CN105063169A

CN105063169A - 一种基于核酸适配体和金纳米颗粒相互作用的肿瘤细胞可视化检测方法

Info

Publication number: CN105063169A
Application number: CN201510455700.4A
Authority: CN
Inventors: 梁兴杰; 刘畅; 邓华; 霍帅东; 邹国漳
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date: 2015-07-29
Filing date: 2015-07-29
Publication date: 2015-11-18

Abstract

本发明涉及一种基于核酸适配体和金纳米颗粒相互作用的肿瘤细胞可视化检测方法，本发明采用可特异性识别肿瘤细胞的DNA适配体作为检测探针，以金纳米颗粒的聚集变色特性为检测指示信号，只需一步即可实现对肿瘤细胞的检测，达到了快速诊断的目的。

Description

一种基于核酸适配体和金纳米颗粒相互作用的肿瘤细胞可视化检测方法

技术领域

本发明涉及临床医学技术领域，具体涉及一种肿瘤细胞的可视化检测方法，尤其涉及一种基于核酸适配体和金纳米颗粒相互作用的肿瘤细胞一步法可视化检测。

背景技术

随着环境的恶化，肿瘤发病率越来越高，发现不及时常常会错过最佳治疗时机而导致治疗失败。目前临床诊断方式主要包括成像学检查、病理组织学检查和生物标记物检查等，但这些方法都比较耗时，而且价格昂贵，需要依赖于高端大型仪器设备，无法在肿瘤细胞数量很少时检测其存在性，因而上述方法既无法有效判断肿瘤的转移或复发，也难以及时反映肿瘤治疗过程中的疗效。因此，目前急需一种成本低、易操作的检测方法用于癌症的快速检测。

核酸适配体(Aptamer)是指人工合成的寡核苷酸，可通过配体指数富集系统进化法(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment,SELEX)从随机的核酸片段中筛选获得。与传统的探针分子(如抗体-抗原)相比，核酸适配体可通过构象折叠特异性识别靶标分子，亲和力较高，还具有可高效大量合成，无需从动物体内提取纯化等优点。

由于金纳米颗粒具有表面等离子共振效应，使其具有独特的光学特性，常被用来作为比色探针，实现可视化检测。其检测原理一般为为：当溶液中的盐浓度升高时，单分散状态下的金纳米颗粒会受到盐离子的影响而发生聚集，导致溶液的颜色由深红色变为蓝紫色，同时紫外-可见吸收峰发生蓝移。基于此原理也可通过金纳米颗粒溶液的颜色变化及紫外-可见吸收光谱的变化来检测特异性靶细胞的存在。

针对核酸适配体和金纳米颗粒的诸多优点，目前也有诸多报道将核酸适配体和金纳米颗粒结合起来用于对靶分子的比色检测。

CN102676508A公开了一种基于纳米金和适配体的小分子探针及其制备方法，其采用的小分子探针包括纳米金颗粒，以及组装在纳米金颗粒上的一种以上巯基修饰DNA片段，还包括一种以上的荧光基团标记的适配体，且所述的一种以上适配体至少部分片段与所述的一种以上巯基修饰DNA组互补杂交。

CN103529197A公开了一种适配体修饰的纳米金探针，采用以直径为20-30nm的纳米金球为内核，金球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链。

王文凤等研究了基于纳米金标记-适配体识别的伏马菌素B1可视化检测新方法，其采用以纳米金为载体，首先在纳米金表面组装巯基化的适配体互补短链DNA1/FBI-适配体复合物，当加入目标物是，适配体链与目标物结合，与互补短链DNA1解离，此时再加入纳米金标记的与适配体互补短链1互补的短链DNA2，二者杂交可导致纳米金粒子的聚集而使溶液颜色发生变化，进而实现目标物的可视化检测(参见“基于纳米金标记-适配体识别的伏马菌素B1可视化检测新方法”，王文凤等，食品与生物技术学报，第32卷第5期，第501-508页，2013)。

上述所涉及到的文献中，均采用的是将巯基化的核酸适配体共价连接到金纳米颗粒表面，这种方法的缺点在于需要复杂的合成过程才能将核酸适配体修饰到金纳米颗粒表面，往往需要昂贵的大型仪器设备作为辅助检测手段。目前也有一些文献公开了直接利用游离的核酸适配体和金纳米颗粒来检测金属离子、蛋白质、DNA等小分子，但都存在步骤复杂，操作繁琐，无法实现快速检测等不足。

