中央ウェル４１２とウェル８５０との間の流体連結部の任意の場所であり得る。
ばねウェル８５０において（例えば流体連結ポート８２５及び８２６を開くことにより）上昇圧を放出することによって、液体（即ち溶解した試料の非捕捉成分）が中央ウェル８１２から廃液８１４へと推し進められるか又は押し出される。このようにして、中央ウェル８１２でビーズにより捕捉されていない試料成分が廃液チャンバー８１４に輸送される。このようにして、標的物のみが中央ウェル８１２に残り、このときに全血試料の残りは廃液チャンバー８１４にある。このようにして、このときに中央ウェル８１２は捕捉プローブ及び標的物を含む複合体とともにビーズを収容する。
続いて、中央ウェル８１２が洗浄され得るが、洗浄緩衝液を生成させるために洗浄緩衝液ウェル８０４にて固形で提供される洗浄緩衝液用の成分が使用される。捕捉手順後、チャンバー８１２にある程度の不純物が残存し得るので、このような洗浄手順は有利であり得る。
上記で既に述べたように、洗浄緩衝液ウェル８０４において洗浄緩衝液が調製される。洗浄ウェル８０４において、このような洗浄緩衝液のための塩が乾燥形態で存在し得る。洗浄緩衝液を調製するために、部品８２１に連結された透明な窓８４０に水が満たされるまで（ウェル８０４の隣の透明な窓に隣接する光バリアを通過するメニスカスを検出することにより検出され得る。）、液体リザーバー８１６からの水が（流体連結ポート８２０、８２２、８２３、８２５及び８２６が閉じられる一方で）チャンネル８３０、８３３及び流体連結ポート８２１を介して洗浄ウェル８０４に輸送され得る。対応する検出シグナルを受け取ると、水の供給が停止され得る。
ある実施形態において、混合を行ってそこで提供される塩を溶解するため、洗浄ウェル８０４をカバーする柔軟性のあるカバー部を圧縮するために作動装置（示さない。）が上下に往復運動し得る。
次に、中央ウェル８１２で洗浄手順が行われ得るように、部品８１８、８３１、８０４、８２１、８３３、８３０、８２５を介して圧をかけることによって、洗浄緩衝液ウェル８０４中の調製済み洗浄緩衝液が中央ウェル８１２に送り出され得る。ウェル８０４の内容物をウェル８１２に送り出すことによって、ウェル８５０の圧が上昇する。この洗浄後、例えば上述のように、ウェル８５０の圧を放出することにより、廃液チャンバー８１４に洗浄溶液が送り出され得る。
次に、ウェル８０６及び８０８中の緩衝液を調製し、同様にチャンバー８１２へ及びチャンバー８１２から、輸送し得る。
次に、対応するＤＮＡに標的ＲＮＡを変換し、続いてＤＮＡを増幅するために、逆転写とそれに続くＰＣＲを行い得る。このような手順は、特に、ＨＩＶなどのレトロウイルスを検出する場合に必要であり、逆転写段階は、例えばＤＮＡウイルスが検出される場合など、その他の場合には不必要であり得る。このような逆転写ＰＣＲを行うために、プライマー、酵素及び緩衝液などの逆転写に必要な成分がＲＴ／ＰＣＲウェル８０８から中央ウェル８１２に送り出され得る。
次に、中央ウェル８１２でＰＣＲ増幅が行われる。このために、温度サイクルを行うことにより、即ち、例えば９５℃で５秒間及び６０℃で１０秒間の手順を４０回繰り返すことにより、中央ウェル８１２でＰＣＲが行われる。別の実施形態において、例えば、９５℃で２０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の３０又は４０サイクルを含む３以上の異なる温度を含む温度サイクルが行われ得る。しかし、その他のＰＣＲサイクリングプロトコールも中央チャンバーで行われ得る。
ある実施形態において、中央ウェル８１２において温度を調整するために、中央ウェル８１２の上下に２枚の加熱プレートが提供され得る。別の実施形態において、この２枚の加熱ウェルの１枚は連続的であり得、他方は続く光学検出を可能にする凹所を有し得る。ある実施形態において、加熱プレートは、ペルティエ素子などの加熱及び／又は冷却プレートであり得る。
ある実施形態において、増幅中、上述のように検出が行われ得る。
例えば、第一の実施形態において、中央ウェル８１２で捕捉分子の競合アッセイが行われ得る。このようにして、この実施形態において、標的分子及び捕捉分子をそれぞれ含む複合体を捕捉するためにビーズなどの第一の結合部材が使用され、中央ウェル８１２に固定化された一連のレポーター特異的捕捉分子を含む第二の結合部材が検出のために使用される。競合アッセイは、標的核酸の少なくとも一部とレポーター化合物の一部の複合体を形成させることを含むが、これらの複合体の形成により中央ウェル８１２に固定化されたレポーター特異的捕捉分子によるレポーター化合物の捕捉が阻害される。中央ウェル８１２に固定化されたレポーター特異的捕捉分子は、標的ポリヌクレオチドとの複合体中にない、少なくともレポーター化合物の残りを捕捉することができる。検出のためのウェル８１２における様々な種類のレポーター特異的捕捉分子のアレイ８１２ｂを提供することによって、ＨＩウイルス、例えば１型ＨＩＶ及び２型ＨＩＶの様々なタイプを識別することが可能となり、ＨＩウイルスの異なるサブタイプを識別することも可能になり得る。
別の実施形態において、検出のための捕捉手順に対しても既に使用されている同じ結合部材、例えばビーズなど、を使用することができる。この実施形態において、アンカー基を介してビーズに結合させられている捕捉オリゴヌクレオチドは、それ自身が蛍光標識を含み得る増幅標的ＤＮＡの複合体とハイブリッド形成し得る。
捕捉されたレポーター化合物又は捕捉された標的分子は、光学的検出により、例えば上述のような蛍光標識を用いて、検出され得る。特に、ＰＣＲの間のシグナルの時間依存性を測定するために、光源（図示せず。）及び光検出器（図示せず。）を有する光学系を操作し得、これによりＨＩＶのウイルス量を導くことができる。換言すれば、蛍光シグナルの時間依存性が得られ、評価され得る。
代表的実施形態によると、中央ウェル８１２は、ＰＣＲ開始前に不可逆的に密封される。入口及び必要に応じて出口を溶接することによってこの密封を行うことができる。第三の構造、例えば空気バネ又はばねウェル８５０がある場合、入口のみを密封することができる。例えばバルブ８２５又はチャンネルに押し付けられる（これによって、プラスチックが溶融し、バルブ又はチャンネルを密封する。）ホットピンを使用することによって、密封を行うことができる。このように、ＰＣＲチャンバーを安全に密封することができる。
さらなる代表的実施形態によると、柔軟性のある第一及び第二の面又はカバー層が凸曲するように、ＰＣＲ用の中央ウェルが満たされる。このように、この層を加熱／冷却素子に推し進めるか又は押し付けることができ、従って、加熱／冷却素子と中央ウェルとの間の効率的な温度遷移が可能となる。
ある実施形態において、この試験に対して、本装置のキャピラリー８０１に血液が満たされる。キャピラリーをカバーで被覆した場合（図３６では示されない。）、溶解チャンバー又は溶解ウェルに血液が供給される。本装置は、ここで、検出器に挿入され、アッセイが開始される。最初に、全てのチャンバー又はウェル（中央のウェルは除外）に水が満たされる。個々のバルブ又は流体連結ポートが開かれ、ウェル８０２の上部の光バリア又は検出装置８４０が、ウェル８０２が満たされたというシグナルを送るまで、リザーバー８１６からウェルに水が押し出される。個々のウェルに対する水流が停止され、次のウェルが満たされる。水で満たすことにより、個々のウェル中の乾燥薬物又は試薬が溶解される。個々の溶液を使用する準備ができたら、最初に、溶解ウェル８０２の内容物が中央ウェル８１２に押し出される。このために、両ウェル間の流体連結が確立されるように、溶解ウェル下のバルブ又は流体連結ポートならびにバルブ又は中央ウェルを連結する流体連結ポートが開かれる。標的核酸を含有する溶解混合物は中央ウェル８１２に流れ、標的核酸は、中央ウェルの結合マトリクス上に捕捉分子を介して捕捉される。標的核酸を捕捉する効率を向上させるために、中央ウェルと溶解ウェルとの間で複数回動かすことによって、溶解混合物を複数回、中央ウェルに押し出す。
次に、上述のように空気バネ８５０を用いることによって、溶解液が廃液容器に押し出される。
以下の実施例によって、本発明をさらに記載するが、以下の実施例は、本発明な具体的実施形態を例示することを目的とするものに過ぎず、いかなる意味においても、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
実施例
ヒトポリオウイルス１ＤＮＡを測定するための競合的アッセイ