因此，研发一种基于核酸适配体和金纳米颗粒相互作用的肿瘤细胞的快速、高效、简便的可视化检测方法是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肿瘤细胞的可视化检测方法，特别是一种基于核酸适配体和金纳米颗粒相互作用的肿瘤细胞一步法可视化检测。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种基于核酸适配体和金纳米颗粒相互作用的肿瘤细胞可视化检测方法，该方法选择可特异性识别肿瘤细胞的DNA适配体作为检测探针，以金纳米颗粒的聚集变色特性为检测指示信号，从而对肿瘤细胞进行可视化检测；其中，所述的DNA适配体为游离状态，所述的金纳米颗粒为无修饰的金纳米颗粒。

本发明所提供的基于核酸适配体和金纳米颗粒相互作用的肿瘤细胞可视化检测方法，具体包括以下步骤：

(1)取10μL浓度为11.5nM的金纳米颗粒于200μL的离心管中，加入10μL游离的可特异性识别肿瘤细胞的DNA适配体进行杂交，得到适配体修饰的金纳米颗粒溶液；

(2)向上述适配体修饰的金纳米颗粒溶液中加入10μL含有待检测的肿瘤细胞的PBS缓冲液，孵育10-30min，观察溶液颜色变化。

本发明可以通过以下方式获得浓缩的金纳米颗粒溶液：取1mL浓度为1.4×10¹²/mL的金纳米颗粒于2.5mL的离心管中，10000rpm离心30min，去上清，即获得浓缩的金纳米颗粒溶液。对于浓缩的金纳米颗粒溶液的制备不作特别限定。

优选地，所述肿瘤细胞在含10％胎牛血清和0.1％青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中培养。

优选地，所述溶液颜色由深红色变为紫色时，即检测到肿瘤细胞的存在。

优选地，所述肿瘤细胞为急性白血病B淋巴细胞瘤细胞、急性白血病淋巴T细胞或急性髓细胞白血病M3细胞中的任意一种。

本发明的原理在于：选择可特异性识别肿瘤细胞的DNA适配体作为检测探针，以金纳米颗粒的聚集变色特性为检测指示信号，以达到对相关疾病的快速检测。在无靶细胞存在时，核酸适配体可以通过非共价的吸附作用吸附到金纳米颗粒表面，从而保护金颗粒不发生聚集，使溶液保持深红色。当有靶细胞存在时，稳定金纳米颗粒的核酸适配体便会被靶细胞竞争性吸附，从而使金颗粒暴露在盐环境下并发生聚集，从而使得溶液由深红色变为紫色，由此通过肉眼便可检到靶细胞的存在。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明只需将游离的核酸适配体、无修饰的金纳米颗粒和肿瘤细胞进行混合即可检测到靶细胞的存在，具有操作简单，一步即可完成的优点。

(2)本发明的核酸适配体非共价连接到金纳米颗粒表面，简化了过程，提高了检测效率，避免了昂贵仪器的使用。

(3)本发明的检测结果具有可视化的特点，且具有较低的检出限，最低可检测到500个癌细胞。

附图说明

图1是本发明实施例1对5000个靶细胞和对照细胞的检测结果图；

其中，图1A表示对5000个靶细胞和对照细胞检测后的溶液颜色变化图，图1B表示对5000个靶细胞和对照细胞检测后的紫外可吸收检测图；

图2是本发明实施例2对10000个靶细胞和对照细胞的检测结果图；

其中，图2A表示对10000个靶细胞和对照细胞检测后的溶液颜色变化图，图2B表示对10000个靶细胞和对照细胞检测后的紫外可吸收检测图；

图3是本发明实施例5对不同数量靶细胞的检测结果图；

其中，图3A表示对10、10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴个靶细胞和对照检测后的溶液颜色变化图，图3B表示对上述靶细胞和对照细胞检测后的紫外可吸收检测图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

材料及制备：

细胞：人B淋巴细胞瘤细胞RAMOS(CRL-1596)、人急性白血病淋巴T细胞CCRF-CEM(CCL-119)和人急性髓细胞白血病M3细胞HL60均来自中国医学科学院。

上述细胞在含10％胎牛血清和0.1％青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中培养。检测前，用PBS清洗细胞三次并最终悬浮在PBS溶液中。细胞密度通过细胞计数板计算而得。

核酸适配体：方法中用到的核酸适配体均由Biomed合成，纯度均在95％以上。最终产品高浓度溶解在TE缓冲液中并保存在-20℃，在使用前复温并稀释到所需浓度。

金纳米颗粒：方法中用到的15纳米金颗粒购自BBI公司(产品号：EMGC15)。金纳米颗粒溶液的起始浓度约为2.3nM(1×)，通过转速为10,000rpm离心30分钟，获得浓缩的金颗粒溶液11.5nM(5×)。