実施した競合的アッセイの原理は、図２２中に模式的に示されている。適切な発現ベクター中（ｐＣＲ（Ｒ）２．１−ＴＯＰＯ（Ｒ），Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）にクローニングされたヒトポリオウイルス１単離株ＴＣＤＣＯ１−８６１（ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＡＦ５３８８４３）のＤＮＡをＤＮＡテンプレートとして使用した（本明細書では、「ＥＶ」（エンテロウイルス）ＤＮＡとも表記される。）。
それぞれ１０４ＤＮＡコピーを含有する２つの試料を平行して分析した。第一の試料は、製造業者の指示に従い、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ６０００リアルタイム回転式ＰＣＲ分析装置（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｙｄｎｅｙ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、ＰＣＲ増幅に供した。
第二の試料（「競合的アッセイ」）は、Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）プローブと同じヌクレオチド配列を有するレポーター分子をさらに含んだが、ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ標識の代わりに、その３’末端にＣＹ３カルボシアニン標識（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含み、加熱可能な基部表面上にアレイが配置されているアッセイ装置の反応チャンバー中で直接使用して増幅された。
以下のＰＣＲプライマーを使用した。
フォワードＰＣＲプライマー：
ｐｒ ｆｏｒ ＥＶ ０２：５’−ＣＡＡＡＣＣＡＧＴＧＡＴＴＧＧＣＣＴＧＴＣＧＴＡＡＣＧ−３’（ＡＦ５３８８４３のヌクレオチド位置４９２から５１８に対応する。）
リバースＰＣＲプライマー：
ｐｒ ｒｅｖ ＥＶ０１：５’−ＴＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＧＣＣＡＡＴＣＣＡＡＴＴＣＧ−３’（ＡＦ５３８８４３のヌクレオチド位置６１７から６４１に対応する。）。
かくして、ＰＣＲは、１５０塩基対のＤＮＡ断片の増幅をもたらした。ＰＣＲ試料は、製造業者の指示に従って、ＰＣＲプライマーの各２００ｎＭ（最終濃度）並びにＥｎｚｙｍＭｉｘ（Ｒ）及びＵｌｔｒａｓｅｎｓｅＲＴ−ＰＣＲＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）の反応緩衝液を含有した。
さらに、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ６０００リアルタイム回転式ＰＣＲ分析装置を用いて、増幅されたＰＣＲ断片を検出するために、相応するＰＣＲ試料は、それぞれ、その５’末端に６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）標識（すなわち、蛍光色素）及びその３’末端に６−カルボキシテトラメチルローダミン−スクシンイミジルエステル（ＴＡＭＲＡ）標識（すなわち、消光物質）を含む、二重標識されたいわゆるＴａｑｍａｎ（Ｒ）プローブの１００ｎＭ（最終濃度）を含有した（両標識は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡから購入した。）。プローブは、以下の配列を有する。
ＨＰ ＥＶ２ ００１：ＦＡＭ−５’−ＡＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴ−３’−ＴＡＭＲＡ
（ＡＦ５３８８４３のヌクレオチド位置５３６から５６１に対応する。）。
競合的分析を実施するために、ＰＣＲ試料は、同じ配列を有するが、Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）プローブと異なる標識、すなわち、ＣＹ３カルボシアニン標識をその３’末端に有するレポーター分子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）：
ＥＶ２ ０２ＣＹ３：５’−ＡＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴ−３’−ＣＹ３
（ＡＦ５３８８４３のヌクレオチド位置５３６から５６１に相当する。）の２０ｎＭ（最終濃度）をさらに含有した。
リアルタイムＰＣＲは、以下の温度プロファイルに従って行った。９４℃で２分、続いて９４℃で５秒、６２℃で３０秒及び７２℃で３０秒の５０サイクル。
ＰＣＲの間、両反応に対する蛍光シグナルが図２３に示されている。
ＨＩＶ１ｇａｇ／ｅｎｖＤＮＡを測定するための、アレイをベースとする競合的アッセイ
実施した競合的アッセイの原理は、図２４Ａ中に模式的に示されている。発現ベクターｐＣＲ（Ｒ）２．１−ＴＯＰＯ（Ｒ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ制限部位中にクローニングされた合成ＨＩＶ１ｇａｇ／ｅｎｖ融合構築物（ＥＭＢＬ受付番号Ａ０６２５８）のＤＮＡをＤＮＡテンプレートとして使用した。
さらに、以下のＰＣＲプライマーを使用した。
フォワードＰＣＲプライマー：ｃｄｉａ：５’−ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣ−３’（Ａ０６２５８のヌクレオチド位置２１４から２３２に対応する。）
リバースプライマー：
ｃｄｉｓ：５’−ＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴ−３’（Ａ０６２５８のヌクレオチド位置３８４から４０５に対応する。）。
かくして、ＰＣＲは、以下の配列：５’−ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＴＧＣ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＡＡ ＡＡＧ ＡＧＡ ＣＣＡ ＴＣＡ ＡＴＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＡＴ ＧＧＧ ＡＴＡ ＧＡＴ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＧＧＣ ＣＴＡ ＴＴＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＧＡ ＴＧＡ ＧＡＧ ＡＡＣ ＣＡＡ ＧＧＧ ＧＡＡ ＧＴＧ ＡＣＡ ＴＡＧ ＣＡＧ ＧＡＡ ＣＴＡ ＣＴＡ ＧＴＡ ＣＣＣ ＴＴＣ Ａ−３’を有する１５１塩基対のＤＮＡ断片の増幅をもたらした。
ＰＣＲは、加熱可能な基部表面上にアレイが配置された、アッセイ装置の反応チャンバー中で行った。ＰＣＲ試料は、ＰＣＲプライマーの各２００ｎＭ（最終濃度）並びにＥｎｚｙｍＭｉｘ（Ｒ）及びＵｌｔｒａｓｅｎｓｅＲＴ−ＰＣＲＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）の反応緩衝液を含有した。較正曲線を作成するために、０、１０４、１０５及び１０６ＤＮＡコピー（それぞれ、４つ組みで行われる。）に対応する、ＤＮＡテンプレートの異なる量（１μＬ中）を使用した。
競合分析を実施するために、ＰＣＲ試料は、その５’末端にＣＹ３カルボシアニン標識を有するレポーター分子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）：ａｎｔｉ ｃｄｓｏ２９ ５’ＣＹ３：ＣＹ３−５’−ＴＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴ−３’（以下に記載されているｃｄｓｏ２９ ＮＨ２プローブ分子と相補的）の１０ｎＭ（最終濃度）をさらに含有した。
ＰＣＲは、以下の温度プロファイルに従って行った。９５℃で３０秒、続いて９５℃で５秒、５０℃で３０秒及び７２℃で３０秒の３６サイクル。
プローブの２つの種類を有するレポーター分子の相互作用は、アッセイ装置の上面の反対側に配置された光学的検出システム及びＩｃｏｎｏｃｌｕｓｔソフトウェアパッケージ（Ｃｌｏｎｄｉａｇ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて徐冷工程の終了時に、各サイクルにおいて測定した。データ獲得の間の曝露時間は２．５秒であった。
プローブ分子の２つの異なる種類は、図２５Ａに示されている配置でアレイ基材上に捕捉された。蛍光標識のみを、陽性対照として用いた。以下のプローブを使用した。