所述方法具体包括以下步骤：

(1)取10μL浓度为11.5nM的金纳米颗粒于200μL的离心管中，加入10μL浓度为4μM的游离特异性识别肿瘤细胞的DNA适配体，得到适配体修饰的金纳米颗粒溶液。

(2)向上述适配体修饰的金纳米颗粒溶液中加入10μL含5000个待检测人B淋巴细胞瘤细胞RAMOS的PBS溶液，孵化10min，观察溶液颜色变化。从图1A可以看出，含有靶细胞的溶液显示紫色，而不含有靶细胞的对照细胞则显示深红色，说明采用实施例1的方法可快速检测到靶细胞的存在。

(3)将以上溶液进行离心6000rpm，3min，取上清进行紫外可见吸收检测，结果如图1B所示，与对照细胞溶液的紫外吸收曲线相比，靶细胞溶液的在540nm左右的吸收度明显下降，这与肉眼观察到的靶细胞溶液呈紫色而对照细胞溶液呈深红色现象一致。

实施例2

(1)取10μL浓度为11.5nM的金纳米颗粒于200μL的离心管中，加入10μL浓度为6μM的游离特异性识别肿瘤细胞的DNA适配体，得到适配体修饰的金纳米颗粒溶液。

(2)向上述适配体修饰的金纳米颗粒溶液中加入10μL含10000个待检测人B淋巴细胞瘤细胞RAMOS的PBS溶液，孵化10min，观察溶液颜色变化。从图2A可以看出，含有靶细胞的溶液显示紫色，而不含靶细胞的对照细胞则显示深红色，说明采用实施例2的方法可快速检测到靶细胞的存在。

(3)将以上溶液进行离心6000rpm，3min，取上清进行紫外可见吸收检测，结果如图2B所示，与对照细胞溶液的紫外吸收曲线相比，靶细胞溶液的在540nm左右的吸收度明显下降，且因为靶细胞含量的增加，吸收度比图1B中的靶细胞溶液下降的更加明显；该紫外吸收变化与肉眼观测到的溶液颜色变化一致。

实施例3

(2)向上述适配体修饰的金纳米颗粒溶液中加入10μL含5000个人急性白血病淋巴T细胞CCRF-CEM的PBS溶液，孵化10min，观察溶液颜色变化。

(3)将以上溶液进行离心6000rpm，3min，取上清进行紫外可见吸收检测。

实施例4

(2)向上述适配体修饰的金纳米颗粒溶液中加入10μL含5000个人急性髓细胞白血病M3细胞HL60的PBS溶液，孵化10min，观察溶液颜色变化。

实施例5

(1)取10μL浓度为11.5nM的金纳米颗粒于200μL的离心管中，加入10μL浓度为6μM的游离特异性识别肿瘤细胞的DNA适配体，得到适配体修饰的金纳米颗粒溶液；

(2)向上述适配体修饰的金纳米颗粒溶液中加入10μL含0、10、10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴个待检测人B淋巴细胞瘤细胞RAMOS的PBS溶液，孵化10min，观察溶液颜色变化。从图3A可以看出，随着浓度的增加，含有靶细胞的溶液显示紫色，而不含靶细胞的对照细胞则显示深红色，说明采用该方法可快速检测到靶细胞的存，并具有较低的检出限。

(3)将以上溶液进行离心6000rpm，3min，取上清进行紫外可见吸收检测，结果如图3B所示，随着靶细胞含量的增加，540nm左右的紫外吸收逐渐降低，相对应的溶液颜色逐渐由深红色变为紫色，当细胞含量减低到500个时，便可以实现肉眼分辨。这与之前实施例的实验结果吻合，且说明吸收度和溶液颜色变化均具有靶细胞浓度依赖性，可以作为半定量的检测方法。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种基于核酸适配体和金纳米颗粒相互作用的肿瘤细胞可视化检测方法，其特征在于，选择可特异性识别肿瘤细胞的DNA适配体作为检测探针，以金纳米颗粒的聚集变色特性为检测指示信号，从而对肿瘤细胞进行可视化检测；其中，所述的DNA适配体为游离状态，所述的金纳米颗粒为无修饰的金纳米颗粒。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞在含10％胎牛血清和0.1％青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中培养。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述溶液颜色由深红色变为紫色时，即检测到肿瘤细胞的存在。

5.如权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为急性白血病B淋巴细胞瘤细胞、急性白血病淋巴T细胞或急性髓细胞白血病M3细胞中的任意一种。