非特異的プローブ：
ａｒａ ５４９８６ ＮＨ２：５’−ＡＣＣＡＧＣＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡＡＣＡＣ−３’受容体特異的プローブ：
ｃｄｓｏ２９ ＮＨ２：５’−ＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡ−３’。
Ｉｃｏｎｏｃｌｕｓｔソフトウェア（Ｃｌｏｎｄｉａｇ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ， Ｊｅｎａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、蛍光の増加、従って、ＤＮＡ量の増加が線形的に起こる指数関数増幅期の開始に対する指標としてＣＴ値（「閾値」）を求め、較正曲線を作成するために、用いたそれぞれのＤＮＡ濃度に対してプロットした（図２４Ｃ）。求められた平均ＣＴ値は、以下のとおりであった。１０４ＤＮＡコピー試料中２２．０、１０５ＤＮＡコピー試料中１８．５及び１０６ＤＮＡコピー試料中１５．０。
受容体特異的プローブを使用する全ての試料において、ＰＣＲサイクルの数が増加するにつれて、蛍光強度の段階的減少が観察された。これに対して、非特異的プローブを用いた試料では、蛍光は観察されなかった（図２４Ｂ）。
アレイ基材上の異なるスポットの配置が、図２５Ａに模式的に図解されている。黒丸はレポーター分子を捕捉するために特異的プローブ（図２４参照）が使用されたスポット（４つの平行試料）を表すのに対して、白丸はレポーター分子を捕捉するために非特異的プローブが使用されたスポット（４つの平行試料）を表す。灰色の丸は、蛍光標識がアレイ基材上にスポット付与された陽性対照を表す。
図２５Ｂは、それぞれ、１、１２、１８及び２１増幅サイクル後に撮影されたアレイ（図２４Ｂ中の１０５ＤＮＡコピー試料に対応している。）の写真を示している。特異的プローブ分子を介してアレイ上に捕捉された試料では、ＰＣＲ増幅の間に、蛍光シグナル強度の段階的減少を観察することができ、これは、次いで、対応する較正曲線との比較によって定量することができる、増幅されたＰＣＲ産物の量の付随する増加に対応する。
ＨＩＶ陽性患者の血液試料中のＨＩＶ量の測定
ＨＩＶ救急、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ−Ｓｃｈｉｌｌｅｒ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙで投薬を受けた５２名のＨＩＶ感染患者から、最初に血液試料を得た。患者らの性別、年齢、ＨＩＶ感染の病因、臨床徴候、存在するＨＩＶの種／サブタイプ、付随する疾患などによって患者はグループ分けされていない。
患者から静脈穿刺によって患者の全血試料を得た。試料の凝固（即ち血栓形成）を防ぐために、５ｍＭの最終濃度でＥＤＴＡを試料に添加した。試料を４℃で保存し、試料回収後２４時間以内に分析した。
４０００ｘｇで５分間遠心し、細胞残屑を除去することによって、全血試料から血漿を精製した。血漿試料１ｍＬ及び全血試料１０μＬ（９９０μＬリン酸緩衝食塩水と混合）をさらなる分析に供した。ウイルス検出のために用いられるＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ ＴａｑＭａｎ ＨＩＶアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を行うために、１ｍＬの試料体積が必要である。
製造者の説明書に従い、ＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ装置において、全血及び血漿試料を自動的に処理した。簡潔に述べると、あらゆる核酸を放出するために、プロテイナーゼＫの存在下でカオトロピック緩衝液中で試料８５０μＬを溶解した。さらに、陰性対照（核酸なし）及びそれぞれ約５００コピー／ｍＬ及び５００．０００コピー／ｍＬのウイルス量に対応するＲＮＡ標準物質を含有する２つの陽性対照を調製した。
磁性シリカ粒子上での非特異的捕捉によって、試料中に存在する核酸を精製した。洗浄後、７５μＬの溶出緩衝液を添加することによって、シリカ粒子から核酸を溶出した。溶出物５０μＬをＣＯＢＡＳ ＴａｑＭａｎマスターミックス（ＨＩＶ特異的ＰＣＲプライマーも含む。）５０μＬと混合し、製造者の説明書に従い、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行うためにＣＯＢＡＳ ＴａｑＭａｎ４８装置に移した。
ＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＬｉｎｋソフトウェアパッケージによって、処理開始前に各試料に添加された標準的ＲＮＡに関して正規化された試料のウイルス量（即ちＨＩＶコピー数／ｍＬ試料）を自動的に計算した。全血試料に対して得られた値に係数１００をかけ、様々な血液試料体積を補正した（１ｍＬ血漿に対して１０μＬ全血）。
特に、この自動データ解析に含まれるのは、ＡｍｐｌｉＬｉｎｋソフトウェアの検出限界に相当する、ＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡの少なくとも４０コピーが検出された試料のみである。ＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡのコピー数が４０未満であるあらゆる試料（即ち、使用される様々な試料体積に対して補正される場合、実際には、ＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡ４０コピー／ｍＬ血漿及びＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡ４．０００コピー／ｍＬ全血に相当する。）を手動で分析した。個々のコピー数／ｍＬ試料に対する全ての計算値に基づき検量線を作成することによって、ウイルスコピー数／ｍＬ試料を計算した（即ち得られたＡｍｐｌｉＬｉｎｋ結果ファイルで与えられる閾値）。
得られた結果を次の表１でまとめるが、これは、なし（「陰性」）、ＨＩＶＲＮＡの、４０コピー未満／ｍＬ（「＜４０」）及び４０コピー超／ｍＬ（「陽性」）が検出された、全血及び血漿試料の個々の番号を示す。
結果（対応する血漿試料から計算されたものに対する全血試料から計算された値の散布図として表される。）はまた図３０及び３１でも示す。特に、図２９は、ＡｍｐｌｉＬｉｎｋソフトウェアにより行われる自動データ解析によって得られる結果を示し、一方、図３０は、血漿及び全血試料に対する手動計算により得られた結果を示し、ここでは、検出されたＨＩＶ ＲＮＡが全くないか又は４０コピー未満であった。
Figure 2019054794
得られた結果から、ＨＩＶを検出するために血漿試料を使用することによって結果が偽陰性となり得ることが明らかとなる。分析したＨＩＶ感染患者の一部における血漿試料中のウイルス量は陰性であり、このことから、対応する全血試料中にかなりのコピー数のＨＩＶ ＲＮＡが検出され得たにもかかわらず、血流中を循環する感染ＨＩＶ粒子がないことが示唆される。
これらの結果は、２４５名のＨＩＶ感染患者の集団を含む次の分析において確証された（最初の分析で調べた５２名の患者を含む。）。上述のようにアッセイを行った。得られた結果（散布図として表される。）を図３１で示し、また、次の表２でもまとめる。
Figure 2019054794
分析した２４５名の血漿試料の６１％が、ＨＩＣ陰性であるか又は、含有されたＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡが４０コピー未満であり（即ち、実際には、使用された様々な試料体積に対して補正された場合、ＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡ４０コピー／ｍＬ血漿及びＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡ４．０００コピー／ｍＬ全血に相当）、一方、分析した２４５名の全血試料のうち、これに相当するのは３５％のみである。言い換えると、血漿試料がＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡを含まないか又は含まれるコピー数が４０コピー未満である６５名（４３％）の患者において、対応する全血試料は実際にはＨＩＶ−陽性であった（即ちＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡ４０コピー超が検出され得た。）。
ＨＩＶのこの「さらなる」プールは、主に、感染細胞での連続的ウイルス複製に対する重要なマーカーに相当すると考えられる、好中球、Ｂリンパ球、血小板及び赤血球（上記背景セクションでの考察を参照）などの血液細胞に接着しているＨＩＶ粒子に起因するという仮説を立てたい。このようにして、血漿試料を用いたアッセイ法は、細胞結合型ＨＩＶ由来の核酸を検出できず、従って、偽陰性の結果が生じ、罹患患者に不利益となる可能性があり得る。従って、総ＨＩＶ核酸量は、血漿中のウイルス量よりも、正確であり信頼性の高い診断マーカーとなると思われる。
診断マーカーとしての全血試料中のＨＩＶ量の使用
投薬計画中の様々な時間点で、実施例１に記載のアッセイに従い、ＨＩＶ抗ウイルス療法を受けている上記対象集団からの５名のＨＩＶ陽性患者（即ち、患者＃０２８、＃００３、＃００４、＃００９及び＃０６６）の個々の血漿及び全血ウイルス量を調べた。得られた個々の結果を次の表３から７ならびに図３３から３５でまとめる。
患者＃０２８に関して、ＨＩＶ療法に対する患者の反応の監視開始後、様々な日（即ち第５、２５、６１及び６８日）に全血及び血漿試料を回収した。得られたアッセイ結果を表３ならびに図３２で示す。
Figure 2019054794
驚くべきことに、薬物療法に対する患者の反応の監視開始後第６８日に回収された試料において、全血中のＨＩＶ量の劇的かつ急激な上昇が観察され、一方で、血漿中のＨＩＶ量は検出不能のままである。Ｊｅｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＨｏｓｐｉｔａｌのＨＩＶ救急にこの観察を報告後、投薬計画中に患者が処方どおりの薬剤摂取を停止していることが分かった。明らかに、このコンプライアンス問題により、ＨＩＶ複製が増加した（全血でのみ検出され得る。）。
この現象の原因は依然として不明であるが、ＨＩＶコピー数の全体的増加は主に血液細胞に接着し続けているＨＩＶ粒子数（即ち血漿試料で検出することができないＨＩＶプール）の増加に起因する。
患者＃００３及び＃００４に関して、ＨＩＶ療法に対する患者の反応の監視開始後、様々な日に（即ち＃００３に対して第０、６０、９８及び１７２日；及び＃００４に対して第０、４２、９８及び１５８日）全血及び血漿試料を回収した。得られたアッセイ結果は、それぞれ表４及び５ならびに図３４Ａ及び３４Ｂで示す。
Figure 2019054794
Figure 2019054794
両患者において、血漿中で低ウイルス量及び全血中で比較的高いウイルス量が一貫して観察された。これらのデータから、投薬計画中にウイルスが依然として活発に複製しているが、この場合も、複製ＨＩＶプールが主に細胞結合型であり、従って血漿試料においては検出可能ではないことを理解することができる。
患者＃００９及び＃０６６に関して、ＨＩＶ療法に対する患者の反応の監視開始後、様々な日に（即ち＃００９に対して第０、６６及び１３６日；及び＃０６６に対して第０、１１、３５及び４２日）全血及び血漿試料を回収した。得られたアッセイ結果は、それぞれ表６及び７ならびに図３５Ａ及び３５Ｂで示す。
Figure 2019054794
Figure 2019054794
患者＃００９において、血漿中のウイルス量は検出限界以下であったが、全血中ではＨＩＶを検出することができた。従って、この場合も、この活発に複製するＨＩＶのプールは主に細胞結合性であると思われる。
患者＃０６６において、コンプライアンス問題のために（即ち本患者は処方どおりに薬剤を摂取しなかった。）、薬物療法に対する患者の反応の監視開始後３５日まで、両方の全血試料において、ＨＩＶ量の上昇が観察された。その後、別の治療が開始され、結果としてウイルス量が低下した。絶対数で全血及び血漿ウイルス量に対して観察される個々の経時変化は同様であるが、全血試料中のウイルス量は常に血漿試料よりも高かった。
このようにして、これらの結果に基づき、全血中のＨＩＶ量は、ＨＩＶ感染患者における疾患進行を監視するためだけでなく、抗ウイルス療法の効率を監視するためにも、血漿中のＨＩＶ量よりも意義深く重要な診断マーカーとなると思われる。
「含む」という用語は他の要素又は特徴を除外するものではなく、「１つ」は複数を除外するものではないことを銘記すべきである。また、異なる実施形態と関連して記載されている要素は組み合わせることができる。
特許請求の範囲における参照符号は特許請求の範囲を限定するものと解釈してはならないことも銘記すべきである。

Claims (12)

  1. 流体状態の試料を収容するように適合され、反応チャンバーを含む装置中に流体全血試料を導入する工程であって、前記反応チャンバーが第一の表面及び第二の表面を含み、及び、前記第一の表面又は前記第二の表面上に配置されたマイクロアレイをさらに含む工程；並びに
    装置中でマイクロアレイに基づく分析を行うことによって、全血試料中のウイルス感染と関連する核酸の存在及び／又は量の指標となる値を測定する工程を含む方法。
  2. ウイルス感染と関連する核酸の存在及び／又は量の指標となる値に基づき、感染患者におけるウイルス負荷量の指標となる値を測定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 試料の容積が１μＬから４５μＬである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. ウイルス感染がＨＩＶ感染である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 流体状態の試料を収容するように適合された装置が微小流体装置である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 装置中で行われる分析が、試料から核酸を放出させる工程をさらに含み、当該放出工程が流体試料を溶解試薬と接触させる工程を任意で含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 装置中で行われる分析が、複合体を形成させる工程をさらに含み、各複合体はウイルス感染と関連する核酸と捕捉分子を含み、各捕捉分子は、ウイルス感染と関連する核酸のある領域に対して特異的な結合部分とアンカー基を含み、ここで、装置中で行われる分析が、複合体を装置の第一の結合要素と接触させる工程をさらに任意で含み、前記第一の結合要素は、複合体を第一の結合要素に結合するために、捕捉分子のアンカー基に結合するように構成されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ウイルス感染と関連する核酸と捕捉分子の複合体を形成させる工程が、複合体を第一の結合要素と接触させる工程から空間的に分離されて行われる、請求項７に記載の方法。
  9. 装置中で行われる分析が、ウイルス感染と関連する核酸を増幅する工程をさらに含み、核酸がＰＣＲによって任意に増幅される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 装置中で行われる分析が、ウイルス感染と関連する核酸と複合体を形成することができるレポーター化合物の一定量及び当該レポーター化合物を捕捉することができる第二の結合要素を準備する工程をさらに含み、レポーター化合物の核酸との複合体の形成が第二の結合要素によるレポーター化合物の捕捉を阻害する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. ウイルス感染と関連する核酸の量の少なくとも一部と、レポーター化合物の量の一部との複合体を形成させる工程；
    第二の結合要素上の、ウイルス感染と関連する核酸と複合体を形成していないレポーター化合物の量の残りの一部を捕捉する工程；並びに
    第二の結合要素上に捕捉されたレポーター化合物の存在及び／又は量に対する指標となる値を測定する工程をさらに含み、並びに、
    レポーター化合物の量に対する指標となる値に基づいて、ウイルス感染と関連する核酸の量の指標となる１つ又はそれ以上の値を測定することをさらに任意で含む、請求項１０に記載の方法。
  12. ウイルス感染と関連する核酸を増幅に供する工程をさらに含み、核酸の量の少なくとも一部とレポーター化合物の量の一部の複合体を形成させる工程の前に、核酸の増幅が開始される、請求項１１に記載の方法。
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